MX2007006551A

MX2007006551A - Cepas recombinantes del bacilo calmette guerin con capacidad mejorada para escapar del endosoma

Info

Publication number: MX2007006551A
Application number: MXMX/A/2007/006551A
Authority: MX
Inventors: David Michael Hone; Jerald C Sadoff; Ronggai Sun
Original assignee: Aeras Global Tb Vaccine Foundation
Priority date: 2004-12-01
Filing date: 2007-05-31
Publication date: 2008-10-03

Abstract

Se proveen cepas de Mycobacterium que tienen una capacidad mejorada para inducir una respuesta inmune de la célula T CD8+restringida al complejo de histocompatibilidad clase I;las cepas de Mycobacterium se diseñan genéticamente para expresar una proteína endosomalítica que es activa a pH neutro (por ejemplo Perfringolisina O), permitiendo el escape de la Mycobacterium a partir de los endosomas dentro del citoplasma de la célula;la invención también provee preparaciones de vacuna que contienen las cepas de Mycobacterium.

Description

CEPAS RECOMBINANTES DEL BACILO CALMETTE GUERIN CON CAPACIDAD MEJORADA PARA ESCAPAR DEL ENDOSO A CAMPO DE LA INVENCION La invención provee cepas de Mycobacterium que tiene una capacidad mejorada para inducir una respuesta inmune. Los experimentos in vivo han demostrado, por ejemplo, una respuesta inmune de la célula T CD8+ restringida al complejo principal de histocompatibilidad clase I. En particular, la invención provee cepas de Mycobacterium que expresan una proteína Perfringolisina O (PfoA) que permite el rescate de Mycobacterium a partir de los endosomas, y preparaciones de vacuna que contienen las cepas de Mycobacterium.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Mycobacterium tuberculosis (M. tb) ha infectado a un tercio de la población mundial, ocasionando la enfermedad activa en 8 millones y eliminando a 1.6-2.2 millones de individuos cada año, la mayoría de los cuales vive en el mundo desarrollado. La tuberculosis (TB) es una epidemia de proporciones globales que se encuentra en crecimiento y se ha vuelto incluso más mortal conforme intersecta con la extensión del VIH. TB es el asesino número uno de la gente con SIDA.

El bacilo Calmette Guerin (BCG), una cepa atenuada de Mycobacterium Boris y la vacuna contra la TB ampliamente utilizada de manera habitual, se desarrolló hace 80 años y cuando se evaluó tuvo relaciones ampliamente variables de eficiencia en contra de la tuberculosis pulmonar, incluyendo una ausencia de eficiencia en el último gran ensayo en campo que se llevó a cabo en India (Fine et al, Vaccine, 16 (20): 1923-1928; 1998; Anónimo, Indian J Med Res., Agosto; 110: 56-69; 1999. Sin embargo, la Organización Mundial de la Salud actualmente ha recomendado a la BCG en el momento del nacimiento o como un primer contacto con los servicios de salud para todos los niños (excepto aquellos con síntomas de enfermedad por VIH/SIDA) en países con una alta prevalencia de TB. Esta política se basa en la evidencia de que la BCG protege en contra de las formas severas infantiles de la TB (Lanckriet et al., Int J Epidemiol, 24 (5): 1042-1049; 1995; Rodrigues et al., J Epidemiol Community Health 45 (1 ): 78-80; 1991. La protección por BCG en contra de la TB más allá de la infancia temprana es un objetivo cohtroversial con datos limitados que han proporcionado resultados mezclados. Sin embargo, la alta incidencia de la TB pediátrica y adulta en los países en desarrollo en donde se practica ampliamente la inmunización infantil por BCG, indica que aunque la BCG se ha administrado de manera habitual, ésta no es altamente eficiente por muchos años cuando la gente se encuentra en riesgo de contraer la enfermedad de TB. Por lo tanto, se considera que BCG es una herramienta de salud pública inadecuada para la intervención y control de la TB.

Aproximadamente 70 por ciento de los humanos expuestos a los organismos TB, y los cuales tienen sistemas inmunes normales, no se infectan, y de aquellos que se infectan solamente aproximadamente 5 por ciento desarrollan la enfermedad dentro de los primeros dos años. La mayoría dé los individuos infectados suprimen la infección, la cual se asocia con el desarrollo de respuestas inmunes celulares fuertes a los antígenos de la M. tb. Un 5 por ciento adicional se reactiva posteriormente cuando la inmunidad declina. Tanto la enfermedad primaria como la reactivación son mucho más comunes en gente con VIH/SIDA, enfatizando de nuevo el papel de la inmunidad en la prevención y control de la infección. Debido a que la mayoría de los humanos son capaces de controlar la TB, existe una buena razón para esperar que mediante la inducción de inmunidad de larga duración del tipo apropiado debería ser posible desarrollar vacunas efectivas que prevengan la infección inicial después de la exposición, prevenir la progresión temprana de la enfermedad, prevenir la reactivación a partir del estado latente y prevenir la recaída después del tratamiento. Finalmente, es la combinación del uso de la vacuna sistémica más la intervención quimioterapéutica la que eliminará eventualmente a la M. tb como un patógeno de humano. A la luz del papel crítico de la vacunación de BCG durante la niñez se piensa que ésta tiene un papel en la prevención de la TB aguda, es difícil reemplazar a la BCG en los ensayos para evaluar a las vacunas de TB candidatos sin evidencia abundante con respecto que la nueva vacuna de TB es un producto superior. El problema es que M. tb es principalmente un patógeno específico de humano y los modelos animales solamente imitan parte de la interacción del hospedero-patógeno. Por lo tanto, la evidencia definitiva de que una nueva vacuna de TB que posee una potencia mejorada solamente se puede obtener a partir de ensayos de campo controlados en humanos. Esta realidad ha llevado a muchos investigadores a concluir que un paso clave hacia una vacuna mejorada de la TB será para mejorar la inmunogenicidad de BCG. Un ejemplo de dicha estrategia es mejorar la capacidad de BCG para inducir o activar las células T para mejorar la respuesta inmune. El papel principal de las células T CD8+ restringidas al complejo principal de histocompatibilidad clase I en la inmunidad hacia M. tb se demuestra por la incapacidad de los ratones deficientes en 2-microglobulina (ß2??) para controlar la infección experimental por M. tb. (Flynn et al., PNAS USA, 89 (24): 12013-12017; 1992). El papel principal de las células T CD8+ restringidas al complejo principal de histocompatibilidad clase I se demostró de manera convincente por la incapacidad de los ratones deficientes en p2-microglobulina (P2m) para controlar la infección experimental por M. tuberculosis (Flynn et al., anteriormente mencionado, 1992). Debido a que estos ratones mutantes carecen de la histocompatibilidad clase I, las células T CD8+ funcionales no se pueden desarrollar. En contraste con la infección por M. tuberculosis, los ratones deficientes en ß2?t? son capaces de controlar ciertas dosis infecciosas de la cepa de vacuna de BCG (Flynn et al., anteriormente mencionado, 1992; Ládel C. H., et al., Eur J Immunol, 25: 377-364; 1995). Además, la vacunación con BCG de ratones deficientes en ß2?t? solamente prolongó la supervivencia después de la infección por M. tuberculosis, mientras que los ratones C57BL/6 inmunizados con BCG resistieron a la M. tuberculosis (Flynn et al., anteriormente mencionado, 1992). Esta dependencia diferencial de la célula T CD8+ entre M. tuberculosis y BCG se puede explicar como sigue: los antígenos de M. tuberculosis tienen un mejor acceso al citoplasma que los antígenos de BCG que llevan a una presentación más pronunciada de la histocompatibilidad clase I (Hess y Kaufmann, FEMS Microbiol. Immunol 7: 95-103; 1993). Consecuentemente, se genera una respuesta más efectiva de la célula T CD8 por M. tuberculosis. Esta noción fue recientemente apoyada por una presentación incrementada de la histocompatibilidad clase I de un antígeno irrelevante, de ovalbúmina, por una infección simultánea de M. tuberculosis, más que por infección por BCG de las células presentadoras del antígeno (APC) (Mazzaccaro et al., Proc Nati Acad Sci USA, Octubre 15: 93 (21 ): 11786-91 ; 1996). Por lo tanto, los antígenos de M. tb tienen acceso al citoplasma de la célula hospedera mejor que los antígenos a partir de BCG, llevando a una presentación incrementada de la histocompatibilidad clase I (Hess et al., anteriormente mencionado, 1993) y una respuesta elevada de la célula T CD8+ a M. tb. Además, M. tb. estimula a las células auxiliares T CD4+ restringidas por el antigeno específico de histocompatibilidad clase llasi como a las células T citotoxicas CD8+ restringidas a la histocompatibilidad clase I en ratones y humanos (Kaufmann, Annu Rev Immunol 11 : 129-163; 1993). Por extensión, este hecho indica que las células infectadas por M. tb son susceptibles al reconocimiento por las células T citotoxicas CD8+ restringidas a la histocompatibilidad clase I. Dado que 70 por ciento de los humanos inmunocompetentes expuestos a los organismos TB no se infectan, la inmunidad inducida por la infección por M. tb es altamente efectiva para controlar a este organismo en la gran mayoría de los casos. Por lo tanto, se cree, que la eficiencia de la vacuna de TB existente cepa BCG será mejorada por el incremento en la capacidad de BCG para inducir las respuestas de la célula T citotóxica CD8+ restringida a la histocompatibilidad clase I (kaufmann, Fundamental Immunology, 1997). Como una regla, los antígenos expresados por los patógenos que permanecen unidos al fagosoma se presentan principalmente por las moléculas de histocompatibilidad clase II a las células T CD4+ pero se reconocen en menor medida por las células T CD8+, que normalmente reconocen los antígenos presentados en el contexto de las moléculas de histocompatibilidad clase I (Kaufmann, anteriormente mencionado, 1997). En contraste, la bacteria intracelular, tal como Listeria monocytogenes (por ejemplo ATCC # 13932), que escapa al fagosoma y se replica en el citoplasma de las células hospederas es efectiva para tener acceso a la ruta de presentación del antígeno de histocompatibilidad clase I y para inducir las respuestas de la célula T CD8+ (Berche et al., J immunol, 138: 2226-2276; 1987). Esta función de escape del endosoma de la Listeria monocytogenes recientemente se transfirió dentro de Salmonella atenuada, que normalmente reside en el fagosoma, mediante la introducción de las secuencias que codifican la listeriolisina (Lio); se mostró que las cepas resultantes escapan del endosoma y fueron más efectivas para inducir las respuestas de la célula T CD8+ (Bielecki et al., Nature (Londres), 354: 175-176; 1990; Gentschev et al., Infect Immun 63 (10): 4202-4205; 1995; Hess et al., Host Response to Intracellular Pathogens, 75-90; 1997). Más recientemente este método se aplicó a BCG; por lo tanto las cepas rBCG que secretan Lio se construyeron para mejorar la capacidad de BCG para inducir las respuestas inmunes restringidas a la histocompatibilidad clase I (Hess et al., PNAS USA, 95 (9): 5299-5304; 1998. Aunque la evidencia temprana ha sugerido que una cepa rBCG-Llo+ es más adecuada para inducir a las células T CD8+, la cepa probó ser incapaz de escapar del endosoma. Por lo tanto, una limitación de este método es que la función hemolítica de Lio, que se requiere para el escape del endosoma, solamente es completamente activa a pH 5.5 y es casi inactiva a pH 7.0. Puesto que las Micobacterias mantienen el pH del endosoma a un valor de casi 7.0, es lógico asumir que Lio en las cepas rBCG-Llo hasta ahora reportadas son disfuncionales debido a que el ambiente en el cual se expresan es subóptimo para la magnitud de la actividad hemolítica (Geoffroy et al., Infect Immun 55 (7): 1641-1646; 1987). Por lo tanto, el beneficio de mejoramiento inmune de este método no será evidente hasta que se desarrolle una estrategia que permita que Lio funcione en los endosoma manipulados por BCG. La técnica previa no ha sido capaz hasta el momento de proveer una rBCG con una capacidad incrementada para escapar del endosoma, y la cual pueda incrementar así la inducción de, por ejemplo, las respuestas de la célula T citotóxica CD8+ restringida al complejo de histocompatibilidad mayor clase I.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Un aspecto ejemplar de la presente invención provee cepas de BCG (rBCG) que tienen una capacidad mejorada para inducir una respuesta inmune de la célula T CD8+ restringida al complejo de histocompatibilidad mayor clase (MHC)-I. Estas cepas rBCG novedosas se han diseñado genéticamente para expresar una proteína endosomalítica funcional que es bioactiva a valores de pH cercanos a la neutralidad (por ejemplo de aproximadamente pH 6-8 o aproximadamente 6.5 a 7.5). Por lo tanto la proteína endosomalítica es activa en los endosomas que contienen Mycobacteria, que típicamente tienen un pH interno cercano a la neutralidad. La actividad de la proteína endosomalítica producida por el rBCG resulta en la alteración del endosoma, permitiendo que rBCG escape a partir del endosoma y dentro del citoplasma de la célula. Las rBCG se exponen entonces al citoplasma, e inducen una fuerte respuesta de la célula T, particularmente una fuerte respuesta de la célula T citotóxica CD8+ restringida a MCH-I. En una modalidad de la invención, la proteína endosomalítica que se introduce dentro de rBCG mediante ingeniería genética es Perfríngolisina O (PfoA) a partir de Clostridium perfringens. La invención provee así una Mycobacterium que está genéticamente diseñada para expresar y secretar una proteína endosomalítica funcional que es activa en un pH neutro. En algunas modalidades, la proteína formadora del poro endosomalítica funcional es PfoA o la PfoA muíante codificada por SEQ ID NO: 3 (en la presente invención referida como PÍOAGI37Q). La expresión de la proíeína endosomalílíca funcional por la Mycobacterium permite el escape de rBCG a partir de los endosomas. La Mycobacterium que se diseña así genéticamente puede ser una Mycobacterium alenuada tal como BCG. La invención también provee: una Mycobacterium que es genéticamente diseñada para expresar y secretar PfoA; y, una Mycobacterium que es genéticamente diseñada para expresar y secretar una PfoAGi37Q codificada por SEQ ID NO: 3. La preseníe invención provee adícionalmeníe un méíodo para permitir que un derivado de Mycobacíerium escape de los endosomas. El méíodo comprende el paso de diseñar genéíicameníe la Mycobacíerium para que coníenga, exprese y secreíe una proíeína endosomalítica funcional tales como PfoA o PÍOAGI37Q tal como aquella codificada por SEQ ID NO: 3. En algunas modalidades, la Mycobacíerium es una Mycobacíerium aíenuada tal como BCG.

La invención provee adicionalmente una preparación de vacuna, que comprende una Mycobacterium que se diseña genéticamente para expresar y secretar una proteína endosomalítica funcional que es activa a pH neutro. La proteína endosomalítica funcional puede ser, por ejemplo, PfoA o PfoAci37Q como se codifica por SEQ ID NO: 3. La expresión de la enzima endosomalítica funcional por la Mycobacterium permite el escape de la Mycobacterium recombinante a partir de los endosomas. En algunas modalidades, la Mycobacterium es una Mycobacterium atenuada tal como BCG.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figura 1. El mapa para un vector suicida pAF102. La denotación para cada uno de los segmentos de ADN es como sigue: flanco-I y flanco-D: flancos izquierdos y derechos del gen de ureC respectivamente; pfoA es el gen que codifica la forma mutante de la Perfringolisina O (número de acceso Genbank: BA000016) con un cambio particular de aminoácido en 137G(Q); LPpA985B es la secuencia de ADN que codifica el péptido líder antígeno 85B (por ejemplo Tv1886c); PAgesA es la secuencia promotora del antígeno del gen 85A (por ejemplo Rv3804c); aph es el gen de la aminoglicósido fosfotransferasa (número de acceso Genbank: X06402), que confiere resistencia a canamicina para el plásmido; OriE es el origen pUC de la replicación (número de acceso Genbank: AY234331 ); Ble es el gen (número dé acceso Genbank: L36850), que confiere resistencia a la zeocina para el plásmido; SacB es el gen (número de acceso Genbank: Y489048) que codifica levansacarosa, que confiere a la bacteria sensibilidad a la sacarosa; Phsp6o es la secuencia promotora del gen de la proteína de choque térmico (por ejemplo Rv0440); MCS es el sitio de clonación múltiple de las enzimas de restricción indicadas. Debe mencionarse que el cassette entre los dos sitios Pací se pueden reemplazar con otros genes de la enzima endosomalítica cuando es aplicable. Figura 2A y 2B. A, La secuencia del gen de PfoA a partir de Clostridium perfringens (SEQ ID NO: 1 ); B, la secuencia de proteína de PfoA a partir de Clostridium perfringens (SEQ ID NO: 2). Figura 3. La secuencia del gen de un mutante preferido, PfoAG137Q (SEQ ID NO: 3). Figura 4. Diagrama de flujo para los pasos principales del intercambio alélico. Figura 5. Digestión por la enzima de restricción para el plásmido de intercambio alélico pAF102. Línea 1 : marcador de ADN de 1 kb, Línea 2: plásmido pAF102 digerido mediante enzima de restricción EcoRI; Línea 3: plásmido pAF102 control no digerido; Línea 4: vector plasmídico pAF100 sin el inserto del cassette PFO digerido mediante la enzima de restricción EcoRI. Línea 5: vector plasmídico pAF100 sin el inserto del cassette PFO control no digerido. A partir de esta figura, el plásmido pAF100 se lineariza para producir una banda particular de 4.4 kb en tamaño mediante la enzima de restricción EcoRI como se esperaba. El plásmido pAF102 produjo dos bandas con un tamaño de 2.3 kb y 6.0 kb respectivamente mediante la enzima de restricción EcoRI como se esperaba. Figura 6. Análisis de PCR de las colonias seleccionadas para el genotipo de AureC::pfoA. La PCR se llevó a cabo como se describió en los materiales y métodos. El producto de PCR se analizó mediante electroforesis en gel en un gel de agarosa al 1 .2%. El marcador de ADN utilizado fue un marcador de ADN estándar de 1 kb obtenido partir de Invitrogen. Líneas 1 -6: PCR para las colonias numeradas 105-1 hasta 105-6, respectivamente; línea 7 y línea 8: PCR para las colonias numeradas 142-7 y 142-10, respectivamente. Línea 9: PCR para cepa BCG Danish 1331 . Figura 7. Crecimiento y sensibilidad a canamicina de AFV102. Las bacterias a partir de la construcción meroploíde AFV102, BCG Danish 1331 y PfoA (Pfo105 MI) se inocularon dentro de medio de crecimiento 7H9 y el crecimiento de cada cepa se comparó mediante la medición de la densidad óptica a 600 nm en puntos de tiempo diferentes. Para la prueba de sensibilidad a canamicina, se añadió el antibiótico a una concentración final de 50 ug/ml y el crecimiento se midió como se mencionó anteriormente. Abreviaturas en la leyenda: Ctrl: medio control sin ninguna inoculación bacteriana; +Kan o -Kan: con o sin canamicina en el medio. Figura 8. Prueba de cítotoxicídad para AFV102 en células J774A.1 . Las células se infectaron ya sea con AFV102 o BCG Danish 1331 . En los puntos de tiempo indicados después de la infección, la viabilidad celular se midió como se describió en los materiales y métodos mediante comparación con el control no infectado. Figura 9. Evaluación de AFV102 para su capacidad de supervivencia en macrófagos. Las células J774A.1 en monocapa se infectaron con AFV102 o BCG Danish 1331 , y en los puntos de tiempo indicados después de la infección las bacterias intracelulares fueron numeradas como se describió en los materiales y métodos. Figura 10. Prueba de AFV102 para su capacidad para secretar la proteína Pfo con pH independiente de la actividad hemolítica. El cultivo de AFV102 se preparó como se describió previamente y el sobrenadante se evaluó por su capacidad para lisar las células rojas a pH 7.0 y 5.5. La actividad de hemolisina se midió como se describió en los materiales y métodos. Figura 11A-11 D. Ilustraciones esquemáticas de los resultados para el ejemplo 3. A, la bacteria (óvalo oscuro) invade un macrófago (óvalo gris) dentro de una célula (hexágono) que estimula la formación de endosomas tempranos; B, BCG detiene la maduración del endosoma y BCG se protege dentro del endosoma temprano; C, las bacterias AFV102 que expresan PfoA se encuentran inicialmente en los endosomas tempranos después de la invasión; sin embargo, empiezan a secretar PfoA y a escapar del endosoma; D, las bacterias AFV 02 que expresan PfoA se pueden observar emergiendo a partir del endosoma o libres en la célula.

