CN103492877B - 抗-分枝杆菌疫苗接种的功效的确定 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及测定疫苗,特别是结核疫苗的功效的方法和试剂。
Description
【技术领域】
本发明涉及测定疫苗,特别是结核疫苗的功效的方法和试剂。
【背景技术】
每年,达2百万人死于结核(TB)(1)。针对TB唯一可利用的疫苗是牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)卡介苗(BCG),其在1921年首次用于人(2)。至今,已施用四十亿剂量的BCG,致使其成为世界上最广泛使用的人疫苗(3)。但是,我们仍远未达到达到TB的根除。BCG疫苗接种在婴儿中预防结核性脑膜炎和粟粒性TB(4)。但是,针对其他形式的TB,尤其是青少年和成年中的肺部TB的保护是非结论性的,如由元分析强调,其揭示成年中0~80%的保护性功效(5)。因此,迫切地需要针对TB的新疫苗。目前,临床试验中针对TB的新疫苗接种策略包括重组BCG以取代规范BCG以及亚单位疫苗和基于非复制病毒载体的疫苗以追加BCG引发(6)(7)。
成为保护的基础的免疫学机理的鉴定可辅助用于TB防止的新疫苗接种策略的合理的设计。而且,此策略可揭示指示保护性免疫的生物标记,其可揭示临床TB疫苗功效试验中临床结果的标志物,由此减少它们的持续时间以及辅助在平行试验中测试更大量的疫苗候选体。聚焦于新感染的,TB患者的健康接触及聚焦于BCG-免疫接种的婴儿的观察研究已起始定议该生物标记(8)。尽管对于针对TB的免疫应答,保护性记忆的根本性的元件的进一步研究仍待阐明。在BCG疫苗接种之后,由于缺乏免疫显性抗原而抗原-特异性记忆CD4T细胞难以检测。目前,最广泛使用的生物标记基于产生IFNγ的CD4T细胞的升高的频度。增加的证据拷问IFNγ作为TB中保护的关联的价值(9,10)。毋庸置疑地IFNγ在针对MTB的防御中起到关键的作用(11),但单独IFNγ的测定可不再被认为是保护性免疫的可靠的标志物。
表达吞噬溶酶体逃逸结构域的重组BCG株描述于WO99/101496,其内容通过引用在本文合并。吞噬溶酶体逃逸结构域致使所述株自感染的宿主细胞的吞噬体通过穿孔吞噬体的膜逃逸。为了提供对于最佳吞噬溶酶体逃逸活性的酸性吞噬体pH,开发了脲酶-缺陷型重组株。此株公开于WO2004/094469,其内容通过引用在本文合并。
在临床前模型中,相比亲本BCG(pBCG),表达单核细胞增多性利斯特菌(Listeria monocytogenes)的膜-穿孔利斯特菌溶血素(Hly)和缺乏脲酶C的重组ΔureC Hly+rBCG(rBCG)株诱导抵御用MTB产气攻击的更优保护(12)。此疫苗构建体在I期临床试验中成功地证明了安全性和免疫原性(US61/384,375),其内客通过引用在本文合并。
在本研究中,显示rBCG和pBCG诱导显著的Th1免疫应答,而更显示仅rBCG引发是深刻的Th17应答。也观察到在rBCG-免疫接种的小鼠的MTB感染后抗原-特异性T淋巴细胞向肺的更早募集。这些T细胞在再刺激之后产生丰富的Th1细胞因子。rBCG的更优保护性功效明显依赖于IL17。也在I期临床试验期间在健康自愿者中检测到在rBCG疫苗接种之后,但不是pBCG疫苗接种之后提升的IL17产生。我们的发现将通用的免疫学通路鉴定为用于针对TB的改善的疫苗接种策略的标志物,其也可由亚单位疫苗候选体探索。
【发明内容】
本发明的主题是测定疫苗功效的方法,包括测定免疫接种的受试者中的Th17免疫应答,其中Th17免疫应答的存在指示所述受试者中的保护性免疫。
本发明的再一方面是测定疫苗功效的试剂盒,其包含至少一种检测Th17免疫应答的试剂。
在优选的实施方式中,疫苗是活疫苗,特别是分枝杆菌属(Mycobacterium)细胞。在甚至更优选的实施方式中,疫苗是重组分枝杆菌属(Mycobacterium),其包含编码融合多肽的重组核酸分子,所述融合多肽包含(a)能引发免疫应答的结构域及(b)吞噬溶酶体逃逸结构域。能引发免疫应答的结构域优选是来自病原体的免疫原性肽或多肽或其免疫原性片段。在进一步实施方式中,疫苗是亚单位疫苗,即疫苗包含自病原体纯化的抗原或其免疫原性片段,特别是重组抗原或其免疫原性片段。在仍进一步实施方式中,疫苗是基于灭活的全病原体细胞或细胞级分的疫苗。
