CN103118703A - 作为人用疫苗的重组分枝杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在人对象中提供保护性免疫、特别是针对结核的保护性免疫的重组疫苗。

Description

作为人用疫苗的重组分枝杆菌
本发明涉及在人对象中提供保护性免疫、特别是针对结核的保护性免疫的新型重组疫苗。
1993年，世界卫生组织(WHO)已宣布结核(TB)全球性紧急状况。全世界约20亿人1,2感染有结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）——TB的病原微生物。这些人均存在发展为该疾病的临床症状的风险。在大多数个体中，结核分枝杆菌感染最初被宿主防御所耐受，感染仍处于潜伏期。然而，潜伏的TB感染具有在任何时候发展为活动的TB病的潜能，而带有活性的TB的个体成为新的感染源。在WHO报告(2009)中，报道2007年新病例的数量为930万1，并且正稳步增长。每年，约180万人死于该疾病。因此，TB继续成为全球范围内感染病致死的主要起因。
卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)，减毒的牛分枝杆菌菌株，自1921年已用作TB疫苗。迄今，约40亿剂量已经被施用。3然而，以BCG接种疫苗对于阻止TB散布不够有效。BCG可以防止、至少减轻儿童系统性TB的严重症状，特别是脑膜炎。BCG不防止该疾病的肺感染形式。4然而，这对于中断该疾病的传播可能是必要的。
仅存在几种抗生素治疗。它们越来越多地失败，因为越来越多的患者被多药耐药性的TB菌株所感染。1,5使这种状况更严重的是，新的高度致病性菌株，如结核分枝杆菌Beijing/W，正在传播。6
本发明的一个目的是开发抗TB的安全、良好耐受而有效的疫苗，特别对于流行病区的居民和非流行病区危险人群。该疫苗将替代当前所用的BCG疫苗。新的疫苗应当至少与现有菌株一样有效，并应当比BCG更为安全。5,7
结核分枝杆菌和BCG由宿主巨噬细胞吞噬。细菌病原体在吞噬体内的定位使得细菌抗原通过主要组织相容性复合物(MHC)II途径运输。这导致优选刺激CD4T细胞。然而，已表明MHC I限制性CD8毒性T细胞在针对结核分枝杆菌的免疫中至关重要。8,9不同于结核分枝杆菌，BCG仅对CD8细胞毒性T细胞有微弱刺激。2,3,10因此，产生表达吞噬溶酶体逃逸结构域的重组BCG菌株，以将分枝杆菌病原体导向MHC I途径。2,7该菌株分泌单核细胞增多性李斯特氏菌（L.monocytogenes）的李斯特菌溶胞素(Hly)。7,11这使得该菌株可以通过穿透吞噬体膜的方式逃逸受感染宿主细胞的吞噬体。失活脲酶C基因对于在吞噬体中保证最适Hly活性的酸性pH值是必需的。穿孔促使抗原转位到胞浆中，并且有利于通过增加的细胞凋亡得到交叉敏化。7,9这个过程能非常有效的模拟结核分枝杆菌对于免疫系统的诱导。这个作用模式预期将会发展出针对TB的有效并很好耐受的疫苗。
这些概念已经在WO99/101496和WO2004/094469中描述过，其内容通过引用并入本文。
在这个研究中，重组脲酶缺陷型BCG疫苗首次被应用与人类对象。本研究评估了这种疫苗的安全性，局部与系统耐受性以及免疫原性。与商用的BCG疫苗相比，本研究使用了剂量递增的序贯设计。在德国，80个对象按照他们以前BCG的免疫记录分层被随机分为4组，每组20个对象。
除了标准安全性监控之外，还进行加强型安全性监控，包括实验室参数、身体安全评估和详细的ECG分析。
本发明的一个主题是应用于人的包含重组分枝杆菌作为活性成分的疫苗，所述重组分枝杆菌是脲酶缺陷型的并且包含编码融合多肽的重组核酸分子，所述融合多肽包含（a）结核分枝杆菌抗原或其免疫原性片段，和（b）吞噬溶酶体逃逸结构域。
