KR20140020243A - 항-마이코박테리아 백신접종의 효능 측정 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 백신, 특히 결핵 백신의 효능을 측정하기 위한 방법 및 시약에 관한 것이다.

Description

항-마이코박테리아 백신접종의 효능 측정{Determination of the efficacy of an anti-mycobacterial vaccination}
본 발명은 백신, 특히 결핵 백신의 효능을 측정하기 위한 방법 및 시약에 관한 것이다.
매년, 2백만 명에 이르는 사람들이 결핵(TB)으로 인해 사망한다(1). TB에 대해 유일하게 이용가능한 백신은 마이코박테리움 보비스 바실러스 칼메테 구에린(Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin (BCG))이며, 이는 1921년에 최초로 인간에게 사용되었다(2). 현재까지, 40억 용량의 BCG가 투여되었으며, BCG는 전세계적으로 가장 널리 사용되는 인간 백신이다(3). 그러나, 인류는 TB의 근절을 달성하는데 여전히 어려움을 겪고 있다. BCG 백신접종은 유아에서 결핵 뇌수막염 및 속립성 TB를 예방한다(4). 그러나, TB의 다른 형태, 특히 청소년 및 성인에서 폐 TB에 대한 방어는 메타-분석에서 강조된 바와 같이 결론에 이르지 못하고 있으며, 성인에서 0-80% 범위의 방어적 효능이 밝혀졌다(5). 그러므로, TB에 대한 신규한 백신이 시급하게 요구된다. 현재, 임상 시험에서 TB에 대한 신규한 백신접종의 전략은 정규(caninical) BCG를 대체하기 위한 재조합 BCG 뿐만 아니라 서브유닛 백신 및 BCG 프라임(prime)을 추가접종(boost)하기 위한 비-복제성의 바이러스 벡터-기반 백신을 포함한다(6)(7).
방어의 기초가 되는 면역학적 기전의 규명은 TB 예방을 위한 신규한 백신접종 전략의 합리적인 설계를 가능하게 한다. 더불어, 이 전략은 임상적 TB 백신 효능 시험에서 임상 결과의 대리결과 변수(surrogate endpoint)를 드러낼 수 있는 방어적 면역성을 나타내는 바이오마커를 규명할 수 있고, 따라서 시험기간을 단축시킬 뿐만 아니라 병행 시험에서 더 많은 수의 백신 후보자를 시험하는 것을 가능하게 한다. 신규 감염된, 건강한 접촉자인 TB 환자 및 BCG-백신접종된 유아를 대상으로 한 관찰 연구가 이러한 바이오마커를 정의하기 위해 개시되었다(8). TB에 대한 면역 반응에 대한 광범위한 연구에도 불구하고, 방어적 기억의 필수적인 요소는 여전히 더 자세한 설명이 요구된다. BCG 백신접종 후에, 항원-특이적 기억 CD4 T 세포는 면역우성 항원의 부족(paucity)으로 인하여 검출이 어렵다. 현재, 가장 널리 사용되는 바이오마커는 IFNγ를 생산하는 CD4 T 세포의 상승된 빈도를 기초로 한다. 증가하는 증거는 TB에서의 방어와 연관성이 있는 IFNγ의 값에 의문을 갖게 한다(9,10). 의심할 여지없이 IFNγ는 MTB에 대한 방어에서 중요한 역할을 하지만(11), IFNγ 측정 단독으로는 방어적 면역성의 믿을만한 마커로서 더 이상 고려될 수 없다.
포식리소좀 탈출 도메인(phagolysosomal escape domain)을 발현하는 재조합 BCG 균주는 WO99/101496에 기술되어 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 포식리소좀 탈출 도메인은 파고솜 막의 관통을 통해 균주가 감염된 숙주 세포의 파고솜으로부터 탈출하는 것을 가능하게 한다. 최적 포식리소좀 탈출 활성을 위한 산성 파고솜 pH를 제공하기 위하여, 우레아제-결핍성 재조합 균주가 개발되었다. 이 균주는 WO2004/094469에 개시되어 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
리스테리아 모노사이토제네스의 막-관통성 리스테리오리신(Hly)을 발현하고 우레아제 C 결핍성 재조합 △ureC HIY + rBCG(rBCG) 균주는 전임상 모델에서 양친 BCG(pBCG)와 비교할 때, MTB에 의한 흡입성 시험접종(aerogenic challenge)에 대하여 더 우수한 방어를 유도한다(12). 이 백신 구조물은 제I상 임상 시험에서 안전성 및 면역원성이 성공적으로 증명되었으며(US 61/384,375), 그 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 연구에서는, rBCG 및 pBCG가 뚜렷한 Th1 면역 반응을 유도하지만, rBCG만이 추가로 현저한 Th17 반응이 있는 것으로 나타났다. rBCG-백신접종된 마우스의 MTB 감염시 폐로의 항원-특이적 T 림프구의 더 이른 동원이 또한 관찰되었다. 이들 T 세포는 재자극 이후에 과다 Th1 사이토카인을 생산하였다. rBCG의 더 우수한 방어적 효능은 IL17에 명백하게 의존적이었다. 제I상 임상 시험 동안에 건강한 지원자에서 rBCG 이후에 상승된 IL17 생산이 또한 관찰되었지만, pBCG 백신접종 이후에는 관찰되지 않았다. 본 발견은 서브유닛 백신 후보자에 의해 또한 분석될 수 있는 TB에 대한 개선된 백신접종 전략을 위한 마커로서 일반적인 면역학적 경로를 규명한다.
본 발명의 청구대상은 백신접종된 개체에서 Th17 면역 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 백신의 효능을 측정하기 위한 방법이며, 여기서 Th17 면역 반응의 존재는 상기 개체에서의 방어적 면역성을 나타낸다.
본 발명의 추가적인 양태는 Th17 면역 반응을 검출하기 위한 적어도 하나의 시약을 포함하는 백신의 효능을 측정하기 위한 시약 키트이다.
바람직한 구현예에서, 백신은 생백신, 특히 마이코박테리움 세포이다. 더욱 바람직한 구현예에서, 백신은 (a) 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 도메인 및 (b) 포식리소좀 탈출 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 재조합 마이코박테리움이다. 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 도메인은 바람직하게는 병원체 또는 이의 면역원성 단편으로부터의 면역원성 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다. 추가적인 구현예에서, 백신은 서브유닛 백신이며, 다시 말하면 병원체 또는 이의 면역원성 단편으로부터 정제된 항원, 특히 재조합 항원 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 백신이다. 다른 추가적인 구현예에서, 백신은 불활성화된 전체 병원체 세포 또는 세포 분획을 기초로 한 백신이다.
