ES2274580T3 - Vacuna de la tuberculosis. - Google Patents

Abstract

Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que comprende: (a) al menos un dominio de un poli-péptido de Mycobacterium, siendo dicho dominio capaz de provocar una respuesta inmunológica en un mamífero y (b) un dominio de escape fagolisosómico que proporciona un escape del polipéptido de fusión desde el fagolisosoma al citosol de células de mamífero.

Description

Vacuna de la tuberculosis.

La presente invención se refiere a nuevas vacunas recombinantes que proporcionan inmunidad protectora especialmente contra la tuberculosis. Adicionalmente, la presente invención se refiere a nuevas moléculas recombinantes de ácido nucleico, vectores que contienen dichas moléculas de ácido nucleico, células transformadas con dichas moléculas de ácido nucleico y polipéptidos codificados por dichas moléculas de ácido nucleico.

La tuberculosis (TB) causada por Mycobacterium tuberculosis sigue siendo un problema mundial importante. Se estima que un tercio de la población mundial está infectada con M. tuberculosis (Kochi, 1991). En muchos países, la única medida para el control de TB ha sido la vacunación con el bacilo de M. bovis Calmette-Guérin (BCG). La eficacia global de la vacuna de BCG contra TB, sin embargo, es aproximadamente 50%, con variaciones extremas que van desde 0% a 80% entre diferentes pruebas de campo (Roche et al., 1995). Así pues, BCG debería mejorarse, v.g. por ingeniería genética, para proporcionar una vacuna para mejor control de la TB (Murray et al., 1996; Hess y Kaufmann, 1993). La aparición generalizada de múltiples cepas de M. tuberculosis farmacorresistentes pone de manifiesto adicionalmente el requerimiento urgente de nuevas vacunas TB (Gange, 1996).

M. tuberculosis pertenece al grupo de bacterias intracelulares que se replican dentro de las vacuolas fagosómicas de macrófagos en reposo, por lo que la protección contra TB depende de la inmunidad medida por las células T (Kaufmann, 1993). Sin embargo, varios estudios en ratones y humanos han demostrado que las micobacterias estimulan las células T CD4 y CD8 restringidas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase II o clase I, específicas de antígeno, respectivamente (Kaufmann, 1993).

El importante papel de las células T CD8 restringidas del MHC clase I se demostró convincentemente por el fallo de ratones deficientes en \beta2-microglobulina (\beta2m) para controlar la infección experimental de M. tuberculosis (Flynn et al., 1993). Dado que estos ratones mutantes carecen del MHC clase I, no pueden desarrollarse células T CD8 funcionales. En contraste con la infección de M. tuberculosis, los ratones deficientes en \beta2m son capaces de controlar ciertas dosis infecciosas de la cepa de la vacuna BCG (Flynn et al., 1993; Ladel et al., 1995). Adicionalmente, la vacunación BCG de ratones deficientes en \beta2m prolongaba la supervivencia después de la infección subsiguiente de M. tuberculosis, en tanto que los C57BL/6 inmunizados con BCG resistían a la TB (Flynn et al., 1993). Esta dependencia diferencial de las células T CD8 entre M. tuberculosis y BCG puede explicarse como sigue: los antígenos de M. tuberculosis logran mejor acceso al citoplasma que los antígenos de BCG, lo que conduce a una presentación más pronunciada del MHC clase I (Hess y Kaufmann, 1993). Por consiguiente, M. tuberculosis genera una respuesta más eficaz de las células T CD8. Esta noción se vio respaldada recientemente por una presentación incrementada del MHC clase I de un antígeno irrelevante, ovoalbúmina, por infección simultánea de M. tuberculosis, en lugar de BCG, de las células presentadoras de antígeno (APC) (Mazzaccaro et al., 1996).

Las proteínas secretadas de M. tuberculosis constituyen una fuente valiosa de antígenos para la presentación del MHC clase I. Recientemente, una vacuna de DNA codificante del antígeno secretado Ag85A provocó respuestas de las células T CD8 restringidas del MHC clase I en ratones, lo que puede contribuir a la defensa contra TB (Huygen et al., 1996). En general, existen pruebas acumuladas de que la inmunización con antígenos proteínicos secretados de M. tuberculosis induce cierta protección contra TB en cobayos y ratones (Horwitz et al., 1995; Andersen, 1994). Una meta importante hacia el desarrollo de vacunas TB mejoradas basadas en BCG, por consiguiente, consiste en aumentar la accesibilidad de los antígenos secretados específicos de BCG al citoplasma de las APC infectadas. El suministro subsiguiente de péptidos derivados de estas proteínas secretadas al camino de presentación del MHC clase I puede potenciar la respuesta inmunológica específica de BCG ya existente para prevención de la TB.

El escape fagolisosómico de L. monocytogenes representa un mecanismo singular para facilitar la presentación de antígeno del MHC clase I de antígenos de listeria (Berche et al., 1987; Portnoy et al., 1988). La listeriolisina (Hly), una citolisina formadora de poros activada por sulfhidrilo, es esencial para la liberación de los microorganismos L. monocytogenes por las vacuolas fagolisosómicas al citosol de las células hospedadoras (Gaillard et al., 1987; Portnoy et al., 1988). Esta función de escape ha sido transferida recientemente a Bacillus subtilis y a cepas atenuadas de Salmonella ssp. (Bielecki et al., 1991; Gentschev et al., 1995; Hess y Kaufmann, 1997). La expresión de Hly por una cepa mutante asporogénica de B. subtilis o en Salmonella ssp. da como resultado el escape bacteriano del fagolisosoma al citosol de células J774 semejantes a macrófagos (Bielecki et al., 1991; Gentschev et al., 1995; Hess y Kaufmann, 1997).