本发明的另一主题是一种对人类对象接种疫苗的方法，包括施用药学上有效剂量的重组分枝杆菌，所述重组分枝杆菌是是脲酶缺陷型的并且包含编码融合多肽的重组核酸分子，所述融合多肽包含（a）结核分枝杆菌抗原或其免疫原性片段，和（b）吞噬溶酶体逃逸结构域。
在一个特别优选的实施方案中，ureC序列是失活的(ΔUrec)，比如通过构建包含被选择性标记基因打断的ureC基因的自杀载体，用该载体转染目标细胞，并筛选具有脲酶阴性表型的选择性基因阳性细胞。
所述细胞优选为牛分枝杆菌（M.bovis）细胞、结核分枝杆菌细胞（尤其是减毒的结核分枝杆菌细胞）或其他分枝杆菌，比如田鼠分枝杆菌（M.microti）、耻垢分枝杆菌（M.smegmatis）、卡内蒂分枝杆菌（M.canetti）、海洋分枝杆菌（M.marinum）或偶发分枝杆菌（M.fortuitum）。更优选的，所述细胞是重组牛分枝杆菌(BCG)细胞，尤其是来自丹麦株布拉格亚型(Danish subtype Prague)的重组牛分枝杆菌细胞13。最优选的，所述细胞是重组BCG丹麦株布拉格亚型，其表征为rBCGΔUrec::Hly+::Hyg+(VPM1002)。
本发明的分枝杆菌细胞包含重组核酸分子，如SEQ ID No.1的核酸分子。该核酸分子包含信号肽编码序列（核苷酸1-120），编码免疫原性结构域的序列（核苷酸121-153），肽接头编码序列（核苷酸154-210），编码吞噬溶酶体结构域的序列（核苷酸211-1722），另一肽接头编码序列（核苷酸1723-1800）和编码随机肽的序列（核苷酸1801-1870）。相应的氨基酸序列示于SEQ ID No.2。
能够引发免疫反应的结构域选自牛分枝杆菌或结核分枝杆菌来源的免疫原性肽或多肽，或者长度为至少6个氨基酸、优选至少8个氨基酸的其免疫原性片段。合适抗原的具体实例是从结核分枝杆菌来源的Ag85B(p30)(Harth等人,1996)，从牛分枝杆菌BCG来源的Ag85B(α-抗原)(Matsuo等人,1988)，从结核分枝杆菌来源的Ag85A(Huygen等人,1996)，以及从结核分枝杆菌来源的ESAT-6(Sorensen等人,1996,Harboe等人,1996和Andersen等人,1995)。更优选，免疫原性结构域衍生于抗原Ag85B。最优选，免疫原性结构域包含在SEQ ID No.2中从41位到51位氨基酸的序列。
重组DNA分子进一步包含吞噬溶酶体逃逸结构域，即提供融合多肽从吞噬溶酶体中逃逸到哺乳动物细胞胞浆中的多肽结构域。优选的是，该吞噬溶酶体逃逸结构域是在US5,733,151描述过的李斯特氏菌的吞噬溶酶体逃逸结构域。更优选的是，吞噬溶酶体逃逸结构域是从单核细胞增多性李斯特氏菌的李斯特菌溶胞素基因(Hly)衍生而来的。最优选的是，该吞噬溶酶体逃逸结构域由选自下列的核酸分子编码：（a）包含如SEQ ID No.1中所示的211-1722位核苷酸的核苷酸序列，（b）编码与在（a）序列相同氨基酸序列的核苷酸序列，和（c）在严格条件下和（a）或（b）序列发生杂交的核苷酸序列。
除了在SEQ ID No.1中描述的核苷酸序列之外，本发明也包括与之发生杂交的核酸序列。在本发明中，如Sambrook等人(MolecularCloning.A laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989),1.101-1.104)中所定义使用术语“杂交”。在本发明中，术语“杂交”在如下情况使用：在55°C、优选62°C、更优选68°C以1X SSC和0.1%SDS洗涤1小时之后，特别是在55°C、优选62°C、更优选68°C以0.2X SSC和0.1%SDS洗涤1小时之后，仍然能够观察到阳性杂交信号。在这种洗涤条件下与SEQ ID No.1的核苷酸序列发生杂交的序列是本发明中优选的编码吞噬溶酶体逃逸结构域的核苷酸序列。
在上面描述的编码吞噬溶酶体逃逸结构域的核苷酸序列可以直接获自李斯特菌体或者任何重组来源，例如含有在上面描述的相应李斯特菌核酸分子或者其变体的重组大肠杆菌细胞。