Figura 12. El mapa para el vector de sobre-expresión del antígeno pAF105. La denotación para cada uno de los segmentos de ADN es como sigue: P V313O es la secuencia promotora del antígeno Rv3130; PA985B es la secuencia promotora del antígeno Rv1886c. Los genes en el cassette de expresión son Rv0288; Rv1886c y Rv3804c; aph es el gen de la aminoglicósido fosfotransferasa (número de acceso Genbank: X06402), que confiere resistencia a canamicina; OriE es el origen de replicacion pUC (número de acceso Genbank: AY234331 ); leuD es el gen que codifica la 3-isopropilmalato deshidratasa (por ejemplo Rv2987c); OriM es el origen de réplicación en Mycobacteríum (número de acceso Genbank: M23557).

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS DE LA INVENCION La presente invención provee una rBCG que es capaz de escapar de los endosomas y tener acceso al citoplasma de la célula hospedera de las células que infecta. Como un resultado, se induce una respuesta superior de célula T CD8+ a del vector de Mycobacteríum en las células. El vector de Mycobacteríum se diseña genéticamente para contener una endosomalisina funcional que se expresa y secreta por la rBCG, y que media el escape endosomal de rBCG. El término endosomalisina en la presente invención se refiere a una proteína que es capaz de romper la membrana endosomal de manera adecuada para permitir que una célula bacteriana pase a partir del endosoma hacia el citosol. El término endosomalítica en la presente invención se refiere a a una proteína que tiene dicha actividad de ruptura. El término endosomalisis en la presente invención se refiere al proceso de ruptura de la membrana endosomal adecuado para permitir que una célula bacteriana pase a partir del endosoma hacia el citosol. La proteína endosomalítica es activa en ambientes con valores de pH cercanos a la neutralidad, tales como dentro de los endosomas de células infectadas con micobacterias, y por lo tanto media el escape de la bacteria hacia el citoplasma. En una modalidad de la presente invención, la proteína endosomalítica funcional que se introduce dentro de las cepas rBCG de la presente invención es pFoA a partir de Clostridium perfringens, o una variante funcional de la misma. PfoA es una citolisina secretada por Clostridium perfringens que se codifica por el gen pfoA (# de acceso Genbank CPE0163). El gen y su secuencia de proteina se muestran en la figura 2A y 2B, respectivamente. PfoA media el escape bacteriano a partir de los fagosomas, tanto en Clostridium como cuando se expresa por B. subtitlis (Portnoy et al., Infect Immun. Julio; 60 (7): 2710-7; 1992). A diferencia de Lio, PfoA es activo tanto a pH 5.0 como a pH 7.0 y por lo tanto permanece activo en el citosol y ocasiona daño a las células hospederas infectadas (Portnoy et al., anteriormente mencionado, 992). Por lo tanto, cuando PfoA se expresa en L. monocytogenes en lugar de Lio, éste permite que la cepa escape de los fagosomas (Jones y Portnoy, Infect Immun. Diciembre; 62 (12): 5608-13; 1994). Sin embargo, su expresión también ocasiona daño a las células hospederas. Lio exhibe propiedades similares a PfoA, excepto que Lio es activo óptimamente a pH 5.5 y exhibe poca actividad a pH 7.0. Por lo tanto, Lio media el escape del endosoma una vez que el pH del endosoma cae a pH 5.5 pero no afecta a la célula hospedera debido a que el pH del citosol, el cual se encuentra cerca de la neutralidad, impide la actividad de Lio. Portnoy et al. han demostrado adicionalmente que cuando PfoA sé expresa en L. monocytogenes en una forma muíante con una cambio particular de aminoácido, la forma muíante de PfoA ya no es tóxica a las células hospederas, incluso si aún es capaz de mediar el escape bacleriano a partir de una vacuola, y de llevar a cabo el crecimienío iníracelular (Portnoy eí al., aníeriormeníe mencionado, 1992). La cepa particular DP-12791 , con una mutación que cambia Gly137 a Gln137 en Pfo (por ejemplo PfoAGi37o), es capaz de escapar a partir del fagosoma de manera similar al organismo de tipo silvestre, pero sin producir un efecío tóxico sobre las células hospederas. Además, PfoAGi37Q es acíivo íanío a pH 5.6 como a pH 7.4 con una vida media ciíosólica reducida. La secuencia génica de PfoAci37Q se muestra en la figura 3 (SEQ ID NO: 3). La expresión de PfoA permite el escape a partir de los endosomas debido a la actividad formadora de poros de PfoA que lleva al daño de la membrana de la célula eucarionle. PfoA forma poros en las membranas que contienen colesterol medíanle la inserción esponíánea de sus dominios dentro de la bicapa. Esto sucede vía la unión al colesterol, el cual actúa como un receptor. Después de la unión, la toxina forma entonces una interfaz monómero-monómero (que se requiere para el ensamblaje del oligómero), oligomeriza y se particiona en la membrana mediante el cambio en su estructura, el cual es dependiente de la unión a la membrana. La formación de los oligómeros unidos a la membrana produce daño a la membrana y la lisis eventual (Ramachandran et al., Nature Structure and Molecular Biology, 11 (8), 697-705 (1995). PfoAGi37Q es capaz de mediar la lisis de la vacuola de esta manera. La PfoAci37Q preferidas tiene actividad limitada en el citoplasma de la célula hospedera infectada, debido a su sensibilidad a las proteasas del hospedero. En una modalidad de la invención, la enzima endosomalítica funcional que se expresa por rBCG es PfoA que se deriva o aisla a partir de C. perfringens. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica reconocerán que otras proteínas endosomalíticas que son activas en o cercanamente a la neutralidad también se presentan, mismas que podrían ser adecuadas para uso en la presente invención. Los ejemplos de dichas proteínas endosomalíticas incluyen pero no se limitan a Pneumolisina (producida por Streptococcus pneumoniae), Streptolisina O (producida por Streptococcus pyogenes), Cerolisina (producida por Bacilus cereus), a-hemolisina (producida por Staphylococcus aureus), etcétera, y variantes funcionales de los mismos. Por "proteína endosomalítica funcional" o "forma funcional" de una proteína (o el producto génico de un gen que se "expresa funcionalmente"), los inventores se refieren a que la forma de la proteina que se produce por la bacteria rBCG exhibe la magnitud de actividad característica para la cual la proteína nativa o natural ("tipo silvestre") se conoce en su organismo nativo. La magnitud de actividad de la forma funcional de la proteína producida por rBCG es, en general, de al menos aproximadamente 50 por ciento de la actividad usual de la proteína de tipo silvestre cuando se erisaya bajo condiciones estándares como se reconoce por aquellos expertos en la técnica. La magnitud de actividad de la proteína se puede determinar mediante la medición de cualquier característica física observable, tal como unión a un ligando, o producción de un efecto, tal como escape de rBCG a partir de los endosomas. Preferiblemente, la magnitud de la actividad es de al menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, o más de la magnitud de estándar de actividad de la proteína de tipo silvestre cuando se ensaya bajo condiciones estándares como se reconoce por aquellos expertos en la técnica. Por "variante funcional" de una proteína, los inventores se refieren a un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos aproximadamente 70% homologa con respecto a aquella de una proteína de "referencia" de tipo silvestre y la cual retiene la magnitud de actividad funcional (como se describió anteriormente) de la proteína de tipo silvestre. La secuencia de aminoácidos de la proteína de referencia de tipo silvestre típicamente se utiliza como un punto inicial para las mutaciones y alteraciones que se llevan a cabo por ingeniería genética.

Preferiblemente, una variante funcional es un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que exhibe aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de identidad con respecto a la secuencia de aminoácidos de referencia. Dichas variantes funcionales incluyen pero no se limitan a secuencias polipeptídicas en las cuales se ha llevado a cabo una o más sustituciones conservativas de aminoácidos. Las sustituciones conservativas de aminoácidos se conocen bien por aquellos expertos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, la sustitución de un aminoácido positivamente cargado por otro, un aminoácido negativamente cargado por otro, un aminoácido hidrófobo por otro, etcétera. Los polipéptidos variantes pueden contener una o más de dichas sustituciones, con la condición de que el polipéptido variante resultante retenga la magnitud de actividad funcional como se define en la presente invención. "Variantes funcionales" también abarcan otros cambios a la secuencia primaria del polipéptido de interés. Los ejemplos de cambios incluyen pero no se limitan a deleciones y adiciones de aminoácidos, o la modificación de aminoácidos (por ejemplo modificaciones químicas tales como sulfonación, deamidación, fosforilación, hidroxilación, etc.). Dichos cambios pueden ser el resultado de la ingeniería genética de una secuencia de aminoácidos de referencia, o pueden ser el resultado de modificaciones post-traduccionales de la proteína, o ambas. Además, las variantes funcionales de una enzima pueden ser el resultado de mutaciones naturales tales como aquellos que se presentan entre proteínas análogas con la misma actividad o con actividades similares que se aislan a partir de diferentes cepas de una especie, o a partir de diferentes especies, o a partir de diferentes organismos individuales dentro de una especie. Las proteínas a partir de las cúales se forman dichas variantes que se presentan de manera natural también pueden servir como la proteína de referencia, y la secuencia de aminoácidos de dicha variante natural puede servir como la secuencia de referencia. En cualquier caso, todas esas variantes funcionales de una proteína de referencia retiene la magnitud de actividad de la proteína, como se describe en la presente invención. Las homologías de secuencia e identidades como se describen en la presente invención no se pretende que incluyan secuencias heterólogas de aminoácidos que se derivan a partir de fuentes diferentes a la secuencia de referencia y que están unidas a o incluidas en la secuencia polipeptídica de una proteína para diversos propósitos diferentes. Los ejemplos de dichas secuencias heterólogas incluyen pero no se limitan a secuencias que faciliten el aislamiento del polipéptido (por ejemplo marcas de histidina), secuencias que faciliten la secreción o la localización del polipéptido dentro de la célula, (por ejemplo, diversas secuencias líder con direccionadoras), y secuencias que codifican para sitios de glicosilación (secuencias para glicosílación), etcétera. En cualquier caso, la variante funcional retendrá la magnitud de actividad de la proteína, de la cual es una variante al grado de que la variante funcional exhibe al menos aproximadamente 50 por ciento, y preferiblemente aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 100% o más, de la magnitud de actividad de la proteína de la cual es una variante, cuando se ensaya bajo condiciones estándares como se reconoce por aquellos expertos en la técnica. Además, la presente invención también incluye secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas y variantes funcionales de proteínas utilizadas en la presente invención. Las secuencias de ácidos nucléicos pueden ser deoxiribonucleótidos, ribonucleótidos, o formas modificadas de cualquiera, y pueden ser de cadena sencilla o doble. Las secuencias de ácidos nucléicos de la presente invención incluyen cualesquiera de las listadas en la presente invención, y también se pretende que abarquen variantes de las mismas. Por ejemplo, las variantes de los ácidos nucléicos pueden no ser idénticas a las secuencias listadas pero aún así pueden codificar una secuencia de aminoácidos idéntica debido a la redundancia del código genético. Alternativamente, se pueden realizar algunos cambios en las secuencias de la presente invención (por ejemplo sustituciones, deleciones o adiciones) que resultan en cambios en la secuencia codificada de aminoácidos, siempre y cuando la secuencia codificada de aminoácidos sea una variante funcional de la secuencia de aminoácidos de referencia anteriormente descrita. Los ejemplos incluyen pero no se limitan a: cambios que ocasionan sustituciones conservativas de aminoácidos en la enzima; y cambios que resultan en sustituciones no conservativas, o deleciones o adiciones en las secuencias de aminoácidos. Dichos cambios se pueden introducir por cualquier razón, por ejemplo con el objeto de alterar las modificaciones post-transcripcionales de la enzima; para incrementar o disminuir la solubilidad; para prevenir o introducir interacciones estéricas en el polipéptido traducido, etcétera. En general, las variantes de las secuencias de ácidos nucléicos de la presente invención exhibirán al menos aproximadamente 50 por ciento, y preferiblemente aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 100% de homología con respecto las secuencias de referencia, como se determina mediante procedimientos comparativos que se conocen bien por aquellos expertos en la técnica. Dichas variantes también se caracterizan mediante la exhibición de la capacidad de unión a las secuencias utilizadas en la presente invención bajo condiciones de alta severidad. Los ensayos de unión a alta severidad se conocen bien por aquellos expertos en la técnica y se pueden aplicar fácilmente para ensayar las variantes potenciales de las secuencias de la presente invención. Las homologías de secuencia como se describen en la presente invención no se pretende que se refieran a las secuencias de ácidos nucléicos que codifican secuencias heterologas de aminoácidos que se derivan a partir de fuentes diferentes a la secuencia de aminoácidos de referencia, y las cuales están unidas a o se incluyen en la secuencia polipeptídica de una proteína para muchos otros propósitos. Por ejemplo, dichas secuencias de ácidos nucléicos pueden codificar secuencias heterologas de aminoácidos incluyendo pero no limitadas a: secuencias que facilitan el aislamiento del pólipéptido (por ejemplo marcas de histidina), secuencias que facilitan la secreción o la localización del polipéptido dentro de la célula, (por ejemplo, diversas secuencias líder o secuencias de direccionamiento), y secuencias que codifican para sitios de glicosilación (secuencias para glicosilación), etc. Otras observaciones de las secuencias de ácido nucleico de la presente invención que se pretende que se incluyan por la presente invención són secuencias que han sido alteradas para conveniencia o que han sido mejoradas en la ingeniería genética de las secuencias de ácido nucleico, o en la expresión de las secuencias de aminoácidos que codifican. En general, dichas alteraciones no afectarán la secuencia del polipéptido que se traduce finalmente a partir de la secuencia de ácidos nucléicos; o el polipéptido aún satisfará los criterios anteriormente establecidos para una variante funcional. Los ejemplos de este tipo de alteración incluyen pero no se limitan a: la inclusión de sitios convenientes de endonucleasa de restricción en una secuencia de ácido nucleico para facilitar la manipulación de la secuencia (por ejemplo para la inserción de una secuencia dentro de un vector); la inclusión, deleción, u otro cambio en una secuencia o secuencias implicadas en la expresión de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo inclusión de cualesquiera que diversas secuencias promotoras y/o potenciadoras, señales de paro, súper promotores, promotores inducibles, y muchas otras secuencias que modifican la expresión de la secuencia de ácidos nucléicos); la inclusión de secuencias que faciliten la interacción de un vector con el ácido nucleico de un organismo hospedero, etcétera. Además, las secuencias de ácido nucleico de la presente invención se pueden modificar químicamente o se pueden incluir bases no tradicionales para cualesquiera de muchas razones que se conocen bien por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, para promover la estabilidad del ácido nucleico, o para conferir una conformación estérica deseable. Por "activo a pH neutro" y "activo a un pH de aproximadamente 7.0" los inventores se refieren a que la enzima está activa a un valor de pH en el intervalo de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0, y preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5. La presente invención provee Mycobacteria recombinantes. En una modalidad preferida de la invención, las Mycobacteria están atenuadas, como se ejemplifica por BCG. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica reconocerán que existen otras Mycobacteria atenuadas y no atenuadas las cuales también podrían ser adecuadas para uso en la presente invención. Los ejemplos de tipos adicionales de Mycobacteria incluyen pero no se limitan a M. tuberculosis cepa CDC1551 (véase, por ejemplo Griffith et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. Agosto; 152 (2): 808: 1995), M. tuberculosis cepa Beijing (Soolingen et al., 1995), M. tuberculosis cepa H37Ra (ATCC#: 251 77), M. tuberculosis cepa H37Rv (ATCC#: 25618), M. bovis (ATCC#: 1921 1 y 27291 ), M. fortuitum (ATCC#: 15073), M. smegmatis (ATCC#: 12051 y 12549), M. intracellulare (ATCC#: 35772 y 13209), M. kansasii (ATCC#: 21 982 y 35775), M. avium (ATCC#: 19421 y 25291 ), M. gallinarum (ATCC#: 1971 1 ), M. vaccae (ATCC#: 15483 y 23024), M. leprae (ATCC#:), M. marinarum (ATCC#: 1 5566 y 1 1567), y M. microtti (ATCC#: 11 152).