Así pues, la transferencia de las funciones de escape lisosómicas a microorganismos heterólogos puede causar una toxicidad elevada de los microorganismos recombinantes resultantes. Por esta razón, el uso de estas funciones de escape lisosómicas para la preparación de vacunas recombinantes vivas no ha sido tomado fácilmente en considera-
ción.

De acuerdo con la presente invención, se han construido cepas BCG recombinantes que secretan Hly hemolíticamente activa, las cuales exhiben una respuesta inmunológica restringida del MHC clase I de eficacia mejorada y, sorprendentemente, una citotoxicidad igual o incluso menor en comparación con las cepas BCG nativas sin modificar. Por tanto, estos organismos recombinantes son vacunas candidato prometedoras contra la TB.

Un primer aspecto de la presente invención es una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de fusión que comprende (a) al menos un dominio de un polipéptido de Mycobacterium, siendo dicho dominio capaz de provocar una respuesta inmunológica en un mamífero, y (b) un dominio de escape fagolisosómico que proporciona un escape del polipéptido de fusión desde el fagolisosoma al citosol de células de mamífero.

Una realización específica de este primer aspecto es la molécula de ácido nucleico de SEQ ID No. 1. Esta molécula de ácido nucleico comprende una secuencia codificante de un péptido señal (nucleótidos 1-120), una secuencia codificante de un dominio inmunógeno (nucleótidos 121-153), una secuencia codificante de un enlazador peptídico (nucleótidos 154-210), una secuencia codificante de un dominio fagolisosómico (nucleótidos 211-1722), una secuencia codificante de enlazador peptídico adicional (nucleótidos 1723-1800) y una secuencia codificante de un péptido aleatorio (nucleótidos 1801-1870). La secuencia de aminoácidos correspondientes se muestra en SEQ ID
No. 2.

El ácido nucleico de la presente invención contiene al menos un dominio inmunógeno de un polipéptido derivado de un organismo del género Mycobacterium, preferiblemente de Mycobacterium tuberculosis o de Mycobacterium bovis. Este dominio tiene una longitud de al menos 6, preferiblemente de al menos 8 aminoácidos. El dominio inmunógeno es preferiblemente una porción de un polipéptido Mycobacterium nativo. Sin embargo, dentro del alcance de la presente invención es también un dominio inmunógeno modificado, que se deriva de un dominio inmunógeno nativo por sustitución, deleción y/o adición de uno o varios aminoácidos.

El dominio inmunógeno es capaz de provocar una respuesta inmunológica en un mamífero. Esta respuesta inmunológica puede ser una respuesta inmunológica mediada por las células B. Preferiblemente, sin embargo, el dominio inmunógeno es capaz de provocar una respuesta inmunológica mediada por las células T, más preferiblemente una respuesta de las células T CD8 restringidas del MHC clase I.

El dominio capaz de provocar una respuesta inmunológica se selecciona preferiblemente de péptidos o polipéptidos inmunógenos de M. bovis o M. tuberculosis o de fragmentos inmunógenos de los mismos. Ejemplos específicos de antígenos adecuados son Ag85B(p30) de M. tuberculosis (Harth et al., 1996), Ag85B (antígeno \alpha) de BCG de M. bovis (Matsuo et al., 1988), Ag85A de M. tuberculosis (Huygen et al., 1996) y ESAT-6 de M. tuberculosis (Sorensen et al., 1996, Harboe et al., 1996 y Andersen et al., 1995). Más preferiblemente, el dominio inmunógeno se deriva del antígeno Ag85B. Muy preferiblemente, el dominio inmunógeno comprende la secuencia desde aa.41 hasta aa.51 en SEQ ID No. 2.

La molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la presente invención comprende además un dominio de escape fagolisosómico, es decir un dominio polipeptídico que proporciona un escape del polipéptido de fusión desde el fagolisosoma al citosol de las células de mamífero. Preferiblemente, el dominio de escape fagolisosómico se deriva de un organismo del género Listeria. Más preferiblemente, el dominio de escape fagolisosómico se deriva del organismo L. monocytogenes. Muy preferiblemente, el dominio fagolisosómico es codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada de: (a) la secuencia nucleotídica de los nucleótidos 211-1722 como se muestra en SEQ ID No. 1, (b) una secuencia de nucleótidos que codifica la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de (a), y (c) una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones severas con la secuencia de (a) o (b).

Aparte de la secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID No. 1, la presente invención comprende también secuencias de ácido nucleico que se hibridan con ella. En la presente invención, el término "hibridación" se utiliza tal como se define en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104). De acuerdo con la presente invención, se utiliza el término "hibridación" si puede observarse todavía una señal de hibridación positiva después de lavado durante 1 hora con 1 X SSC y 0,1% SDS a 55ºC, preferiblemente a 62ºC y más preferiblemente a 68ºC, particularmente durante 1 hora en 0,2 X SSC y 0,1% SDS a 55ºC, preferiblemente a 62ºC y más preferiblemente a 68ºC. Una secuencia que se hibrida con una secuencia nucleotídica de acuerdo con SEQ ID No. 1 en tales condiciones de lavado es una secuencia nucleotídica que codifica un dominio de escape fagolisosómico preferida por la presente invención.

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de fusión contiene una secuencia codificante de péptido señal. Más preferiblemente, la secuencia señal es una secuencia señal activa en Micobacterias, preferiblemente en M. bovis, v.g. una secuencia señal nativa de M. bovis. Un ejemplo preferido de una secuencia señal adecuada es la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señal Ag85B que se representa en SEQ ID No. 1 desde el nucleótido 1 al 120.

