CN114778256A - 一种基于双靶位的荧光染色液、产品及应用 - Google Patents
一种基于双靶位的荧光染色液、产品及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种基于双靶位的荧光染色液，包括：第一靶位染色剂0.05‑5mg/ml；第二靶位染色剂0.05‑5mg/ml；辅助染色剂1‑100mg/L；缓冲试剂0.1‑100 g/L；碱性调节试剂1‑500 mg/L；抗淬灭剂0.5‑50 g/L；抑菌剂0.01‑10 g/L及水；本申请采用双靶位的染色理念，即对微生物进行不同部位的染色，在激发光的激发下两个染色部门显示不同的颜色，从而可以清楚的呈现染色样本微生物的结构，大大减小了由于视觉因素造成的误判。2.本申请的双靶位分别为核染和膜染，染色后，核结构显示绿色荧光，膜上显示橘红色荧光。颜色清晰可辨，无背景杂色影响。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于双靶位的荧光染色液、产品及应用，属于微生物检测技术领域。
背景技术
女性下生殖道共生着许多微生物菌群，对病原体的侵入有自然防御功能，但是当阴道的微生态失调、自然防御功能遭到破坏，病原体则易侵入，导致阴道炎、宫颈炎、盆腔炎等疾病的发生，增加了艾滋病和宫颈癌的风险；患有阴道炎的女性在怀孕时会影响精子的质量，甚至导致不孕；即使怀孕孕期也很容易引起宫内感染、产道感染等环节感染胎儿、新生儿，造成流产、早产、先天发育畸形、智力低下等严重后果。
阴道微生物增殖感染引发的感染类型主要有细菌性阴道病、外阴阴道白色念珠菌病、滴虫性阴道炎、需氧菌性阴道炎以及细胞溶解性阴道病等。细菌性阴道病是一种由阴道加德纳菌和一些厌氧菌的混合感染，导致阴道内微生态平衡失调，其中线索细胞阳性是细菌性阴道病诊断的一个重要指标。外阴阴道白色念珠菌病是白色念珠菌在一定条件下感染女性下生殖道引起的一种阴道炎症，其中80%-90%的外阴阴道白色念珠菌病是由白白色念珠菌增殖感染引起，所以观察阴道分泌物样本中真菌孢子、芽生孢子以及假菌丝是重要的镜检指标。滴虫性阴道炎主要是由阴道毛滴虫感染引起，是一种常见的性传播疾病。阴道毛滴虫呈梨形，长为10-30μm，适宜在25-40℃、pH5.5-6.6的潮湿环境下生长。镜检中阴道毛滴虫阳性是滴虫性阴道炎感染的诊断标准，临床样本送检过程中需要注意保温。
传统的微生物染色技术，如革兰氏染色法操作流程复杂，且染色过程中对于染色的技术要求较高，操作不当会造成干扰而导致结果不准确。另外妇科常见的微生物如滴虫，其形态和尺寸与白细胞、细胞核非常相近，极易造成对滴虫检测的干扰；此外，传统微生物染色技术，如湿片染色法可以直接检查清洁度及有无滴虫和真菌菌丝。该方法虽然操作简单，但对染色结果主观性强，且对样本中的细胞及微生物无染色效果，无法辨认各微生物的形态。
中国专利CN110940646A公开的一种阴道微生物检测双重荧光染色液及其应用，为申请人自主研发出的、本领域内首次将双重荧光染色技术应用在阴道微生物检测技术领域，具体公开了采用Sybr Green I和PerCP、以及异硫氰酸荧光素FITC和碘化丙啶PI实现双重荧光染色的目的，且与传统的革兰氏染色法和湿片法相比，染色后的微生物形态清晰，辨识度高，从而大大提高了检测的有效性及阳性检出率。申请人在该技术的基础上进行了拓展性开发研究，获得了基于双靶位的荧光染色液，具体为：1.拓展了更多的第一靶位染色剂和第二靶位染色剂，且拓展的两个靶位的染色剂配合，也取得了很好的染色效果，不但微生物染色结构清晰，而且可以对样本中的上皮细胞、白细胞等进行染色，并与待测微生物在显色和形态具有明显的区别；2.待测微生物种类更多，比如纤毛菌、链球菌、金黄色葡萄均等，均可以获得很好的染色效果；因此，临床应用更为广泛。
