JP2015513915A - 細胞性免疫応答の誘導のための組換え細菌 - Google Patents
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Abstract
本発明は、組換え細菌、および細胞性免疫応答を誘導するために組換え細菌を用いる方法を提供する。
Description
政府の権利
本発明は、NIH助成金番号R01 AI065779−06、R01 AI56389およびR01 AI93348の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、NIH助成金番号R01 AI065779−06、R01 AI56389およびR01 AI93348の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、宿主において対象の抗原に対するTh1 T細胞応答を誘導できる組換え細菌を提供する。
本発明は、宿主において対象の抗原に対するTh1 T細胞応答を誘導できる組換え細菌を提供する。
インフルエンザは、依然として、急性呼吸器疾患を引き起こし、かつ慢性肺感染症を悪化させる感染症の25%を占める、世界的に最も重大な疾患の一つである。いくつかの流行および3つの深刻なパンデミックが報告されている。インフルエンザ感染は、表面タンパク質ヘマグルチニン(HA)およびノイラミニダーゼ(NA)に対する中和抗体を誘発するワクチンによって主に効果的にコントロールされる。インフルエンザワクチンは、抗原ドリフトに起因する循環株(circulating strain)に合致するように毎年再調製しなければならず、かつ異なる種由来の遺伝子分節(gene segment)の遺伝子再集合(reassortment)に起因する抗原シフトによって生じる株を予防しない。この最新の例は、ヒト、トリおよび北アメリカとユーラシアの両方のブタ起源由来の配列を含有する、2009年のパンデミックブタ(H1N1)インフルエンザの出現である。
同様に、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)は、毎年約800万の疾患を伴う新たな感染者、および約200万の死亡者を伴い、人口の3分の1に感染している。感染した多くの人が寛解を経験するが、生存中、後に、疾患の再燃を経験する可能性がある。結核はまた、HIVに感染した人における第1位の死因である。BCGは粟粒結核(milliary tuberculosis)から乳幼児を保護する生弱毒化ワクチンであるが、成人集団における肺結核を予防する際には効果が無い。結核(tuberculiosis)に対する有効なワクチンは、結核菌(M.tuberculosis)抗原への強い細胞性免疫の誘導を必要とするであろうと広く考えられている。
不活化ワクチンは一般に細胞性免疫を刺激しない。したがって、細菌およびウイルス感染を取り除くことをもたらすであろう効率の良いT細胞応答を刺激するために、結核菌防御タンパク質抗原に対する、およびインフルエンザ核タンパク質(NP)のような保存されたタンパク質への、細胞性免疫応答を誘発するであろうワクチン技術が、当技術分野において必要とされている。かかる技術は、細菌性病原体、ウイルス性病原体および寄生虫病原体によって引き起こされる感染性(infectipous)疾患の最終的なコントロールにおいて広範囲の適用を有するだろう。
カラー図面の参照
本願は、カラーで制作された少なくとも1つの写真を含む。カラー写真を含む本特許出願公開の複製は、請求および必要な手数料の支払いにより、特許庁によって提供される。
本願は、カラーで制作された少なくとも1つの写真を含む。カラー写真を含む本特許出願公開の複製は、請求および必要な手数料の支払いにより、特許庁によって提供される。
発明の詳細な説明
本発明は、宿主から免疫応答を誘発するために使用され得る組換え細菌を提供する。例示的な実施形態では、免疫応答は細胞性免疫応答である。つまり、免疫応答はTh1 T細胞応答である。本発明はまた、本発明の組換え細菌を含むワクチン、および宿主に本発明の組換え細菌を投与することを含む、免疫応答を誘発する方法を提供する。
本発明は、宿主から免疫応答を誘発するために使用され得る組換え細菌を提供する。例示的な実施形態では、免疫応答は細胞性免疫応答である。つまり、免疫応答はTh1 T細胞応答である。本発明はまた、本発明の組換え細菌を含むワクチン、および宿主に本発明の組換え細菌を投与することを含む、免疫応答を誘発する方法を提供する。
I.組換え細菌
本発明の組換え細菌は、典型的には腸内細菌科(Enterobaceteriaceae)に属する。腸内細菌ファミリーは、以下の属に由来する種を含む:アルテロコッカス属(Alterococcus)、アクアモナス属(Aquamonas)、アラニコラ属(Aranicola)、アルセノフォナス属(Arsenophonus)、ブレネリア属(Brenneria)、ブドビシア属(Budvicia)、ブティアウクセラ属(Buttiauxella)、カンジダツス・フロモバクター(Candidatus Phlomobacter)、セデセア属(Cedeceae)、シトロバクター属(Citrobacter)、エドワードシエラ属(Edwardsiella)、エンテロバクター属(Enterobacter)、エルウィニア属(Erwinia)、大腸菌属(Escherichia)、エウィンゲラ属(Ewingella)、ハフニア属(Hafnia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、クライベラ属(Kluyvera)、レクレルシア属(Leclercia)、レミノレラ属(Leminorella)、モエレレラ属(Moellerella)、モルガネラ属(Morganella)、オブサムバクテリウム属(Obesumbacterium)、パントエア属(Pantoea)、ペクトバクテリウム属(Pectobacterium)、フォトラブダス属(Photorhabdus)、プレジオモナス属(Plesiomonas)、プラジア属(Pragia)、プロテウス属(Proteus)、プロビデンシア属(Providencia)、ラーネラ属(Rahnella)、ラオウルテラ属(Raoultella)、サルモネラ属(Salmonella)、サムソニア属(Samsonia)、セラチア属(Serratia)、シゲラ属(Shigella)、ソダリス属(Sodalis)、テイタメラ属(Tatumella)、トラブルシエラ属(Trabulsiella)、ウィグルスウォーチア属(Wigglesworthia)、ゼノラブダス属(Xenorhbdus)、エルシニア属(Yersinia)、ヨケネラ属(Yokenella)。特定の実施形態では、組換え細菌は、典型的には腸内細菌科(Enterobaceteriaceae)の病原性種である。それらの臨床的意義に起因して、大腸菌(Escherichia coli)、シゲラ属(Shigella)、エドワードシエラ属(Edwardsiella)、サルモネラ属(Salmonella)、シトロバクター属(Citrobacter)、クレブシエラ属(Klebsiella)、エンテロバクター属(Enterobacter)、セラチア属(Serratia)、プロテウス属(Proteus)、モルガネラ属(Morganella)、プロビデンシア属(Providencia)およびエルシニア属(Yersinia)が、特に有用であると考えられる。他の実施形態では、組換え細菌はワクチンのために一般に用いられる種または株としてもよい。
本発明の組換え細菌は、典型的には腸内細菌科(Enterobaceteriaceae)に属する。腸内細菌ファミリーは、以下の属に由来する種を含む:アルテロコッカス属(Alterococcus)、アクアモナス属(Aquamonas)、アラニコラ属(Aranicola)、アルセノフォナス属(Arsenophonus)、ブレネリア属(Brenneria)、ブドビシア属(Budvicia)、ブティアウクセラ属(Buttiauxella)、カンジダツス・フロモバクター(Candidatus Phlomobacter)、セデセア属(Cedeceae)、シトロバクター属(Citrobacter)、エドワードシエラ属(Edwardsiella)、エンテロバクター属(Enterobacter)、エルウィニア属(Erwinia)、大腸菌属(Escherichia)、エウィンゲラ属(Ewingella)、ハフニア属(Hafnia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、クライベラ属(Kluyvera)、レクレルシア属(Leclercia)、レミノレラ属(Leminorella)、モエレレラ属(Moellerella)、モルガネラ属(Morganella)、オブサムバクテリウム属(Obesumbacterium)、パントエア属(Pantoea)、ペクトバクテリウム属(Pectobacterium)、フォトラブダス属(Photorhabdus)、プレジオモナス属(Plesiomonas)、プラジア属(Pragia)、プロテウス属(Proteus)、プロビデンシア属(Providencia)、ラーネラ属(Rahnella)、ラオウルテラ属(Raoultella)、サルモネラ属(Salmonella)、サムソニア属(Samsonia)、セラチア属(Serratia)、シゲラ属(Shigella)、ソダリス属(Sodalis)、テイタメラ属(Tatumella)、トラブルシエラ属(Trabulsiella)、ウィグルスウォーチア属(Wigglesworthia)、ゼノラブダス属(Xenorhbdus)、エルシニア属(Yersinia)、ヨケネラ属(Yokenella)。特定の実施形態では、組換え細菌は、典型的には腸内細菌科(Enterobaceteriaceae)の病原性種である。それらの臨床的意義に起因して、大腸菌(Escherichia coli)、シゲラ属(Shigella)、エドワードシエラ属(Edwardsiella)、サルモネラ属(Salmonella)、シトロバクター属(Citrobacter)、クレブシエラ属(Klebsiella)、エンテロバクター属(Enterobacter)、セラチア属(Serratia)、プロテウス属(Proteus)、モルガネラ属(Morganella)、プロビデンシア属(Providencia)およびエルシニア属(Yersinia)が、特に有用であると考えられる。他の実施形態では、組換え細菌はワクチンのために一般に用いられる種または株としてもよい。
本発明のいくつかの実施形態は、サルモネラ属の種または亜種を含む。例えば、組換え細菌はサルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)血清型(serovar)であってもよい。例示的な実施形態では、本発明の細菌はネズミチフス菌(S.typhimurium)、チフス菌(S.typhi)、パラチフス菌(S.paratyphi)、トリチフス菌(S.gallinarum)、腸炎菌(S.enteritidis)、ブタコレラ菌(S.choleraesius)、アリゾナ菌(S.arizona)、またはサルモネラ・ダブリン(S.dublin)に由来し得る。
サルモネラに由来する本発明の組換え細菌は、ワクチンとして用いるために特に適しているだろう。サルモネラ株での宿主の感染は、典型的には、腸管関連リンパ系組織(GALT)またはパイエル板の定着(colonization)につながる、これは組換え細菌への全身性の粘膜免疫応答の誘導につながる。腸間膜リンパ節、肝臓および脾臓内への細菌のさらなる侵入(penetration)は、細菌に対して向けられる全身性および細胞性免疫応答の誘導を増大し得る。それゆえ、組換えサルモネラの使用は3つの免疫系全てを刺激することができる、これは、粘膜表面を通して、定着および/または侵入する(invade)感染症病原体に対して免疫を与えるために特に重要である。
本発明の細菌は、以下に詳述されるような1以上の変異を含んでもよい。特に、細菌は、エンドソーム脱出(endosomal escape)を可能にするための1以上の変異(下記(a)欄)、細菌の溶解を誘導するための1以上の変異(下記(b)欄)、抗原をコードする核酸を発現するための1以上の変異(下記(c)欄)、細菌を弱毒化するための1以上の変異(下記(d)欄)、および/またはワクチンとしての細菌の性能を増強するための1以上の変異(下記(e)欄)を含んでもよい。
(a)エンドソーム脱出
本発明の組換え細菌は、宿主細胞のエンドソーム区画を脱出できてもよい。脱出は、典型的には宿主細胞のサイトゾルへの抗原の運搬を促進する。組換え細菌は、宿主細胞の侵入(invasion)直後にエンドソームから脱出してもよく、またあるいは、脱出を遅らせてもよい。エンドソーム区画からの脱出を検出する方法は、当技術分野においてよく知られており、顕微鏡解析を含み得る。
本発明の組換え細菌は、宿主細胞のエンドソーム区画を脱出できてもよい。脱出は、典型的には宿主細胞のサイトゾルへの抗原の運搬を促進する。組換え細菌は、宿主細胞の侵入(invasion)直後にエンドソームから脱出してもよく、またあるいは、脱出を遅らせてもよい。エンドソーム区画からの脱出を検出する方法は、当技術分野においてよく知られており、顕微鏡解析を含み得る。
一実施形態では、エンドソーム区画から脱出できる組換え細菌は、SifAの機能を変化させる変異を含む。例えば、sifAによってコードされるタンパク質の機能が変化するように、sifAを変異させてもよい。非限定的な例には、sifAを欠失している変異(ΔsifA)が挙げられる。かかる変異は、宿主細胞侵入にあたりエンドソームからの脱出を可能にする。別の例は、遅延脱出(delayed escape)を可能にする、ΔPsifA::TT araC PBAD sifA変異である。宿主組織にはアラビノースが存在しないので、sifA遺伝子の発現は停止し、かつSifAタンパク質が全く合成されず、その量が細菌の細胞分裂のラウンドごとに減少して、それによってエンドソームからの脱出を可能にする。同様の遅延脱出変異は、キシロースまたはラムノース制御系由来のように、他の制御可能なプロモーターを用いて構築されてもよい。
別の実施形態では、エンドソーム区画を脱出できる組換え細菌は、発疹チフスリケッチア(Rickettsiae prowazekii)由来のtlyCまたはpldなどの核酸配列の発現を引き起こす変異を含んでもよい。発現は誘導性プロモーターによって制御されてもよい。例えば、細菌は、araC PBAD tlyCまたはaraC PBAD pld変異を含んでもよい。いくつかの実施形態では、細菌は、sifA変異およびtlyCまたはpldの発現を引き起こす変異を含んでもよい。
(b)溶解
別の実施形態では、本発明の組換え細菌は制御された溶解(regulated lysis)が可能である。宿主細胞内での細菌の溶解は、抗原の塊(bolus)を放出し得る。溶解はまた、生物学的封じ込めの手段を提供する。さらなる生物学的封じ込め機構に関しては、下記(e)欄を参照のこと。
別の実施形態では、本発明の組換え細菌は制御された溶解(regulated lysis)が可能である。宿主細胞内での細菌の溶解は、抗原の塊(bolus)を放出し得る。溶解はまた、生物学的封じ込めの手段を提供する。さらなる生物学的封じ込め機構に関しては、下記(e)欄を参照のこと。
いくつかの実施形態では、制御された溶解が可能である組換え細菌は、細菌細胞壁のペプチドグリカン層の必要な構成要素において変異を含んでもよい。例えば、murAなどの、ムラミン酸合成に関与するタンパク質をコードする核酸配列において変異を含んでもよい。しかしながら、ΔmurA変異が致死的であり、単離することができないので、欠失によってmurAを変化させることは不可能である。これは、不足している生存に必要な栄養素が、腸内細菌が内部に取り入れることができないので外因的に供給できない、リン酸化されたムラミン酸であるからである。したがって、murA核酸配列は、murAの発現を、細菌の成長の間に供給できる栄養素(例えば、アラビノース)に依存するように、変化され得る。例えば、変化は、ΔPmurA::TT araC PBAD murA欠失−挿入変異を含んでもよい。細菌のin vitroでの生育の間、この種類の変異は、ムラミン酸の合成を成長培地におけるアラビノースの存在に依存させる。しかしながら、宿主における細菌の生育の間、アラビノースは存在しない。したがって、細菌が、発現された場合に実質的にmurAとして機能する核酸配列を含む、少なくとも1つの染色体外ベクターをさらに含まなければ、細菌は宿主において生育不能(non−viable)かつ/または非病原性(avirulent)である。アラビノースの存在下で生育したΔPmurA::TT araC PBAD murA欠失−挿入変異を有する組換え細菌は、細胞壁喪失溶解(cell wall−less lysing)に起因する細胞死に先立って、経口ワクチン接種の後に、エフェクターリンパ組織の有効な定着を示す。
同様に、様々な実施形態において、組換え細菌は、細菌細胞壁のペプチドグリカン層の必須成分である、DAP合成のために必要な酵素である、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするasdA核酸配列に挿入されたaraC PBAD c2カセットを含んでもよい。染色体asdA核酸配列は、典型的には、平衡致死宿主−ベクター系(balanced−lethal host−vector system)において野生型のasdA核酸配列をコードするプラスミドベクターの使用を可能にするために、不活性化される。これは、生細菌ワクチンにおいては認められない、任意の薬物耐性属性の非存在下で、in vivoでのプラスミドの安定した維持を可能にする。
一実施形態では、ΔasdA27::TT araC PBAD c2は改良されたSD配列およびコドン最適化されたc2核酸配列を有する。アラビノース存在下で合成されたC2リプレッサーは、P22 PRおよびPLプロモーターからの核酸配列発現を抑制するために用いられる。別の実施形態では、ΔasdA27::TT araC PBAD c2は、欠失した1104塩基対のasdA核酸配列(1から1104、しかしTAG終止コドンを含まない)および挿入されたT4 ipIII TT araC PBAD c2を含有する1989塩基対断片を有する。ΔasdA27::TT araC PBAD c2におけるc2核酸配列は、TAAGGAGGTへ最適化されたSD配列を有する。それはまた、−10配列がTACTGTからTATAATへ改良されるような、改良されたPBADプロモーターを有する。またさらに、それは第2コドンがAATからAAAへ改変された、コドン最適化c2核酸配列を有する。
例示的な実施態様では、細菌は、ムラミン酸合成における第1の酵素をコードするmurA核酸配列およびDAP合成に必須のasdA核酸配列における変異を含んでもよい。非限定的な例として、これらの実施形態は、染色体欠失−挿入変異ΔasdA19::TT araC PBAD c2またはΔasdA27::TT araC PBAD c2およびΔPmurA7::TT araC PBAD murAまたはΔPmurA12::TT araC PBAD murAまたはΔPmurA25::TT araC PBAD murAを含み得る。この宿主ベクターは0.1% L−アラビノースを有するLBブロスにおいて生育するが、溶解によって細胞壁喪失死(cell wall−less death)を受けるので、アラビノースの無い培地中または培地上では生育できない。
これらの変異を含む細菌はまた、murAおよびasdAの代わりになる核酸配列を含有するプラスミドを含む。これは、許容状態の(permissive)環境において、例えばアラビノースが存在する場合に、細菌が生育することを可能にする。例えば、プラスミドベクターpYA3681は、araC PBADプロモーターの制御下のmurA核酸配列(翻訳効率を減少させるために変化した開始コドン配列を有する)を含有する。このプロモーターの指揮下の第2の核酸配列はasdA核酸配列(翻訳効率を減少させるために変化した開始コドン配列を有する)である。P22 PRプロモーターは、asdA核酸配列およびmurA核酸配列両方のアンチセンス方向にある。P22 PRは、アラビノースを有する培地において株の生育の間に作られるC2リプレッサーによって抑制される(ΔasdA::TT araC PBAD c2欠失−挿入に起因して)。しかしながら、asdAおよびmurA mRNAの翻訳をさらに阻止するために、アンチセンスmRNAのPRに指揮される合成を引き起こすため、C2濃度はin vivoでの細胞分裂に起因して減少する。araC PBAD配列はまた、当初記載された通りの大腸菌(E.coli) B/r由来ではなく、アラビノースの非存在下で、より厳しい制御およびより少ない漏出を備える大腸菌K−12株χ289に由来する配列を表わす。好ましい実施形態では、1つのドメインが別のドメインの活性に影響を与えないように、転写ターミネーター(TT)が、制御された溶解、複製、および発現のための全てのドメインに隣接する。安全機能として、それらは共通して欠失した配列を有するので、プラスミドのasdA核酸配列は染色体のasdA変異の代わりとならない。さらに、大腸菌murA核酸配列が、サルモネラmurA核酸配列を用いる代わりにプラスミドにおいて用いられた。完全に弱毒化されることに加えて、この構築は完全な生物的封じ込めを示す。この特性は、ワクチン安全性を増強し、かつワクチン接種を意図していない個体のワクチン接種の可能性を最小化する。
当業者であれば、アラビノース以外の他の栄養素が上記の変異において用いられ得ることを認識できる。非限定的な例として、キシロース、マンノースおよびラムノース制御系も用いられ得る。
本発明のいくつかの実施形態では、組換え細菌は、asdAおよびmurA核酸配列発現が、外部アラビノースの無い環境中へ経口免疫後、1または2細胞分裂の間、続くように、内部に取り入れたアラビノースの分解および漏出を起こらないようにするために、araBADおよびaraE変異をさらに含んでもよい。さらに、細菌は、コラン酸の形成を起こらないようにするために、GDP−フコース合成に関与するタンパク質において変異を含んでもよい。かかる変異の非限定的な例にはΔ(gmd−fcl)が挙げられる。細菌はまた、タンパク質合成への依存から細胞壁喪失死を切り離すΔrelAのような変異を含んでもよい。
細菌の溶解は、典型的には、エンドトキシンであるリピドAを放出できる。したがって、本発明の細菌は、リピドAの毒性を低減する変異を含んでもよい。非限定的な例には、モノホスホリルリピドAの合成を引き起こす変異が挙げられる。この形式のリピドAは無毒であるが、未だアジュバントアゴニストとして機能する。
あるいは、本発明の組換え細菌は、その全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、Kong et al., (2008) PNAS 105:9361または米国特許出願公開第2006/0140975号に開示される溶解系を含んでもよい。
(c)抗原合成
本発明の細菌は、1以上の抗原をコードする1以上の核酸を発現または運搬し得る。例えば、一実施形態では、組換え細菌は抗原をコードする核酸配列の制御された発現が可能であってもよい。別の実施形態では、組換え細菌は核酸ワクチンベクターを含んでもよい。また別の実施形態では、組換え細菌は8ユニットウイルスカセット(eight unit viral cassette)を含んでもよい。上記実施形態の各々は以下により詳細に記載される。1以上の抗原をコードする1以上の核酸を発現または運搬する他の手段は、当技術分野において知られている。
本発明の細菌は、1以上の抗原をコードする1以上の核酸を発現または運搬し得る。例えば、一実施形態では、組換え細菌は抗原をコードする核酸配列の制御された発現が可能であってもよい。別の実施形態では、組換え細菌は核酸ワクチンベクターを含んでもよい。また別の実施形態では、組換え細菌は8ユニットウイルスカセット(eight unit viral cassette)を含んでもよい。上記実施形態の各々は以下により詳細に記載される。1以上の抗原をコードする1以上の核酸を発現または運搬する他の手段は、当技術分野において知られている。
一実施形態では、抗原はアイメリア(Eimeria)抗原である。例えば、アイメリア抗原の非限定的な例には、EASZ240、EAMZ250、TA4、EtMIC2、またはSO7が挙げられ得る。
別の実施形態では、抗原はウイルス抗原であってもよい。例えば、抗原はインフルエンザ抗原であってもよい。インフルエンザ抗原の非限定的な例には、M2e、核タンパク質(NP)、ヘマグルチニン(HA)、およびノイラミニダーゼ(NA)が挙げられ得る。抗原は、宿主細胞内での抗原プロセシングを増強するために、タンパク質に融合され得る。例えば、抗原は、SopE、SptP、ウッドチャック肝炎コア抗原、またはHBVコア抗原に融合され得る。抗原のさらなる例は、以下のi.、ii.、およびiii.欄、ならびに実施例において見られ得る。
別の実施形態では、抗原は結核菌由来の抗原である。例えば、結核菌抗原の非限定的な例には、ESAT−6、CFP−10、Ag85A、Ag85B、Ag85C、Mtb39A、FAP(フィブロネクチン付着タンパク質)、Tb15.3、RfpAおよびRfpBまたはT細胞性免疫応答を誘導するであろう任意の他の抗原が挙げられ得る。
本発明の抗原は、2型または3型分泌装置を介して、in vivo系での制御された遅延溶解によって、エンドソーム脱出によって、またはそれらの組み合わせで、運搬され得る。より詳細については実施例を参照のこと。
抗原をコードする核酸配列の発現レベルは、当技術分野において知られており、かつ以下のリプレッサーの発現を最適化するために記載されるような方法を用いて、改変され得る。
i.制御された発現
本発明は、対象の抗原をコードする少なくとも1つの核酸配列の制御された発現が可能である組換え細菌を包含する。一般的に言えば、そのような細菌は、リプレッサーをコードする核酸配列およびベクターを含む。各々、以下に詳細に説明される。
本発明は、対象の抗原をコードする少なくとも1つの核酸配列の制御された発現が可能である組換え細菌を包含する。一般的に言えば、そのような細菌は、リプレッサーをコードする核酸配列およびベクターを含む。各々、以下に詳細に説明される。
A.リプレッサーをコードする核酸配列
抗原をコードする少なくとも1つの核酸配列の制御された発現が可能である、本発明の組換え細菌は、部分的に、リプレッサーをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む。核酸は、染色体に組み込まれてもよい。他の実施形態では、核酸は染色体外ベクター上にあってもよい。典型的には、リプレッサーをコードする核酸配列は、制御可能なプロモーターに作動可能に連結される。リプレッサーをコードする核酸配列および/またはプロモーターは、リプレッサーをコードする核酸配列の発現レベルを最適化するように、野生型の核酸配列から改変されてもよい。
抗原をコードする少なくとも1つの核酸配列の制御された発現が可能である、本発明の組換え細菌は、部分的に、リプレッサーをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む。核酸は、染色体に組み込まれてもよい。他の実施形態では、核酸は染色体外ベクター上にあってもよい。典型的には、リプレッサーをコードする核酸配列は、制御可能なプロモーターに作動可能に連結される。リプレッサーをコードする核酸配列および/またはプロモーターは、リプレッサーをコードする核酸配列の発現レベルを最適化するように、野生型の核酸配列から改変されてもよい。
制御可能なプロモーターに作動可能に連結されたリプレッサーをコードする核酸配列を染色体に組み込む方法は、当技術分野において知られており、実施例において詳述される。一般的に言えば、リプレッサーをコードする核酸配列は、組換え細菌による宿主の定着を妨害する、あるいは細菌を弱毒化する遺伝子座に組み込まれるべきではない。一実施形態では、リプレッサーをコードする核酸配列は、relA核酸配列内に組み込まれてもよい。別の実施形態では、リプレッサーをコードする核酸配列は、endA核酸配列内に組み込まれてもよい。
いくつかの実施形態では、リプレッサーをコードする少なくとも1つの核酸配列が染色体に組み込まれる。他の実施形態では、リプレッサーをコードする少なくとも2つ、または少なくとも3つの核酸配列が、組換え細菌内の染色体に組み込まれる。リプレッサーをコードする1より多くの核酸配列がある場合、リプレッサーをコードする各核酸配列は、各プロモーターが同じ化合物または条件によって制御されるように、制御可能なプロモーターに作動可能に連結されてもよい。あるいは、リプレッサーをコードする各核酸配列は、その各々が異なる化合物または条件によって制御される、制御可能なプロモーターに作動可能に連結されてもよい。
1.リプレッサー
本明細書で使用するとき、「リプレッサー」は、1以上のプロモーターからの転写を抑制する生体分子をいう。一般的に言えば、本発明の適切なリプレッサーは、以下に詳述されるように、ベクター上の対象の抗原をコードする核酸配列の転写を抑制し、かつ株のin vitroでの生育を妨げないのに十分高い量で、細菌株のin vitroでの生育の間、合成される。さらに、適切なリプレッサーは、一般に、本質的に安定である、すなわち、タンパク質分解性の分解(proteolytic breakdown)に供されない。またさらに、適切なリプレッサーは、非許容状態の(non−permissive)環境(例えば、動物またはヒト宿主)におけるような、リプレッサーの発現が停止した後、細胞分裂ごとに約半分に希釈できる。
本明細書で使用するとき、「リプレッサー」は、1以上のプロモーターからの転写を抑制する生体分子をいう。一般的に言えば、本発明の適切なリプレッサーは、以下に詳述されるように、ベクター上の対象の抗原をコードする核酸配列の転写を抑制し、かつ株のin vitroでの生育を妨げないのに十分高い量で、細菌株のin vitroでの生育の間、合成される。さらに、適切なリプレッサーは、一般に、本質的に安定である、すなわち、タンパク質分解性の分解(proteolytic breakdown)に供されない。またさらに、適切なリプレッサーは、非許容状態の(non−permissive)環境(例えば、動物またはヒト宿主)におけるような、リプレッサーの発現が停止した後、細胞分裂ごとに約半分に希釈できる。
リプレッサーの選択は、部分的に、用いられる組換え細菌の種によって決まる。例えば、リプレッサーは通常、組換え細菌と同じ細菌の種に由来しない。例えば、組換え細菌がサルモネラ属に由来する場合、リプレッサーは大腸菌に由来し得る。あるいは、リプレッサーはバクテリオファージに由来し得る。
適切なリプレッサーは当技術分野において知られており、例えば、大腸菌のLacI、バクテリオファージP22によってコードされるC2、またはバクテリオファージλによってコードされるC1が挙げられ得る。他の適切なリプレッサーは、糖の取り込みおよび利用に関与する核酸配列などの、制御可能な核酸配列の発現を制御することが知られているリプレッサーとしてもよい。一実施形態では、リプレッサーはLacIである。別の実施形態では、リプレッサーはC2である。さらに別の実施形態では、リプレッサーはC1である。
2.制御可能なプロモーター
リプレッサーをコードする、染色体に組み込まれた核酸配列は、制御可能なプロモーターに作動可能に連結される。用語「プロモーター」は、本明細書で使用するとき、核酸の発現を与える、活性化する、または増強することができる、合成または天然由来の分子を意味し得る。プロモーターは、発現をさらに増強するため、かつ/または、核酸の空間的発現および/または時間的発現を変化させるために、1以上の特定の転写制御配列を含んでもよい。用語「作動可能に連結される」は、本明細書で使用するとき、核酸配列の発現が、それが空間的に接続されているプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下の核酸配列の5’(上流)に位置し得る。プロモーターと発現される核酸配列の間の距離は、そのプロモーターとそれが制御する天然の核酸配列の間の距離とほぼ同じであってもよい。当技術分野において知られているように、この距離のバリエーションはプロモーター機能の喪失無く提供され得る。
リプレッサーをコードする、染色体に組み込まれた核酸配列は、制御可能なプロモーターに作動可能に連結される。用語「プロモーター」は、本明細書で使用するとき、核酸の発現を与える、活性化する、または増強することができる、合成または天然由来の分子を意味し得る。プロモーターは、発現をさらに増強するため、かつ/または、核酸の空間的発現および/または時間的発現を変化させるために、1以上の特定の転写制御配列を含んでもよい。用語「作動可能に連結される」は、本明細書で使用するとき、核酸配列の発現が、それが空間的に接続されているプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下の核酸配列の5’(上流)に位置し得る。プロモーターと発現される核酸配列の間の距離は、そのプロモーターとそれが制御する天然の核酸配列の間の距離とほぼ同じであってもよい。当技術分野において知られているように、この距離のバリエーションはプロモーター機能の喪失無く提供され得る。
本明細書で用いられる制御されたプロモーターは、一般に、許容状態の環境(すなわち、in vitroでの生育)中ではリプレッサーをコードする核酸配列の転写を可能にするが、非許容状態の環境(すなわち、動物またはヒト宿主における細菌の生育の間)中ではリプレッサーをコードする核酸配列の転写を停止させる。例えば、プロモーターは、許容状態と非許容状態の環境の間の物理的または化学的差異に感受性であってもよい。かかる制御可能なプロモーターの適切な例は、当技術分野において知られている。
いくつかの実施形態では、プロモーターは、環境におけるアラビノースのレベルに反応するものであってもよい。一般的に言えば、アラビノースは細菌のin vitroでの生育の間に存在し得る、一方で、典型的に宿主組織には存在しない。一実施形態では、プロモーターは、araC−PBAD系に由来する。araC−PBAD系は、厳密に制御された発現系であり、低濃度のアラビノースの添加によって誘導される強力なプロモーターとして働くことが示されている(5)。araC−araBADプロモーターは、一方向にaraBAD核酸配列、他方向にaraC核酸配列の発現を制御する両方向性プロモーターである。便宜上、araC核酸配列産物によって制御される、araBAD核酸配列の発現を媒介するaraC−araBADプロモーターの部分は、本明細書においてPBADと称される。本明細書に記載される使用のため、araC核酸配列およびaraC−araBADプロモーターを備えるカセットが用いられてもよい。このカセットは、本明細書においてaraC−PBADと称される。AraCタンパク質はPBADの正および負の両方のレギュレーターである。アラビノースの存在下では、AraCタンパク質はPBADからの発現を可能にする正の調節エレメント(regulatory element)である。アラビノースの非存在下では、AraCタンパク質はPBADからの発現を抑制する。これは、PBADからの発現レベルにおいて、1,200倍の差異を引き起こすことができる。
他の腸内細菌は、大腸菌由来のaraC−araBAD系と相同であるアラビノース制御系を含有する。例えば、大腸菌とネズミチフス菌のAraCタンパク質の間にはアミノ酸配列レベルでの相同性があり、かつDNAレベルではより低い相同性がある。しかしながら、AraCタンパク質の活性においては高い特異性がある。例えば、大腸菌AraCタンパク質は大腸菌PBADだけを活性化し(アラビノース存在下で)、ネズミチフス菌PBADを活性化しない。したがって、プロモーターとオペロンが2つの異なる細菌の種に由来する場合、アラビノース制御プロモーターは、2つの間の実質的な干渉無しで、同様のアラビノースオペロンを保有する組換え細菌において用いられ得る。
一般的に言えば、発現を誘導するために必要なアラビノースの濃度は、典型的には約2%未満である。いくつかの実施形態では、濃度は、約1.5%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、または0.05%である。他の実施形態では、濃度は、0.05%以下、例えば約0.04%、0.03%、0.02%、または0.01%である。例示的な実施形態では、濃度は約0.05%である。
他の実施形態では、プロモーターは、環境中のマルトースのレベルに反応するものであってもよい。一般的に言えば、マルトースは細菌のin vitroでの生育の間に存在し得る、一方で、典型的に宿主組織には存在しない。malT核酸配列は、マルトース反応性プロモーター(PPQ、PEFG、PKBM、およびPS)の正のレギュレーターである、MalTをコードする。malTおよびmalプロモーターの組み合わせは、マルトースの添加によって誘導される強力なプロモーターとして働くことが示されている、厳密に制御された発現系を構築する(6)。araC−PBAD系とは違って、malTは他のmalプロモーターに機能的に接続されていないプロモーター(PT)から発現される。PTはMalTによって制御されない。malEFG−malKBMプロモーターは、一方向にmalKBM核酸配列、他方向にmalEFG核酸配列の発現を制御する両方向性プロモーターである。便宜上、malT核酸配列産物によって制御される、malKBM核酸配列の発現を媒介するmalEFG−malKBMプロモーターの部分は、本明細書においてPKBMと称され、かつmalT核酸配列産物によって制御される、malEFG核酸配列の発現を媒介するmalEFG−malKBMプロモーターの部分は、本明細書においてPEFGと称される。PKBMの完全な誘導は、PEFGのMalT結合部位の存在を必要とする。本明細書に記載されるベクターおよび系における使用のため、malT核酸配列およびmalプロモーターの1つを備えるカセットが用いられてもよい。このカセットは、本明細書においてmalT−Pmalと称される。マルトースの存在下では、MalTタンパク質は、Pmalからの発現を可能にする正の調節エレメントである。