分枝杆菌属(Mycobacterium)细胞优选是牛分枝杆菌(M.bovis)细胞,结核分枝杆菌(M.tuberculosis)细胞,特别是减毒的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)细胞或其他分枝杆菌属(Mycobacterium),例如田鼠分枝杆菌(M.microti),耻垢分枝杆菌(M.smegmatis),卡耐提分枝杆菌(M.canettii),海分枝杆菌(M.marinum)或偶发分枝杆菌(M.fortuitum)。更优选地,细胞是重组牛分枝杆菌(M.bovis)(BCG)细胞,特别是来自丹麦亚型布拉格株的重组牛分枝杆菌(M.bovis)细胞(43)。在尤其优选的实施方式中,疫苗是重组脲酶-缺陷型分枝杆菌属(Mycobacterium)细胞。在尤其优选的实施方式中,将分枝杆菌属(Mycobacterium)细胞的ureC序列灭活(ΔUrec),例如通过构建含有被选择标记物基因破坏的ureC基因的自杀载体,用所述载体转化靶细胞及筛选具有脲酶阴性表型的选择标记物-阳性细胞。最优选,细胞是表征为rBCGΔUrec::Hly+::Hyg+的重组BCG株丹麦亚型布拉格。
能引发免疫应答的结构域优选选自来自牛分枝杆菌(M.bovis)或结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的免疫原性肽或多肽或选自具有至少6个,优选至少8个氨基酸,更优选至少9个氨基酸和例如达20个氨基酸长度的其免疫原性片段。适合的抗原的特定例是自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的Ag85B(p30),自牛分枝杆菌(M.bovis)BCG的Ag85B(α-抗原),自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的Ag85A及自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的ESAT-6及其片段。
疫苗优选是针对分枝杆菌感染,特别是肺部分枝杆菌感染,更特别是结核的疫苗。
根据本发明的方法,测定免疫接种的受试者中的Th17免疫应答。受试者优选是哺乳动物,例如人。测定优选在源于所述受试者的生物学样品中实施,其中所述样品包含免疫细胞,特别是T细胞和/或NK细胞,更特别是抗原-特异性T细胞诸如CD4T细胞。样品可为体液或组织样品,例如血,血清或血浆样品或自肺或脾脏的样品。收集样品的方法为本领域所熟知。
本发明的方法需要确定Th17免疫应答。为此目的,优选用免疫原再刺激待分析的受试者的样品中存在的免疫细胞及测定从所述细胞的细胞因子表达。待分析的细胞优选是抗原-特异性T细胞,更优选CD4T细胞。用于再刺激的免疫原对应于疫苗中存在的免疫原(待测定其功效)。免疫原可以与疫苗中存在的形式相同的形式或以不同形式存在。例如,当疫苗包含免疫原性多肽时,在再刺激步骤中免疫原可包含其免疫原性片段或反之亦然。优选地,用于再刺激步骤的免疫原是纯化的多肽或肽。为了测试结核疫苗的功效,特别是上述活结核疫苗,免疫原可有利地为分枝杆菌抗原,例如自PPD"纯化的蛋白衍生物"选择的,其是分枝杆菌的甘油提取物或Ag85A和Ag85B,以及其他分枝杆菌抗原和其免疫原性片段(诸如以上描述的)。
柜据本发明测定Th17应答可包括利用所述细胞中存在的和/或由所述细胞分泌的表面标志物和/或细胞因子测定与Th17应答关联的细胞,例如IL-17产生细胞。表面标志物的例是CD4,CD8,IL-23R,CCR4和/或CCR6。该细胞中存在的和/或由该细胞分泌的细胞因子的例是IL-17,IL-21,IL-22,IL-23,IFN-γ和其组合。优选地,细胞因子是IL-17。该细胞可通过细胞学方法,例如由细胞分选技术使用可携带标记,例如荧光基团的免疫学检测试剂诸如特异于细胞-表面标志物和/或细胞因子的抗体来测定。
更优选地,与Th17免疫应答关联的细胞是例如产生及任选地分泌IL-17的CD4T细胞。
在进一步实施方式中,测定Th17免疫应答包括测定从Th17免疫应答关联的细胞分泌的细胞因子,例如IL-17。细胞因子可通过免疫学方法使用适当的抗体,例如针对IL-17的抗体测定。
在本发明的方法中,在疫苗接种之后适合的时间测定Th17免疫应答。例如,免疫应答可在疫苗接种之后20~50天,特别是25~35天测定。
本发明也涉及测定疫苗功效的试剂盒,特别是在上述方法中使用的试剂盒。试剂盒包含适合于再刺激来自已免疫接种的受试者的样品中存在的免疫细胞的免疫原。进一步试剂盒包含至少一种如上所述的适合于检测Th17免疫应答标志物的试剂。试剂可例如选自细胞学和/或免疫学检测试剂,例如针对对于Th17免疫应答关联的细胞特征性的细胞标志物的抗体和/或特异于与Th17免疫应答关联的细胞因子,特别是IL-17和/或IL-22的免疫学试剂。检测区可携带可检测基团,例如荧光标记基团。