发明内容
本发明为了解决现有技术中传统染色技术存在的缺陷和不足，提供了一种基于双靶位的荧光染色液、产品及应用。
为解决上述技术问题，本发明第一个目的是提供一种基于双靶位的荧光染色液，包括：
第一靶位染色剂 0.05-5mg/ml；
第二靶位染色剂 0.05-5mg/ml；
辅助染色剂 1-100mg/L；
缓冲试剂 0.1-100 g/L；
碱性调节试剂 1-500 mg /L；
抗淬灭剂 0.5-50 g/L；
抑菌剂 0.01-10 g/L
及水；
其中，第一靶位染色剂为异硫氰酸荧光素FITC、Sybr Green I或Sybr Green Ⅱ中的一种或几种组合；第二靶位染色剂为吡啰红 G、藻红素、或溴化乙啶中的一种或几种组合；或者
第一靶位染色剂为Sybr Green I或Sybr Green Ⅱ中的一种或组合；第二靶位染色剂为碘化丙啶PI、吡啰红 G、藻红素、或溴化乙啶中的一种或几种组合。
作为示例性的具体实施例，第一靶位可以为微生物或细胞的核酸，第二靶位为微生物或细胞的表面糖蛋白结构。本申请利用不同的染色剂特异性染色的位点不同，实现对微生物或细胞核酸结构和表面糖蛋白结构的双重染色，从而提高辨识度。但在申请人实际研发过程中发现，染色剂种类的以及染色剂的浓度是染色效果尤为关键的影响因素。经过试验验证，染色剂浓度过低或过量，都会造成综合染色效果的差异。因此，申请人经过潜心研究获得了上述技术方案，经染色后，被染样本呈现清晰的轮廓，大大提高了辨识度。
进一步，所述辅助染色剂为果绿、甲基绿或亮绿中的一种或几种的组合。辅助染色剂也是一种染料，在本申请的染色液中加入辅助染色剂，与第一靶位染色剂和第二靶位染色剂结合染色，使得微生物结构更加清晰，便于微生物种类的识别。
进一步，所述缓冲试剂为乙酸-乙酸钠缓冲体系、磷酸盐缓冲体系或Tris-HCl缓冲体系中的一种或几种的组合。
进一步，碱性调节试剂为氢氧化钾或氢氧化钠。
进一步，所述抗淬灭剂为1,4-二偶氮双环[2,2,2]-辛烷、N -丙基没食子酸盐、甘油、对苯二胺或抗坏血酸中的一种或几种的组合。
进一步，所述抑菌剂为硫柳汞、叠氮钠、Proclin 300或庆大霉素中的一种或几种的组合。
本发明第二个目的是提供一种产品，包括任一项上述的染色液。
本发明人第三个目的是提供一种利用任一项上述的染色液进行阴道微生物检测的非疾病诊断的应用。
进一步所述阴道微生物包括细菌、真菌或滴虫。
进一步，所述真菌为念珠菌属，如白色念珠菌(C. albicans）、热带假丝酵母菌（C.tropicalis）、近平滑假丝酵母菌（C. parapsilosis）、都柏林假丝酵母菌（C. dubliniensis）等，在一个实施例中，以白色念珠菌为例进行说明本发明提供的荧光染色液的染色效果；
或/和
所述细菌为链球菌、纤毛菌、加特纳菌或小杆菌等，在一个实施例中，选取含有链球菌和纤毛菌感染的阴道炎样本进行说明本发明提供的荧光染色液的染色效果。
本发明的有益技术效果： 1.本申请采用双靶位的染色理念，即对微生物进行不同部位的染色，在荧光的激发下两个染色剂结合部位显示不同的颜色，从而可以清楚的呈现染色样本微生物的结构，大大减小了由于视觉因素造成的误判。2.本申请的双靶位分别为核染和膜染，染色后，核结构显示绿色荧光，膜上显示橘红色荧光。颜色清晰可辨，无背景杂色影响。
附图说明
图1为本发明实施例1-7针对白色念珠菌的染色效果图；
图2为本发明实施例1-7针对滴虫的染色效果图；
图3为本发明实施例1-7针对金黄色葡萄球菌的染色效果图；
图4为本发明实施例8-实施例9分别针对白色念珠菌、滴虫和金黄色葡萄球菌的染色效果图；
图5为本发明实施例1-7针对白色念珠菌感染确诊病例的临床样本染色效果图；