さらに他の実施形態では、プロモーターは、環境中のラムノースのレベルに反応するものであってもよい。上述のaraC−PBAD系と類似するように、rhaRS−PrhaBアクチベーター−プロモーター系は、ラムノースによって厳密に制御される。ラムノースプロモーター(Prha)からの発現は、ラムノースの添加によって高レベルまで誘導される、これは、細菌においては一般的であるが宿主組織ではめったに見られない。核酸配列rhaBADは、PrhaBADプロモーターによって制御される1つのオペロンに編成されている。このプロモーターは、2つのアクチベーター、RhaSおよびRhaR、によって制御され、対応する核酸配列は、rhaBAD核酸配列の反対方向に位置する1つの転写ユニットに属する。L−ラムノースが利用可能な場合、RhaRはPrhaRSプロモーターに結合し、RhaRとRhaSの産生を活性化する。L−ラムノースと一緒にRhaSは、順に、PrhaBADおよびPrhaTプロモーターに結合し、構造核酸配列(structural nucleic acid sequences)の転写を活性化する。rhaBAD転写の完全な誘導はまた、カタボライト抑制の主要なレギュレーターである、Crp−cAMP複合体の結合を必要とする。
L−アラビノースおよびL−ラムノースの両方はそれらの異化(catabolism)のためのレギュロン(regulon)の発現のためのインデューサーとして直接機能するが、制御機構に関して重要な違いが存在する。L−アラビノースは、アラビノースレギュロンの正の制御において、アクチベーターAraCと共にインデューサーとして機能する。しかしながら、L−ラムノースレギュロンは制御性カスケードに供される;それゆえ、それはaraC PBAD系よりもさらにより厳密な制御に供される。L−ラムノースは、ラムノースレギュロンの正の制御において、順に、アクチベーターとして機能する、RhaSの合成のための、アクチベーターRhaRと共にインデューサーとして機能する。本発明において、ラムノースはRhaRタンパク質と相互作用するために用いられてもよく、次いで、RhaSタンパク質は、PrhaBADプロモーターに作動可能に連結された核酸配列の転写を活性化させ得る。
さらに他の実施形態では、プロモーターは環境中のキシロースのレベルに感受性のものであってもよい。xylR−PxylA系は、別の十分に確立した誘導性アクチベーター−プロモーター系である。キシロースは、XylRおよびサイクリックAMP−Crp系によって制御されるキシロース特異的なオペロン(xylE、xylFGHR、およびxylAB)を誘導する。XylRタンパク質は、xyl核酸配列プロモーターの2つの別個の領域へ結合することにより、正のレギュレーターとして機能する。上述のaraC−PBAD系と同様に、xylR−PxylABおよび/またはxylR−PxylFGH制御系は、本発明において用いてもよい。これらの実施形態では、XylRタンパク質と相互作用するxylR PxylABキシロースは、2つのPxylプロモーターのいずれかに作動可能に連結された核酸配列の転写を活性化する。
本明細書に詳述されるプロモーターの核酸配列は当技術分野において知られており、また、リプレッサーをコードする、染色体に組み込まれた核酸配列へそれらを作動可能に連結する方法は当技術分野において知られており、かつ実施例において詳述される。
3.発現を最適化するための改変
上に詳述されるリプレッサーをコードする核酸配列および制御可能なプロモーターは、本発明における使用のため、リプレッサーをコードする核酸配列の発現レベルを最適化するように改変されてもよい。リプレッサーをコードする核酸配列の発現の最適なレベルは推定してもよく、または実験によって決定してもよい(実施例を参照のこと)。かかる決定は、以下に詳述するように、リプレッサーが単量体、二量体、三量体、四量体、またはより高度の多量体として機能するかどうかを考慮すべきであり、かつ対象の抗原をコードするベクターのコピー数もまた考慮すべきである。例示的な実施形態では、リプレッサーが、許容状態の環境(すなわち、in vitroでの生育)中では、対象の抗原をコードする核酸配列の発現を実質的に阻害するレベルで合成され、かつ、非許容状態の環境においては実質的に合成されず、それによって対象の抗原をコードする核酸配列の発現を可能にするように、発現のレベルが最適化される。
上に詳述されるリプレッサーをコードする核酸配列および制御可能なプロモーターは、本発明における使用のため、リプレッサーをコードする核酸配列の発現レベルを最適化するように改変されてもよい。リプレッサーをコードする核酸配列の発現の最適なレベルは推定してもよく、または実験によって決定してもよい(実施例を参照のこと)。かかる決定は、以下に詳述するように、リプレッサーが単量体、二量体、三量体、四量体、またはより高度の多量体として機能するかどうかを考慮すべきであり、かつ対象の抗原をコードするベクターのコピー数もまた考慮すべきである。例示的な実施形態では、リプレッサーが、許容状態の環境(すなわち、in vitroでの生育)中では、対象の抗原をコードする核酸配列の発現を実質的に阻害するレベルで合成され、かつ、非許容状態の環境においては実質的に合成されず、それによって対象の抗原をコードする核酸配列の発現を可能にするように、発現のレベルが最適化される。
上述の通り、発現のレベルはリプレッサーおよび/またはプロモーターをコードする核酸配列を改変することにより最適化してもよい。本明細書で使用するとき、「改変」は、リプレッサーをコードする核酸配列の転写のレベルにおける変化をもたらす、あるいはリプレッサーの合成のレベルにおける変化をもたらす、リプレッサーおよび/またはプロモーターの核酸配列の変化をさす。例えば、一実施形態では、改変は、リプレッサーをコードする核酸配列の開始コドンを変化させることをさす。一般的に言えば、GTGまたはTTG開始コドンは、ATG開始コドンとは対照的に、翻訳効率を10倍減少させ得る。別の実施形態では、改変は、リプレッサーをコードする核酸配列のシャイン・ダルガーノ(SD)配列を変化させることをさし得る。SD配列は、開始コドンの6−7ヌクレオチド上流に一般に位置するリボソーム結合部位である。SDコンセンサス配列はAGGAGGであり、かつコンセンサス配列のバリエーションは翻訳効率を変化させ得る。また別の実施形態では、改変は、SD配列と開始コドンの間の距離を変化させることをさし得る。さらに別の実施形態では、改変は、RNAポリメラーゼ認識のための−35配列を変化させることをさし得る。類似の実施形態では、改変は、RNAポリメラーゼ結合のための−10配列を変化させることをさし得る。さらなる実施形態では、改変は、−35配列および−10配列の間のヌクレオチドの数を変化させることをさし得る。代替的な実施形態では、改変は、リプレッサーをコードするmRNAの翻訳のレベルを変化させるために、リプレッサーをコードする核酸配列のコドンを最適化することをさし得る。例えば、リプレッサーをコードする核酸配列の開始コドン後最初の非A−リッチコドンは、リプレッサーをコードするmRNAの翻訳を最大化しないだろう。同様に、リプレッサーをコードする核酸配列のコドンが、特定の生物の高度に合成されたタンパク質由来のコドンを模倣するように変化されてもよい。さらなる実施形態では、改変は、リプレッサーをコードするmRNAの翻訳のレベルを変化させるために、リプレッサーをコードする核酸配列のGC含量を変化させることをさし得る。
いくつかの実施形態では、1より多くの改変または改変の種類がリプレッサーをコードする核酸配列の発現レベルを最適化するために実施される。例えば、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、または9個の改変または改変の種類が、リプレッサーをコードする核酸配列の発現レベルを最適化するために実施され得る。
非限定的な例として、リプレッサーがLacIである時、LacIの核酸配列およびプロモーターは次いで、LacI合成のレベルを増大するように変化され得る。一実施形態では、LacIリプレッサーの開始コドンがGTGからATGへ変更され得る。別の実施形態では、SD配列がAGGGからAGGAへ変更され得る。また別の実施形態では、lacIのコドンが、サルモネラの高度に合成されたタンパク質のためのコドン使用頻度にしたがって最適化され得る。さらなる実施形態では、lacIの開始コドンが変化され、SD配列が変化され、かつlacIのコドンが最適化され得る。
リプレッサーをコードする核酸配列および/または制御可能なプロモーターを改変する方法は当技術分野において知られており、実施例において詳述される。
4.転写終結配列(transcription termination sequence)
いくつかの実施形態では、染色体に組み込まれた、リプレッサーをコードする核酸配列は、転写終結配列をさらに含む。転写終結配列は、染色体に組み込まれた、リプレッサーをコードする核酸配列および制御可能なプロモーターに隣接する核酸配列の不適切な発現を妨げるために含まれ得る。
いくつかの実施形態では、染色体に組み込まれた、リプレッサーをコードする核酸配列は、転写終結配列をさらに含む。転写終結配列は、染色体に組み込まれた、リプレッサーをコードする核酸配列および制御可能なプロモーターに隣接する核酸配列の不適切な発現を妨げるために含まれ得る。
B.ベクター
抗原をコードする少なくとも1つの核酸配列の制御された発現が可能である、本発明の組換え細菌は、部分的に、ベクターを含む。ベクターは、プロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つの対象の抗原をコードする核酸配列を含む。プロモーターは、細菌のin vitroでの生育の間、抗原をコードする核酸の発現が抑制されるが、細菌が動物またはヒト宿主において抗原の高レベルの合成が可能であるように、染色体にコードされたリプレッサーによって制御される。ある実施形態では、しかしながら、プロモーターはまたプラスミドにコードされたリプレッサーによって制御されてもよい。
抗原をコードする少なくとも1つの核酸配列の制御された発現が可能である、本発明の組換え細菌は、部分的に、ベクターを含む。ベクターは、プロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つの対象の抗原をコードする核酸配列を含む。プロモーターは、細菌のin vitroでの生育の間、抗原をコードする核酸の発現が抑制されるが、細菌が動物またはヒト宿主において抗原の高レベルの合成が可能であるように、染色体にコードされたリプレッサーによって制御される。ある実施形態では、しかしながら、プロモーターはまたプラスミドにコードされたリプレッサーによって制御されてもよい。
本明細書で使用するとき、「ベクター」は、自律複製核酸ユニットをさす。本発明は、ウイルス、コスミド、ファスミド(phasmid)、およびプラスミドベクターを含む、任意の既知の種類のベクターで実施できる。最も好ましいベクターの種類はプラスミドベクターである。
当技術分野においてよく知られているように、プラスミドおよび他のベクターは、多様なプロモーター、マルチプルクローニング配列、転写ターミネーター(transcription terminator)等を保有し得る、また、ベクターは、ベクターの相対的なコピー数を制御することにより抗原をコードする核酸配列の発現のレベルを制御するために選択され得る。ベクターが抗原として表面局在アドヘシン(surface localized adhesin)、あるいはT細胞免疫を刺激できる抗原をコードし得るいくつかの例では、細菌細胞当たり少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10コピーなどの、低コピー数を備えるベクターを用いることが好ましいだろう。低コピー数のベクターの非限定的な例は、pSC101 oriを含むベクターであり得る。
他の場合では、中程度のコピー数のベクターが、所望の免疫応答を引き起こすために最適であるだろう。例えば、中程度のコピー数のベクターは、細菌細胞当たり少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30コピーを有し得る。中程度のコピー数のベクターの非限定的な例は、p15A oriを含むベクターであり得る。
さらに他の場合では、高コピー数のベクターが最大の抗体応答の誘導のために最適であるだろう。高コピー数のベクターは、細菌細胞当たり少なくとも31、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100コピーを有し得る。いくつかの実施形態では、高コピー数のベクターは、細菌細胞当たり少なくとも100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、または400コピーを有し得る。高コピー数のベクターの非限定的な例は、pBR oriまたはpUC oriを含むベクターを含み得る。
さらに、ベクターコピー数は、プラスミドコピー数を増大させる変異について選択することにより増大させてもよい。これらの変異は細菌の染色体において発生し得るが、プラスミドベクターにおいてより発生する可能性が高い。
好ましくは、本明細書で用いられるベクターは、ベクターの維持について選択する抗生物質耐性マーカーを含まない。
1.抗原
本明細書で使用するとき、「抗原」は、宿主において免疫応答を誘発できる生体分子をさす。いくつかの実施形態では、抗原は、タンパク質、またはタンパク質の断片、または核酸であってもよい。例示的な実施形態では、抗原は防御免疫応答を誘発する。本明細書で使用するとき、「防御(的)」は、抗原が由来するまたはそれに対する応答を誘発するように設計される、病原体での宿主の感染に関連する任意の症状の軽減に貢献する、あるいは宿主における病原体の残存(persistence)を減じることを意味する。例えば、マイコバクテリウム(Mycobacterium)などの病原体由来の防御抗原は、マイコバクテリウム感染に関連する症状を改善する、または該病原体での感染に関連する罹患率および死亡率を低減するのに役立つ、免疫応答を誘導し得る。この発明における用語「防御(的)」の使用は、宿主が病原体の影響から完全に保護されることを必ずしも必要としない。
本明細書で使用するとき、「抗原」は、宿主において免疫応答を誘発できる生体分子をさす。いくつかの実施形態では、抗原は、タンパク質、またはタンパク質の断片、または核酸であってもよい。例示的な実施形態では、抗原は防御免疫応答を誘発する。本明細書で使用するとき、「防御(的)」は、抗原が由来するまたはそれに対する応答を誘発するように設計される、病原体での宿主の感染に関連する任意の症状の軽減に貢献する、あるいは宿主における病原体の残存(persistence)を減じることを意味する。例えば、マイコバクテリウム(Mycobacterium)などの病原体由来の防御抗原は、マイコバクテリウム感染に関連する症状を改善する、または該病原体での感染に関連する罹患率および死亡率を低減するのに役立つ、免疫応答を誘導し得る。この発明における用語「防御(的)」の使用は、宿主が病原体の影響から完全に保護されることを必ずしも必要としない。
抗原は、細菌性、ウイルス性、真菌性、および寄生虫性病原体由来であってもよく、それぞれ、細菌性、ウイルス性、真菌性、および寄生虫性感染に対して保護するように設計されてもよい。あるいは、抗原は、それらが配偶子特異的である限り、配偶子に由来してもよく、かつ受精を阻止するように設計されてもよい。別の代替形態では、抗原は腫瘍抗原であってもよく、腫瘍の生育を減少するように設計されてもよい。今、知られているあるいは今後同定されるものを含む、新たに同定された、または新たに疾患もしくは病態(pathogenic condition)に関連づけられた生物、あるいは、動物またはヒトの新しいあるいは新たに出現した病原体由来の抗原が、本明細書で詳述される細菌によって発現され得ることが、特に意図される。またさらに、本発明における使用のための抗原は、病原体(pathogenic organism)に由来するものに限定されない。細菌の免疫原性は、サイトカイン、アジュバント、および他の免疫調節物質のための配列も発現する株を構築することにより、増大かつ/または調節され得る。
抗原の源として有用な微生物のいくつかの例が以下に記載される。これらは、ペスト菌(Yersinia pestis)ならびに仮性結核菌(Y.pseudotuberculosis)およびエンテロコリチカ菌(Y.enterocolitica)などの他のエルシニア(Yersinia)種によって引き起こされるペスト(plague)の制御のため、淋菌(Neisseria gonorrhoea)によって引き起こされる淋病の制御のため、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)によって引き起こされる梅毒の制御のため、およびトラコーマクラミジア(Chlamydia trachomatis)によって引き起こされる性病ならびに眼感染症の制御のための微生物を含み得る。咽喉疾患または心臓疾患を引き起こす種などの、A群およびB群の両方に由来する連鎖球菌(Streptococcus)の種、ブタ丹毒菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)および他のマイコプラズマ(Mycoplasma)種、インフルエンザ菌(Hemophilus influenza)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、らい菌(Mycobacterium leprae)、他のボルデテラ(Bordetella)種、大腸菌(Escherichia coli)、腺疫菌(Streptococcus equi)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、ウシ流産菌(Brucella abortus)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella hemolytica)およびP.マルトシダ(P.multocida)、コレラ菌(Vibrio cholera)、シゲラ(Shigella)種、ボレリア(Borrellia)種、バルトネラ(Bartonella)種、ヘリコバクター・ピロリ(Heliobacter pylori)、カンピロバクター(Campylobacter)種、シュードモナス(Pseudomonas)種、モラクセラ(Moraxella)種、ブルセラ(Brucella)種、フランシセラ(Francisella)種、エロモナス(Aeromonas)種、アクチノバチルス(Actinobacillus)種、クロストリジウム(Clostridium)種、リケッチア(Rickettsia)種、バチルス(Bacillus)種、コクシエラ(Coxiella)種、エーリキア(Ehrlichia)種、リステリア(Listeria)種、ならびにレジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)は、抗原核酸配列を得ることができるこの発明の範囲内の細菌のさらなる例である。ウイルス抗原もまた用いられ得る。ウイルス抗原は、ウイルス、DNAまたはRNAウイルスのいずれか、例えば、パポーバウイルス(Papovavirus)、アデノウイルス(Adenovirus)、ヘルペスウイルス(Herpesvirus)、ポックスウイルス(Poxvirus)、パルボウイルス(Parvovirus)、レオウイルス(Reovirus)、ピコルナウイルス(Picornavirus)、ミクソウイルス(Myxovirus)、パラミクソウイルス(Paramyxovirus)、フラビウイルス(Flavivirus)またはレトロウイルス(Retrovirus)のクラス由来、に対する、抗原運搬微生物において用いられ得る。一実施形態では、抗原はインフルエンザ抗原である。抗原はまた、病原性の真菌類、原虫類および寄生生物に由来し得る。例えば、非限定的な例として、抗原はアイメリア(Eimeria)抗原、マラリア原虫(Plasmodium)抗原、または有鉤条虫(Taenia solium)抗原であってもよい。
特定の実施形態は、抗原としてアレルゲンを包含する。アレルゲンは、それらに曝される宿主においてアレルギー反応を引き起こす物質である。I型過敏症あるいは即時型過敏症としても知られるアレルギー反応は、ある細胞性免疫応答と合わさったIgE産生によって特徴づけられる脊椎動物の免疫応答である。動物のふけおよび花粉など、様々な物質がアレルゲンとなり得、また個々の宿主のアレルギー反応は任意の特定のアレルゲンに対して変化できる。通常アレルギー反応を示す宿主において、アレルゲンに対する耐性を誘導することは可能である。耐性を誘導する方法はよく知られており、一般に、用量を増加させて宿主へアレルゲンを投与することを含む。
ベクターが抗原の完全な核酸配列を含む必要はない。用いられる抗原配列が免疫応答を誘発できることのみが必要である。抗原は親生物においてその正確な形態で見られなかったものであってもよい。例えば、75、65、55、45、35、25、15、またはたった10アミノ酸残基のみを含むペプチドが組換え細菌によって産生されるように、100アミノ酸残基を含む抗原をコードする配列が、部分的に、組換え細菌内に導入(transfer)されてもよい。あるいは、特定の抗原またはその断片のアミノ酸配列が知られている場合、自動核酸配列合成機、PCRなどによって、それらの核酸断片またはアナログを化学的に合成し、適切なコピー数のベクターへ前記核酸配列を導入することも可能であり得る。
別の代替形態では、ベクターは、それらの1つまたは全てが抗原性である、数個の核酸配列産物をコードする核酸の長い配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、本発明のベクターは、少なくとも1つの抗原、少なくとも2つの抗原、少なくとも3つの抗原、または3より多くの抗原をコードする核酸配列を含み得る。これらの抗原は、各抗原が独立して合成される、オペロンとして協調的に発現されるように作動可能に連結された2以上のオープンリーディングフレームによってコードされ得る。あるいは、抗原が融合タンパク質として合成されるように、2以上の抗原が単一のオープンリーディングフレームによってコードされてもよい。
特定の実施形態では、本発明の抗原はB細胞エピトープまたはT細胞エピトープを含み得る。あるいは、免疫応答が望まれる抗原は、抗原またはその構成部分への免疫応答を、全ての場合において、増強するために、強力な無差別のT細胞エピトープを含有し、かつ/またはアジュバントとして機能し、かつ/または抗原の提示を促進する、キャリアタンパク質への融合体として発現されてもよい。これは当技術分野において知られている方法によって達成することができる。他のエピトープ提示システムは当技術分野においてよく知られているが、tenus毒素断片C、CT−B、LT−Bおよび肝炎ウイルスBまたはウッドチャック肝炎ウイルスコアへの融合は、これらの目的に特に役立つ。
さらなる実施形態では、本発明の抗原をコードする核酸配列は分泌シグナルを含んでもよい。他の実施形態では、本発明の抗原は組換え細菌に対して毒性であってもよい。
2.リプレッサーによって制御されるプロモーター
ベクターは、染色体に組み込まれた核酸配列によってコードされる、リプレッサーによって制御されるプロモーターに作動可能に連結された、少なくとも1つの抗原をコードする核酸配列を含む。当業者は、それゆえ、リプレッサーの選択が、部分的に、対象の抗原をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターの選択に影響するということを理解するだろう。例えば、リプレッサーがLacIであるなら、プロモーターはPtrc、Plac、PT7lacおよびPtaなどのLacI反応性プロモーターからなる群から選択され得る。リプレッサーがC2であるなら、プロモーターはP22プロモーターPLおよびPRなどのC2反応性プロモーターからなる群から選択され得る。リプレッサーがC1であるなら、プロモーターはλプロモーターPLおよびPRなどのC1反応性プロモーターからなる群から選択され得る。
ベクターは、染色体に組み込まれた核酸配列によってコードされる、リプレッサーによって制御されるプロモーターに作動可能に連結された、少なくとも1つの抗原をコードする核酸配列を含む。当業者は、それゆえ、リプレッサーの選択が、部分的に、対象の抗原をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターの選択に影響するということを理解するだろう。例えば、リプレッサーがLacIであるなら、プロモーターはPtrc、Plac、PT7lacおよびPtaなどのLacI反応性プロモーターからなる群から選択され得る。リプレッサーがC2であるなら、プロモーターはP22プロモーターPLおよびPRなどのC2反応性プロモーターからなる群から選択され得る。リプレッサーがC1であるなら、プロモーターはλプロモーターPLおよびPRなどのC1反応性プロモーターからなる群から選択され得る。
本明細書における各実施形態において、リプレッサーが合成される場合(すなわち細菌のin vitroでの生育の間)、抗原をコードする核酸配列の発現が抑制されるが、リプレッサーが合成されない場合(すなわち動物またはヒト宿主において)、抗原をコードする核酸配列の発現が高いように、プロモーターが抗原をコードする核酸配列の発現を制御する。一般的に言えば、リプレッサーの濃度は、リプレッサーをコードする核酸配列の発現が停止した後、細胞分裂ごとに減少できる。いくつかの実施形態では、リプレッサーの濃度は、細菌の約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12分裂後、抗原をコードする核酸配列の高レベルの発現を可能とするのに十分に減少する。例示的な実施形態では、リプレッサーの濃度は、動物またはヒト宿主における細菌の約5分裂後、抗原をコードする核酸配列の高レベルの発現を可能とするのに十分に減少する。
特定の実施形態では、プロモーターは他の調節エレメントを含んでもよい。例えば、リプレッサーがLacIである場合、プロモーターはlacOを含んでもよい。これは、LacI結合ドメインlacOを保有するのでLacIによって制御される、リポタンパク質プロモーターPlppに当てはまる。
一実施形態では、リプレッサーはLacIリプレッサーであり、プロモーターはPtrcである。
3.抗原をコードする核酸配列の発現
上に詳述されるように、一般的に言えば、抗原をコードする核酸配列の発現は、リプレッサーが合成される場合、抑制されるはずである。例えば、リプレッサーが細菌のin vitroでの生育の間、合成される場合、抗原をコードする核酸配列の発現は抑制されるはずである。発現は、それが非抑制状態下での発現の約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、1%、またはたった1%未満である時、「抑制」または「部分的に抑制」され得る。したがって、「完全な抑制」の条件下での発現のレベルは過度に低いだろうが、抑制は決して絶対的ではないので、非常に高感度な方法を用いて検出することが可能である。
上に詳述されるように、一般的に言えば、抗原をコードする核酸配列の発現は、リプレッサーが合成される場合、抑制されるはずである。例えば、リプレッサーが細菌のin vitroでの生育の間、合成される場合、抗原をコードする核酸配列の発現は抑制されるはずである。発現は、それが非抑制状態下での発現の約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、1%、またはたった1%未満である時、「抑制」または「部分的に抑制」され得る。したがって、「完全な抑制」の条件下での発現のレベルは過度に低いだろうが、抑制は決して絶対的ではないので、非常に高感度な方法を用いて検出することが可能である。
反対に、抗原をコードする核酸配列の発現は、リプレッサーをコードする核酸配列の発現が抑制される場合、高いはずである。例えば、リプレッサーをコードする核酸配列が宿主における組換え細菌の生育の間、発現されない場合、抗原をコードする核酸配列の発現は高いはずである。本明細書で使用するとき、「高レベル」の発現は、抗原に対する免疫応答を誘発するのに十分に強力である発現をさす。その結果として、高レベルの発現と相関するコピー数は、抗原および所望の免疫応答の種類によって、変化でき、変化するだろう。抗体レベルまたは抗原依存性T細胞集団もしくは抗原依存性サイトカインレベルを測定することによるなどの、抗原が免疫応答を誘発するかどうかを決定する方法は、当技術分野において知られており、かつ、転写されたmRNAレベルを測定することにより、または抗原合成のレベルを定量することにより、抗原をコードする核酸配列の発現のレベルを測定する方法もまた、当技術分野において知られている。
ii.8ユニットウイルスベクター
分節化ゲノム(segmented genome)由来の弱毒化ウイルスを生成できる単一のベクターが開発されている。栄養要求性の細菌キャリアは、この発現ベクターを有し、in vitro培養細胞へ運搬することができ、結果として、弱毒化または非弱毒化のいずれかであるウイルスの回収をもたらす。有利なことに、発現ベクターは37℃で細菌において安定であり、真核細胞へトランスフェクトされる場合、従来のマルチベクター系より高いウイルスの力価を産生する。
分節化ゲノム(segmented genome)由来の弱毒化ウイルスを生成できる単一のベクターが開発されている。栄養要求性の細菌キャリアは、この発現ベクターを有し、in vitro培養細胞へ運搬することができ、結果として、弱毒化または非弱毒化のいずれかであるウイルスの回収をもたらす。有利なことに、発現ベクターは37℃で細菌において安定であり、真核細胞へトランスフェクトされる場合、従来のマルチベクター系より高いウイルスの力価を産生する。
発現ベクターは一般に、少なくとも2つの種類の転写カセットを有する、プラスミドを含む。1種類の転写カセットはvRNA産生のために設計される。他の種類の転写カセットはvRNA、およびmRNA両方の産生のために設計される。当業者によって理解されるように、転写カセットの数、および互いに対するベクター内でのそれらの配置は、産生される分節化ウイルスによって、変化でき、変化するだろう。発現ベクターのこれらの成分の各々は、以下に、より詳細に記載される。
発現ベクターは、いくつかの異なる分節型および非分節型ウイルスを産生するために利用されてもよい。発現ベクターから産生され得るウイルスは、プラス鎖(positive−sense)RNAウイルス、マイナス鎖(negative−sense)RNAウイルスおよび二本鎖RNA(ds−RNA)ウイルスを含む。
一実施形態では、ウイルスはプラス鎖RNAウイルスであってもよい。プラス鎖RNAウイルスの非限定的な例には、アルテリウイルス科(Arteriviridae)、カリシウイルス科(Caliciviridae)、コロナウイルス科(Coronaviridae)、フラビウイルス科(Flaviviridae)、ピコルナウイルス科(Picornaviridae)、ロニウイルス科(Roniviridae)、およびトガウイルス科(Togaviridae)のファミリーのウイルスが挙げられ得る。プラス鎖RNAウイルスの非限定的な例には、SARSコロナウイルス、デング熱ウイルス、A型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ノーウォークウイルス、風疹ウイルス、西ナイルウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルスおよび黄熱ウイルスが挙げられ得る。
一実施形態では、ウイルスは二本鎖RNA(ds−RNA)ウイルスであってもよい。分節型二本鎖RNAウイルスの非限定的な例には、レオウイルス科(Reoviridae)のファミリーのウイルスが挙げられ、かつ、アクアレオウイルス(aquareovirus)、ブルータングウイルス(blue tongue virus)、コルティウイルス(coltivirus)、サイポウイルス(cypovirus)、フィジウイルス(fijivirus)、イドノレオウイルス(idnoreovirus)、マイコレオウイルス(mycoreovirus)、オルビウイルス(orbivirus)、オルトレオウイルス(orthoreovirus)、オリザウイルス(oryzavirus)、フィトレオウイルス(phytoreovirus)、ロタウイルス(rotavirus)およびセドルナウイルス(seadornavirus)が挙げられ得る。
また別の実施形態では、ウイルスはマイナス鎖RNAウイルスであってもよい。マイナス鎖RNAウイルスは、それぞれ、6から8、3、または2つのマイナス鎖vRNA分節を有する、オルソミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)、ブニヤウイルス科(Bunyaviridae)、およびアレナウイルス科(Arenaviridae)のファミリーに属するウイルスであり得る。マイナス鎖RNAウイルスの非限定的な例には、ソゴトウイルス(thogotovirus)、イサウイルス(isavirus)、ブニヤウイルス(bunyavirus)、ハンタウイルス(hantavirus)、ナイロウイルス(nairovirus)、フレボウイルス(phlebovirus)、トスポウイルス(tospovirus)、テヌイウイルス(tenuivirus)、オフィオウイルス(ophiovirus)、アレナウイルス(arenavirus)、デルタウイルス(deltavirus)およびインフルエンザウイルス(influenza virus)が挙げられ得る。
別の態様では、本発明はインフルエンザウイルスを生成できる発現ベクターを提供する。インフルエンザウイルスの3つの既知の属:A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルスおよびC型インフルエンザウイルスが存在する。これらの種類のインフルエンザウイルスの各々は、本発明の単一の発現ベクターを利用して産生され得る。
1つの例示的な実施形態では、発現ベクターはA型インフルエンザウイルスを産生するために利用される。A型インフルエンザウイルスは、合計10から11タンパク質をコードする、PA、PB1、PB2、HA、NP、NA、MおよびNSを含む、8つのvRNA分節のゲノムを保有する。複製周期を開始するために、vRNAおよびウイルス複製タンパク質はウイルスのリボ核タンパク質(RNP)を形成しなければならない。インフルエンザRNPは、ウイルスの核タンパク質によってキャプシド形成されたマイナス鎖ウイルスRNA(vRNA)、ならびにPA、PB1およびPB2タンパク質によって形成されるウイルスポリメラーゼ複合体からなる。RNAポリメラーゼ複合体は、3つの異なる反応:宿主翻訳機構による翻訳に必須の5’キャップおよび3’polyA構造を有するmRNA;完全長の相補RNA(cRNA)、および鋳型としてcRNAを用いる染色体vRNA、の合成を触媒する。新たに合成されたvRNAs、NPおよび、PB1、PB2およびPAポリメラーゼタンパク質は、次いで、さらなる複製またはキャプシド形成および子孫ウイルス粒子の放出のため、新たなRNPに構築(assemble)される。それゆえ、逆遺伝学システムを用いてインフルエンザウイルスを産生するために、8つ全てのvRNAおよび複製に必須のウイルスタンパク質(NP、PB1、PB1およびPA)を発現するmRNAが合成されなければならない。本発明の発現ベクターは、これらのvRNAおよびmRNAの全てを産生するために利用され得る。
発現ベクターはまた、本発明の範囲から逸脱することなく、A型インフルエンザウイルスの任意の血清型を産生するために利用され得る。A型インフルエンザウイルスは、HA vRNA分節によってコードされるウイルス表面タンパク質ヘマグルチニン(HAまたはH)、およびNA vRNA分節によってコードされるノイラミニダーゼ(NAまたはN)への抗体反応に基づいて、血清型に分類される。A型インフルエンザウイルスの少なくとも16のHサブタイプ(または血清型)および9のNサブタイプが同定されている。1より多くのインフルエンザウイルスが1人の宿主に感染する時、変異によって、または8つのvRNA分節の遺伝子再集合によって、新しいインフルエンザウイルスが絶えず産生されている。例として、既知のインフルエンザ血清型には、H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H9N2、およびH10N7血清型が挙げられ得る。
A.ベクター
本発明の発現ベクターはベクターを含み得る。8ユニットウイルスベクターに関して使用するとき、「ベクター」は、自律複製核酸ユニットをさす。本発明は、ウイルス、コスミド、ファスミド(phasmid)、およびプラスミドベクターを含む、任意の既知の種類のベクターで実施できる。最も好ましいベクターの種類はプラスミドベクターである。当技術分野においてよく知られているように、プラスミドおよび他のベクターは、多様なプロモーター、マルチプルクローニング配列、および転写ターミネーターを保有し得る。
本発明の発現ベクターはベクターを含み得る。8ユニットウイルスベクターに関して使用するとき、「ベクター」は、自律複製核酸ユニットをさす。本発明は、ウイルス、コスミド、ファスミド(phasmid)、およびプラスミドベクターを含む、任意の既知の種類のベクターで実施できる。最も好ましいベクターの種類はプラスミドベクターである。当技術分野においてよく知られているように、プラスミドおよび他のベクターは、多様なプロモーター、マルチプルクローニング配列、および転写ターミネーターを保有し得る。
ベクターは、高コピー数、中程度のコピー数、または低コピー数を有し得る。コピー数は、転写カセットのための発現レベルを制御するため、および発現ベクターの安定性を制御するための手段として、利用され得る。一実施形態では、高コピー数のベクターが利用され得る。高コピー数のベクターは、細菌細胞当たり少なくとも31、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100コピーを有し得る。他の実施形態では、高コピー数のベクターは、細菌細胞当たり少なくとも100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、または400コピーを有し得る。高コピー数のベクターの非限定的な例には、pBR oriまたはpUC oriを含むベクターが挙げられ得る。代替的な実施形態では、低コピー数のベクターが利用され得る。例えば、低コピー数のベクターは、細菌細胞当たり1、または少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10コピーを有し得る。低コピー数のベクターの非限定的な例は、pSC101 oriを含むベクターであり得る。例示的な実施形態では、中程度のコピー数のベクターが用いられ得る。例えば、中程度のコピー数のベクターは、細菌細胞当たり少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30コピーを有し得る。中程度のコピー数のベクターの非限定的な例は、p15A oriを含むベクターであり得る。