而且,本发明由以下图和实施例更详细描述。
【附图说明】
图1:WT小鼠中的MTB负荷。腹膜内免疫保护免于p.i.90天用MTB感染(A)。细菌负荷是在p.i.第7天在免疫接种的及非-免疫接种的组之间可比较的(B)。在用400CFU MTB气雾剂感染之后肺和脾脏中的CFU测定。将心脏肺叶(全器官的大致71/10)或半个脾脏均质化;余下物质用于体外再刺激测定。统计学意义由具有2-尾的P值的Mann-Whitney测试测定。*,P<0.05;**,P<0.01。数据是具有近似结果的3次实验的代表。
图2:相比pBCG疫苗接种,在rBCG疫苗接种之后的更优细胞因子诱导。用rBCG或pBCG皮下疫苗接种后83天在肺(A)和脾脏(B)中的应答。将总2.5×105(肺)或2×106细胞(脾脏)用PPD再刺激20小时并将上清液由多重测定分析。细胞因子浓度以4次每次实验3个重复的独立实验的平均值±SEM描述。减去自培养基对照产生的背景细胞因子。ANOVA和Bonferroni多比较测试应用于统计学分析。*,P<0.05;**,P<0.01。
图3:用rBCG疫苗接种加速在用MTB气雾剂感染之后抗原-特异性T细胞向肺的募集。在用200~400CFU MTB气雾剂感染之后7天由肺细胞的细胞因子分泌。将总2×105细胞用PPD刺激20小时,并将上清液由多重测定分析(A)。细胞因子浓度以2次每次实验3个重复的独立实验的平均值±SEM表示。减去自培养基对照产生的背景细胞因子。将在布雷菲德菌素A的存在下用PPD再刺激6小时的细胞由多色流式细胞术分析(B)。应答CD4T细胞的频度以3次每次实验3个重复的独立实验的平均值±SEM表示。ANOVA和Bonferroni多比较测试应用于统计学分析。*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001。
图4:用rBCG疫苗接种增加在用MTB气雾剂感染之后脾脏中的PPD-特异性应答。在用200~400CFU MTB气雾剂感染之后7天由脾脏细胞的细胞因子分泌。将总2×106细胞用PPD再刺激20小时,并将上清液由多重测定分析(A)。细胞因子浓度以4次每次实验3个重复的独立实验的平均值±SEM表示。减去自培养基对照产生的背景细胞因子。将在布雷菲德菌素A的存在下用PPD再刺激6小时的细胞由多色流式细胞术分析(B)。应答CD4T细胞的频度以3次每次实验3个重复的独立实验的平均值±SEM表示。ANOVA和Bonferroni多比较测试应用于统计学分析。*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001。
图5:用pBCG或rBCG疫苗接种不导致Treg细胞群中的显著变化。用rBCG或pBCG皮下免疫之后脾脏中的Treg细胞。黑条表示CD25+FoxP3+和白条表示CD25-FoxP3+细胞。在免疫(A和B)之后83天以及在用200~400CFU MTB气雾剂感染之后7天(C和D)或90天(E和F)CD4T细胞和CD8Treg细胞的频度。3小鼠/组,以平均值±SEM表示。数据是具有近似结果的3次独立实验的代表。
图6:在疫苗接种和随后用MTB气雾剂感染之后肺中产生细胞因子的CD8T细胞的频度。在用200~400CFU MTB气雾剂感染之后7天的细胞因子分泌。将在布雷菲德菌素A的存在下用PPD再刺激6小时的细胞由多色流式细胞术分析。应答CD8T细胞的频度以2次每次实验3个重复的独立实验的平均值±SEM表示。ANOVA和Bonferroni多比较测试应用于统计学分析。
图7:在疫苗接种和随后用MTB气雾剂感染之后脾脏中产生细胞因子的CD8T细胞的频度。在用200~400CFU MTB气雾剂感染之后7天的细胞因子分泌。将在布雷菲德菌素A的存在下用PPD再刺激6小时的细胞由多色流式细胞术分析。应答CD8T细胞的频度以4次每次实验3个重复的独立实验的平均值±SEM表示。ANOVA和Bonferroni多比较测试应用于统计学分析。*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001。
图8:在持续MTB感染期间在rBCG-免疫接种的小鼠中肺中的免疫应答。在用200~400CFU MTB气雾剂感染之后90天由肺细胞的细胞因子分泌。细胞用PPD再刺激20小时,并将上清液由多重测定分析(A)。细胞因子浓度以2次每次实验3个重复的独立实验的平均值±SEM表示。减去自培养基对照产生的背景细胞因子。将在布雷菲德菌素A的存在下用PPD再刺激6小时的细胞由多色流式细胞术分析(B)。应答CD4T细胞的频度以2次每次实验3个重复的独立实验的平均值±SEM表示。ANOVA和Bonferroni多比较测试应用于统计学分析。*,P<0.05;**,P<0.01。