图6为本发明实施例1-7针对滴虫感染确诊病例的临床样本染色效果图；
图7为本发明实施例1-7针对细菌性阴道炎确诊病例的临床样本染色效果图；
图8为本发明实施例1-7针对纤毛菌感染确诊病例的临床样本染色效果图；
图9为本发明实施例1-7针对链球菌感染确诊病例的临床样本染色效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护。
本发明实施例的试剂原料来源如表1所示。
表1 试剂表
| 序号 | 原材料名称 | 规格 | 厂家及货号 |
| 1 | SybrGreenI | PCR（10000×） | 大连美仑生物技术有限公司，MB3387 |
| 2 | SybrGreenⅡ | PCR（10000×） | 北京索莱宝科技有限公司,SY1040 |
| 3 | 异硫氰酸荧光素 | HPLC | Sigma-Aldrich，F3651 |
| 4 | 碘化丙啶 | HPLC | Sigma-Aldrich，81845 |
| 5 | 吡啰红G | FMP | 国药集团化学试剂有限公司，71035381 |
| 6 | 藻红素 | / | Sigma-Aldrich，52412 |
| 7 | 溴化乙啶 | HPLC | 国药集团化学试剂有限公司，XW12394581 |
| 8 | 甲基绿 | FMP | 国药集团化学试剂有限公司，71025082 |
| 9 | 乙酸 | AR | 国药集团化学试剂有限公司，10000218 |
| 10 | 无水乙酸钠 | AR | 国药集团化学试剂有限公司，10018818 |
| 11 | ProClin300 | / | Sigma-Aldrich，48912-U |
| 12 | 无水磷酸二氢钠 | AR | 国药集团化学试剂有限公司，20040818 |
| 13 | 十二水合磷酸氢二钠 | AR | 国药集团化学试剂有限公司，10020318 |
| 14 | 氢氧化钠 | AR | 国药集团化学试剂有限公司，10019764 |
| 15 | 甘油 | AR | 国药集团化学试剂有限公司，10010618 |
| 16 | 纯化水 | 自制 | 自制 |
实施例1
一种基于双靶位的荧光染色液，包括第一靶位染色剂0.05mg/ml；第二靶位染色剂0.05mg/ml；辅助染色剂1mg/L；缓冲试剂0.1 g/L；碱性调节试剂1 mg /L；抗淬灭剂0.5g/L；抑菌剂0.01 g/L及水；其中，第一靶位染色剂为异硫氰酸荧光素FITC，第二靶位染色剂为吡啰红 G，辅助染色剂为果绿，缓冲试剂为乙酸-乙酸钠缓冲体系，碱性调节试剂为氢氧化钾，抗淬灭剂为1,4-二偶氮双环[2,2,2]-辛烷，抑菌剂为硫柳汞。
实施例2
一种基于双靶位的荧光染色液，包括第一靶位染色剂0.1mg/ml；第二靶位染色剂0.1mg/ml；辅助染色剂10mg/L；缓冲试剂10g/L；碱性调节试剂20 mg /L；抗淬灭剂5 g/L；抑菌剂0. 1 g/L及水；其中，第一靶位染色剂为异硫氰酸荧光素FITC，第二靶位染色剂为藻红素，辅助染色剂为甲基绿，缓冲试剂为乙酸-乙酸钠缓冲体系，碱性调节试剂为氢氧化钾，抗淬灭剂为甘油，抑菌剂为Proclin 300。
实施例3
一种基于双靶位的荧光染色液，包括第一靶位染色剂1mg/ml；第二靶位染色剂1.5mg/ml；辅助染色剂20mg/L；缓冲试剂40g/L；碱性调节试剂100 mg /L；抗淬灭剂10 g/L；抑菌剂2 g/L及水；其中，第一靶位染色剂为异硫氰酸荧光素FITC，第二靶位染色剂为溴化乙啶，辅助染色剂为亮绿，缓冲试剂为乙酸-乙酸钠缓冲体系，碱性调节试剂为氢氧化钾，抗淬灭剂为甘油，抑菌剂为Proclin 300。
实施例4