优选，编码融合多肽的重组核酸分子含有信号肽编码序列。更优选，所述信号肽是在分枝杆菌中、优选牛分枝杆菌中有活性的信号序列，例如天然牛分枝杆菌信号序列。合适的信号肽的优选实例是编码Ag85B信号肽的核苷酸序列，其在SEQ ID No.1中从1-120位核苷酸。
进一步，优选在免疫原性结构域与吞噬溶酶体逃逸结构域之间提供肽接头。优选的是，所述肽接头长度为5-50个氨基酸。更优选的是，在SEQ ID No.1中从154-210位核苷酸序列，或者由于遗传密码子简并性与该序列相应的序列。
所述核酸序列可位于重组载体上。优选，所述重组载体是原核生物载体，即包含在原核生物细胞中复制和/或基因组整合的元件的载体。优选，所述重组质粒携带可操作地连接于表达控制序列的本发明的核酸序列。优选，所述表达控制序列为在分枝杆菌中、特别是牛分枝杆菌中有活性的表达控制序列。所述载体可以是染色体外载体，或者是适合于染色体整合的载体。所述质粒对于本领域技术人员是已知的，并且，例如在如上所述的Sambrook等人中提供。
在一些实施方案中，重组分枝杆菌细胞可以携带抗生素抗性基因，比如潮霉素(Hyg)抗性基因。在其它实施方案中，重组分枝杆菌细胞不携带抗生素抗性基因。
优选，所述疫苗为应用于人的活疫苗，比如用于感染分枝杆菌、例如结核的流行病区的居民，或者在非流行病区的危险人群。所述疫苗可施用于未用分枝杆菌（比如BCG）免疫的对象，例如未预暴露于免疫原性分枝杆菌攻击的人或未用BCG预免疫的人。这些对象的例子是例如新生儿或者儿童，例如可达8岁的儿童，例如在分枝杆菌感染比如结核病流行病区，或者在非流行病区的危险人群。所述疫苗特别适合于接种具有HIV阳性父母例如母亲的对象。所述疫苗也可施用给HIV感染流行人群中未用分枝杆菌(比如BCG)免疫的对象。在其他实施方式中，所述疫苗可以施用给例如居住于结核病流行的地区中预先暴露于分枝杆菌例如BCG的对象，例如9岁以上的儿童或成人，或施用给用BCG预先免疫的对象。在这些对象中，本发明疫苗对已经存在BCG诱导的免疫状态具有增强效应。
在进一步的优选实施方案中，施用所述疫苗在未免疫或预先免疫的对象中产生增加的IFN-γ反应，并且上调CD4+T细胞，特别是多功能CD4+T细胞。
在优选的实施方式中，所述疫苗是包含分枝杆菌细胞并任选地包含试剂诸如葡萄糖和/或葡聚糖的冻干物。任选地，所述疫苗额外地包含重构液、注射用水或盐水。在一些实施方案中，所述疫苗包含大约103-104CFU（菌落形成单位）、大约104-105CFU或大约105-106CFU的剂量。
粘膜表面施用（比如眼、鼻内、经口、胃、肠、直肠、阴道或泌尿道）或通过非肠道途径施用（比如皮下、皮内、肌内、静脉内或腹膜内）也可被选择。特别优选的是皮内施用。
在一些实施方式中，所述疫苗以单剂量施用，包括免疫未用分枝杆菌免疫的对象或者加强接种预先暴露于分枝杆菌的对象，例如在施用本发明的疫苗之前已经用基于分枝杆菌的疫苗（例如用于已经与分枝杆菌例如病原性分枝杆菌接触的对象的天然BCG疫苗）预先接种的对象。可选地，本发明的疫苗可以以两个或更多剂量施用。每个剂量可以以大约1周到大约6个月或更长的间隔施用时间。
本发明的疫苗用于对抗分枝杆菌的感染，特别是用于对抗结核的感染。
本发明将使用下面的图、序列表和实施例来进一步说明。
图1：处理组的平均红斑大小和研究天数的相关性
图2：处理组的平均硬结大小和研究天数
图3：用Ag85B刺激未免疫对象后IFN-γ反应相对于基线的平均变化。
A．PBMC ELISA，测定IFN-γ
B．ELISpot
C．全血ELISA，测定IFN-γ
所有测定均用2μg/mL的Ag85B进行刺激。VPM1002(5x105)组使用红色柱表示，BCG组用蓝色柱表示。刺激：Ag85B2μg/mL。VPM1002增强了IFN-γ反应。
图4：在预先免疫的对象中用Ag85B刺激后IFN-γ反应相对于基线的平均变化。