Adicionalmente, es preferible proporcionar un enlazador peptídico entre el dominio inmunógeno y el dominio de escape fagolisosómico. Preferiblemente, dicho enlazador peptídico tiene una longitud de 5 a 50 aminoácidos. Más preferiblemente, una secuencia codificante de un enlazador como se muestra en SEQ ID No. 1 desde el nucleótido 154 al 210 o una secuencia correspondiente al mismo teniendo en cuenta la degeneración del código genético.

Un objeto adicional de la invención se refiere a un vector recombinante que comprende al menos una copia de una molécula de ácido nucleico como se ha definido arriba. Preferiblemente, el vector recombinante es un vector procariota, es decir un vector que contiene elementos para replicación y/o integración genómica en células procariotas. Preferiblemente, el vector recombinante lleva la molécula de ácido nucleico de la presente invención enlazada operativamente con una secuencia de control de la expresión. La secuencia de control de la expresión es preferiblemente una secuencia de control de la expresión activa en Micobacterias, particularmente en M. bovis. El vector puede ser un vector extracromosómico o un vector adecuado para integración en el cromosoma. Ejemplos de tales vectores son conocidos por las personas expertas en la técnica y se dan, por ejemplo, en Sambrook et al., supra.

Otro objeto adicional de la invención es una célula que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante o un vector como se ha definido arriba. Preferiblemente, la célula es procariota, particularmente una célula de Mycobacterium. Adicionalmente, se prefiere que la célula sea capaz de expresar la molécula de ácido nucleico de la invención.

En un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona una célula recombinante de Mycobacterium bovis que comprende al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de fusión que comprende (a) al menos un dominio capaz de provocar una respuesta inmunológica en un mamífero y (b) un dominio de escape fagolisosómico que proporciona un escape del polipéptido de fusión desde el fagolisosoma al citosol de las células de mamífero. De acuerdo con este aspecto, el dominio inmunógeno no está restringido a antígenos de Mycobacterium y puede seleccionarse de autoantígenos, antígenos tumorales y antígenos de patógenos tales como antígenos de virus, antígenos de parásitos, antígenos bacterianos en general y fragmentos inmunógenos de los mismos. Ejemplos específicos de antígenos tumorales adecuados son antígenos de tumores humanos tales como el producto del gen supresor del tumor p53 (Houbiers et al., 1993) y antígenos de diferenciación de melanocitos, v.g. Melan-A/MART-1 y gp100 (van Elsas et al., 1996). Ejemplos específicos de antígenos virales adecuados son antígenos de virus tumorales humanos tales como antígenos del virus del papiloma humano, v.g. los antígenos E6 y E7 (Bosch et al., 1991), antígenos del virus de la gripe, v.g. la nucleoproteína del virus de la gripe (Matsui et al., 1995; Fu et al., 1997) o antígenos retrovirales tales como antígenos del HIV, v.g. los antígenos p17, p24, RT y Env del HIV-1 (Harrer et al., 1996; Haas et al., 1996). Ejemplos específicos de antígenos parasitarios adecuados son antígenos de Plasmodium tales como el antígeno de la etapa hepática (LSA-1), la proteína de los circumsporozoítos (CS o las variantes alélicas cp26 o cp29), la proteína amónima afín a la trombospondina (TRAP), la proteína de los esporozoítos rica en treonina y asparagina (STARP) de Plasmodium falciparum (Aidoo et al., 1995) y antígenos de Toxoplasma tales como p30 de Toxoplasma gondii (Khan et al., 1991; Vulgo y Boothroyd, 1991). Ejemplos específicos de antígenos bacterianos adecuados son antígenos de Legionella tales como la proteína secretaria Major de Legionella pneumophila (Blander y Horwitz, 1991).

La célula de acuerdo con la invención es preferiblemente capaz de secretar el polipéptido de fusión codificado por la molécula de ácido nucleico de la invención y de proporcionar el mismo en una forma adecuada para reconocimiento de antígeno restringido del MHC clase I.

La célula de Mycobacterium bovis recombinante que se proporciona de acuerdo con la presente invención puede contener al menos un recombinante adicional, v.g. una molécula heteróloga de ácido nucleico que codifica un péptido o polipéptido capaz de provocar una respuesta inmunológica en un mamífero. Dicho péptido o polipéptido inmunógeno adicional puede seleccionarse de antígenos de Mycobacterium o, en un sentido más amplio, de autoantígenos, antígenos tumorales, antígenos de patógenos y fragmentos inmunógenos de los mismos. La molécula de ácido nucleico que codifica el péptido o polipéptido adicional puede estar situada en el mismo vector que el gen de fusión. No obstante, la misma puede, por ejemplo, estar situada también en un plásmido diferente, con independencia del gen de fusión, o estar integrada en el cromosoma.

Sorprendentemente, se ha encontrado que una célula de Mycobacterium de acuerdo con la presente invención tiene una persistencia intracelular en las células infectadas, v.g. macrófagos, que es igual o menor que la persistencia intracelular de una célula de Mycobacterium nativa correspondiente que no contiene la molécula de ácido nucleico recombinante.

Otro objeto adicional de la presente invención es un polipéptido de fusión recombinante codificado por una molécula de ácido nucleico como se define arriba. El polipéptido de fusión de acuerdo con la invención imparte a una célula la capacidad de reconocimiento de antígeno restringido del MHC clase I mejorado.

La presente invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende como agente activo una célula o un polipéptido de fusión como se define arriba, opcionalmente junto con diluyentes, vehículos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables. Preferiblemente, la composición es una vacuna viva adecuada para administración a un mamífero, preferiblemente un humano. La ruta de vacunación seleccionada realmente depende de la elección del vector de vacunación. La administración puede realizarse en una sola dosis o repetirse a intervalos. La dosificación apropiada depende de diversos parámetros tales como el vector vacunal propiamente dicho o la ruta de administración. Podría seleccionarse la administración a una superficie mucosa (v.g. ocular, intranasal, oral, gástrica, intestinal, rectal, vaginal o del tracto urinario) o por la ruta parenteral (v.g. subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa o intraperitoneal).