一种基于双靶位的荧光染色液，包括第一靶位染色剂2mg/ml；第二靶位染色剂2.5mg/ml；辅助染色剂50mg/L；缓冲试剂50g/L；碱性调节试剂200mg /L；抗淬灭剂20g/L；抑菌剂4g/L及水；其中，第一靶位染色剂为异硫氰酸荧光素FITC 和Sybr Green I的组合，第二靶位染色剂为溴化乙啶，辅助染色剂为亮绿，缓冲试剂为乙酸-乙酸钠缓冲体系，碱性调节试剂为氢氧化钾，抗淬灭剂为甘油，抑菌剂为Proclin 300。
实施例5
一种基于双靶位的荧光染色液，包括第一靶位染色剂4mg/ml；第二靶位染色剂4mg/ml；辅助染色剂80mg/L；缓冲试剂70g/L；碱性调节试剂400mg /L；抗淬灭剂40g/L；抑菌剂8g/L及水；其中，第一靶位染色剂为异硫氰酸荧光素FITC和Sybr Green I的组合，第二靶位染色剂为吡啰红G和溴化乙啶的组合，辅助染色剂为甲基绿，缓冲试剂为磷酸盐缓冲体系，碱性调节试剂为氢氧化钠，抗淬灭剂为甘油，抑菌剂为Proclin 300。
实施例6
一种基于双靶位的荧光染色液，包括第一靶位染色剂0.6mg/ml；第二靶位染色剂1.8mg/ml；辅助染色剂100mg/L；缓冲试剂100g/L；碱性调节试剂500mg /L；抗淬灭剂50g/L；抑菌剂10g/L及水；其中，第一靶位染色剂为异硫氰酸荧光素FITC、Sybr Green I和SybrGreen Ⅱ的组合，第二靶位染色剂为吡啰红G、藻红素和溴化乙啶的组合，辅助染色剂为甲基绿，缓冲试剂为乙酸-乙酸钠缓冲体系，碱性调节试剂为氢氧化钠，抗淬灭剂为甘油，抑菌剂为Proclin 300。
实施例7
一种基于双靶位的荧光染色液，包括第一靶位染色剂5mg/ml；第二靶位染色剂5mg/ml；辅助染色剂100mg/L；缓冲试剂100g/L；碱性调节试剂500mg /L；抗淬灭剂50g/L；抑菌剂10g/L及水；其中，第一靶位染色剂为异硫氰酸荧光素FITC和Sybr Green I的组合，第二靶位染色剂为吡啰红G、藻红素和溴化乙啶的组合，辅助染色剂为甲基绿，缓冲试剂为磷酸盐缓冲体系，碱性调节试剂为氢氧化钠，抗淬灭剂为甘油，抑菌剂为Proclin 300。
实施例8
一种基于双靶位的荧光染色液，包括第一靶位染色剂0.01mg/ml；第二靶位染色剂0.02mg/ml；辅助染色剂100mg/L；缓冲试剂100g/L；碱性调节试剂500mg /L；抗淬灭剂50g/L；抑菌剂10g/L及水；其中，第一靶位染色剂为异硫氰酸荧光素FITC，第二靶位染色剂为溴化乙啶，辅助染色剂为甲基绿，缓冲试剂为磷酸盐缓冲体系，碱性调节试剂为氢氧化钠，抗淬灭剂为甘油，抑菌剂为Proclin 300。
实施例9
一种基于双靶位的荧光染色液，包括第一靶位染色剂8mg/ml；第二靶位染色剂10mg/ml；辅助染色剂100mg/L；缓冲试剂100g/L；碱性调节试剂500mg /L；抗淬灭剂50g/L；抑菌剂10g/L及水；其中，第一靶位染色剂为异硫氰酸荧光素FITC，第二靶位染色剂为溴化乙啶，辅助染色剂为甲基绿，缓冲试剂为磷酸盐缓冲体系，碱性调节试剂为氢氧化钠，抗淬灭剂为甘油，抑菌剂为Proclin 300。
试验例1 微生物染色试验
阴道微生物培养：白色念珠菌、滴虫、金黄色葡萄球菌培养过程如下：
1.白色念珠菌培养：取-70℃冻存白色念珠菌取出恢复至室温，在超净工作台中用接种环挑取菌液涂布至沙氏培养基平板，于37℃恒温培养箱培养48小时，备用。
2.滴虫培养：取冻存滴虫原液恢复至室温，于试管中取8ml滴虫培养基，加入2ml胎牛血清，取滴虫原液100μL加入培养基中，试管用橡胶塞密封，放入厌氧培养袋中，然后于37℃恒温培养箱培养72小时，备用。
3.金黄色葡萄球菌培养：将冻存金黄色葡萄球菌恢复至室温，用接种环挑取菌液在营养琼脂培养基平板上涂布，于37℃恒温培养箱培养48小时，备用。