图9:在疫苗接种和随后用MTB气雾剂感染之后产生细胞因子的CD8T细胞的频度。由在用200~400CFU MTB气雾剂感染之后90天自肺分离的细胞的细胞因子分泌。将在布雷菲德菌素A的存在下用PPD再刺激6小时的细胞由多色流式细胞术分析。应答CD8T细胞的频度以2次每次实验3个重复的独立实验的平均值±SEM表示。ANOVA和Bonferroni多比较测试应用于统计学分析。*,P<0.05。
图10:疫苗接种诱导IL22产生但不诱导IL21产生。由自在疫苗接种和随后用200~400CFU MTB气雾剂感染之后83天小鼠的脾脏的细胞(2×106细胞)或肺的细胞(2×105细胞)的IL21(A)和IL22(B)分泌。自3样品/组测量IL21浓度,以平均值±SEM表示。对于IL22,合并来自一组的样品。数据是2个(疫苗接种后第83天)和5个(p.i.第7天)近似实验的代表。细胞用PPD再刺激20小时,并上清液由ELISA分析。
图11:rBCG不显著地改变APC群地导至γδT细胞和NK细胞的增加的募集。腹膜内施用106CFU的rBCG或pBCG后细胞募集到腹膜腔。由流式细胞术的腹膜灌洗液中细胞群的分析。腹膜内施用rBCG或pBCG后5小时(上图)和6天(下图)募集到腹膜的APC(A)。注射后5小时的T细胞群的ICS(B)。将细胞在布雷菲德菌素A的存在下用αCD3/αCD28抗体刺激18小时。施用后6天T细胞群的ICS(C)。将细胞在布雷菲德菌素A的存在下用PPD再刺激18小时。数据显示为用5只小鼠/组的3次独立实验的总结。水平线指示中位。ANOVA和Bonferroni多比较测试应用于统计学分析。*,P<0.05;**,P<0.01。将在腹膜灌洗液中检测的细胞因子和趋化因子由多重测定(D)分析,以平均浓度±SEM表示。
图12:rBCG在自I期临床试验的健康自愿者的人PBMC中诱导IL17。由自I期临床研究的健康人自愿者分离的人PBMC的IL17产生。用rBCG或pBCG疫苗接种后29天分离总5×105细胞,用PPD再刺激20小时,并将上清液由多重测定分析。统计学意义由用单尾P值和Welch氏修正的Mann-Whitney测试测定。*,P<0.05;对于pBCG是n=3和对于rBCG是n=7。
【实施例】
【材料和方法】
【小鼠】
在柏林的Bundesinstitut für Risikobewertung(BfR)中饲养雌性BALB/c小鼠。小鼠在实验开始时是6~8周龄及保持在无特定病原体的(SPF)条件下。在Landesamt für Gesundheit und Soziales(LAGeSo,柏林,德国)的批准下进行动物实验。
【细菌】
之前描述了使用的MTB H37Rv和pBCG和rBCG株(12)。使细菌在补充甘油,0.05%吐温80和ADC的Middlebrook7H9肉汤中生长。收获中-对数培养物及存储于-80℃直到使用。全部浓储物在使用之前滴定。单细胞细菌悬浮液由通过具有27G针的注射器重复的转移获得。
【疫苗接种和MTB感染】
将pBCG或rBCG(106CFU)在尾根紧邻处皮下施用。用MTB的小鼠气原感染通过使用Glas-Col吸入暴露系统实施。细菌负荷由在PBS0.5%v/v吐温80中机械破坏无菌地移出的器官及在补充OADC的Middlebrook7H11琼脂板上平铺系列稀释来评定。在3周之后,对MTB集落计数。结果的统计学意义通过用于非-参数数据的2-尾的p-值的Mann-Whitney测试使用GraphPad Prism5.0测定。
【细胞分离,刺激和流式细胞术】
如之前描述纯化细胞(42)。实验组包含5只小鼠。将2个脾脏或肺合并及将一个样品个别处理,导致3样品/5只小鼠的组用于随后刺激。将细胞用50μg/ml PPD(SSI,哥本哈根,丹麦)刺激20小时而用于由多重测定的细胞因子分析或在25μg/ml布雷菲德菌素A的存在下刺激6小时而用于细胞内细胞因子染色(ICS)。使用以下抗体:CD4(RM4-5),IFNγ(XMG-1.2),IL2(JES6-5H4),Ly6G/C(RB6-8C5),CD11b(M1/70),γδ-TCR(GL-3),FoxP3染色组和CD49b(cloneDX5)全部eBioscience。将CD8α(YTS169),TNF-α(XT22),CD16/CD32(2.4G2),F4/80(CI:A3-1)和CD11c(N418)自杂交瘤上清液纯化和内部荧光标记。IL-17(TC11-18H10)从BDBiosciences得到。将细胞通过使用FACSCanto II或LSRII流式细胞仪和FACSDiva软件(BD Biosciences)分析。通过使用来自Bio-Rad的基于Bio-Plex小鼠Th1/Th2,IL17和IL6珠的免疫测定根据生产商的使用说明测量细胞因子。IL21和IL22由自R&D systems的ELISA测量。人IL17用自Millipore的Milliplex42-plex测定检测。