Adicionalmente, la presente invención concierne a un método para preparación de una célula bacteriana recombinante como se ha definido arriba. De acuerdo con el primer aspecto, este método comprende los pasos de (i) insertar una molécula de ácido nucleico recombinante en una célula bacteriana, codificando dicha molécula de ácido nucleico un polipéptido de fusión que comprende (a) al menos un dominio de un polipéptido de Micobacterium, siendo dicho dominio capaz de provocar una respuesta inmunológica en un mamífero y (b) un dominio de escape fagolisosómico que proporciona un escape del polipéptido de fusión desde el fagolisosoma al citosol de células de mamífero, y (ii) cultivar la célula obtenida de acuerdo con el paso (i) en condiciones adecuadas. Preferiblemente, se obtiene una célula que es capaz de expresar dicha molécula de ácido nucleico. Preferiblemente, la célula es una célula de M. bovis.

De acuerdo con el segundo aspecto, este método comprende los pasos de (i) insertar una molécula de ácido nucleico recombinante en una célula de Mycobacterium bovis, codificando dicha molécula de ácido nucleico un polipéptido de fusión que comprende (a) al menos un dominio de un polipéptido, siendo dicho dominio capaz de provocar una respuesta inmunológica en un mamífero, y (b) un dominio de escape fagolisosómico que proporciona un escape del polipéptido de fusión desde el fagolisosoma al citosol de células de mamífero, y (ii) cultivar la célula obtenida de acuerdo con (i) en condiciones adecuadas.

Si se desea, el método de la presente invención comprende insertar al menos una molécula de ácido nucleico recombinante adicional en la célula de Mycobacterium bovis, codificando dicha molécula de ácido nucleico recombinante adicional un péptido o polipéptido capaz de provocar una respuesta inmunológica en un mamífero.

Por último, la presente invención se refiere a un método para la preparación de una vacuna viva que comprende formular la célula recombinante en una cantidad farmacéuticamente eficaz con diluyentes, vehículos y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

La invención se ilustrará adicionalmente por las figuras y listados de secuencias siguientes.

Fig. 1: Muestra mapas de plásmido para secreción de Hly por cepas recombinantes de BCG.

A. Expresión extracromosómica de Hly por el plásmido lanzadera pAT261:Hly Escherichia coli - Mycobacteria. Inserción del fragmento Pst I de 1,7 kb derivado de pILH-1 que codifica la secuencia de DNA de la proteína Hly madura. Abreviaturas: Mrep, replicón micobacteriano; Erep, origen de replicación de E. coli; kan, gen de resistencia a la kanamicina; hsp, promotor de la proteína del choque térmico.

B. Vector lanzadera integrador cromosómico pMV306:Hly para expresión de Hly por micobacterias. El fragmento de restricción de DNA insertado (Xba I-Sal I) que incluye el promotor hsp60 se deriva del plásmido pAT261:Hly. Abreviaturas: attP, sitio de fijación del micobacteriófago L5; MCS, sitio de clonación múltiple; int, integrasa del micobacteriófago L5.

Fig. 2: Muestra la secuencia de aminoácidos de la fusión de Hly expresada por BCG pAT261:Hly o BCG pMV306:
Hly. La secuencia de aminoácidos correspondiente al marco de lectura abierto específico del gen hly se deriva de la secue4ncia de DNA de los plásmidos de expresión de micobacterias pAT261:Hly o pMV306:Hly. La proteína de fusión de Hly está constituida por las secuencias de polipéptidos diferentes siguientes: Ag85B específica de BCG que incluye el péptido señal, la secuencia de aminoácidos subrayada en el código de una sola letra (denominada previamente antígeno \alpha; Matsuo et al., 1988); HlyA específico de pHly152 de E. coli, letras cursivas (Hess et al., 1986); Hly madura, letras negritas (Domann y Chakraborty, 1989); secuencia de aminoácidos aleatoria, letras normales. Los sitios de restricción utilizados (Pst I y Nsi I) para las fusiones de genes correspondientes se presentan bajo la secuencia de aminoácidos.

Fig. 3: Muestra el análisis de la expresión de Hly por BCG recombinante. La detección de la proteína de fusión Hly en lisados (L) o sobrenadantes (S) de cepas BCG, pAT261:Hly de BCG o pMV306:Hly de BCG por inmunotinción. Lisados de cultivo y sobrenadantes enriquecidos de las diferentes cepas micobacterianas se separaron en gel de SDS/poliacril-amida al 10% y se transfirieron a membrana Hybond-PVDF. El anticuerpo primario utilizado para la inmunotinción quimioluminiscente de la proteína híbrida Hly de 62 kDa era mAb H14-3 anti-Hly (Nato et al., 1991).

Fig. 4: muestra el crecimiento intracelular y la citotoxicidad de una cepa recombinante de BCG.

A. Supervivencia de las cepas BCG de tipo salvaje (\blacksquare), BCG pAT261:Hly (\Delta) y BCG pMV306:Hly (\blacklozenge) en las células humanas THP-1 semejantes a macrófagos.

B. Supervivencia de las cepas BCG de tipo salvaje (\blacksquare), BCG pAT261:Hly (\Delta) y BCG pMV306:Hly (\blacklozenge) en células J774A.1 murinas semejantes a macrófagos. A las 3 horas después de la infección, se determinaron las CFU (unidades formadoras de colonias) específicas de r-BCG a partir de los lisados de células infectadas y se observaron desde el día 0 al día 15. Los datos se presentan como valores medios \pm desviación estándar (SD) (n = 3).