染色：取实验室培养完成的微生物于试管中，加入适量生理盐水，震荡后将菌悬液涂布在载玻片上。于加热台上加热干燥，获得待染样本，备用。将实施例1-7荧光染色液滴加至载玻片上，覆盖样本静置15-30s，纯化水冲洗后，用吸水纸吸去多余水份。选择波长450nm-500nm的蓝光作为激发光，置于生物（荧光）显微镜物镜下，进行直接镜检。检测结果如图1-3所示。
图1为白色念珠菌经实施例1-7提供的染色液染色后的图片，其中1A-1G依次为实施例1-实施例7染色后的效果图片，从图中1中可以看出，白色念珠菌均呈现较好的结构形态。另外，从图1中还可以看出，白色念珠菌的核酸结构被染成绿色，膜结构被染成橘红色，且视野以橘红色为主。申请人根据长期的研究推测，这可能是因为白色念珠菌作为真菌的一种，膜结构较核结构结合的荧光染色剂更多，所以主要呈现橘红色。图2为滴虫经实施例1-7提供的染色液染色后的图片，其中，2A-2G依次为实施例1-实施例7染色后的效果图片，从图中2中可以看出，观察视野中清楚地呈现椭圆或水滴状的滴虫。结构形态清晰，显色明亮。图3为金黄色葡萄球菌经实施例1-7提供的染色液染色后的图片，其中，3A-3G依次为实施例1-实施例7染色后的效果图片，从图中3中可以看出，金黄色葡萄球菌显示橘红色，且结构轮廓清晰。
对比例：根据申请的研究发现，荧光染色液染色效果的好或不好，第一靶位染色剂和第二靶位染色剂的浓度起到决定性因素。因此，申请人对浓度范围做了对比例，即将实施例8和实施例9提供的染色液分别对前述培养的白色念珠菌、滴虫和金黄色葡萄球菌进行染色，获得的染色图片如图4所示，其中，4A和4B分别是实施例8和实施例9对白色念珠菌的染色效果图，4C和4D分别是实施例8和实施例9对滴虫的染色效果图，4E和4F分别是实施例8和实施例9对金黄色葡萄酒菌的染色效果图。
从图中可以看出，经实施例8染色后，由于染色剂浓度较低：1.针对白色念珠菌如4A所示，由于白色念珠菌由于结合染色剂较少、荧光微弱，几乎看不见，且白色念珠菌表面的糖蛋白结合染色剂也较少，视野中几乎不呈现橘红色；2.针对滴虫如4C所示，与白色念珠菌一样，视野中几乎看不到橘红色荧光；3.针对金黄色葡萄球菌如4E所示，与白色念珠菌和滴虫一样，视野中看不到呈现橘红色的目标菌出现。经实施例9染色后，由于染色剂浓度较高：1针对白色念珠菌如4B所示，由于染色剂浓度较高，染色剂之间发生了干扰，与目标菌的结合效率反而降低，染色效果也不均匀，辨识度低；2.针对滴虫如4D所示，染色效果较差，滴虫着色不明显，视野中显示的结构无规律，缺乏辨识度；3.针对金黄色葡萄球菌如4F所示，染色效果也较差，目标菌缺乏辨识度。
此外，与传统的革兰氏染色法和湿片染色法相比，本申请提供的染色液，目标菌经染色后，轮廓结构清晰，呈现的颜色干净、明亮、均匀，辨识度高。对于革兰氏染色法和湿片染色法的染色效果为现有技术，且本身申请在专利CN110940646A中已详细介绍，在此不再赘述。
试验例3 临床分泌物样本的染色
选择确诊的外阴阴道白色念珠菌感染性阴道病、滴虫性阴道炎、细菌性阴道病样本，向取样拭子所在试管中加入适量的生理盐水，振荡后将拭子涂抹在载玻片上。将载玻片置于温度为60-70℃加热台上，样本干燥后取下干片备用。将上述双重荧光染色液中配制的A液分别滴加到不同类型样本玻片上，覆盖样本后静置15-30s，纯化水冲洗玻片除去A液。待玻片上水分稍干燥后分别滴加1滴双重荧光染色液的B液，盖上盖玻片，使用吸水纸吸去多余染色液。选择波长为450nm-500nm的蓝光作为激发光，置于生物（荧光）显微镜物镜下，进行直接镜检。拍摄的染色结果图片如图5-图9所示。