A．PBMC ELISA，测定IFN-γ
B．全血ELISA，测定IFN-γ
所有测定均用2μg/mL的Ag85B进行刺激。VPM1002(5x105)组使用红色柱表示，BCG组用蓝色柱表示。刺激：Ag85B2μg/mL。VPM1002增强了IFN-γ反应。
图5：在未免疫对象中单阳性与多功能CD4+T细胞相对于基线的变化。
A．用PPD再刺激的单阳性CD4+T细胞（表达IFN-γ）的频率
B．用Ag85B再刺激的多功能CD4+T细胞（表达IFN-γ和IL-2）的频率
C．用PPD或再刺激的多功能CD4+T细胞（表达IFN-γ和TNF-α）的频率
D．通过对来自用VPM1002（红色）或BCG对照（蓝色）免疫的成年人的PBMC进行FACS ICS来测定Ag85B再刺激的。
SEQ ID No.1:表示编码分枝杆菌85B抗原和李斯特菌吞噬溶酶体逃逸结构域的核酸分子的核苷酸序列。
SEQ ID No.2：表示与SEQ ID No.1的核酸序列相对应的氨基酸序列。
实施例
在针对BCG接种史分级的健康男性志愿者中进行1期临床研究以评价本发明的疫苗（VPM1002）相比于BCG的安全性与免疫原性。
1．疫苗VPM1002的鉴定
VPM1002是从牛分枝杆菌BCG丹麦株布拉格亚型（表征为rBCGΔureC::Hly+::Hyg+）来源的经过基因修饰的BCG疫苗。VPM1002可以活的牛分枝杆菌BCGΔureC::Hly+::Hyg+的冻干块获得。一瓶包含5x106CFU(范围2-8x106CFU)的VPM1002。
李斯特菌溶胞素基因(Hly)被整合在脲酶C基因（ureC）中，这使得脲酶C活性缺失并引入李斯特菌溶胞素活性。
VPM1002是具有潮霉素(Hyg)抗性的。潮霉素抗性作为在该菌株的基因改造中的选择性标记，并作为在基因修饰生物(GMO)监测与GMO应急计划(GMO-emergency-plan)中的特异性标记。VPM1002对于在治疗分枝杆菌中普遍使用的抗生素敏感，比如异烟肼、利福平和乙胺丁醇。
VPM1002以冻干（冷冻干燥）块供应，该冻干块采用1mL H2O（可注射用水）重构。重构之后的浓度大约在5x106CFU。对于5x103和5x104CFU的施用剂量，分别使用无菌直接应用的0.9%氯化钠溶液以1:100或1:10的比例稀释重构的VPM1002悬液。
2．目的
本研究的主要目的是研究单剂量的VPM1002的安全性。
本研究的次要目的是研究单剂量的VPM1002用于接种抗结核病的免疫原性。
3．方法学（研究设计）
这是首次将VPM1002应用于人。本研究遵循开放、随机、可控、剂量递增的设计，以评估单剂量VPM1002的安全性与免疫原性。
将单次VPM1002接种皮内施用给未免疫卡介苗(BCG)的对象或用BCG预先免疫的对象（在接种记录中有BCG接种记录或有BCG疤痕，并且在两种情况下纯化蛋白衍生物(PPD)皮试中均不强于弱阳性）。研究三个递增剂量的VPM1002。参考组对象接受单剂量的BCG疫苗。
接种疫苗后，紧密监测安全参数，直至给药后4小时。之后对象被允许离开诊所，除了每个剂量组的前3名对象。他们留在诊所直到接种疫苗之后24小时。
安全性与药物动力学评估被进行至第57天，并在接种疫苗后6个月再次进行。
在对于每组的前3名对象的第57天的结果可获得后，进行中间安全性分析。基于这些数据，以可达5x105CFU的剂量施用VPM1002被认为是安全并可以被良好耐受的。基于免疫原性的第二研究终点，对于样本大小进行了统计学重新评估。该分析结果(p1=0.0119)显示在本研究中包括的80个对象的计划样本是充足的。增加样本大小并无必要。
4．对象数量
40位未免疫BCG的对象与40位预先免疫过BCG（或PPD阳性）的对象被纳入本研究。所有80名对象，除了1名失去跟踪以外，全部按计划完成了研究。
Figure BDA00002938585800091
处理:BCG=5x10E5CFU BCG(范围2-8x10E5),