C. Se ensayaron sobrenadantes y lisados de células de J774A.1 respecto a actividad de LDH después de infección con BCG o r-BCG. J774A.1 (\Box), BCG (\lozenge), BCG pMV306:Hly (\blacklozenge), BCG pAT261:Hly (\Delta) o L. monocytogenes EGD (\blacksquare). Se indica el porcentaje acumulado de actividad total de LDH detectada en el sobrenadante (valor medio \pm SD). Éste es un experimento representativo de tres. El porcentaje de LDH liberada en el sobrenadante se determinó como una medida de la muerte celular.

SEQ ID No. 1:

muestra la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.

SEQ ID No. 2:

muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente de la molécula de ácido nucleico de SEQ ID No. 1.

Ejemplos 1. Procedimientos experimentales 1.1 Cepas bacterianas y plásmidos

Se cultivó la cepa Chicago (ATCC 27289) de BCG de M. bovis en caldo Dubos base (Difco) complementado con albúmina de medio Dubos (Difco) a 37ºC. Un cultivo semi-logarítmico se dividió en partes alícuotas y se guardó a -70ºC hasta su utilización. L. monocytogenes EGD Sv 1/2a (Domann y Chakraborty, 1989) obtenida originalmente de G.B. Mackaness se cultivó en caldo de infusión cerebro-corazón (BHI) (Difco) a 37ºC con aireación. El plásmido pILH-1 fue un obsequio generoso de los Drs. I. Gentschev y W. Goebel (Universidad de Würzburg Alemania). Los vectores lanzadera Mycobacteria - E. coli pAT261 y pMV306 se obtuvieron de MedImmune (Gaithersburg, EE.UU.).

1.2 Enzimas y técnicas genéticas generales

Se utilizaron enzimas de restricción (Boehringer Mannhein) y DNA-ligasa T4 (Pharmacia) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las técnicas de clonación molecular y DNA recombinante se realizaron siguiendo protocolos estándar (Sambrook et al., 1989).

1.3 Manipulaciones y secuenciación del DNA

Se utilizaron los plásmidos de expresión extracromosómicos pAT261 (vector parental pAB261; Stover et al., 1993) y pMV306 integrador (vector parental pMV361; Stover et al., 1991) para la secreción de Hly. Los plásmidos pAT261 y pMV306 comparten elementos comunes que incluyen una casete de expresión, el gen aph derivado de Tn903 que confiere resistencia a la kanamicina como marcador seleccionable, y un origen de replicación de E. coli derivado de pUC19. Dichos plásmidos difieren por la inserción de un origen de replicación de plásmido micobacteriano (pAT261) o los genes attP e int del micobacteriófago L5 (pMV306). El fragmento de DNA insertado del gen Ag85B específico de BCG de M. bovis en el constructo plasmídico pAT261 se halla bajo el control del promotor hsp60 de BCG. El sitio de restricción Pst I (posición 4404, MedImmune) aguas abajo de la secuencia codificante de la proteína Ag85B madura se utilizó para construir fusiones derivadas de Hly que mantienen la actividad hemolítica de Hly nativa de L. monocytogenes EGD y son exportadas por el péptido señal N-terminal específico de Ag85B. El fragmento Pst I de 1,7 kb (posición original 1357 y 4277; Hess et al., 1986) de la fusión de genes original hly-hlyA codificada por el plásmido pILH-1 (Gentschev et al., 1985; Hess et al., 1996) se utilizó para construir pAT261:Hly. La casete de expresión de DNA completa Xba I-Sal I, que incluía el promotor hsp60, para la proteína híbrida Ag85B-Hly codificada del plásmido pAT261:Hly se introdujo en el plásmido pMV306. El constructo resultante se denominó pMV306:Hly. La secuencia de DNA correcta de estos plásmidos en los sitios de inserción de los fragmentos se determinó utilizando los oligonucleótidos siguientes BCG-Hly5-GCTTTGTCCTGCTG y BCG-Hly3-GGAAGTCAGGGTGA (Sequiserve, Vaterstetten, Alemania). El análisis de la secuencia de DNA reveló una inserción aleatoria de un fragmento corto Pst I-DNA en el extremo 3' de la fusión de genes hly-hlyA que codifica 11 aminoácidos.

1.4 Caracterización de cepas de BCG recombinantes de M. bovis

Los plásmidos pAT261:Hly o pMV306:Hly se introdujeron en la cepa Chicago de BCG de M. bovis por un protocolo estándar de electroporación (Langermann et al., 1994) y se seleccionaron luego colonias recombinantes en agar Mliddlebrook 7H10 complementado con kanamicina (15 \mug/ml). Se cultivaron colonias resistentes a la kanamicina hasta la fase logarítimica media en medio líquido Dubos (Difco) que contenía 10% de albúmina de medio Dubos (Difco) y 15 \mug/ml de kanamicina durante 3 semanas. Después de lavar las células en solución salina tamponada con fosfato (PBS) más Tween 80, la suspensión de células se concentró 20 veces en tampón RIPA (1% NP-40, 0,5% Des-oxicolato, 0,1% SDS, Tris 50 mM, pH 8,0) para lisar las células. Los sobrenadantes exentos de bacterias (1 ml) de estos cultivos se filtraron a través de filtros de membrana de 0,2 \mum. La proteína de fusión Hly en el sobrenadante se enriqueció por incubación con 100 \mul de butil-Sepharose (Pharmacia) durante 30 minutos a la temperatura ambiente en un dispositivo rotativo (Schoel et al., 1994). Después de centrifugación (3000 rpm) el pelet se disolvió en tampón Laemmli (Laemmli, 1970). Subsiguientemente, se separaron las proteínas por electroforesis en gel SDS/poliacrilamida al 10% como se ha descrito previamente (Laemmli, 1970) y se transfirieron a membranas Hybond-PVDF (Amersham Life Science). Se realizaron inmunotinciones con el anticuerpo mAb H14-3 anti-Hly (Nato et al., 1991) y anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (Boehringer Mannhein). El procedimiento de lavado y la inmunodetección por quimioluminiscencia se realizaron de acuerdo con la descripción del fabricante [Estuche de Transferencia Western BM (Ratón/Conejo) (Boehringer Mannhein)]. El revelado de la señal en película de rayos X (Kodak, XOMAT-AR) se realizó durante 1 min.