其中，图5为白色念珠菌感染确诊患者的临床样本经实施例1-7提供的染色液染色后的荧光图片，从5A-5G可以清楚的看出白色念珠菌的菌丝分布在图片视野中。此外，从图片上还可以清楚的看出白细胞及上皮细胞。其中，5B和5E可以清楚的看出该临床样本图片中不仅有白色念珠菌，还有线索细胞。该结果提示患者可能为外阴阴道假丝酵母菌病和细菌性阴道病的感染。
图6为滴虫感染确诊患者的临床样本经实施例1-7提供的染色液染色后的荧光图片，从图中可以清楚的看到椭圆形或水滴状的滴虫，且滴虫的数量也是清晰可见。此外，白细胞和上皮细胞也清楚的呈现。
图7为细菌性阴道炎确诊患者的临床样本经实施例1-7提供的染色液染色后的荧光图片，从图中可以看出，上皮细胞表面被细菌覆盖，所以细胞核呈现绿色，细胞表面感染的细菌呈现橘红色，与正常的上皮细胞形成鲜明的对比。
图8为纤毛菌感染确诊患者的临床样本经实施例1-7提供的染色液染色后的荧光图片，从图中可以清楚看到呈现橘红色的纤毛菌。患者感染的程度也清晰可见，其中8F和8G感染程度较重，可以看到一定数量的纤毛菌，此外，在纤毛菌的周边分布大量的乳杆菌。8B、8C和8D虽然感染程度较轻，但仍可以清楚的看到呈现橘红色的纤毛菌的存在。此外，7张图片中均可以清楚的看到白细胞、上皮细胞等正常细胞的呈现。上述结果与患者的病情也是吻合的。
图9为链球菌感染确诊患者的临床样本经实施例1-7提供的染色液染色后的荧光图片，从图中可以看出呈现橘红色的链球菌，球形或卵圆形的链球菌以链状排列呈现。此外，视野中白细胞、上皮细胞、乳杆菌也清晰可见。
综上所述，本发明提供的染色液对临床样本染色后具有以下特点：1.可以清楚的显示不同微生物的形态结构，如在同一个视野中可以清楚的看出白细胞、上皮细胞、乳杆菌、纤毛菌的的形态结构，如图8所示；帮助医护人员通过形态结构判断感染微生物的种属。2.对于同一个微生物呈现两种颜色，便于辨认，如白色念珠菌，核被染成绿色，膜被染成橘红色，有利于避免背景杂质的干扰。
实施例10
一种基于双靶位的荧光染色液，包括第一靶位染色剂0.08mg/ml；第二靶位染色剂4mg/ml；辅助染色剂50mg/L；缓冲试剂60g/L；碱性调节试剂260mg /L；抗淬灭剂40g/L；抑菌剂5g/L及水；其中，第一靶位染色剂为异硫氰酸荧光素FITC和Sybr Green Ⅱ的组合，第二靶位染色剂为吡啰红G，辅助染色剂为甲基绿，缓冲试剂为磷酸盐缓冲体系，碱性调节试剂为氢氧化钠，抗淬灭剂为甘油，抑菌剂为Proclin 300。
实施例11
一种基于双靶位的荧光染色液，包括第一靶位染色剂0.08mg/ml；第二靶位染色剂4mg/ml；辅助染色剂50mg/L；缓冲试剂60g/L；碱性调节试剂260mg /L；抗淬灭剂40g/L；抑菌剂5g/L及水；其中，第一靶位染色剂为异硫氰酸荧光素FITC和Sybr Green Ⅱ的组合，第二靶位染色剂为吡啰红G，辅助染色剂为甲基绿，缓冲试剂为磷酸盐缓冲体系，碱性调节试剂为氢氧化钠，抗淬灭剂为1,4-二偶氮双环[2,2,2]-辛烷，抑菌剂为庆大霉素。
实施例12
一种基于双靶位的荧光染色液，包括第一靶位染色剂2.4mg/ml；第二靶位染色剂1.6mg/ml；辅助染色剂34mg/L；缓冲试剂60g/L；碱性调节试剂300mg /L；抗淬灭剂50g/L；抑菌剂0.01g/L及水；其中，第一靶位染色剂为异硫氰酸荧光素FITC和Sybr Green Ⅱ的组合，第二靶位染色剂为碘化丙啶PI，辅助染色剂为甲基绿，缓冲试剂为磷酸盐缓冲体系，碱性调节试剂为氢氧化钠，抗淬灭剂为1,4-二偶氮双环[2,2,2]-辛烷，抑菌剂为庆大霉素。
实施例13
一种基于双靶位的荧光染色液，包括第一靶位染色剂2.4mg/ml；第二靶位染色剂1.6mg/ml；辅助染色剂34mg/L；缓冲试剂60g/L；碱性调节试剂300mg /L；抗淬灭剂50g/L；抑菌剂0.01g/L及水；其中，第一靶位染色剂为异硫氰酸荧光素FITC和Sybr Green Ⅱ的组合，第二靶位染色剂为藻红素，辅助染色剂为甲基绿，缓冲试剂为磷酸盐缓冲体系，碱性调节试剂为氢氧化钠，抗淬灭剂为1,4-二偶氮双环[2,2,2]-辛烷，抑菌剂为庆大霉素。