ベクターは選択可能なマーカーをさらに含んでもよい。一般的に言えば、選択可能なマーカーは、細胞が特定の化合物への耐性を獲得する、または特定の条件下で生存できるような、宿主細胞が作製できない産物をコードする。例えば、マーカーは抗生物質耐性因子をコードしてもよい。抗生物質耐性マーカーの適切な例には、カナマイシン、スペクトマイシン、ネオマイシン、ジェネティシン(G418)、アンピシリン、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコール(chlorampenicol)に対する耐性を与えるタンパク質をコードするものが挙げられるが、それらに限定されない。選択可能なマーカーは、クロルスルフロンまたはホスフィノトリシン(phosphinotricin)アセチルトランスフェラーゼなどの、除草剤に対する耐性を与えるタンパク質をコードしてもよい。他の適切な選択可能なマーカーには、それぞれtk−およびapr−細胞における選択を可能にする、チミジンキナーゼ(tk)およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(apr)遺伝子、およびメトトレキサートまたはトリメトプリムに対する耐性を与えるジヒドロ葉酸(dihydrofloate)還元酵素(dhfr)遺伝子が挙げられる。さらに他の場合では、ベクターは、キャリア細菌内に存在し、キャリア細菌によって運搬される場合に、平衡致死または平衡弱毒化ベクター−宿主系において発現ベクターが用いられる場合、選択可能なAsd+、MurA+、AroA+、DadB+、Alr+、AroC+、AroD+、IlvC+および/またはIlvE+を有し得る。
いくつかの実施形態では、ベクターはまた、非ウイルスレポータータンパク質のための転写カセットを含んでもよい。例として、レポータータンパク質には、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびそれらのバリアントが挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、ベクターはまた、DNA核標的配列(DTS)を含んでもよい。DTSの非限定的な例には、SV40 DNA核標的配列が挙げられ得る。他の実施形態では、ベクターはまた、NF−κBおよび/またはAP−2(配列番号xx:GGGGACTTTCCGGGGACTTTCCTCCCCACGCGGGGGACTTTCCGCCACGGGCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCC)などの、転写因子のための人工的な結合部位を含んでもよい。転写因子NF−κBは、ほとんど全ての動物細胞種において見られる。サルモネラ感染は、NF−κBの発現を速やかに刺激し、かつ、NF−κBメンバーのそれらのDNA結合部位(κB部位)への結合アフィニティーは高く、かつNF−κB−DNA複合体の核への移行は急速(分)である。κB部位を備えるプラスミドDNAは、新たに合成されたNF−κBが細胞質においてプラスミドDNAに結合し、タンパク質核輸入機構(import machinery)によって核にそれを輸送できるようする。導入遺伝子に対するそれらの位置によって、結合部位はまた、遺伝子発現レベルをさらに増大させる転写エンハンサーとして機能することができた。SV40 DTS、NF−κB、およびAP−2結合配列は、プラスミドDNAの核輸入を促進し、かつ、これはベクター上の遺伝子配列の転写を促進する。
B.vRNA発現のための転写カセット
発現ベクターは、vRNA産生のための少なくとも1つの転写カセットを含む。一般的に言えば、vRNA産生のための転写カセットは、最小限、PolI転写終結配列に連結されたウイルスcDNAに作動可能に連結されたPolIプロモーターを含む。例示的な実施形態では、転写カセットはまた、核標的配列を含んでもよい。発現ベクター内のvRNA産生のための転写カセットの数は、産生されるウイルスによって、変化でき、変化するだろう。例えば、発現ベクターは、vRNA産生のための2、3、4、5、6、7、または8以上の転写カセットを含んでもよい。産生されるウイルスがインフルエンザである場合、ベクターは、典型的には、vRNA産生のための4つの転写カセットを含むことができる。
発現ベクターは、vRNA産生のための少なくとも1つの転写カセットを含む。一般的に言えば、vRNA産生のための転写カセットは、最小限、PolI転写終結配列に連結されたウイルスcDNAに作動可能に連結されたPolIプロモーターを含む。例示的な実施形態では、転写カセットはまた、核標的配列を含んでもよい。発現ベクター内のvRNA産生のための転写カセットの数は、産生されるウイルスによって、変化でき、変化するだろう。例えば、発現ベクターは、vRNA産生のための2、3、4、5、6、7、または8以上の転写カセットを含んでもよい。産生されるウイルスがインフルエンザである場合、ベクターは、典型的には、vRNA産生のための4つの転写カセットを含むことができる。
用語「ウイルスcDNA」は、本明細書で使用するとき、RNAウイルスゲノムのvRNA分節に対応するデオキシリボ核酸(cDNA)配列のコピーをさす。ウイルスRNA分節のcDNAコピーは、当技術分野において知られている標準的な分子生物学的技術を用いて、vRNAから得てもよい(例えば、Sambrook et al. (1989) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, およびKnipe et al (2006) “Virology”, Fifth Edition, Lippincott Williams & Wilkins; editionを参照のこと)。いくつかの実施形態では、cDNAは、天然に発生するウイルス株またはin vitroで一般に用いられるウイルスに由来し得る。他の実施形態では、cDNAは、当技術分野において知られている方法を用いて、in vitroでcDNA配列を生成することによって合成的に得てもよい。天然または合成cDNA配列は、変異および配列変化を導入するために、さらに変化させてもよい。例として、天然に発生するウイルス配列は、ウイルスを弱毒化するために、in vitro培養のためにウイルスを適合させるために、またはコードされるウイルスタンパク質にタグを付けるために、変化させてもよい。
プロモーターの選択は、変化でき、変化するだろう。用語「プロモーター」は、ウイルスカセットに関して使用するとき、核酸の発現を与える、活性化する、または増強することができる、合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに増強するため、かつ/または、核酸の空間的発現(spatial expression)および/または時間的発現(temporal expression)を変化させるために、1以上の特定の転写制御配列を含み得る。プロモーターは、ウイルス、原核生物、ファージまたは真核生物起源のものであってもよい。プロモーターの非限定的な例には、T7プロモーター、T3プロモーター、SP6プロモーター、RNAポリメラーゼIプロモーターおよびそれらの組み合わせが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは各転写カセットにおいて異なってもよい。好ましい実施形態では、プロモーターは各転写カセットにおいて同じであってもよい。この実施形態の好ましい代替形態では、プロモーターはRNAポリメラーゼI(Pol I)プロモーターであり得る。この実施形態の例示的な代替形態では、プロモーターはヒトPol Iプロモーターであり得る。この実施形態の別の例示的な代替形態では、プロモーターはニワトリPol Iプロモーターであり得る。
プロモーターは、マイナス鎖vRNAまたはプラス鎖cRNAを産生するために、cDNAに作動可能に連結され得る。この実施形態の例示的な代替形態では、プロモーターは、マイナス鎖vRNAを産生するために、cDNAに作動可能に連結され得る。
転写カセットはまた、ウイルスcDNA配列の終わりで転写終結を引き起こす、ターミネーター配列を含む。非限定的な例として、本発明に適したターミネーター配列には、Pol Iターミネーター、後期SV40ポリアデニル化シグナル、CMVポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、または合成ポリアデニル化シグナルが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、ターミネーターは各転写カセットにおいて異なってもよい。好ましい実施形態では、ターミネーターは各転写カセットにおいて同じであってもよい。この実施形態の1つの代替形態では、Pol IターミネーターはヒトPol Iターミネーターであり得る。例示的な実施形態では、ターミネーターはマウスPol Iターミネーターであり得る。この実施形態の例示的な代替形態では、発現カセットのターミネーター配列は、マウスPol Iターミネーターの切断バージョンであり得る。
複製の間、適切に機能するために、転写カセットから転写されたvRNAは一般に、過剰な非ウイルス配列を含まない正確な5’および3’末端を有する。用いられるプロモーターおよびターミネーターに応じて、これはプロモーターおよびターミネーターへの正確な融合によって達成され得る、あるいは、例として、転写カセットは、転写物の末端にリボザイムを含んでもよく、ここでリボザイムは、vRNAにおいて見られるように、5’および3’末端の配列が生成されるような方法で、転写物を切断するものである。
当業者によって理解されるように、発現ベクターがインフルエンザウイルスを産生する場合、発現ベクターは、vRNA産生のための少なくとも1つの転写カセットを含み得る。転写カセットは、(1)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスHA cDNAに作動可能に連結されたPol Iプロモーター;(2)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNA cDNAに作動可能に連結されたPol Iプロモーター;(3)PolI転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスM cDNAに作動可能に連結されたPol Iプロモーター;および(4)PolI転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNS cDNAに作動可能に連結されたPolIプロモーターからなる群から選択され得る。発現ベクターは、これらの転写カセットの少なくとも2、3、または4つを含んでもよい。例示的な実施形態では、発現ベクターはまた、1つまたは2つの異なる核標的配列(例えば、SV40 DTSならびにNF−κBおよび/またはAP−2などの転写因子のための人工的な結合配列)を含むことができる。
発現ベクターがインフルエンザウイルスを産生する場合の例示的な実施形態では、発現ベクターは、vRNA産生のための4つの転写カセットを含むことができる。この実施形態のための転写カセットは、(1)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスHA cDNAに作動可能に連結されたPol Iプロモーター;(2)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNA cDNAに作動可能に連結されたPol Iプロモーター;(3)PolI転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスM cDNAに作動可能に連結されたPol Iプロモーター;および(4)PolI転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNS cDNAに作動可能に連結されたPolIプロモーターを含むことができる。例示的な実施形態では、発現ベクターはまた、1つまたは2つの異なる核標的配列(例えば、SV40 DTSならびにNF−κBおよび/またはAP−2などの転写因子のための人工的な結合配列)を含むことができる。
C.vRNAおよびmRNA発現のための転写カセット
発現ベクターは、vRNAおよびmRNA産生のための少なくとも1つの転写カセットを含む。典型的には、vRNAおよびmRNA産生のための転写カセットは、最小限、Pol I転写終結配列に連結されたウイルスcDNAに作動可能に連結されたPol Iプロモーター、ならびにウイルスcDNAに作動可能に連結されたPolllプロモーターおよびPolll転写終結配列を含む。例示的な実施形態では、転写カセットはまた、核標的配列を含むことができる。発現ベクター内のvRNAおよびmRNA産生のための転写カセットの数は、産生されるウイルスによって、変化でき、変化するだろう。例えば、発現ベクターは、vRNAおよびmRNA産生のための2、3、4、5、6、7、または8以上の転写カセットを含んでもよい。産生されるウイルスがインフルエンザである場合、発現カセットは、典型的には、vRNAおよびmRNA産生のための4つの転写カセットを含み得る。
発現ベクターは、vRNAおよびmRNA産生のための少なくとも1つの転写カセットを含む。典型的には、vRNAおよびmRNA産生のための転写カセットは、最小限、Pol I転写終結配列に連結されたウイルスcDNAに作動可能に連結されたPol Iプロモーター、ならびにウイルスcDNAに作動可能に連結されたPolllプロモーターおよびPolll転写終結配列を含む。例示的な実施形態では、転写カセットはまた、核標的配列を含むことができる。発現ベクター内のvRNAおよびmRNA産生のための転写カセットの数は、産生されるウイルスによって、変化でき、変化するだろう。例えば、発現ベクターは、vRNAおよびmRNA産生のための2、3、4、5、6、7、または8以上の転写カセットを含んでもよい。産生されるウイルスがインフルエンザである場合、発現カセットは、典型的には、vRNAおよびmRNA産生のための4つの転写カセットを含み得る。
vRNAを産生するのに適したウイルスcDNA、Pol IプロモーターおよびPol Iターミネーターは、上記(e)iiB欄に記載される。
mRNA産生のため、各転写カセットは、cDNAに作動可能に連結されたPol llプロモーターおよびPol ll終結配列を含む。プロモーターの非限定的な例には、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、シミアンウイルス40(SV40)初期プロモーター、ユビキチンCプロモーターまたは伸長因子1アルファ(EF1α)プロモーターが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは各転写カセットにおいて異なってもよい。好ましい実施形態では、プロモーターは各転写カセットにおいて同じであってもよい。この実施形態の好ましい代替形態では、プロモーターはCMV Pol IIプロモーターであり得る。
各転写カセットはまた、Pol IIターミネーター配列を含む。非限定的な例として、本発明に適したターミネーター配列には、後期SV40ポリアデニル化シグナル、CMVポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナル、または合成ポリアデニル化シグナルが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、ターミネーターは各転写カセットにおいて異なってもよい。好ましい実施形態では、ターミネーターは各転写カセットにおいて同じであってもよい。例示的な実施形態では、ターミネーターはBGHポリアデニル化シグナルであり得る。この実施形態の例示的な代替形態では、発現カセットのターミネーター配列は、BGHポリアデニル化シグナルの切断バージョンであり得る。
vRNA複製を開始する際に適切に機能するために、転写カセットから転写されたmRNAは、宿主細胞翻訳機構による適切な翻訳のためのシグナルを含有し得る。PolIIプロモーターから転写されたほとんどの細胞性mRNAは、mRNA翻訳を促進するために、転写後、5’末端でキャップされ、かつ3’末端でポリアデニル化される。しかしながら、いくつかの細胞性mRNAおよび多くのウイルスmRNAは、5’キャップ構造または3’ポリA構造がない場合、mRNAの翻訳を促進する他の配列をコードする。例として、いくつかの細胞性mRNAおよびウイルスmRNAは、機能的に5’キャップの代わりとなることができる、配列内リボソーム進入部位(IRES)をコードし得る。別の例として、いくつかのmRNAおよびウイルスmRNAは、mRNAの3’末端に、シュードノット(pseudoknot)などの、機能的に3’ポリAの代わりとなることができる、RNA構造をコードし得る。例示的な実施形態では、転写カセットから転写されたmRNAは、5’末端でキャップされ、かつ3’末端でポリアデニル化される。
当業者によって理解されるように、発現ベクターがインフルエンザウイルスを産生する場合、発現ベクターは、vRNAおよびmRNA産生のための少なくとも1つの転写カセットを含み得る。転写カセットは、(1)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPA cDNAに作動可能に連結されたPol IプロモーターならびにPA cDNAに作動可能に連結されたPol llプロモーターおよびPol ll転写終結配列;(2)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPB1 cDNAに作動可能に連結されたPol IプロモーターならびにPB1 cDNAに作動可能に連結されたPol llプロモーターおよびPol ll転写終結配列;(3)PolI転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPB2 cDNAに作動可能に連結されたPol IプロモーターならびにPB2 cDNAに作動可能に連結されたPol llプロモーターおよびPol ll転写終結配列;および(4)PolI転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNP cDNAに作動可能に連結されたPolIプロモーターならびにNP cDNAに作動可能に連結されたPol llプロモーターおよびPol ll転写終結配列からなる群から選択され得る。発現ベクターは、これらの転写カセットの少なくとも2、3、または4つを含んでもよい。例示的な実施形態では、発現ベクターはまた、1つまたは2つの異なる核標的配列(例えば、SV40 DTSあるいはNF−κBおよび/またはAP−2などの転写因子のための人工的な結合配列)を含むことができる。
発現ベクターがインフルエンザウイルスを産生する場合の例示的な実施形態では、発現ベクターは、vRNAおよびmRNA産生のための4つの転写カセットを含むことができる。この実施形態のための転写カセットは、(1)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPA cDNAに作動可能に連結されたPol IプロモーターならびにPA cDNAに作動可能に連結されたPol llプロモーターおよびPol ll転写終結配列;(2)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPB1 cDNAに作動可能に連結されたPol IプロモーターならびにPB1 cDNAに作動可能に連結されたPol llプロモーターおよびPol ll転写終結配列;(3)PolI転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPB2 cDNAに作動可能に連結されたPol IプロモーターならびにPB2 cDNAに作動可能に連結されたPol llプロモーターおよびPol ll転写終結配列;および(4)PolI転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNP cDNAに作動可能に連結されたPolIプロモーターならびにNP cDNAに作動可能に連結されたPolllプロモーターおよびPol ll転写終結配列を含むことができる。例示的な実施形態では、各発現プラスミド構築物はまた、1つまたは2つの異なる核移行シグナル(例えば、SV40 DTSあるいはNF−κBおよび/またはAP−2などの転写因子のための人工的な結合配列)を含むことができる。
D.例示的な発現ベクター
本発明の例示的な反復では、単一の発現ベクターは、宿主細胞におけるインフルエンザウイルスの産生に必要なゲノム分節の全てを含むことができる。上に詳述されるように、インフルエンザウイルスの産生のためには、HA、NA、NS、およびM vRNAが産生されなければならず、かつPA、PB1、PB2、およびNP vRNAならびにmRNAが産生されなければならない。この反復のため、発現ベクターは、vRNA産生のための4つの転写カセットおよびvRNAおよびmRNA産生のための4つの転写カセットを含むことができる。vRNA産生のための4つの転写カセットは、(1)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスHA cDNAに作動可能に連結されたPol Iプロモーター;(2)PolI転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNA cDNAに作動可能に連結されたPol Iプロモーター;(3)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスM cDNAに作動可能に連結されたPol Iプロモーター;および(4)PolI転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNS cDNAに作動可能に連結されたPol Iプロモーターを含むことができる。vRNAおよびmRNA産生のための4つの転写カセットは、(1)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPA cDNAに作動可能に連結されたPol IプロモーターならびにPA cDNAに作動可能に連結されたPol llプロモーターおよびPol ll転写終結配列;(2)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPB1 cDNAに作動可能に連結されたPol IプロモーターならびにPB1 cDNAに作動可能に連結されたPol llプロモーターおよびPol ll転写終結配列;(3)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPB2 cDNAに作動可能に連結されたPol IプロモーターならびにPB2 cDNAに作動可能に連結されたPol llプロモーターおよびPolll転写終結配列;および(4)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNP cDNAに作動可能に連結されたPol IプロモーターならびにNP cDNAに作動可能に連結されたPol llプロモーターおよびPolll転写終結配列を含むことができる。発現ベクターはまた、好ましくは、1つまたは2つの異なる核移行シグナル(例えば、SV40 DTSあるいはNF−κBおよび/またはAP−2などの転写因子のための人工的な結合配列)を含むことができる。例示的な実施形態では、ベクターはプラスミドである。プラスミドは一般に、低または中程度のコピー数のプラスミドとすることができる。
本発明の例示的な反復では、単一の発現ベクターは、宿主細胞におけるインフルエンザウイルスの産生に必要なゲノム分節の全てを含むことができる。上に詳述されるように、インフルエンザウイルスの産生のためには、HA、NA、NS、およびM vRNAが産生されなければならず、かつPA、PB1、PB2、およびNP vRNAならびにmRNAが産生されなければならない。この反復のため、発現ベクターは、vRNA産生のための4つの転写カセットおよびvRNAおよびmRNA産生のための4つの転写カセットを含むことができる。vRNA産生のための4つの転写カセットは、(1)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスHA cDNAに作動可能に連結されたPol Iプロモーター;(2)PolI転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNA cDNAに作動可能に連結されたPol Iプロモーター;(3)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスM cDNAに作動可能に連結されたPol Iプロモーター;および(4)PolI転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNS cDNAに作動可能に連結されたPol Iプロモーターを含むことができる。vRNAおよびmRNA産生のための4つの転写カセットは、(1)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPA cDNAに作動可能に連結されたPol IプロモーターならびにPA cDNAに作動可能に連結されたPol llプロモーターおよびPol ll転写終結配列;(2)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPB1 cDNAに作動可能に連結されたPol IプロモーターならびにPB1 cDNAに作動可能に連結されたPol llプロモーターおよびPol ll転写終結配列;(3)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPB2 cDNAに作動可能に連結されたPol IプロモーターならびにPB2 cDNAに作動可能に連結されたPol llプロモーターおよびPolll転写終結配列;および(4)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNP cDNAに作動可能に連結されたPol IプロモーターならびにNP cDNAに作動可能に連結されたPol llプロモーターおよびPolll転写終結配列を含むことができる。発現ベクターはまた、好ましくは、1つまたは2つの異なる核移行シグナル(例えば、SV40 DTSあるいはNF−κBおよび/またはAP−2などの転写因子のための人工的な結合配列)を含むことができる。例示的な実施形態では、ベクターはプラスミドである。プラスミドは一般に、低または中程度のコピー数のプラスミドとすることができる。
互いに対する単一の発現ベクター内での転写カセットの配置および方向は、本発明の範囲から逸脱することなく、変化でき、変化するだろう。しかしながら、いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、vRNAカセットならびにvRNAおよびmRNAカセットの対における転写カセットの配置が好ましい、なぜなら、それは、組換えの程度を低減し、その結果、増大した遺伝的安定性を有する発現ベクターを生じさせ得るからである。
特定の実施形態において、インフルエンザゲノム分節が、本発明の範囲から逸脱することなく、単一の発現ベクターより多くから産生され得ることもまた想定されている。ゲノム分節は、例えば、2、3、または4以上の異なる発現ベクターから産生されてもよい。この実施形態の反復では、NS、およびM vRNA、ならびにPA、PB1、PB2、およびNP vRNAならびにmRNAが、単一の発現ベクターから産生される。この反復のため、発現ベクターは、vRNA産生のための2つの転写カセットならびにvRNAおよびmRNA産生のための4つの転写カセットを含むことができる。vRNA産生のための2つの転写カセットは、(1)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスM cDNAに作動可能に連結されたPol Iプロモーター;および(2)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNS cDNAに作動可能に連結されたPol Iプロモーターを含むことができる。vRNAおよびmRNA産生のための4つの転写カセットは、(1)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPA cDNAに作動可能に連結されたPol IプロモーターならびにPA cDNAに作動可能に連結されたPol llプロモーターおよびPol ll転写終結配列;(2)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPB1 cDNAに作動可能に連結されたPol IプロモーターならびにPB1 cDNAに作動可能に連結されたPol llプロモーターおよびPol ll転写終結配列;(3)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPB2 cDNAに作動可能に連結されたPol IプロモーターならびにPB2 cDNAに作動可能に連結されたPol llプロモーターおよびPol ll転写終結配列;および(4)PolI転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNP cDNAに作動可能に連結されたPol IプロモーターならびにNP cDNAに作動可能に連結されたPol llプロモーターおよびPol ll転写終結配列を含むことができる。HA vRNAおよびNA vRNAの発現は、(1)PolI転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスHA cDNAに作動可能に連結されたPolIプロモーター;および(2)Pol I転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNA cDNAに作動可能に連結されたPolIプロモーターを含む、2つの転写カセットを含む単一の発現ベクターからであってもよい。あるいは、HA vRNAおよびNA vRNAの発現は、2つの別個の発現ベクターからであってもよい。
いくつかの実施形態では、制限消化部位が発現ベクターにおける都合のよい位置に配置されてもよい。例として、cDNAの末端に配置された制限酵素部位を用いて、ウイルスの所望の遺伝子再集合または株を産生するために、cDNA分節の交換を促進し得る。別の例として、転写カセットの末端に配置された制限酵素部位を用いて、ウイルスの所望の遺伝子再集合または株を産生するために、転写カセットの交換を促進し得る。適切な、エンドヌクレアーゼ制限部位は、二本鎖核酸を切断する制限酵素によって認識される部位を含む。非限定的な例として、これらの部位には、AarI、AccI、AgeI、Apa、BamHI、BgIl、BglIl、BsiWI、BssHI、BstBI、ClaI、CviQI、DdeI、DpnI、DraI、EagI、EcoRI、EcoRV、FseI、FspI、HaeII、HaeIII、HhaI、HincII、HindIII、HpaI、HpaII、KpnI、KspI、MboI、MfeI、NaeI、NarI、NcoI、NdeI、NgoMIV、NheI、NotI、PacI、PhoI、PmlI、PstI、PvuI、PvuII、SacI、SacII、SalI、SbfI、SmaI、SpeI、SphI、SrfI、StuI、TaqI、TfiI、TliI、XbaI、XhoI、XmaI、XmnI、およびZraIが挙げられ得る。この実施形態の例示的な代替形態では、制限酵素部位はAarIであり得る。
iii.核酸ワクチンベクター
本発明の組換え細菌は、核酸ワクチンベクターを包含し得る。かかるベクターは、典型的には、対象の1以上の抗原をコードするmRNAを産生するために、宿主細胞の核において転写されるように設計される。性能を増大するために、核酸ワクチンベクターは宿主細胞の核を標的とすべきであり、かつヌクレアーゼ攻撃に耐性であるべきである。
本発明の組換え細菌は、核酸ワクチンベクターを包含し得る。かかるベクターは、典型的には、対象の1以上の抗原をコードするmRNAを産生するために、宿主細胞の核において転写されるように設計される。性能を増大するために、核酸ワクチンベクターは宿主細胞の核を標的とすべきであり、かつヌクレアーゼ攻撃に耐性であるべきである。
本発明の一実施形態では、核酸ワクチンベクターは、DNA核標的配列を用いて、核を標的としてもよい。かかる配列は、宿主細胞の転写因子が細胞質においてベクターに結合し、かつ核局在化シグナル媒介性機構を介してそれを核へ送り届けるのを可能にする。DNA核標的配列は当技術分野において知られている。例えば、SV40エンハンサーが用いられ得る。特に、単コピーのSV40エンハンサーの72−bpエレメント、またはそれらのバリエーションが用いられ得る。SV40エンハンサーは、CMV最初期(immediate−early)遺伝子エンハンサー/プロモーターと組み合わせて用いられてもよい。
さらに、真核生物転写因子のためのDNA結合部位がワクチンベクターに含まれてもよい。これらの部位は、NF−κBおよびAP−2などの転写因子がベクターに結合するのを可能にし、核局在シグナル(nuclear location signal)が核へのベクターの輸入を媒介するのを可能にする。
本発明の核酸ワクチンベクターはまた、真核生物ヌクレアーゼ攻撃に耐性であってもよい。特に、ポリアデニル化シグナルはヌクレアーゼ攻撃への耐性を増大させるために改変され得る。ヌクレアーゼ攻撃に耐性である適切なポリアデニル化シグナルは当技術分野において知られている。例えば、SV40後期ポリAシグナルが用いられ得る。あるいは、他のポリAシグナル配列は、鳥類および/または哺乳類種を感染させることに成功すると知られている他のDNAウイルスから得ることができる。
核酸ワクチンベクターを含む細菌はまた、ΔendA変異などの、ペリプラズムエンドヌクレアーゼI酵素を除去する変異を含んでもよい。この種類の変異は、宿主細胞内のベクターの放出の際に、ベクター生存を増大させるように設計される。
(d)弱毒化
上記実施形態の各々において、本発明の組換え細菌は弱毒化され得る。「弱毒化される」は、細菌が、遺伝子組換え的または物理的な操作の何らかの形で、その野生型の適応度(fitness)が弱められている、細菌の状態をさす。これは、細菌の遺伝子型を、疾患を引き起こすその能力を低減するために、変化させることを含む。しかしながら、消化管に定着する(サルモネラの場合において)、および細菌の免疫応答を誘導する能力は、好ましくは、実質的に損なわれない。例えば、一実施形態では、制御された弱毒化は、組換え細菌が、免疫後に宿主において遭遇するストレスに耐えるために、細菌にとって重要な産物をコードする1以上の核酸を発現することを可能にする。これは、組換え細菌が弱毒化された表現型を示すように制御される前に、リンパ組織の効率の良い侵入および定着を可能にする。
上記実施形態の各々において、本発明の組換え細菌は弱毒化され得る。「弱毒化される」は、細菌が、遺伝子組換え的または物理的な操作の何らかの形で、その野生型の適応度(fitness)が弱められている、細菌の状態をさす。これは、細菌の遺伝子型を、疾患を引き起こすその能力を低減するために、変化させることを含む。しかしながら、消化管に定着する(サルモネラの場合において)、および細菌の免疫応答を誘導する能力は、好ましくは、実質的に損なわれない。例えば、一実施形態では、制御された弱毒化は、組換え細菌が、免疫後に宿主において遭遇するストレスに耐えるために、細菌にとって重要な産物をコードする1以上の核酸を発現することを可能にする。これは、組換え細菌が弱毒化された表現型を示すように制御される前に、リンパ組織の効率の良い侵入および定着を可能にする。
一実施形態では、組換え細菌はLPS O−抗原を制御することによって弱毒化され得る。他の実施形態では、弱毒化は、野生型細菌において見られる天然の核酸配列を変化させる(例えば、欠失させる)ことにより、達成され得る。例えば、細菌がサルモネラである場合、弱毒化のために用いられ得る核酸配列の非限定的な例には:pab核酸配列、pur核酸配列、aro核酸配列、asdA、dap核酸配列、nadA、pncB、galE、pmi、fur、rpsL、ompR、htrA、hemA、cdt、cya、crp、dam、phoP、phoQ、rfc、poxA、galU、mviA、sodC、recA、ssrA、sirA、inv、hilA、rpoE、flgM、tonB、slyA、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例示的な弱毒化変異は、aroA、aroC、aroD、cdt、cya、crp、phoP、phoQ、ompR、galE、およびhtrAであり得る。
特定の実施形態では、上記の核酸配列は、糖制御プロモーターの制御下に配置されてもよく、ここで、糖は組換え細菌のin vitroでの生育の間存在するが、動物またはヒト宿主内では実質的に存在しない。上記の核酸配列の転写における停止は、次いで、弱毒化および組換え細菌の病徴(disease symptoms)の誘導不能をもたらすだろう。
細菌はまた、他の種類の系もまた用いられてもよいが(例えば、相補性ヘテロ接合体(complementation heterozygote)を作成する)、平衡致死宿主−ベクター系を作成するために改変され得る。平衡致死宿主−ベクター系のため、細菌は、その細胞壁の強固なペプチドグリカン層の合成のために必要な、様々な本質的な構成要素を合成するその能力を操作することによって、改変され得る。1つの例では、構成要素はジアミノピメリン酸(DAP)である。様々な酵素がDAPの最終合成に関与する。1つの例では、細菌は、細菌のDAPの合成に必須の酵素であるβ−アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素を産生する能力を除去するために、ΔasdA変異を用いることにより改変される。当業者はまた、DAPの合成の廃止をもたらす、核酸配列の他の種類の変異に関する米国特許第6,872,547号の教示を用いることができる。これらの核酸配列には、dapA、dapB、dapC、dapD、dapE、dapF、およびasdAが挙げられるが、それらに限定されない。採用し得る他の改変には、D−アラニンを合成する、または細菌のD−グルタミン酸を合成する能力への改変(例えば、ΔmurI変異)が挙げられ、これらは両方とも、細菌細胞壁のペプチドグリカン層の独自の構成要素である。