Los ejemplos de cepas atenuadas de Mycobacterium incluyen pero no se restringen a M. tuberculosis cepa pantotenato auxótrofa (Sambandamurthy, Nat. Med. 2002 8 (10): 1 171 ; 2002), M. tuberculosis cepa muíante rpoV (Collins et al., Proc Nati Acad Sci USA 92 (17): 8036; 1995), M. tuberculosis cepa leucina auxótrofa (Hondalus et al., Infecí. Immun. 68 (5): 2888; 2000), BCG cepa Danish (ATCC # 35733), BCG cepa Japanese (ATCC # 35737), BCG, cepa Chicago (ATCC # 27289), BCG cepa Copenhague (ATCC # 27290), BCG cepa Pasteur (ATCC # 35734), BCG cepa Glaxo (ATCC # 35741 ), BCG cepa Connaught (ATCC # 35745), BCG Monreal (ATCC # 35746). En una modalidad adicional de esta invención, las cepas atenuadas de Mycobacterium se modifican para potenciar la apoptosis, en donde dichas cepas inducen fuerte las respuestas inmunes celulares. La apoptosis es la muerte celular programada, que difiere dramáticamente de la muerte celular necrótica en términos de su inducción y consecuencias. De hecho, el proceso por medio del cual la apoptosis de las células que contienen el antígeno resulta en la inducción de la inmunidad celular potente ha sido denominado cebado cruzado (Heath et al., Immunol Rev 199; 2004; Gallucci et al., Nature Biotechnology 5: 1249; 1999; Albert et al., Nature 392: 86; 1998). Existen varios mecanismos para inducción de la apoptosis que llevan a una inmunidad incrementada mediada por la célula específica del antígeno. La apoptosis mediada por la caspasa 8 lleva a la protección inmunes celulares específica del antígeno (Sheridan et al., Science 277: 818; 1997).

Por lo tanto, otras modalidad de la presente invención provee cepas atenuadas de Mycobacterium las cuales exhiben propiedades mejoradas de la pro-apoptosis, tales, pero no limitadas a secA1 que secreta SódA que carece de un péptido líder a partir de la Salmonella enteriditis (número de acceso Genbank 1068147), Escherichia coli (número de acceso Genbank 1250070) o Shigella flexneri (número de acceso Genbank 1079977) o alternativamente una proteína SodA que no se secreta de manera natural tal como la SodA de Listeria monocytogenes EDG-e (número de acceso Genbank 986791 ). Dichas cepas atenuadas de Mycobacterium no producen Sod extracelular y por lo tanto no suprimen las respuestas inmunes del hospedero, incluso no expresan Sod intracelular, permitiendo así la supervivencia de dicha Mycobacterium (Edwards et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 164 (12): 2213-9; 2001 ). Alternativamente, las cepas atenuadas de Mycobacterium que exhiben propiedades mejoradas de pro-apoptosis portan un gen Rv3238c. Alternativamente, la expresión de Salmonella SopE (número de acceso Genbank AAD54239, AAB51429 o AAC02071 ) o caspasa-8 (número de acceso Genbank AAD24962 o AAH06737) en el citoplasma de células hospederas mediante Mycobacterium atenuado en la presente invención impartirá un método poderoso para inducir muerte celular programada en el contexto de antígenos expresados por dicha Mycobacterium atenuada, invocando niveles elevados de inmunidad celular específica del antígeno.

El receptor de muerte-5 (DR-5) también conocido como TRAIL-R2 (receptor TRAIL 2) o TNFR-SF-10B (miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral 10B) también media la apoptosis mediada por caspasa 8 (Sheridan et al., 1997). La apoptosis inducida por reovirus es mediada por TRAIL-DR5 produciendo una eliminación subsecuente del virus (Clarke et al., J. Virol 74: 8135; 2000). La expresión de DR-5, tal como DR-5 de humano (número de acceso Genbank BAA33723), homólogo de herpesvirus-6 (HHV-6) DR-5 (número de acceso Genbank CAA58423) etc., mediante Mycobacterium atenuada en la presente invención provee un efecto adyuvante potente para la inducción de inmunidad celular específica del antígeno en contra de antígenos de Mtb. Además, las células presentadoras del antígeno (tales como macrófagos y células dendríticas) también se pueden inducir para llevar a cabo apoptosis a través de la ligación de Fas, la cual es un estímulo fuerte para la inducción de las respuestas inmunes celulares específicas del antígeno (Chattergoon et al., Nat Biotechnology 18: 974; 2000). Por lo tanto, la Mycobacterium atenuada que expresa Fas o la proteína de fusión del dominio citoplásmico Fas/del ectodominio CD4 inducirá la apoptosis y aumentará las respuestas inmunes celulares específicas del antígeno. En resumen, las cepas atenuadas de Mycobacterium que promueven la inducción de la apoptosis proveen una herramienta poderosa para la inducción de respuestas celulares que llevan a la destrucción de la célula mediada por el sistema inmune de las células infectadas por Mtb, con eliminación subsecuente, reducción o prevención de la infección por Mtb. En incluso otra modalidad de la presente invención, los dos componentes de la vacuna de TB pueden incluir cepas atenuadas de Mycobacterium que sobre-expresan al menos un antígeno de Mycobacterium incluyendo, pero no restringidas a Rv0125, Rv0203, Rv0287, Rv0288, Rv0603, Rv1 196, Rv1223, Rv1271 c, Rv1733c, Rv1738, Rv1804c, Rv1886, Rv2031c, Rv2032, Rv2253, Rv2290, Rv2389c, Rv2626c, Rv2627c, Rv2779c, Rv2873, Rv2875, Rv3017c, Rv3407, Rv3804c, Rv3810, o Rv3841 . Alternativamente, los antígenos sobre-expresados de Mycobacterium se pueden encontrar en la forma de una proteína de fusión comprendida de una o más proteínas de fusión de Mycobacterium, tal como Mtb72f (Brandt et al., Infect. Immun., 72: 6622-6632; 2004; Skeky et al., J. Immunol., 172: 7618-7628; 2004), híbrido-I (Olsen et al., Infect. Immun., 72: 6148-6150; 2004; Langermans et al., Vaccine, 23: 2740-2750; 2005), Hyvac-4 (Dietrich et al., J. Immunol., 174: 6332-6339; 2005), etc. Esta invención tiene utilidad en el desarrollo de vacunas en contra de especies patogénicas de Mycobacterium y en el desarrollo de vectores de vacuna para administración del antígeno. Un vector de Mycobacterium se define en la presente invención como cualquier cepa de Mycobacterium diseñada para expresar al menos una secuencia nucleotódica pasajera (en la presente invención referida como "PNS") comprendida de ADN o ARN y que codifican cualquier combinación de antígenos, factores inmunoreguladores o adyuvantes, como se estableció anteriormente. La PNS se puede introducir dentro del cromosoma como parte de un vector de expresión utilizando composiciones y métodos bien conocidos en la técnica (Jacobs et al., Nature 327: 532- 535; 1987; Barletta et al., Res Microbiol. 141 : 931 - 939; 1990; Kawahara et al., Clin Immunol. 105: 326- 331 ; 2002; Lim et al., AIDS Res Hum Retroviruses. 13: 1573-1581 ; 1997; Chujoh et al., Vaccine, 20: 797- 804; 2001 ; Matsumoto et al., Vaccine, 14: 54-60; Haeseleer et al., Mol Biochem Parasitol., 57: 1 17- 126; 1993). En la presente invención, el vector de Mycobacterium puede portar un PNS que codifica un inmunógeno, que puede ser ya sea un inmunógeno externo a partir de un patógeno viral, bacteriano y parasitario, o un inmunógeno endógeno, tal como pero no limitado a un antígeno autoinmune o a un antígeno tumoral. Los inmunógenos pueden ser proteínas nativas de longitud total, fusiones quiméricas entre la proteína inmunógena externa y una proteína endógena o mimético, un fragmento o fragmentos de los mismos de un inmunógeno que se origina a partir de patógenos virales, bacterianos y parasitarios. Como se utiliza en la presente invención, "inmunógeno extraño" significa una proteína o fragmento de la misma, que no se expresa normalmente en la célula o tejido animal recipiente, tales como, pero no limitadas a, proteínas virales, proteínas bacterianas, proteínas parasitarias, citoquinas, quimocinas, agentes inmunoreguladores, o agentes terapéuticos.

Un "inmunógeno endógeno" significa una proteína o parte de la misma que está naturalmente presente en la célula o tejido animal recipiente, tales como, pero no limitados a, una proteína celular endógena, un agente inmunoregulador, o un agente terapéutico. Alternativamente o adicionalmente, el inmunógeno puede ser codificado por un gen sintético que se puede construir utilizando métodos convencionales de ADN recombinante conocidos por aquellos expertos en la técnica. El inmunógeno externo puede ser cualquier molécula que se expresa por cualquier patógeno viral, bacteriano o parasitario antes de o durante la entrada, colonización de, o replicación en su hospedero animal; el vector de Mycobacterium puede expresar inmunógenos o partes de los mismos que se originan a partir de patógenos virales, bacterianos y parasitarios. Estos patógenos pueden ser infecciosos en hospederos humanos, animales domésticos o animales silvestres. Los patógenos virales, a partir de los cuales se derivan los antígenos virales, incluyen, pero no se limitan a, Ortomixovirus, tal como el virus de la influenza (ID de taxonomía: 59771 ); retrovirus, tales como RSV, HTLV-I (ID de taxonomía: 39015), y HTLV-II (ID de taxonomía: 1 1909); virus del Herpes tal como EBV (ID de taxonomía: 10295); CMV (ID de taxonomía: 10358) o virus del herpes simplex (ATCC #: VR-1487); Antivirus, tales como HIV-I (ID de taxonomía: 12721 ) y HTV-2 (ID de taxonomía: 1 1709); rabdovirus, tal como el virus de la rabia; picornovirus, tal como Poliovirus (ID de taxonomía: 12080); virus de erupción pustulosa, tal como vaccinia (ID de taxonomía: 10245); Rotavirus (ID de taxonomía: 10912); y parvovirus, tal cómo virus adeno-asociado 1 (ID de taxonomía: 85106). Los ejemplos de antígenos virales se pueden encontrar en el grupo incluyendo pero no limitado a los antígenos del virus de inmunodeficiencía de humano Nef (National Institute of Allergy and Infectious Disease HTV Repository # de catálogo 183; # de acceso Genbank AF238278), Gag, Env (National Institute of Allergy and Infectious Disease HTV Repository # de catálogo 2433; # de acceso Genbank U39362), Tat (National Institute of Allergy and Infectious Disease HTV Repository # de catálogo 827; # de acceso Genbank M13137), derivados mutantes de Tat, tal como Tat-A31 -45 (Agwale et al. Proc. Nati. Acad. Sci. En prensa. Julio 8a; 2002), Rev (National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV Repository # de catálogo 2088; # de acceso Genbank L14572), y Pol (National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV Repository # de catálogo 238; # de acceso Genbank AJ237568) y epítopes de la célula T y B de gp120 (Hanke y McMichael, AIDS Immunol Lett., 66: 177; 1999; Hanke, et al., Vaccine, 17: 589; 1999; Palker et al., J. Immunol., 142: 3612-3619; 1989), derivados quiméricos de HIV-1 Env y gp120, tales como pero no restringidos a la proteína de fusión entre gp120 y CD4 (Fouts et al., J. Virol. 2000, 74: 1 1427-1 1436; 2000); derivados truncados o modificados de HTV-1 env, tal como pero no restringidos a gp140 (Stamatos et al., J Virol, 72: 9656-9667; 1998), o derivados de HTV-1 Env y/o gp140 de los mismos (Binley, et al., J Virol, 76: 2606-2616; 2002; Sanders, et al., J Virol, 74: 5091 -5100; 2000; Binley, et al., J Vifol, 74: 627-643; 2000), el antígeno de superficie de la hepatitis B (# de acceso Genbank AF043578; Wu et al., Proc. Nati. Acad. Sd., USA, 86: 4726-4730; 1989); los antígenos de rotavirus, tales como VP4 (# de acceso Genbank AJ293721 ; Mackow et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 87: 518-522; 1990) y VP7 (# de acceso Genbank AY003871 ; Green et al., J. Virol., 62: 1819-1823; 1988), antígenos del virus de la influenza tal como la hemaglutinina (# de acceso Genbank AJ404627; Pertmer y Robinson, Virology, 257: 406; 1999); nucleoproteína (# de acceso Genbank AJ289872; Lin et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 97: 9654-9658; 2000); antígenos del virus del herpes simplex tal como timidina cinasa (# de acceso Genbank AB047378; Whitley et al., En: New Generation Vaccines, 825-854; 2004). Los patógenos bacterianos, a partir de los cuales se derivan los antígenos bacterianos, incluyen pero no se limitan a, Mycobacterium spp., Helicobacter pylori, Salmonella spp., Shigella spp., E. colí, Rickettsía spp., Listeria spp., Legíonella pneumoniae, Pseudomonas spp., Vibrio spp., y Borellia burgdorferi. Los ejemplos de antígenos protectores de patógenos bacterianos incluyen los antígenos somáticos de E. coli enterotoxigénica, tal como el antígeno fimibrial CFA/I (Yamamoto et al., Infect. Immun., 50: 925-928; 1985) y la subunidad B no tóxica de la toxina lábil al calor (Klipstein et al., Infect. Immun., 40: 888-893; 1983); pertactina de Bordetella pertussis (Roberts et al., Vacc, 10: 43-48; 1992), adenilato ciclasa hemolisina de B. pertussis (Guiso et al., Micro. Path., 11 : 423-431 ; 1991 ), fragmento C de toxina de tétanos de Clostridium tetani (Fairweather et al., Infecí. Immun., 58: 1 323-1326; 1990), OspA de Borellia burgdorferi (Sikand, et al., Pediatrics, 108: 123-128; 2001 ); Wallich, et al., Infecí Immun, 69: 2130-2136; 2001 ), proteínas protectoras de la capa de superficie paracrisíalina de Rickeíísia prowazekii y Rickettsia typhi (Cari, et al., Proc Nati Acad Sci USA, 87: 8237-8241 ; 1990), la listeriolisina (también conocida como "Lio" y "Hly") y/o la superóxido dismulasa (también conocida como "SOD" y "p60") de Listeria monocytogenes (Hess, J., et al., Infecí. Immun. 65: 1286-92; 1997; Hess, J., eí al., Proc. Naíl. Acad. Sci. 93: 1458-1463; 1996; Bouwer, eí al., J. Exp. Med. 175: 1467-71 ; 1992), la ureasa de Helicobacter pylori (Gomez-Duaríe, et al., Vaccine 16, 460-71 ; 1998; Corthesy-Theulaz, et al., Infecíion & Immunity 66, 581-6; 1998), y el dominio de unión al receptor de la íoxina letal y/o el antígeno proteclor de Bacillus anthrax (Price, el al., Infecí. Immun. 69, 4509-4515; 2001 ). Los patógenos parasilarios, a partir de los cuales se derivan los aníígenos parasitarios, incluyen pero no se limiían a: Plasmodium spp. tal como Plasmodium falciparum (ATCC# 30145); Trypanosome spp. tal como Trypanosoma cruzi (ATCC# 50797); Giardia spp. tal como Giardia intesíinalis (ATCC# 30888D); Boophilus spp., Babesia spp. lal como Babesia microli (ATCC# 30221 ); Eníamoeba spp. tal como Eníamoeba histolytica (ATCC# 30015); Eimeria spp. lal como Eimeria máxima (ATCC# 40357); Leishmania spp. (ID de taxonomía: 38568); Schistosome spp., Brugía spp., Fascida spp., Dirofilaria spp., Wuchereria spp., y Onchocerea spp.

Los ejemplos de antígenos protectores de patógenos parasitarios incluyen los antígenos de circumsporozoito de Plasmodium spp. (Sadoff et al., Science, 240: 336-337; 1988), tal como el antígeno de circumsporozoito de P. bergerii o el antígeno de circumsporozoito de P. falciparum; el antígeno de superficie de merozoito de Plasmodium spp. (Spetzler et al., Int. J. Pept. Prot. Res., 43: 351-358; 1994); la lectina específica de galactosa de Entamoeba histolytica (Mann et al., Proc. Nati. Acád. Sci., USA, 88: 3248-3252; 1991 ), gp63 de Leishmatiia spp. (Russell et al., J. Immunol., 140: 1274-1278; 1988; Xu y Liew, Immunol., 84: 173-176; 1995), gp46 de Leishmania major (Handman et al., Vaccine, 18: 3011-3017; 2000), paramiosina de Brugia malayi (Li et al., Mol. Biochem. Parasitol., 49: 315-323; 1991 ), la triosa-fosfato isomerasa de Schistosoma mansoni (Shoemaker et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 89: 1842-1846; 1992); la proteína secretada semejante a globina de Trichostrongylus colubriformís (Frenkel et al., Mol. Biochem. Parasitol., 50: 27-36; 1992); la glutationa-S-tránsferasa de Frasciola hepática (Hillyer et al., Exp. Parasitol., 75: 176-186; 1992), Schistosoma bovis y S. japonicum (Bashir et al., Trop. Geog. Med., 46: 255-258; 1994); y KLH de Schistosoma bovis y S. japonicum (Bashir et al., anteriormente mencionado 1994). Como se mencionó anteriormente, el vector de Mycobacterium puede puede portar un PNS que codifica un inmunógeno endógeno, el cual puede ser cualquier proteína celular, agente inmunoregulador, o agente terapéutico, o partes de los mismos, que se pueden expresar en la célula recipiente, incluyendo pero no limitados a inmunógenos tumorales, inmunógenos del transplante, e inmunógenos autoinmunes, o fragmentos y derivados de inmunógenos tumorales, inmunógenos del transplante, e inmunógenos autoinmunes de los mismos. Por lo tanto, en la presente invención, el vector de Mycobacterium puede codificar un PNS que codifica el tumor, inmunógenos del transplante, o inmunógenos autoinmunes, o partes o derivados de los mismos. Alternativamente, el vector de Mycobacterium puede portar PNS sintéticos (como se describió anteriormente), los cuales codifican aritígenos específicos del tumor, antígenos del transplante, o antígenos autoinmunes o partes de los mismos. Los ejemplos de antígenos específicos del tumor incluyen antígeno específico de próstata (Gattuso et al., Human Pathol., 26: 123-126; 1995), TAG-72 y CEA (Guadagni et al., Int. J. Biol. Markers, 9: 53-60; 1994), MAGE-1 y tirosinasa (Coulie et al., J. Immunothera., 14: 104-109; 1993). Recientemente se ha mostrado en los ratones que la inmunización con células no malignas que expresan un antígeno tumoral provee un efecto tipo vacuna, y también ayuda al animal a montar una respuesta inmune para eliminar las células tumorales malignas que exhiben el mismo antígeno (Koeppen et al., Anal. N. Y. Acad. Sci., 690: 244-255; 1993). Los ejemplos de antígenos del transplante incluyen la molécula CD3 en las células T (Alegre et al., Digest. Dis. Sci., 40: 58-64; 1995). Se ha mostrado que el tratamiento con un anticuerpo al receptor CD3 elimina rápidamente las células T en circulación y revierte el rechazo del transplante mediado por la célula (Alegre et al., anteriormente mencionado, 1995). Los ejemplos de antígenos autoinmunes incluyen IAS cadena ß (Topham et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 91 : 8005-8009; 1994). Se ha demostrado que la vacunación de ratones con un péptido de 18 aminoácidos a partir de IAS cadena ß provee protección y tratamiento a los ratones con encefalomielitis autoinmune experimental (Topham et al., anteriormente mencionado, 1994).