实施例14
一种基于双靶位的荧光染色液，包括第一靶位染色剂2.4mg/ml；第二靶位染色剂1.6mg/ml；辅助染色剂34mg/L；缓冲试剂60g/L；碱性调节试剂300mg /L；抗淬灭剂50g/L；抑菌剂0.01g/L及水；其中，第一靶位染色剂为异硫氰酸荧光素FITC和Sybr Green Ⅱ的组合，第二靶位染色剂为溴化乙啶，辅助染色剂为甲基绿，缓冲试剂为磷酸盐缓冲体系，碱性调节试剂为氢氧化钠，抗淬灭剂为1,4-二偶氮双环[2,2,2]-辛烷，抑菌剂为庆大霉素。
实施例15
一种基于双靶位的荧光染色液，包括第一靶位染色剂2.4mg/ml；第二靶位染色剂1.6mg/ml；辅助染色剂34mg/L；缓冲试剂60g/L；碱性调节试剂300mg /L；抗淬灭剂50g/L；抑菌剂0.01g/L及水；其中，第一靶位染色剂为异硫氰酸荧光素FITC和Sybr Green Ⅱ的组合，第二靶位染色剂为吡啰红G和溴化乙啶的组合，辅助染色剂为甲基绿，缓冲试剂为磷酸盐缓冲体系，碱性调节试剂为氢氧化钠，抗淬灭剂为甘油，抑菌剂为庆大霉素。
实施例16
一种基于双靶位的荧光染色液，包括第一靶位染色剂2.4mg/ml；第二靶位染色剂1.6mg/ml；辅助染色剂34mg/L；缓冲试剂60g/L；碱性调节试剂300mg /L；抗淬灭剂50g/L；抑菌剂0.01g/L及水；其中，第一靶位染色剂为异硫氰酸荧光素FITC和Sybr Green Ⅱ的组合，第二靶位染色剂为碘化丙啶PI、吡啰红 G和藻红素的组合，辅助染色剂为甲基绿，缓冲试剂为磷酸盐缓冲体系，碱性调节试剂为氢氧化钠，抗淬灭剂为甘油，抑菌剂为庆大霉素。
实施例17
一种基于双靶位的荧光染色液，包括第一靶位染色剂2.4mg/ml；第二靶位染色剂1.6mg/ml；辅助染色剂34mg/L；缓冲试剂60g/L；碱性调节试剂300mg /L；抗淬灭剂50g/L；抑菌剂0.01g/L及水；其中，第一靶位染色剂为异硫氰酸荧光素FITC和Sybr Green Ⅱ的组合，第二靶位染色剂为碘化丙啶PI、吡啰红 G、藻红素和溴化乙啶的组合，辅助染色剂为甲基绿，缓冲试剂为磷酸盐缓冲体系，碱性调节试剂为氢氧化钠，抗淬灭剂为甘油，抑菌剂为庆大霉素。
实施例18
一种基于双靶位的荧光染色液，包括第一靶位染色剂2.4mg/ml；第二靶位染色剂1.6mg/ml；辅助染色剂34mg/L；缓冲试剂60g/L；碱性调节试剂300mg /L；抗淬灭剂50g/L；抑菌剂0.01g/L及水；其中，第一靶位染色剂为Sybr Green I和Sybr Green Ⅱ的组合，第二靶位染色剂为碘化丙啶PI、吡啰红 G、藻红素和溴化乙啶的组合，辅助染色剂为甲基绿，缓冲试剂为磷酸盐缓冲体系，碱性调节试剂为氢氧化钠，抗淬灭剂为甘油，抑菌剂为庆大霉素。
实施例19
一种基于双靶位的荧光染色液，包括第一靶位染色剂2.4mg/ml；第二靶位染色剂1.6mg/ml；辅助染色剂34mg/L；缓冲试剂60g/L；碱性调节试剂300mg /L；抗淬灭剂50g/L；抑菌剂0.01g/L及水；其中，第一靶位染色剂为Sybr Green I，第二靶位染色剂为碘化丙啶PI、吡啰红 G、藻红素和溴化乙啶的组合，辅助染色剂为甲基绿，缓冲试剂为磷酸盐缓冲体系，碱性调节试剂为氢氧化钠，抗淬灭剂为甘油，抑菌剂为庆大霉素。
实施例20
一种基于双靶位的荧光染色液，包括第一靶位染色剂2.4mg/ml；第二靶位染色剂1.6mg/ml；辅助染色剂34mg/L；缓冲试剂60g/L；碱性调节试剂300mg /L；抗淬灭剂50g/L；抑菌剂0.01g/L及水；其中，第一靶位染色剂为Sybr Green Ⅱ，第二靶位染色剂为碘化丙啶PI、吡啰红 G、藻红素和溴化乙啶的组合，辅助染色剂为甲基绿，缓冲试剂为磷酸盐缓冲体系，碱性调节试剂为氢氧化钠，抗淬灭剂为甘油，抑菌剂为庆大霉素。