La actividad hemolítica de los sobrenadantes y las suspensiones bacterianas enteras de BCG pAT261:Hly, BCG pMV306:Hly, BCG y L. Monocytogenes se determinó por dilución seriada de las muestras en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 0,1% de seroalbúmina bovina. Las muestras diluidas (100 \mul) se activaron subsiguientemente por adición de cisteína (concentración final 20 mM) y se incubaron a 37ºC durante 45 min con 50 \mul de eritrocitos de oveja (6 x 10^{8} células/ml en PBS, pH 6,0) en placas de 96 pocillos. Las actividades hemolíticas son CHU completas (que se definen como el valor recíproco de la dilución máxima para la cual era detectable una hemólisis completa (Gentschev et al., 1995).

1.5 Análisis in vitro del crecimiento micobacteriano

Células humanas y murinas semejantes a macrófagos THP-1 (ATCC TIB-202) y J774A.1 (ATCC TIB-67), respectivamente, se dejaron adherir a placas de 24 pocillos (10^{6} por pocillo). En el caso de THP-1, la adherencia se consiguió por estimulación con PMA 10 nM (Sigma) 48 h antes de la infección. Las células se infectaron a una multiplicidad de infección (moi) de 10 micobacterias (BCG, BCG pAT261:Hly o BCG pMV306:Hly) por célula durante 3 h. Inmediatamente después de la infección, se determinaron las CFU (unidades formadoras de colonias) extendiendo en placas diluciones seriadas de sobrenadantes y lisados de células sobre agar 7H10 enriquecido con Bacto Middlebrook OADC (Difco) y 15 \mug/ml de kanamicina apropiada. El grado de absorción de las micobacterias por los macrófagos era comparable. Las muestras restantes de macrófagos infectados se lavaron con PBS y se incubaron ulteriormente durante 14 días en presencia de 200 \mug/ml de gentamicina. El crecimiento intracelular de cepas BCG recombinantes se determinó por análisis de CFU después de 1, 8 ó 15 días con posterioridad a la infección (p.i.).

1.6 Liberación de LDH

La citotoxicidad de las cepas de BCG recombinante y de L. monocytogenes EGD como control positivo se determinó por medida de la liberación de LDH por los macrófagos J774A.1 infectados. Los sobrenadantes de cultivo y los lisados de células macrófagos J774A.1 infectados con BCG, BCG pAT261:Hly, BCG pMV306:Hly o L. monocytogenes EGD se ensayaron respecto a actividad de LDH utilizando el kit de cuantificación obtenido de Promega. Las células J774A.1 (10^{4} por pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos y se infectaron a moi de 10. Una hora después de la infección, se añadió gentamicina (concentración final 200 \mug/ml) a las muestras. La actividad de LDH se analizó cuantitativamente al cabo de 3, 4, 5 ó 24 h p.i. de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El porcentaje de citotoxicidad se calculó como sigue: % Citotoxicidad = (J774A.1 infectadas-J774A.1 espontánea)/(J774A.1 máximo-J774A.1 espontáneo x 100).

2. Resultados 2.1 Construcción de los vectores de expresión lanzadera micobacteria-Escherichia coli pAT261:Hly y pMV306:Hly

Con objeto de transferir la función de escape fagolisosómica [mediada por Hly de L. monocytogenes EGD Sv 1/2a (Domann y Chakraborti, 1989)] a BCG Chicago, se utilizaron dos vectores lanzadera E. coli-micobacteria diferentes pAT261 y pMV306. El vector de segunda generación pAT261, un derivado de pMV261 (Stover et al., 1991), dirige la expresión extracromosómica de Hly con aproximadamente cinco copias del plásmido por genoma de BCG y el plásmido integrador pMV306, una derivación de pMV261, permite la expresión cromosómica estable de Hly (Fig. 1) (Stover et al., 1991).

Un fragmento Pst I-DNA de 1,7 kb derivado de pILH-1, codificante de un marco de lectura abierto (ORF) hly-hlyA (hemolisina A específica de pHly152 de E. coli) se insertó en el sitio Pst I del plásmido pAT261 (Gentschev et al., 1995; Stover et al., 1993). Esta fusión de genes resultante codifica la expresión de proteínas secretadas dirigidas al sobrenadante por el péptido señal Ag85B específico de BCG (Matsuo et al., 1990). El constructo se denominó pAT261:Hly y su casete de expresión de DNA Xba I-Sal I bajo control de la transcripción del promotor micobacteriano hsp60 se utilizó subsiguientemente para inserción en el vector parental pMV306 dando como resultado el constructo pMV306:Hly (Fig. 1). Se analizó la secuencia de DNA de los sitios de inserción específicos de hly en ambos plásmidos de expresión micobacterianos, que incluían la secuencia codificante del péptido señal Ag85B específico de BCG (Matsuo et al., 1990). La secuencia de aminoácidos derivada de la proteína de fusión Hly completa se presenta en Fig. 2. La proteína de fusión Hly madura se compone de 30 aminoácidos (aa) en el término N y 52 aa en la parte C-terminal de la fusión, que pertenecen originalmente a HlyA de E. coli (Gentschev et al., 1995).

