CN101329230B - 改进的免疫荧光细胞染色方法 - Google Patents
改进的免疫荧光细胞染色方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101329230B CN101329230B CN2008100699792A CN200810069979A CN101329230B CN 101329230 B CN101329230 B CN 101329230B CN 2008100699792 A CN2008100699792 A CN 2008100699792A CN 200810069979 A CN200810069979 A CN 200810069979A CN 101329230 B CN101329230 B CN 101329230B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- dyeing
- penetrating
- add
- staining
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一种改进的免疫荧光细胞染色方法，包括固定/通透、通透、表面染色和核内染色、洗涤、重悬共5个步骤；本发明方法是对eBioscience公司的Foxp3免疫荧光细胞染色方法的改进，将二步多重染色法改为一步多重染色法，同时进行细胞表面染色和核内染色，具有操作简便，染色快速，节约试剂，降低成本等优点，研究显示本发明方法与eBioscience公司方法无显著性差异，可以用于细胞表面和核内同时染色，具有良好的应用前景和推广价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，特别涉及改进的免疫荧光细胞染色方法。
背景技术
调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)是一类具有免疫抑制作用的T细胞，是机体维持自身耐受的重要组成部分，在免疫相关性疾病、肿瘤免疫和器官移植免疫等方面具有重要意义。目前，免疫相关性疾病、肿瘤和器官移植患者外周血Treg细胞表达水平及其临床意义已成为研究的重点。已有研究表明，Treg细胞比例上升可能是导致系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、肺癌、胃癌、卵巢癌、鼻咽癌、乙肝病毒感染等免疫抑制的原因之一；患者治疗前后Treg细胞数量的变化可作为疗效评估的指标之一。传统鉴定Treg细胞主要是通过CD4+CD25+双阳性来定义，但这种方法并不完全准确，因为CD25分子在部分活化的CD4+非Treg细胞上也会表达。研究发现，转录因子Foxp3(forkhead box P3，Scurfin)与Treg细胞的生长发育和功能维持密切相关，在小鼠特异性表达于CD4+CD25+T细胞；在人类不仅表达于CD4+CD25+T细胞，还表达于CD8+CD28-T细胞，但在CD4+T细胞中的表达明显高于CD8+T细胞，是目前公认的Treg细胞的特异、敏感标志。
由此，美国eBioscience公司开发了一套针对Foxp3的免疫荧光细胞染色试剂和方案，用于流式细胞术检测Treg细胞，现已成为Treg细胞染色检测的常规方法，主要包括以下步骤：
a、表面染色：在细胞悬液中，加入细胞表面抗原(如CD4、CD25等)的荧光标记抗体，于温度2-8℃避光孵育20分钟；同时设阴性同型对照；
b、洗涤：在经步骤a表面染色处理后的细胞悬液中，加入预冷的流式细胞术染色液(Flow Cytometry Staining Buffer)或预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)，离心洗涤细胞，弃上清；重复洗涤2次；
c、固定/通透：在经步骤b洗涤处理后的细胞沉淀中，加入固定/通透液(Fixation/Permeabilization)，混匀，于温度2-8℃避光孵育30-60分钟；
d、通透：在经步骤c固定/通透处理后的细胞悬液中，加入通透液(Permeabilization Buffer)，离心洗涤细胞，弃上清；重复洗涤1次；
e、核内染色：在经步骤d通透处理后的细胞沉淀中，加入Foxp3荧光标记抗体，混匀，于温度2-8℃避光孵育至少30分钟；同时设阴性同型对照；
f、洗涤：在经步骤e核内染色处理后的细胞悬液中，加入通透液，离心洗涤细胞，弃上清；重复洗涤1次；
g、重悬：在经步骤f洗涤处理后的细胞沉淀中，加入流式细胞术染色液，重悬细胞。
此方法为二步多重染色法，先进行细胞表面抗原染色，再进行细胞核内抗原染色，具有良好的染色效果，能够准确地识别Treg细胞，但存在操作较繁琐、耗时、且成本较高的缺点。因此，需要对此方法进行改进和优化，既能够保持良好的细胞染色效果，又可以简化操作、缩短时间、节省试剂、降低成本。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种改进的免疫荧光细胞染色方法，可以同时对细胞表面抗原和核内抗原进行多重染色，具有良好的染色效果，且方法简便、快速、经济。
本发明的改进的免疫荧光细胞染色方法，包括以下步骤：
a、固定/通透：在分离的细胞沉淀中，加入固定/通透液，混匀，于温度2-8℃避光孵育30-60分钟；
b、通透：在经步骤a固定/通透处理后的细胞悬液中，加入通透液，离心洗涤细胞，弃上清；
c、表面染色和核内染色：在经步骤b通透处理后的细胞沉淀中，加入细胞表面抗原的荧光标记抗体和核内抗原的荧光标记抗体，于温度2-8℃避光孵育至少30分钟；同时设阴性同型对照；