마이크로박테리움 세포는 바람직하게는 M. 보비스(M.bovis) 세포, M. 튜버큘로시스(M.tuberculosis) 세포, 특히 약독화된 M. 튜버큘로시스 세포 또는 다른 마이코박테리아, 예컨대 M. 미크로티(M.microti), M. 스메그마티스(M.smegmatis), M. 카네티(M.canettii), M. 마리눔(M.marinum) 또는 M. 포르투이툼(M.fortuitum)이다. 더욱 바람직하게는, 세포는 재조합 M. 보비스(BCG) 세포, 특히 덴마크 아형 프라그(Danish subtype Prague) 균주로부터의 재조합 M. 보비스 세포이다(43). 특히 바람직한 구현예에서, 백신은 재조합 우레아제-결핍성 마이코박테리움 세포이다. 특히 바람직한 구현예에서, 마이코박테리움 세포의 ureC 서열은, 예컨대 선별 마커 유전자에 의해 파괴된 ureC 유전자를 함유하는 자살 벡터를 구성하고, 벡터로 표적 세포를 형질전환하고, 우레아제 음성 표현형을 갖는 선별 마커-양성 세포에 대해 스크리닝함으로써 불활성화된다(ΔUrec). 가장 바람직하게는, 세포는 rBCG ΔUrec :: Hly+ :: Hyg+를 특징으로 하는 재조합 BCG 균주 덴마크 아형 프라그이다.
면역 반응을 이끌어낼 수 있는 도메인은 바람직하게는 적어도 6개, 바람직하게는 적어도 8개 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 9개 아미노산, 및 예컨대 20개 이하의 아미노산 길이를 갖는 M. 보비스 또는 M. 튜버큘로시스로부터의 면역원성 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 이들의 면역원성 단편으로부터 선택된다. 적합한 항원의 구체적인 예로는 M. 튜버큘로시스로부터의 Ag85B(p30), M. 보비스 BCG로부터의 Ag85B(α-항원), M. 튜버큘로시스로부터의 Ag85A 및 M. 튜버큘로시스로부터의 ESAT-6 및 이들의 단편이다.
백신은 바람직하게는 마이코박테리아 감염에 대한 백신, 특히 폐 마이코박테리아 감염, 더욱 특히 결핵에 대한 백신이다.
본 발명의 방법에 따르면, 백신접종된 개체에서의 Th17 면역 반응이 측정된다. 개체는 바람직하게는 포유동물, 예컨대 인간이다. 측정은 바람직하게는 상기 개체 유래의 생물학적 샘플에서 수행되며, 상기 샘플은 면역 세포, 특히 T 세포 및/또는 NK 세포, 더욱 특히 CD4 T 세포와 같은 항원-특이적 T 세포를 포함한다. 샘플은 체액 또는 조직 샘플, 예컨대 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플 또는 폐 또는 비장으로부터의 샘플일 수 있다. 샘플을 수집하는 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있다.
본 발명의 방법은 Th17 면역 반응의 측정을 필요로 한다. 이 목적을 위하여, 분석될 개체의 샘플 내에 존재하는 면역 세포를 면역원으로 재자극하고, 상기 세포로부터 사이토카인 발현을 측정하는 것이 바람직하다. 세포는 바람직하게는 항원-특이적 T 세포, 더욱 바람직하게는 CD4 T 세포이다. 재자극을 위한 면역원은 (그의 효능이 측정될) 백신 내에 존재하는 면역원에 상응한다. 면역원은 백신 내에 존재하는 형태와 동일한 형태 또는 상이한 형태로 존재할 수 있다. 예를 들면, 백신이 면역원성 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 재자극 단계에서 면역원은 이의 면역원성 단편 또는 그 반대를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 재자극 단계를 위해 사용된 면역원은 정제된 폴리펩타이드 또는 펩타이드이다. 상기 기술된 튜버큘로시스 백신, 특히 생 튜버큘로시스 백신의 효능을 시험하기 위해, 면역원은 예컨대 PPD "정제된 단백질 유도체"로부터 선택된, 유리하게는 마이코박테리아 항원일 수 있으며, 이는 (상기 기술된 바와 같은) 다른 마이코박테리아 항원 및 이의 면역원성 단편 뿐만 아니라, 마이코박테리아 또는 Ag85A 및 Ag85B의 글리세롤 추출물이다.
본 발명에 따른 Th17 반응의 측정은 Th17 반응과 관련된 세포, 예컨대 IL-17 생산 세포를 상기 세포에 존재하고/존재하거나 이에 의해 분비된 표면 마커 및 사이토카인을 이용하여 측정하는 것을 포함할 수 있다. 표면 마커의 예로는 CD4, CD8, IL-23R, CCR4 및/또는 CCR6이다. 이러한 세포에 존재하고/존재하거나 이에 의해 분비된 사이토카인의 예로는 IL-17, IL-21, IL-22, IL-23, IFN-γ 및 이들의 조합이다. 바람직하게는, 사이토카인은 IL-17이다. 이러한 세포는 세포학적 방법, 예컨대 표지, 예컨대 형광 그룹을 운반할 수 있는 세포 표면 마커 및/또는 사이토카인에 대해 특이적인 항체와 같은 면역학적 검출 시약을 사용하는 세포 분류 기술에 의해 측정될 수 있다.
더욱 바람직하게는, Th17 면역 반응과 관련된 세포는, 예컨대 IL-17를 생산하고 선택적으로 이를 분비하는 CD4 T 세포이다.
추가적인 구현예에서, Th17 면역 반응의 측정은 Th17 면역 반응과 관련된 세포, 예컨대 IL-17 면역 반응으로부터 분비된 사이토카인을 측정하는 단계를 포함한다. 사이토카인은 적절한 항체, 예컨대 IL-17에 대하여 지시된 항체를 사용하는 면역학적 방법에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 방법에서, Th17 면역 반응은 백신접종 이후에 적합한 시간에 측정된다. 예를 들면, 면역 반응은 백신접종 이후 20-50일째, 특히 25-35일째에 측정될 수 있다.
본 발명은 또한 특히 상기 기술된 방법에서 사용하기 위한 백신의 효능을 측정하기 위한 시약 키트에 관한 것이다. 시약 키트는 백신접종된 개체로부터의 샘플 내에 존재하는 면역 세포를 재자극에 적합한 면역원을 포함한다. 추가적으로 시약 키트는 상기 기술된 바와 같은 Th17 면역 반응 마커를 검출하기에 적합한 적어도 하나의 시약을 포함한다. 시약은 예컨대 세포학적 및/또는 면역학적 검출 시약, 예컨대 Th17 면역 반응과 관련된 세포에 특징적인 세포 마커에 대한 항체 및/또는 Th17 면역 반응과 관련된 사이토카인, 특히 IL-17 및/또는 IL-22에 특이적인 면역학적 시약으로부터 선택될 수 있다. 검출 부위는 검출가능한 그룹, 예컨대 형광 표지 그룹을 운반할 수 있다.
추가로, 다음의 도면 및 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 기술한다.