また別の平衡致死宿主−ベクター系は、細菌細胞壁の強固な層の本質的な構成要素の合成が、微生物の成育の間に供給できる栄養素(例えば、アラビノース)に依存するように、細菌を改変することを含む。例えば、細菌は、ΔPmurA::TT araC PBAD murA欠失−挿入変異を含み得る。この種類の変異は、ムラミン酸(細菌細胞壁のペプチドグリカン層の別の独自の本質的な構成要素)の合成を、in vitroでの細菌の生育の間に供給できるアラビノースの存在に依存させる。
弱毒化の他の手段は当技術分野において知られている。
i.制御された弱毒化
本発明はまた、制御された弱毒化が可能である組換え細菌を包含する。一般的に言えば、細菌は、染色体に組み込まれた制御可能なプロモーターを含む。該プロモーターは、タンパク質の機能の欠如が細菌を弱毒化するように、天然のプロモーターの代わりとなり、かつ弱毒化タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、プロモーターは制御された弱毒化を最適化するために改変される。
本発明はまた、制御された弱毒化が可能である組換え細菌を包含する。一般的に言えば、細菌は、染色体に組み込まれた制御可能なプロモーターを含む。該プロモーターは、タンパク質の機能の欠如が細菌を弱毒化するように、天然のプロモーターの代わりとなり、かつ弱毒化タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、プロモーターは制御された弱毒化を最適化するために改変される。
本明細書に記載される上記実施形態の各々において、1より多くの弱毒化の方法が用いられてもよい。例えば、本発明の組換え細菌は、タンパク質の機能の欠如が細菌を弱毒化するように、天然のプロモーターの代わりとなり、かつ弱毒化タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列に作動可能に連結されるように、染色体に組み込まれた制御可能なプロモーターを含んでもよく、かつ細菌は上記I欄で詳述された別の弱毒化の方法を含んでもよい。
A.弱毒化タンパク質
本明細書において、「弱毒化タンパク質」は、その欠如が細菌を弱毒化する、任意のタンパク質を包含する、最も広い意味で用いられることを意味する。例えば、いくつかの実施形態では、弱毒化タンパク質は、消化管または気道において遭遇するストレスから細菌を保護するのを支援するタンパク質であってもよい。非限定的な例は、RpoS、PhoPQ、OmpR、Fur、およびCrpタンパク質であり得る。他の実施形態では、タンパク質は、細菌の細胞壁の成分を合成するのに必要であってもよく、あるいは、それ自身が、murAによってコードされるタンパク質などの細胞壁の必要な成分であってもよい。さらに他の実施形態では、タンパク質は上記i欄に記載されているものであり得る。
本明細書において、「弱毒化タンパク質」は、その欠如が細菌を弱毒化する、任意のタンパク質を包含する、最も広い意味で用いられることを意味する。例えば、いくつかの実施形態では、弱毒化タンパク質は、消化管または気道において遭遇するストレスから細菌を保護するのを支援するタンパク質であってもよい。非限定的な例は、RpoS、PhoPQ、OmpR、Fur、およびCrpタンパク質であり得る。他の実施形態では、タンパク質は、細菌の細胞壁の成分を合成するのに必要であってもよく、あるいは、それ自身が、murAによってコードされるタンパク質などの細胞壁の必要な成分であってもよい。さらに他の実施形態では、タンパク質は上記i欄に記載されているものであり得る。
少なくとも1、2、3、4、5、または5より多くの弱毒化タンパク質の天然のプロモーターが、本明細書に記載される制御可能なプロモーターに交換され得る。一実施形態では、RpoS、PhoPQ、OmpR、Fur、およびCrpを含む群から選択されるタンパク質の1つのプロモーターが交換され得る。別の実施形態では、RpoS、PhoPQ、OmpR、Fur、およびCrpを含む群から選択されるタンパク質の2、3、4または5つのプロモーターが交換され得る。
1より多くの弱毒化タンパク質のプロモーターが交換される場合、各プロモーターは、各弱毒化タンパク質コード配列の発現が、同じ化合物または条件によって制御されるように、制御可能なプロモーターに交換されてもよい。あるいは、各プロモーターは、各弱毒化タンパク質コード配列の発現が、糖類アラビノース、マルトース、ラムノースまたはキシロースによってなど、異なる化合物または条件によって制御されるように、異なる制御可能なプロモーターに交換されてもよい。
B.制御可能なプロモーター
弱毒化タンパク質をコードする核酸配列の天然のプロモーターは、弱毒化タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された制御可能なプロモーターに交換される。用語「作動可能に連結される」は、上に定義される。
弱毒化タンパク質をコードする核酸配列の天然のプロモーターは、弱毒化タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された制御可能なプロモーターに交換される。用語「作動可能に連結される」は、上に定義される。
本明細書で用いられる制御可能なプロモーターは、一般に、許容状態の環境(すなわち、in vitroでの生育)中では、弱毒化タンパク質をコードする核酸配列の転写を可能にするが、非許容状態の環境(すなわち、動物またはヒト宿主における細菌の生育の間)中では、弱毒化タンパク質をコードする核酸配列の転写を停止させる。例えば、プロモーターは、許容状態と非許容状態の環境の間の物理的または化学的差異に反応するものであってもよい。かかる制御可能なプロモーターの適切な例は、当技術分野において知られており、上に詳述される。
いくつかの実施形態では、プロモーターは、上述のように、環境におけるアラビノースのレベルに反応し得る。他の実施形態では、プロモーターは、上述のように、環境におけるマルトース、ラムノース、またはキシロースのレベルに反応し得る。本明細書で詳述されるプロモーターは当技術分野において知られており、かつ、弱毒化タンパク質をコードする核酸配列にそれらを作動可能に連結する方法は当技術分野において知られている。
特定の実施形態では、本発明の組換え細菌は、以下のいずれかを含み得る:ΔPfur::TT araC PBAD fur、ΔPcrp::TT araC PBAD crp、ΔPphoPQ::TT araC PBAD phoPQ、またはそれらの組み合わせ。アラビノースの存在下でのこのような株の生育はfur、phoPQ、および/またはcrp核酸配列の転写につながるが、宿主内では、遊離アラビノースが存在しないため、核酸配列発現は停止する。fur、phoPQ、および/またはcrp核酸配列の産物が細胞分裂ごとに希釈されるにつれて、弱毒化が進展する。ΔPfurおよび/またはΔPphoPQ変異を有する株は、離乳時、3週齢のマウスにおいてさえ、109 CFUの経口投与量で弱毒化された。一般的に言えば、発現を誘導するために必要なアラビノースの濃度は、典型的には約2%未満である。いくつかの実施形態では、濃度は、約1.5%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、または0.05%未満である。特定の実施形態では、濃度は、約0.04%、0.03%、0.02%、または0.01%であってもよい。例示的な実施形態では、濃度は約0.05%である。より高い濃度のアラビノースまたは他の糖類は、望ましい細胞密度を阻害し得る、生育の間の酸生産につながる。ΔaraBADなどの変異またはマルトース、ラムノース、もしくはキシロースの取り込みおよび/または分解を阻止する変異の包含は、しかしながら、そのような酸生産を防ぎ、かつ全く悪影響なくより高い糖濃度の使用を可能し得る。
制御可能なプロモーターがアラビノースに反応する場合、弱毒化の開始は、経口免疫の時に細胞質において保持されたアラビノースの使用を妨げるΔaraBAD23、および/またはアラビノースの保持を増強するΔaraE25などのさらなる変異を含むことによって、遅延され得る。それゆえ、これらの変異の包含は、少なくとも2つの意味で有益であり得る:第一に、より高い培養密度を可能にする、そして第二に、さらに免疫原性を増強するために、エフェクターリンパ組織におけるより高い密度をもたらし得る、弱毒化された表現型の提示におけるさらなる遅延を可能にする。
C.改変
組換え細菌の弱毒化は、弱毒化タンパク質をコードする核酸配列および/またはプロモーターを改変することにより、最適化してもよい。プロモーターおよび/または弱毒化タンパク質をコードする核酸配列を改変する方法は、(e)欄にてリプレッサーについて上に詳述したものと同じである。
組換え細菌の弱毒化は、弱毒化タンパク質をコードする核酸配列および/またはプロモーターを改変することにより、最適化してもよい。プロモーターおよび/または弱毒化タンパク質をコードする核酸配列を改変する方法は、(e)欄にてリプレッサーについて上に詳述したものと同じである。
いくつかの実施形態では、1より多くの改変が細菌の弱毒化を最適化するために実施され得る。例えば、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8または9つの改変が細菌の弱毒化を最適化するために実施され得る。本発明の様々な例示的な実施形態では、furおよび/またはphoPQ毒性(virulence)核酸配列のためのSD配列および/または開始コドンが、これらの核酸産物の産生レベルが制御された弱毒化に最適であるように、変化され得る。
(e)他の変異
細菌はさらにさらなる変異を含んでもよい。かかる変異には、以下に詳述される、血清型特異的抗原の制御が含まれ得る。
細菌はさらにさらなる変異を含んでもよい。かかる変異には、以下に詳述される、血清型特異的抗原の制御が含まれ得る。
i.少なくとも1つの血清型特異的抗原をコードする核酸配列の制御された発現
一般的に言えば、本発明の細菌は、少なくとも1つの血清型特異的抗原をコードする核酸配列の制御された発現が可能である。本明細書で使用するとき、用語「血清型特異的抗原」は、細菌ベクター血清型に特異的な免疫応答を誘発する抗原をさす。いくつかの実施形態では、血清型特異的抗原への免疫応答はまた、同じ血清群におけるが、異なる、しかし関連する血清型において、近縁株を認識する。血清型特異的抗原の非限定的な例には、LPS O−抗原、鞭毛の1以上の成分、およびVi莢膜抗原が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、血清型特異的抗原をコードする少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つの核酸配列の発現が、本発明の細菌において制御される。
一般的に言えば、本発明の細菌は、少なくとも1つの血清型特異的抗原をコードする核酸配列の制御された発現が可能である。本明細書で使用するとき、用語「血清型特異的抗原」は、細菌ベクター血清型に特異的な免疫応答を誘発する抗原をさす。いくつかの実施形態では、血清型特異的抗原への免疫応答はまた、同じ血清群におけるが、異なる、しかし関連する血清型において、近縁株を認識する。血清型特異的抗原の非限定的な例には、LPS O−抗原、鞭毛の1以上の成分、およびVi莢膜抗原が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、血清型特異的抗原をコードする少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つの核酸配列の発現が、本発明の細菌において制御される。
用語「少なくとも1つの血清型特異的抗原をコードする核酸配列の制御された発現」とは、細菌が、細菌ベクター血清型に特異的な免疫応答を実質的に誘導しないような、血清型抗原をコードする核酸配列の発現をさす。一実施形態では、血清型特異的抗原の発現が除去される。別の実施形態では、発現が実質的に低減される。さらに別の実施形態では、血清型特異的抗原の発現が一時的に制御される方法で低減される。例えば、血清型特異的抗原の発現は、宿主における細菌の生育の間は低減され得るが、in vitroでの生育の間はそうではない。
サルモネラ血清型特異的抗原をコードする核酸配列の発現は、当業者に知られている標準的な分子生物学およびタンパク質および炭水化物化学技術を用いて測定し得る。本明細書で使用するとき、血清型特異的抗原をコードする核酸配列の発現の「実質的な低減」とは、血清型特異的抗原発現の低減が試みられていないサルモネラ細菌と比べて、少なくとも約1%から少なくとも約99.9%の低減をさす。一実施形態では、血清型特異的抗原をコードする核酸配列の発現は、欠失変異を用いることにより、100%低減される。本発明の他の実施形態では、血清型特異的抗原をコードする核酸配列の発現は、少なくとも約99.9%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%または90%低減される。本発明のまた他の実施形態では、血清型特異的抗原をコードする核酸配列の発現は、少なくとも約89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%または80%低減される。本発明のさらに他の実施形態では、血清型特異的抗原をコードする核酸配列の発現は、少なくとも約75%、70%、65%、60%、55%または50%低減される。さらなる実施形態では、血清型特異的抗原をコードする核酸配列の発現は、少なくとも約45%、40%、35%、30%、25%または20%低減される。またさらなる実施形態では、血清型特異的抗原をコードする核酸配列の発現は、少なくとも約15%、10%、5%、4%、3%、2%または1%低減される。
少なくとも1つの血清型特異的抗原をコードする核酸配列の発現を制御する方法は、以下に詳細に、かつ実施例において、説明される。
A.LPS O−抗原をコードする核酸配列の発現を制御する
一実施形態では、血清型特異的抗原LPS O−抗原をコードする核酸配列の発現が、フルクトース−6−Pおよびマンノース−6−Pを相互変換するために細菌に必要とされるホスホマンノースイソメラーゼをコードする、pmi核酸配列を変異させることにより、制御される。いくつかの例では、細菌は、Δpmi−2426変異などの、Δpmi変異を含む。マンノース存在下で生育させた、Δpmi−2426変異を含む細菌は、完全なLPS O−抗原を合成することが可能である。しかし、細菌の取り込みのために必要な形態である、非リン酸化マンノースは、in vivoでは入手できない。したがって、Δpmi−2426変異を含む細菌は、in vivoでの生育の少数の世代の後、LPS O−抗原血清型特異的側鎖を合成する能力を失っている。合成されるLPSは、多くの種々のサルモネラ血清型にわたって実質的に類似するコア構造を含む。これは、細菌ベクターの血清型に特異的な免疫応答を実質的に誘導せずに、少なくとも2つのサルモネラ血清型に対する免疫応答を誘発できる細菌をもたらす。
一実施形態では、血清型特異的抗原LPS O−抗原をコードする核酸配列の発現が、フルクトース−6−Pおよびマンノース−6−Pを相互変換するために細菌に必要とされるホスホマンノースイソメラーゼをコードする、pmi核酸配列を変異させることにより、制御される。いくつかの例では、細菌は、Δpmi−2426変異などの、Δpmi変異を含む。マンノース存在下で生育させた、Δpmi−2426変異を含む細菌は、完全なLPS O−抗原を合成することが可能である。しかし、細菌の取り込みのために必要な形態である、非リン酸化マンノースは、in vivoでは入手できない。したがって、Δpmi−2426変異を含む細菌は、in vivoでの生育の少数の世代の後、LPS O−抗原血清型特異的側鎖を合成する能力を失っている。合成されるLPSは、多くの種々のサルモネラ血清型にわたって実質的に類似するコア構造を含む。これは、細菌ベクターの血清型に特異的な免疫応答を実質的に誘導せずに、少なくとも2つのサルモネラ血清型に対する免疫応答を誘発できる細菌をもたらす。
Δpmi変異を含む本発明の細菌はまた、in vitroでの生育の間、細菌が利用可能なマンノースがLPS O−抗原合成のために用いられることを確保する、他の変異を含んでもよい。例えば、細菌はΔ(gmd−fcl)−26変異を含み得る。この変異は、GDP−マンノースのGDP−フコースへの変換のための酵素をコードする2つの核酸配列を欠失している。これは、in vitroでの生育の間、細菌が利用可能なマンノースが、コラン酸産生ではなくLPS O−抗原合成のために用いられることを確保する。同様に、細菌は、コラン酸産生のために必要な19個の核酸配列を全て欠失し、かつGDP−マンノースのGDP−フコースへの変換を起こらないようにもする、Δ(wcaM−wza)−8変異を含み得る。
マンノースでLPS O−抗原合成を制御することに加え、LPS O−抗原の合成は、in vivoでも存在しない、アラビノースによって制御されてもよい。例えば、細菌は、変異ΔPrfc::TT araC PBAD rfcを含み得る。(Pはプロモーターを表わし、かつ、TTは転写ターミネーターを表わす。)rfc核酸配列は、繰り返し方式で3つまたは4つの糖を典型的に含む、O−抗原サブユニットの付加のために必要である。rfc核酸配列が存在しない場合、O−抗原繰り返しサブユニットだけがLPSコア多糖に付加される。通常、血清型特異的O−抗原は、rfc核酸配列によってコードされる酵素によって触媒される、約50かそこらのO−抗原サブユニットの繰り返しを含有する。ΔPrfc::TT araC PBAD rfc欠失−挿入変異を含む細菌の場合、rfc核酸配列の発現は、株のin vitroでの生育の間に供給できるが、in vivoでは存在しないアラビノースの存在に依存する。結果的に、rfc発現はin vivoで停止し、O−抗原繰り返し構造の集合(assembly)の停止をもたらす。これは、細菌の血清型特異的O−抗原に対する免疫応答を誘導する能力を低減する。
LPS O−抗原発現を制御する別の手段は、本発明の組換え細菌においてgalEの機能を除去することである。galE核酸配列は、LPS O−抗原、外部LPSコア(outer LPS core)およびコラン酸のための基質である、UDP−Galの合成のための酵素をコードする。ガラクトースの存在下での適切なgalE変異を含む細菌の生育は、O−抗原およびLPSコアの合成をもたらす。非リン酸化ガラクトースはin vivoでは入手できない、しかしながら、そして、UDP−Galのin vivo合成は停止する、O−抗原およびLPS外部コアの合成もそうである。適切なgalE変異の一例は、Δ(galE−ybhC)−851変異である。
特定の実施形態では、本発明の細菌は、Δ(gmd−fcl)−26またはΔ(wcaM−wza)−8の有無にかかわらず、Δpmi、ΔPrfc::TT araC PBAD rfc、およびΔgalE変異の1以上を含み得る。このような組み合わせは、in vitroで(すなわち、適切な濃度のマンノース、アラビノースおよびガラクトースの存在下で)生育させた場合、LPSコアおよびO−抗原側鎖の全ての成分を合成するが、遊離の非リン酸化マンノース、アラビノースまたはガラクトースの入手不可能によりin vivoではLPS外部コアおよびO−抗原を合成するのを停止する、組換え細菌を産生し得る。また、細菌がマクロファージおよび/または補体媒介性細胞毒性による殺傷の影響をより受けやすいので、LPS外部コアおよび/またはO−抗原を合成する能力を有さない組換え細菌は弱毒化される。さらに、in vivoでLPS外部コアおよび/またはO−抗原を合成する能力を有さない組換え細菌は、血清型特異的LPS O−抗原への最小限の免疫応答だけを誘導する。
LPS O−抗原の合成を可能にする1以上の核酸の制御された発現は、本発明の組換え細菌に、細菌のin vitroでの生育の間、マンノース、アラビノースおよび/またはガラクトースなどの必要とされる糖が供給されることを可能にし、LPS O−抗原の完全な合成を確保する。これは、組換え細菌細胞表面上のO−抗原の存在が、株が、免疫原性であるための必要な前提条件である、リンパ組織に侵入し、定着するために不可欠であるため、重要である。in vivoでは、LPS O−抗原合成が、遊離の非リン酸化糖の入手不可能に起因して停止する。結果的に、組換え細菌は弱毒化され、補体媒介性細胞毒性およびマクロファージ食作用の影響をより受けやすくなる。また、LPS O−抗原合成が停止する場合、LPSコアがさらされる。コアは、全てのサルモネラ血清型において類似の構造を有する交差反応性の抗原である。また、LPS O−抗原合成が停止する場合、組換え細菌によって発現される任意の交差反応性の外膜タンパク質が、宿主免疫系による監視に対してさらされる。
B.鞭毛の成分をコードする核酸配列の発現
一実施形態では、鞭毛の血清型特異的な成分をコードする核酸配列の発現が、FljBまたはFliCをコードする核酸を変異させることにより制御される。例えば、本発明の細菌はΔfljB217変異を含み得る。あるいは、細菌はΔfliCI80変異を含み得る。ΔfljB217変異は、第2相鞭毛抗原(Phase II flagellar antigen)をコードする構造核酸配列を欠失している、一方で、ΔfliCI80変異は、第1相FIiC鞭毛抗原の抗原的に変異する血清型特異的ドメインをコードする180アミノ酸を欠失している。先天性免疫応答をリクルートする/刺激するためにTLR5と相互作用する鞭毛タンパク質の一部分は、鞭毛タンパク質の保存されたNおよびC末端領域を表し、かつ、これはΔfliCI80変異を有する株によって保持され発現される。また、ΔfliCI80変異はCD4−依存性T−細胞エピトープを保持する。第2相鞭毛抗原ではなく第1相鞭毛抗原(Phase I flagellar antigen)の発現が、マウスのネズミチフス菌感染を高めることに留意すべきである。Δpmi−2426、ΔfljB2I7およびΔfliC180変異を有するネズミチフス菌組換え細菌は、マンノースの非存在下で生育された場合、B−群O−抗原に特異的な抗血清またはネズミチフス菌特異的抗鞭毛血清(anti−flagellar sera)と凝集しない。これらの組換え細菌はまた、高レベルで合成されるFIiC180タンパク質が鞭毛に効率良く組み込まれないので、非運動性である。TLR5を特異的に発現するHEK293細胞を用いてこれらの組換え細菌を評価する場合、NF−κB産生のレベルは、フラジェリンを鞭毛内に集合させ(assemble)、かつ運動性を示す、ΔfliB217 F1iC+株を用いる場合よりも約50%高い(鞭毛のない対照ΔfljB217 ΔfliC2426株によるNF−κB産生は存在しない)。同様に、Δ(galE−ybhC)−851、ΔfljB2I7およびΔfliC180変異を有する組換え細菌は、ガラクトースの非存在下で生育された場合、B−群O−抗原に特異的な抗血清またはネズミチフス菌特異的抗鞭毛血清と凝集しない。これらの細菌もまた非運動性である。
一実施形態では、鞭毛の血清型特異的な成分をコードする核酸配列の発現が、FljBまたはFliCをコードする核酸を変異させることにより制御される。例えば、本発明の細菌はΔfljB217変異を含み得る。あるいは、細菌はΔfliCI80変異を含み得る。ΔfljB217変異は、第2相鞭毛抗原(Phase II flagellar antigen)をコードする構造核酸配列を欠失している、一方で、ΔfliCI80変異は、第1相FIiC鞭毛抗原の抗原的に変異する血清型特異的ドメインをコードする180アミノ酸を欠失している。先天性免疫応答をリクルートする/刺激するためにTLR5と相互作用する鞭毛タンパク質の一部分は、鞭毛タンパク質の保存されたNおよびC末端領域を表し、かつ、これはΔfliCI80変異を有する株によって保持され発現される。また、ΔfliCI80変異はCD4−依存性T−細胞エピトープを保持する。第2相鞭毛抗原ではなく第1相鞭毛抗原(Phase I flagellar antigen)の発現が、マウスのネズミチフス菌感染を高めることに留意すべきである。Δpmi−2426、ΔfljB2I7およびΔfliC180変異を有するネズミチフス菌組換え細菌は、マンノースの非存在下で生育された場合、B−群O−抗原に特異的な抗血清またはネズミチフス菌特異的抗鞭毛血清(anti−flagellar sera)と凝集しない。これらの組換え細菌はまた、高レベルで合成されるFIiC180タンパク質が鞭毛に効率良く組み込まれないので、非運動性である。TLR5を特異的に発現するHEK293細胞を用いてこれらの組換え細菌を評価する場合、NF−κB産生のレベルは、フラジェリンを鞭毛内に集合させ(assemble)、かつ運動性を示す、ΔfliB217 F1iC+株を用いる場合よりも約50%高い(鞭毛のない対照ΔfljB217 ΔfliC2426株によるNF−κB産生は存在しない)。同様に、Δ(galE−ybhC)−851、ΔfljB2I7およびΔfliC180変異を有する組換え細菌は、ガラクトースの非存在下で生育された場合、B−群O−抗原に特異的な抗血清またはネズミチフス菌特異的抗鞭毛血清と凝集しない。これらの細菌もまた非運動性である。
いくつかの実施形態では、細菌はΔfljB217およびΔfliC2426変異の両方を含み得る。このような細菌は、典型的には鞭毛を合成せず、それゆえ運動性ではないだろう。これは、TLR5との相互作用およびNF−κB産生のアップレギュレーションを起こらないようにする。このような細菌は、細菌誘導性宿主プログラム細胞死(bacterial−induced host programmed cell death)を低減することができる。
C.Vi莢膜抗原をコードする核酸配列の発現
チフス菌およびサルモネラ・ダブリンなどの特定のサルモネラ株はVi莢膜抗原を発現する。この抗原は血清型特異的であり、侵入を阻害し、かつ防御免疫応答の誘導を抑制するために作用する。結果的に、本発明の組換え細菌がVi莢膜抗原を含む株に由来する場合、Vi莢膜抗原が合成されないようにVi莢膜抗原をコードする1以上の核酸が欠失できる。たとえサルモネラ細胞表面上でのVi莢膜抗原の合成および提示が、侵入に干渉し、かつ免疫の誘導を抑制するとしても、精製されたVi抗原は、Vi抗原を提示するチフス菌およびサルモネラ・ダブリンによる感染に対する防御免疫を誘導するためにワクチンとして用いることができる。
チフス菌およびサルモネラ・ダブリンなどの特定のサルモネラ株はVi莢膜抗原を発現する。この抗原は血清型特異的であり、侵入を阻害し、かつ防御免疫応答の誘導を抑制するために作用する。結果的に、本発明の組換え細菌がVi莢膜抗原を含む株に由来する場合、Vi莢膜抗原が合成されないようにVi莢膜抗原をコードする1以上の核酸が欠失できる。たとえサルモネラ細胞表面上でのVi莢膜抗原の合成および提示が、侵入に干渉し、かつ免疫の誘導を抑制するとしても、精製されたVi抗原は、Vi抗原を提示するチフス菌およびサルモネラ・ダブリンによる感染に対する防御免疫を誘導するためにワクチンとして用いることができる。
ii.少なくとも2つのサルモネラ血清型に対する免疫応答を誘発する
本発明の組換え細菌は、少なくとも2つのサルモネラ血清型に対する免疫応答を誘発できてもよい。これは、例えば、上記のような血清型特異的LPS O−抗原側鎖を除去することにより、達成され得る。残るLPSコアは、免疫応答を誘発し、LPSコアに対する抗体の産生を誘導することができる。LPSコアは数千のサルモネラ・エンテリカ血清型において実質的に同一であるので、抗体は、チフィムリウム(Typhimurium)、ハイデルベルグ(Heidelberg)、ニューポート(Newport)、インファンティス(Infantis)、ダブリン(Dublin)、ウィルヒョウ(Virchow)、チフィ(Typhi)、エンテリティディス(Enteritidis)、ベルタ(Berta)、ゼンフテンベルグ(Seftenberg)、オハイオ(Ohio)、アゴナ(Agona)、ブラエンデラップ(Braenderup)、ハダル(Hadar)、ケンタッキー(Kentucky)、トンプソン(Thompson)、モンテビデオ(Montevideo)、ムバンダカ(Mbandaka)、ジャビアナ(Javiana)、オラニエンブルク(Oranienburg)、アナタム(Anatum)、パラチフィA(Paratyphi A)、シュワルツェングルント(Schwarzengrund)、セントポール(Saintpaul)、およびミュンヘン(Munchen)などの、数種の異なるサルモネラ・エンテリカ血清型に対する免疫を潜在的に提供する。
本発明の組換え細菌は、少なくとも2つのサルモネラ血清型に対する免疫応答を誘発できてもよい。これは、例えば、上記のような血清型特異的LPS O−抗原側鎖を除去することにより、達成され得る。残るLPSコアは、免疫応答を誘発し、LPSコアに対する抗体の産生を誘導することができる。LPSコアは数千のサルモネラ・エンテリカ血清型において実質的に同一であるので、抗体は、チフィムリウム(Typhimurium)、ハイデルベルグ(Heidelberg)、ニューポート(Newport)、インファンティス(Infantis)、ダブリン(Dublin)、ウィルヒョウ(Virchow)、チフィ(Typhi)、エンテリティディス(Enteritidis)、ベルタ(Berta)、ゼンフテンベルグ(Seftenberg)、オハイオ(Ohio)、アゴナ(Agona)、ブラエンデラップ(Braenderup)、ハダル(Hadar)、ケンタッキー(Kentucky)、トンプソン(Thompson)、モンテビデオ(Montevideo)、ムバンダカ(Mbandaka)、ジャビアナ(Javiana)、オラニエンブルク(Oranienburg)、アナタム(Anatum)、パラチフィA(Paratyphi A)、シュワルツェングルント(Schwarzengrund)、セントポール(Saintpaul)、およびミュンヘン(Munchen)などの、数種の異なるサルモネラ・エンテリカ血清型に対する免疫を潜在的に提供する。
また、LPS O−抗原の除去は、組換え細菌の外膜タンパク質へのよりよいアクセスを宿主免疫系に提供し、それによって、これらの外膜タンパク質に対する免疫応答の誘導を増強する。いくつかの実施形態では、以下に説明するように、これらのタンパク質への宿主免疫応答をさらに増強するために、外膜タンパク質がアップレギュレートされ得る。
外膜タンパク質の非限定的な例には、以下に説明されるような、鉄およびマンガン取り込みに関与するタンパク質が挙げられる。鉄およびマンガンは腸内病原体のための必須栄養素であり、鉄およびマンガン取り込みを阻害する抗体の誘導は、事実上、病原体を飢えさせ、宿主に防御免疫を与える。さらに、これらのタンパク質は腸内細菌間で相同であるので、かかる宿主免疫応答は、複数のサルモネラ・エンテリカ血清型に対する、ならびにエルシニア属、シゲラ属および大腸菌属の株などの他の腸内細菌病原体への免疫を提供する。この証拠として、エルシニア抗原を全く発現しない弱毒化ネズミチフス菌は、高用量の経口投与された仮性結核菌(Y.pseudotuberculosis)への著しい防御免疫を誘導することができる。
誘発される免疫応答には、先天性免疫応答、粘膜免疫応答、体液性免疫応答および細胞性免疫応答が挙げられるが、それらに限定されない。一実施形態では、腸内抗原(enteric antigen(s))に対するTh2−依存性粘膜および全身性抗体応答が観察される。免疫応答は当業者に知られている標準的な免疫学的アッセイにより測定され得る。例示的な実施形態では、免疫応答は防御的である。
iii.体液分泌の低減
いくつかの実施形態では、本発明の組換え細菌は、宿主における体液分泌を低減するように改変され得る。例えば、細菌はΔsopB1925変異を含み得る。あるいは、細菌はΔmsbB48変異を含み得る。別の代替形態では、細菌はΔsopB1925変異およびΔmsbB48変異の両方を含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明の組換え細菌は、宿主における体液分泌を低減するように改変され得る。例えば、細菌はΔsopB1925変異を含み得る。あるいは、細菌はΔmsbB48変異を含み得る。別の代替形態では、細菌はΔsopB1925変異およびΔmsbB48変異の両方を含み得る。
iv.生物学的封じ込め
特定の実施形態下では、生組換え細菌は、宿主から排出される場合、生存し増殖する可能性を有し得る。これは、免疫されることを選ばない個体が組換え細菌にさらされるかもしれない可能性をもたらす。結果的に、特定の実施形態では、本発明の組換え細菌は、動物の消化管(GI tract)に残存するサルモネラワクチンの能力を、起こらないようにするとまではいかなくても減少させる、1以上の変異を含み得る。
特定の実施形態下では、生組換え細菌は、宿主から排出される場合、生存し増殖する可能性を有し得る。これは、免疫されることを選ばない個体が組換え細菌にさらされるかもしれない可能性をもたらす。結果的に、特定の実施形態では、本発明の組換え細菌は、動物の消化管(GI tract)に残存するサルモネラワクチンの能力を、起こらないようにするとまではいかなくても減少させる、1以上の変異を含み得る。
別の実施形態では、本発明の組換え細菌は、コラン酸、薄い集合性の線毛(thin aggregative fimbriae)(すなわち、カーリー(curli))、セルロースおよび細胞外多糖、これらの全てはバイオフィルム形成に寄与する、の合成をそれぞれ阻止する、Δ(gmd fcl)−26もしくはΔ(wcaM−wza)−7、ΔagfBAC811、Δ(PagfD agfG)−4、Δ(agfC−agfG)−999、ΔbcsABZC2118もしくはΔbcsEFG2319およびΔ(yshA−yihW)−157変異の1以上を含み得る。また、栄養素としてのDNAの使用を妨げる変異ΔyhiR36、サルモネラが宿主細胞外マトリックスタンパク質に付着することを可能にする4つのタンパク質をコードするΔ(shdA−ratB)−64、ΔmisL2およびΔbigA3、ならびに酢酸塩の使用を阻止するΔackA233が、生物学的封じ込めのための手段として用いられ得る。同様に、ΔfucOR8およびΔrbs−19などの、糖類フコースおよびリボースの使用を阻止する変異の包含は、ワクチン株が腸管に残存する能力を低減させることができる。例示的な実施形態では、生物学的封じ込め変異を含む組換え細菌は、その毒性(virulence)において悪影響を受けない。
いくつかの実施形態では、組換え細菌は、排出された場合に、細菌のin vivoでの残存および生存を妨げる、in vivoでの制御された遅延溶解の方法を含み得る。これらの染色体変異には:完全に溶解することから細胞壁喪失死を受ける細胞を保護できるコラン酸の合成を起こらないようにする、Δ(gmd fcl)−26もしくはΔ(wcaM−wza)−8、胆嚢における胆石上の持続的な定着を可能にするバイオフィルム形成にとって重要である、薄い集合性の線毛(カーリー)の合成を阻止する、ΔagfBAC811およびΔ(agfC−agfG)−999、ペプチドグリカン構成要素DAPのための必要条件を課すためのΔasdA27::TT araC PBAD c2挿入−欠失変異ならびにペプチドグリカン構成要素ムラミン酸の合成を阻止する条件致死(conditional lethal)変異としてのΔPmurAl2::TTaraC PBAD murAもしくは改良されたΔPmurA25::TTaraC PBAD murA挿入欠失変異、が挙げられ得る。後者の2つの変異は、典型的に、pYA3681またはasdAおよびmurA遺伝子のアラビノース依存性発現を有する改良されたpYA4763などの、制御された遅延溶解プラスミドによって補完される。かかる変異を含む組換え細菌は、通常、アラビノースの存在下で生育する。in vivoでは、しかしながら、細菌は、ペプチドグリカン細胞壁層の合成が停止し、最終的に細菌の溶解をもたらすように、AsdおよびMurA酵素をコードする任意の核酸を発現するのを停止する。この溶解は、腸内病原体に特異的な抗原の塊の放出をもたらし、それによって、生物学的封じ込めを与えながら、その腸内病原体に対する免疫の誘導を増強する手段として機能し得る。
いくつかの実施形態では、組換え細菌は溶解が起こることを確保するために細胞壁ペプチドグリカンの再利用を阻止する変異を含み得る。例えば、細菌は、ampG変異、ampD変異もしくはnagE変異、またはこれらの変異の2つもしくは3つを含み得る。
v.crpカセット
いくつかの実施形態では、本発明の組換え細菌はまた、ΔPcrp::TT araC PBAD crp欠失−挿入変異を含み得る。araC PBADカセットはアラビノースの存在およびカタボライトリプレッサータンパク質Crpの結合の両方に依存するため、ΔPcrp::TT araC PBAD crp欠失−挿入変異は、PBADプロモーターの制御下の任意の核酸配列の発現を低減させるさらなる手段として挙げられ得る。これは、細菌が非許容状態の環境(すなわち、アラビノース無し)において生育される場合、リプレッサー自体およびCrpタンパク質の両方が合成されるのを停止し、結果的に、araC PBAD制御された核酸配列のための両方の制御シグナル(regulating signal)を除去することを意味する。このaraC PBADの二重の遮断は、所望の表現型の遺伝的安定性を確保するさらなる安全機能(safety feature)を構成し得るものであり、かつ、制御された遅延溶解(regulated delayed lysis)表現型を有する株の場合に、AsdおよびMurA酵素の合成を起こらないようにし、かつin vivoでの溶解を確保するさらなる手段を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明の組換え細菌はまた、ΔPcrp::TT araC PBAD crp欠失−挿入変異を含み得る。araC PBADカセットはアラビノースの存在およびカタボライトリプレッサータンパク質Crpの結合の両方に依存するため、ΔPcrp::TT araC PBAD crp欠失−挿入変異は、PBADプロモーターの制御下の任意の核酸配列の発現を低減させるさらなる手段として挙げられ得る。これは、細菌が非許容状態の環境(すなわち、アラビノース無し)において生育される場合、リプレッサー自体およびCrpタンパク質の両方が合成されるのを停止し、結果的に、araC PBAD制御された核酸配列のための両方の制御シグナル(regulating signal)を除去することを意味する。このaraC PBADの二重の遮断は、所望の表現型の遺伝的安定性を確保するさらなる安全機能(safety feature)を構成し得るものであり、かつ、制御された遅延溶解(regulated delayed lysis)表現型を有する株の場合に、AsdおよびMurA酵素の合成を起こらないようにし、かつin vivoでの溶解を確保するさらなる手段を提供する。