【腹膜灌洗】
自中-对数培养新鲜制备pBCG或rBCG。将细菌用PBS洗涤3次和通过在580nm处测量光密度来测定浓度。腹膜内实施施用106CFU。通过注射5ml PBS在5小时或6天后从腹膜腔得到募集的细胞及由流式细胞术分析。通过使用来自Bio-Rad的Bio-Plex小鼠细胞因子23-plex试剂盒测定灌洗液中的细胞因子和趋化因子。
【结果】
【在rBCG和pBCG疫苗接种之后的Th1/Th17应答】
在尝试阐明与TB疫苗功效关联的免疫机理中,我们比较了小鼠中针对rBCG和pBCG的免疫应答。在静脉内免疫后已原本测定rBCG的更优保护性功效(12)。在这里我们显示rBCG的皮下施用诱导可比较的水平的保护及保留其强于pBCG的更优功效(图1A)。接下来,我们分析了在用rBCG或pBCG皮下疫苗接种后83天小鼠的肺和脾脏中的长期记忆应答。将细胞用PPD再刺激和由多重测定分析上清液中的细胞因子。相比pBCG,用rBCG免疫诱导了由自肺分离的细胞的显著地更高细胞因子产生(图2A)。这些包括IFNγ,IL2,IL6和GM-CSF。相反,2型细胞因子IL4,IL5和IL10未增加到背景水平以上(不显示数据)。有趣地,由自rBCG-免疫接种的小鼠的肺细胞产生大致3倍更高IL17浓度。注意到可从未感染的小鼠的肺分离仅少量细胞。因而,总体细胞因子浓度少于脾脏中的浓度,其中每孔10倍更高细胞密度可用于刺激(图2B)。在脾脏中,两种疫苗引发了与由IL2,IL6,IFNγ和GM-CSF的可比较的浓度反映的等同强的Th1应答。然而,相比pBCG-免疫接种的动物,自rBCG-免疫接种的小鼠的脾脏细胞在用PPD再刺激后产生了显著地更多IL17。由此,用rBCG免疫,而非pBCG,在肺和脾脏中诱导了相伴的和强的Th1和Th17应答,其持续延长的时间。
【在rBCG-免疫接种的小鼠中用强毒MTB感染之后MTB-特异性T细胞的加速的募集】
Th17细胞已关联到改善的免疫监督(13)。我们比较了用强毒MTB气雾剂感染之后在免疫接种的动物中,在感染后7天肺和脾脏中抗原-特异性T细胞应答。在用PPD(图3A)或Ag85A肽(数据未显示)再刺激之后20小时检测到由来自rBCG-免疫接种的小鼠的肺细胞的显著的IFNγ,IL17,IL2和GM-CSF产生。相反,这些细胞因子极罕由来自pBCG-免疫接种的小鼠的细胞分泌。在用MTB感染的非-免疫接种的动物中,细胞因子产生在检测限以下,与MTB-特异性T细胞在MTB感染后3周之前不呈现的之前报道一致(13)。在此MTB攻击后早期时间点未检测到2型细胞因子IL4,IL5和IL10,且TNFα,IL12p70和IL6仅极罕在背景水平以上(数据未显示)。
我们在MTB感染后7天由流式细胞术测定由肺T细胞的细胞因子产生(图3B)。将细胞用PPD刺激6小时,之后是对IL2,IL17,IFNγ和TNFα的细胞内细胞因子染色。在非-免疫接种的对照中,小比例的CD4T细胞产生IL2,TNFα或IFNγ。在免疫接种的小鼠中,CD4T细胞分泌了IL2,IFNγ,TNFα和也IL17。在rBCG组中单细胞因子产生细胞的频度最高,尽管不显著。在免疫接种的动物中,我们检测了牵涉保护性免疫的多功能T细胞(14)。多细胞因子-产生T细胞主要是IL2+TNFα+双生产者和在rBCG疫苗接种后显著地增加。三-生产细胞几乎唯独是IL2+IFNγ+TNFα+和相比pBCG-免疫接种的小鼠,在rBCG-免疫接种的小鼠中稍微增加。而且,IL2+TNFα+IFNγ+IL17+四重-阳性细胞在rBCG组中唯独呈现,尽管以非常低频度呈现。
原理上,脾T细胞产生了与肺部T细胞类似的细胞因子模式(图4)。相比pBCG组,在rBCG-免疫接种的动物中IL2和GM-CSF产生显著地更高,及在非-免疫接种的对照中在检测水平以下,即使在非-免疫接种的对照中,小百分率的CD4T细胞产生IFNγ。总之,相比pBCG组,在rBCG-免疫接种的小鼠中用pBCG或rBCG疫苗接种诱导具有单和多-生产者的更高频度的分泌IFNγ和TNFα的CD4T细胞。
在p.i.7天CD4T细胞是主要细胞因子生产者;尽管具有类似模式,检测到CD8细胞因子生产者在肺(图6)和脾脏(图7)中具有更低频度。需注意,在rBCG组中检测到显著地更高频度的TNFα-单产生CD8T细胞。