实施例21
一种基于双靶位的荧光染色液，包括第一靶位染色剂2.4mg/ml；第二靶位染色剂1.6mg/ml；辅助染色剂34mg/L；缓冲试剂60g/L；碱性调节试剂300mg /L；抗淬灭剂50g/L；抑菌剂0.01g/L及水；其中，第一靶位染色剂为Sybr Green I，第二靶位染色剂为碘化丙啶PI，辅助染色剂为甲基绿，缓冲试剂为磷酸盐缓冲体系，碱性调节试剂为氢氧化钠，抗淬灭剂为甘油，抑菌剂为庆大霉素。
实施例22
一种基于双靶位的荧光染色液，包括第一靶位染色剂2.4mg/ml；第二靶位染色剂1.6mg/ml；辅助染色剂34mg/L；缓冲试剂60g/L；碱性调节试剂300mg /L；抗淬灭剂50g/L；抑菌剂0.01g/L及水；其中，第一靶位染色剂为Sybr Green Ⅱ的组合，第二靶位染色剂为藻红素和溴化乙啶的组合，辅助染色剂为甲基绿，缓冲试剂为磷酸盐缓冲体系，碱性调节试剂为氢氧化钠，抗淬灭剂为甘油，抑菌剂为庆大霉素。
上述实施例为本申请技术方案的代表，未列举实施例并不代表其染色效果不好。在此，就不赘述。
以上已以较佳实施例公布了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采取等同替换或等效变换的方案所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于双靶位的荧光染色液，其特征在于，包括：
第一靶位染色剂 0.05-5mg/ml；
第二靶位染色剂 0.05-5mg/ml；
辅助染色剂 1-100mg/L；
缓冲试剂 0.1-100 g/L；
碱性调节试剂 1-500 mg /L；
抗淬灭剂 0.5-50 g/L；
抑菌剂 0.01-10 g/L
及水；
其中，第一靶位染色剂为异硫氰酸荧光素FITC、Sybr Green I或Sybr Green Ⅱ中的一种或几种组合；第二靶位染色剂为吡啰红 G、藻红素、或溴化乙啶中的一种或几种组合；或者
第一靶位染色剂为Sybr Green I或Sybr Green Ⅱ中的一种或组合；第二靶位染色剂为碘化丙啶PI、吡啰红 G、藻红素、或溴化乙啶中的一种或几种组合。
2.根据权利要求1所述的基于双靶位的荧光染色液，其特征在于：所述辅助染色剂为果绿、甲基绿或亮绿中的一种或几种的组合。
3.根据权利要求1所述的基于双靶位的荧光染色液，其特征在于：所述缓冲试剂为乙酸-乙酸钠缓冲体系、磷酸盐缓冲体系或Tris-HCl缓冲体系中的一种或几种的组合。
4.根据权利要求1所述的基于双靶位的荧光染色液，其特征在于：
碱性调节试剂为氢氧化钾或氢氧化钠。
5.根据权利要求1所述的基于双靶位的荧光染色液，其特征在于：
所述抗淬灭剂为1,4-二偶氮双环[2,2,2]-辛烷、N -丙基没食子酸盐、甘油、对苯二胺或抗坏血酸中的一种或几种的组合。
6.根据权利要求1所述的基于双靶位的荧光染色液，其特征在于：
所述抑菌剂为硫柳汞、叠氮钠、Proclin 300或庆大霉素中的一种或几种的组合。
7.一种产品，包括权利要求1-6任一项所述的染色液。
8.一种利用权利要求1-6任一项所述的染色液进行阴道微生物检测的非疾病诊断的应用。
9.根据权要求8所述的非疾病诊断的应用，其特征在于：所述阴道微生物包括细菌、真菌或滴虫。
10.根据权要求9所述的非疾病诊断的应用，其特征在于：
所述真菌为念珠菌属；
或/和
所述细菌为链球菌、纤毛菌、加特纳菌或小杆菌。
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