도 1: WT 마우스에서 MTB 부하( burden ). S.c. 면역접종은 p.i. 90일째 MTB에 의한 감염에 대하여 방어한다. (A). 세균성 부하는 백신접종된 그룹과 백신접종되지 않은 그룹 사이에서 p.i. 7일째에 대등하다. (B). 400 CFU MTB에 의한 에어로솔 감염 이후 폐 및 비장에서 CFU 측정. 심성폐 엽(전체 장기의 대략 71/10th) 또는 비장의 절반을 균질화시켰으며; 잔존 물질은 시험관내 재자극 분석을 위해 사용하였다. 통계학적 유의성은 양-방향 P 값을 갖는 만-휘트니 검정으로 측정하였다. *, P < 0.05; **, P < 0.01. 데이터는 유사한 결과를 갖는 3회 실험의 대표이다.
도 2: pBCG 백신접종 보다 rBCG 백신접종 이후 더 우수한 사이토카인 유도. rBCG 또는 pBCG에 의한 s.c. 백신접종 이후 83일째에 폐(A) 및 비장(B)에서의 반응. 총 2.5×105 세포(폐) 또는 2×106 세포(비장)를 20시간 동안 PPD로 재자극하였고, 상청액을 멀터플렉스 분석에 의해 분석하였다. 사이토카인 농도는 각각 3개의 복제물을 갖는 4회의 독립적인 실험의 평균±SEM으로서 나타낸다. 배지 대조군으로부터 배경 사이토카인 생산을 감산하였다. ANOVA 및 본페로니(Bonferroni) 복합 비교 검정을 통계 분석을 위해 적용하였다. *, P < 0.05; **, P < 0.01.
도 3: rBCG 에 의한 백신접종은 MTB 에 의한 에어로솔 감염시 폐로의 항원-특이적 T 세포의 동원을 가속화시킨다. 200-400 CFU MTB에 의한 에어로솔 감염 이후 7일째에 페 세포에 의한 사이토카인 분비. 총 2×105 세포를 20분 동안 PPD로 자극하였고 상청액을 멀티플렉스 분석에 의해 분석하였다 (A). 사이토카인 농도는 각각 3가지 복제물을 갖는 2개의 독립적인 실험의 평균±SEM으로서 나타낸다. 배지 대조군으로부터 배경 사이토카인 생산을 감산하였다. 브레펠딘(Brefeldin) A의 존재하에 6시간 동안 PPD에 의해 재자극시킨 세포는 다색 유동 세포분석법으로 분석하였다 (B). 반응성 CD4 T 세포의 빈도는 각각 3개의 복제물을 갖는 3회의 독립적인 실험의 평균±SEM으로서 나타낸다. ANOVA 및 본페로니 다중 비교 검증을 통계적 분석을 위해 적용하였다. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***,P < 0.001.
도 4. rBCG 에 의한 백신접종은 MTB 에 의한 에어로솔 감염시 비장에서 PPD -특이적 반응을 증가시킨다. 200-400 CFU MTB에 의한 에어로솔 감염 이후 7일째에 비장 세포에 의한 사이토카인 분비. 총 2×106 세포를 20시간 동안 PPD로 재자극하였고, 상청액을 멀터플렉스 분석에 의해 분석하였다 (A). 사이토카인 농도는 각각 3개의 복제물을 갖는 4개의 독립적인 실험의 평균 ±SEM으로서 나타낸다. 배지 대조군으로부터 배경 사이토카인 생산을 감산하였다. 브레펠딘 A의 존재하에 6시간 동안 PPD로 재자극시킨 세포를 다색 유동 세포분석법으로 분석하였다 (B). 반응성 CD4 T 세포의 빈도는 각각 3개의 복제물을 갖는 3회의 독립적인 실험의 평균±SEM으로서 나타낸다. ANOVA 및 본페로니 다중 비교 검증을 통계적 분석을 위해 적용하였다. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***,P < 0.001.
도 5. pBCG 또는 rBCG 에 의한 백신접종은 Treg 세포 집단에서 유의미한 변화를 유도하지 않는다. rBCG 또는 pBCG에 의한 s.c. 면역접종 이후 비장에서 Treg 세포. 흑색 바(bar)는 CD25+FoxP3+을 나타내고 백색 바는 CD25-FoxP3+ 세포를 나타낸다. 면역접종(A 및 B) 이후 83일째, 뿐만 아니라 200-400 CFU MTB에 의한 에어로솔 감염 이후 7일째(C 및 D) 또는 90일째(E 및 F)의 CD4 T 세포 및 CD8 Treg 세포의 빈도. 그룹당 3마리의 마우스, 평균±SEM으로서 나타낸다. 데이터는 유사한 결과를 갖는 3회 실험의 대표이다.
도 6. 백신접종 및 MTB 에 의한 후속적인 에어로솔 감염 이후에 폐에서 사이토카인 생산성 CD8 T 세포의 빈도. 200-400 CFU MTB에 의한 에어로솔 감염 이후 7일째 사이토카인 분비. 브레펠딘 A의 존재하에 6시간 동안 PPD에 의해 재자극시킨 세포를 다색 유동 세포분석법으로 분석하였다. 반응성 CD8 T 세포의 빈도는 각각 3개의 복제물을 2회의 독립적인 실험의 평균±SEM으로서 나타낸다. ANOVA 및 본페로니 다중 비교 검정을 통계적 분석을 위해 적용하였다.
도 7: 백신접종 및 MTB 에 의한 후속적인 에어로솔 감염 이후에 비장에서 사이토카인 생산성 CD8 T 세포의 빈도. 200-400 CFU MTB에 의한 에어로솔 감염 이후 7일째 사이토카인 분비. 브레펠딘 A의 존재하에 6시간 동안 PPD로 재자극시킨 세포를 다색 유동 세포분석법으로 분석하였다. 반응성 CD8 T 세포의 빈도는 각각 3개의 복제물을 4회의 독립적인 실험의 평균±SEM으로서 나타낸다. ANOVA 및 본페로니 다중 비교 검정을 통계적 분석을 위해 적용하였다. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001.
도 8: rBCG -백신접종 된 마우스에서 지속적인 MTB 감염 동안 폐에서의 면역 반응. 200-400 CFU MTB에 의한 에어로솔 감염 이후 90일째에 폐 세포에 의한 사이토카인 분비. 세포를 20시간 동안 PPD로 재자극하였고, 상청액을 멀터플렉스 분석에 의해 분석하였다 (A). 사이토카인 농도는 각각 3개의 복제물을 갖는 2개의 독립적인 실험의 평균±SEM으로서 나타낸다. 배지 대조군으로부터 배경 사이토카인 생산을 감산하였다. 브레펠딘(Brefeldin) A의 존재하에 6시간 동안 PPD로 재자극시킨 세포를 다색 유동 세포분석법으로 분석하였다 (B). 반응성 CD4 T 세포의 빈도는 각각 3개의 복제물을 갖는 2회의 독립적인 실험의 평균 ±SEM으로서 나타낸다. ANOVA 및 본페로니 다중 비교 검증을 통계적 분석을 위해 적용하였다. *, P < 0.05; **, P < 0.01.