Vectores de Mycobacterium que expresan un adyuvante Se pueden construir vectores viables para Mycobacterium que portan PNS que codifica un inmunógeno y un adyuvante, y son útiles para inducir respuestas aumentadas del hospedero al vector y al inmunógeno codificado por PNS. Alternativamente, el viable construir vectores de Mycobacterium que portan PNS que codifican un adyuvante, los cuales se administran en mezclas con otros vectores de Mycobacterium que portan PNS que codifican al menos un inmunógeno para incrementar las respuestas del hospedero a dicho inmunógeno codificado por el copartícipe del vector de Mycobacterium. El adyuvante particular codificado por PNS insertado en dicho vector de Mycobacterium no es crítico para la presente invención y puede ser la subunidad A de la toxina del cólera (por ejemplo CtxA; número de acceso Genebank X00171 , AF175708, D30053, D30052), o partes y/o derivados mutantes de los mismos (por ejemplo el dominio Al de la subunidad A de Ctx (por ejemplo CtxA1 ; número de acceso Genebank K02679), a partir de cualquier Vibrio cholerae clásica (por ejemplo V. cholerae cepa 395, ATCC # 39541 ) o V. cholerae cepa El Tor (por ejemplo V. cholerae cepa 2125, ATCC # 39050). Alternativamente, cualquier toxina bacteriana que es un miembro de la familia de exotoxinas bacterianas que ribosilan adenosina difosfato (Krueger y Barbier, Clin. Microbiol. Rev., 8: 34; 1995), se puede utilizar en lugar de CtxA, por ejemplo la subunidad A de la toxina lábil al calor (referida en la presente invención como EltA) de Escherichia coli enterotoxigénica (# de acceso Genbank M35581 ), subunidad S1 de toxina de pertussis (por ejemplo ptxS1 , # de acceso Genbank AJ007364, AJ007363, AJ006159, AJ0061 57, etc.); como una alternativa adicional el adyuvante puede ser uno de la adenilato ciclasa-hemolisinas de Bordetella pertussis (ATCC # 8467), Bordetella bronchiseptica (ATCC # 7773) o Bordetella parapertussis (ATCC # 15237), por ejemplo los genes cyaA de B. pertussis (número de acceso Genebank X14199), B. parapertussis (número de acceso Genebank AJ249835) o B. bronchiseptica (número de acceso Genebank Z371 12).

Vector de Mvcobacterium que expresa un agente inmunorequlador Incluso otro método comprende el uso del vector de Mycobacterium que porta al menos un PNS que codifica un inmunógeno y una citoquina, que se utilizan para inducir respuestas aumentadas del hospedero al PNS codificado por el vector de Mycobacterium inmunógeno. Alternativamente, es posible construir un vector de Mycobacterium que porta un PNS que codifica dicha citoquina sola, que se utilizan en mezclas con al menos otro vector de Mycobacterium que porta un PNS que codifica un inmunógeno para incrementar las respuestas del hospedero a los inmunógenos codificados por PNS expresados por el copartícipe del vector de Mycobacterium. La citoquina particular codificada por el vector de Mycobacterium no es crítica para la presente invención e incluye, pero no se limita a, interleucina-4 (en la presente invención referida como "IL-4"; número de acceso Genebank AF352783 (IL-4 de murino) o NM_000589 (IL-4 de humano)), IL-5 (número de acceso Genebank NM_010558 (IL-5 de murino) o NM_000879 (IL-5 de humano)), IL-6 (número de acceso Genebank M20572 (IL-6 de murino) o M29 50 (IL-6 de humano)), IL-10 (número de acceso Genebank NM_010548 (IL-10 de murino) o AF418271 (IL-10 de humano)), IL-12p40 (número de acceso Genebank NM_008352 (IL-12 p40 de murino) o AY008847 (IL-12 p40 de humano)), IL-12p70 (número de acceso Genebank NM_008351/NM_008352 (IL-12 p35/40 de murino) o AF093065/AY008847 (IL-12 p35/40 de humano)), TGF (número de acceso Genebank NM_01 1 577 (TGF l de murino) o M60316 (TGFpl de humano)), y TNFa número de acceso Genebank X0261 1 (TNFa de murino) o M26331 (de humano TNFa)). El método específico utilizado para introducir un gen que codifica un gen Pfo dentro del genoma de BCG no es una característica crítica de la invención y se puede seleccionar a partir de métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica (Parish et al., Microbiology, 145: 3497-3503; 1999). Un método preferido incluye el direccionamiento del gen Pfo al locus urea, resultando así en la inactivación del último gen y creando un marcador para selección de las cepas modificadas (Qadri et al., J Clin Micro. 20 (6): 1198-1199; 1984). Para lograr lo mismo, se puede modificar un plásmido de intercambio alélico sintético, tal como el plásmido descrito en los ejemplos de la sección a continuación, para que contenga secuencias de 1 kb que flanquean los extremos hacia 5 prima y 3 prima del gen urea (base de datos del genoma # Mb1881). El gen PfoA (base de datos del genoma # CPE0163) se inserta entonces entre las secuencias flanqueantes bajo el control del promotor Ag85B. Para secretar la proteína PfoA, una secuencia péptica líder de Ag85B se utiliza en lugar de la secuencia señal de PfoA para asegurar la secreción eficiente a partir de las cepas BCG recombinantes. El método por medio del cual los plásmidos de intercambio alélico se introducen dentro de las cepas blanco de BCG no es una característica crucial de la presente invención y se puede lograr mediante protocolos estándares de electroporación para Mycobacterium. De manera similar, el método específico para afectar el intercambio alélico e introducir el alelo Pfo dentro del locus urea no es una característica crucial de la invención y se puede seleccionar a partir de métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Un vector suicida tal como aquel ilustrado en la figura 1 provee un método preferido, y este plásmido contiene dos marcadores para selección por antibiótico, minimizando asi la selección de mutantes espontáneos resistentes al antibiótico. Durante el intercambio alélico, el segmento del gen PfoA reemplaza el gen urea como un resultado de la recombinación homologa de las secuencias flanqueantes a la izquierda y a la derecha, resultando así en la integración cromosomal estable y en la expresión de PfoA. Una ventaja de este método es que no se requieren antibióticos para mantener el producto final, y no está presente un genotipo o fenotipo resistente al antibiótico en la cepa final. Esta es la modalidad preferida para los productos para uso en humano (estos son "libres de antibióticos"). Un fenotipo negativo a urea marcará las cepas que se han sometido a intercambio alélico y reemplazaron ureC con Pfo, y se entiende que el fenotipo positivo a UreC también se puede emplear en ciertas aplicaciones. En la presente invención, la ubicación de pfoA en la BCG no se restringe a urea. Otras ubicaciones incluyen pero no se limitan a pfoA integrado dentro de un plásmido, y en el sitio attB en el cromosoma. Aquellos expertos en la técnica conocerán otras ubicaciones el cromosoma que son sitios potenciales para la integración y expresión de pfoA. La presente invención también provee preparaciones de vacuna para uso en la inducción de una respuesta inmune en contra de la tuberculosis. Las preparaciones de vacuna incluyen al menos una cepa rBCG como se describe en la presente invención, y un vehículo fármacológicamente adecuado. La preparación de dichas composiciones para uso como vacunas sé conoce bien por aquellos expertos en la técnica. Típicamente, dichas composiciones se preparan ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, sin embargo, también se contemplan las formas sólidas tales como tabletas, pildoras, polvos y los similares. También se pueden preparar las formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensiones en, líquidas antes de la administración. La preparación también puede estar emulsificada. Los ingredientes activos se pueden mezclar con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con los ingredientes activos. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, rafinosa, glicerol, etanol y los similares, o combinaciones de los mismos. Además, las composiciones pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, agentes reguladores de pH, y los similares. Además, la composición puede contener otros adyuvantes. Si se desea administrar una forma oral de la composición, se pueden añadir diversos espesantes, saborizantes, diluyentes, emulsificantes, auxiliares de dispersión o aglutinantes y los similares. La composición de la presente invención puede contener cualesquiera de dichos ingredientes adicionales de manera que se proveea a la composición en una forma adecuada para administración. La cantidad final de la bacteria rBCG en las formulaciones puede variar. Sin embargo, en general, la cantidad en las formulaciones será de aproximadamente 1-99 por ciento. Las preparaciones de vacuna de la presente invención pueden comprender adicionalmente un adyuvante, ejemplos adecuados de los cuales incluyen pero no se limitan a Seppic, Quil A, Alhydrogel, etc. Además, las preparaciones de vacuna de la presente invención pueden contener un tipo particular de rBCG. Alternativamente, más de un tipo de rBCG se puede utilizar en una vacuna. La presente invención también provee métodos para inducir una respuesta inmune a la tuberculosis y métodos para vacunar a un mamífero en contra de la tuberculosis. Mediante la inducción de una respuesta inmune, los inventores se refieren a aquella administración de la preparación de vacuna de la presente invención que ocasiona la síntesis de anticuerpos específicos (a un título en el intervalo de 1 a 1 x 106, preferiblemente de 1 x 103, más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 106, y más preferiblemente mayor de 1 x 106) y/o proliferación celular, como se mide, por ejemplo mediante incorporación de 3H timidina. Los métodos incluyen la administración de una composición que comprende una cepa rBCG de la presente invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable a un mamífero. Las preparaciones de vacuna de la presente invención se pueden administrar por uno de muchos medios adecuados que se conocen bien por aquellos expertos en la técnica, incluyendo pero no limitados a administración por inyección, oralmente, nasalmente, mediante ingestión de un producto alimenticio que contiene la rBCG, etcétera. En modalidades preferidas, el modo de administración es subcutáneo o intramuscular.

Los siguientes ejemplos se deben considerar como ejemplares de diversos aspectos de la presente invención y no se pretende que sean limitantes con respecto a la práctica de la invención. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que los materiales alternos, condiciones, y procedimientos deben variar y permanecer dentro de la capacidad del experto en la técnica sin apartarse del alcance general de la invención como se enseña en la especificación.

EJEMPLOS Se ha demostrado el papel clave de las células T CD8+ restringidas al MHC clase I en la protección inmune de TB (Flynn et al., anteriormente mencionado, 1992). En un esfuerzo por mejorar la respuesta de la célula T CD8, se ha diseñado una cepa BCG recombinante para expresar listeriolisina de Listeria monocytogenes. Sin embargo, esta BCG recombinante (rBCG) no pudo exhibir una capacidad incrementada para el escape endosomal, y por lo tanto no ocasiona la inducción incrementada de, por ejemplo, las respuestas de la célula T citotóxica CD8+ restringida al MHC clase I. Cuando se examinó, la cepa exhibió menos de 1% de escape del endosoma. Esto no es sorprendente debido a que la actividad de la listeriolisina es altamente sensible al pH, por lo tanto la enzima probablemente no es activa al pH dentro del endosoma. A pesar de esta desventaja, se mejoró tanto la protección como la seguridad de esta cepa recombinante de manera dramática. Basándose en esta observación, los inventores han construido una cepa novedosa rBCG mediante la introducción de PÍOAGI37Q, dedicada a partir de Clostridium perfringens dentro del cromosoma de BCG. PfoAGi37Q tiene un cambio de aminoácidos en la posición 137 de G a Q. Este cambio único de aminoácidos resulta en la pérdida de la toxicidad de Pfo de tipo silvestre en las células de mamífero, incluso la enzima retiene su función endosomolítica. Se ha mostrado que la cepa resultante es segura e inmunogénica en un modelo animal.

Materiales y métodos: General Para cada experimento descrito en las siguientes secciones, las endonucleasas de restricción (en la presente invención "REs"); New England Biolabs Beverly, MA), T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Beverly, MA) y Taq polimerasa (Life Technologies, Gaithersburg, MD) se utilizaron de conformidad con los protocolos del fabricante; el ADN plasmídico se preparó utilizando equipos de purificación de ADN plasmídico de pequeña escala (equipo Qiagen MiniprepR, Santa Clarita, CA) o de gran escala (equipo Qiagen MáxiprepR, Santa Clarita, CA) de conformidad con los protocolos del fabricante (Qiagen, Santa Clarita, CA); el agua milli-Q grado biología molecular, libre de nucleasa, Tris-HCI (pH 7.5), EDTA pH 8.0, 1 M MgCI2, 100% (v/v) etanol, agarosa ultra-pura, y regulador de pH para electroforesis en gel de agarosa se obtuvieron a partir de Life Technologies, Gaithersburg, MD. Las digestiones por RE, PCRs, las reacciones de ligación de ADN y la electroforesis en gel de agarosa se llevaron a cabo de conformidad con los procedimientos bien conocidos (Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1 , 2, 3; 1989); Straus, et al., Proc Nati Acad Sci USA. Mar; 87 (5) 1889-93; 1990). La secuenciación nucleotídica para verificar la secuencia de ADN de cada plásmido recombinante descrito en las siguientes secciones se logró mediante técnicas convencionales automatizadas de secuenciación de ADN utilizando un secuenciador automatizado Applied Biosystems, modelo 373A. Los iniciadores de PCR se obtuvieron a partir de vendedores comerciales tal como Sigma (St. Louis, MO) o se sintetizaron utilizando un sintetizador de ADN de Applied Biosystems (modelo 373A). Los iniciadores de PCR se utilizaron a una concentración de 150-250 uM y las temperaturas de hibridación para las reacciones de PCR se determinaron utilizando el software Clone manager versión 4.1 (Scientific and Educational Software Inc., Durham NC). Las PCRs se llevaron a cabo en un Stratagene Robocycler, modelo 400880 (Stratagene, La Jolla, CA). Los iniciadores de PCR para las amplificaciones se diseñaron utilizando el software Clone Manager® versión 4.1 (Scientific and Educational Software Inc., Durham NC). Este software permitió el diseño de los iniciadores de PCR e identificó los sitios RE que son compatibles con los fragmentos específicos de ADN a ser manipulados. Las PCRs se llevaron a cabo en un dispositivo termociclador, tal como el Stratagene Robocycler, modelo 400880 (Stratagene), y los tiempos de hibridación del iniciador, elongación y desnaturalización en las PCRs se establecieron de conformidad con los procedimientos estándares (Straus et al., anteriormente mencionado, 1990). Las digestiones por RE y las PCRs se analizaron subsecuentemente mediante electroforesis en gel de agarosa utilizando procedimientos estándares (Straus et al., anteriormente mencionado, 1990; y Sambrook et al., anteriormente mencionado, 1989). Una clona positiva se define como aquélla que exhibe el patrón apropiado de RE y/o el patrón de PCR. Los plásmidos identificados a través de este procedimiento se pueden evaluar adicionalmente utilizando procedimientos estándares de secuenciación de ADN, como se describió anteriormente. Las cepas de Escherichia coli, tales como DH5a y Sable2R, se obtuvieron a partir de Life Technologies (Bethesda, MD) y sirvieron como hospederos iniciales de los plásmidos recombinantes. Los plásmidos recombinantes se introdujeron dentro de las cepas de E. coli mediante electroporación utilizando un dispositivo de electropulso de alto voltaje, tal como el Gene Pulser (BioRad Laboratories, Hercules, CA), ajustado a 100-200O, 15-25 uF y 1.0-2.5 kV, como se describió (Straus et al., anteriormente mencionado, 1990). Las condiciones óptimas para electroporación se identificaron mediante la determinación de los ajustes que resultaron en las relaciones de transformación máxima por mcg de ADN por bacteria. Las cepas bacterianas se crecieron típicamente en agar tríptico de soya (Difco, Detroit, MI) o en caldo tríptico de soya (Difco, Detroit, MI), que se elaboraron de conformidad con las instrucciones del fabricante. A menos que se establezca de otra manera, todas las bacterias se crecieron a 37°C en 7 % de CO2 (v/v) con agitación suave. Cuando fue apropiado, los medios se suplementaron con antibióticos (Sigma, St. Louis, MO). Las cepas bacterianas típicamente se almacenaron a -80°C, se suspendieron en (Difco) que contenía 30% (v/v) de glícerol (Sigma, St. Louis, MO) a casi 109 unidades formadoras de colonia (en la presente invención referidas como "cfu") por mi.