第1组=5x10E3CFU VPM1002(范围2-8x10E3)
第2组=5x10E4CFU VPM1002(范围2-8x10E4),
第3组=5x10E5CFU VPM1002(范围2-8x10E5)
5．诊断及主要入选标准：
健康男性对象，年龄18-55岁（包括端值），没有任何症状、体征或实验室值表明具有系统性疾病或流行疾病，并且没有任何症状表明具有活动性或潜伏性结核病感染(LTBI)。结核菌素-PPD测试对于接种过BCG必须小于10mm，而对于处于基线水平的未免疫BCG的对象必须小于1mm。
6．测试产品、施用剂量和模式、批次号：
VPM1002的活性成分是牛分枝杆菌rBCGΔureC::Hly+::Hyg+，其是冻干的并且标准化为每次应用的活(菌落形成单位(CFU))分枝杆菌数目。
剂量水平:5x103CFU VPM1002(范围2-8x103CFU)
5x104CFU VPM1002(范围2-8x104CFU)
5x105CFU VPM1002(范围2-8x105CFU)
大约0.1mL重构并稀释的VPM1002悬液使用分刻度至百分之一mL的（1/100mL）的1mL注射器经由皮内注射施用，所述注射器配备短的斜面针头(25G/0.50mm或26G/0.45mm,10mm长)。不允许使用喷射注射器或多穿刺设备。
7．处理持续时间：
一次单剂量接种
8．参考治疗、施用剂量与模式、批次号：
BCG疫苗SSI，粉末和用于注射的悬浮溶剂，丹麦国立血清研究所（Statens Serum Institut）
重构后，1剂量（0.1mL）包含：
牛分枝杆菌BCG(卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin)),丹麦株1331,活减毒疫苗,2-8x105CFU。
与对于VPM1002所描述的方式进行施用。
9．评价标准：
安全性参数：
·不良事件的发生率，不良事件的时间分布，不良事件的其它分布
·评估接种部位局部反应和接种部位局部反应的照片记录(第1天、第5天、第11天、第29天、第57天、6个月之后)
·标准安全性实验室参数（血液学、凝聚、临床化学(包括肝酶)、尿分析）
·在基线、第57天和第6个月进行QuantiFeron Gold测试，
·体检，包括心电图（ECG）、生命体征和体重
·胸部X光检查
·在基线、第57天和第6个月进行超声肝脏成像
·对象耐受性的整体评估。
免疫原性参数：
·淋巴细胞刺激试验（LST）：每个细胞的干扰素IFN-γ量
·酶联免疫斑点技术（ELISPOT）：分泌IFN-γ的外周血单核细胞（PBMC）的数目/PBMC总数
·全血测定（WBA）：IFN-γ的量/淋巴细胞数
·胞内细胞因子染色（ICS）（荧光激活细胞分选术（FACS）分析）：CD4+和CD8+淋巴细胞的数量；其是xxx-阳性(xxx-bright)、xxx-阳性和xxx阳性（“三重阳性细胞”）；根据总淋巴细胞计算。
10．研究终点:
初级终点：
如通过体检、生命体征、ECG、肝超声检查、胸部X光检查、实验室安全性参数（包括血液学、凝聚、临床化学和尿分析）、耐受性、同时服用药物的记录和不良事件的监测，评价单剂量VPM1002的安全性。
次级终点：免疫原性，通过下列评估：
·对结核菌素（PPD）进行LST，接着对PBMC上清液进行IFN-γ特异性的酶联免疫吸附测定（ELISA）。
·在PPD刺激之后进行特异于分泌IFN-γ的PBMC的ELIspot。
·WBA，用PPD刺激细胞3天并且通过ELISA测量血浆中IFN-γ。
探索性终点：免疫原性，通过下列评估
·经PPD过夜刺激的CD4+和CD8+淋巴细胞中IFN-γ、肿瘤坏死因子（TNF）-α和白细胞介素（IL）-2进行ICS后的FACS-分析。
·在PPD过夜刺激的CD4+和CD8+淋巴细胞中用羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯（CFSE）进行胞内染色后的FACS-分析。