도 9: 백신접종 및 MTB 에 의한 에어로솔 감염 이후 사이토카인 생산성 CD8 T 세포의 빈도. 200-400 CFU MTB에 의한 에어로솔 감염 이후 90일째에 폐로부터 분리된 세포에 의한 사이토카인 분비. 브레펠딘 A의 존재하에 6시간 동안 PPD로 재자극시킨 세포를 다색 유동 세포분석법으로 분석하였다. 반응성 CD8 T 세포의 빈도는 각각 3개의 복제물을 가진 2회의 독립적인 실험의 평균±SEM으로서 나타낸다. ANOVA 및 본페로니 다중 비교 검증을 통계적 분석을 위해 적용하였다. *, P < 0.05.
도 10: 백신접종은 IL22 생산을 유도하지만 IL21 생산은 유도하지 않는다. 백신접종 및 200-400 CFU MTB에 의한 후속적인 에어로솔 감염 이후 83일째에 마우스의 비장(2×106 세포) 또는 폐(2×105 세포)로부터 분리된 세포에 의한 IL21 (A) 및 IL22 (B) 분비. IL21 농도는 그룹당 3개 샘플로부터 측정하였고, 평균±SEM로 나타냈다. 하나의 그룹으로부터의 IL22 샘플에 대해 풀링(pool)하였다. 데이터는 2회(백신접종 후 83일째) 및 5회(p.i. 7일째) 유사한 실험의 대표이다. 세포를 20시간 동안 PPD로 재자극하였고, 상청액을 ELISA에 의해 분석하였다.
도 11: rBCG 는 APC 집단의 유의미한 변형없이 γδT 세포 및 NK 세포의 증가 된 동원을 초래한다. 106 CFU의 rBCG 또는 pBCG i.p. 투여 시 세포는 복막강으로 동원된다. 유동 세포분석법에 의한 복막세척액 내의 세포 집단의 분석. rBCG 또는 pBCG의 i.p. 투여 이후 5시간째(상부 패널) 및 6일째(하부 패널) APC가 복막으로 동원되었다 (A). 감염 이후 5시간째 T 세포 집단의 ICS (B). 세포를 브레펠딘 A의 존재하에 18시간 동안 αCD3/αCD28 항체로 자극하였다. 투여 이후 6일째 T 세포 집단의 ICS (C). 세포를 브레펠딘 A의 존재하에 18시간 동안 PPD로 자극하였다. 데이터는 그룹당 5마리의 마우스를 갖는 3회의 독립적인 실험의 요약으로서 나타냈다. 수평선은 중앙값을 나타낸다. ANOVA 및 본페로니 다중 검정을 통계적 분석을 위해 적용하였다. *, P < 0.05; **, P < 0.01. 복막세척액에서 검출된 사이토카인 및 케모카인을 멀티플렉스 분석에 의해 분석하고 (D) 평균 농도±SEM로서 나타냈다.
도 12: rBCG 는 제I상 임상 시험의 건강한 지원자들로부터의 인간 PBMC 에서 IL17을 유도한다. 임상 제I상 연구의 건강한 인간 지원자로부터 분리된 인간 PBMC에 의한 IL17 생산. rBCG 또는 pBCG에 의한 백신접종 후 29일째 분리된 총 5×105 세포를 20시간 동안 PPD로 재자극하였고, 상청액을 멀티플렉스 분석에 의해 분석하였다. 통계적 유의성은 양-방향 P 값 및 웰치(Welch's) 보정을 갖는 만-휘트니 검정으로 측정하였다. *, P < 0.05; pBCG의 경우 n=3 및 rBCG의 경우 n=7.
실시예
재료 및 방법
마우스
암컷 BALB/c 마우스를 베를린의 Bundesinstitut fur Risikobewertung(BfR)에서 사육하였다. 마우스는 실험 개시 시점에서 6-8주령이었으며 특정 무-병원체(SPF) 상태로 유지하였다. 동물 실험은 Landesamt fur Gesundheit und Soziales(LAGeSo, Berlin, Germany)의 승인 하에 수행하였다.
세균
사용한 MTB H37Rv 및 pBCG 및 rBCG 균주는 이전에 기술되었다(12). 세균을 글리세롤, 0.05% 트윈 80 및 ADC가 동원된 Middlebrook 7H9 브로쓰에서 성장시켰다. 중간-대수기 배양물을 수거하여 사용하기 전까지 -80℃에서 저장하였다. 모든 스톡은 사용하기 전에 적정하였다. 27G 바늘이 장착된 시린지를 통해 반복 이동시켜 단일 세포 세균 현탁액을 수득하였다.
백신접종 및 MTB 감염
pBCG 또는 rBCG(106 CFU)를 꼬리 기저에 인접하게 피하로(s.c.) 투여하였다. MTB에 의한 마우스의 흡입성 감염을 Glas-Col 흡입 노출 시스템을 사용하여 수행하였다. PBS 0.5% v/v 트윈 80에서 무균적으로 제거된 장기의 기계적 파괴 및 OADC가 보충된 Middlebrook 7H11 아가 플레이트 상의 연속 희석 도말에 의해 세균 부하를 평가하였다. 3주 후에, MTB 콜로니를 계수하였다. 결과의 통계학적 유의성은 GraphPad Prism 5.0를 사용하여 비-매개변수적 데이터에 대해 양방성 p-값을 갖춘 만-휘트니 검정을 통해 측정하였다.
세포 분리, 자극 및 유동 세포분석법
세포를 이전 기술된 바와 같이 정제하였다(42). 실험 그룹은 5마리 마우스로 구성하였다. 2개의 비장 또는 폐를 모으고(pool), 1개의 샘플을 개별적으로 처리하여, 후속적인 자극에 대해 5마리 마우스의 그룹당 3개의 샘플을 생성하였다. 세포를 멀티플렉스 분석에 의한 사이토카인 분석을 위해 20시간 동안 50 ㎍/ml PPD(SSI, Copenhagen, Denmark)로 자극하거나 세포내 사이토카인 염색(ISC)을 위해 25 ㎍/ml 브레펠딘 A의 존재하에 6시간 동안 자극하였다. 다음의 항체를 사용하였다: CD4 (RM4-5), IFNγ(XMG-1.2), IL2(JES6-5H4), Ly6G/C(RB6-8C5), CD11b(M1/70), γδ-TCR(GL-3), FoxP3 염색 세트 및 CD49b(클론DX5) [모두 eBioscience]. CD8α(YTS169), TNF-α(XT22), CD16/CD32(2.4G2), F4/80(CI:A3-1) 및 CD11c(N418)를 하이브리도마 상청액으로부터 정제하였고 내부(in house)에서 형광 표지하였다. IL-17(TC11-18H10)은 BD Biosciences로부터 입수하였다. 세포를 FACSCanto II 또는 LSRII 유동 세포분석법 및 FACSDiva 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용해 분석하였다. 사이토카인은 제조자의 지시에 따라 Bio-Rad로부터의 Bio-Plex 마우스 Th1/Th2, IL17 및 IL6 비드-기초 면역분석을 사용하여 측정하였다. IL21 및 IL22은 R&D 시스템으로부터 ELISA에 의해 측정하였다. Millipore로부터의 Milloplex 42-플렉스를 이용해 인간 IL-17을 검출하였다.