Subsiguientemente, cada constructo plasmídico pAT261:Hly o pMV306:Hly se sometió a electroporación en la cepa BCG Chicago dando como resultado BCG pAT261:Hly o BCG pMV306:Hly con expresión de Hly plasmídico o cromosómico, respectivamente.

2.2 Análisis de la expresión de Hly en BCG pAT261:Hly y BCG pMV306:Hly

Para caracterizar la secreción de Hly por la cepa BCG pAT262:Hly o la cepa BCG pMV305:Hly, se prepararon sobrenadantes y lisados micobacterianos apropiados de cultivos en crecimiento logarítmico medio de acuerdo con Stover et al., (1993). La fusión de Hly se enriqueció por cromatografía de interacción hidrófoba para superar la reactividad cruzada observada de anticuerpos monoclonales (mAb) anti-Hly disponibles para inmunotinción (Schoel et al., 1994; Nato et al., 1991). La proteína de fusión Hly es detectable en los lisados y sobrenadantes de ambas cepas micobacterianas, BCG pAT261:Hly y BCG pMV306:Hly (Fig. 3). El tamaño predicho, 62 kDa, del polipéptido derivado de Hly es ligeramente mayor que el de la proteína original Hly de 58 kDa de L. monocytogenes.

Con objeto de caracterizar la capacidad formadora de poros de la proteína de fusión Hly secretada por BCG pAT261:Hly y BCG pMV306:Hly, se determinó la actividad hemolítica de las suspensiones de bacterias enteras y de los sobrenadantes. Las muestras de BCG pAT261:Hly y BCG pMV306:Hly revelan actividad hemolítica en los eritrocitos de oveja (Tabla 1) lo que demuestra formalmente la transferencia con éxito de la función citolítica de Hly a especies de micobacterias.

TABLA 1 Actividades hemolíticas de las suspensiones de sobrenadantes y bacterias enteras de cepas BCG recombinantes y L. Monocytogenes EGD

1

^{a} \begin{minipage}[t]{155mm} La actividad hemolítica se da en unidades completas (CHU), que se definen como el recíproco de la dilución máxima de la hemólisis completa. \end{minipage}

^{b} Actividad hemolítica extracelular y fijada a la membrana.

^{c} ND, no detectable.

2.3 Crecimiento de cepas BCG recombinantes en macrófagos

La supervivencia de los microorganismos BCG pAT261:Hly o BCG pMV306:Hly en las células hospedadoras se observó por CFU micobacterianas de macrófagos infectados el día 1, 8 ó 15 después de la infección (p.i.). La línea de células monocíticas humanas THP-1 (ATCC TIB-202) y la línea de células murinas semejantes a macrófagos J774A.1 (ATCC TIB-67) se utilizaron como células micobacterianas diana. Las células THP-1 estimuladas por miristato-acetato de forbol (PMA) se asemejan a los macrófagos humanos nativos derivados de monocitos (Tsuchiya et al., 1982). Tres horas después de la infección de las células THP-1 o J774A.1, se determinó la eficacia de la fagocitosis micobacteriana. Subsiguientemente se realizó un cultivo a largo plazo en presencia de 200 \mug/ml de gentamicina para matar las micobacterias liberadas o no fagocitadas en el sobrenadante. Como se representa en Fig. 4, cada cepa BCG, BCG pAT261:Hly y BCG pMV306:Hly, no conseguía crecer en ninguno de los tipos de célula hospedadora. Además, las bacterias BCG pMV306:Hly exhibían una persistencia intracelular deteriorada en las células hospedadoras THP-1 y J774A.1 en comparación con la cepa BCG parental. Es digno de mención que la tasa de supervivencia intracelular de las bacterias BCG pMV306:Hly en los macrófagos THP-1 era ya reducida el día 1 después de la infección con respecto a los valores de las muestras infectadas con BCG o BCG pAT261:Hly.

En contraste, la persistencia intracelular de BCG pMV306:Hly era comparable a la BCG en THP-1 (Fig. 4). Es interesante que el día 15 p.i. no eran detectables bacterias viables BCG pAT261:Hly en las células J774A.1 infectadas, lo que sugiere una inhibición completa del crecimiento de estos constructos micobacterianos al menos en presencia de gentamicina.

Con objeto de hacerse una idea en cuanto a la persistencia intracelular deteriorada de las cepas BCG pAT261:Hly y BCG pMV306:Hly, se determinó la citotoxicidad para los macrófagos J774A.1 de estas cepas BCG recombinantes en cultivos a corto plazo. La citotoxicidad se analizó por medida de la actividad de lactato-deshidrogenasa (LDH) en sobrenadantes de células hospedadoras infectadas con BCG; BCG pAT261:Hly; BCG pMV306:Hly; o L. monocytogenes EGD al cabo de 3, 4, 5 y 24 h después de la infección. A las 24 h después de la infección, la cantidad de LDH liberada en los sobrenadantes no difería significativamente entre las células hospedadoras infectadas con BCG parental, BCG pAT261:Hly o BCG pMV306:Hly y las no infectadas (Fig. 4). En contraste, la cepa de crecimiento rápido y hemolítica L. monocytogeses EGD causaba una liberación intensa de LDH en el sobrenadante dentro de las 24 h después de la infección. Estos datos sugieren que la secreción de Hly hemolítica por las cepas de BCG recombinante no alteraba la citotoxicidad de la cepa BCG parental. En lugar de ello, ambas cepas BCG pAT261:Hly y BCG pMV306:Hly exhibían una persistencia deteriorada en macrófagos murinos en comparación con el vehículo BCG no recombinante.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Max-Planck-Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften e.V.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Hofgartenstrasse 2

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Munich

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Alemania

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 80539

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vacuna de la tuberculosis

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: DISCO FLEXIBLE

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/LS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1881 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1878

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

2

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 626 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

Claims (28)

1. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que comprende (a) al menos un dominio de un polipéptido de Mycobacterium, siendo dicho dominio capaz de provocar una respuesta inmunológica en un mamífero, y(b) un dominio de escape fagolisosómico que proporciona un escape del polipéptido de fusión desde el fagolisosoma al citosol de células de mamífero.

2. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual dicho dominio de escape fagolisosómico se deriva de un organismo del género Listeria.

3. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual dicho dominio fagolisosómico está codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada de:

(a)

la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 211 al 1722 como se muestra en SEQ ID No. 1,

(b)

una secuencia de nucleótidos que codifica la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de (a), y

(c)

una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia (a) o (b).

4. El ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual el dominio capaz de provocar una respuesta inmunológica es un péptido o polipéptido capaz de provocar respuestas de las células CD8 restringidas del MHC clase I.

5. El ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual el dominio capaz de provocar una respuesta inmunológica se selecciona de los antígenos de Mycobacterium Ag85B (M. tuberculosis), Ag85B (M. bovis), Ag85A (M. tuberculosis) y ESAT-6 (M. tuberculosis) o un fragmento inmunógeno de los mismos.

6. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5, en el cual el dominio capaz de provocar una respuesta inmunológica es el antígeno Ag85B o un fragmento inmunógeno del mismo.

7. El ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el cual el polipéptido de fusión está precedido por una secuencia de péptido señal.

8. El ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el cual está localizado un enlazador peptídico entre el dominio que provoca la respuesta inmunológica y el dominio fagolisosómico.

9. Un vector recombinante que comprende al menos una copia de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. El vector de acuerdo con la reivindicación 9, en el cual dicha molécula de ácido nucleico está enlazada operativamente con una secuencia de control de la expresión.

11. El vector de acuerdo con la reivindicación 10, en el cual dicha secuencia de control de la expresión es activa en Micobacterias.

12. El vector de acuerdo con la reivindicación 9, 10 ó 11, que es un vector extracromosómico.

13. El vector de acuerdo con la reivindicación 9, 10 ó 11, que es un vector cromosómico.

14. Una célula que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13.

15. Una célula de Mycobacterium bovis recombinante, que comprende al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de fusión que comprende (a) al menos un dominio capaz de provocar una respuesta inmunológica en un mamífero y (b) un dominio de escape fagolisosómico que proporciona un escape del polipéptido de fusión desde el fagolisosoma al citosol de células de mamífero.

16. La célula de acuerdo con la reivindicación 15, en la cual el dominio o péptido o polipéptido capaz de provocar una respuesta inmunológica se selecciona de autoantígenos, antígenos tumorales, antígenos virales, antígenos de parásitos, antígenos de bacterias y fragmentos inmunógenos de los mismos.

17. La célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, que es capaz de expresar dicha al menos una molécula de ácido nucleico recombinante.

18. La célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, que es capaz de secretar un polipéptido codificado por dicha al menos una molécula de ácido nucleico.

19. La célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, que tiene una persistencia intracelular en macrófagos infectados que es igual o menor que la persistencia intracelular de una célula de Mycobacterium nativa.

20. Polipéptido de fusión recombinante codificado por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

21. Una composición farmacéutica que comprende como agente activo una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19 o un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 20, opcionalmente junto con diluyentes, vehículos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

22. Una composición de acuerdo con la reivindicación 21, que es una vacuna viva adecuada para administración a una superficie mucosal o por la ruta parenteral.

23. Un método para la preparación de una vacuna viva que comprende formular una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19 en una cantidad farmacéuticamente eficaz con diluyentes, vehículos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

24. Un método para preparar una célula bacteriana recombinante de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende los pasos:

(i)

insertar una molécula de ácido nucleico recombinante en una célula bacteriana, codificando dicha molécula de ácido nucleico un polipéptido de fusión que comprende (a) al menos un dominio de un polipéptido de Mycobacterium, siendo dicho dominio capaz de provocar una respuesta inmunológica en un mamífero, y (b) un dominio de escape fagolisosómico que proporciona un escape del polipéptido de fusión desde el fagolisosoma al citosol de células de mamífero, y

(ii)

cultivar la célula obtenida de acuerdo con (i) en condiciones adecuadas.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 23, en el cual dicha célula es una célula de M. bovis.

26. Un método para preparar una célula bacteriana recombinante de acuerdo con la reivindicación 15, que comprende los pasos:

(i)

insertar una molécula de ácido nucleico recombinante en una célula de Micobacterium bovis, codificando dicha molécula de ácido nucleico un polipéptido de fusión que comprende (a) al menos un dominio de un polipéptido, siendo dicho dominio capaz de provocar una respuesta inmunológica en un mamífero, y (b) un dominio de escape fagolisosómico que proporciona un escape del polipéptido de fusión desde el fagolisosoma al citosol de células de mamífero, y

(ii)

cultivar la célula obtenida de acuerdo con (i) en condiciones adecuadas.

27. El método de la reivindicación 26, que comprende insertar al menos una molécula de ácido nucleico recombinante adicional en la célula de Mycobacterium bovis, codificando dicha molécula de ácido nucleico recombinante adicional un péptido o polipéptido capaz de provocar una respuesta inmunológica en un mamífero.

28. El método de acuerdo con la reivindicación 26 ó 27, en el cual el dominio o péptido o polipéptido capaz de provocar una respuesta inmunológica se selecciona de autoantígenos, antígenos tumorales, antígenos virales, antígenos parasitarios, antígenos bacterianos y fragmentos inmunógenos de los mismos.