d、洗涤：在经步骤c染色处理后的细胞悬液中，加入通透液，离心洗涤细胞，弃上清；
e、重悬：在经步骤d洗涤处理后的细胞沉淀中，加入流式细胞术染色液，重悬细胞。
进一步，所述步骤c细胞表面抗原的荧光标记抗体选自荧光标记的抗CD4抗体或抗CD25抗体，或用不同颜色荧光标记的抗CD4抗体和抗CD25抗体；
进一步，所述步骤c细胞核内抗原的荧光标记抗体选自荧光标记的抗Foxp3抗体；
进一步，所述步骤a和步骤c的孵育温度优选地为4℃，孵育时间优选地为30分钟。
本发明的有益效果在于：本发明对eBioscience公司的Foxp3免疫荧光细胞染色方法作了改进和优化，省略了原方法中的步骤a和步骤b，改二步多重染色法为一步多重染色法，将细胞表面染色和核内染色同时进行。本发明方法具有如下优点：(1)染色和洗涤步骤减少，操作简便，时间缩短约1小时，染色快速；(2)原方法在步骤a表面染色和步骤e核内染色时均需设置相应的阴性同型对照，而本发明方法只需在步骤c进行表面染色和核内染色时设置阴性同型对照，操作简单且节约时间；(3)由于染色、洗涤步骤和阴性同型对照的减少，染色试剂如固定/通透液、通透液、流式细胞术染色液和PBS等的使用量减少，成本降低。分别采用本发明方法和eBioscience公司方法对Balb/c小鼠的脾脏淋巴细胞进行CD4和Foxp3染色，再用流式细胞仪检测，结果显示两种方法无显著性差异(P＞0.05)。本发明的改进的免疫荧光细胞染色方法，不仅可以用于Treg细胞的染色和流式细胞术检测；采用其它细胞相应的表面抗原和核内抗原的荧光标记抗体，还可以用于其它细胞如Th1、Th2、Th17等细胞的表面和核内转录因子同时染色。因此，本发明方法具有良好的应用前景和推广价值，具有突出的实质性特点和显著的进步。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：
图1为采用本发明方法染色的脾脏淋巴细胞的流式细胞图；
图2为采用eBioscience公司方法染色的脾脏淋巴细胞的流式细胞图。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
本实施例采用本发明的改进的免疫荧光细胞染色方法对Balb/c小鼠的脾脏淋巴细胞进行CD4和Foxp3染色，再用流式细胞仪检测，并与eBioscience公司方法进行比较。
实验动物：6-8周龄Balb/c小鼠3只，由第三军医大学实验动物中心提供。
实验试剂：异硫氰酸荧光素(FITC)标记的大鼠抗小鼠CD4抗体(FITC-CD4)、别藻蓝蛋白(APC)标记的大鼠抗小鼠Foxp3抗体(APC-Foxp3)，同型对照：FITC标记的大鼠抗小鼠IgG2a(FITC-IgG2a)、APC标记的大鼠抗小鼠IgG2a(APC-IgG2a)，以及固定/通透液、通透液、流式细胞术染色液均为eBioscience公司产品。
实验设备：FACS Aria流式细胞仪为美国BD公司产品。
实验方法：包括以下步骤：
a、固定/通透：在分离的脾脏淋巴细胞沉淀(细胞数为1×106个)中，加入固定/通透液1ml，脉冲式涡旋混匀，于温度4℃避光孵育30分钟；
b、通透：在经步骤a固定/通透处理后的细胞悬液中，加入通透液1ml，于温度4℃、300g离心5分钟洗涤细胞，弃上清；重复洗涤1次；
c、表面染色和核内染色：在经步骤b通透处理后的细胞沉淀中，加入通透液100μl重悬细胞，再加入浓度为0.5mg/ml的FITC-CD4 1μl、浓度为0.2mg/ml的APC-Foxp 32μl，混匀，于温度4℃避光孵育30分钟；同时设1个阴性同型对照：以FITC-IgG2a和APC-IgG2a代替FITC-CD4和APC-Foxp3；
d、洗涤：在经步骤c染色处理后的细胞悬液中，加入通透液1ml，离心洗涤细胞，弃上清；重复洗涤1次；
e、重悬：在经步骤d洗涤处理后的细胞沉淀中，加入流式细胞术染色液100μl，重悬细胞。
f、检测：用流式细胞仪检测，FACS Diva 4.1软件获取10000个细胞数据进行分析；以FITC-CD4设“门”于CD4+T细胞，分析Foxp3的表达率，结果以百分比表示。
实验结果：采用本发明方法和eBioscience公司方法染色的脾脏淋巴细胞的流式细胞图分别见图1、图2，图1-2中的方框P2部分显示CD4+T细胞中Foxp3+细胞所占百分比例，如图所示，两种方法检测结果基本一致；两种方法染色的脾脏淋巴细胞的流式检测数据比较见表1，经t检验分析，两种方法无显著性差异(P＞0.05)。
表1、采用本发明方法与eBioscience公司方法染色的检测结果比较
结论：本发明方法具有良好的染色效果，可以用于细胞表面和核内同时染色。不仅可以用于Treg细胞的染色和流式细胞术检测；采用其它细胞相应的表面抗原和核内抗原的荧光标记抗体，还可以用于其它细胞如Th1、Th2、Th17等细胞的表面和核内转录因子同时染色。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (3)
1.改进的免疫荧光细胞染色方法，包括以下步骤：
a、固定/通透：在分离的细胞沉淀中，加入固定/通透液，混匀，于温度2-8℃避光孵育30-60分钟；
b、通透：在经步骤a固定/通透处理后的细胞悬液中，加入通透液，离心洗涤细胞，弃上清；
c、表面染色和核内染色：在经步骤b通透处理后的细胞沉淀中，加入细胞表面抗原的荧光标记抗体和核内抗原的荧光标记抗体，于温度2-8℃避光孵育至少30分钟；同时设阴性同型对照；
d、洗涤：在经步骤c染色处理后的细胞悬液中，加入通透液，离心洗涤细胞，弃上清；
e、重悬：在经步骤d洗涤处理后的细胞沉淀中，加入流式细胞术染色液，重悬细胞。