一般的に言えば、Crpタンパク質の活性はcAMPとの相互作用を必要とするが、cAMPの合成を阻害し得るグルコースの添加は、araC PBADプロモーターからの転写を制御するCrpタンパク質の能力を減少させる。結果的に、cAMPに対するグルコースの影響を避けるため、グルコースが培養培地から実質的に除外され得る、あるいは、PBADからの転写を制御するのにcAMPに依存しないCrpタンパク質を合成する、crpのバリアントが単離または構築され得る。crp遺伝子における2つのこのような変化が、crp−70遺伝子改変をもたらすためにアミノ酸置換変異T127I、Q170KおよびL195Rで、かつ、crp−72遺伝子改変をもたらすためにアミノ酸置換I112L、T127IおよびA144Tで、作られる。両構築物は、ΔPcrp70::TT araC PBAD crp−70およびΔPcrp72::TT araC PBAD crp−72欠失−挿入変異を得るために、araC PBADで作られる。両方の場合において、アラビノースによって誘導されたCrpタンパク質の合成は、グルコースの添加に反応しにくい。この戦略はまた、上述されたラムノース、キシロースおよびマルトースに反応する系などのCrpに反応する他の系において用いられてもよい。
vi.過侵襲性(hyper−invasiveness)
本発明の組換え細菌はまた、過侵襲性であってもよい。本明細書で使用するとき、「過侵襲性」は、同じ株の野生型の細菌よりも、宿主細胞により効率良く侵入できる細菌をさす。侵入は、当技術分野において知られている方法、例えばCFUs/組織のgによって、決定され得る。いくつかの実施形態では、組換え細菌はM細胞の増大した侵入が可能であってもよい。一般的に言えば、このような細菌はhilAの発現を増大させる変異を含み得る。例えば、hilAのプロモーターがhilAの構成的発現を可能にするために変異され得る。非限定的な例には、ΔPhilA::PtrcΔlacO888 hilAなどのΔPhilA::PtrcΔlacO hilA変異が挙げられる。かかる変異は、野生型hilAプロモーターを、lacOオペレーター配列を欠くPtrcプロモーターと交換する。これは、lacIが発現される場合でさえ、hilAの構成的発現を可能にする。あるいは、lrp核酸配列の欠失がhilA発現を増大するために用いられてもよい。
本発明の組換え細菌はまた、過侵襲性であってもよい。本明細書で使用するとき、「過侵襲性」は、同じ株の野生型の細菌よりも、宿主細胞により効率良く侵入できる細菌をさす。侵入は、当技術分野において知られている方法、例えばCFUs/組織のgによって、決定され得る。いくつかの実施形態では、組換え細菌はM細胞の増大した侵入が可能であってもよい。一般的に言えば、このような細菌はhilAの発現を増大させる変異を含み得る。例えば、hilAのプロモーターがhilAの構成的発現を可能にするために変異され得る。非限定的な例には、ΔPhilA::PtrcΔlacO888 hilAなどのΔPhilA::PtrcΔlacO hilA変異が挙げられる。かかる変異は、野生型hilAプロモーターを、lacOオペレーター配列を欠くPtrcプロモーターと交換する。これは、lacIが発現される場合でさえ、hilAの構成的発現を可能にする。あるいは、lrp核酸配列の欠失がhilA発現を増大するために用いられてもよい。
vii.低減した細菌誘導性宿主プログラム細胞死
本発明の細菌によって侵入される宿主細胞のプログラム細胞死(programmed cell death)は、細菌によって運搬される核酸ワクチンベクターを含む核酸配列の転写を減少させる可能性がある。結果的に、いくつかの実施形態では、本発明の組換え細菌は、同じ株の野生型の細菌と比べて、細菌誘導性宿主プログラム細胞死を低減できてもよい。細菌誘導性宿主プログラム細胞死の非限定的な例には、アポトーシスおよびピロトーシス(pyroptosis)が挙げられ得る。細菌誘導性宿主プログラム細胞死を検出および測定する方法は、当技術分野において知られている。
本発明の細菌によって侵入される宿主細胞のプログラム細胞死(programmed cell death)は、細菌によって運搬される核酸ワクチンベクターを含む核酸配列の転写を減少させる可能性がある。結果的に、いくつかの実施形態では、本発明の組換え細菌は、同じ株の野生型の細菌と比べて、細菌誘導性宿主プログラム細胞死を低減できてもよい。細菌誘導性宿主プログラム細胞死の非限定的な例には、アポトーシスおよびピロトーシス(pyroptosis)が挙げられ得る。細菌誘導性宿主プログラム細胞死を検出および測定する方法は、当技術分野において知られている。
一実施形態では、細菌誘導性宿主プログラム細胞死を低減できる本発明の細菌は、アポトーシス/ピロトーシスを誘導する経路に影響する変異を含んでもよい。このような変異の非限定的な例には、sseLなどの脱ユビキチン化酵素核酸配列における変異、および/またはtlpAなどの温度感知タンパク質(temperature−sensing protein)核酸配列における変異が挙げられ得る。例えば、細菌は、ΔsseL変異、ΔtlpA変異、または両変異を含み得る。別の実施形態では、細菌は鞭毛を完全に欠いてもよい。
(f)例示的な細菌
例示的な実施形態では、細菌は、エンドソーム脱出を可能にするための1以上の変異(上記(a)欄)、細菌の溶解を誘導するための1以上の変異(上記(b)欄)、抗原をコードする核酸を発現するための1以上の変異(上記(c)欄)、細菌を弱毒化するための1以上の変異(上記(d)欄)、およびワクチンとしての細菌の性能を増強するための1以上の変異(上記(e)欄)を含み得る。
例示的な実施形態では、細菌は、エンドソーム脱出を可能にするための1以上の変異(上記(a)欄)、細菌の溶解を誘導するための1以上の変異(上記(b)欄)、抗原をコードする核酸を発現するための1以上の変異(上記(c)欄)、細菌を弱毒化するための1以上の変異(上記(d)欄)、およびワクチンとしての細菌の性能を増強するための1以上の変異(上記(e)欄)を含み得る。
II.ワクチン組成物および投与
本発明の組換え細菌は、ワクチン組成物として宿主に投与されてもよい。本明細書で使用するとき、ワクチン組成物は、細菌によって合成され得る任意の抗原を含む、組換え細菌への免疫応答を誘発するように設計された組成物である。例示的な実施形態では、免疫応答は、上述のように、防御的である。別の例示的な実施形態では、免疫応答は細胞性免疫応答である。さらに別の例示的な実施形態では、免疫応答はTh1応答である。抗原への免疫応答はよく研究され、広く報告されている。免疫学に関する調査はPaul, WE, Stites D et.al.およびOgra PL. et.al.によって提供される。粘膜免疫もまたOgra PL et.al.によって記載される。
本発明の組換え細菌は、ワクチン組成物として宿主に投与されてもよい。本明細書で使用するとき、ワクチン組成物は、細菌によって合成され得る任意の抗原を含む、組換え細菌への免疫応答を誘発するように設計された組成物である。例示的な実施形態では、免疫応答は、上述のように、防御的である。別の例示的な実施形態では、免疫応答は細胞性免疫応答である。さらに別の例示的な実施形態では、免疫応答はTh1応答である。抗原への免疫応答はよく研究され、広く報告されている。免疫学に関する調査はPaul, WE, Stites D et.al.およびOgra PL. et.al.によって提供される。粘膜免疫もまたOgra PL et.al.によって記載される。
本発明のワクチン組成物は、免疫応答を搭載(mounting)できる任意の宿主に投与され得る。かかる宿主には、全ての脊椎動物、例えば、家畜、農業動物(agricultural animal)、実験動物およびヒトを含む哺乳動物、ならびに家禽(domestic bird)および農業に重要なトリを含む様々な種のトリが挙げられ得る。好ましくは、宿主は温血動物である。ワクチンは、予防薬として、または治療目的のために投与できる。
例示的な実施形態では、組換え細菌は、本発明のワクチン組成物において、宿主に投与される場合、生きている。適切なワクチン組成物製剤(formulation)および投与の方法は、以下に詳述される。
(a)ワクチン組成
本発明の組換え細菌を含むワクチン組成物は、担体、保存剤、安定剤、アジュバントおよび他の物質などの1以上の可能な添加剤を、任意に含み得る。
本発明の組換え細菌を含むワクチン組成物は、担体、保存剤、安定剤、アジュバントおよび他の物質などの1以上の可能な添加剤を、任意に含み得る。
一実施形態では、ワクチンはアジュバントを含む。水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムなどのアジュバントは、免疫応答を引き起こす、増強する、延長するワクチンの能力を増大させるために、任意に添加される。例示的な実施形態では、生弱毒化細菌の使用が、天然のアジュバントとして機能し得る。ワクチン組成物は、抗−CTLA4のような、T細胞共刺激分子または抗体などの、ワクチンへの免疫応答を改良するために、当技術分野において知られているさらなる成分をさらに含んでもよい。サイトカイン、ケモカイン、CpGのような細菌において天然に見られる細菌核酸配列、ならびにモンタナイド(Montamide)ゲル01、IMS1312、IMS1313およびISA 201などの生細菌ワクチンに適合するアジュバントなどの、さらなる物質もまた、潜在的なワクチンアジュバントである。
別の実施形態では、ワクチンは医薬担体(または賦形剤)を含み得る。このような担体は、接種を受けた宿主に非毒性であり、かつ組換え細菌に適合する、カプセル化のための任意の溶媒または固形物質であり得る。担体は、形状(form)または粘度(consistency)を与え、あるいは希釈剤として機能し得る。適切な医薬担体には、生理食塩水および生理的濃度またはその近くの他の非毒性の塩類などの、液体担体、ならびに、タルクもしくはスクロース、あるいは動物飼料などの、ヒトのために用いられない固体担体が挙げられ得る。担体はまた、安定剤、湿潤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変えるための塩、カプセル化剤、バッファー、ならびに皮膚浸透増強剤を含んでもよい。担体および賦形剤ならびに非経口および経口(nonparenteral)薬物送達のための製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 19th Ed. Mack Publishing (1995)に説明される。気管支を介する投与のために用いられる場合、ワクチンは、好ましくはエアロゾルの形式で示される。
添加剤を用いる場合、生きている組換え細菌が死なないように、あるいは、添加物の使用によって損なわれる、GALT、NALTおよびBALTなどのリンパ組織に効果的に定着するその能力を有するように、注意すべきである。ラクトースまたはグルタミン酸ナトリウム(MSG)などの安定剤は、温度変化あるいは凍結乾燥工程などの様々な条件に対して、ワクチン製剤を安定させるために添加され得る。
当業者によって理解されるように、本発明のワクチン組成物の投与量は、組換え細菌、制御される抗原、および対象とする宿主によって、変化でき、変化するだろう。一般的に言えば、投与量は、大多数の宿主において防御免疫応答を誘発するのに十分であることだけを必要とする。日常的な実験が必要な投与量を容易に確立し得る。経口投与のためのワクチンの典型的な最初の投与量は、免疫される宿主の年齢に応じて、約1x107から1x1010CFUとすることができる。所望のレベルの防御免疫を提供するために必要に応じて、複数薬剤を投与することもまた用いられ得る。
(b)投与の方法
GALT、NALTまたはBALT細胞の好ましい応答を刺激するために、静脈内、筋肉内、皮下注射または他の非経口経路などの、組換え細菌を投与する他の方法が可能であるが、経口投与、鼻腔内投与、胃挿管による、あるいはエアロゾルの形式での、消化管、鼻咽腔、または気管支への直接的なワクチン組成物の投与が好ましい。
GALT、NALTまたはBALT細胞の好ましい応答を刺激するために、静脈内、筋肉内、皮下注射または他の非経口経路などの、組換え細菌を投与する他の方法が可能であるが、経口投与、鼻腔内投与、胃挿管による、あるいはエアロゾルの形式での、消化管、鼻咽腔、または気管支への直接的なワクチン組成物の投与が好ましい。
いくつかの実施形態では、これらの組成物は、注射による投与(例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内、等)のために製剤化される。したがって、これらの組成物は、好ましくは、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液などの、薬学的に許容可能なビヒクルと組み合わされる。
III.キット
本発明はまた、必要とする宿主にワクチン接種するための、適切な一定分量で上記の組成物のいずれか1つを含むキットを包含する。一実施形態では、キットは使用のための指示書をさらに含む。他の実施形態では、好ましくは経口的に、投与する準備ができているワクチン組成物を生成するために、水和剤(例えば、緩衝生理食塩水)の添加が組成物を再構成するように、組成物が凍結乾燥される。
本発明はまた、必要とする宿主にワクチン接種するための、適切な一定分量で上記の組成物のいずれか1つを含むキットを包含する。一実施形態では、キットは使用のための指示書をさらに含む。他の実施形態では、好ましくは経口的に、投与する準備ができているワクチン組成物を生成するために、水和剤(例えば、緩衝生理食塩水)の添加が組成物を再構成するように、組成物が凍結乾燥される。
以下の実施例は、本発明の好ましい形態を実証するために含まれる。続く実施例において開示される技術が、本発明の実施において十分に機能するために本発明者らによって発見された技術を表わすことは、当業者によって理解されるだろう。当業者は、しかしながら、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、かつ本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、同様または類似の結果をまだ得ることができることを理解するだろう、そのため、添付の図面に説明されているまたは示されている全ての事項は、例示として解釈されるべきであり、限定的な意味ではない。
IV.使用の方法
本発明のさらなる態様は、本発明の組換え細菌を使用する方法を包含する。例えば、一実施形態では、本発明は宿主の免疫系を調節する方法を提供する。該方法は、本発明の組換え細菌を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む。当業者は、有効量の組成物が、所望の免疫応答(例えば、細胞性)を生成できる量であることを理解できる。宿主の免疫応答をモニタリングする方法は、医師および他のスキルを持つ実践者に良く知られている。例えば、ELISA、およびELISPOTなどのアッセイが用いられ得る。有効性は、宿主に残っている対象の抗原の量をモニタリングすることにより、あるいは宿主において所与の病原体によって引き起こされる疾病の発生の減少を測定することにより、決定され得る。特定の病原体については、宿主から生体サンプルとして採取された培養物またはスワブが、個体における病原体の存在あるいは量をモニタリングするために用いられてもよい。
本発明のさらなる態様は、本発明の組換え細菌を使用する方法を包含する。例えば、一実施形態では、本発明は宿主の免疫系を調節する方法を提供する。該方法は、本発明の組換え細菌を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む。当業者は、有効量の組成物が、所望の免疫応答(例えば、細胞性)を生成できる量であることを理解できる。宿主の免疫応答をモニタリングする方法は、医師および他のスキルを持つ実践者に良く知られている。例えば、ELISA、およびELISPOTなどのアッセイが用いられ得る。有効性は、宿主に残っている対象の抗原の量をモニタリングすることにより、あるいは宿主において所与の病原体によって引き起こされる疾病の発生の減少を測定することにより、決定され得る。特定の病原体については、宿主から生体サンプルとして採取された培養物またはスワブが、個体における病原体の存在あるいは量をモニタリングするために用いられてもよい。
別の実施形態では、本発明は、宿主における抗原に対する細胞性免疫応答を誘発する方法を提供する。該方法は、本発明の組換え細菌を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む。
さらに別の実施形態では、本発明の組換え細菌は、必要とする個体において病原体に対する細胞性免疫応答を誘発するための方法において、用いられ得る。該方法は、本明細書に記載される組換え細菌を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む。さらなる実施形態では、本明細書に記載される組換え細菌は、必要とする宿主において感染症の1以上の症状を改善するための方法において、用いられ得る。該方法は、本明細書に記載される組換え細菌を含む有効量の組成物を投与することを含む。
以下の実施例は、本発明の好ましい形態を実証するために含まれる。続く実施例において開示される技術が、本発明の実施において十分に機能するために本発明者らによって発見された技術を表わすことは、当業者によって理解されるだろう。当業者は、しかしながら、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、かつ本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、同様または類似の結果をまだ得ることができることを理解するだろう、そのため、添付の図面に説明されているまたは示されている全ての事項は、例示として解釈されるべきであり、限定的な意味ではない。
以下の実施例は、本発明の様々な反復を説明する。
実施例1−5のための序論
インフルエンザは、依然として、急性呼吸器疾患を引き起こす、世界的に最も重大な疾患の一つであり、かつ慢性肺感染症を悪化させる感染症の25%を占める[1]。いくつかの流行および3つの深刻なパンデミックが報告されている。インフルエンザ感染は、表面タンパク質ヘマグルチニン(HA)およびノイラミニダーゼ(NA)に対する中和抗体を誘発するワクチンによって主に効果的にコントロールされる。インフルエンザワクチンは、抗原ドリフトに起因する循環株に合致するように毎年再調製しなければならず、かつ異なる種由来の遺伝子分節の遺伝子再集合に起因する抗原シフトによって生じる株を予防しない。この最新の例は、ヒト、トリおよび北アメリカとユーラシア両方のブタ起源由来の配列を含有する、2009年のパンデミックブタ(H1N1)インフルエンザの出現である[2,3]。
インフルエンザは、依然として、急性呼吸器疾患を引き起こす、世界的に最も重大な疾患の一つであり、かつ慢性肺感染症を悪化させる感染症の25%を占める[1]。いくつかの流行および3つの深刻なパンデミックが報告されている。インフルエンザ感染は、表面タンパク質ヘマグルチニン(HA)およびノイラミニダーゼ(NA)に対する中和抗体を誘発するワクチンによって主に効果的にコントロールされる。インフルエンザワクチンは、抗原ドリフトに起因する循環株に合致するように毎年再調製しなければならず、かつ異なる種由来の遺伝子分節の遺伝子再集合に起因する抗原シフトによって生じる株を予防しない。この最新の例は、ヒト、トリおよび北アメリカとユーラシア両方のブタ起源由来の配列を含有する、2009年のパンデミックブタ(H1N1)インフルエンザの出現である[2,3]。
不活化ワクチンは一般に細胞性免疫を刺激しない。ウイルス感染を取り除くことをもたらすであろう効率の良いT細胞応答を刺激するために、インフルエンザ核タンパク質(NP)のような保存されたタンパク質に対する、細胞性免疫応答を誘発するワクチンの開発への関心が高い。NPにおけるT細胞エピトープは詳細に明らかにされ[4]、CD8およびCD4 T細胞の両方がNPによって与えられた保護において重要な役割を果たす[5]。数グループが、精製された免疫原[8、9]として、またはDNAワクチン[10]として、アデノウイルス[6]、ワクシニアウイルス[7]を用いて、NPを運搬した。これらの研究は、インフルエンザ特異的T細胞応答を実証したが、ウイルス負荷に対して中程度から低い保護を示した。NPでのDNAワクチン接種は、マウスモデルにおいて、同種(homologous)および比較的低用量の異種(heterologous)の負荷に対して、保護する[11−13]。
弱毒化サルモネラワクチンは、数種の細菌、ウイルスおよび寄生虫抗原のためのワクチン担体として用いるのに成功している[14]。経口的に運搬されたワクチンは、非経口経路を介して運搬されたワクチンと比べて、多数の抗原への粘膜ならびに全身性免疫応答を引き起こすという利点を有する[14]、これは、粘膜表面を通って侵入するインフルエンザのような感染因子(infectious agent)にとって非常に重要である。さらに、経口投与されたワクチンは、それらが、それを集団ワクチン接種のための手頃な選択にする針と注射器の使用を除去するので、対費用効果が高いという利点を有する。90年代の初めに、組換えサルモネラSL3261(aroA変異体)によるインフルエンザNPを運搬する試みが行われ、抗原特異的CD4+ T細胞をもたらしたが、ウイルス負荷に直面しても任意のCD8+ T細胞または任意の保護を誘発できなかった[15]。
本発明者らは、肺炎連鎖球菌、エルシニア、およびアイメリアのような感染因子に対する、数個の組換え弱毒化サルモネラワクチン(RASV)の開発に成功している[16−18]。かかる研究で用いられるRASVは、弱毒化のために遺伝的に改変され、かつ抗生物質耐性マーカーの必要性を除去するプラスミド維持のため、Asd+平衡致死宿主−ベクター系に依存する[19]。asdA遺伝子の欠失は、細菌がin vivoで生存できないように、ペプチドグリカンの必須構成要素である、ジアミノピメリン酸(DAP)に必須の必要条件を課す。RASV株は、免疫付与の時に、それらが腸管関連リンパ系組織(GALT)においてストレスに遭遇することを可能にし、かつin vivo条件下でのインデューサーの入手不可能に起因して弱毒化が始まる前に、リンパ器官へ侵入し定着するのに成功する、野生株の属性を有するように精巧に設計されている[20]。ワクチン株の成功は、宿主への最小のダメージを備え宿主防御から生き残るその能力、および適切なエフェクターリンパ部位(effector lymphoid site)での運搬された抗原の最大の合成に依存する。これらの目標は、リンパ組織の定着後に弱毒化を与える手段としての、asdA遺伝子の欠失およびmurAのアラビノース制御発現に基づき、かつ最終的に生物学的封じ込めを与える細胞溶解をもたらす、制御された遅延溶解系を設計することにより、達成された。プログラム細胞溶解による抗原の放出は、強力なTh1型抗体応答をもたらす[21]。しかしながら、制御された溶解系を含むワクチンでの免疫後のT細胞応答の誘導は、これまで評価されていない。
NPのような細胞内病原体由来の抗原を運搬するRASVの成功の重要な要因は、サイトゾルにそれを直接運搬する、あるいは、それがプロテオソーム分解(proteosomal degradation)のために取り込まれ、かつMHC−I分子の上で提示できるように、細胞のサイトゾル内部でそれを産生する能力である。サルモネラは腸上皮のような非食細胞に侵入し、かつサルモネラ含有液胞(Salmonella containing vacuole)(SCV)と呼ばれる構造におけるエンドソーム内部に残り、MHC−II分子に最終的に提示するエンドリソソーム経路に向けられる[22]。
グラム陰性菌は、III型分泌装置(type III secretion system)(T3SS)、宿主細胞サイトゾルへのエフェクタータンパク質の注入のためのシリンジ様構造、を使用する。T3SSによって分泌されるタンパク質に異種エピトープを融合させることによって、エピトープは細胞のサイトゾルに運搬でき、MHC−I分子によって効率良く提示できる[23,24]。SopEおよびSptPのような数種のエフェクタータンパク質が、サルモネラ菌によるサイトゾルへの異種エピトープの効率の良い運搬のために記載され、かつアイメリア・アセルブリナ(Eimeria acervulina)抗原EASZ240およびEAMZ−250ならびにニワトリ盲腸コクシジウム(Eimeria tenella)抗原SO7を効果的に運搬するために用いられている[25,26]。
細菌のSptPへの融合による[27]、およびサルモネラT3SSを介するインフルエンザ(NP 366−374)およびリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)の運搬は、T細胞応答およびLCMVでの致死的負荷に対する保護をもたらした[27]。SopEエフェクターへのサル免疫不全ウイルス(SIV)Gagタンパク質の断片の融合は、CD4+およびCD8+応答の効率の良いプライミングをもたらした[28]。それゆえ、様々なNP断片およびエピトープがSopEへ融合され、かつRASV株を介して運搬され、ウイルス負荷に対する、それによって誘発されたT細胞応答および与えられた保護が評価された。
エンドソームからサルモネラを、それが細胞に侵入した後、放出するための別の戦略は、sifA遺伝子の欠失による。sifA遺伝子は、フィラメントへのサルモネラ含有液胞(SCV)の転換を支配する、SPI−2コード性の、III型分泌エフェクタータンパク質であり、その欠失はサイトゾルへのサルモネラの脱出につながる[29]。SCV内部でのネズミチフス菌の複製は、正常なエンドサイトーシス経路によるSCVのプロセシングを変化させる[30]。細菌の液胞内(intravacuolar)複製は、SCVを連結するsif(Salmonella induced filament)の形成と共に起こる。sifA変異を有するサルモネラ株は、液胞膜の完全性を失い、細胞の細胞質へ放出される。sifA変異を有するサルモネラ株は弱毒化されているが、上皮細胞における野生型の細菌よりも効率良く複製する[30,31]。sifA欠失有りまたは無しで、生じた細胞性免疫応答の比較研究を可能にするために、宿主細胞への侵入に際しサルモネラがすぐにエンドソームから出て、より速く細胞質(サイトゾル)において増殖することを可能にする、制御された溶解RASV株において、sifA遺伝子が欠失された。
以下の実施例は、RASV株による効率の良いT細胞プライミングおよびMHC−I分子への提示のために、細胞のサイトゾルへ、既知のT細胞エピトープおよび抗原を運搬する方法を記載する。モデルとして、インフルエンザNPが標的抗原として用いられた。エフェクタータンパク質SopEと共にTTSSが、抗原特異的T細胞の刺激のために採用された。代替的な戦略として、sifA欠失を有する制御された溶解変異を含有する株が生成された。インフルエンザ負荷に対してかかるワクチン接種によって与えられた細胞性および体液性免疫応答ならびに保護が、マウスにおいて評価された。以下の実施例は、サイトゾルへ抗原を運搬し、罹患率(mobidity)および死亡率を低減することにより、インフルエンザ負荷に対して、マウスの効率の良いCD8+ T細胞プライミングおよび保護をもたらす、経口投与された組換えサルモネラベクターを利用する、ウイルス抗原のための新規な細菌性遺伝子送達システムについて、初めて記載する。これはまた、クラスI提示がCD8−依存性CTL応答を誘発するのを可能にするために、T−細胞抗原を運搬する手段を表す。
実施例1−5のための材料および方法
細菌株、酵素およびプラスミド。
本研究で用いられた細菌株およびプラスミドが表1に示される。ネズミチフス菌株は非常に病原性のある株UK−1に由来した。バクテリオファージP22HTintが普遍形質導入のために用いられた。大腸菌およびネズミチフス菌培養物を、LBブロス内またはLBアガープレート上で、37℃で生育させた。NaCl非含有5%スクロース含有LBアガーが、対立遺伝子交換実験においてsacB遺伝子に基づく対抗選択のために用いられた。ジアミノピメリン酸(DAP)が、Asd−株の生育のため、50μg/mlの濃度で添加された。宿主−制御された遅延溶解ベクターの組み合わせのため、LBには0.2%アラビノースが添加された。
細菌株、酵素およびプラスミド。
本研究で用いられた細菌株およびプラスミドが表1に示される。ネズミチフス菌株は非常に病原性のある株UK−1に由来した。バクテリオファージP22HTintが普遍形質導入のために用いられた。大腸菌およびネズミチフス菌培養物を、LBブロス内またはLBアガープレート上で、37℃で生育させた。NaCl非含有5%スクロース含有LBアガーが、対立遺伝子交換実験においてsacB遺伝子に基づく対抗選択のために用いられた。ジアミノピメリン酸(DAP)が、Asd−株の生育のため、50μg/mlの濃度で添加された。宿主−制御された遅延溶解ベクターの組み合わせのため、LBには0.2%アラビノースが添加された。
株構築および特徴付け。
ΔasdA27::TT araC PBAD c2のためのファージ溶解物が、株χ9477から、標準的な方法によって大腸菌χ7213(pYA4138)とそれを接合することにより、調製された。変異ΔasdA27::TT araC PBAD c2が、株χ8633内への形質導入により導入され、株χ11001をもたらした。コロニーがクロラムフェニコール感受性およびDAP依存性についてスクリーニングされ、PCRによって確認された。
ΔasdA27::TT araC PBAD c2のためのファージ溶解物が、株χ9477から、標準的な方法によって大腸菌χ7213(pYA4138)とそれを接合することにより、調製された。変異ΔasdA27::TT araC PBAD c2が、株χ8633内への形質導入により導入され、株χ11001をもたらした。コロニーがクロラムフェニコール感受性およびDAP依存性についてスクリーニングされ、PCRによって確認された。
ΔsifA26変異は、sifA遺伝子の定義済みのインフレーム欠失である。(χ8926::pYA3716)から、ファージP22形質導入によって株χ11017内へそれを導入し、株χ11246を生成した。変異の存在はPCRによって確認された。サルモネラにおけるΔasdA27::TT araC PBAD c2変異の存在は、生育のためのDAPへのその依存性によって確認された。ΔPmurA25::TT araC PBAD murA変異(表1)の存在は生育のためのアラビノースへのその依存性によって確認された。以前に記載されたように、LPSプロファイルが検討された。
細菌株の溶解表現型を、一晩培養物を10−3および10−4へ希釈し、0.2%アラビノース有りまたは無しのLBプレート上に100μlのサンプルをプレーティングすることにより、次いで37℃でインキュベートすることにより、確認した。制御された遅延溶解を示す株は、アラビノースのみを含有するLBアガー上で生育し、生存のためアラビノースの存在に完全な依存性を表した。
一般的なDNA手順。
DNA操作はSambrook et.alによって記載されたように実施した[32]。大腸菌およびネズミチフス菌の形質転換をエレクトロポレーションにより行った(Bio−Rad,Hercules,CA)。Asd+プラスミドを含有する形質転換体を、DAP無しのLBアガープレート上で選択した。
DNA操作はSambrook et.alによって記載されたように実施した[32]。大腸菌およびネズミチフス菌の形質転換をエレクトロポレーションにより行った(Bio−Rad,Hercules,CA)。Asd+プラスミドを含有する形質転換体を、DAP無しのLBアガープレート上で選択した。
プラスミド安定性。
プラスミド安定性を以前に記載されたように決定した[24]。プラスミドpYA4702またはpYA4858を持つRASV株を、50μg/mlのDAPおよび0.2%アラビノースが添加された3ml培養液において一晩生育させた。翌日、DAPおよびアラビノースが添加された新鮮なLBに一晩培養物の1:1000希釈液を接種し、静的に、37℃で一晩(約14時間)生育させた。Asd+プラスミドを保持している細菌細胞の割合を推定するために、培養物を連続希釈し、10−5および10−6をDAPおよびアラビノースが添加されたLBプレート上にプレーティングし、37℃で一晩生育させた。翌日、これらのプレートから100コロニーを選び取り、アラビノースが添加されたLBおよびDAPおよびアラビノースが添加されたLB上にパッチした。プラスミドを保持しているクローンのパーセンテージを、コロニーを数えることにより決定した。同時に、毎日のプレーティングからのコロニーを、DAPおよびアラビノースが添加された新鮮なLBブロスで生育し、この工程を5日連続して(50世代)繰り返した。最後に、代表的な数のコロニーを、正確なサイズおよびコピー数のAsd+プラスミドを保有すること、および正確なサイズの防御抗原の合成をコードすることについてスクリーニングした。
プラスミド安定性を以前に記載されたように決定した[24]。プラスミドpYA4702またはpYA4858を持つRASV株を、50μg/mlのDAPおよび0.2%アラビノースが添加された3ml培養液において一晩生育させた。翌日、DAPおよびアラビノースが添加された新鮮なLBに一晩培養物の1:1000希釈液を接種し、静的に、37℃で一晩(約14時間)生育させた。Asd+プラスミドを保持している細菌細胞の割合を推定するために、培養物を連続希釈し、10−5および10−6をDAPおよびアラビノースが添加されたLBプレート上にプレーティングし、37℃で一晩生育させた。翌日、これらのプレートから100コロニーを選び取り、アラビノースが添加されたLBおよびDAPおよびアラビノースが添加されたLB上にパッチした。プラスミドを保持しているクローンのパーセンテージを、コロニーを数えることにより決定した。同時に、毎日のプレーティングからのコロニーを、DAPおよびアラビノースが添加された新鮮なLBブロスで生育し、この工程を5日連続して(50世代)繰り返した。最後に、代表的な数のコロニーを、正確なサイズおよびコピー数のAsd+プラスミドを保有すること、および正確なサイズの防御抗原の合成をコードすることについてスクリーニングした。
ペプチド。
合成ペプチドNP147−155(TYQRTRALV)はBiosynthesis Inc.(Lewisville,TX)から入手した。製造業者の指示書に従ってそれを水に溶解し、等分し、用いるまで−20℃で保存した。
合成ペプチドNP147−155(TYQRTRALV)はBiosynthesis Inc.(Lewisville,TX)から入手した。製造業者の指示書に従ってそれを水に溶解し、等分し、用いるまで−20℃で保存した。
NP遺伝子のコドン最適化。
インフルエンザウイルス株A/WSN/33の核タンパク質(NP)遺伝子の配列(NCBI,登録番号EU330203)が、サルモネラにおける最大発現のためにコドン最適化された。遺伝子配列を商業的にコドン最適化し、かつpUC−57にクローニングして、Genscript(Piscataway,NJ)によりpUC−57−NP−WSNを得た。交換されたコドンが表2に表される。平均G+C含量は、コドン最適化後に、非最適化遺伝子に対する46.66から54.59へ変化した。リボソームの結合およびmRNAの安定性に影響を与えるステムループ構造は破壊された。大腸菌に関するコドン使用バイアス(codon usage bias)は、0.57のコドン適応指数(codon adaptation index)から0.98に増加された。
表2. A/WSN/33 NP遺伝子に関する、コドン最適化対オリジナルのヌクレオチド配列およびアミノ酸。Opt=コドン最適化配列;Ori=非コドン最適化オリジナル配列。
インフルエンザウイルス株A/WSN/33の核タンパク質(NP)遺伝子の配列(NCBI,登録番号EU330203)が、サルモネラにおける最大発現のためにコドン最適化された。遺伝子配列を商業的にコドン最適化し、かつpUC−57にクローニングして、Genscript(Piscataway,NJ)によりpUC−57−NP−WSNを得た。交換されたコドンが表2に表される。平均G+C含量は、コドン最適化後に、非最適化遺伝子に対する46.66から54.59へ変化した。リボソームの結合およびmRNAの安定性に影響を与えるステムループ構造は破壊された。大腸菌に関するコドン使用バイアス(codon usage bias)は、0.57のコドン適応指数(codon adaptation index)から0.98に増加された。
表2. A/WSN/33 NP遺伝子に関する、コドン最適化対オリジナルのヌクレオチド配列およびアミノ酸。Opt=コドン最適化配列;Ori=非コドン最適化オリジナル配列。
III型分泌装置(T3SS)ベクター。
pSC101 oriを有する、プロモーター領域およびネズミチフス菌ATG−sopEの末端分泌(terminal secretion)および移行(translocation)ドメイン(1−80aa)をコードするヌクレオチド配列を含有するAsdベクター、pYA3869、ならびにp15 oriを有する、pYA3870は、以前に記載されている[33]。NPのC末端領域(CT)(ヌクレオチド772−1505)またはNP(147−155)エピトープが、これら2つのベクターに挿入された。
pSC101 oriを有する、プロモーター領域およびネズミチフス菌ATG−sopEの末端分泌(terminal secretion)および移行(translocation)ドメイン(1−80aa)をコードするヌクレオチド配列を含有するAsdベクター、pYA3869、ならびにp15 oriを有する、pYA3870は、以前に記載されている[33]。NPのC末端領域(CT)(ヌクレオチド772−1505)またはNP(147−155)エピトープが、これら2つのベクターに挿入された。