복막 세척
pBCG 또는 rBCG를 중기-대수기적 배양물로부터 신선하게 준비하였다. 세균을PBS로 3회 세척하고 580 nm에서 광학 밀도를 측정하여 농도를 측정하였다. 106 CFU의 투여를 복강 내로 수행하였다. 동원된 세포를 5 ml PBS의 주사 이후 5시간째 또는 6일째 복막강으로부터 수득하였고, 유동 세포분석법에 의해 분석하였다. Bio-Rad로부터의 Bio-Plex 마우스 사이토카인 23-플렉스 키트를 사용하여 세척액(lavage fluid) 내의 사이토카인 및 케모카인을 측정하였다.
결과
rBCG 및 pBCG 백신접종 이후에 Th1 / Th17 반응
TB 백신 효능과 관련된 면역 기전을 설명하기 위한 노력으로, 본 발명자들은 마우스에서 rBCG 및 pBCG에 대한 면역 반응을 비교하였다. rBCG의 더 우수한 방어적 효능은 원래 i.v. 면역접종 이후에 측정되었다(12). 여기서 본 발명자들은 rBCG의 s.c. 투여가 대등한 수준의 방어를 유도하였고, pBCG에 비해 그의 더 우수한 효능을 유지하였음을 보여준다(도 1A). 다음으로, 본 발병자들은 rBCG 또는 pBCG에 의한 s.c. 백신접종 이후 83일째에 마우스의 폐 및 비장에서 장기간 기억 반응을 분석하였다. 세포를 PPD로 재자극하였고, 상청액을 사이토카인에 대한 멀티플렉스 분석으로 분석하였다. rBCG에 의한 면역접종은 pBCG와 비교할 때 폐로부터 분리된 세포에 의해 유의미하게 더 높은 사이토카인을 유도하였다(도 2A). 이들에는 IFNγ, IL2, IL6 및 GM-CSF가 포함되었다. 대조적으로, 유형 2 사이토카인 IL4, IL5 및 IL10은 배경 수준 이상으로 증가하지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 매우 흥미롭게도, rBCG-백신접종된 마우스로부터의 폐 세포에 의해 대략 3-배 더 높은 IL17 농도가 생산되었다. 단지 적은 수의 세포가 감염되지 않은 마우스의 폐로부터 분리될 수 있음을 언급한다. 결론적으로, 전체적인 사이토카인 농도는 비장에서 더 낮았으며, 여기에서 웰당 10-배 더 높은 세포 밀도가 자극을 위해 사용될 수 있었다(도 2B). 비장에서, 두 백신 모두는 IL2, IL6, IFNγ 및 GM-CSF의 대등한 농도에 의해 반영된 바와 같이 동일하게 강한 Th1 반응을 유발하였다. 그러나, rBCG-백신접종된 마우스로부터의 비장 세포는 pBCG-백신접종된 동물과 비교할 때, PPD에 의한 재자극 시 유의미하게 더 많은 IL17을 생산하였다. 따라서, pBCG에 의한 것이 아닌, rBCG에 의한 면역접종은 폐 및 비장에서 동시적이고(concomitant) 강한 Th1 및 Th17 반응을 유도하였으며, 이는 연장된 기간 동안 지속적이었다.
rBCG - 백신접종된 마우스에서 독성 MTB 에 의한 감염시 MTB -특이적 T 세포의 가속화된 동원
Th17 세포는 개선된 면역 감시와 연관이 있었다(13). 본 발명자들은 감염 후 7일째에 폐 및 비장에서, 독성 MTB에 의한 에어로솔 감염시 백신접종된 동물에서 항원-특이적 T-세포 반응을 비교하였다. rBCG-백신접종된 마우스로부터의 폐 세포에 의한 현저한 IFNγ, IL17, IL2 및 GM-CSF 생산이 PPD(도 3A) 또는 Ag85A 펩타이드(데이터는 나타내지 않음)에 의한 재자극 이후 20시간 째에 검출되었다. 대조적으로,이들 사이토카인은 pBCG-백신접종된 마우스로부터의 세포에 의해서는 거의 분비되지 않았다. MTB에 의해 감염된 비-백신접종된 동물에서, 사이토카인 생산은 검출 한계 이하였는데, 이는 MTB 감염 이후 3주 이전에 MTB-특이적 T 세포가 나타나지 않는다는 이전의 보고와 일치하였다(13). 유형 2 사이토카인 IL4, IL5 및 IL10은 검출되지 않았고, TNFα, IL12p70 및 IL6은 MTB 시험접종(challenge) 후, 이 초기 시점에서 단지 배경 수준보다 조금 높게 검출되었다(데이터 나타내지 않음).
본 발명자들은 사이토카인 생산을 MTB 감염 이후 7일째에 유동 세포분석법에 의해서 측정하였다(도 3B). 세포를 6시간 동안 PPD로 자극한 후, IL2, IL17, IFNγ 및 TNFα에 대하여 세포내 사이토카인을 염색하였다. 비-백신접종된 대조군에서, 적은 비율의 CD4 T 세포는 IL2, TNFα 또는 IFNγ를 생산하였다. 백신접종된 마우스에서, CD4 T 세포는 IL2, IFNγ, TNFα 및 IL17도 분비하였다. 단일 사이토카인 생산성 세포의 빈도는 rBCG 그룹에서 비록 유의미하진 않더라도 가장 높았다. 백신접종된 동물에서, 본 발명자들은 방어적 면역성과 연루된 다중기능성 T 세포를 검출하였다(14). 다중 사이토카인-생산성 T 세포는 대부분 IL2+TNFα+ 이중 생산자였고, rBCG 백신접종시 유의미하게 증가하였다. 삼중-생산자 세포는 거의 독점적으로 IL2+IFNγ+TNFα+이었고, pBCG-백신접종된 마우스와 비교할 때 rBCG에서 약간 증가하였다. 또한, IL2+TNFα+IFNγ+IL17+ 사중-양성 세포는 비록 매우 낮은 빈도이긴 하였지만 rBCG 그룹에서 독점적으로 나타났다.