生产细胞的差异细胞因子产生和频度不是由于在感染之后在此早期时间点的不同细菌负荷,如由肺和脾脏中可比较的集落形成单位(CFU)数确认(图1B)。在2个免疫接种的组中在感染后Treg细胞总数增加到可比较的程度(图5)。
【用rBCG疫苗接种在持续感染期间赋予有力的免疫应答】
我们在当肺细菌负荷相比pBCG组而在rBCG-免疫的动物中大致10倍更低和相比非-免疫接种的对照组而在rBCG-免疫的动物中100倍更低时分析了p.i.90天的MTB-特异性免疫应。将来自免疫接种的小鼠的肺的细胞及未处理的对照用PPD再刺激20小时,并由多重测定测量细胞因子浓度(图8A)。再刺激后检测的细胞因子主要是1型。但是,我们在持续感染期间在IFNγ或IL17免疫接种的组之间无法检测到差异。相反,IL2,IL6,GM-CSF和TNFα的量在rBCG-免疫接种的小鼠中更高。在全部组中,IL4和IL5在检测限以下并测量一些IL12p70和IL10(数据未显示)。此外,由多色流式细胞术的肺细胞分析主要揭示持续感染期间产生细胞因子的CD4T细胞(图8B)。在全部组中检测到分泌仅IFNγ的CD4T细胞具有类似频度。疫苗接种之后,也可检测到以不同组合产生IL2,IFNγ,TNFα或IL17的CD4T细胞。有趣地,应答CD4T细胞的频度在rBCG和pBCG疫苗接种之间未显著地不同,尽管上清液中更高浓度的IL2和TNFα。我们推定在用成为更有力的细胞因子生产者的rBCG-诱导的T细胞持续MTB感染期间两种疫苗增加了肺中抗原-特异性CD4T细胞的频度。在全部组中CD8T细胞以可比较的频度几乎唯独分泌IFNγ,然而在rBCG组中检测到显著地更高的单TNFα-产生CD8T细胞。多功能CD8T细胞呈现极罕在背景以上(图9)。
【疫苗接种导致IL22而非IL21产生】
Th17细胞可产生另外的效应子细胞因子诸如IL21(15)和IL22(16)。已在TB患者中鉴定IL22-产生细胞,但这些似乎不同于IL17-产生细胞(17)。我们在用来自免疫接种的及随后MTB-感染的小鼠的脾脏或肺细胞的PPD刺激之后未检测到IL21(图10A)。在rBCG-免疫的小鼠中由用PPD刺激20小时的脾细胞以提升的浓度产生IL22(图10B),但在用MTB感染之后早期未进一步增加。仅在rBCG-免疫接种的组中观察到由肺细胞的IL22产生及在气雾剂MTB感染之后降低。
【腹膜内rBCG不显著地改变APC群地导至γδT细胞和NK细胞的增加的募集】
我们想要定义成为在用rBCG免疫之后优先Th17细胞诱导的基础的机理。为此,腹膜内施用rBCG和pBCG,在施用之后5小时或6天自腹膜腔分离迁移细胞及由流式细胞术分析(图11A)。嗜中性粒细胞(定义为Gr1HI,CD11bHI,MHCII-,CD11c-)快速进入腹膜腔及在p.i.第6天在pBCG和rBCG组中保持升高到相同的程度。定居性腹膜巨噬细胞(定义为CD11bHI,F4/80HI,Gr1-,MHCIIHI,CD11c-)和树突细胞(CD11c+,CD11bLO,Gr1-)的频度以低百分率保持不变。总之,rBCG和pBCG组之间未检测到显著差异。使在疫苗接种之后5小时收获的腹膜细胞经历用αCD3/αCD28抗体的多克隆刺激(图11B)。CD4T细胞和NK细胞的频度在全部组之间可比较,如IFNγ和IL17产生。在施用之后6天,这些细胞数字上增加及在rBCG组中达到最高频度(图11C)。将PPD用于在6天时间点细胞的再刺激。CD4T细胞未产生可察觉的量的IFNγ或IL17,而在rBCG施用之后实质性比例的NK细胞产生IFNγ。γδT细胞已被鉴定为在TB中早期IL17的主要来源(18)。用rBCG注射后5小时鉴定了尽管不显著,增加的比例的γδT细胞产生IFNγ。此细胞群进一步增加及在注射之后6天在rBCG组中检测到产生IL17的γδT细胞的显著地更高频度。在任何组腹膜中未检测到CD8T细胞。我们由腹膜灌洗液的多重测定分析了存在于腹膜腔的细胞因子和趋化因子(图11D)。注射后MCP-1,MIP1α,G-CSF和KC快速增加;嗜酸性粒细胞趋化因子水平保持未变化及在6天之后检测到更高浓度的IL12p40。IL12p70,IFNγ,IL1a,IL2,IL3,IL4,IL5,IL10,IL17,GM-CSF和TNFα浓度在检测限以下,然而IL1β,IL6,IL9,IL13,MIP1β和RANTES可测量但产生在rBCG和pBCG之间可比较。由此,rBCG和pBCG以近似程度诱导APC的募集以及在施用位点趋化因子和细胞因子产生。有趣地,分泌IL17的γδT细胞和产生IFNγ的NK细胞的比例在rBCG施用之后最丰富。