·LST、ELIspot，、ICS和WBA，测定结核抗原（TB-Ag）85b肽混合物的刺激。
·抗PPD或TB-Ag85b肽混合物的血清抗体的浓度；这些血清抗体的免疫球蛋白（Ig）G-亚型的定量。
11．统计方法：
描述统计学被用于评价安全性参数。
以下统计检验步骤被用于免疫原性数据：
·Jonckheere Terpstra检验(α=0.05)，用于检测与BCG组相比在重复测量设置中经调节的相对于基线的变化中的剂量-应答关系
·线性回归模型，用于在具有处理因素的前瞻性限定的推定协变量和协同因子的各个参数方面针对在基线后个值访问而调整相对于基线的变化(后向选择，Backward selection)
·在组间和比较VPM1002与BCG组时，使用95%的置信区间估计处理效果（与基线相比的变化）
·在调整回归模型(adjusting regression model)中统计学上不相关的协变量/协同因子的后向消除(Backward elimination)
·χ2-检验、t-检验、U-检验，用于两个处理组之间的探索性比较
·多元线性回归代替Jonckheere Terpstra检验，评估非参数分析的灵敏度
12．研究群体总结：
所有80名对象都被列入安全群体和意向治疗（ITT）群体。所有80名对象均提供了都提供了有效的和可解释的免疫原性参数评估，并且均无重大方案偏差；因此，所有对象对于免疫原性（IM）和符合方案（PP）群体均是有效的。
整体平均年龄为33.1岁（不同组的平均值在25.2到38.7岁之间）。平均身高为179.7cm（在177.2到181.8cm之间），平均体重为78.8kg（在73.0到82.5kg之间），平均BMI为24.38kg/m2（在22.98到25.78kg/m2之间）。处理组之间的差异被认为没有临床相关性。
13．药物动力学总结：
本研究的第二个目的是显示VPM1002的免疫原性。这个目的已经达到。本研究表明，VPM1002在未免疫BCG与预免疫BCG的两个人群中从定量和定性上都引起了非常良好的细胞免疫应答。所有观测到的数据都显示出由VPM1002引发的明显的Th1型免疫反应。开发该特定疫苗株VPM1002的最初目的是增强细胞介导的免疫反应，并诱导在定性上比BCG更好的免疫反应。这些目标可达到。此外，它也显示出作为BCG诱导的在先免疫反应的增强免疫接种的潜力。
对于IFN-γ的量/淋巴细胞数（次级终点LST和WBA），通过参数统计和非参数统计，可以在接受VPM1002的组之间观察到剂量-反应相关性。在各分组中，在所有研究天数上，在5×105CFU VPM1002组中相对于基线的平均变化最高，而在5×103CFU VPM1002组中相对于基线的平均变化最低。这证明了VPM1002对于接受者的有效性。
在次级终点中，相对于基线的变化的线性回归分析显示，年龄、体重、在基线处的总PBMC和在基线处的总淋巴细胞对于结果并无统计学上显著的影响。
在探索终点中，在两组之间均观察到对多功能CD4+T细胞诱导的显著影响。
总之，VPM1002通过诱导IFN-γ引发Th1型免疫应答，不仅与BCG相比在定量上有差异，也与多功能T细胞上在定性上有差异。这些结果将进一步推动这个疫苗的发展。
14．安全性总结：
这个临床1期研究的初级终点是对VPM1002的安全性评估。事实上，这项研究并没有揭示出VPM1002具有任何安全问题。
具体而言，单次接种高达5×105CFU VPM1002的耐受性良好。无严重不良事件（AE）的发生。
共计80.7％的不良反应被研究人员认为是与研究药物有关（药物不良反应（ADR）：评价为“肯定”、“很有可能”或“可能”的关系）。
所有对象都报告了ADR。几乎所有的ADR都是注射部位症状（所有ADR中的98.0％）。