Intercambio alélico en BCG. La técnica previa enseña el uso de métodos para la introducción de alelos alterados dentro de cepas de Mycobacterium y aquéllos expertos en la técnica serán capaces de interpretar y ejecutar los métodos (Parish et al., Microbiology 146: 1969-1975; 2000). Un método novedoso para generar un plásmido de intercambio alélico incluye el uso del ADN sintético. La ventaja de este método es que el producto del plásmido tendrá una historia altamente definida y será condescendiente con las regulaciones gubernamentales, mientras que los métodos previamente utilizados, aunque son efectivos, tienen registros de cultivo de laboratorio escasamente documentados y por lo tanto es poco probable que sean condescendientes. La condescendencia con estas regulaciones es esencial si un producto se debe permitir para uso en humanos por las autoridades reguladoras de los Estados Unidos y por las autoridades reguladoras Europeas. Un vector suicida para el intercambio alélico en Mycobacterium es un plásmido que tiene la capacidad de replicarse en las cepas de E. coli pero que es incapaz de llevar a cabo replicación en Mycobacterium spp., tales como M. tb y BCG. El vector suicida específico para uso en los procedimientos de intercambio alélico en la presente invención no es importante, y se puede seleccionar a partir de aquéllos disponibles a partir de fuentes académicas (Parish et al., anteriormente mencionado, 2000) y fuentes comerciales. Un diseño preferido de un plásmido suicida para intercambio alélico se muestra en la figura 1. El plásmido está comprendido de los siguientes segmentos de ADN: una secuencia oriE para que el plásmido se replique en E. coli (# de acceso Genbank L09137), una secuencia para resistencia a canamicina para la selección tanto en E. coli como en Mycobacterium (# de acceso Genbank AAM97345), y un marcador adicional para selección por antibiótico (por ejemplo el gen de resistencia a zeocina (# de acceso Genbank AAU06610), que se encuentra bajo el control de un promotor de Mycobacterium (por ejemplo el promotor hsp60). El segundo marcador para selección por antibiótico no es esencial pero se incluye para permitir la selección doble para prevenir el exocrecimiento de aislados espontáneos resistentes a canamicina durante el proceso de intercambio alélico. La construcción de dichos vectores suicidas se puede lograr utilizando técnicas estándares de ADN recombinante como se describen en la presente invención. Sin embargo, los estándares reguladores habituales (por ejemplo regulaciones federales) han elevado el espectro de introducción de las partículas de prión adquiridas a partir de productos expuestos a productos bovinos que contienen material infectado por BSE. Por lo tanto, para evitar la introducción de materiales (por ejemplo secuencias de ADN) dentro de la cepa blanco de origen desconocido, es preferible que todo el ADN en el vector suicida sea elaborado sintéticamente mediante fuentes comerciales (por ejemplo Picoscript, Inc.). Por consiguiente, un método preferido para la construcción de vector suicidas es ensamblar un plano de las secuencias de ADN utilizando el software DNA (por ejemplo Clone Manager), luego sintetizar el ADN en una base de tarifa por servicio mediante cualquier abastecedor comercial que ofrece dicho servicio (por ejemplo Picoscript Inc.). Este procedimiento se utilizó para diseñar y obtener el vector suicida utilizado en la sección de ejemplos a continuación. La configuración del vector suicida anteriormente descrito (figura 1 ) tiene ventajas, puesto que este plásmido contiene dos marcadores de selección por antibiótico, minimizando así la selección de mutantes espontáneos que exhiben resistencia a un antibiótico, lo cual se presenta en casi 1/108 por generación. La resistencia espontánea a dos antibióticos es extremadamente rara y solamente se presenta en casi 1/1016 por generación. Por lo tanto, existe una probabilidad menor de 1/106 de que surjan cepas resistentes dobles en los cultivos utilizados para ejecutar el procedimiento de intercambio alélico. Para la selección negativa durante el proceso de intercambio alélico, se puede incluir un gen sacB (# de ID de la Secuencia del Genoma # NT0 BS4354), que imparte un fenotipo sensible a sacarosa, para enriquecer los cultivos con cepas que han llevado a cabo el paso de recombinación final del ADN y han completado el intercambio alélico.

Cultivo de Mycobacterium. Las cepas seleccionadas de BCG se cultivan en medio líquido, tal como Middlebrook 7H9 o menos sintético Saulton, preferiblemente a 37°C. Las cepas se pueden mantener como cultivos estáticos o cultivos agitados. Además, la velocidad de crecimiento de BCG se puede mejorar mediante la adición de ácido oléico (0.06% v/v; Research Diagnostics número de catálogo 01257) y detergentes tal como Tyloxapol (0.05% v/v; Research Diagnostics número de catálogo 70400). La pureza de los cultivos de BCG se puede evaluar mediante la extensión homogénea de alícuotas de 100 mcl de los cultivos de BCG serialmente diluidos (por ejemplo diluciones 10 veces a partir del cultivo puro - 08) en solución salina con pH regulado con fosfato (en la presente invención referido con PBS) en placas de 8.9 centímetros que contienen 25-30 mi de medio sólido, tal como Middlebrook 7H10. Además, la pureza del cultivo se puede evaluar adicionalmente utilizando equipos comercialmente disponibles tal como medio de tioglicolato (Science Lab, # de catálogo 1891 ) y medio de soya-caseína (BD, # de catálogo 211768). Los lotes semilla de BCG se almacenaron a -80°C a una densidad de 0.1-2 x 107 cfu/ml. Típicamente, los cultivos líquidos se cosecharon a una densidad óptica (600 nm) de 0.2 - 4.0 en relación con un control estéril; los cultivos se colocaron dentro de tubos de centrífuga de un tamaño apropiado y los organismos se sometieron a centrifugación a 8,000 x g por 5-10 minutos. El sobrenadante se desechó y los organismos se resuspendieron en solución de almacenamiento que comprendía Middlebrook 7H9 que contenía 10-30% (v/v) de glicerol a una densidad de 0.1-2 x 107 cfu/ml. Estas suspensiones se dispersaron en viales estériles de 1.5 mi de silicato de boro para congelamiento en alícuotas de 1 mi y luego se colocaron a -80°C.

EJEMPLO 1 Construcción de las cepas rBCG-PfoA capaces de escapar del endosoma Se llevó a cabo la construcción de las cepas rBCG-PfoA capaces de escapar del endosoma mediante intercambio alélico de las regiones flanqueantes del gen ureC. Como un resultado, el segmento del gen PfoA reemplazó el gen ureC, permitiendo la expresión cromosomal estable de PfoA. Los detalles específicos se describen a continuación.

Construcción del plásmido para intercambio alélico: El plásmido de intercambio alélico se compone de los siguientes segmentos de ADN: una secuencia oriE para que el plásmido se replique en E. coli, una secuencia del gen para resistencia a canamicina parar la selección tanto en E. coli como en mi Mycobacterium, y un marcador de selección para antibiótico adicional (gen resistente a zeocina), el cual se expresa por el promotor Hsp60. El segundo marcador se utilizó para hacer una selección doble, previniendo así la resistencia espontánea a la canamicina durante el procedimiento. Para la selección negativa durante el procedimiento de intercambio alélico, se utilizó un gen para sensibilidad a sacarosa. Finalmente, las secuencias flanqueantes de 1 kb hacia izquierda y derecha del gen ureC para la cepa blanco BCG Danish 1331 se incluyeron dentro del gen PfoA en medio. El gen PfoA se expresó bajo el control del promotor Ag85B. La secuencia del péptido líder Ag85B se utilizó en lugar de la secuencia señal de secreción original PfoA para la secreción de PfoA. Finalmente, todos estos componentes se sintetizaron y ensamblaron mediante Picoscript Inc (Houston, TX). El plásmido resultante es un vector suicida micobacteriano y el mapa del plásmido que se obtuvo es como se muestra en la figura 1. La construcción del plásmido resultante se confirmó como se muestra en la figura 5.

Introducción del plásmido de intercambio alélico dentro de la cepa BCG Danisq 1331 de Mvcobacterium bovis El proceso de intercambio alélico se ilustra esquemáticamente en la figura 4, que describe los pasos principales del procedimiento. Esos pasos se describen con detalle a continuación. BCG Danish 1331 se cultivó en medio 7H9 con 10% de OADC (ácido oléico-albúmina-dextrosa-catalasa) (BD Gibco) y 0.05% (v/v) de suplementación de Tyloxapol (research and diagnostic lab). Cuando el cultivo alcanzó la fase logarítmica, las bacterias se recolectaron y se prepararon como se describió previamente (Sun et al., 2004) para eléctroporación. Cinco miligramos del plásmido de intercambio alélico se introdujeron dentro de células electrocompetentes recientemente preparadas utilizando metodologías estándares. El plásmido de intercambio alélico anteriormente construido se introdujo dentro de la cepa BCG Danish 1331 de M. bovis mediante el protocolo estándar para eléctroporación micobacteriana para Mycobacterium. Después de la eléctroporación, las células se cultivaron durante toda la noche en medio 7H9 con 10% (v/v) de OADC y 0.5% (v/v) de suplementación con Tyloxapol. Luego las células se sembraron en placas 7H10 que contenían 50 ug/ml tanto de canamicina como de zeocina fondo las colonias resultantes se seleccionaron y cultivaron en medio 7H9 que contenía 10% (v/v) de sacarosa. El cultivo obtenido se sembró en placas 7H10 la clonación, para obtener colonias individuales, que se identificaron para la presencia del gen PfoA en lugar de ureC. Un diagrama de flujo que describe los pasos principales de este procedimiento se proporciona en la figura 4, y el cuadro 1 describe el vector suicida, pAF 102, que también se ¡lustra en la figura 1.

CUADRO 1 Vector suicida utilizado en la invención El ejemplo 1 muestra que la cepa BCG de Mycobacterium se diseña genéticamente para expresar una proteína endosomolítica seleccionada que es activa a pH neutro, permitiendo el escape de la Mycobacterium a partir de los endosomas en el citoplasma de la célula.

EJEMPLO 2 Materiales y métodos para el ejemplo 2 Cultivo de Mycobacterium: Para los siguientes experimentos, las cepas BCG se cultivaron a 37°C en medio Middlebrook 7H9 (BD biosciences) con 10% de suplementación de OADC. El Tyloxapol (0.05% v/v, Research Diagnostics número de catálogo 70400) se utilizó para dispersar las bacterias. En los experimentos en los cuales el crecimiento se comparó entre diferentes cepas, se midió la densidad óptica (600 nm) a diferentes tiempos después de la inoculación. Para la prueba de sensibilidad a canamicina, el cultivo se preparó y se midió el crecimiento como se mencionó anteriormente excepto que la canamicina se añadió a una concentración final de 50 ug/ml. Cuando el medio sólido se utilizó para cultivar la bacteria, se empleo agar con Middlebrook 7H10 (BD biosciences). Cuando fue apropiado, se añadió canamicina a una concentración final de 50 ug/ml, y se añadió sacarosa a una concentración final de 3%.

Prueba de actividad de ureasa: Las colonias resultantes a partir de las placas con sacarosa descritas en el ejemplo 1 se seleccionaron inicialmente para una ausencia de actividad de ureasa utilizando un equipo para evaluación de ureasa (BD Difico) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se resuspendió una asa llena de bacterias en el regulador de pH para prueba suministrado por el abastecedor en un tubo transparente. La cepa BCG Danish 1331 se utilizó como un control positivo a ureasa. El regulador de pH solo se utilizó como el control negativo. La mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente por 30 minutos y el resultado se juzgó basándose en las instrucciones del fabricante.

Análisis del genotipo de las cepas rBCG AureC:proA. Las PCR con iniciador hacia delante [acggctaccgtctggacat] (SEQ ID NO: 4) y el iniciador reverso [cgatggcttcttcgatgc] (SEQ ID NO: 5) se llevaron a cabo para amplificar la secuencia de ADN del alelo de inserción específico de Pfo y las secuencias de ADN genómico de BCG que flanquean al gen ureC. Los parámetros de PCR fueron como sigue: paso 1 : 95°C 4 minutos un ciclo; Paso 2: 95°C un minuto, 60°C 1 minuto, y luego 72°C un minuto por un total de 30 ciclos; Paso 3: 72°C 10 minutos con un ciclo. Paso 4: almacenamiento a 4°C. Los productos resultantes de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se secuenciaron mediante técnicas de secuenciación automatizada por dideoxinucleótido, y se confirmó la presencia de un gen PfoA de longitud total en el lugar del gen de ureC (por ejemplo AureC::PfoA).

Crecimiento de AFV102 en macrófagos: El crecimiento de la cepa rBCG AFV102 in situ se evaluó en células semejantes a macrófagos J774A.1 mediante la determinación de unidades formadoras de colonia micobacterianas (CFU) en los macrófagos infectados. La eficiencia de los fagocitos micobacterianos se determinó mediante la evaluación de las CFU intracelulares tres horas después de la infección de las células J774A.1 . La supervivencia intracelular a largo plazo subsecuente se llevó a cabo mediante tisis de las células para liberar a la bacteria intracelular para la numeración de las CFU después del lavado con PBS cinco veces, como se describió previamente (Sun et al., 2004).

Análisis de la actividad hemolítica sobre Pfo expresado por AFV102: Para evaluar la secreción de PfoA por AFV102, la cepa se creció hasta la fase logarítmica media como se describió anteriormente. Luego los sobrenadante del cultivo y las bacterias se recolectaron. El concentrado bacterial de AFV102 se resuspendió en 100 ul de PBS (pH 7.0) que contenía 0.1 % de BSA en una placa del fondo en V de 96 pozos. Para evaluar si la prpteína PfoA se secretó hacia el sobrenadante del cultivo, el cultivo líquido se centrifugó y el sobrenadante se utilizó para la prueba. Para la evaluación de PfoA expresado para su actividad independiente de hemolisis, las muestras se prepararon como se mencionó anteriormente excepto que el regulador de pH PBS con diferentes valores de pH se utilizó como el regulador de pH para reacción. Se añadieron 100 ul de 1 % de eritrocitos de oveja lavados a cada uno de los pozos. La reacción se mezcló suavemente y se incubó a 37°C por 1 hora con agitación. La bacteria cepa BCG Danish 331 se utilizó como el control de hemolisis negativo. La a-hemolisina (Sigma) con unidades conocidas de actividad de hemolisina se utilizó en diluciones seriales como el control de hemolisis positivo. Después del término de la incubación, la reacción se concentró mediante centrifugación a 500 g por 15 minutos, y luego el sobrenadante a partir de la placa con fondo en V se transfirió hacia ubicaciones equivalentes en una placa de 96 pozos de fondo plano y se midió la densidad óptica (la observancia a 450 menos la observancia a 540 nm). La actividad hemolítica de la molécula PfoA se cuantificó mediante la medición de la densidad óptica del cambio de color después de la lisis de la célula roja.. La intensidad medida del color está en proporción con la cantidad de lisis de la célula roja, la cual está entonces en proporción con la cantidad de hemolisina. Los valores de las muestras se leyeron entonces a partir de una curva estándar a través del uso de estándares conocidos. Las unidades hemolíticas se definieron como las diluciones de la muestra en la cual 50% de las células rojas sanguíneas de oveja se lisaron.

Citotoxicidad de AFV102 hacia los macrofagos: La citotoxicidad de la cepa recombinante sobre los macrofagos J774A.1 (ATCC No. A TIB-67) se determinó mediante la medición de la Lactato deshidrogenasa (LDH) liberada a partir de células infectadas utilizando un equipo "Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay" (Promega, número de catálogo: G3580) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se infectaron con las bacterias AFV102 a la multiplicidad de infección de 10. A diferentes tiempos después de la infección, el sobrenadante se midió para la cantidad de liberación de LDH a partir de las células, la cual se comparó entonces con aquella de la cepa BCG Danish 1331. Las células normales no infectadas se utilizaron como el control negativo. El porcentaje de células viables se calculó basándose en la cantidad de LDH liberado a partir de las células infectadas en comparación con aquel liberada a partir de las células control negativas (100% de viabilidad celular).

Resultados para el ejemplo 2.

Construcción de AFV102: Durante la construcción de AFV102, la bacteria merodiploide seleccionada, la cual contiene el plásmido knockout total en su cromosoma vía intercambio alélico en su segmento de ADN homólogo con el plásmido knockout, se cultivaron en placas con Middlebrook 7H10 que contenían sacarosa para el intercambio alélico final para reemplazar el gen ureC por el cassette de expresión PfoA. De las colonias producidas en las placas de sacarosa, se encontró una colonia Pfo-105-5 (renombrada como AFV102) negativa a ureasa, sugiriendo que el gen ureC había sido reemplazado por el cassette de expresión PfoA. Esta colonia bacteriana se sometió adicionalmente a análisis génotípico mediante PCR para el genotipo de AureC::QpfoA. La reacción de PCR resultante se analizó mediante electroforesis en gel en un gel de agarosa al 1.2%, y los resultados se presentaron en la figura 6. Como se puede observar, la PCR utilizando esta bacteria como el molde produjo un producto de PCR del tamaño esperado, el cual es mayor que aquel de la cepa parental BCG Danish 1331. El tamaño esperado de la banda de ADN para el genotipo de AureC::QpfoA es 2180 pb, mientras que la cepa parental BCG Danish 1331 se encuentra en el tamaño de 1967 pbs. El producto de PCR para la colonia 105-5 se purificó adicionalmente mediante gel y se secuenció mediante la instalación de secuenciación comercial de la Johns Hopkins University (Baltimore, MD). La secuenciación resultante mostró que esta colonia tenía el genotipo esperado AureC::QpfoA. Además, la PCR dirigida para amplificar el gen de canamicina y el gen sacB a partir de la cepa AFV102 no pudo producir ningún producto de PCR (datos no mostrados). Estos hallazgos sugieren que AFV102 ha llevado a cabo el paso final de intercambio alélico y tuvo el genotipo deseado de AureC::QpfoA.

Caracterización del crecimiento y prueba de sensibilidad a canamicina para AFV102: basándose en la prueba de actividad de ureasa y en los resultados de genotipicación, la clona 105-5 (renombrada AFV102) exhibió el fenotipo esperado y el genotipo deseado de AureC::QpfoA. AFV102 se evaluó entonces adicionalmente por su capacidad para crecer en medio de crecimiento 7H9 en comparación con aquel de la cepa parental BCG Danish 1331. El resultado se muestra en la figura 7. Como se puede observar, la construcción AFV102 tiene una curva de proliferación muy similar en el medio de crecimiento 7H9 con respecto a la cepa parental. Además, en la presencia de canamicina, el crecimiento de AFV102 declinó en un grado similar a aquel que la cepa parental BCG Danish 1331 , sugiriendo que, como se esperaba, tuviera una sensibilidad similar a la canamicina.

Citotoxicidad de AFV102: Se ha reportado que un cambio particular de aminoácidos en la proteína PfoA (mutación de sustitución en el codón 137 a partir de gga, que codifica Gly, hacia cag, que codifica Gln) resulta en la pérdida de toxicidad a las células de mamífero. Incluso la proteína retiene la capacidad de mediar el escape bacteriano a partir de una vacuola (Portnoy anteriormente mencionado, 1996). La toxicidad de la proteína expresada a partir de AFV102 se evaluó mediante la infección de las células J7741A con la bacteria AFV102. Cuando se comparó con la célula normal no infectada control a diferentes puntos de tiempo después de la infección, AFV102 no ocasionó ninguna muerte celular más significativa que la cepa de vacuna BCG Danish 1331 actualmente utilizada (figura 8). Supervivencia en una línea celular de macrófago alveolar: Para investigar si la construcción es capaz de sobrevivir en los macrófagos, se utilizaron los cultivos de fase logarítmica media para infectar a los macrófagos alveolares J774A.1. Las células se infectaron con una multiplicidad de infección (MOI) de 1 :1. La supervivencia intracelular de la Mycobacterium se monitoreó mediante conteo de placas de la bacteria a diversos intervalos de tiempo después de la infección. Como se puede observar en la figura 9, la construcción AFV102 mostró un fenotipo persistente similar a aquel que la cepa parental, sugiriendo que no había un defecto en la sobrevivencia intracelular de esta construcción en las células J774A.1.