【在人中用rBCG疫苗接种产生IL17-产生细胞】
最后,我们分析了来自I期临床试验的健康人自愿者的PBMC,以询问是否IL17产生在rBCG-免疫接种的研究参与者中增加。在用rBCG或pBCG免疫之后29天从自愿者取血并将PBMC分离及冷冻。将PBMC解冻及静止过夜,之后是用PPD再刺激20小时。由多重测定分析细胞因子产生。在来自用rBCG免疫的研究参与者的PBMC中唯独检测到IL17产生(图12)。注意到有限数量的样品是可利用的。
【讨论】
免疫保护标志物的鉴定对于新TB疫苗的合理的设计是关键的。这些标志物也可建立替代品标志物的定义的基础以预测TB疫苗功效试验中临床结果的端点,由此提供改善当前疫苗候选体的指南。良好建立活化巨噬细胞抗分支杆菌能力的关键细胞因子,包括IFNγ(21)和TNFα(22)的重要性,及记忆细胞扩展中IL2(23)的必要性,由此通常用于监测TB疫苗试验。
在鉴定疫苗功效的生物标志物的尝试中,我们比较了由被证明相比其亲本株,pBCG赋予更优保护的rBCG引发的长期记忆免疫应答。应答在定量和定性术语中不同。我们检测了肺中用rBCG疫苗接种后1型细胞因子以及IL17的增加的丰度(图2A)。肺中疫苗-诱导的免疫应答的分析在临床试验情景中是明显不可行的。因此,我们也分析了系统性长期记忆应答(图2B)。有趣地,在pBCG和rBCG组中检测到可比较的浓度的类型-1导向细胞因子。相反,由脾细胞的IL17产生在rBCG疫苗接种后显著地提升。由此,我们总结,IL17,而非IFNγ或IL2,作为由rBCG诱导的更优保护的标志物合适。
Th17细胞通过吸引及活化是在待响应IL17而募集的第1细胞之中的嗜中性粒细胞(24)来贡献于抗微生物防御。已显示,IL17在主要MTB感染期间是可有可无的(25,26),但在记忆应答中获得重要性(13)。此外,对人Th17细胞上CCR6的表达的新近报道(27,28)意味着正反馈环,因为CCR6是由嗜中性粒细胞产生的CCL20的受体(29)和CCL20-CCR6已牵涉TB的免疫发病机制(30)。由此,Th17细胞可辅助抗原-特异性记忆T细胞向细菌驻留位点的加速的募集。通过分析在用MTB气雾剂感染之后7天疫苗-诱导的免疫应答,我们显示,用rBCG疫苗接种的确导致效应细胞向细菌复制位点加速的募集。我们观察到增加的频度的抗原-特异性CD4T细胞及由肺(图3)和脾脏细胞(图4)的IL2,IL17,IFNγ和GM-CSF的提升的产生。
共产生IL2,IFNγ和TNFα的多功能CD4T细胞首先牵涉针对硕大利什曼原虫(Leishmania major)的成功的疫苗接种策略(14)和随后也牵涉针对MTB的成功的疫苗接种策略(31)。最近,这些多功能CD4T细胞也在临床TB疫苗试验中检测到(32,33)。我们在rBCG和pBCG疫苗接种和随后感染后检测了多功能CD4T细胞(图3和4);但是双生产者和三生产者中细胞因子的组成(IL2,IL17,IFNγ和TNFα)在实验以及个体动物之间显著地改变。如果多功能细胞与保护真关联,则它们的总体频度,所述频度在rBCG组中更高,而非它们的组成,似乎最关联。
为何rBCG诱导Th17应答?用rBCG和pBCG免疫导致APC以及趋化因子和细胞因子生产者募集至类似程度。有趣地,分泌IL17的γδT细胞和产生IFNγ的NK细胞的比例在rBCG疫苗接种之后高度丰富。此与显示IL17可由γδT细胞(34,18)以及NKT细胞(35)快速产生的报道一致。NK细胞,其在用rBCG疫苗接种后也增加,是早期IFNγ的重要来源。我们已显示了自rBCG释放的不同分子组分在于感染的巨噬细胞的胞质溶胶(12)。Nod-2是重要细胞溶质PRR和其参与已关联于Th17记忆T细胞应答的发展(19)。
在细菌感染期间诱导的凋亡诱导Th17细胞(36)。我们获得了相比pBCG,rBCG诱导增加的凋亡的证据(12),其可还贡献于Th17细胞的增加的发展。发炎体的活化也可经IL1β产生而贡献于Th17记忆应答(37)。NLRP3例如已被发现通过ATP水平变化感知利斯特菌溶血素的存在(38)。由此,rBCG疫苗接种后Th17细胞的诱导可需要细胞内刺激及增加的凋亡的复杂相互作用。
Th17细胞被认为是炎性和自身免疫疾病诸如胶原-诱导的关节炎(39),EAE(40,39)和过敏性气道超敏反应(41,39)中的仪器而非有益于成功的疫苗接种。此病原性作用通常关联于深刻的IL21-介导的炎性应答的发展。我们从未在任何实验中检测到在疫苗接种和随后MTB感染之后IL21在背景水平以上(图10A)。此外,我们从未观察到用rBCG疫苗接种后在注射位点自身免疫或过量的发炎的迹象,也未观察到在肺中MTB感染后达200天。