ADR数量随着剂量的增加而增加。然而，ADR的频率和强度总是医疗上可接受的，即使是最高剂量的VPM1002（5×105CFU）也是如此。相比于无BCG预免疫的对应处理组，在预先BCG接种的对象中还存在更高的不良反应发生率的倾向（分别是204起与239起ADR）。
所有对象都经历了AE。在BCG组和5×105CFU VPM1002组中，在未经BCG预先免疫的对象中AE数量是相似的（分别是76和82起），而其他2组AE数量较低（在5×103CFU VPM1002后有47起AE，在5×104CFU VPM1002后有53起AE）。在具有在先BCG接种的对象组中，AE数量在5×105CFU VPM1002组（97起AE）中最高，相比于在BCG组中的72起，以及在5x103CFU VPM1002组的61起和5×104CFU VPM1002组中的61起。
在未免疫BCG的对象组中，在接受相同剂量范围（5×105CFU）的BCG和VPM1002的处理组中观察到的ADR具有相当的发生率和严重程度（在BCG和VPM1002之后分别为64与72起）。而在预免疫BCG的对象组中，在接受5×105CFU VPM1002的对象中比在接受5×105CFU BCG的对象中ADR发生率略高（在VPM1002后的78起比在BCG后的60起）。然而，ADR的强度在两组之间是相当的，经更仔细的检查后，这种不平衡的主要原因似乎是免疫VPM1002后注射部位溃疡的发病率略高（在BCG和VPM1002免疫后分别为4起和8起；直径1mm至8mm），并伴随相关的后续事件，如结痂和在注射部位处的脱皮（在BCG和VPM1002免疫后，分别为6起比9起和4起比7起），这在强度上都被评定为轻微的，并且是免疫原性诱导的另一个指标。
大多数AE具有轻微的强度（全部AE的95.3％），25起AE（全部AE的4.6％）具有中等强度，1起AE（全部AE的0.1％，在BCG免疫后报告）具有严重程度。
没有对象因AE而停止试验。
AE总数与注射部位症状总结
Figure BDA00002938585800161
处理:BCG组：5x10E5CFU BCG(范围2-8x10E5)
组1：5x10E3CFU VPM1002(范围2-8x10E3)
组2：5x10E4CFU VPM1002(范围2-8x10E4)
组3：5x10E5CFU VPM1002(范围2-8x10E5)
整体而言，具有局部反应的对象的数量和局部反应的强度都随着剂量的增加而增加，并且对于5×105CFU BCG组和VPM1002组是相当的。在未免疫BCG的对象和预先免疫BCG的对象中的结果大致相似，没有观察到明显的局部反应差异的趋势。最突出的局部反应是红斑和硬结。在所有对象中都观察到红斑。红斑的平均大小随剂量增加。用5×105CFU BCG和VPM1002接种后平均红斑大小相似。在接受5×105CFU VPM1002的对象中，平均红斑大小始终比预先免疫的对象高，而在BCG组中平均大小比无在先BCG免疫的对象组高。
对于具有硬结的对象的数目，没有观察到明显的剂量关系。在接受5x105CFU BCG或VPM1002的处理组中，平均硬结大小最高。在用5x105CFU BCG接种的组中最大硬结发生在月第3至5天，这早于用5x105CFU VPM1002接种的组，其在第11至29天显示出最大尺寸。局部硬结的大小是局部细胞免疫应答的量度。VPM1002组中的特征时间分布与BCG组中的时间分布不同，这符合药物动力学免疫原性结果。
处理组的平均红斑大小与研究天数的相关性如图1所示。
处理组的平均硬结大小与研究天数的相关性如图2所示。
整体耐受性几乎总是被所述对象评定为良好（42％）或非常好（57％）。只有1个对象（BCG组，无在先接种）在第57天将整体耐受性评定为差，但在接种6个月后不再如此。