Secreción de la proteína PfoA por AFV102: La secreción de la proteína PfoA por las bacterias que contienen la construcción AFV102 se evaluó mediante la medición del sobrenadante de cultivo bacteriano para actividad hemolítica mejorada en comparación con aquella de la cepa BCG Danish 1331. Los sobrenadante de cultivo para ambas cepas AFV102 y BCG Danish 1331 se cosecharon a la misma densidad óptica y se compararon por su capacidad para lisar las células rojas sanguíneas. Los resultados se muestran en la figura 10. Consistente con el reporte previo, el sobrenadante de cultivo de BCG exhibió un nivel de línea basal de la actividad hemolítica como un resultados de los metabolitos liberadores de la bacteria durante el crecimiento, que puede resultar en lisis de la célula roja (Grade et al., Journal of Clinical Investigation, 1 15: 2472-2479; 2005). En contraste, el sobrenadante de cultivo del AFV102 tuvo un nivel significativamente superior de actividad hemolítica en comparación con aquella de la cepa BCG Danish 1331 , consistente con la secreción de las moléculas PfoA dentro del sobrenadante de cultivo. Además, la actividad hemolítica independiente de pH de la PfoA se evaluó adicionalmente y que comparó tanto a pH 5.5 como a pH 7.0, y los resultados se muestran en la figura 10. Como se puede observar, el sobrenadante a partir de AFV102 tuvo una capacidad hemolítica similar tanto a pH 5.5 como a pH 7.0, sugiriendo que la actividad hemolítica secretada por la proteína PfoA es independiente de pH, como se esperaba. El ejemplo 2 muestra que la cepa construida tuvo las actividades biológicas pronosticadas, y que Pfo que se elabora por la cepa se secreta y tiene actividad independiente del pH.

EJEMPLO 3 Escape endosomal de rBCG-PfoA y prueba de inmunogenicidad animal Un paradigma central de la patogénesis de Mycobacterium tuberculosis es el paro de la maduración fagosomal. Armstrong y Hart (1971 ) establecieron que los fagosomas de M. tuberculosis no se mezclan con los lisosomas marcados con ferritina, en referencia con la inhibición de la fusión del fagosoma-lisosoma. También se encontró que la cepa de vacuna M. bovis (BCG) reside en el compartimiento fagosomal, secuestrado de los organelos endocíticos terminales (Clemens y Horwitz, 1995; Hasan et al., 1997; Via et al., 1997). Clemens y Howitz (1995) encontraron que los fagosomas micobacterianos se teñían persistentemente para el receptor a transferrina (TfR) a densidades similares a aquellas en la membrana plasmática. El receptor de transferrina típicamente se removió de manera rápida (t1/2 en minutos) a partir de los endosomas y se transportó de vuelta a la membrana plasmática; sin embargo, en los fagosomas micobacterianos este procedimiento se detiene y los fagosomas contendrán el receptor de transferrina. Es este fenómeno el que permitió a los inventores visualizar los fagosomas que contienen micobacterias. Los fagosomas se marcaron con anticuerpos al receptor de transferrina. Al mismo tiempo, las micobacterias se tiñeron con un colorante fluorescente que permite monitorear de manera visual el destino de las bacterias una vez dentro del fagosoma. Los resultados mostraron que la construcción rBCG-Pfo fue capaz de escapar al endosoma después de infectar a las células.

Materiales y métodos para prueba de escape endosomal: Bacterias y células: BCG Danish 1331 y rBCG-AureC::QpfoAGi37Q (AFV102) se crecieron en medio 7H9 con 10% (v/v) de OADC y 0.05% (v/v) de suplementación con Tyloxapol (del medio de crecimiento) a una DO60O de aproximadamente 0.8 - 1 .0. Antes de la infección, las células bacterianas se marcaron con succinimidil éster de Alexa Fluor 568 (Molecular Probes, Eugene, OR) en PBS a temperatura ambiente por 1 -1 .5 horas de conformidad con las instrucciones del fabricante. Este colorante forma enlaces amida muy estables con respecto a las aminas primarias localizadas en las proteínas en la superficie bacteriana. Brevemente, 10 mi del cultivo bacteriano se concentraron y se resuspendieron en 25 mi de 0.625 ug/ml de Alexa Fluor 568 en PBS (pH 7.2) y se incubaron a temperatura ambiente por 1 -1 .5 horas para marcar las bacterias. Las células bacterianas marcadas se lavaron entonces tres veces con PBS y se resuspendieron en medio de crecimiento 7H9 y se almacenaron en el refrigerador durante toda la noche. Las células J774A.1 se cultivaron en medio DMEM como se describió previamente (Sun et al., 2004) en placas de cultivo celular de 6 pozos sobre cubreobjetos revestidos con fibronectina de humano. Las células se sembraron a una densidad de 3x106 células/pozo y se cultivaron por 2 días en una incubadora a 37°C con 5% de CO2 y humedad. Durante la infección, las bacterias marcadas se concentraron y resuspendieron en medio DMEM + 10% de FBS y se añadieron directamente a las células J774A.1 con una multiplicidad de infección (MOI) de 10 para cada célula. Después de 20 minutos, ocho horas y 24 horas, las células se lavaron con solución salina con pH regulado con fosfato (PBS , pH 7.2) a temperatura ambiente (RT - por sus siglas en inglés). Luego las células se fijaron por 20 minutos a temperatura ambiente con 2% de paraformaldehído en PBS (pH 7.2). Las células fijadas se permeabilizaron entonces con 0.1 % de tritón X-100 en PBS (pH 7.2) por 10 minutos a temperatura ambiente seguido por lavado dos veces con PBS (pH 7.2). El bloqueo se realizó por al menos 2 horas a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4°C con 3% de albúmina de suero de bovino (BSA), 5% de suero normal de cabra (NGS - por sus siglas en inglés), y 0.5% de azida de sodio en PBS (pH 7.2). El regulador de pH para bloqueo se removió y luego se añadió receptor de transferrina de rata anti-ratón marcado con FITC (US Biological, Swampscott, MA) a una dilución de 1 :50 en PBS (pH 7.2) que contiene 1% de BSA, 3% de NGS, y 0.5% de azida de sodio seguido por incubación a temperatura ambiente por al menos 1 hora. Las células se lavaron entonces 2-3 veces con PBS y se montaron con medio para montaje vectsheils sobre portaobjetos de vidrio. Los análisis se realizaron a una amplificación de 1500 utilizando un microscopio invertido Nikon TE20O0 el citado con Retiga EXI Mono, sistema de refrigeración de trépano 12, cámara digital con filtro IR para formación de imágenes. Resultado: Cuando se examinaron bajo el microscopio, tanto la bacteria BCG como la bacteria rBCG-PfoA se encontraron internalizadas por las células del hospedero 15 minutos después de la infección. Sin embargo, a las 8 horas después de la infección, las bacterias rBCG-PfoA se encontraron fuera del endosoma, en contraste con las bacterias BCG, las cuales se encontraron principalmente localizadas dentro del fagosoma del hospedero. Estos resultados se ilustran esquemáticamente en las figuras 11A-11 D, que ilustran la invasión bacteriana de un macrófago (figura 11 A), persistencia de BCG dentro del endosoma (figura 1 B), bacterias AFV102 dentro de un endosoma temprano (figura C) y bacteria AFV102 que escapa a partir del endosoma hacia el citoplasma de la célula (figura 11 D) debido a la secreción de PfoA recombinante. La enumeración de las bacterias mostró que 100 AVF102 de 138 habían escapado al endosoma (72%) después de 8 horas post-infección, mientras que solamente 29 BCG de 100 (26%) habían escapado del fagosoma. El examen de las bacterias en la muestra 24 horas post-infección produjo un resultado similar. Este hallazgo muestra que la expresión de PfoA incrementa la liberación de AVF 02 a partir de los fagosomas. La confirmación adicional de este resultado se llevó a cabo utilizando un sistema diferente en el cual un colorante sensible a pH se utilizó para marcar endosomas y lisosomas (Lysotracker-Red, Molecular probes, número de catálogo L-7528) bajo un ajuste experimental similar y procedimiento como se mencionó anteriormente. Las bacterias se visualizaron a emisiones de longitud de onda de 568, mientras que los fagosomas se visualizaron a emisiones de longitud de onda de 488. El resultado fue consistente con las observaciones anteriormente mencionadas. El ejemplo 3 muestra que la cepa recombinante AVF102 fue capaz de escapar del endosoma mientras que la cepa BCG fue mucho menos eficiente para escapar del endosoma. Por lo tanto, la cepa AVF102 es mucho más probable que induzca una respuesta inmune por el complejo de inmunocompatibilidad clase I que BCG, y podría ser útil en las aplicaciones de vacuna.

Referencias para el ejemplo 3 Armstrong J, Hart PD. 1971. Response of cultured macrophages to Mycobacterium tubercolosis, with observations on fusión of lysosomes with phagosomes. J Exp Med. 134: 713-40. Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7. Infect Immun. 68 (9): 5 54-66. Hasan Z, Schlax C, Kuhn L, Lefkovits I, Young D, Thole J, Pieters J. 1997.lsolation and characterization of the mycobacterial phagosome: segregation from the endosomal/lysosomal pathway. Mol Microbiol 25 (2): 427 Via LE, Deretic D, Ulmer RJ, Hibler NS, Huber LA, Deretic V. Arrest of mycobacterial phagosome maturation is caused by block in vesicle fusión between stages controlled by rab5 and rab7. J Biol Chem. 1997: 272 (20): 13326-31. Sun R, Converse PJ, Ko C, Tyagi S, Morrison NE, Bishai WR. 2004. Mycobacterium tuberculosis ECF sigma factor sigC is required for lethality in mice and for the conditional expresión of a defined gene set. mol Microbiol. 52 (1 ): 25-38.

EJEMPLO 4 Estrategias de formulación y vacunación La estrategia de formulación de vacuna se basa en estudios para determinar la viabilidad máxima y estabilidad a través del proceso de elaboración. Esto incluye la determinación de una viabilidad máxima del organismo (vivo a muerto) durante el cultivo utilizando una variedad de medios comúnmente utilizados para el cultivo de Mycobacteria para incluir la adición de glicerol, azúcares, aminoácidos, y detergentes o sales. Después del cultivo, las células se cosecharon mediante centrifugación o filtración en flujo tangencial y se resuspendieron en un medio para estabilización que permite la protección de las células durante congelamiento o secado por congelamiento. Los agentes estabilizantes comúnmente utilizados incluyen glutamato de sodio, aminoácidos o derivados de aminoácidos, glicerol, azúcares y sales comúnmente utilizadas. La formulación final proveerá organismos adecuadamente viables para ser administrados vía administración intradermal, inyección percutánea, perfusión o administración oral con estabilidad adecuada para mantener una vida de anaquel adecuada para su distribución y uso.

Evaluación preclínica de vacunas de TB Prueba de seguridad general Los ratones BALB/c en grupos de seis se infectaron intraperitonealmente con 2 x106 CFU de la cepa(s) de rBCG de interés y las cepas parentales análogas. Los animales se monitorearon para controlar su salud general y su peso corporal por 14 días después de la infección. Los animales que recibieron las cepas BCG y rBCG permanecieron sanos, y ninguno perdió peso ni exhibió signos evidentes de enfermedad durante el periodo de observación.

Virulencia de las cepas novedosas de rBCG en ratones inmunocompetentes. Se infectaron intravenosamente grupos de 15 ratones BALB/c inmunocompetentes con 2x106 de rBCG y la cepa parental BCG respectivamente. En el día 1 después de la infección, se sacrifican tres ratones en cada grupo y se analizaron las CFU en el bazo, pulmón e hígado y se analizaron para asegurar que cada animal tenía una dosis de infección igual. A la semana 4, 8, 12, y 16 después de la infección, se sacrificaron tres ratones en cada grupo y se obtuvieron las CFU en el bazo, hígado y pulmón para evaluar el crecimiento in vivo de las cepas rBCG en comparación con la cepa parental de BCG. Se esperaba que las cepas de rBCG exhibieran una virulencia similar a aquella que la cepa parental de BCG.

Prueba de seguridad severa en ratones inmunocomprometidos Los ratones inmunocomprometidos que poseían la SCID (inmunodeficiencia severa combinada) en grupos de 10 se infectaron intravenosamente con 2x106 cfu de rBCG y con la cepa parental de BCG respectivamente. En el día 1 después de la infección, se sacrificaron tres ratones en cada grupo y se evaluaron las cfu en el bazo, hígado y pulmón para verificar las dosis de inoculación. Los siete ratones remanentes en cada grupo se monitorearon para salud general y peso corporal. La supervivencia de estos ratones es seguida y los resultados exitosos son cuando la supervivencia de los ratones infectados con rBCG se compara con aquella del animal infectado con la cepa parental en todo el periodo de observación.

Prueba de seguridad en conejillo de Indias La seguridad de las cepas de rBCG también se evaluó en el modelo de conejillo de Indias en comparación con la vacuna parental de BCG, la cual tiene un perfil de seguridad bien establecido en los humanos. Primero, se examinó el efecto de la vacuna sobre el estado de salud general de los animales, incluyendo ganancia de peso. Los conejillos de Indias se inmunizaron intramuscularmente con 107 (100x de dosis de vacunación) CFU de las cepas recombinantes y parentales, y los animales se monitorearon para salud general y peso corporal por seis semanas. El examen post mortem se llevó a cabo para animales que murieron antes del período de seis semanas. Todos los animales se sacrificaron al término de la infección después de seis semanas y se llevó a cabo un examen patológico general. No se presentó pérdida de peso corporal, ni conducta anormal y todos los órganos se observaron normales en la necropsia después de 6 semanas. Una prueba exitosa se indica cuando no se observan efectos adversos a la salud a partir de la vacuna rBCG-Pfo, y los animales vacunados con rBCG-Pfo ganan peso a la velocidad normal en comparación con los animales inoculados con la cepa pa renta I. Al mismo tiempo, se monitorearon los niveles bacterianos en los órganos del animal. Los conejillos de Indias inmunizados ya sea con la vacuna parental o con la vacuna recombinante se sacrificaron a diversos intervalos después de la inoculación, después de lo cual los pulmones, vasos, y nodulos linfáticos regionales (inguinales) se ensayaron para CFU de BCG o rBCG.

Prueba de toxicidad: Para evaluar la toxicidad de las cepas rBCG, los conejillos de Indias (12 en cada grupo) se vacunaron intradermalmente con 1 dosis, cuatro veces mayor que la dosis particular o cuatro veces menor que la dosis particular de las cepas rBCG para uso en humano, la cepa parental de BCG o solución salina respectivamente. En el día 3 después de la vacunación, se sacrificaron seis animales para evaluar los efectos agudos de la vacunación en estos animales. Al día 28 después de la vacunación, los seis animales remanentes se sacrificaron para evaluar los efectos crónicos sobre los animales. En ambos puntos de tiempo, se obtuvo el peso corporal de cada animal, y se examinaron la patología general y la apariencia de los sitios de inyección. La sangre se tomó para química sanguínea, y se llevó a cabo la histopatología de los órganos internos y de los sitios de inyección.

Estudio de protección en murino. Los ratones C57BI/6 (hembras, -6 semanas de edad) en grupos de 13 se inmunizaron subcutáneamente con 06 CFU de rBCG, BCG parental o solución salina. Otro grupo de ratones se utilizó como controles sanos. Ocho semanas después de la inmunización, los ratones se probaron con la cepa M. tb Erdman (o la cepa resistente a canamicina H37Rv) mediante un aerosol generado a partir de una suspensión de 10 mi de célula particular que contenía un total de 107 CFU de la cepa para prueba, una dosis que suministra -100 bacterias vivas a los pulmones de cada animal, como se describió previamente (Brodin et al., J Infect Dis., 190 (1 ): 115-122; 2004). Los animales experimentales se monitorearon para supervivencia junto con animales no probados. Después de la prueba, los animales se monitorearon para pérdida de peso y salud general. Al día 1 después de la prueba, se sacrificaron tres ratones en cada grupo para monitorear la cantidad de CFU en pulmón para confirmar la dosis de la prueba y un animal se sacrificó para llevar a cabo la histopatología de bazo y pulmón. Cinco semanas después de la prueba, se sacrificaron nueve animales en cada grupo, y se llevaron a cabo los análisis de histopatología y microbiología del animal. Los tejidos de pulmón y de bazo a partir de seis ratones se evaluaron para cuentas de CFU (las placas con suplementos para selección se utilizaron para distinguir la cepa de vacuna a partir de la cepa para prueba). Si se probaba con una cepa resistente a canamicina H37Rv, se utilizaba Kan o TCH (hidrazida del ácido tiofen-2-carboxílico) para distinguir la cepa de prueba a partir de la cepa de vacuna. Si la cepa M. tb Erdman se utiliza para la prueba, entonces TCH se utiliza para distinguir la cepa de vacuna a partir de la cepa de prueba (BCG es susceptible, pero M. tb es resistente de manera natural).

Inducción de hipersensibilidad cutánea de tipo retrasado (DTH -por sus siglas en inglés). Los conejillos de Indias libres de patógenos específicos (SPF - por sus siglas en inglés) se inmunizados intradermalmente con 103 de las cepas de rBCG o de las cepas parentales de BCG. Nueve semanas después de la inmunización, a los animales se les rasuró la parte trasera y se inyectaron intradermalmente con 10 ug de PPD (derivado de proteína purificada) en 100 ul de solución salina con pH regulado con fosfato. Después de 24 horas, se midió el diámetro de la induración. Las cepas de rBCG deben inducir una DTH igual a o mayor que aquella inducida por las cepas parentales de BCG.

Estudio de prueba en conejillo de Indias. Para determinar la eficiencia del vector de Mycobacterium en contra de la prueba con M. tb, se inmunizaron conejillos de Indias (SPF Hartley, adultos jóvenes, 250-300 gramos, machos) en grupos de 12, cada uno con la cepa de rBCG, la cepa parental de BCG o con solución salina. Las vacunas y los controles se administraron intradermalmente con 106 cfu. A las 10 semanas después de la inmunización, los animales inmunizados con rBCG-, BCG- e inmunizados sin el uso del antígeno fueron probados mediante aerosol con el M. tb mediante un aerosol generado a partir de 10 mi de una suspensión de celular particular que contenía un total de 07 cfu de M. tb; este procedimiento suministra -100 bacterias vivas a los pulmones de cada animal, como se describió previamente (Brodin et al., 2004). Después de la prueba, los animales se monitorearon para supervivencia, pérdida de peso- y salud general junto con un grupo sano de animales no vacunados, no probados. Se sacrificaron seis animales en cada grupo a las 10 semanas después de la prueba y se sacrificaron los seis animales remanentes en cada grupo a las 70 semanas después de la prueba para la evaluación a largo plazo. En ambos puntos de tiempo, se llevaron a cabo análisis de histopatología y microbiología del animal. Se evaluaron los tejidos de pulmón y de bazo para histopatología y contenido de CFU (las placas con suplementos para selección se utilizaron para distinguir la cepa de vacuna a partir de la cepa de prueba). Si se probaba con una cepa resistente a canamicina H37Rv, Kan o TCH se utilizaba para distinguir la cepa de prueba a partir de la cepa de vacuna. Si la cepa M. tb Erdman se utilizaba para la prueba, TCH se utilizaba para distinguir la cepa de vacuna a partir de la cepa de prueba (BCG es susceptible pero M. tb es resistente de manera natural). Para un estudio de prueba exitoso, los animales inmunizados sin el antígeno morían más rápidamente después de la prueba, y los animales inmunizados con rBCG sobrevivían más tiempo que los animales inmunizados con la cepa parental de BCG.