이론적으로, 비장 T 세포는 폐 T 세포와 같은 유사한 사이토카인 패턴을 생산하였다(도 4). IL2 및 GM-CSF 생산은 pBCG 그룹과 비교할 때 rBCG-백신접종된 동물에서 유의미하게 더 높았고, 비-백신접종된 대조군에서 적은 비율의 CD4 T 세포가 IFNγ를 생산하였다고 하더라도, 비-백신접종된 대조군에서는 검출 수준 이하였다. 요약하면, pBCG 또는 rBCG 중 하나에 의한 백신접종은 pBCG 그룹과 비교할 때 rBCG-백신접종된 마우스에서 단일 및 다중-생산자의 더 높은 빈도를 갖는 IFNγ 및 TNFα를 분비하는 CD4 T 세포를 유도하였다.
p.i. 7일째 CD4 T 세포는 주요 사이토카인 생산자였으며; CD8 사이토카인 생산자는 유사한 패턴을 가짐에도 불구하고, 폐(도 6) 및 비장(도 7)에서 더 낮은 빈도로 검출되었다. TNFα-단일 생산성 CD8 T 세포의 유의미하게 더 높은 빈도가 rBCG 그룹에서 검출되었음은 중요하다.
상이한 사이토카인 생산 및 생산자 세포의 빈도는 폐 및 비장에서 대등한 콜로니 형성 유닛(CFU)에 의해 확정된 바와 같이(도 1B), 감염 후 초기 시점에서 상이한 세균성 부하에 기인한 것이 아니었다. Treg 세포의 총 숫자는 2개의 백신접종된 그룹에서 대등한 정도로 감염시 증가하였다(도 5).
rBCG 에 의한 백신접종은 지속적인 감염 동안 강한 면역 반응을 부여한다.
본 발명자들은 폐 세균 부하가 pBCG 그룹과 비교할 때 rBCG-면역접종된 동물에서 대략 10-배 더 낮고, 비-백신접종 대조군 그룹과 비교할 때 100-배 더 낮았을 경우, p.i. 90일째에 MTB-특이적 면역 반응을 분석하였다. 백신접종된 마우스 및 비처리 대조군의 폐로부터의 세포를 20시간 동안 PPD로 재자극하였고, 사이토카인 농도를 멀티플렉스 분석에 의해 측정하였다(도 8A). 재자극 시 검출된 사이토카인은 대부분 유형 1이었다. 그러나, 본 발명자들은 지속적인 감염 동안 백신접종된 그룹 사이에서 IFNγ 또는 IL17의 차이점을 검출하지 못했다. 대조적으로, IL2, IL6, GM-CSF 및 TNFα의 양은 rBCG-백신접종된 마우스에서 더 높았다. 모든 그룹에서, IL4 및 IL5은 검출 한계 이하였으며, 일부 IL12p70 및 IL10가 측정되었다(데이터 나타내지 않음). 추가적으로, 다색 유동 세포분석법에 의한 폐 세포의 분석은 지속적인 감염 동안 대부분 사이토카인-생산성 CD4 T 세포를 드러냈다(도 8B). IFNγ만을 분비하는 CD4 T 세포가 유사한 빈도로 모든 그룹에서 검출되었다. 백신접종시, 상이한 조합에서 IL2, IFNγ, TNFα 또는 IL17를 생산하는 CD4 T 세포가 또한 검출될 수 있었다. 매우 흥미롭게도, 상청액에서 IL2 및 TNFα의 더 높은 농도에도 불구하고, 반응성 CD4 T 세포의 빈도는 rBCG와 pBCG 사이에서 유의미한 차이가 없었다. 본 발명자들은 두 백신 모두가 더 강한 사이토카인 생산자가 되는, rBCG-유도된 T 세포에 의한 지속적인 MTB 감염 동안 폐에서 항원-특이적 CD4 T 세포의 빈도를 증가시켰음을 추측한다. CD8 T 세포는 모든 그룹에서 대등한 빈도로 IFNγ를 거의 독점적으로 분비하는 반면, rBCG 그룹에서는 유의미하게 더 높은 단일 TNFα- 생산성 CD8 T 세포가 검출되었다. 다기능성 CD8 T 세포는 간신히 배경 이상인 것으로 나타났다(도 9).
백신접종은 IL22 생산을 야기하지만 IL21 생산은 야기하지 않는다.
Th17 세포는 IL21(15) 및 IL22(16)과 같은 추가적인 작용기 사이토카인을 생산할 수 있다. IL22-생산성 세포는 TB 환자에서 동정되었지만, 이들은 IL17-생산성 세포와 완전히 다른 것으로 보인다(17). 본 발명자들은 백신접종 후에 MTB-감염된 마우스로부터의 비장 또는 폐 세포의 PPD에 의한 자극 이후에 IL21을 검출하지 못했다(도 10A). IL22는 rBCG-면역접종된 마우스에서 20시간 동안 PPD로 자극된 비장세포에 의해 상승된 농도로 생산되었지만(도 10B), MTB에 의한 감염 이후 초기에 추가적으로 증가하지 않았다. 폐 세포에 의한 IL22 생산은 rBCG-백신접종된 그룹에서만 관찰되었고, 에어로솔 MTB 감염 이후 감소하였다.
복강내 rBCG 는 APC 집단의 유의미한 변형없이 γδ T 세포 및 NK 세포의 증가된 동원을 야기한다.
본 발명자들은 rBCG에 의한 면역접종 이후 우선적인 Th17 세포 유도에 잠재하는 기전을 정의하고자 한다. 이를 위해, rBCG 및 pBCG를 i.p. 투여하고, 이주 세포를 투여 이후 5시간째 및 6일째에 복막강으로부터 분리시켜 유동 세포분석법으로 분석하였다(도 11A). 호중구(Gr1HI, CD11bHI, MHCII-, CD11c-로서 정의됨)는 빠르게 복막강으로 진입하고, 유사한 정도로 pBCG 및 rBCG 그룹에서 p.i. 6일째에 상승된 채로 잔존한다. 잔류성 복막 대식세포(CD11bHI, F4/80HI, Gr1-, MHCIIHI, CD11c-로서 정의됨) 및 수지상 세포(CD11c+, CD11bLO, Gr1-)의 빈도는 낮은 비율로 변화없이 잔존한다. 요약하면, rBCG 및 pBCG 그룹 사이에서 어떠한 유의미한 차이도 검출되지 않았다.