2.根据权利要求1所述的改进的免疫荧光细胞染色方法，其特征在于：所述染色细胞为调节性T细胞；所述步骤c细胞表面抗原的荧光标记抗体选自荧光标记的抗CD4抗体或抗CD25抗体，或用不同颜色荧光标记的抗CD4抗体和抗CD25抗体；所述步骤c细胞核内抗原的荧光标记抗体选自荧光标记的抗Foxp3抗体。
3.根据权利要求1或2所述的改进的免疫荧光细胞染色方法，其特征在于：所述步骤a和步骤c的孵育温度优选地为4℃，孵育时间优选地为30分钟。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2008100699792A CN101329230B (zh) | 2008-07-14 | 2008-07-14 | 改进的免疫荧光细胞染色方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2008100699792A CN101329230B (zh) | 2008-07-14 | 2008-07-14 | 改进的免疫荧光细胞染色方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101329230A CN101329230A (zh) | 2008-12-24 |
| CN101329230B true CN101329230B (zh) | 2010-10-20 |
Family
ID=40205149
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2008100699792A Expired - Fee Related CN101329230B (zh) | 2008-07-14 | 2008-07-14 | 改进的免疫荧光细胞染色方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101329230B (zh) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK2656070T3 (en) * | 2010-12-21 | 2016-06-13 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wss E V | Determination of a live recombined anti-mycobacterial vaccination efficacy |
| CN102288471B (zh) * | 2011-07-27 | 2013-06-12 | 上海交通大学医学院附属仁济医院 | 一种悬浮细胞的免疫荧光染色方法 |
| CN103196731A (zh) * | 2013-04-18 | 2013-07-10 | 王刚平 | 用于鉴别乳腺肌上皮病变的多重染色试剂及其检测方法 |
| CN103235135B (zh) * | 2013-04-26 | 2015-02-04 | 史其新 | 一种用于表征外周调节性t细胞抑制活性的特征细胞群的检测方法及其应用 |
| CN104459135B (zh) * | 2013-09-18 | 2016-08-10 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 检测样本阴阳性的设备、方法及判断标准的确定方法 |
| CN105242046A (zh) * | 2015-09-17 | 2016-01-13 | 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 | 结核感染Treg/Th17细胞的检测方法 |
| CN105424450B (zh) * | 2015-12-17 | 2018-12-18 | 天津医科大学总医院 | 悬浮细胞球免疫荧光染色方法及染色装置 |
| CN105547791B (zh) * | 2015-12-22 | 2018-03-02 | 湖南人康生命科技有限公司 | 一种神经系统突触位点的免疫荧光染色方法 |
| CN107121547A (zh) * | 2016-01-21 | 2017-09-01 | 广东和信健康科技有限公司 | 直接免疫荧光检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒a16型的试剂盒及其应用 |
| CN105911292B (zh) * | 2016-05-19 | 2018-06-26 | 深圳市衍生生物科技有限公司 | 用于组合分析CD11c+CD11b+ DC亚群以及其分化程度和功能的试剂盒及方法 |
| CN107024462B (zh) * | 2017-04-17 | 2019-11-19 | 山东大学 | 一组用于同时显示活细胞核构造与细胞整体的荧光探针 |
| CN113029733B (zh) * | 2021-03-30 | 2023-11-14 | 姜云瀚 | 基于标记抗体的活细胞免疫荧光染色方法 |
| CN114778256A (zh) * | 2022-06-23 | 2022-07-22 | 江苏美克医学技术有限公司 | 一种基于双靶位的荧光染色液、产品及应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1314414A (zh) * | 2001-03-16 | 2001-09-26 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种新的分子量为140kDa的活化T细胞表面抗原 |
-
2008