Seguridad para el primate y estudio de prueba. Más recientemente, los primates no humanos se han utilizado para la evaluación de las vacunas en contra de M. tb. La relación evolutiva entre los humanos y los primates no humanos y las manifestaciones clínicas y patológicas similares de la tuberculosis en estas especies ha hecho que el modelo de primate no humano sea atractivo para los estudios experimentales de enfermedad por TB y eficiencia de la vacuna. Este modelo, caracterizado por el desarrollo de cavidades en el pulmón, parece ser aplicable a la TB de humano. El curso de la infección y la enfermedad es seguido por análisis de rayos X y pérdida de peso, así como por una variedad de pruebas hematológicas, incluyendo velocidad de sedimentación del eritrocito (ESR - por sus siglas en inglés), proliferación de la célula mononuclear de sangre periférica (PBMC - por sus siglas en inglés) y producción de citoquina, actividad de linfocito T citotóxico (CTL - por sus siglas en inglés), y respuestas al anticuerpo. Después de la infección, el mono cynomolgus desarrolla patología pulmonar con lesiones características, y, dependiendo de las dosis evaluadas, se presenta la muerte debido a la infección respiratoria aguda en un periodo de cuatro a seis meses después de la infección. Dosis menores de infección pueden producir infecciones crónicas sin enfermedad, muy semejante en los humanos.

El estudio compara directamente dosis variables de la cepa parental de BCG contra la cepa recombinante de BCG administrada ya sea sola o después de dos refuerzos subsecuentes con la vacuna que comprende las secuencias que se sobre-expresan en las construcciones de rBCG. Esta última se administra mediante cualesquiera de los diversos medios conocidos, incluyendo pero no limitados a: una proteína recombinante basada en una formulación adyuvante adecuada, como ADN o como una construcción de Ad35. El primer estudio evalúa la eficiencia protectora de la BCG parental contra las construcciones de rBCG sin un refuerzo. Este estudio comprende tres grupos con 10 animales en cada grupo: cada uno de los grupos comprendiendo BCG, rBCG y solución salina. Dos animales a partir de cada grupo fueron evaluados en la piel con los antígenos sobre-expresados en las construcciones rBCG así como con PPD estándar y solución salina como controles. Una induración positiva y más larga en el grupo de rBCG en comparación con el grupo de BCG es indicativa de una toma de vacuna in vivo y de la inducción de una respuesta inmune. Los ocho animales remanentes a partir de cada grupo se probaron mediante aerosol con una baja dosis de la cepa M. tb Erdman y se midió la protección mediante la reducción de la carga bacteriana a las 16 semanas después de la prueba o con la supervivencia como el punto terminal. El siguiente protocolo de cebado con BCG es esencialmente el mismo como se mencionó anteriormente excepto que los animales son vacunados inicialmente con BCG, rBCG y solución salina, seguido por dos refuerzos con los antígenos sobre-expresados. El estudio de inmunogenicidad y de protección en el modelo de primate no humano investiga los aspectos inmunobiológicos e inmunopatológicos de la tuberculosis en macacos para estudios de eficiencia con respecto a las construcciones de rBCG. Los animales son juveniles a adultos jóvenes criados en cautividad con un peso promedio de 2 a 3 kg que han sido condicionados extensivamente antes del inicio del experimento. Los estudios de pre-inoculación incluyen pruebas de línea basal en sangre que incluyen estudios hematológicos de rutina y velocidades de sedimentación del eritrocito así como ensayos de proliferación del linfocito. La prueba en la piel se realizó con PPD para asegurar que la ausencia de sensibilidad a la tuberculina y a los rayos X en caja torácica se obtienen como parte del perfil de pre-infección. El periodo de inmunización durará 21 semanas en total, abarcando la vacunación primaria con BCG o rBCG a la semana = 0 y refuerzos con el antígeno a las semanas 12 y 16. La inmunidad específica del antígeno se evaluó mediante medición de la proliferación y secreción del interferón ? (IFNy) en pruebas de estimulación en linfocito. La frecuencia de producción de IFNy en linfocitos se determinó mediante el ensayo inmunosorbente asociado a enzima (ELISPOT) o una clasificación celular activada por florescencia (FACS - por sus siglas en inglés). Para este fin, se retiraron muestras de sangre a las semanas 0, 4, 8, 12, 16 y 20 en relación con la vacunación primaria.

Cuatro a seis semanas después de la última inmunización, los animales fueron probados mediante instilación intratraqueal de 3 mi (1 ,000 cfu) de la M. tuberculosis Erdman en el mismo día y con la misma preparación. El curso de la infección será evaluado para pérdida de peso, fiebre, relación de sedimentación elevada del eritrocito (ESR), DTH a PPD, respuesta proliferativa in vitro de PBMC estimuladas con PPD y sobre-expresión de los antígenos en rBCG seguido por las mediciones de los niveles de producción de IFN-g. Los rayos X de la caja torácica se llevarán a cabo para detectar anormalidades consistentes con la TB pulmonar, y finalmente, necropsia a las 12-16 semanas después de la prueba.

Evaluación clínica de vectores y vacunas de TB Seguridad y estudios de toxicidad: La seguridad preclínica y los estudios de toxicidad son obligatorios según las guías reguladoras y se llevan a cabo de conformidad con la toxicología preclínica y estudios de seguridad como se describió anteriormente. Después de estos estudios, se llevan a cabo los estudios de seguridad en humano. Estos estudios se llevan a cabo ¡nicíalmente en adultos saludables negativos a Quantiferon, seguido por una escala en la edad hacia niños y neonatos.

Estudios de inmunogenicidad: se pueden utilizar los estudios de inmunogenicidad en ratones y primates pero no se limitan a métodos estándares para la evaluación de la inmunidad celular tales como INFy, ELISPOT y/o citometría de flujo con antígeno de corto y largo plazo o estimulación del péptido. Las metodologías similares se utilizan para la evaluación de las respuestas en humano. Los estudios con tetrámero se emplean para la evaluación de las respuestas de CD4 y CD8 después de la vacunación de humanos.

Optimización de las estrategias de refuerzo de la cebadura: rBCG funciona bien como una vacuna estándar sola en contra de la TB u otras enfermedades para las cuales se ha diseñado para que exprese aritígenos relevantes. rBCG como se describe en la presente invención como una vacuna para la TB o que expresa antígenos para proteger en contra de otras enfermedades también funciona extremadamente bien para cebar el sistema inmune para inmunización por refuerzo con proteínas recombinantes mezcladas con adyuvantes, o antígenos que se comportan como vectores virales o bacterianos. Tanto en estudios preclínicos en animal como en estudios en humano, la cebadura por BCG seguida por proteína recombinante/adjuvante o refuerzos del vector se optimiza en términos de regímenes y dosis. Estas estrategias de refuerzo de la cebadura son los medios más potentes para inducir inmunidad en humanos debido a la potencia de la cebadura por BCG incluida en la presente invención, seguida por enfoque y mejoría de la respuesta al refuerzo del sistema inmune por una proteína recombinante o vector.

Estudios después de la exposición a la vacuna terapéutica en animales. Los ratones C57BL/6 pero no limitados a este animalito serán utilizados para el establecimiento de la infección latente; las vacunas terapéuticas fueron proporcionadas a los ratones en un punto de tiempo cuando solamente se había inducido una inmunidad insignificante específica de M. tb mediante infección con una dosis baja y en un punto de tiempo posterior cuando la inmunidad específica del M. tb inducida y disminuida predomina en las células T de memoria. Entonces, el beneficio terapéutico de las vacunas fue evaluado entonces en ratones 2 y 5 meses después de la última administración de la vacuna terapéutica mediante la enumeración de las cuentas de CFU en pulmones y bazos de los ratones individuales. Las cuentas de cfu se analizaron mediante métodos estándares estadísticos en los grupos de ratones y los resultados se utilizaron para observar si la vacunación terapéutica reduce significativamente la infección latente por . tb en ratones. Metodologías similares se utilizan para la evaluación de las respuestas de otros animales cuando es necesario.

Evaluación clínica de los vectores de BCG: administración oral de las vacunas de rBCG. La vacunación oral del animal blanco con el vector de Mycobacterium de la presente invención se puede lograr utilizando métodos previamente descritos (Miller et al., Can Med Assoc J 121 (1 ): 45-54; 1979). La cantidad oralmente administrada de rBCG de la presente invención variará dependiendo de las especies del sujeto, así como la enfermedad o condición que se va a tratar. Generalmente, la dosis empleada será de aproximadamente 103 a 101 organismos viables, y preferiblemente de aproximadamente 105 a 109 organismos viables. Las rBCG generalmente se administran junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. El vehículo o diluyente particular aceptable farmacéuticamente empleado no es crítico para la presente invención. Los ejemplos de diluyentes incluyen una solución salina con pH regulado con fosfato, regulador de pH para regular el pH en contra del ácido gástrico en el estómago, tal como regulador de pH con citrato (pH 7.0) que contiene sacarosa, regulador de pH con bicarbonato (pH 7.0) sólo (Levine et al., J. Clin. Invest, 79: 888-902; 1987; y Black et al., J. Infect. Dis., 155: 1 260-1265; 1987), o regulador de pH con bicarbonato (pH 7.0) que contiene ácido ascórbico, lactosa, y opcionalmente aspartame (Levine et al., Lancet, II: 467-470; 1988). Los ejemplos de vehículos incluyen proteínas, por ejemplo, como se encuentran en la leche descremada, azúcares, por ejemplo, sacarosa, o polivinilpirrolidona. Típicamente estos vehículos se utilizan a una concentración de aproximadamente 0.1 -90% (p/v) pero preferiblemente se utilizan en un intervalo de 1 -10% (p/v).

EJEMPLO 5 Seguridad en ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) Como se mencionó anteriormente, la expresión de Lio en BCG probó ser relativamente ineficiente para promover el escape del endosoma, probablemente debido a la baja actividad de Lio a pH neutro del ambiente del endosoma modificado en el cual reside BCG (Hess, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 95: 5299; 1998; Grade et al., J. Clin. Invest, 115 (9): 2472; 2005). Sin embargo, la expresión de Lio aparente modifica cual endosoma lo suficientemente para reducir la virulencia de BCG-Llo+ en los ratones SCID (Grode et al., 2005). Esta observación sugiere que el redireccionamiento de BCG hacia el citoplasma de las células hospederas tiene el potencial de mejorar tanto la inmunogenicidad como la seguridad de esta vacuna TB viva antigua. Por lo tanto, el objetivo de este estudio, es determinar la seguridad de la cepa AFV102 que escapa al endosoma la cual expresa PfoAci37Q en ratones SCID. Para este fin, las cepas parentales BCG Danish 1331 (BCG1331 ) y el derivado de BCG1331 que expresa PfoAGi37Q, cepa AFV102 se crecieron en matraces de 2 L con agitación (150 oscilaciones por minutos) hasta una fase logarítmica tardía (densidad óptica a 450 nanómetros de 6.5-7.5). Las bacterias se cosecharon mediante la cosecha por centrifugación y almacenamiento a 1 .5 x 109 cfu/ml a -80°C en solución salina + 0.05% (v/v) de tyloxapol + 10% (v/v) de glicerol.

Los inóculos se prepararon mediante el descongelamiento de los viales de almacenamiento anteriormente mencionados en hielo y se elaboraron series de diluciones seriales en solución salina normal (0.85% c/s NaCI) libre de endotoxina (<0.05 UE/ml). Se utilizaron tres diluciones para inocular grupos de 6 ratones SCID subcutáneamente con las dosis respectivas mostradas en el cuadro 2 a continuación suspendidas en un volumen de 0.1 mi.

CUADRO 2 Diseño de estudio de seguridad para ratón SCID Después de la inoculación, los ratones se monitorearon para supervivencia durante un período de 100 días después de la inoculación. Los resultados de este estudio muestran que los ratones inoculados con AFV102 sobreviven más tiempo que los ratones que recibieron las dosis análoga de Recientemente ha ganado atención el uso de una vacuna de refuerzo heteróloga para reforzar la inmunidad inducida por BCG. Por lo tanto, los animales de laboratorio y los humanos cebados con BCG desarrollan respuestas inmunes celulares impresionantes después de un refuerzo heterólogo que comprende una vacuna modificada Ankara (MVA) que codifica el antigeno Mtb 85A (en la presente invención "Ag85A"; también conocido como Rv3804c; Vordemeier et al., Immunol. 112 (3): 461 ; 2004; McShane et al., Nature Med. 10 (11 ): 1240; 2004); en contraste, los individuos sin afección desarrollan respuestas relativamente poco impresionantes al vector MVA-Ag85A (McShane et al., 2004). Además, existen estudios independientes que muestran que los animales de laboratorio cebados con BCG y reforzados con cualquier MVA-Ag85A (Williams et al., Infecí Immun. 73 (6): 3814; 2005) o con la subunidad de la vacuna Mtb72f (Brandt et al., Infect. Immun. 72 (11 ): 6622; 2004) desarrollan grandes niveles de resistencia a una prueba con Mtb que aquellos logrados mediante la activación con BCG solo como un refuerzo de apoyo para este método. Aunque estos estudios no definen las correlaciones de protección, es evidente que las estrategias de vacunación con refuerzo por cebado heterólogo ofrecen un medio efectivo para invocar protección en contra del Mtb. El objetivo de este y del siguiente ejemplo, por lo tanto, es evaluar la cepa para escape del endosoma AFV102 en un régimen de vacunación con refuerzo de cebado. El objetivo del experimento en este ejemplo es optimizar el intervalo en un régimen de refuerzo de cebado en el cual la cepa que escapa del endosoma AFV 02 se utiliza como el sebo y un vector tipo vacuna serotipo 35 adenovirus deficiente replicación (Vogels et al., J Virol. 77 (15): 8263-71 ; 2003; barouch et al., J. Immunol. 172 (10): 6290; 2004) el cual contiene un cassette de expresión que codifica una proteína de fusión que comprende genes Mtb Rv3804c-Rv1886-Rv0288 bajo el control del promotor temprano del citomegalovirus (Vogels et al., J. Virol. 77 (15): 8263-71 ; 2003) que se utiliza como el refuerzo. El refuerzo se administra mediante la ruta intranasal (in), puesto que los antígenos TB para expresión de adenovirus son más efectivos por esta ruta que las rutas de administración parenterales convencionales (Wang et al., J. Imunol. 173 (10): 6357; 2004). Por consiguiente, los grupos de 10 conejillos de Indias Hartley machos SPF (250-300 gramos) se inmunizaron como se muestra en el cuadro 3 de manera que se evaluaron a los intervalos de 14, 18 y 21 semanas del refuerzo con sebo.

CUADRO 3 Diseño de estudio para régimen con conejillo de Indias Nota: Ad35-TBS denota un vector de vacuna serotipo 35 de adenovirus deficiente en replicación (Vogel et al., J. Virol. 77 (15): 8263-71 ; 2003; barouche et al., J. Immunol. 172 (10): 6290; 2004) el cual contiene un cassette de expresión que codifica una proteína de fusión comprendida de los genes Mtb Rv3804c-Rv1886-Rv0288 bajo el control del promotor de citomegalovirus temprano (Vogels et al., J. Virol. 77 (15): 8263-71 ; 2003). Los cebados se administran intradermalmente a una dosis de 106 cfu en 0.1 mi de glicerol al 10%. A los ratones control se les proporcionó 0.1 mi de glicerol al 10% solamente de manera intradermal. A las 14 semanas después de la cebado, a los conejillos de Indias se les proporcionó un cebado que comprende Ad35-TBS y se administraron intranasalmente a una dosis de 109 unidades formadoras de placa (por ejemplo Vogels et al., 2003; Barouche et al., 2004) suspendida en 10 ul de PBS. A las 14 semanas después del refuerzo, los animales fueron probados mediante aerosol con Mtb cepa Erdman mediante un aerosol generado a partir de 10 mi de una suspensión de célula particular que contenía un total de 107 cuf de Mtb, éste procedimiento suministra -100 baterías vivas a los pulmones de cada animal, como se describió previamente (Brodin et al., 2004). A las 5 semanas después de la prueba, los animales en cada grupo fueron sacrificados y los pulmones y bazos fueron recolectados para análisis histológico y microbiológico. En el último caso, los tejidos de pulmón y de bazo a partir de los conejillos de Indias fueron evaluados para contenidos de cfu. Puesto que la cepa Mtb Erdman se utiliza para la prueba, sé añadió TCH al medio para distinguir a la cepa de la vacuna, la cual es sensible a TCH, a partir de la cepa de prueba. Los resultados de este estudio identifican el intervalo óptimo entre el cebado con rBCG y el refuerzo con Ad35-TBS.

EJEMPLO 6 Prueba de inmunización Para medir la potencial de la cepa de vacuna TB candidata AFV102 en contra de la prueba con Mtb, se inmunizaron grupos de 8 (conejillos de Indias Hartley SPF adultos jóvenes (250-300 gramos)) como se muestra en el cuadro 4.