实验室数据显示，没有临床相关的时间-或剂量-相关性差异。一些对象在基线值已经高于正常范围。在一些对象中，肝功能参数，特别是ALT增加至高于正常范围（19个对象，其中13个未免疫BCG的对象和6个具有在先BCG免疫的对象）。在没有免疫BCG和接受5x105CFU VPM1002的对象组中，在接种后具有异常ALT值的对象数目最高，但在低剂量组观察到更加明显的增加，并且从未超过正常范围的6倍且直到研究结束时均一直下降。
生命体征和ECG参数显示没有时间或剂量相关性的差异。
在接种疫苗后的体检、肝脏超声检查和胸部X射线检查中没有观察到任何临床相关发现。所有QuantiFeron Gold试验均为阴性。
15．结论
药物动力学（次级研究目的）
-达到次级研究目的。
-VPM1002显示出免疫原性，如通过剂量依赖性的IFN-γ刺激所检测的。结果示于图3和4中。
-在定量上和定性上，VPM1002都诱导与BCG不同的免疫反应。
-VPM1002对于已经存在的、BCG诱导的免疫状态具有增强效应。
-多功能CD4+T细胞在所有VPM1002（5×105CFU）组都被上调。结果示于图5中。
安全性（初级研究目的）
-达到初级研究目的：单次接种高达5×105CFU的VPM1002是安全的，且耐受性良好。
-被认为与药物相关的不良事件几乎都是注射部位的症状。AE的数量随剂量增加，并且在5×105CFU的VPM1002和5×105CFU BCG的参考疫苗接种后是相似的。
-局部反应的数量和强度随VPM1002剂量的增加而增加，在最高剂量下的局部反应的发生率是与BCG疫苗接种后所观察到的类似。
-VPM1002的整体耐受性总是被所述对象评定为良好或非常良好。
-实验室数据、生命体征和ECG数据显示没有临床相关的时间-或剂量-相关性差异。
16．总结
VPM1002的安全性良好。VPM1002表现出免疫原性。VPM1002的免疫原性与BCG不同。该利益-风险比率允许继续这种候选疫苗的临床开发。
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Figure IDA00002938586300011
Figure IDA00002938586300021
Figure IDA00002938586300031

Claims (15)

1.人用疫苗，其包含作为活性成分的重组分枝杆菌，所述重组分枝杆菌为脲酶缺陷型并包含编码融合多肽的重组核酸分子，所述融合多肽包含（a）分枝杆菌抗原或其免疫原性片段和（b）吞噬溶酶体逃逸结构域。
2.权利要求1的疫苗，其中所述重组分枝杆菌细胞为重组牛分枝杆菌（BCG）细胞，特别是来自丹麦株布拉格亚型的重组牛分枝杆菌细胞。
3.权利要求1或2的疫苗，其中所述分枝杆菌抗原是Ag85B。
4.权利要求1-3任一项的疫苗，其中所述重组分枝杆菌细胞携带抗生素抗性基因，例如潮霉素抗性基因。
5.权利要求1-3任一项的疫苗，其中所述重组分枝杆菌细胞不携带抗生素抗性基因。
6.权利要求1-3任一项的疫苗，其为rBCGΔUrec::Hly+::Hyg+(VPM1002)。
7.权利要求1-6任一项的疫苗，其施用于未免疫分枝杆菌的对象，例如新生儿。
8.权利要求1-6任一项的疫苗，其施用于预先暴露于分枝杆菌的对象。
9.权利要求1-8任一项的疫苗，其为冻干物，任选地与重构液一起。
10.权利要求1-9任一项的疫苗，其包含约103-104CFU、约104-105CFU或约105-106CFU的剂量。
11.权利要求1-10任一项的疫苗，其用于皮内施用。
12.权利要求1-11任一项的疫苗，用于单剂量或多剂量施用。
13.权利要求1-12任一项的疫苗，其用于上调多功能CD4+T细胞。
14.权利要求1-13任一项的疫苗，其用于抗结核。
15.接种人对象的方法，其包括施用药学有效剂量的重组分枝杆菌，所述重组分枝杆菌为脲酶缺陷型并包含编码融合多肽的重组核酸分子，所述融合多肽包含（a）分枝杆菌抗原或其免疫原性片段和（b）吞噬溶酶体逃逸结构域。
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