NP遺伝子のCTをプライマーTTFP−3およびTTRP−3を用いてpCAGGS−NP(Dr. Andrew Pekosz,ワシントン大学,St.Louisにより提供された)から増幅し、Zero bluntクローニングキット(Invitrogen)内にクローニングして、pYA4631を得た。SopE−ESAT−6およびCFP−10を有するプラスミドpYA4247をCla1で消化して、これらの配列を取り除き、再ライゲーションして、C末端に3 X FLAGを含有すること以外はpYA3870と類似している、pYA4632を得た。pYA4631からのNP−CT断片をEcoR1およびXma1で消化し、pYA3870内にライゲーションして、pYA4629を得た。SopE−CT−NP−Flag断片をプライマーTTFCla−5およびTTFlagR−6を用いてpYA4629から増幅し、Cla1で消化し、pYA3869内にクローニングして、pYA4630を得た。
SopEをNPエピトープと融合するために、プラスミドpYA4247をプライマーTTFCla−5およびNP−epi147を用いて増幅し、PCR産物をZeroblunt PCRクローニングキット(Invitrogen)内にクローニングして、pYA4699を得た。SopE−NPエピトープ融合体をCla1で消化し、pYA4632内にサブクローニングして、pYA4700を得た。pYA4700をプライマーNP−Epi−F2およびNP−Epi−R3で増幅し、PCR産物をEcoR1およびXma1酵素で消化し、pYA3869内にクローニングして、pYA4701を得た。in vitro分泌解析およびワクチン接種実験のために、プラスミドをχ8916(ΔphoP233 ΔasdA16)およびχ11001(ΔrelA ΔspoT ΔasdA27::TT araC PBAD c2)内に形質転換した。
制御された溶解ベクター。
NP遺伝子を、プライマー対RDLF−3およびRDLP−2を用いるPCRによってプラスミドpCGGAS−NP(Dr. Andrew Pekoszにより提供された)から増幅した。PCR産物をNcoIおよびXmaI部位を用いて消化し、プラスミドpYA3681内にクローニングして、pYA4702を得た。pUC−57−WSN−NP由来のコドン最適化NP遺伝子を、プライマー対RDLF−5およびRDLRP−7を用いて増幅した。PCR産物をNcoIで消化し、pYA3681にクローニングして、pYA4858を得た。NP遺伝子の正しい方向を、PstIでの制限消化によって、かつシークエンシングによって確認した。pYA3681の全ての誘導体は、それぞれ、プライマー対Ptrc−FおよびPtrc−Rを用いて、シークエンシングされた。pYA3681にクローニングされた肺炎連鎖球菌(S.pneumonia)由来のply遺伝子をコードする陰性対照ベクターpYA4651は、Wei Xinによって構築された。全てのベクターは、エレクトロポレーションによって、適切なネズミチフス菌株にトランスファーされた。全てのDNA構築物は、ABI Prism fluorescent BigDye terminatorsを用いて、アリゾナ州立大学のコア施設にて、シークエンシングによって確認された。
NP遺伝子を、プライマー対RDLF−3およびRDLP−2を用いるPCRによってプラスミドpCGGAS−NP(Dr. Andrew Pekoszにより提供された)から増幅した。PCR産物をNcoIおよびXmaI部位を用いて消化し、プラスミドpYA3681内にクローニングして、pYA4702を得た。pUC−57−WSN−NP由来のコドン最適化NP遺伝子を、プライマー対RDLF−5およびRDLRP−7を用いて増幅した。PCR産物をNcoIで消化し、pYA3681にクローニングして、pYA4858を得た。NP遺伝子の正しい方向を、PstIでの制限消化によって、かつシークエンシングによって確認した。pYA3681の全ての誘導体は、それぞれ、プライマー対Ptrc−FおよびPtrc−Rを用いて、シークエンシングされた。pYA3681にクローニングされた肺炎連鎖球菌(S.pneumonia)由来のply遺伝子をコードする陰性対照ベクターpYA4651は、Wei Xinによって構築された。全てのベクターは、エレクトロポレーションによって、適切なネズミチフス菌株にトランスファーされた。全てのDNA構築物は、ABI Prism fluorescent BigDye terminatorsを用いて、アリゾナ州立大学のコア施設にて、シークエンシングによって確認された。
培養上清へのsopE−NPの分泌。
SopE−CT−NPまたはSopE−NPエピトープの分泌を以前に記載された手順に従って解析した[24]。簡単に言うと、RASV株培養物を、300mM NaCl含有LBで穏やかに通気させながら、0.6のO.D600まで生育させた。細胞を6000 x gで15分間、遠心分離し、0.45μmフィルターを通してろ過し、10%トリクロロ酢酸(TCA)で一晩沈殿させ、そして13000 x gで15分間の遠心分離によって沈殿させた。沈殿物を氷冷アセトンで洗浄し、風乾し、SDS−PAGEサンプルバッファーに再懸濁し、そしてSDS−PAGEおよびウェスタンブロットによって解析した。抗原が、細胞の溶解によらず、T3SSを介して分泌されることを確かめるため、膜漏出の指標としてRpoDσ70について上清と培養液を同時に解析した。
SopE−CT−NPまたはSopE−NPエピトープの分泌を以前に記載された手順に従って解析した[24]。簡単に言うと、RASV株培養物を、300mM NaCl含有LBで穏やかに通気させながら、0.6のO.D600まで生育させた。細胞を6000 x gで15分間、遠心分離し、0.45μmフィルターを通してろ過し、10%トリクロロ酢酸(TCA)で一晩沈殿させ、そして13000 x gで15分間の遠心分離によって沈殿させた。沈殿物を氷冷アセトンで洗浄し、風乾し、SDS−PAGEサンプルバッファーに再懸濁し、そしてSDS−PAGEおよびウェスタンブロットによって解析した。抗原が、細胞の溶解によらず、T3SSを介して分泌されることを確かめるため、膜漏出の指標としてRpoDσ70について上清と培養液を同時に解析した。
SDS−PAGEおよびイムノブロット。
大腸菌およびネズミチフス菌株におけるプラスミドからのNPタンパク質合成を評価するために、細胞を、0.2%アラビノース含有LBにおいて、37℃で一晩生育させた。一定分量(1ml)を採取し、低速度で遠心分離し、2x SDS−PAGEローディングバッファーに再懸濁し、そして10分間煮沸した。サンプルを10分間遠心分離し、2x サンプルローディングバッファーに1:10で希釈し、そして、以前に記載されたように[44]、電気泳動による分離のために、10μlを12.5% SDS−PAGEゲルにロードした。タンパク質をニトロセルロース膜にトランスファーし、室温で1時間、5%スキムミルクでブロッキングした。膜をPBS−0.05% Tween 20(T20)で3回すすいだ。NP合成を解析するため、ブロットを、一定に振盪させながら、1時間、ウサギポリクローナル抗−A型インフルエンザ NP抗体(Abcam)とインキュベートした。PBS−T20で洗浄後、1時間、ヤギ抗−ウサギIgGアルカリホスファターゼコンジュゲート(Sigma)とインキュベートし、ニトロブルーテトラゾリウム−5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェート(tetrazolium−5−bromo−4−chloro−3−indolyphosphate)(BCIP)(Sigma)と反応させた。膜を水で洗浄し、風乾した。
大腸菌およびネズミチフス菌株におけるプラスミドからのNPタンパク質合成を評価するために、細胞を、0.2%アラビノース含有LBにおいて、37℃で一晩生育させた。一定分量(1ml)を採取し、低速度で遠心分離し、2x SDS−PAGEローディングバッファーに再懸濁し、そして10分間煮沸した。サンプルを10分間遠心分離し、2x サンプルローディングバッファーに1:10で希釈し、そして、以前に記載されたように[44]、電気泳動による分離のために、10μlを12.5% SDS−PAGEゲルにロードした。タンパク質をニトロセルロース膜にトランスファーし、室温で1時間、5%スキムミルクでブロッキングした。膜をPBS−0.05% Tween 20(T20)で3回すすいだ。NP合成を解析するため、ブロットを、一定に振盪させながら、1時間、ウサギポリクローナル抗−A型インフルエンザ NP抗体(Abcam)とインキュベートした。PBS−T20で洗浄後、1時間、ヤギ抗−ウサギIgGアルカリホスファターゼコンジュゲート(Sigma)とインキュベートし、ニトロブルーテトラゾリウム−5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェート(tetrazolium−5−bromo−4−chloro−3−indolyphosphate)(BCIP)(Sigma)と反応させた。膜を水で洗浄し、風乾した。
T3SS解析のため、ブロットを、分泌に関するマーカーとして、抗−Flag抗体(Sigma)および抗−βガラクトシダーゼ抗体(Abcam)でプローブし、二次抗体はそれぞれ、抗−マウスIgGおよび抗−ウサギIgG(Sigma)であった。
ウイルス株、増殖、精製および滴定。
rWSNウイルスはDr. Andrew Pekosz(ジョンズ・ホプキンス大学,Baltimore,MD)により提供された。それは逆遺伝学によって作成されたマウス馴化株であり、103 TCID50以上の用量でマウスに対して致死的である。ウイルスを、2μg/mlアセチル−トリプシン(Sigma)含有RPMI−1640(Gibco)にて培養されたメイディン−ダービーイヌ腎臓細胞において増殖し、滴定した。ウイルスを、WK ultra 90 centrifuge(Thermo Electron Corp.)を用いて、Surespin Sorvall 630ローターにて、3時間、11,620 x gで、30%(w/v)スクロースクッションを通過させた。生じた沈殿物をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH7.2に再懸濁し、11,620 x gで1時間、遠心分離した。ウイルス沈殿物を最後に500μlのPBSに溶解し、用いるまで−80℃で冷凍しておいた。
rWSNウイルスはDr. Andrew Pekosz(ジョンズ・ホプキンス大学,Baltimore,MD)により提供された。それは逆遺伝学によって作成されたマウス馴化株であり、103 TCID50以上の用量でマウスに対して致死的である。ウイルスを、2μg/mlアセチル−トリプシン(Sigma)含有RPMI−1640(Gibco)にて培養されたメイディン−ダービーイヌ腎臓細胞において増殖し、滴定した。ウイルスを、WK ultra 90 centrifuge(Thermo Electron Corp.)を用いて、Surespin Sorvall 630ローターにて、3時間、11,620 x gで、30%(w/v)スクロースクッションを通過させた。生じた沈殿物をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH7.2に再懸濁し、11,620 x gで1時間、遠心分離した。ウイルス沈殿物を最後に500μlのPBSに溶解し、用いるまで−80℃で冷凍しておいた。
マウスの免疫付与。
全ての動物実験は、承認されたASU IACUCプロトコールに従って、アリゾナ州立大学、バイオデザイン研究所の我々の動物施設において、BSL−2レベルの封じ込めにて、行われた。5週齢の雌BALB/cマウスをCharles River Laboratories(Wilmington,MA)から購入し、免疫前1週間、環境に慣れさせた。マウスの各グループは、経口免疫前の4時間、食糧および水を与えられなかった。組換えネズミチフス菌株を、0.85のOD600まで、0.2%アラビノースおよび0.2%マンノースを有するLBブロスにて個別に生育させた。培養物を室温で15分間、4,000 x gで遠心分離し、5x109 CFU/mlの終濃度に、0.01%ゼラチン(BSG)含有緩衝食塩水に再懸濁した。細菌をアラビノースが添加されたLBアガー上で滴定した。マウスを、20μl(1x109 CFU)で経口(PO)経路、10μl(1x107 CFU)で鼻腔内経路(IN)によって、または100μl(1x105 CFU)で腹腔内(IP)経路によって、免疫した。食糧および水を、ワクチン投与30分後に、経口免疫されたマウスに戻した。発現される抗原遺伝子を有さないベクター(pYA3681)もしくは肺炎連鎖球菌(S.pneumonia)由来のply遺伝子を発現するもの(pYA4651)およびBSG免疫マウスを、以下の実験において陰性対照として用いた。
全ての動物実験は、承認されたASU IACUCプロトコールに従って、アリゾナ州立大学、バイオデザイン研究所の我々の動物施設において、BSL−2レベルの封じ込めにて、行われた。5週齢の雌BALB/cマウスをCharles River Laboratories(Wilmington,MA)から購入し、免疫前1週間、環境に慣れさせた。マウスの各グループは、経口免疫前の4時間、食糧および水を与えられなかった。組換えネズミチフス菌株を、0.85のOD600まで、0.2%アラビノースおよび0.2%マンノースを有するLBブロスにて個別に生育させた。培養物を室温で15分間、4,000 x gで遠心分離し、5x109 CFU/mlの終濃度に、0.01%ゼラチン(BSG)含有緩衝食塩水に再懸濁した。細菌をアラビノースが添加されたLBアガー上で滴定した。マウスを、20μl(1x109 CFU)で経口(PO)経路、10μl(1x107 CFU)で鼻腔内経路(IN)によって、または100μl(1x105 CFU)で腹腔内(IP)経路によって、免疫した。食糧および水を、ワクチン投与30分後に、経口免疫されたマウスに戻した。発現される抗原遺伝子を有さないベクター(pYA3681)もしくは肺炎連鎖球菌(S.pneumonia)由来のply遺伝子を発現するもの(pYA4651)およびBSG免疫マウスを、以下の実験において陰性対照として用いた。
制御された溶解株
発現される抗原を有さないベクターpYA3681もしくは肺炎連鎖球菌由来のply抗原を発現するpYA4651およびBSGワクチン接種マウスを、以下の実験において陰性対照として用いた。頬袋採血(cheek pouch bleeding)によって血液を取り出し、37℃のインキュベーターにて30分間凝固させ、そして4℃で一晩放置した。15分間10,000 x gでの遠心分離後に血清を回収し、用いるまで−20℃で保存し、以下に記載するように、NPまたはLPSに対する抗体の有無についてELISAにより試験した。細胞性免疫応答をアッセイするために、脾臓を無菌的に回収し、プールし、そして以下に記載するように、ELISPOTおよび細胞内サイトカイン染色(ICS)のために処理した。
発現される抗原を有さないベクターpYA3681もしくは肺炎連鎖球菌由来のply抗原を発現するpYA4651およびBSGワクチン接種マウスを、以下の実験において陰性対照として用いた。頬袋採血(cheek pouch bleeding)によって血液を取り出し、37℃のインキュベーターにて30分間凝固させ、そして4℃で一晩放置した。15分間10,000 x gでの遠心分離後に血清を回収し、用いるまで−20℃で保存し、以下に記載するように、NPまたはLPSに対する抗体の有無についてELISAにより試験した。細胞性免疫応答をアッセイするために、脾臓を無菌的に回収し、プールし、そして以下に記載するように、ELISPOTおよび細胞内サイトカイン染色(ICS)のために処理した。
動物実験1。
インフルエンザウイルスのコドン最適化NPをコードする(pYA4858)RASV株によって与えられる免疫原性および防御免疫へのsifA欠失(χ11246)の影響を評価するために、BALB/cマウス(n=8)が、親χ11017(pYA4858)(SifA+)、変異体χ11246(pYA4858)(SifA−)、ベクター対照χ11017(pYA3681)(SifA+)およびχ11246(pYA3681)(SifA−)で、またはBSGで、0週目に経口免疫され、一次免疫後(PPI)1、4および7週目に3回追加免疫(boost)された。頬袋採血によってPPI3および6週で回収された血液を、ELISAによってNPまたはネズミチフス菌LPSに対する抗体の存在についてモニタリングした。抗原特異的IFN−γ分泌T細胞をアッセイするために、2−3匹のマウスからPPI8週で脾臓を無菌的に回収し、プールし、ELISPOTのために処理した。各グループにおける残りのマウス(n=5)を、PPI8週(14週齢)にrWSN(100 LD50)で負荷し、さらなる3週間、罹患率および死亡率について観察した。
インフルエンザウイルスのコドン最適化NPをコードする(pYA4858)RASV株によって与えられる免疫原性および防御免疫へのsifA欠失(χ11246)の影響を評価するために、BALB/cマウス(n=8)が、親χ11017(pYA4858)(SifA+)、変異体χ11246(pYA4858)(SifA−)、ベクター対照χ11017(pYA3681)(SifA+)およびχ11246(pYA3681)(SifA−)で、またはBSGで、0週目に経口免疫され、一次免疫後(PPI)1、4および7週目に3回追加免疫(boost)された。頬袋採血によってPPI3および6週で回収された血液を、ELISAによってNPまたはネズミチフス菌LPSに対する抗体の存在についてモニタリングした。抗原特異的IFN−γ分泌T細胞をアッセイするために、2−3匹のマウスからPPI8週で脾臓を無菌的に回収し、プールし、ELISPOTのために処理した。各グループにおける残りのマウス(n=5)を、PPI8週(14週齢)にrWSN(100 LD50)で負荷し、さらなる3週間、罹患率および死亡率について観察した。
動物実験2。
マウスのグループ(n=8)が、コドン最適化NPをコードする株χ11246(pYA4858)(SifA−)、χ11246(pYA4651)由来の無関係な抗原(Ply)、またはBSGで、0週目に経口免疫され、PPI1および4週目に2回追加免疫された。最後の追加免疫の4日後、脾臓および血液が各グループからの3匹のマウスから回収され、ELISPOTおよびELISAを実施して、抗原特異的T細胞ならびにNPおよびLPS特異的抗体を検出した。各グループにおける残りのマウスは、PPI5週(10週齢で)にrWSN(100 LD50)で負荷され、さらなる3週間、罹患率および死亡率について観察された。
マウスのグループ(n=8)が、コドン最適化NPをコードする株χ11246(pYA4858)(SifA−)、χ11246(pYA4651)由来の無関係な抗原(Ply)、またはBSGで、0週目に経口免疫され、PPI1および4週目に2回追加免疫された。最後の追加免疫の4日後、脾臓および血液が各グループからの3匹のマウスから回収され、ELISPOTおよびELISAを実施して、抗原特異的T細胞ならびにNPおよびLPS特異的抗体を検出した。各グループにおける残りのマウスは、PPI5週(10週齢で)にrWSN(100 LD50)で負荷され、さらなる3週間、罹患率および死亡率について観察された。
動物実験3。
異なる経路を介して投与された場合の、SifA−株を用いることの免疫原性および防御効率を決定するために、マウスが、PO、INまたはIP経路を介して、RASV χ11246(pYA4858)(NP+SifA−)および陰性対照としてχ11246(pYA4651)(Ply+SifA−)で、0週目に免疫され、PPI1、4および7週目に3回追加免疫された。最後の免疫の4日後、3匹のマウスから脾臓を回収し、ELISPOTによって抗原特異的IFN−γ分泌T細胞の産生について、およびNP147−155特異的増殖について解析した。各グループにおける残りのマウスは、PPI8週(14週齢)にrWSN(100 LD50)で負荷され、さらなる3週間、罹患率および死亡率について観察された。
異なる経路を介して投与された場合の、SifA−株を用いることの免疫原性および防御効率を決定するために、マウスが、PO、INまたはIP経路を介して、RASV χ11246(pYA4858)(NP+SifA−)および陰性対照としてχ11246(pYA4651)(Ply+SifA−)で、0週目に免疫され、PPI1、4および7週目に3回追加免疫された。最後の免疫の4日後、3匹のマウスから脾臓を回収し、ELISPOTによって抗原特異的IFN−γ分泌T細胞の産生について、およびNP147−155特異的増殖について解析した。各グループにおける残りのマウスは、PPI8週(14週齢)にrWSN(100 LD50)で負荷され、さらなる3週間、罹患率および死亡率について観察された。
ウイルス負荷。
ウイルス負荷のため、腹腔内に投与した0.05ml/20g体重のケタミンカクテル(21.0mg ケタミン、2.4mg キシラジン、および0.3mg アセプロマジン)でマウスに麻酔をかけた。鎮静状態のマウスを、全ての実験のため、鼻孔あたり30μl、15μlの総容積で、100 LD50(1x105 TCID50)のrWSNに鼻腔内(IN)感染させた。マウスのグループを、8週齢で、30μlの1x107−1x102 TCID50に連続希釈された精製rWSNにIN感染させ、ReedおよびMuenchの方法によってLD50を決定した。LD50用量におけるあらゆる年齢依存性の変動を排除するために、同様の実験が10および14週齢のマウスで実施された。8、10または14週齢のマウスにおいて、ウイルスに関連した罹患率および死亡率の観点から、違いは観察されなかった。負荷のために用いられたウイルスの一定分量をMDCK細胞で逆滴定し、マウスに与えられた正確な用量を確認した。負荷されたマウスを、被毛の乱れ(ruffled fur)、猫背(hunched posture)などの感染の兆候について毎日調べ、21日目まで一日置きに体重を量って、感染の進行をモニタリングした。パーセント体重減少が、それらの負荷前の体重とそれらの毎日の体重を比較することにより、各グループにおける個々のマウスについて計算された。感染で死んだ、あるいは安楽死させなければならなかったマウスは、速やかに取り除かれた。
ウイルス負荷のため、腹腔内に投与した0.05ml/20g体重のケタミンカクテル(21.0mg ケタミン、2.4mg キシラジン、および0.3mg アセプロマジン)でマウスに麻酔をかけた。鎮静状態のマウスを、全ての実験のため、鼻孔あたり30μl、15μlの総容積で、100 LD50(1x105 TCID50)のrWSNに鼻腔内(IN)感染させた。マウスのグループを、8週齢で、30μlの1x107−1x102 TCID50に連続希釈された精製rWSNにIN感染させ、ReedおよびMuenchの方法によってLD50を決定した。LD50用量におけるあらゆる年齢依存性の変動を排除するために、同様の実験が10および14週齢のマウスで実施された。8、10または14週齢のマウスにおいて、ウイルスに関連した罹患率および死亡率の観点から、違いは観察されなかった。負荷のために用いられたウイルスの一定分量をMDCK細胞で逆滴定し、マウスに与えられた正確な用量を確認した。負荷されたマウスを、被毛の乱れ(ruffled fur)、猫背(hunched posture)などの感染の兆候について毎日調べ、21日目まで一日置きに体重を量って、感染の進行をモニタリングした。パーセント体重減少が、それらの負荷前の体重とそれらの毎日の体重を比較することにより、各グループにおける個々のマウスについて計算された。感染で死んだ、あるいは安楽死させなければならなかったマウスは、速やかに取り除かれた。
ELISA。
血清におけるNPまたはまたはLPSに対するIgG応答はELISAによって決定された[50]。簡単に言うと、96ウェル平底ポリスチレンマイクロタイタープレート(Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA)を、炭酸塩コーティングバッファー(pH=9.5)に再懸濁した、2μg/mlの精製NPタンパク質(Dr.Troy Randall,(トルドー研究所, Saranac Lake, NY)により提供された)またはLPS(Sigma)でコートし、4℃で一晩インキュベートした。遊離結合部位を、室温で2時間、3%ウシ血清アルブミン(BSA)含有リン酸緩衝生理食塩水(PBS)−0.05% T20でブロッキングした。血清をPBS/3% BSA中に連続的に2倍希釈し、100μlを室温で1時間、デュプリケートのウェルでインキュベートした。プレートをPBS−T20で3回洗浄し、ビオチン化ヤギ抗−マウスIgGまたはIgG1またはIgG2a(Southern Biotechnology Inc., Birmingham, AL)のいずれかの1:1000希釈液で1時間インキュベートした。上記のような洗浄の後、プレートをストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート(Southern Biotechnology Inc., Birmingham, AL)と1時間インキュベートし、30分間、p−ニトロフェニルリン酸(Sigma)とインキュベートすることにより反応させ、そして405 nmで自動ELISAプレートリーダー(SpectraMax, Molecular Devices, Sunnydale, CA)により読み取った。終点力価(endpoint titer)は、最後の陽性サンプルの希釈倍数の逆数のlog2値として表された。ベースライン値として用いられる免疫前血清よりも2倍高い吸光度が、陽性であると考えた。
血清におけるNPまたはまたはLPSに対するIgG応答はELISAによって決定された[50]。簡単に言うと、96ウェル平底ポリスチレンマイクロタイタープレート(Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA)を、炭酸塩コーティングバッファー(pH=9.5)に再懸濁した、2μg/mlの精製NPタンパク質(Dr.Troy Randall,(トルドー研究所, Saranac Lake, NY)により提供された)またはLPS(Sigma)でコートし、4℃で一晩インキュベートした。遊離結合部位を、室温で2時間、3%ウシ血清アルブミン(BSA)含有リン酸緩衝生理食塩水(PBS)−0.05% T20でブロッキングした。血清をPBS/3% BSA中に連続的に2倍希釈し、100μlを室温で1時間、デュプリケートのウェルでインキュベートした。プレートをPBS−T20で3回洗浄し、ビオチン化ヤギ抗−マウスIgGまたはIgG1またはIgG2a(Southern Biotechnology Inc., Birmingham, AL)のいずれかの1:1000希釈液で1時間インキュベートした。上記のような洗浄の後、プレートをストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート(Southern Biotechnology Inc., Birmingham, AL)と1時間インキュベートし、30分間、p−ニトロフェニルリン酸(Sigma)とインキュベートすることにより反応させ、そして405 nmで自動ELISAプレートリーダー(SpectraMax, Molecular Devices, Sunnydale, CA)により読み取った。終点力価(endpoint titer)は、最後の陽性サンプルの希釈倍数の逆数のlog2値として表された。ベースライン値として用いられる免疫前血清よりも2倍高い吸光度が、陽性であると考えた。
IFN−γ ELISPOT。
5または8週目に、2−3匹のワクチン接種マウス由来の脾臓を各グループから無菌的に回収し、グループ内にプールした。酵素免疫スポット(ELISPOT)アッセイを以前に記載されたように実施した[38]。簡単に言うと、5μg/mlのPBS中抗−ガンマインターフェロン(IFN−γ)モノクローナル抗体(MAb)(BD Pharmingen, San Diego, CA)でコートしたポリビニリデンジフルオリド膜プレート(Millipore, Bedford, MA)を4℃で一晩保持した。ウェルをPBSで洗浄し、2時間、10%ウシ胎児血清(FCS)を含むRPMI培地でブロッキングした。ペプチドNP(147−155)有りまたは無しの、10% FCS、2mM L−グルタミン、100IU/ml ペニシリンおよびストレプトマイシン、ならびに1% HEPESが添加された50μl(ウェル当たり1,000,000)のRPMI 1640中の脾臓細胞がウェルごとに添加され、37℃、5% CO2にて、一晩プレート中でインキュベートされた。2μg/mlのコンカナバリンAが陽性対照として用いられた。翌日、細胞懸濁液を捨て、プレートをPBSで洗浄した。1% FCSを含むPBS中0.5μg/mlのビオチン化抗−IFN−γ MAbを添加し、室温で2時間インキュベートした。PBSで洗浄した後、100μl/ウェルの、1% FCS含有PBS−Tween 20に1:1,000(vol/vol)希釈されたアビジンペルオキシダーゼを添加し、続いて室温で1時間インキュベートした。3−アミノ−9−エチルカルバゾール基質(Vector Laboratories, Burlingame, CA)を製造業者の仕様書に従って調製し、100μlの基質をウェルごとに添加した。スポットを室温で15分間反応させた。プレートを乾燥させ、自動CTL ELISPOTリーダーシステム(Cellular Technology LTD, Cleveland, OH)を用いることにより解析した。
5または8週目に、2−3匹のワクチン接種マウス由来の脾臓を各グループから無菌的に回収し、グループ内にプールした。酵素免疫スポット(ELISPOT)アッセイを以前に記載されたように実施した[38]。簡単に言うと、5μg/mlのPBS中抗−ガンマインターフェロン(IFN−γ)モノクローナル抗体(MAb)(BD Pharmingen, San Diego, CA)でコートしたポリビニリデンジフルオリド膜プレート(Millipore, Bedford, MA)を4℃で一晩保持した。ウェルをPBSで洗浄し、2時間、10%ウシ胎児血清(FCS)を含むRPMI培地でブロッキングした。ペプチドNP(147−155)有りまたは無しの、10% FCS、2mM L−グルタミン、100IU/ml ペニシリンおよびストレプトマイシン、ならびに1% HEPESが添加された50μl(ウェル当たり1,000,000)のRPMI 1640中の脾臓細胞がウェルごとに添加され、37℃、5% CO2にて、一晩プレート中でインキュベートされた。2μg/mlのコンカナバリンAが陽性対照として用いられた。翌日、細胞懸濁液を捨て、プレートをPBSで洗浄した。1% FCSを含むPBS中0.5μg/mlのビオチン化抗−IFN−γ MAbを添加し、室温で2時間インキュベートした。PBSで洗浄した後、100μl/ウェルの、1% FCS含有PBS−Tween 20に1:1,000(vol/vol)希釈されたアビジンペルオキシダーゼを添加し、続いて室温で1時間インキュベートした。3−アミノ−9−エチルカルバゾール基質(Vector Laboratories, Burlingame, CA)を製造業者の仕様書に従って調製し、100μlの基質をウェルごとに添加した。スポットを室温で15分間反応させた。プレートを乾燥させ、自動CTL ELISPOTリーダーシステム(Cellular Technology LTD, Cleveland, OH)を用いることにより解析した。
細胞増殖。
リンパ球増殖アッセイを実施して、インフルエンザペプチド特異的(NP 147−155)細胞媒介性応答を評価した。脾臓から調製された単一細胞懸濁液を5x105細胞/ウェルの濃度でプレーティングし、7日間、NP147−155ペプチドTYQRTRALV(20μg/ml)で刺激した。蛍光細胞生存アッセイキット(Biovision, Mountain View, CA)のVision blues色素商標を製造業者の指示書に従って添加し、プレートを励起530nmおよび蛍光590nmで読み取った。
リンパ球増殖アッセイを実施して、インフルエンザペプチド特異的(NP 147−155)細胞媒介性応答を評価した。脾臓から調製された単一細胞懸濁液を5x105細胞/ウェルの濃度でプレーティングし、7日間、NP147−155ペプチドTYQRTRALV(20μg/ml)で刺激した。蛍光細胞生存アッセイキット(Biovision, Mountain View, CA)のVision blues色素商標を製造業者の指示書に従って添加し、プレートを励起530nmおよび蛍光590nmで読み取った。
細胞調製および細胞内サイトカインアッセイ。
単一細胞懸濁液が脾臓から調製し、2回洗浄し、そしてfine Nitex膜を通してろ過した。サンプルを次いで細胞培地(10% FCS、2mM L−グルタミン、100IU/ml ペニシリンおよびストレプトマイシン、ならびに1% HEPESが添加されたRPMI−1640)中で培養した。IFN−γ分泌CD8+細胞を、製造業者のプロトコールを用いて検出した(eBioscience, San Diego, CA)[39]。簡単に言うと、培養物をNPペプチド(147−155)TYQRTRALVまたはNP抗原(5μg/ml)で12時間刺激した。インキュベーションの終了の2時間前に、モネンシンを2μMの終濃度に添加した。細胞を洗浄バッファー(PBS中3% FBS)で洗浄し、FcRII/IIIを介する非特異的な染色を阻止するために精製抗−マウスCD16/32でブロッキングした。細胞をフィコエリトリン−Cy5(PE−cy5)コンジュゲート抗−マウスCD8抗体で染色し、固定し、透過処理し、そしてフィコエリトリン(PE)とコンジュゲートした抗−マウスIFN−γ抗体(eBioscience, San Diego, CA)で染色した。全ての解析は、データ解析用CXPソフトウェアを用いてFACS500(BD Biosciences)上で行われた。
単一細胞懸濁液が脾臓から調製し、2回洗浄し、そしてfine Nitex膜を通してろ過した。サンプルを次いで細胞培地(10% FCS、2mM L−グルタミン、100IU/ml ペニシリンおよびストレプトマイシン、ならびに1% HEPESが添加されたRPMI−1640)中で培養した。IFN−γ分泌CD8+細胞を、製造業者のプロトコールを用いて検出した(eBioscience, San Diego, CA)[39]。簡単に言うと、培養物をNPペプチド(147−155)TYQRTRALVまたはNP抗原(5μg/ml)で12時間刺激した。インキュベーションの終了の2時間前に、モネンシンを2μMの終濃度に添加した。細胞を洗浄バッファー(PBS中3% FBS)で洗浄し、FcRII/IIIを介する非特異的な染色を阻止するために精製抗−マウスCD16/32でブロッキングした。細胞をフィコエリトリン−Cy5(PE−cy5)コンジュゲート抗−マウスCD8抗体で染色し、固定し、透過処理し、そしてフィコエリトリン(PE)とコンジュゲートした抗−マウスIFN−γ抗体(eBioscience, San Diego, CA)で染色した。全ての解析は、データ解析用CXPソフトウェアを用いてFACS500(BD Biosciences)上で行われた。
統計分析
グループ間の抗体力価の差異、細胞増殖およびグループ間のIFN−γ分泌細胞の数の量的差異が、分散分析(ANOVA)を用いて決定され、かつ統計的に異なる手法が、ボンフェローニテストを用いて、あるいはTukey法(Tukey’s method)によって、さらに分析された。生存率分析はログランク検定を用いて分析された(GraphPad Prism;GraphPad Software)。
グループ間の抗体力価の差異、細胞増殖およびグループ間のIFN−γ分泌細胞の数の量的差異が、分散分析(ANOVA)を用いて決定され、かつ統計的に異なる手法が、ボンフェローニテストを用いて、あるいはTukey法(Tukey’s method)によって、さらに分析された。生存率分析はログランク検定を用いて分析された(GraphPad Prism;GraphPad Software)。
実施例1:III型分泌装置(T3SS)解析。
C末端NPに融合したSopEを有するプラスミドは、T3SSを通って重要なタンパク質を分泌しなかった。pSC101 oriプラスミドは、中程度のコピー数のプラスミド(p15A ori)上に同じ融合体を示すプラスミドよりも良好にSopE−NP(147−158)を分泌した。pYA4762において開始コドンをATGからGTGへ変更することにより、分泌は減少した(図1)。経口または鼻腔内に送達されたこのようなRASV株において、T−細胞応答は検出されなかった(データは示さず)。これらの構築物の全ては、ウイルス負荷に対するマウスへの保護を誘導しなかった(データは示さず)。これらの結果は、T3SSが外来防御抗原をサイトゾルへ必ずしも運搬できるとは限らず、それゆえ、時々、T細胞依存性免疫応答を誘導する抗原を運搬する下位の手段である、ということを示す。細胞性免疫の誘導を増大する別の手段は、NP抗原の運搬のために機能しなかったT3SSによるよりはむしろ、細胞溶解によって、増大した量のNP抗原を運搬することであるだろう。
C末端NPに融合したSopEを有するプラスミドは、T3SSを通って重要なタンパク質を分泌しなかった。pSC101 oriプラスミドは、中程度のコピー数のプラスミド(p15A ori)上に同じ融合体を示すプラスミドよりも良好にSopE−NP(147−158)を分泌した。pYA4762において開始コドンをATGからGTGへ変更することにより、分泌は減少した(図1)。経口または鼻腔内に送達されたこのようなRASV株において、T−細胞応答は検出されなかった(データは示さず)。これらの構築物の全ては、ウイルス負荷に対するマウスへの保護を誘導しなかった(データは示さず)。これらの結果は、T3SSが外来防御抗原をサイトゾルへ必ずしも運搬できるとは限らず、それゆえ、時々、T細胞依存性免疫応答を誘導する抗原を運搬する下位の手段である、ということを示す。細胞性免疫の誘導を増大する別の手段は、NP抗原の運搬のために機能しなかったT3SSによるよりはむしろ、細胞溶解によって、増大した量のNP抗原を運搬することであるだろう。
実施例2:制御された溶解系。