在比较自小鼠中实验TB的数据和人数据的第1尝试中,我们用rBCG和pBCG分析了冷冻的自I期临床试验的PBMC的细胞因子特征。在有限数量的样品中,我们在rBCG,而非pBCG,疫苗接种之后检测到IL17产生。已在MTB-感染的人的外周血检测到Th17细胞(17)。最近,IL17-产生CD4T细胞已报道于由表达Ag85A的修饰的痘苗病毒Ankara组成的候选TB疫苗免疫接种的青少年(33)。应答在疫苗接种后第7和28天之间达峰值及然后降低。此与我们的显示在rBCG组中疫苗接种后第29天提升的IL17产生的数据一致(图12)。由此,尝试建议IL17为TB疫苗试验中的保护关联物。
总之,我们显示,用rBCG疫苗接种导致Th17细胞的优先产生,可能依赖于细菌组分由Nod-2的细胞内识别。这些Th17细胞进而加速抗原-特异性T细胞向肺的募集。最终,此事件级联导致MTB的早先防范和因此,至相比pBCG而由rBCG的更优保护。我们在成功地完成的I期临床试验中检测到唯独由自rBCG-免疫接种的自愿者的PBMC的IL17产生。由于IL17似乎是抗原-特异性T细胞向MTB复制位点加速的募集的仪器,未来TB疫苗应修饰为随之诱导平衡的Th1和Th17应答。
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Claims (23)
1.下列物质用于制备测定疫苗功效的试剂盒的用途:
(a)再刺激来自之前免疫接种的受试者的免疫细胞的试剂,及
(b)检测Th17免疫应答的试剂,
其中
所述疫苗是分枝杆菌活疫苗,且
所述疫苗是重组脲酶-缺陷型分枝杆菌属(Mycobacterium)rBCGΔUreC::Hly+::Hyg+,其包含编码融合多肽的重组核酸分子,所述融合多肽包含:
(a)能引发免疫应答的结构域,以及
(b)吞噬溶酶体逃逸结构域,且
其中测定疫苗功效包括:测定免疫接种的受试者中的Th17免疫应答,且
其中可检测的Th17免疫应答指示所述受试者中的保护性免疫。
2.权利要求1的用途,其中疫苗是亚单位疫苗。
3.权利要求1或2的用途,其中疫苗是针对分枝杆菌感染的疫苗。
4.权利要求3的用途,其中疫苗是针对肺部分枝杆菌感染的疫苗。
5.权利要求4的用途,其中疫苗是针对结核的疫苗。
6.权利要求5的用途,其中所述再刺激来自之前免疫接种的受试者的免疫细胞的试剂是分枝杆菌抗原。
7.权利要求6的用途,其中测定Th17免疫应答包括:
使包含来自所述免疫接种的受试者的免疫细胞的样品经历用对应于所述疫苗中的免疫原的免疫原再刺激,及
测定所述样品中Th17免疫应答关联的细胞的存在和/或量。
8.权利要求7的用途,其中所述检测Th17免疫应答的试剂是特异于与Th17应答关联的细胞中存在的和/或由所述与Th17应答关联的细胞分泌的细胞-表面标志物和/或细胞因子的免疫学检测试剂。
9.权利要求8的用途,其中所述免疫学检测试剂携带标记基团。
10.权利要求9的用途,其中测定Th17免疫应答包括测定IL17。
11.权利要求10的用途,其中由免疫学方法测定IL17。
12.权利要求11的用途,其中受试者是哺乳动物。
13.权利要求12的用途,其中受试者是人。
14.权利要求13的用途,其中Th17免疫应答在疫苗接种之后20~50天测定。
15.测定疫苗功效的试剂盒,其包含:
(a)再刺激来自之前免疫接种的受试者的免疫细胞的试剂,及
(b)检测Th17免疫应答的试剂,
其中
所述疫苗是分枝杆菌活疫苗,且
所述疫苗是重组脲酶-缺陷型分枝杆菌属(Mycobacterium)rBCGΔUreC::Hly+::Hyg+,其包含编码融合多肽的重组核酸分子,所述融合多肽包含:
(a)能引发免疫应答的结构域,以及
(b)吞噬溶酶体逃逸结构域。
16.权利要求15的试剂盒,其中疫苗是亚单位疫苗。
17.权利要求15或16的试剂盒,其中疫苗是针对分枝杆菌感染的疫苗。
18.权利要求17的试剂盒,其中疫苗是针对肺部分枝杆菌感染的疫苗。
19.权利要求18的试剂盒,其中疫苗是针对结核的疫苗。
20.权利要求19的试剂盒,其中所述再刺激来自之前免疫接种的受试者的免疫细胞的试剂是分枝杆菌抗原。
21.权利要求20的试剂盒,其中所述检测Th17免疫应答的试剂是特异于与Th17应答关联的细胞中存在的和/或由所述与Th17应答关联的细胞分泌的细胞-表面标志物和/或细胞因子的免疫学检测试剂。
22.权利要求21的试剂盒,其中所述细胞因子是IL-17。
23.权利要求21的试剂盒,其中所述免疫学检测试剂携带标记基团。
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