백신접종 이후 5시간째 수확한 복막 세포를 αCD3/αCD28 항체를 이용한 폴리클론성 자극(도 11B)에 적용하였다. CD4 T 세포 및 NK 세포의 빈도는 IFNγ 및 IL17 생산에서와 같이 모든 그룹 사이에서 대등하였다. 투여 이후 6일째에, 이들 세포는 계수적으로 증가하였고, rBCG 그룹에서 가장 높은 빈도에 도달하였다(도 11C). PPD를 6일째 시점에서 세포의 재자극을 위해 사용하였다. CD4 T 세포는 주목할만한 양의 IFNγ 또는 IL17을 생산하지 않았던 반면, 상당한 비율의 NK 세포가 rBCG 투여 이후에 IFNγ를 생산하였다. γδ T 세포는 TB에서 초기 IL17의 주요한 근원으로서 확인되었다(18). 유의미하지는 않더라도, IFNγ를 생산하는 γδ T 세포의 증가된 비율을 rBCG에 의한 감염 후 5시간째에 확인하였다. 이 세포 집단은 추가적으로 증가하였고 IL17을 생산하는 γδ T 세포의 현저하게 더 높은 빈도가 감염 이후 6일째에 rBCG 그룹에서 검출되었다. CD8 T 세포는 어떤 그룹에서 복막에서도 검출되지 않았다. 본 발명자들은 복막세척액의 멀티플렉스 분석에 의해 복막강에 존재하는 사이토카인 및 케모카인을 분석하였다(도 11D). MCP-1, MIP1α, G-CSF 및 KC는 감염시 빠르게 증가하였으며; 에오탁신의 수준은 변화없이 잔존하였고, IL12p40은 6일째 이후 더 높은 농도로 검출되었다. IL12p70, IFNγ, IL1a, IL2, IL3, IL4, IL5, IL10, IL17, GM-CSF, 및 TNFα 농도는 검출 한계 이하였던 반면, IL1β, IL6, IL9, IL13, MIP1β 및 RANTES는 검출할 수 있었으나, 생산은 rBCG 및 pBCG 사이에서 대등하였다. 따라서, rBCG 및 pBCG는 APC의 동원 뿐만 아니라, 유사한 정도로 투여 부위에서 케모카인 및 사이토카인 생산을 유도하였다. 매우 흥미롭게도, IL17을 분비하는 γδ T 세포 및 IFNγ를 생산하는 NK 세포의 비율은 rBCG 투여 이후 가장 높았다.
rBCG 에 의한 백신접종은 인간에서 IL17 -생산성 세포를 생성하였다.
마지막으로, 본 발명자들은 IL17 생산이 rBCG-백신접종된 연구 참여자에서 증가하였는지 여부에 대한 정보를 얻기 위해 임상 제I상 시험의 건강한 인간 지원자로부터의 PBMC를 분석하였다. 지원자로부터 혈액을 rBCG 또는 pBCG에 의한 면역접종 이후 28일째에 취하였고, PBMC를 분리하여 냉동하였다. PBMC를 해동하고, 밤새 정치시킨 후, PPD로 20시간 재자극하였다. 사이토카인 생산은 멀티플렉스 분석에 의해 분석하였다. IL17 생산은 rBCG에 의해 면역접종된 연구 참여자로부터의 PBMC에서 대개 검출되었다(도 12). 제한된 수의 샘플만 이용가능하였음을 언급한다.
논의
방어의 면역 마커의 동정은 신규한 TB 백신의 합리적인 설계를 위해 중요하다. 이들 마커는 TB 백신 효능 시험에서 임상적 결과의 종점을 예상하기 위한 대리 마커의 정의를 위한 기초를 또한 확립할 수 있었으며, 이에 따라 현재 백신 후보자의 개선을 위한 가이드라인을 제공한다. IFNγ(21) 및 TNFα(22)를 포함하는 대식세포 항마이코박테리아 능력을 활성화시키는 핵심 사이토카인의 중요성, 및 기억 세포(23)의 팽창에서 IL2에 대한 필요성은 잘 확립되어 있으며, 이에 따라 TB 백신 시험을 모니터링하는데 통상적으로 사용되었다.
백신 효능의 바이오마커 동정을 위한 노력에서, 본 발명자들은 이의 모 균주인 pBCG에 비해 더 우수한 방어를 부여하는 것으로 증명된 rBCG에 의해 유발된 장기간 기억 면역 반응을 비교하였다. 반응은 정량 및 정성적 측면(term) 모두에서 상이하였다. 본 발명자들은 폐에서 rBCG에 의한 백신접종 이후에 유형 1 사이토카인 뿐만 아니라 IL17의 증가된 과다를 검출하였다(도 2A). 폐에서 백신-유도된 면역 반응의 분석은 임상 시험의 맥락에서 실현가능성이 명백하지 않다. 그러므로, 본 발명자들은 또한 전신성 장기간 반응을 분석하였다(도 2B). 매우 흥미롭게도, 사이토카인을 지시하는 유형-1의 대등한 농도를 pBCG 및 rBCG 그룹에서 검출하였다. 대조적으로, 비장세포에 의한 IL17 생산은 rBCG 백신접종시 유의미하게 상승하였다. 따라서, 본 발명자들은 IFNγ 또는 IL2에 비해 IL17이 rBCG에 의해 유도된 더 우수한 방어의 마커로서 자격이 있는 것으로 결론을 내린다.
Th17 세포는 IL17에 반응하여 동원되는 제1 세포들 중의 하나인 호중구를 유인하고 활성화시킴으로써(24) 항세균성 방어에 공헌한다. IL17은 일차성 MTB 감염 동안 불필요하지만(25,26), 기억반응에서 중요한 것으로 나타났다(13). 추가로, 인간 Th17 세포 상의 CCR6 발현에 대한 최근의 보고(27,28)는 양성 피드백(feedback) 루프(loop)를 가리키는데, 이는 CCR6이 호중구에 의해 생산된 CCL20에 대한 수용체이고(29), CCL20-CCR6이 TB의 면역발병에 관여하였기 때문이다(30). 따라서, Th17 세포는 세균 주거 부위로 항원-특이적 기억 T 세포의 가속화된 동원을 가능하게 하였다. MTB에 의한 에어로솔 감염 이후 7일째 백신-유도된 면역 반응을 분석함으로써, 본 발명자들은 rBCG에 의한 백신접종이 세균성 복제 부위로 효과기 세포 동원의 가속화를 실제로 유도함을 보여준다. 본 발명자들은 항원-특이적 CD4 T 세포의 증가된 빈도 및 폐(도 3) 및 비장 세포(도 4)에 의한 IL2, IL17, IFNγ 및 GM-CSF의 상승된 생산을 관찰하였다.