T3SSが、NPタンパク質のC末端を分泌するその能力において制限されているように見えるので、制御された遅延溶解系がNPを運搬するための代替アプローチとして用いられた。遺伝子のC末端に3 x FLAGタグを有する完全なNP遺伝子がpYA3681内にクローニングされ、pYA4702を得て、強力な細胞性免疫応答を誘導できると考えられている株χ11001、非溶解株によって運搬した。pYA4702を運搬するRASV χ11001は、ペプチドで刺激された場合、リンパ球増殖を示した(図2)。しかしながら、これらの構築物はウイルス負荷に対するマウスへの保護を誘導しなかった(データは示さず)。これらの結果の1つの可能性のある理由は、細胞性免疫応答を誘発するのに十分な防御NP抗原が運搬されていないことだろう。NPの発現を改良するために、サルモネラにおける最大発現のためにコドンが最適化された。コドン最適化配列を有するpYA4858ベクターは、SDS−PAGEによって、次いでウサギポリクローナル抗−NP抗血清を用いるウェスタンブロットによって検出されるように、χ11017において、非コドン最適化NP配列を有するpYA4702ベクターよりも、より多くの量のタンパク質を合成した(図3)。
T3SSが、NPタンパク質のC末端を分泌するその能力において制限されているように見えるので、制御された遅延溶解系がNPを運搬するための代替アプローチとして用いられた。遺伝子のC末端に3 x FLAGタグを有する完全なNP遺伝子がpYA3681内にクローニングされ、pYA4702を得て、強力な細胞性免疫応答を誘導できると考えられている株χ11001、非溶解株によって運搬した。pYA4702を運搬するRASV χ11001は、ペプチドで刺激された場合、リンパ球増殖を示した(図2)。しかしながら、これらの構築物はウイルス負荷に対するマウスへの保護を誘導しなかった(データは示さず)。これらの結果の1つの可能性のある理由は、細胞性免疫応答を誘発するのに十分な防御NP抗原が運搬されていないことだろう。NPの発現を改良するために、サルモネラにおける最大発現のためにコドンが最適化された。コドン最適化配列を有するpYA4858ベクターは、SDS−PAGEによって、次いでウサギポリクローナル抗−NP抗血清を用いるウェスタンブロットによって検出されるように、χ11017において、非コドン最適化NP配列を有するpYA4702ベクターよりも、より多くの量のタンパク質を合成した(図3)。
実施例3:動物実験1の結果。
RASV χ11017(pYA4858)(SifA+)およびχ11246(pYA4858)(SifA−)、両方とも制御された遅延溶解in vivo表現型を示す株、で経口免疫されたマウスは、両方とも、BSGと比べて、インフルエンザNPに対して、およびサルモネラLPSに対して、有意に(P<0.001)より高い抗体力価を誘導した(図4A)。χ11017(pYA4858)(SifA+)またはχ11246(pYA4858)(SifA−)のいずれかでの免疫によりNPに対して誘発された抗体力価は類似しており、両方のRASV株が等しく免疫原性であったことを示した。χ11017(pYA4858)(SifA+)、χ11246(pYA4858)(SifA−)およびベクター対照によりLPSに対して誘発された抗体力価は類似しており、全てのベクターが宿主細胞に侵入し、かつ同様に良好にリンパ組織に定着したことを示した。インフルエンザNPに対する抗体応答は、IgG2a、RASVにより誘発された典型的なTh1型応答、の方へ傾いていた(図4B)。
RASV χ11017(pYA4858)(SifA+)およびχ11246(pYA4858)(SifA−)、両方とも制御された遅延溶解in vivo表現型を示す株、で経口免疫されたマウスは、両方とも、BSGと比べて、インフルエンザNPに対して、およびサルモネラLPSに対して、有意に(P<0.001)より高い抗体力価を誘導した(図4A)。χ11017(pYA4858)(SifA+)またはχ11246(pYA4858)(SifA−)のいずれかでの免疫によりNPに対して誘発された抗体力価は類似しており、両方のRASV株が等しく免疫原性であったことを示した。χ11017(pYA4858)(SifA+)、χ11246(pYA4858)(SifA−)およびベクター対照によりLPSに対して誘発された抗体力価は類似しており、全てのベクターが宿主細胞に侵入し、かつ同様に良好にリンパ組織に定着したことを示した。インフルエンザNPに対する抗体応答は、IgG2a、RASVにより誘発された典型的なTh1型応答、の方へ傾いていた(図4B)。
rWSNインフルエンザ株に感染したマウスは、負荷後第2日目から、時間と共に進行した、感染の兆候として、被毛の乱れ、猫背、振顫(trembling)および持続的な体重減少を示した。体重減少し続け、より具合が悪くなった、χ11246(pYA4858)(SifA−)で、およびベクター対照群で免疫されたマウスよりも、χ11246(pYA4858)(SifA−)で免疫されたマウスは、負荷の6日後までに兆候の緩和によって示されるように、より早く、インフルエンザ感染から回復した。これはまた、χ11017(pYA4858)(SifA+)で、またはベクター対照χ11017(pYA3681)(SifA+)、χ11246(pYA3681)(SifA−)またはBSGで免疫されたマウスと比べた、χ11246(pYA4858)(SifA−)で免疫されたマウスの体重回復データによっても明白である(図5)。株χ11246(pYA4858)(SifA−)で免疫されたマウスは生存したが、一方で、χ11017(pYA4858)(SifA+)ならびにベクター対照χ11017(pYA3681)およびχ11246(pYA3681)で、あるいはBSGで免疫されたマウスは、負荷の8日後、死に始めた。χ11246(pYA4858)で経口免疫された全てのマウスは、χ11017(pYA4858)で免疫されたグループにおける25%の生存動物、ならびにχ11017(pYA3681)およびχ11246(pYA3681)(ベクター対照)またはBSGで免疫されたグループにおける0%から20%の生存動物と比べて、100 LD50 rWSNウイルス負荷に対して保護された(100%)(図5)。これらの結果から、NPがχ11246(pYA4858)によって運搬される場合に可能になるような、サイトゾルにおける制御された遅延溶解によるNPの運搬は、ΔsifA26変異がサイトゾルにおいて溶解するためにエンドソームを脱出できることに起因するものであり、χ11246(pYA4858)の全ての属性を有さないRASV株での免疫の他の手段によっては達成されない、防御免疫応答を誘導することが明らかである。
実施例4:動物実験2の結果。
致死的ウイルス負荷からマウスを保護するのに必要とされる追加免疫の最適な数を決定するために、我々は、PPI1および4週目に与えられる、追加免疫の数を、従前の試験における3回から本試験において2回の免疫に減じた。マウスはPPI5週目にrWSNインフルエンザウイルス(100 LD50)で負荷された。RASV χ11246(pYA4858)(SifA−)で免疫されたマウスは、無関係なPly抗原をコードするχ11246(pYA4651)(SifA−)で、あるいはBSGで免疫されたマウスと比べて、インフルエンザNPに対して有意に高い(P<0.001)IgG抗体を誘発した(図6)。LPSに対する力価は、NPの過度の合成から生じる株の弱毒化におそらく起因して、ベクター対照群と比べて、χ11246(pYA4858)で免疫されたマウスにおいてより低かった。PPI5週で得られた抗体レベルは、従前の試験におけるPPI6週での2回の免疫後に得られたものと類似していた(図6)。
致死的ウイルス負荷からマウスを保護するのに必要とされる追加免疫の最適な数を決定するために、我々は、PPI1および4週目に与えられる、追加免疫の数を、従前の試験における3回から本試験において2回の免疫に減じた。マウスはPPI5週目にrWSNインフルエンザウイルス(100 LD50)で負荷された。RASV χ11246(pYA4858)(SifA−)で免疫されたマウスは、無関係なPly抗原をコードするχ11246(pYA4651)(SifA−)で、あるいはBSGで免疫されたマウスと比べて、インフルエンザNPに対して有意に高い(P<0.001)IgG抗体を誘発した(図6)。LPSに対する力価は、NPの過度の合成から生じる株の弱毒化におそらく起因して、ベクター対照群と比べて、χ11246(pYA4858)で免疫されたマウスにおいてより低かった。PPI5週で得られた抗体レベルは、従前の試験におけるPPI6週での2回の免疫後に得られたものと類似していた(図6)。
試験2における抗原特異的IFN−γ分泌T細胞の測定は、ELISPOTアッセイにおいて、精製NPタンパク質で、あるいはNP147−155ペプチドまたは陽性対照としてのConAのいずれかで、最後の免疫の4日後、PPI4週目に、各グループにおける免疫されたマウスから回収された脾臓細胞を刺激することにより行った。NPタンパク質またはNP147−155ペプチドのいずれかでの刺激後、インフルエンザ特異的IFN−γ分泌T細胞は無かった(図7)。
100 LD50のrWSNでの負荷に続いて、RASV χ11246(pYA4858)(NP+)(SifA−)で免疫されたマウスは、インフルエンザ感染から回復し、体重を取り戻し始めたが、一方、無関係な抗原(Ply)またはBSGのいずれかを受けているマウスは体重減少し続け、回復しなかった(図8)。χ11246(pYA4858)(NP+)(SifA−)で2回追加免疫されたマウスは、陰性対照として肺炎連鎖球菌(S.pneumoniae)Plyを運搬するχ11246(pYA4651)およびBSGで免疫されたグループにおけるマウスの22%生存と比べて、100 LD50のrWSNのインフルエンザウイルスに対して、有意に保護された(66%生存)(P>0.05)(図8)。これらの結果は、細胞サイトゾルへの抗原の運搬が、T−細胞エピトープを有する抗原が他の手段により、および他の経路により運搬される場合よりもより防御的である、免疫応答を誘発するということを、さらに裏付けた。
実施例5:動物実験3の結果。
異なる経路を介して投与された場合のSifA−ワクチン株の有効性を調査するために、マウスを、PO、INおよびIP経路を介して、RASV株χ11246(pYA4858)(NP+)(SifA−)およびχ11246(pYA4651)(SifA−)(Ply+)で3回(試験1におけるように)追加免疫した。全3経路(PO、INおよびIP)を介してRASV χ11246(pYA4858)(NP+)(SifA−)で免疫されたマウスは、無関係なPly抗原をコードするχ11246(pYA4651)(SifA−)で、あるいはBSGで経口免疫されたマウスと比べて、インフルエンザNPおよびサルモネラLPSに対して、有意に高い(P<0.001)IgG抗体を誘発した(図9)。これらの免疫付与からのNPに対する生じた抗体応答は、IP経路を介して投与されたχ11246(pYA4858)(NP+)(SifA−)が、IgG2a(Th1型)およびIgG1(Th−2型)が混ざった応答を誘導したことを除き、全ての場合において、Th1−型(IgG2a)のものであった(図9)。
異なる経路を介して投与された場合のSifA−ワクチン株の有効性を調査するために、マウスを、PO、INおよびIP経路を介して、RASV株χ11246(pYA4858)(NP+)(SifA−)およびχ11246(pYA4651)(SifA−)(Ply+)で3回(試験1におけるように)追加免疫した。全3経路(PO、INおよびIP)を介してRASV χ11246(pYA4858)(NP+)(SifA−)で免疫されたマウスは、無関係なPly抗原をコードするχ11246(pYA4651)(SifA−)で、あるいはBSGで経口免疫されたマウスと比べて、インフルエンザNPおよびサルモネラLPSに対して、有意に高い(P<0.001)IgG抗体を誘発した(図9)。これらの免疫付与からのNPに対する生じた抗体応答は、IP経路を介して投与されたχ11246(pYA4858)(NP+)(SifA−)が、IgG2a(Th1型)およびIgG1(Th−2型)が混ざった応答を誘導したことを除き、全ての場合において、Th1−型(IgG2a)のものであった(図9)。
有意に高い(P<0.0001)数のインフルエンザNP147−155ペプチド特異的IFN−γ分泌細胞が、経口的に(PO)または鼻腔内(IN)経路によって免疫されたマウスにおけるよりも、IP経路を介してχ11246(pYA4858)(NP+)(SifA−)を受けている、PPI8週目のマウスから回収された脾臓細胞において、検出された(図10)。
より高いパーセンテージのIFN−γ分泌CD8+ T細胞が、χ11246(pYA4651)またはBSGワクチン接種グループと比べて、PO、INおよびIP投与経路を介してχ11246(pYA4858)をワクチン接種されたマウスのグループにおいて、ICSを用いて検出された(図11)。
インフルエンザNP147−155ペプチド特異的細胞媒介性応答を評価するために、PPI8週に免疫されたマウスから回収された脾臓細胞をNP147−158ペプチドで刺激した。増殖の程度は、vision blue色素の蛍光の増大によって測定した。陰性対照マウスからのバックグラウンドの読み取りを、NP147−158刺激脾臓細胞からの読み取りから引いた。PO(P<0.05)またはIP(P<0.01)経路を介して免疫されたマウスから回収された脾臓細胞は、陰性対照で免疫されたマウスから回収された脾臓細胞と比べ、NP147−158ペプチドに反応して増殖した(図12)。
インフルエンザウイルスに感染したマウスは、感染の兆候として、被毛の乱れ、猫背、および振顫、ならびに体重減少を示し、かつ負荷の8日後、死に始めた。POおよびIN経路を介してχ11246(pYA4858)(NP+)(SifA−)で免疫されたマウスは、負荷の6日後までに感染から回復したが、一方で、IP経路により免疫されたものは、インフルエンザ感染の症状からの回復および体重増加によって示されるように、負荷の4日後までに、より早く回復した(図13)。PO、INおよびIP免疫経路を介してχ11246(pYA4858)(NP+)(SifA−)で免疫されたマウスは、χ11246(pYA4651)(SifA−)(Ply+)免疫グループにおける22%と比べて、インフルエンザウイルス負荷から、それぞれ、80%、100%および100%保護された(P<0.0002)(図13)。
考察
まとめると、得られた結果は、NPでのワクチン接種がウイルスに対する殺菌免疫を提供しないことを示した。したがって我々は、SifA−およびSifA+遅延制御溶解(delayed regulated lysis)ワクチン株間の保護における差異は、プログラムされたサルモネラ溶解によるSifA+株よりも良好な、サイトゾルへNP抗原を運搬するSifA−株の能力に起因する、と結論づけた。また、検出可能なIFN−γおよび防御抗体の非存在下では、保護は、サイトゾルにNP抗原を放出することにより引き起こされる強いCTL応答の誘導におそらく起因した。この新たに発見された、インフルエンザ感染を予防しそうにないが、インフルエンザへの持続性の細胞性免疫を誘導する手段は、かかるインフルエンザ感染に関連する罹患率および死亡率を著しく低減することが期待できる。さらに、エンドソームを脱出し、溶解を受けるために遺伝子操作されたサルモネラワクチンによる、免疫された個体における細胞のサイトゾルへの抗原の運搬は、3型感染針(infection needle)を通るそれらの運搬を減少あるいは起こらないようにしさえする、T細胞エピトープを有する抗原の構造的属性による抗原の運搬において多くの場合制限されるT3SSの使用と比べて、はるかに優れた手段である。
実施例1−5のための参考文献
まとめると、得られた結果は、NPでのワクチン接種がウイルスに対する殺菌免疫を提供しないことを示した。したがって我々は、SifA−およびSifA+遅延制御溶解(delayed regulated lysis)ワクチン株間の保護における差異は、プログラムされたサルモネラ溶解によるSifA+株よりも良好な、サイトゾルへNP抗原を運搬するSifA−株の能力に起因する、と結論づけた。また、検出可能なIFN−γおよび防御抗体の非存在下では、保護は、サイトゾルにNP抗原を放出することにより引き起こされる強いCTL応答の誘導におそらく起因した。この新たに発見された、インフルエンザ感染を予防しそうにないが、インフルエンザへの持続性の細胞性免疫を誘導する手段は、かかるインフルエンザ感染に関連する罹患率および死亡率を著しく低減することが期待できる。さらに、エンドソームを脱出し、溶解を受けるために遺伝子操作されたサルモネラワクチンによる、免疫された個体における細胞のサイトゾルへの抗原の運搬は、3型感染針(infection needle)を通るそれらの運搬を減少あるいは起こらないようにしさえする、T細胞エピトープを有する抗原の構造的属性による抗原の運搬において多くの場合制限されるT3SSの使用と比べて、はるかに優れた手段である。
実施例1−5のための参考文献
実施例6.抗原シフト/抗原ドリフトにかかわらず保護を提供するための、およびCTL応答を増大させ、終生免疫のためのメモリーT細胞を生成するための、亜型間(Heterosubtypic)保存を示す、インフルエンザウイルスのエレメントを含むために、抗原をエクスパンドする。
細菌株、プラスミド、およびプライマー
本研究で用いられた細菌株およびプラスミドが表4に示される。ネズミチフス菌(Serovar Typhimurium)株は非常に病原性のある株UK−1に由来する。
細菌株、プラスミド、およびプライマー
本研究で用いられた細菌株およびプラスミドが表4に示される。ネズミチフス菌(Serovar Typhimurium)株は非常に病原性のある株UK−1に由来する。
株構築および特徴付け。
in vivoで溶解が起こることを確保するために、我々はΔ(wza−wcaM)−8の欠失変異を含める。変異Δ(wza−wcaM)−8は、コラン酸合成遺伝子をコードするwzaからwcaMまでの20個の構造遺伝子を欠失し、それゆえコラン酸産生を阻止する。コラン酸合成ができないことは、サルモネラのバイオフィルムを形成する能力を低減させ、それゆえ生物学的封じ込めに貢献し、胆石への接着(adherence)の可能性を減少させ、それゆえ残存を減じる。Δ(wza−wcaM)−8変異を制御された遅延溶解株に導入して、株χ11509を得た(表4)。
in vivoで溶解が起こることを確保するために、我々はΔ(wza−wcaM)−8の欠失変異を含める。変異Δ(wza−wcaM)−8は、コラン酸合成遺伝子をコードするwzaからwcaMまでの20個の構造遺伝子を欠失し、それゆえコラン酸産生を阻止する。コラン酸合成ができないことは、サルモネラのバイオフィルムを形成する能力を低減させ、それゆえ生物学的封じ込めに貢献し、胆石への接着(adherence)の可能性を減少させ、それゆえ残存を減じる。Δ(wza−wcaM)−8変異を制御された遅延溶解株に導入して、株χ11509を得た(表4)。
細菌株の制御された溶解表現型は、一晩培養物を10−3および10−4へ希釈し、かつLBのみのプレートおよび0.2%アラビノース含有LBプレート上に100μlをプレーティングし、かつ37℃でインキュベートすることにより、確認された。溶解株はアラビノース含有LBプレート上でのみ生育し、生存のためアラビノースの存在に完全な依存性を表す。
NP遺伝子の最新のコドン最適化
インフルエンザウイルス株A/WSN/33のコドン最適化核タンパク質(NP)遺伝子の配列をpUC−57−NP−WSN(Genscript)から増幅し、NP遺伝子のN末端およびC末端の短い付加配列を取り除いた。これは、最新のコドン最適化NP遺伝子(uOpt−NP)(49)のカセットをもたらした。
インフルエンザウイルス株A/WSN/33のコドン最適化核タンパク質(NP)遺伝子の配列をpUC−57−NP−WSN(Genscript)から増幅し、NP遺伝子のN末端およびC末端の短い付加配列を取り除いた。これは、最新のコドン最適化NP遺伝子(uOpt−NP)(49)のカセットをもたらした。
HA T細胞エピトープタグのコドン最適化
NP−HA−タグ融合構築物のための、A型インフルエンザウイルスHA抗原の保存されたT細胞エピトープ由来のHA−エピトープタグの配列を決定するために、我々は、http://www.immuneepitope.org/(NIAIDによって支援されている)で、免疫エピトープデータベースに対して、A型インフルエンザの基準でHA T細胞エピトープ、ヘマグルチニン、およびT細胞応答を検索した。184個の陽性T細胞アッセイ間で、多数の重複したエピトープが発見された。我々は、全ての直鎖ペプチド配列のリストをエクスポートし、(保存によって)アラインメントされる配列の数を決定するために各固有の配列を用いてBLASTを実行した。
配列アラインメントは対象の株(Avian/swine/recent WHO推奨ワクチン株)と共に行われた(図15)。(>500データベース配列とアラインメントする)亜型間保存に関する2つのペプチド(HAaおよびHAb)が選択された(図16)。また、これら2つのペプチドは両方とも、ストーク(stalk)、膜貫通、および細胞質領域におけるエピトープがより保存されているので、HA分子のHA2部分に分類される。2つの提案されたエピトープ(HAaおよびHAb)のコドン最適化DNA配列がAAYリンカーによって連結された、なぜなら、それが所望の切断部位のC末端に直接配置された場合、線状エピトープ(linear epitope)のプロテアソームプロセシングに貢献すると知られているからである(50)。生じたHAエピトープタグは、Opt−HAa−AAY−Opt−HAbと名付けられた(図15)。
NP−HA−タグ融合構築物のための、A型インフルエンザウイルスHA抗原の保存されたT細胞エピトープ由来のHA−エピトープタグの配列を決定するために、我々は、http://www.immuneepitope.org/(NIAIDによって支援されている)で、免疫エピトープデータベースに対して、A型インフルエンザの基準でHA T細胞エピトープ、ヘマグルチニン、およびT細胞応答を検索した。184個の陽性T細胞アッセイ間で、多数の重複したエピトープが発見された。我々は、全ての直鎖ペプチド配列のリストをエクスポートし、(保存によって)アラインメントされる配列の数を決定するために各固有の配列を用いてBLASTを実行した。
配列アラインメントは対象の株(Avian/swine/recent WHO推奨ワクチン株)と共に行われた(図15)。(>500データベース配列とアラインメントする)亜型間保存に関する2つのペプチド(HAaおよびHAb)が選択された(図16)。また、これら2つのペプチドは両方とも、ストーク(stalk)、膜貫通、および細胞質領域におけるエピトープがより保存されているので、HA分子のHA2部分に分類される。2つの提案されたエピトープ(HAaおよびHAb)のコドン最適化DNA配列がAAYリンカーによって連結された、なぜなら、それが所望の切断部位のC末端に直接配置された場合、線状エピトープ(linear epitope)のプロテアソームプロセシングに貢献すると知られているからである(50)。生じたHAエピトープタグは、Opt−HAa−AAY−Opt−HAbと名付けられた(図15)。
ベクター構築
プラスミドpYA5121。最新のコドン最適化NP遺伝子(uOpt−NP)をNcoI部位で溶解ベクターpYA3681内に挿入し、プラスミドpYA5121を作成した(図14)。プラスミドpYA5121のDNA配列が表5に示される。
プラスミドpYA5121。最新のコドン最適化NP遺伝子(uOpt−NP)をNcoI部位で溶解ベクターpYA3681内に挿入し、プラスミドpYA5121を作成した(図14)。プラスミドpYA5121のDNA配列が表5に示される。
プラスミドpYA5122。HAエピトープタグOpt−HAa−AAY−Opt−HAbのコドン最適化DNA配列を、SphIおよびPciI部位を用いて溶解ベクターpYA3681に挿入し、プラスミドpYA5122を作成した(図17)。プラスミドpYA5122のDNA配列が表6に示される。
プラスミドpYA5126。C末端にインフレームで融合したHA T細胞エピトープタグ(Opt−HAa−AAY−Opt−HAb)を有する最新のコドン最適化NP遺伝子を、NcoIおよびPciI部位を用いて溶解ベクターpYA3681に挿入し、プラスミドpYA5126を作成した(図18)。プラスミドpYA5126のDNA配列が表7に示される。
プラスミド安定性
プラスミドpYA 3681、pYA5121、pYA5122、およびpYA5126を、それぞれRASV株χ11246およびχ11509に形質転換した。プラスミド安定性を決定した。RASV株を50μg/mlのDAPおよび0.2%アラビノースが添加された3ml培養液において一晩生育させた。翌日、DAPおよびアラビノースが添加された新鮮なLBに各一晩培養物の1:1000希釈液を接種し、静的に、37℃で一晩(約14時間)生育させた。Asd+プラスミドを保持している細菌細胞の割合を推定するために、培養物を連続希釈し、10−5および10−6をDAPおよびアラビノースが添加されたLBプレート上にプレーティングし、37℃で一晩生育させた。翌日、これらのプレートから100コロニーを選び取り、アラビノースが添加されたLBおよびDAPおよびアラビノースが添加されたLB上にパッチした。プラスミドを保持しているクローンのパーセンテージを、コロニーを数えることにより決定した。同時に、毎日のプレーティングからのコロニーが、DAPおよびアラビノースが添加された新鮮なLBで生育され、この工程は5日連続して(50世代)繰り返された。
プラスミドpYA 3681、pYA5121、pYA5122、およびpYA5126を、それぞれRASV株χ11246およびχ11509に形質転換した。プラスミド安定性を決定した。RASV株を50μg/mlのDAPおよび0.2%アラビノースが添加された3ml培養液において一晩生育させた。翌日、DAPおよびアラビノースが添加された新鮮なLBに各一晩培養物の1:1000希釈液を接種し、静的に、37℃で一晩(約14時間)生育させた。Asd+プラスミドを保持している細菌細胞の割合を推定するために、培養物を連続希釈し、10−5および10−6をDAPおよびアラビノースが添加されたLBプレート上にプレーティングし、37℃で一晩生育させた。翌日、これらのプレートから100コロニーを選び取り、アラビノースが添加されたLBおよびDAPおよびアラビノースが添加されたLB上にパッチした。プラスミドを保持しているクローンのパーセンテージを、コロニーを数えることにより決定した。同時に、毎日のプレーティングからのコロニーが、DAPおよびアラビノースが添加された新鮮なLBで生育され、この工程は5日連続して(50世代)繰り返された。
SDS−PAGEおよびイムノブロット
サルモネラ株χ11246およびχ11509におけるプラスミドpYA5121およびpYA5126からのNPタンパク質およびNP−HA−タグ融合タンパク質の合成を評価するために、細菌細胞を0.2%アラビノース含有LBにおいて、37℃で一晩生育させた。培養物を0.2%アラビノース含有新鮮LBに1:100で希釈し、分光光度計により600nmで0.6の吸光度(O.D)が達成されるまで、37℃で回転させて生育させた。NPタンパク質およびNP−HA−タグ融合タンパク質の合成は、細菌培養物に0.3mM IPTGを添加することにより誘導した。一定分量(1ml)のサンプルを採取し、低速度で遠心分離して細菌を沈殿させ、2x SDS−PAGEローディングバッファーに再懸濁し、そして水浴で10分間煮沸した。サンプルを10分間遠心分離し、2x サンプルローディングバッファーに1:10で希釈し、そして、10μlを12.5% SDS−PAGEゲルにロードして、電気泳動により分離した。サンプルをニトロセルロース膜にトランスファーし、室温で1時間、5%スキムミルクでブロッキングした。膜をPBS−0.05% Tween(T20)で3回すすぎ、一定に振盪させながら、1時間、マウスモノクローナル抗−A型インフルエンザ NP抗体(Abcam)とインキュベートした。前の通りにPBS−T20で洗浄後、1時間、アルカリホスファターゼコンジュゲート抗−マウスとインキュベートし、ニトロブルーテトラゾリウム−5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェート(tetrazolium−5−bromo−4−chloro−3−indolyphosphate)(BCIP)(Sigma, St. Louis, MO)と反応させた。膜を水で洗浄し、風乾した。サルモネラ株χ11246およびχ11509におけるプラスミドpYA5121およびpYA5126からのNPタンパク質およびNP−HA−タグ融合タンパク質のLacI制御された合成が、図19および図20にそれぞれ示された。
サルモネラ株χ11246およびχ11509におけるプラスミドpYA5121およびpYA5126からのNPタンパク質およびNP−HA−タグ融合タンパク質の合成を評価するために、細菌細胞を0.2%アラビノース含有LBにおいて、37℃で一晩生育させた。培養物を0.2%アラビノース含有新鮮LBに1:100で希釈し、分光光度計により600nmで0.6の吸光度(O.D)が達成されるまで、37℃で回転させて生育させた。NPタンパク質およびNP−HA−タグ融合タンパク質の合成は、細菌培養物に0.3mM IPTGを添加することにより誘導した。一定分量(1ml)のサンプルを採取し、低速度で遠心分離して細菌を沈殿させ、2x SDS−PAGEローディングバッファーに再懸濁し、そして水浴で10分間煮沸した。サンプルを10分間遠心分離し、2x サンプルローディングバッファーに1:10で希釈し、そして、10μlを12.5% SDS−PAGEゲルにロードして、電気泳動により分離した。サンプルをニトロセルロース膜にトランスファーし、室温で1時間、5%スキムミルクでブロッキングした。膜をPBS−0.05% Tween(T20)で3回すすぎ、一定に振盪させながら、1時間、マウスモノクローナル抗−A型インフルエンザ NP抗体(Abcam)とインキュベートした。前の通りにPBS−T20で洗浄後、1時間、アルカリホスファターゼコンジュゲート抗−マウスとインキュベートし、ニトロブルーテトラゾリウム−5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェート(tetrazolium−5−bromo−4−chloro−3−indolyphosphate)(BCIP)(Sigma, St. Louis, MO)と反応させた。膜を水で洗浄し、風乾した。サルモネラ株χ11246およびχ11509におけるプラスミドpYA5121およびpYA5126からのNPタンパク質およびNP−HA−タグ融合タンパク質のLacI制御された合成が、図19および図20にそれぞれ示された。
NPおよびNP HA−タグ構築物を改良する。
サルモネラSopE2、侵入−および病原性−関連III型分泌タンパク質(51)、は、効率の良いMHCクラスI提示のために、プロテオソームへの抗原移動を促進するために非常に速やかにユビキチン化されるとわかった(52)。NPおよびNP−HAタグタンパク質のMHCクラスI提示を増強するために、SopE2 N末端1−80アミノ酸を、NPおよびNP−HAタグタンパク質のN末端に融合させてもよい。
サルモネラSopE2、侵入−および病原性−関連III型分泌タンパク質(51)、は、効率の良いMHCクラスI提示のために、プロテオソームへの抗原移動を促進するために非常に速やかにユビキチン化されるとわかった(52)。NPおよびNP−HAタグタンパク質のMHCクラスI提示を増強するために、SopE2 N末端1−80アミノ酸を、NPおよびNP−HAタグタンパク質のN末端に融合させてもよい。
プラスミドpYA SopE21−80+uOpt−NPの設計および構築。
N末端にインフレームで融合したSopE2 N末端1−80アミノ酸を有する最新のコドン最適化NP遺伝子のカセットを、ネズミチフス菌における発現を最大にするために、および効率の良いMHCクラスI提示のために、溶解ベクターpYA3681へ挿入してもよい(図21)。
N末端にインフレームで融合したSopE2 N末端1−80アミノ酸を有する最新のコドン最適化NP遺伝子のカセットを、ネズミチフス菌における発現を最大にするために、および効率の良いMHCクラスI提示のために、溶解ベクターpYA3681へ挿入してもよい(図21)。
プラスミドpYA SopE21−80+uOpt−NP+Opt−HAa−AAY−Opt−HAbの設計および構築。
N末端にインフレームで融合したSopE2 N末端1−80アミノ酸およびC末端にインフレームで融合したOpt−HAa−AAY−Opt−HAbを有する最新のコドン最適化NP遺伝子のカセットが、ネズミチフス菌における最大発現、および効率の良いMHCクラスI提示のために、溶解ベクターpYA3681に挿入されている(図22)。
N末端にインフレームで融合したSopE2 N末端1−80アミノ酸およびC末端にインフレームで融合したOpt−HAa−AAY−Opt−HAbを有する最新のコドン最適化NP遺伝子のカセットが、ネズミチフス菌における最大発現、および効率の良いMHCクラスI提示のために、溶解ベクターpYA3681に挿入されている(図22)。
TRAPアッセイ法に基づく抗原特異的T細胞アッセイのためのプロトコールの開発。
インフルエンザ抗原への免疫応答からサルモネラへの免疫応答を「分離」するために、我々は、TRAPアッセイ(タンパク質捕捉によるAPCのT細胞認識(T cell recognition of APCs by protein capture)またはトロゴサイトーシス解析プロトコール(trogocytosis analysis protocol))アッセイに基づいた新たな方法を調査している(53,54)。TRAPアッセイは、トロゴサイトーシス(trogocytosis)と呼ばれる、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞およびBリンパ球によって実行される過程に基づく。トロゴサイトーシスは、前述されているように、リンパ球がそれらの同種抗原(cognate antigen)を発現する抗原提示細胞(APC)由来の原形質膜の断片を捕捉する過程である。この方法のため、(蛍光脂質またはビオチンなどの)標識が、APCの膜に最初に組み込まれる。これらの標識された細胞は次いで、免疫されたマウスから単離されたリンパ球を含有する細胞の集団と数時間、共培養される。この刺激の期間の後、トロゴサイトーシスを行ったリンパ球が、フローサイトメトリーを用いて、APC膜上に最初に存在する標識のそれらの獲得によって同定される。
インフルエンザ抗原への免疫応答からサルモネラへの免疫応答を「分離」するために、我々は、TRAPアッセイ(タンパク質捕捉によるAPCのT細胞認識(T cell recognition of APCs by protein capture)またはトロゴサイトーシス解析プロトコール(trogocytosis analysis protocol))アッセイに基づいた新たな方法を調査している(53,54)。TRAPアッセイは、トロゴサイトーシス(trogocytosis)と呼ばれる、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞およびBリンパ球によって実行される過程に基づく。トロゴサイトーシスは、前述されているように、リンパ球がそれらの同種抗原(cognate antigen)を発現する抗原提示細胞(APC)由来の原形質膜の断片を捕捉する過程である。この方法のため、(蛍光脂質またはビオチンなどの)標識が、APCの膜に最初に組み込まれる。これらの標識された細胞は次いで、免疫されたマウスから単離されたリンパ球を含有する細胞の集団と数時間、共培養される。この刺激の期間の後、トロゴサイトーシスを行ったリンパ球が、フローサイトメトリーを用いて、APC膜上に最初に存在する標識のそれらの獲得によって同定される。
免疫実験
ワクチン株χ11246(pYA5121)、χ11246(pYA5122)、χ11246(pYA5126)、χ11246(pYA3681)、χ11509(pYA5121)、χ11509(pYA5122)、χ11509(pYA5126)、χ11509(pYA3681)、χ11246(pYA SopE21−80+uOpt−NP)、χ11246(pYA SopE21−80+uOpt−NP+Opt−HAa−AAY−Opt−HAb)、χ11509(pYA SopE21−80+uOpt−NP)、およびχ11509(pYA SopE21−80+uOpt−NP+Opt−HAa−AAY−Opt−HAb)が、実施例1から5のための材料および方法において記載されたように生育され、雌BALB/cマウスを経口免疫するために用いられ得る。インフルエンザウイルスでの負荷への免疫保護は、エンドソームへ脱出できない組換えワクチン株と比べて、エンドソームへ脱出できる制御された遅延細胞溶解を示す株において、優れているだろう。実施例1から5における教示に基づくと、エンドソームからのワクチン脱出による、続いてサイトゾルにおける溶解による、サイトゾルへの、NPに加えてHAエピトープ(epttope)の運搬は、インフルエンザ負荷に対する防御免疫の誘導をさらに増大し得る。SopE2断片の融合体が、CD8 T細胞応答および防御免疫のレベルをさらに拡大するため、クラスI提示のためのプロテオソームへの輸送(trafficing)を促進するために、速やかにユビキネート化(ubiquinated)されるべきであることもまた、予測される。全体として、細菌、ウイルスおよび寄生虫病原体に対する防御T細胞免疫応答を誘導することへのこれらのアプローチは、宿主細胞サイトゾルへのT3SSによるように、分泌を低減あるいは起こらないようにしさえする、抗原構造的拘束(structural constrait)によって多くの場合制限される、抗原運搬の他の方法よりも優れている。
実施例6のための参考文献