CUADRO 4 Diseño de estudio de prueba en conejillos de Indias Nota: 1 . n* denota que el intervalo entre el cebado y el refuerzo será el valor definido en el ejemplo precedente. 2. Ad35-TBS denota un vector vacuna serotipo 35 de adenovirus deficiente en replicación ((Vogels et al., J. Virol. 77 (15): 8263-71 ; 2003; Barouche et al., J. Immunol. 172 (10) 6290; 2004) que contiene un cassette de expresión que codifica una proteína de fusión que comprende los genes Mtb Rv3840c-Rv1886-Rv0288 bajo el control del promotor temprano de citomegalovirus (Vogels et al., J. Virol. 77 (15): 8263-71 ; 2003). Los cebados en grupos de 4 y 5 se administraron intradermalmente a una dosis de 106 cfu en 0.1 mi de glicerol al 10%. A los ratones control en el grupo 1 y 3 se les proporcionó 0.1 mi de glicerol al 10% solamente de manera intradermal. A los ratones control en el grupo 2, se les proporcionaron 106 cfu de BCG Danish 1331 en 0.1 mi de glicerol 10%. A las 14 semanas después del cebado los conejillos de Indias fueron reforzados. En el grupo 5, el refuerzo comprendió de AFV102 y se administró intradermalmente a una dosis de 106 cfu en 0.1 mi de glicerol al 10%. En los grupos 4 y 6 los refuerzos comprendieron Ad35-TBS y se administraron intranasalmente a una dosis de 109 unidades formadoras de placa (por ejemplo Vogels et al., 2003; Barouche et al., 2004) suspendidas en 10 ul de PBS. A las 14 semanas después de la inmunización final, los animales fueron probados mediante aerosol con la Mtb mediante un aerosol generado a partir de 10 mi de una suspensión de célula particular que contenía un total de 107 cfu de Mtb, este procedimiento suministra -100 bacterias vivas a los pulmones de cada animal, como se describió previamente (Brodin et al., 2004). Después de la prueba, los animales se monitorearon para supervivencia junto con un grupo sano de animales no vacunados, no probados. Los animales también se monitorearon para pérdida de peso y salud general. Los resultados de este estudio demuestran que los animales inmunizados con un elemento que no produce antígenos murieron más rápidamente después de la prueba, los animales vacunados con BCG ¡ntradermalmente sin un refuerzo exhibieron un tiempo medio intermedio con respecto a la muerte y los animales inmunizados con AFV102 y reforzados intranasalmente con Ad35-TBS sobrevivieron por más tiempo.

EJEMPLO 7 Apoptosis La apoptosis es la muerte celular programada que difiere dramáticamente de la muerte celular necrótica en términos de su inducción y consecuencias. La apoptosis de las células que contienen antígenos extraños es un estímulo conocido poderoso de inmunidad celular en contra de dichos antígenos. El proceso por medio del cual la apoptosis de las células que contienen el antígeno lleva a la inmunidad celular algunas veces ha sido denominado cebado cruzado. ,2,3 Existen varios mecanismos para la inducción del apoptosis que llevan a una inmunidad incrementadamediada por célula especifica del antígeno. La caspasa 8 mediada apoptosis que lleva a una protección inmune celular específica del antígeno. 4 La producción de caspasa 8 en el citoplasma celular mediante BCG recombinante que escapa del endosoma será un método adicional poderoso para inducir muerte celular programada en el contexto de antígenos extraños expresados por BCG recombinante, en contra de BCG y otros antígenos de la tuberculosis sobre-expresados por BCG así como antígenos en contra de BCG misma que llevan a altos niveles de inmunidad celular específica del antígeno. El receptor de muerte-5 (DR-5) también conocido como TRAIL-R2 (receptor TRAIL 2) o TNFR-SF-10B (miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral 10B) también media la apoptosis mediada por caspasa 8.4 La apoptosis inducida por reovirus es mediada por TRAIL-DR5 produciendo una eliminación subsecuente del virus.5 La expresión de DR-5 medíante BCG que escapa del endosoma debe proveer un efecto adyuvante potente para la inducción de inmunidad celular específica del antígeno en contra de antígenos de Mtb expresados por rBCG. Las células presentadoras del antígeno también se pueden inducir para llevar a cabo apoptosis a través de la ligación de Fas, la cual es un estímulo fuerte para la inducción de las respuestas inmunes celulares específicas del antígeno.6 La BCG recombinante que escapa del endosoma que expresa Fas o la proteína de fusión del dominio citoplásmíco Fas/del ectodominio CD4 inducirá la apoptosis y las respuestas inmunes celulares específicas del antígeno. La mejoría de la inmunidad celular por la cepa rBCG que escapa al endosoma o por las cepas rBCG que escapa del endosoma que producen potenciadores adicionales de la apoptosis anteriormente descritos no se limita a antígenos BCG o antígenos específicamente codificados para la sobre-expresión de rBCG sino que incluye cualquier antígeno en la célula eucarionte en donde el rBCG anteriormente mencionado puede invadir. Como un ejemplo, si dicha rBCG se administra a células tumorales en donde la apoptosis se induce, entonces la inmunidad celular en contra de antígenos tumorales importantes será inducida con eliminación, reducción o prevención del tumor y/o metástasis. Este efecto anti-tumoral estará en adición al efecto anti-tumoral general que genera BCG cuando se proporciona localmente tal como en el caso del cáncer de vejiga. En una modalidad adicional de esta invención, rBCG que escapa del endosoma o rBCG con escape del endosoma mejorado por la producción de mediadores específicos de la apoptosis, se administra dentro del tumor o de otras células en donde dicha rBCG también produce antígenos extraños en contra de dichas respuestas inmunes celulares fuertes que será montada e inducirá la producción de respuestas celulares fuertes en contra de aquellas células tumorales u otras células eucariontes que contienen estos antígenos. Estas respuestas celulares llevarán a la destrucción de la célula tumoral mediada por el sistema inmune, cebado cruzado adicional e inducción de la inmunidad celular en contra del tumor u otros antígenos importantes con eliminación subsecuente, reducción o prevención del tumor y/o metástasis. Un ejemplo de dicho antígeno extraño es un antígeno HLA diferente del HLA de la célula hospedera en contra del cual será montada una respuesta celular heteróloga fuerte. rBCG con escape del endosoma o rBCG con escape del endosoma cuyas propiedades de inducción apoptótica se mejoran mediante el expresión de mediadores específicos de la apoptosis que también administran antígenos específicos del tumor que inducirán respuestas celulares fuertes específicas al antígeno en contra de estos antígenos tumorales, incluyendo eliminación de cierta tolerancia para estos antígenos que llevan a la eliminación, reducción o prevención de tumores y/o metástasis sin la necesidad de administración directa de la rBCG dentro del tumor mismo. La apoptosis después del daño al ADN o a la caspasa 9 induce tolerancia a ciertos antígenos. La inducción de la tolerancia es importante en el control o prevención de las enfermedades autoinmunes tales como pero no limitadas a diabetes, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, enfermedad de intestino inflamatorio y esclerosis múltiple. La producción de la caspasa 9 o de otras proteínas inducidas por la tolerancia mediada por la apoptosis por rBCG que escapa al endosoma en células tales como pero no limitadas a células ß pancreáticas, células colorectales y células nerviosas producirá apoptosis limitada que inducirán tolerancia en contra del antígeno blanco de la autoinmunidad en esas células tratando así o previniendo la condición de enfermedad autoinmune. La identificación de los antígenos específicos implicados en las reacciones autoinmunes permitirá la inducción de tolerancia en contra de estos antígenos autoinmunes blanco a través de la producción por rBCG que escapa al endosoma de ambos antígenos y de la caspasa 9 o de otras moléculas capaces de inducir la tolerancia mediada por proceso apoptótico. Dichas rBCG tratarán y/o prevendrán estas enfermedades autoinmunes.

Referencias para el ejemplo 7. 1. Heat, W.R., G.T. Belz, G.M. Behrens, C. M. Smith, S. P. Forehan, I.A., Parish, G.M. Davey, N.S. Wilson, F. R. Carbone, y J. A. Villandangos. 2004. Cross-presentation, dendritic dell subsets, and the generation of immunity to cellular antigens. Immunology Rev. 199: 9. 2. Gallucci, S., M. Lolkema, y P. Matzinger. 1999. natural Adjuvants: Endogenous activators of dendritic cells. Nature Biotechnology. 5: 1249. 3. Albert, M. L, B. Sauter, y N. Bhadrdwaj. 1998. Dendritic cells acquire antigen from apoptotic cells and induce class l.restricted CTLs. Nature 392: 86. 4. Sheridan, J. P., S.A. Masters, R.M. Pítti, A, Gruney, M. Skutbatch, D. Baldwin, L. Ramakrishnan, C.L. Gray, K. Baker, W.l. Wood, A.D. Goddard, P. Godowski, y A. Ashkenazi. 1997. Control of Trail induced apoptosis by a family of signaling and decoy receptors. Science 277: 818.

. Clarke, P., S. M. Meintzer, S. Gibson, C. Widmann, T.P. Garrington, G.L. Johnson, y K.L. Tyler. 2000. Reovirus-induced apoptosis is mediated by TRAIL. J. Virol 74: 8135. 6. Chattergoon, M.A., J.J. Kim, J.S. Yang, T.M. Robbinson, D.J. Lee, T. Dentchev, D.M. Wilson, V. Ayyavoo, y D.D. Weiner. 2000. Targeted antigen delivery to antigen-presenting cells including dendritic celia by engineered Fas-mediated apoptosis. Nat. Biotechnology 18: 974. 7. Huges, S., E. Mougneau, W. Ferlin, D. Jeske, P. hoffman, D. Homann, L. Beaudoin, D. Schrike, M. Von Herrath, A. Lehuen, y N. Glaichenenhaus. 2002. Tolerance to islets and prevention from diabetes induced by limited apoptosis of pancreatic beta cells. Immunity 16: 169.

EJEMPLO 8 Sobre-expresión de antí enos de vacuna en una cepa rBCG capaz de escapar del endosoma Para sobre-expresar los antígenos TB dentro de la cepa rBCG AFV 02, las secuencias que codifican del promotor Rv3033 funcionalmente asociadas a las secuencias que codifican Rv3804c (también conocido como Ag85A), Rv1886 (también conocido como Ag85B) y Rv0288 (también conocido como TB10.4) se insertaron dentro del sitio Pací de pAF100. El plásmido resultante, pAF105 (figura 12) se digirió subsecuentemente con la endonucleasa de restricción Ndel para remover el replicón de E. coli y el gen de resistencia a canamicina, y se re-circularizó mediante ligación con T4 ligasa. Este ADN (1-2 ug) se introdujo dentro de la cepa rBCG AFV102 mediante electroporación. Las bacterias se cultivaron en placas de 8.75 cm que contenían 25-30 mi de medio sólido (Middlebrook 7H10). Después de una preselección mediante PCR para detectar las colonias que contienen el plásmido de expresión del antígeno, se seleccionó una colonia rBCG, la cual es positiva a PfoA y contiene el cassette de expresión del antígeno TB, designado AFV112 y se expandió en 500 mi de medio líquido en agitación (Middlebrook 7H9) a 37°C. Una vez que el cultivo alcanzó la fase logarítmica tardía, se añadió glicerol a los 500 mi de cultivo hasta una concentración final de 10% (v/v) y la semilla pre-dominante se almacenó en alícuotas de 5 mi a -80°C. La pureza de los cultivos de BCG y de rBCG se evaluó mediante la extensión homogénea de alícuotas de 100 ul del cultivo de BCG serialmente diluido (por ejemplo pasos de 10 veces la dilución a partir de una solución pura hasta 10"8) en solución salina con pH regulado con fosfato (PBS) en placas de 8.75 cm que contenían 25-30 mi de medio sólido (Middlebrook 7H10). La PCR y el análisis por endonucleasa de restricción del ADN plasmídíco se utilizaron para confirmar que el genotipo deseado estaba presente en cada aislado de rBCG. Además, los fragmentos de ADN generados mediante PCR se secuenciaron mediante técnicas automatizadas de secuenciación por dideoxinucleótido para confirmar la presencia de los genes de longitud total.

Para evaluar la secreción de PfoA por AFV102 y AFV1 12 que contienen el plásmido de expresión del antígeno TB, ambas cepas se crecieron hasta fase logarítmica media, como se describió anteriormente. Los sobrenadante del cultivo de estos cultivos se recolectaron y filtraron a través de filtros de membrana de 0.2 mm, como se describió previamente (Hess et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 95: 5299-304; 1998). Las proteínas del filtrado de cultivo se evaluaron entonces para actividad hemolítica, como se describió previamente. Los resultados mostraron que AFV102 y AFV112 exhiben niveles similares de actividad hemolítica y que AFV112 retiene el alelo AureC::QpfoAci37Q y expresa una proteína funcional PfoA. Finalmente, la expresión de los antígenos TB se evaluó en proteínas de sobrenadantes de cultivo separadas en geles de SDS al 10-15%-PAGE. Los resultados muestran una expresión incrementada de Rv3804c y Rv1886. Puesto que Rv0288 no se esperaba que se sobre-expresara en el sobrenadante del cultivo, la sobre-expresión de esta proteína de 10 kDa, la cual se expresa en el mismo ARNm que Rv3804c y Rv1886, se infiere mediante la observación de que Rv3804c y Rv1886 están sobre-expresados. Tomado como un todo, este ejemplo demuestra que es posible generar una cepa rBCG la cual expresa tanto PfoA como antígenos TB sobre expresados. Dicha cepa tiene potencial para servir como una vacuna de TB de segunda generación. Aunque la invención ha sido descrita en detalle, y con referencia a las modalidades específicas de la misma, será evidente a un experto en la técnica que se pueden realizar diversos cambios y modificaciones a ésta sin apartarse del espíritu y alcance de la misma.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Una Mycobacterium que está genéticamente diseñada para incluir una proteína endosomalítica funcional que se expresa y secreta que es activa a un pH de 6-8.
2. La Mycobacterium de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha proteína endosomalítica funcional que se expresa y secreta es perfringolisina o una variante funcional de la misma. 3. - La Mycobacterium de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque una secuencia de aminoácidos de dicha proteína endosomalítica funcional que se expresa y secreta se representa por SEQ ID NO: 2. 4.- La Mycobacterium de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha proteína endosomalítica funcional que se expresa y secreta se codifica por una secuencia génica específica para perfringolisina o una muíante de la misma. 5. - La Mycobacterium de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque dicha secuencia génica se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 3. 6. - La Mycobacterium de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha mycobacterium se diseña genéticamente para expresar una proteína apoptótica o un potenciador funcional de la apoptosis. 7. - La Mycobacterium de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque dicha proteína apoptótica o dicho potenciador funcional de la apoptosis se selecciona a partir del grupo que consiste de caspasa 8, receptor de muerte-5, Fas y proteína de fusión del dominio citoplásmico Fas/ectodominio CD4. 8. - La Mycobacterium de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha mycobacterium se diseña genéticamente para que exprese de manera funcional un gen de interés. 9. - La Mycobacterium de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha Mycobacterium se diseña genéticamente para expresar de manera funcional una proteína apoptótica o un potenciador funcional de la apoptosis; y un gen de interés. 10.- Una Mycobacterium que se diseña de manera genética para incluir una proteína endosomalítica funcional que se expresa y secreta que es activa a un pH presente en endosomas de células infectadas por dicha mycobacterium. 11. - La Mycobacterium de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque dicha proteína endosomalítica funcional que se expresa y secreta es perfringolisina o una variante funcional de la misma. 12. - La Mycobacterium de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque una secuencia de ácidos nucléicos de dicha proteína endosomalítica funcional que se expresa y secreta se representa por SEQ ID NO. 2. 13. - La Mycobacterium de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque dicha proteína endosomalítica funcional que se expresa y secreta se codifica por una secuencia génica específica para perfringolisina o una mutante de la misma. 14. - La Mycobacterium de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicha secuencia génica se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 3. 5.- La Mycobacterium de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque dicha mycobacterium es BCG. 16. - La Mycobacterium de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque dicha mycobacterium se diseña genéticamente para expresar una proteína apoptótica o un potenciador funcional de la apoptosis. 17. - La Mycobacterium de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque dicha proteína apoptótica o dicho potenciador funcional de la apoptosis se selecciona a partir del grupo que consiste de caspasa 8, receptor de muerte-5, Fas y proteína de fusión del dominio citoplásmico Fas/ectodominio CD4. 18. - La Mycobacterium de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque dicha mycobacterium se diseña genéticamente para expresar funcionalmente un gen de interés. 19.- La Mycobacterium de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque dicha mycobacterium se diseña genéticamente para expresar funcionalmente una proteína apoptótica o un potenciador funcional de la apoptosis; y un gen de interés. 20.- Un método para permitir que una Mycobacterium escape de los endosomas, que comprende el paso de diseñar genéticamente dicha Mycobacterium para que contenga, exprese y secrete una proteína endosomalítica funcional. 21 . - El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque dicha proteína endosomalítica funcional es perfringolisina O o una mutante de la misma. 22. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicha proteína endosomalítica funcional es una perfringolisina O mutante codificada por SEQ ID NO: 3. 23.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque dicha Mycobacterium es una Mycobacterium atenuada. 24.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque dicha Mycobacterium atenuada es BCG. 25.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque dicha Mycobacterium se diseña genéticamente para expresar una proteína apoptótica o un potenciador funcional de la apoptosis.

26. - El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque dicha proteína apoptotica o dicho potenciador funcional de la apoptosis se selecciona a partir del grupo que consiste de caspasa 8, receptor de muerte-5, Fas y proteína de fusión del dominio citoplásmico Fas/ectodominio CD4. 27. - El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque dicha Mycobacterium se diseña genéticamente para expresar funcionalmente un gen de interés. 28. - El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque dicha Mycobacterium se diseña genéticamente para expresar funcionalmente una proteína apoptotica o un potenciador funcional de la apoptosis; y un gen de interés. 29. - Una preparación de vacuna, que comprende una Mycobacterium genéticamente diseñada para expresar y secretar una proteína endosomalítica funcional, en donde dicha proteína endosomalítica funcional es activa a pH neutro. 30. - La preparación de vacuna de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque dicha proteína endosomalítica funcional es perfringolisina O. 31.- La preparación de vacuna de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque dicha proteína endosomalítica funcional es una perfringolisina O muíante codificada por SEQ ID NO: 3. 32.- La preparación de vacuna de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque la expresión de dicha proteína endosomalítica funcional expresada por dicha Mycobacterium permite el escape de dicha Mycobacterium recombinante de los endosomas. 33.- La preparación de vacuna de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque dicha Mycobacterium es una Mycobacterium alterada. 34. - La preparación de vacuna de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque dicha Mycobacterium atenuada es BCG. 35. - La preparación de vacuna de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque dicha Mycobacterium se diseña genéticamente para expresar una proteína apoptótica o un potenciador funcional de la apoptosis. 36.- La preparación de vacuna de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada además porque dicha proteína apoptótica o dicho potenciador funcional de la apoptosis se selecciona a partir del grupo que consiste de caspasa 8, receptor de muerte-5, Fas y proteína de fusión del dominio citoplásmico Fas/ectodomínio CD4. 37.- La preparación de vacuna de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque dicha Mycobacterium se diseña genéticamente para expresar funcionalmente un gen de interés. 38.- La preparación de vacuna de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque dicha Mycobacterium se diseña genéticamente para expresar funcionalmente una proteína apoptotica o un potenciador funcional de la apoptosis; y un gen de interés.