IL2, IFNγ 및 TNFα을 공동-생산하는 다기능성 CD4 T 세포는 일차적으로 레슈마니아 메이저(Leishmania major)(14), 그리고 이후에 또한 MTB(31)에 대한 성공적인 백신접종 전략에 포함되었다. 최근에, 이들 다기능성(polyfunctional) CD4 T 세포가 또한 TB 백신 임상 시험에서 검출되었다(32,33). 본 발명자들은 rBCG 및 pBCG 백신접종 및 후속적인 감염시 다기능성 CD4 T 세포를 검출하였다(도 3 및 4); 그러나 이중- 및 삼중-생산자에서 사이토카인의 조성(IL2, IL17, IFNγ 및 TNFα)은 실험간 뿐만 아니라 개개의 동물 사이에서 상당히 다양하였다. 다기능성 세포가 방어와 실질적인 관련이 있는 경우, 이들의 조성 보다는 rBCG 그룹에서 더 높았던 이들의 전체 빈도가 가장 관련 있는 것으로 보인다.
rBCG가 Th17 반응을 유도하였던 이유는 무엇일까? rBCG 및 pBCG에 의한 면역접종은 유사한 정도로 APC 뿐만 아니라 케모카인 및 사이토카인 생산자의 동원을 야기하였다. 매우 흥미롭게도, IL17을 분비하는 γδ T 세포 및 IFNγ을 생산하는 NK 세포의 비율은 rBCG 백신접종 이후 아주 높았다. 이는 IL17이 γδ T 세포(34,18) 뿐만 아니라 NKT(35) 세포에 의해 빠르게 생산될 수 있음을 보여주는 보고와 일치하는 것이다. rBCG에 의한 백신접종시 또한 증가되었던 NK 세포는 초기 IFNγ의 중요한 근원이다. 본 발명자들은 rBCG로부터 방출된 상이한 분자 구성성분이 감염된 대식세포의 세포질 내에 존재함을 이미 보여주었다(12). Nod-2는 중요한 세포질 PRR이고, 이의 관여는 Th17 기억 T 세포 반응의 발달과 연관이 있었다(19).
세균 감염 동안에 유도된 아폽토시스는 Th17 세포를 유도한다(36). 본 발명자들은 rBCG가 pBCG와 비교할 때 증가된 아폽토시스를 유도하며(12), 이는 Th17 세포의 증가된 발달에 추가로 공헌할 수 있다는 증거를 획득하였다. 염증조절복합체(inflammasome)의 활성화는 IL1β의 생산을 통한 Th17 기억 반응에 또한 공헌할 수 있었다(37). 예를 들면, NLRP3은 ATP 수준에서의 변화를 통해 리스테리오리신의 존재를 감지할 수 있음이 밝혀졌다(38). 따라서, rBCG 백신접종시 Th17 세포의 유도는 세포내 자극 및 증가된 아폽토시스의 복합적인 상호작용을 필요로 할 수 있다.
Th17 세포는 성공적인 백신접종에 대하여 유익하다기 보다는, 염증 및 자가면역 질환, 예컨대 콜라겐-유도된 관절염(39), EAE (40, 39) 및 알레르기성 기도 과민반응(41,39)에 있어서 중요한 것으로 고려된다. 이러한 병원성 역할은 보통 깊은 IL21-매개 염증 반응의 발달과 관련이 있다. 본 발명자들은 어떤 실험에서도 백신접종 및 후속적인 MTB 감염 이후에 배경 수준 이상의 IL21을 검출하지 못했다(도 10A). 추가로, 본 발명자들은 rBCG에 의한 백신접종시 감염 부위 및 MTB 감염 후 200일째 이전의 폐에서도 자가 면역 또는 과다 염증의 징후를 관찰하지 못했다.
마우스에서 실험적인 TB로부터의 결과와 인간에서의 데이터를 비교하기 위한 첫번째 시도에서, 본 발명자들은 rBCG 및 pBCG를 사용한 제I상 임상 시험으로부터 냉동된 PBMC의 사이토카인 프로파일을 분석하였다. 제한된 수의 샘플에서, 본 발명자들은 rBCG 백신접종 후 IL17 생산을 검출하였으나, pBCG 백신접종 후에는 검출하지 못했다. Th17 세포를 MTB-감염된 인간의 말초 혈액에서 검출하였다(17). 최근에, Ag85A를 발현하는 변형된 백시니아 바이러스 안카라로 구성된 TB 백신 후보자에 의해 백신접종된 청소년에서 IL17-생산성 CD4 T 세포가 보고되었다(33). 반응은 백신접종 후 7일째 및 28일째 사이에서 피크에 도달했으며, 이후 감소하였다. 이는 rBCG 그룹에서 백신접종 후 29일째에 상승된 IL17 생산을 보여주는 본 발명자들의 데이터와 일치하는 것이다(도 12). 따라서, TB 백신 시험에서 방어의 연관자로서 IL17을 제안하고자 한다.
요약하면, 본 발명자들은 rBCG에 의한 백신접종이 Nod-2에 의한 세균성 구성성분의 세포내 인식에 의존적일 것 같은 Th17 세포의 우선적인 생성을 유도함을 보여준다. 이들 Th17 세포는 폐로의 항원-특이적 T 세포의 동원을 차례로 가속화시킨다. 결론적으로, 이러한 연쇄반응 사례는 MTB의 조기 봉쇄로 인해 pBCG에 비해 rBCG에 의한 더 우수한 방어를 초래한다. 본 발명자들은 제I상 임상 시험을 성공적으로 완료한 rBCG-백신접종된 지원자들로부터 PBMC에 의한 독점적인 IL17 생산을 검출하였다. IL17가 MTB 복제 부위로의 항원-특이적 T 세포의 가속화된 동원에 중요한 것 같기 때문에, 미래의 TB 백신은 균형잡힌 Th1 및 Th17 반응의 유도를 수반하도록 맞춤되어야 한다.
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Claims (13)

  1. 백신접종된 개체에서 Th17 면역 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 백신의 효능을 측정하기 위한 방법으로, 여기서 검출가능한 Th17 면역 반응이 상기 개체에서 방어 면역을 나타내는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 백신은 생백신, 특히 마이코박테리아 생백신인 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 백신은 (a) 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 도메인 및 (b) 포식리소좀 탈출 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 재조합 마이코박테리움인 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 마이코박테리움이 우레아제-결핍성인 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 마이코박테리움이 rBCG△UreC :: Hly+ :: Hyg+인 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 백신이 서브유닛 백신인 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 백신은 마이코박테리아 감염, 특히 폐 마이크로박테리아 감염, 더욱 특히 결핵에 대한 백신인 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Th17 면역 반응을 측정하는 단계가 상기 백신접종된 개체로부터의 면역 세포를 포함하는 샘플을 상기 백신 내의 면역원에 상응하는 면역원으로 재자극시키고 상기 샘플에서 Th17 면역 반응 관련 세포의 존재 및/또는 양을 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Th17 면역 반응을 측정하는 단계가, 예컨대 면역학적 방법에 의해 IL17을 측정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 개체는 포유동물, 예컨대 인간인 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, Th17 면역 반응은 백신접종 이후 20-50일째 측정된 것인 방법.
  12. (a) 이전에 백신접종된 개체로부터의 면역 세포를 재자극하기 위한 시약, 및 (b) Th17 면역 반응을 검출하기 위한 시약을 포함하는, 백신의 효능을 측정하기 위한 시약 키트.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에서 제12항의 시약 키트의 용도.
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