ワクチン株χ11246(pYA5121)、χ11246(pYA5122)、χ11246(pYA5126)、χ11246(pYA3681)、χ11509(pYA5121)、χ11509(pYA5122)、χ11509(pYA5126)、χ11509(pYA3681)、χ11246(pYA SopE21−80+uOpt−NP)、χ11246(pYA SopE21−80+uOpt−NP+Opt−HAa−AAY−Opt−HAb)、χ11509(pYA SopE21−80+uOpt−NP)、およびχ11509(pYA SopE21−80+uOpt−NP+Opt−HAa−AAY−Opt−HAb)が、実施例1から5のための材料および方法において記載されたように生育され、雌BALB/cマウスを経口免疫するために用いられ得る。インフルエンザウイルスでの負荷への免疫保護は、エンドソームへ脱出できない組換えワクチン株と比べて、エンドソームへ脱出できる制御された遅延細胞溶解を示す株において、優れているだろう。実施例1から5における教示に基づくと、エンドソームからのワクチン脱出による、続いてサイトゾルにおける溶解による、サイトゾルへの、NPに加えてHAエピトープ(epttope)の運搬は、インフルエンザ負荷に対する防御免疫の誘導をさらに増大し得る。SopE2断片の融合体が、CD8 T細胞応答および防御免疫のレベルをさらに拡大するため、クラスI提示のためのプロテオソームへの輸送(trafficing)を促進するために、速やかにユビキネート化(ubiquinated)されるべきであることもまた、予測される。全体として、細菌、ウイルスおよび寄生虫病原体に対する防御T細胞免疫応答を誘導することへのこれらのアプローチは、宿主細胞サイトゾルへのT3SSによるように、分泌を低減あるいは起こらないようにしさえする、抗原構造的拘束(structural constrait)によって多くの場合制限される、抗原運搬の他の方法よりも優れている。
実施例7の序論
結核(TB)は昔および現在の疾患である。およそ800万人が、世界の至る所で毎年TBと診断される。感染する全ての人が活動性疾患を発症するとは限らないが、そうする人のうち、ほぼ200万人が毎年死ぬ。活動性疾患を治療するための有効な抗生物質が存在するが、治療計画は長く(少なくとも6ヶ月)、治療における著しいノンコンプライアンスにつながる。毎年、多数(多剤耐性またはMDR)または本質的に全て(極度薬剤耐性またはXDR)の利用可能な抗生物質に耐性である結核菌(TBの原因病原体)の株によって引き起こされるTB症例の数が増加している、それにより、疾患を治す医者の能力が重度に損なわれている。利用可能なワクチン、ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)の弱毒株、乳児および幼児においてTBの合併症(髄膜炎、粟粒結核症)を著しく低減する、ウシ型結核菌BCG(カルメット−ゲラン桿菌(Bacille Calmette Guerin))、が存在する。しかしながら、BCGワクチンは、青年、若年成人および初老の大人のような、感染の影響を受けやすい免疫された人に、持続性の保護を与えない。
結核(TB)は昔および現在の疾患である。およそ800万人が、世界の至る所で毎年TBと診断される。感染する全ての人が活動性疾患を発症するとは限らないが、そうする人のうち、ほぼ200万人が毎年死ぬ。活動性疾患を治療するための有効な抗生物質が存在するが、治療計画は長く(少なくとも6ヶ月)、治療における著しいノンコンプライアンスにつながる。毎年、多数(多剤耐性またはMDR)または本質的に全て(極度薬剤耐性またはXDR)の利用可能な抗生物質に耐性である結核菌(TBの原因病原体)の株によって引き起こされるTB症例の数が増加している、それにより、疾患を治す医者の能力が重度に損なわれている。利用可能なワクチン、ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)の弱毒株、乳児および幼児においてTBの合併症(髄膜炎、粟粒結核症)を著しく低減する、ウシ型結核菌BCG(カルメット−ゲラン桿菌(Bacille Calmette Guerin))、が存在する。しかしながら、BCGワクチンは、青年、若年成人および初老の大人のような、感染の影響を受けやすい免疫された人に、持続性の保護を与えない。
TBへの耐性は、感染の制御および阻止の両方を行う細胞性免疫応答の発達の結果である(55,65)。CD4+ T細胞は、最初はエフェクター細胞の役割であるが、メモリーT細胞もまた生じる、防御免疫応答の主なレギュレーターである(65)。CD8+ T細胞もまた、強力なサイトカイン、インターフェロンγのそれらの産生およびそれらの細胞傷害性機能を通して、強い防御応答の発達に重要である(55,65)。CD8+ T細胞はまた、感染の長期制御にとって重要であるメモリー細胞を生じる(65)。防御免疫に対する両種類のT細胞の貢献は、各種類のT細胞サブセットの受身移入(passive transfer)によって(64,64)、およびCD4+またはCD8+ T細胞のいずれかが欠損しているマウスを用いる研究によって(56,57)、動物実験で最初に示された。CD4+またはCD8+ T細胞のいずれかを欠くマウスは、結核菌の感染の影響を非常に受けやすく、感染を制御することができなかった。ヒトと動物研究の相関性は、ヒト免疫不全ウィルス(HIV)に感染した個体、それらの疾患が進行するにつれCD4+ T細胞の数が減少し、かつ結果として結核菌の感染の影響をますます受けやすくなる、において観察できる(60)。同様に、CD8+ T細胞生産に関して遺伝的に欠損している個体もまた、無傷の(intact)サイトカイン媒介性マクロファージ活性経路を有する個体より、TBの影響をより受けやすい(66)。それゆえ、持続性の保護を与える、結核菌に対する有効なワクチンの開発は、エフェクターCD4+ T細胞、メモリーCD4+ T細胞、エフェクターCD8+ T細胞およびメモリーCD8+ T細胞を生成する、強いCMI応答を誘発しなければならない。
実施例7のための材料および方法
細菌株およびプラスミド
これらの研究で用いられた細菌株およびプラスミドが表8に示される。ネズミチフス菌(Serovar Typhimurium)株は非常に病原性のある株UK−1に由来する。バクテリオファージP22HTintが普遍形質導入のために用いられた。大腸菌およびネズミチフス菌の培養物を、LBブロス内またはLBアガープレート上で、37℃で生育した。Asd−株の生育のため、50μg/mlの濃度でジアミノピメリン酸(DAP)が添加され[19]、かつ制御された遅延溶解ベクターの場合において、LBには0.2%アラビノースが添加された。
細菌株およびプラスミド
これらの研究で用いられた細菌株およびプラスミドが表8に示される。ネズミチフス菌(Serovar Typhimurium)株は非常に病原性のある株UK−1に由来する。バクテリオファージP22HTintが普遍形質導入のために用いられた。大腸菌およびネズミチフス菌の培養物を、LBブロス内またはLBアガープレート上で、37℃で生育した。Asd−株の生育のため、50μg/mlの濃度でジアミノピメリン酸(DAP)が添加され[19]、かつ制御された遅延溶解ベクターの場合において、LBには0.2%アラビノースが添加された。
株構築および特徴付け。
ΔtlpA181は、χ3761(ネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium)UK−1)における、tlpA遺伝子の定義済みのインフレーム欠失である。それをP22形質導入によってχ11017へ導入し、株χ11226を得た。
ΔtlpA181は、χ3761(ネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium)UK−1)における、tlpA遺伝子の定義済みのインフレーム欠失である。それをP22形質導入によってχ11017へ導入し、株χ11226を得た。
ΔsseL116は、χ3761(ネズミチフス菌UK−1)における、sseLの定義済みのインフレーム欠失である。それを、ΔsseL116を形質導入するためにP22溶解物を用いて、形質導入によってχ11226へ導入し、株χ11228を得た。
ΔPhilA::Ptrc ΔlacO888 hilAは、hilAの制御された発現をもたらすための、hilA遺伝子のプロモーターの欠失およびPtrc ΔlacO888との交換である。それをP22形質導入によってχ11228へ導入し、χ11234を得た。
一般的なDNA手順およびプラスミド安定性。
これらの手順は上述の通りである。
これらの手順は上述の通りである。
結核菌抗原
本研究で用いられた結核菌抗原およびそれらをコードする遺伝子は、esxAによってコードされる、ESAT−6;esxBによってコードされる、CFP−10;fbpAによってコードされる、抗原85A(Ag85A)およびppe−18によってコードされる、Mtb39Aである。これらの抗原の全ては、T細胞エピトープを含有すると知られており(57,58,62,67,68)、かつマウスおよびモルモットにおいて、エアロゾル化した結核菌での負荷に対する保護を誘発すると示された(57,58,62,67)。これらの抗原は、ヒトの感染症に対する保護への候補ワクチンに組み込まれている。
本研究で用いられた結核菌抗原およびそれらをコードする遺伝子は、esxAによってコードされる、ESAT−6;esxBによってコードされる、CFP−10;fbpAによってコードされる、抗原85A(Ag85A)およびppe−18によってコードされる、Mtb39Aである。これらの抗原の全ては、T細胞エピトープを含有すると知られており(57,58,62,67,68)、かつマウスおよびモルモットにおいて、エアロゾル化した結核菌での負荷に対する保護を誘発すると示された(57,58,62,67)。これらの抗原は、ヒトの感染症に対する保護への候補ワクチンに組み込まれている。
fbpA遺伝子のコドン最適化。
Ag85Aタンパク質をコードするfbpA遺伝子(Rv3804c)のヌクレオチド配列を含有するDNA断片を、結核菌H37Rv染色体DNAからPCR増幅した。1111bpのPCR産物をXbaIおよびEcoRIで消化し、XbaI−EcoRI消化したpBK−CMV(Stratagene)内にクローニングして、pYA3817を生成した。サルモネラにおけるfbpAの発現を最適化するために、pYA3817を鋳型として用いて、適切なプライマーとQuick−Change site−directed mutagenesisキット(Stratagene)を用いて、サルモネラにおいて最も頻繁に見られるコドンで、fbpAの24個のコドンを置換した。fbpAコドン62(TCCからTCTへ)、63(CGGからCGTへ)、66(TTGからCTGへ)、88(AGTからAGCへ)、94(CCCからCCGへ)、136(TCAからTCTへ)、145(CCCからCCGへ)、173(AGGからCGTへ)、177(CCCからCCGへ)、179(GGAからGGTへ)、200(CCCからCCGへ)、207(GGAからGGTへ)、213(TTGからCTGへ)、215(CCCからCCGへ)、221(CCCからCCGへ)、255(TTGからCTGへ)、258(GGGからGGTへ)、294(CGGからCGTへ)、336(CCCからCCGへ)、240(CGGからCGTへ)、346(CCCからCCGへ)、349(GGGからGGTへ)、250(CCCからCCGへ)および252(CCCからCCGへ)が置換された。fbpAの最適化された配列の全てを含有する、生じた組換えプラスミドは、pYA3932と名付けた(61)。
Ag85Aタンパク質をコードするfbpA遺伝子(Rv3804c)のヌクレオチド配列を含有するDNA断片を、結核菌H37Rv染色体DNAからPCR増幅した。1111bpのPCR産物をXbaIおよびEcoRIで消化し、XbaI−EcoRI消化したpBK−CMV(Stratagene)内にクローニングして、pYA3817を生成した。サルモネラにおけるfbpAの発現を最適化するために、pYA3817を鋳型として用いて、適切なプライマーとQuick−Change site−directed mutagenesisキット(Stratagene)を用いて、サルモネラにおいて最も頻繁に見られるコドンで、fbpAの24個のコドンを置換した。fbpAコドン62(TCCからTCTへ)、63(CGGからCGTへ)、66(TTGからCTGへ)、88(AGTからAGCへ)、94(CCCからCCGへ)、136(TCAからTCTへ)、145(CCCからCCGへ)、173(AGGからCGTへ)、177(CCCからCCGへ)、179(GGAからGGTへ)、200(CCCからCCGへ)、207(GGAからGGTへ)、213(TTGからCTGへ)、215(CCCからCCGへ)、221(CCCからCCGへ)、255(TTGからCTGへ)、258(GGGからGGTへ)、294(CGGからCGTへ)、336(CCCからCCGへ)、240(CGGからCGTへ)、346(CCCからCCGへ)、349(GGGからGGTへ)、250(CCCからCCGへ)および252(CCCからCCGへ)が置換された。fbpAの最適化された配列の全てを含有する、生じた組換えプラスミドは、pYA3932と名付けた(61)。
制御された溶解ベクター。
pYA4890、pYA4891およびpYA4893の構築は、Juarez−Rodriguezらによって記載された(61)。プラスミドpYA4683は、pYA4589(p15A oriがpYA3681のpBR oriの代わりとなった、pYA3681の誘導体)をNcoIおよびPstIで消化することにより構築された。sopE2Nt−ppe18カセットを、プライマーSopE2−F2およびMtb39A−R3でPCR増幅し、NcoIおよびPstIで消化し、pYA4589にライゲーションして、pYA4683を生成した。sopE2Nt−ppe18カセットをまた、NcoI+PstI−消化されたpYA3681にライゲーションして、pYA4851を生成した。ppe遺伝子単独をMtb39A−F3およびMtb39A−R3でPCR増幅し、NcoIおよびPstIで消化し、同じ酵素で消化されたpYA3681にライゲーションして、pYA4856を形成した。プラスミドpYA3816を、プライマーMtb39A−F2およびMtb39A−R2でppe−18遺伝子を増幅し、PCR産物をEcoRVで消化することにより、構築した。消化した断片を、消化され平滑化された(blunt−ended)pYA3650にライゲーションした、このライゲーションはpYA3816の構築をもたらした。
pYA4890、pYA4891およびpYA4893の構築は、Juarez−Rodriguezらによって記載された(61)。プラスミドpYA4683は、pYA4589(p15A oriがpYA3681のpBR oriの代わりとなった、pYA3681の誘導体)をNcoIおよびPstIで消化することにより構築された。sopE2Nt−ppe18カセットを、プライマーSopE2−F2およびMtb39A−R3でPCR増幅し、NcoIおよびPstIで消化し、pYA4589にライゲーションして、pYA4683を生成した。sopE2Nt−ppe18カセットをまた、NcoI+PstI−消化されたpYA3681にライゲーションして、pYA4851を生成した。ppe遺伝子単独をMtb39A−F3およびMtb39A−R3でPCR増幅し、NcoIおよびPstIで消化し、同じ酵素で消化されたpYA3681にライゲーションして、pYA4856を形成した。プラスミドpYA3816を、プライマーMtb39A−F2およびMtb39A−R2でppe−18遺伝子を増幅し、PCR産物をEcoRVで消化することにより、構築した。消化した断片を、消化され平滑化された(blunt−ended)pYA3650にライゲーションした、このライゲーションはpYA3816の構築をもたらした。
動物実験1。
マウスのグループが、RASV χ11021(pYA4890)、χ11021(pYA4891)、χ11021(pYA4893)、χ11021(pYA3681)およびBSGで、0、7および49日目に経口免疫された。マウスの別のグループが、1回の5x104 cfuのウシ型結核菌BCGの皮下注射により、0日目に免疫された。最初の免疫の2日前、および最初のワクチン接種の77日後に、顎下静脈穿刺により、血液サンプルを得た。ELISAによりこれらのサンプルから抗体力価を決定した。最後の免疫の4週後(77日)、全てのマウスを、吸入曝露システム(Glas−Col, LLC, Terre Haute, IN)でのエアロゾルによって運搬された、肺当たり100 cfuの推定吸入用量の結核菌H37Rvで感染させた。負荷の6週後にマウスを安楽死させ、肺および脾臓を無菌的に回収した。細菌負荷(bacterial load)を、全臓器ホモジネートの連続希釈をプレーティングすることにより決定した。保護は、BSG投薬対照群における細菌負荷より、統計的に有意に低かった細菌負荷として定義された。最後の免疫の3週後、各グループからの3匹のマウスから得た脾臓細胞でELISPOTアッセイを実施し、インターフェロン−γ−、TNF−α−、インターロイキン−2(IL−2)−およびIL−4−分泌細胞の産生を測定した。
マウスのグループが、RASV χ11021(pYA4890)、χ11021(pYA4891)、χ11021(pYA4893)、χ11021(pYA3681)およびBSGで、0、7および49日目に経口免疫された。マウスの別のグループが、1回の5x104 cfuのウシ型結核菌BCGの皮下注射により、0日目に免疫された。最初の免疫の2日前、および最初のワクチン接種の77日後に、顎下静脈穿刺により、血液サンプルを得た。ELISAによりこれらのサンプルから抗体力価を決定した。最後の免疫の4週後(77日)、全てのマウスを、吸入曝露システム(Glas−Col, LLC, Terre Haute, IN)でのエアロゾルによって運搬された、肺当たり100 cfuの推定吸入用量の結核菌H37Rvで感染させた。負荷の6週後にマウスを安楽死させ、肺および脾臓を無菌的に回収した。細菌負荷(bacterial load)を、全臓器ホモジネートの連続希釈をプレーティングすることにより決定した。保護は、BSG投薬対照群における細菌負荷より、統計的に有意に低かった細菌負荷として定義された。最後の免疫の3週後、各グループからの3匹のマウスから得た脾臓細胞でELISPOTアッセイを実施し、インターフェロン−γ−、TNF−α−、インターロイキン−2(IL−2)−およびIL−4−分泌細胞の産生を測定した。
動物実験2。
マウスのグループが、RASV χ11021(pYA4956)、χ11246(pYA4683)、χ11246(pYA4851)、χ11246(pYA4856)、χ11324(pYA4856)、χ11327(pYA4856)、χ11412(pYA3816)およびχ11246(pYA4891)+χ11412(pYA3816)の混合物で、0、7および49日目に経口免疫される。マウスの別のグループが、BCGで同じ日に免疫される。マウスの別のグループが、5x104 cfuのウシ型結核菌(M.bovis)BCGで皮下に1回、0日目に免疫される。最初の免疫の2日前、および最初の免疫の21および77日後に、顎下静脈穿刺により、血液サンプルを得る。ELISAにより抗体力価を決定する。
マウスのグループが、RASV χ11021(pYA4956)、χ11246(pYA4683)、χ11246(pYA4851)、χ11246(pYA4856)、χ11324(pYA4856)、χ11327(pYA4856)、χ11412(pYA3816)およびχ11246(pYA4891)+χ11412(pYA3816)の混合物で、0、7および49日目に経口免疫される。マウスの別のグループが、BCGで同じ日に免疫される。マウスの別のグループが、5x104 cfuのウシ型結核菌(M.bovis)BCGで皮下に1回、0日目に免疫される。最初の免疫の2日前、および最初の免疫の21および77日後に、顎下静脈穿刺により、血液サンプルを得る。ELISAにより抗体力価を決定する。
最後の免疫の4週後(77日)、全てのグループのマウスを、上述のように、エアロゾル用量の結核菌H37Rvで負荷する。肺および脾臓を、最後の免疫の7日後、結核菌での負荷の21日後、および負荷後6週で、各グループからの6匹のマウスから切除する。負荷後6週で、全てのグループの全てのマウスを安楽死させる;肺および脾臓を無菌的に切除し、組織がホモジナイズする。各臓器のホモジネートの一部分を連続希釈し、プレーティングして、肺および脾臓における細菌負荷を決定する。肺ホモジネートの残りを、フローサイトメトリーにより、IFN−γ、TNF−α、IL−10、IL−17、エフェクターCD4+ T細胞、メモリーCD4+ T細胞、エフェクターCD8+ T細胞およびメモリーCD8+ T細胞の産生についてアッセイする。
ELISA
ELISAアッセイを以前に記載されたように実施した(61)。Ag85A、ESAT−6、CFP−10およびサルモネラ外膜タンパク質(SOMP)に対する総IgG、IgG1およびIgG2b抗体力価が決定された。Nunc Immunoplate Maxisorb F96プレート(Nalge Nunc. Rochester, NY, USA)を、0.05M 炭酸−重炭酸塩緩衝液、pH9.6中に懸濁させた、精製された0.5μg/ウェルのAg85A、1μg/ウェルのESAT−6もしくはCFP−10または0.5μg/ウェルのSOMPでコートした。同じ実験グループから得られた血清をプールし、PBS中に1:200の初期希釈から2倍希釈により、連続希釈した。ELISAアッセイを以前に記載されたようにトリプリケートで実施した(42)。終点力価(endpoint titer)を、インキュベーションの1時間後の、陰性対照上で、0.1 ODユニットの吸光度を有する最後のサンプル希釈倍数として表した。
ELISAアッセイを以前に記載されたように実施した(61)。Ag85A、ESAT−6、CFP−10およびサルモネラ外膜タンパク質(SOMP)に対する総IgG、IgG1およびIgG2b抗体力価が決定された。Nunc Immunoplate Maxisorb F96プレート(Nalge Nunc. Rochester, NY, USA)を、0.05M 炭酸−重炭酸塩緩衝液、pH9.6中に懸濁させた、精製された0.5μg/ウェルのAg85A、1μg/ウェルのESAT−6もしくはCFP−10または0.5μg/ウェルのSOMPでコートした。同じ実験グループから得られた血清をプールし、PBS中に1:200の初期希釈から2倍希釈により、連続希釈した。ELISAアッセイを以前に記載されたようにトリプリケートで実施した(42)。終点力価(endpoint titer)を、インキュベーションの1時間後の、陰性対照上で、0.1 ODユニットの吸光度を有する最後のサンプル希釈倍数として表した。
ELISPOT
ELISPOTアッセイを、製造業者の指示書に従って、ELISPOTキット(マウスIFN−γ、TNF−α、IL−2、IL−4 ELISPOTセット、eBioscience)を用いて実施し、免疫されたマウスおよびナイーブなマウスの脾臓におけるインターフェロン−γ(IFN−γ)、腫瘍壊死因子−アルファ(TNF−α)、インターロイキン−2(IL−2)およびIL−4サイトカイン分泌細胞を数え上げた。ELISPOTアッセイは、同じグループからの3匹のマウスからの脾臓のプールを対象に、最後の免疫の3週後に実施した;これらのアッセイはまた、トリプリケートで行った。全てのグループのマウスからの脾臓の細胞を、加湿(空気中5% CO2)インキュベーター内で、37℃で、1μg/ウェルの組換え抗原または培養培地とインキュベートした。サルモネラ株χ9879(pYA3620)およびχ9879(pYA3941)で免疫されたマウスからの脾臓細胞を、24時間(INF−γおよびTNF−α−分泌細胞について)または48時間(IL−2およびIL−14−分泌細胞について)インキュベートし、一方で、Asd+/MurA+溶解ベクター誘導体の各々を独立して持つサルモネラχ11021株で免役されたマウスからの脾臓細胞は、40時間(INF−γおよびTNF−α−分泌細胞について)または66時間(IL−2およびIL−14−分泌細胞について)インキュベートした。自動ELISPOTプレートリーダー(CTLアナライザー;Cellular Technology Ltd, Cleveland, OH)を用いることにより、スポットを数えた。
ELISPOTアッセイを、製造業者の指示書に従って、ELISPOTキット(マウスIFN−γ、TNF−α、IL−2、IL−4 ELISPOTセット、eBioscience)を用いて実施し、免疫されたマウスおよびナイーブなマウスの脾臓におけるインターフェロン−γ(IFN−γ)、腫瘍壊死因子−アルファ(TNF−α)、インターロイキン−2(IL−2)およびIL−4サイトカイン分泌細胞を数え上げた。ELISPOTアッセイは、同じグループからの3匹のマウスからの脾臓のプールを対象に、最後の免疫の3週後に実施した;これらのアッセイはまた、トリプリケートで行った。全てのグループのマウスからの脾臓の細胞を、加湿(空気中5% CO2)インキュベーター内で、37℃で、1μg/ウェルの組換え抗原または培養培地とインキュベートした。サルモネラ株χ9879(pYA3620)およびχ9879(pYA3941)で免疫されたマウスからの脾臓細胞を、24時間(INF−γおよびTNF−α−分泌細胞について)または48時間(IL−2およびIL−14−分泌細胞について)インキュベートし、一方で、Asd+/MurA+溶解ベクター誘導体の各々を独立して持つサルモネラχ11021株で免役されたマウスからの脾臓細胞は、40時間(INF−γおよびTNF−α−分泌細胞について)または66時間(IL−2およびIL−14−分泌細胞について)インキュベートした。自動ELISPOTプレートリーダー(CTLアナライザー;Cellular Technology Ltd, Cleveland, OH)を用いることにより、スポットを数えた。
フローサイトメトリー。
細胞の調製:マウスを安楽死させ、胸腔を開ける。10mlの、50U/mlのヘパリン(Sigma, St. Louis, MO)を含有する氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Mediatech Inc, Manassas VA)での、肺動脈を通すかん流(perfusion)によって、肺から血液を取り除く。肺を無菌的に切除し、培地に置く。切断した肺組織を、コラゲナーゼXI(0.7mg/ml;Sigma−Aldrich)およびIV型ウシ膵臓DNase(30μg/ml;Sigma−Aldrich)を含有する不完全DMEMと、37℃で30分間インキュベートした。消化された肺を、セルストレイナーを通して穏やかに組織を押すことにより、さらに破壊させる。赤血球をゲイ液(Gey’s solution)で溶解し、洗浄し、そして完全DMEMに再懸濁した。製造業者によって記載されるように(Invitrogen, Eugene, OR)、Invitrogen CountBright absolute liquid counting beadsを用いて、、フローサイトメトリーにより、総細胞数を決定する。
細胞の調製:マウスを安楽死させ、胸腔を開ける。10mlの、50U/mlのヘパリン(Sigma, St. Louis, MO)を含有する氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Mediatech Inc, Manassas VA)での、肺動脈を通すかん流(perfusion)によって、肺から血液を取り除く。肺を無菌的に切除し、培地に置く。切断した肺組織を、コラゲナーゼXI(0.7mg/ml;Sigma−Aldrich)およびIV型ウシ膵臓DNase(30μg/ml;Sigma−Aldrich)を含有する不完全DMEMと、37℃で30分間インキュベートした。消化された肺を、セルストレイナーを通して穏やかに組織を押すことにより、さらに破壊させる。赤血球をゲイ液(Gey’s solution)で溶解し、洗浄し、そして完全DMEMに再懸濁した。製造業者によって記載されるように(Invitrogen, Eugene, OR)、Invitrogen CountBright absolute liquid counting beadsを用いて、、フローサイトメトリーにより、総細胞数を決定する。
表面マーカーおよび細胞内サイトカインのためのフローサイトメトリー:フローサイトメトリー解析のため、各マウスからの肺の単一細胞懸濁液を0.1%アジ化ナトリウム含有1x PBS(Mediatech Inc, Manassas, VA)に再懸濁する。細胞を、あらかじめ定められた最適力価の特定の抗体と、4℃または37℃のいずれかで、30分間、暗中でインキュベートする。細胞表面発現をCD4、CD44、CD62L、CD8、およびCCR7について解析し、かつ解析されたサイトカインはIFN−γ、TNF−α、IL−10、およびIL−17である。全ての抗体および試薬は、BD Pharmingen(San Jose, CA)、eBioscience(San Diego, CA)、またはBiolegend(San Diego, CA)から購入する。全てのサンプルはBecton Dickinson LSR II機器で解析し、データはFACSDiva v.6.1.1ソフトウェアで解析する。細胞を、前方−および側方−散乱プロファイルの特徴に基づき、リンパ球にゲーティングする。個々の細胞集団を、特定の蛍光標識抗体の存在に従って同定する。分析は全て、最低100,000事象の取り込み(acquisition)で行う。
統計分析。
統計分析をGraphPad Prismソフトウェア(GraphPad Software, San Diego, CA)を用いて実施した。抗体応答、ELISPOTにより測定されたサイトカイン分泌レベル、およびグループ間の肺および脾臓における細菌負荷の差異を、一元配置分散分析(one−way analysis of variance)ANOVAによって、続いてTukeyの多重比較検定(Tukey’s Multiple Comparison Test)によって決定した。P値<0.05を有する差異を、95%信頼区間で有意であると考えた。
統計分析をGraphPad Prismソフトウェア(GraphPad Software, San Diego, CA)を用いて実施した。抗体応答、ELISPOTにより測定されたサイトカイン分泌レベル、およびグループ間の肺および脾臓における細菌負荷の差異を、一元配置分散分析(one−way analysis of variance)ANOVAによって、続いてTukeyの多重比較検定(Tukey’s Multiple Comparison Test)によって決定した。P値<0.05を有する差異を、95%信頼区間で有意であると考えた。
実施例7:動物実験1の結果。
結核菌抗原ESAT−6、CFP−10およびAg85Aを、溶解ベクターpYA4890、pYA4891およびpYA4893を持つ、制御された遅延溶解株χ11021により、免役されたマウスにおいて産生させた。RASV χ11021はSifAタンパク質を産生し、それによって、エンドソーム区画からのRASVの脱出を不可能にし、かつプロテオソーム(proteosome)による効率の良いプロセシングがCMI応答を誘発することを可能にするために、結核菌抗原が抗原提示細胞の細胞質に効率良く到達する可能性を減少させる。χ11021(pYA4890)、χ11021(pYA4891)またはχ11021(pYA4893)で免疫されたマウスは、IgG1抗体よりも、Ag85Aに対するより高いレベルのIgG2b抗体を産生した。これらの免役された動物由来の脾臓は、χ11021(pYA4890)またはχ11021(pYA4891)で免疫されたマウスが、χ11021(pYA4893)で免疫されたマウスよりも強い応答を有したが、非免疫対照マウスよりも多くのIFN−γ−およびTNF−α−産生細胞を有した。重要なことに、これらのRASV構築物の各々で免疫されたマウスは、結核菌に対するワクチンのための「ゴールドスタンダード」と考えられている、ウシ型結核菌BCGワクチンによって与えられた保護と同等のレベルで、病原性のある結核菌でのエアロゾル負荷に対して、保護を与えた。
結核菌抗原ESAT−6、CFP−10およびAg85Aを、溶解ベクターpYA4890、pYA4891およびpYA4893を持つ、制御された遅延溶解株χ11021により、免役されたマウスにおいて産生させた。RASV χ11021はSifAタンパク質を産生し、それによって、エンドソーム区画からのRASVの脱出を不可能にし、かつプロテオソーム(proteosome)による効率の良いプロセシングがCMI応答を誘発することを可能にするために、結核菌抗原が抗原提示細胞の細胞質に効率良く到達する可能性を減少させる。χ11021(pYA4890)、χ11021(pYA4891)またはχ11021(pYA4893)で免疫されたマウスは、IgG1抗体よりも、Ag85Aに対するより高いレベルのIgG2b抗体を産生した。これらの免役された動物由来の脾臓は、χ11021(pYA4890)またはχ11021(pYA4891)で免疫されたマウスが、χ11021(pYA4893)で免疫されたマウスよりも強い応答を有したが、非免疫対照マウスよりも多くのIFN−γ−およびTNF−α−産生細胞を有した。重要なことに、これらのRASV構築物の各々で免疫されたマウスは、結核菌に対するワクチンのための「ゴールドスタンダード」と考えられている、ウシ型結核菌BCGワクチンによって与えられた保護と同等のレベルで、病原性のある結核菌でのエアロゾル負荷に対して、保護を与えた。
実施例8:動物実験2からの結果。
動物実験2では、sifAにおける変異、ならびにΔsifA、ΔtlpA、ΔsseLおよびΔPhilA::Ptrc ΔlacO888 hilA変異の組み合わせを持つサルモネラRASV株による、結核菌抗原の運搬によって誘導された、免疫応答の増強が、評価され得る。提案された実験はまた、我々が、抗原Mtb39Aを産生するRASVワクチンで免疫されたマウスにおいて誘発された免疫応答の種類、およびRASV系によるこの抗原の運搬の最適な手段を決定するのを可能にし得る。我々はまた、2つのRASV株(制御された遅延溶解株を介して抗原提示細胞のサイトゾルへ運搬されるタンパク質抗原としてESAT−6、CFP−10およびAg85Aを運搬するもの、および、制御された遅延溶解株を介してDNAワクチンとしてMtb39Aを運搬するもの)の混合物としての4つの結核菌抗原の運搬かどうかを決定してもよい。RASV−結核菌ワクチンで免疫されたマウスからの脾臓細胞のフローサイトメトリー解析を採用することは、我々が誘発されたT細胞のサブセットを決定することを可能にし得る、これは生成された免疫応答のより正確な評価を我々に提供し得る。エアロゾル化した結核菌での免疫されたマウスの負荷は、我々が、ウシ型結核菌BCGワクチンによって与えられた保護と比べて、RASV−結核菌によって与えられた保護のレベルを決定することを可能にし得る。しかしながら、sifA欠失変異の存在に起因してサイトゾルにおいて起こる、制御された遅延溶解を備えるサルモネラワクチンベクターを用いる、サイトゾルへの結核菌抗原の運搬が、薬剤感受性および薬剤耐性の結核菌株による感染症を効果的に予防し得る、優れたT細胞免疫応答を誘導し得るということが、予測される。
実施例7および8のための参考文献
動物実験2では、sifAにおける変異、ならびにΔsifA、ΔtlpA、ΔsseLおよびΔPhilA::Ptrc ΔlacO888 hilA変異の組み合わせを持つサルモネラRASV株による、結核菌抗原の運搬によって誘導された、免疫応答の増強が、評価され得る。提案された実験はまた、我々が、抗原Mtb39Aを産生するRASVワクチンで免疫されたマウスにおいて誘発された免疫応答の種類、およびRASV系によるこの抗原の運搬の最適な手段を決定するのを可能にし得る。我々はまた、2つのRASV株(制御された遅延溶解株を介して抗原提示細胞のサイトゾルへ運搬されるタンパク質抗原としてESAT−6、CFP−10およびAg85Aを運搬するもの、および、制御された遅延溶解株を介してDNAワクチンとしてMtb39Aを運搬するもの)の混合物としての4つの結核菌抗原の運搬かどうかを決定してもよい。RASV−結核菌ワクチンで免疫されたマウスからの脾臓細胞のフローサイトメトリー解析を採用することは、我々が誘発されたT細胞のサブセットを決定することを可能にし得る、これは生成された免疫応答のより正確な評価を我々に提供し得る。エアロゾル化した結核菌での免疫されたマウスの負荷は、我々が、ウシ型結核菌BCGワクチンによって与えられた保護と比べて、RASV−結核菌によって与えられた保護のレベルを決定することを可能にし得る。しかしながら、sifA欠失変異の存在に起因してサイトゾルにおいて起こる、制御された遅延溶解を備えるサルモネラワクチンベクターを用いる、サイトゾルへの結核菌抗原の運搬が、薬剤感受性および薬剤耐性の結核菌株による感染症を効果的に予防し得る、優れたT細胞免疫応答を誘導し得るということが、予測される。
実施例7および8のための参考文献
Claims (14)
- a.病原体に対する抗原をコードする少なくとも1つの核酸の制御された発現、および
b.前記抗原がサイトゾルに運搬され、かつ前記病原体に対する宿主細胞性免疫を誘導するように、エンドソーム脱出を可能にする、少なくとも1つの変異
が可能である、組換え細菌。 - 病原体がインフルエンザウイルスである、請求項1に記載の組換え細菌。
- 抗原がインフルエンザウイルスのNPである、請求項1に記載の組換え細菌。
- 抗原がインフルエンザウイルスの1以上の保存されたT細胞エピトープに融合したNPである、請求項1に記載の組換え細菌。
- 抗原がインフルエンザウイルスのNP147−155エピトープである、請求項1に記載の組換え細菌。
- 病原体が結核菌である、請求項1に記載の組換え細菌。
- 抗原が、ESAT−6、CFP−10、Ag85A、Ag85B、Ag85C、Mtb39A、FAP、Tb15.3、RfpAおよびRfpBからなる群から選択される結核菌の抗原である、請求項1に記載の組換え細菌。
- 細胞性免疫がエンドソーム脱出により誘導される、請求項1に記載の組換え細菌。
- 細胞性免疫がCD8媒介性免疫である、請求項1に記載の組換え細菌。
- 細胞性免疫が病原体の保存されたエピトープに対する、請求項1に記載の組換え細菌。
- 抗原がT細胞エピトープを含有すると知られている、請求項1に記載の組換え細菌。
- 請求項1、2または5に記載の組換え細菌を含む、ワクチン組成物。
- 病原体に対する細胞性免疫応答を誘導する方法であって、宿主に請求項1、2または5に記載の組換え細菌を含むワクチン組成物を投与することを含む、方法。
- 宿主において細胞性免疫応答を誘発するための方法であって、請求項1、2または5に記載の組換え細菌を含む有効量のワクチン組成物を宿主に投与することを含む、方法。
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