- 2008-07-14 CN CN2008100699792A patent/CN101329230B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1314414A (zh) * | 2001-03-16 | 2001-09-26 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种新的分子量为140kDa的活化T细胞表面抗原 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101329230A (zh) | 2008-12-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101329230B (zh) | 改进的免疫荧光细胞染色方法 | |
| Mishra et al. | Ultrahigh-throughput magnetic sorting of large blood volumes for epitope-agnostic isolation of circulating tumor cells | |
| Tasoglu et al. | Levitational image cytometry with temporal resolution | |
| Tario et al. | Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry | |
| US20110195413A1 (en) | Integrated Method for Enriching and Detecting Rare Cells from Biological Body Fluid Sample | |
| Hennig et al. | A versatile platform for comprehensive chip‐based explorative cytometry | |
| CN103940997B (zh) | 一种乳腺癌循环肿瘤细胞检测系统及试剂盒 | |
| CN106932576A (zh) | 一种人调节性t细胞的免疫抑制功能的检测方法 | |
| CN107449713A (zh) | 依赖于混合抗体的循环肿瘤细胞分选和富集的方法 | |
| US6630316B1 (en) | Method for measurement of lymphocyte function | |
| CN106596938A (zh) | 一种循环肿瘤细胞快速检测试剂盒 | |
| Jin et al. | Erythrocyte enrichment in hematopoietic progenitor cell cultures based on magnetic susceptibility of the hemoglobin | |
| CN106635769A (zh) | 细胞分离装置以及细胞分离方法 | |
| CN104155325B (zh) | 一种基于磁性微珠的样品无转移低场nmr稀有细胞快速检测方法 | |
| Sirianni et al. | Protein A-positive staphylococci serve as a selective B cell mitogen for lymphocytes from primary immunodeficiency patients. | |
| CN203535053U (zh) | 用于检测nk细胞活性的试剂盒 | |
| CN107144687A (zh) | 蜕膜淋巴细胞亚型的检测方法、试剂盒及其应用 | |
| Manuszak et al. | Standardized 11-color flow cytometry panel for the functional phenotyping of human T regulatory cells | |
| CN108795858A (zh) | 高抗癌活性t细胞的筛选方法和应用 | |
| Melnik et al. | Evaluation of eluents from separations of CD34+ cells from human cord blood using a commerical, immunomagnetic cell separation system | |
| CN115032374A (zh) | 蛇毒致急性肺损伤小鼠肺部免疫细胞图谱特征的建立方法 | |
| CN204631046U (zh) | 用于检测移植后患者免疫重建功能的试剂盒 | |
| CN104293734B (zh) | 一种人γδT细胞的制备方法 | |
| Hosokawa et al. | Monitoring of benzene-induced hematotoxicity in mice by serial leukocyte counting using a microcavity array | |
| US7169571B2 (en) | Methods for measurement of lymphocyte function |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20101020 Termination date: 20150714 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |