MX2013002989A - Micobacteria recombinante como vacuna para uso en humanos. - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con una vacuna recombinante que proporciona inmunidad protectora especialmente contra la tuberculosis en sujetos humanos.

Description

MICOBACTERIA RECOMBINANTE COMO VACUNA PARA USO EN 'HUMANOS CAMPO DE LA INVENCION La invención se relaciona con una' vacuna recombinante novedosa que proporciona inmunidad protectora especialmente contra la tuberculosis en sujetos hurhanos.

En 1993 la tuberculosis (TB) había sido declarada una urgencia global por la Organización Mundial de' la Salud (OMS) . En todo el mundo aproximadamente 2 billones de personas1'2 están infectados con Mycobacterium tuberculosis, el organismo causante de la TB. Todos están en riesgo de desarrollar los síntomas clínicos de la enfermedád. En la mayoría de los individuos la infección con Mycobacterium tuberculosis es inicialmente contenida por las defensas del i anfitrión, y la infección permanece latente. Sin embargo, la infección con TB latente tiene el potencial de desarrollarse en una enfermedad de TB activa en cualquier momento, y los individuos con TB activa se convierten en fuentes de nuevas infecciones. En 2007 el número de nuevos casos de la enfermedad reportados en el reporte' de la OMS (2009) fue de 9,3 millones1 y se está incrementando constantemente. Aproximadamente 1,8 millones de personas mueren de la enfermedad cada año. De este modo, la TB continúa siendo una causa principal de muerte por enfermedades infecciosas en todo el mundo. ¡ El BCG {Bacillus Calmette-Guerin) , una cepa I atenuada de Mycobacterium bovis, ha estado en uso como i vacuna para la TB desde 1921. Hasta la fecha aproximadamente han sido administrados 4 billones de i dosis.3 Sin embargo, la vacunación con ¦ BCG es insuficientemente efectiva para detener la propagación de la TB. El BCG puede proteger contra, o al menosj mejorar, las formas severas de la TB sistémica en niños, particularmente la meningitis. El BCG no parece1 proteger contra la forma pulmonar e infecciosa de la enfermedad.4 De este modo, sin embargo, seria necesaria la interrupción de i la transmisión de la enfermedad. 1 Existen sólo unos cuantos tratamientos con antibióticos disponibles. Ellos están fallando ; cada vez I más, puesto que más y más quedan infectados con cepas de TB resistentes a fármacos múltiples.1,5 Para empeorár aún más la situación, se están propagando nuevas cepas ( altamente patógenas, como el Mycobacterium tuberculosis Bei in/W.6 BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Un objetivo de la presente invención es el desarrollo de una vacuna segura, bien tolerada y eficaz contra la TB, particularmente para quienes residan en áreas endémicas y personas en riesgo en áreas no endémicas. Esta vacuna pretende reemplazar la vacuna de BCG actualmente i usada. La nueva vacuna deberá ser al menos tan potente como la cepa actual y deberá ser más segura que el BCG.5'7 El Mycobacterium tuberculosis y BCG son fagocitados por los macrófagos del anfitrión. La ubicación intrafagosómica produce la adhesión del antigeno bacteriano a través de la vía del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) II. Esto da como resultado una estimulación preferente de las células T CD . Sin embargo, se ha demostrado que las células T citotóxicas CD8 restringidas por el MHC I son cruciales en la inmunidad a Mycobacterium tuberculosis .8,9 En contraste con el i Mycobacterium tuberculosis, el BCG únicamente induce un estimulo débil de las células T citotóxicas CD8.2'3;'10 Por lo tanto, se generó una cepa de BCG recombinante que expresa un dominio de escape fagolisosomal para dirigir los i antigenos micobacterianos hacia la vía de MHC I.2'1 La cepa secreta listeriolisina (Hly) de L. monocytogenes.1'11 Esto permite que la cepa escape del fagosoma de células anfitrionas infectadas perforando la membrana del fagosoma .

La inactivación del gen de ureasa C fue necesaria para asegurar un pH fagosómico ácido para la actividad de Hly óptima. La perforación promueve la translocación del antigeno hacia el citoplasma y facilita el cebado; cruzado a través del incremento de la apoptosis .7' 9 Este proceso imita la inducción inmune del Mycobacterium tuberculosis de manera muy efectiva. Se espera que el modo de acción de cómo resultado una vacuna eficaz y bien tolerada contra la TB.

El concepto ha sido descrito en la W099 101496 y i en la WO 2004/094469, el contenido de las cuales se incorpora aquí como referencia.

En este estudio se aplicó una vacuna de BCG deficiente en ureasa re-combinante en sujetos humanos por i primera vez. El estudio evaluó la seguridad, tolerancia local y sistémica, asi como la inmunogenicidad de la vacuna. Se siguió un diseño secuencial escalando i la dosis con una comparación con BCG comercialmente disponible. Ochenta (80) sujetos en Alemania fueron 'asignados aleatoriamente a 4 grupos que consistían de 20 sujetos cada i uno estratificados por su historia de vacunación qon BCG.

Se efectuó la verificación de 1 seguridad I intensiva, incluyendo los parámetros de laboratorio, evaluaciones de seguridad física y análisis' de ECG i detallado además de la verificación de seguridad estándar. j Una materia objeto de la presente invención es una vacuna para usarse en humanos que comprende como un ingrediente activo un Mycobacterium recombinante el cual es i deficiente en ureasa y que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para polipéptido de fusión que comprende (a) un antígeno de Mycobacterium o un fragmento inmunogénico del mismo, y (b) un dominio de escape fagolisosomal . ¡ Una materia objeto más de la presente invención es un método para vacunar a un sujeto humano, que comprende administrar una dosis farmacéuticamente efectiva de un Mycobacterium recombinante el cual es deficiente en ureasa y que comprende una molécula de ácido nucleico rec'ombinante que codifica para polipéptido de fusión que comprende (a) un antigeno de Mycobacterium o un fragmento inmunogénico del mismos, y (b) un dominio de escape fagolisosomál .

En una modalidad especialmente preferida, la secuencia ureC es inactivada (AUrec) , por | ejemplo, construyendo un vector suicida que contiene un gen de ureC perturbado por un gen marcador de selección, transformando la célula objetivo con el vector y tamizando las células positivas al marcador de selección que tengan un fenotipo negativo de ureasa .

La célula es preferiblemente una célula de M. bovis, una célula de M. tuberculosis, particularmente una célula de M. tuberculosis atenuada u otra micobadteria, por i ejemplo M. microti, M. smegmatis , M.canettii, M.marinum o M. fortuitum. De manera más preferible, la célula es una célula de M. bovis (BCG) recombinante, particularmente una célula de M. bovis recombinante de la cepa ' Danesa de subtipo Praga13. De manera más preferible, la célula es la cepa BCG recombinante Danesa subtipo Praga caracterizada como rBCG AUrec :: Hly+ :: Hyg + (VPM1002).

La célula de Mycobacterium de la invención comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico en la SEC ID No. 1. Esta molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que codifica para el péptido señal (nucleótidos 1 - 120) , una secuencia que codifica para un dominio inmunogénico (nucleótidos 121 - 153) , una secuencia que codifica para un enlazante peptidico (nucleótidos 154 - 210) , una secuencia que codifica para un dominio fagolisosomal (nucleótidos 211 - 1722), una secuencia codifica para un enlazante peptidico (nucleótidos 1723 - 1800) adicional y una secuencia que codifica para un péptido aleatorio (nucleótidos 1801 1870). La secuencia de aminoácidos correspondientes se muestra en la SEC ID No. 2. 1 El dominio capaz de producir una respues;ta inmune es seleccionado de péptidos o polipéptidos inmunogenicos de M. bovis o M. tuberculosis, o de fragmentos inmunogénicos i de los mismos que tienen una longitud de al | menos 6, preferiblemente al menos 8 aminoácidos. Los 1 ejemplos específicos para antígenos adecuados son Ag85B (p 0) de M. tuberculosis (Harth et al., 1996), Ag85B (antígeno a) de BCG de M. bovis (Matsuo et al., 1988), Ag85A de M.

I tuberculosis (Huygen et al., 1996) y ESAT-¡6 de M. tuberculosis (Sorensen et al., 1996, Harboe et al . , 1996 y Andersen et al., 1995). De manera más preferible, el dominio inmunogénico es derivado del antigeno Ag85B. De manera más preferible, el dominio inmunogénico comprende la secuencia de aa.41 a aa.51 en la SEQ ID No. 2.

La molécula de ácido nucleico recombinante i comprende además un dominio de escape fagolisos(omal, es decir un dominio polipeptidico el cual proporciona un i escape del polipéptido de fusión desde del fagblisosoma hacia el citosol de células de mamífero. Preferiblemente, i el dominio de escape fagolisosomal es un dominio ele escape i fagolisosomal de Listeria, el cual es descrito en, la US 5, 733,151, incorporada aquí como referencia. De manera más preferible, el dominio de escape fagolisosomal es1 derivado I del gen de listeriolisina (Hly) de L. monocytogenes . De i manera más preferible, el dominio fagolisosomal es I codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada de: (a) una secuencia nucleotídica que comprende los nucleótidos 211 - 1722, como se muestra en la SEC'ID No. 1, (b) una secuencia nucleotídica la cual codifica para la misma secuencia de aminoácidos de la secuencia jde (a), y (c) una secuencia nucleotídica que se híbrida bajo i condiciones rigurosas con la secuencia de (a) o (b) .

Además de la secuencia nucleotídica descrita en la SEC ID No. 1 la presente invención también comprende una secuencia de ácido nucleico que se híbrida con esta. En la presente invención el término "hibridación" es usjado como se define en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104). De acuerdo con la presente invención, el término "hibridación" es usado si puede ser aún observada una señal de hibridación positiva después de lavar durante una hora con 1 X SSC y 0.1% de SDS a 55°C, preferiblemente a 62°C y de manera más preferible a 68°C, particularmente durante 1 hora en 0.2 X SSC y 0.1%¡ de SDS a 55°C, preferiblemente a 62°C y de manera más preferible a 68 °C. Una secuencia que se híbrida con una 'secuencia nucleotídica como la SEQ ID No. 1 bajo esas condiciones de lavado es un dominio de escape fagolisosomal qué codifica para la secuencia de ácido nucleico preferida por la presente invención.

Una secuencia nucleotídica que codifica para un dominio de escape fagolisosomal como se describió anteriormente puede ser obtenida directamente de un organismo de Listeria o de cualquier fuente repombinante por ejemplo, una célula de E. coli recombihante que contenga la molécula de ácido nucleico de' Listeria correspondiente o una variante de la misma! como se describió anteriormente. ; Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido [ de fusión contiene un secuencia que codifica para un péptido señal. i De manera más preferible, la secuencia señal1 es una secuencia señal activa en icobacterias, preferiblemente en M. bovis, por ejemplo, una secuencia señal de M. bovis nativa. Un ejemplo preferido de una secuencia señal adecuada es la secuencia nucleotídica que codifica para el péptido señal Ag85B que se describe en la SEQ ID ¡No. 1 de los nucleótidos 1 a 120.

Además, se prefiere que sea proporcionado un enlazante peptidico entre el dominio inmunogénico y el dominio de escape fagolisosomal . Preferiblemente, el enlazante peptidico tiene una longitud de 15 a 50 aminoácidos. De manera más preferible, una secuencia que codifica para un enlazante como se muestra en la SEC ID No. 1 del nucleótido 154 al 210 o una secuencia que corresponde a esto con respecto a la degeneración del código genético.

El ácido nucleico puede localizarse sobre un vector recombinante. Preferiblemente, el, vector recombinante es un vector procariotico, es decir, 1 un vector que contiene elementos para la replicación y/o integración genómica en células procariotas. Preferiblemente,, el vector recombinante contiene la molécula de ácido nucleico de la presente invención ligada operativamente con una1 secuencia I de control de la expresión. La secuencia de control de la expresión es preferiblemente una secuencia de control de la expresión activa en. icobacterias, particularmente en M. i bovis. El vector puede ser un vector extracromosomal o un vector adecuado para la integración en el cromosoma. Los ejemplos de esos vectores son conocidos por el experto en la técnica y, por ejemplo, se dan en Sambrook et aí.

En algunas modalidades, la célula de Mycobacterium recombinante puede contener un gen de resistencia a antibióticos, por ejemplo, un 1 gen de resistencia a la higromicina (Hyg) . En otras modalidades, la célula de Mycobacterium recombinante no contiéne un gen I de resistencia a antibióticos. 1 Preferiblemente, la vacuna es una vacuna viva I para usarse en humanos, por ejemplo para usarse en aquellos que residen en áreas endémicas para infecciones micobacterianas , como la tuberculosis o para ¡usarse en personas en riesgo en áreas no endémicas. La vacuna puede ser para administrarse a un sujeto no expuesto a Mycobacterium, por ejemplo, BCG, por ejemplo, un 'humano que no haya sido expuesto previamente a un desafio iñmunogénico I con Mycobacterium o un humano que no haya sido preinmunizado con BCG. Los ejemplos de esos sujetos son por ejemplo recién nacidos o niños, por ejemplo, ele hasta 8 años, por ejemplo en áreas endémicas para infecciones micobacterianas, como la tuberculosis, o personas en riesgo en áreas no endémicas. La vacuna es particularmente adecuada para administrarse a sujetos con padres positivos a VIH, por ejemplo las madres. La vacuna puede ser administrada a sujetos no expuestos a Mycobacterium, por ejemplo BCG, en una población endémica para infecciones por VIH. En otras modalidades, la vacuna puede ser para administrarse a un sujeto preexpuesto a Mycobacterium, por ejemplo, BCG, por ejemplo, niños de 9 años o adultos, por ejemplo, que vivan en áreas con tuberculosis endémica o sujetos preinmunizados con BCG. En esos sujetos, la vacuna de la invención tiene un efecto de refuerzo sobre ¡el estado inmune ya inducido por BCG existente. 1 En una modalidad preferida más, la administración de la vacuna da como resultado en un incremento en la respuesta de IFN-? en sujetos no expuestos o preinmunizados y una sobrerregulación de las células ¡ T CD4+, particularmente de células T CD4+ multifuncionales^.

En una modalidad preferida, la vacuna es un liofilizado que comprende la célula de Mycobacterium y opcionalmente agentes, por ejemplo, glucosa y/o dextran. Opcionalmente, la vacuna comprende adicionalmente¡ un fluido de reconstitución, agua para inyección o solución salina. En algunas modalidades, la vacuna comprende una dosis de aproximadamente 103 - 104 UFC (unidades formadoras de colonias), aproximadamente 104 - 105 UFC o aproximadamente 105 -106 UFC.

Puede ser elegida la administración! a una superficie mucosa (por ejemplo, ocular, intranasal, oral, gástrica, intestinal, rectal, vaginal o el tracto urinario) o vía la ruta parenteral (por ejemplo, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa o intraperitoneal) . La administración intradérmica es especialmente preferida.

En algunas modalidades, la vacuna es para administrarse en una sola dosis incluyendo una inmunización de sujetos no expuestos a Mycobacterium o una vacunación de refuerzo de sujetos previamente expuestos a Mycobacterium, por ejemplo sujetos que han sido previamente vacunados con una vacuna base de Mycobacterium, por ejemplo, una vacuna de BCG a sujetos no expuestos que han entrado en' contacto con micobacterias, por ejemplo, micobacterias patógenas antes de la administración de la vacuna de la invención. De manera alternativa, la vacuna de la invención puede ser administrada en dos o más dosis. Las dosis respectivas pueden ser administradas en intervalos de aproximadamente 1 semana hasta aproximadamente 6 meses o más.

I La vacuna de la presente invención es para usarse i contra infecciones micobacterianas, de mañera más ! particular para usarse contra la tuberculosis.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS I La invención será ilustrada mejor mediante las siguientes Figuras, listados de secuencias y Ejemplos.

La Figura 1 muestra la correlación del tamaño de eritema medio por grupo de tratamiento y día de Estjudio La Figura 2 muestra el tamaño de induración medio por grupo de tratamiento y día de Estudio.

Las Figuras 3a, 3b, 3c muestran los cambios del valor basal para la respuesta de IFN-? después del estímulo con Ag 85B en sujetos no expuestos.

FIG. 3A. PBMC ELISA para IFN-?, FIG. 3B. ELISpot, FIGURA 3C. ELISA de sangre completa para! IFN-?.

Todos los ensayos han sido estimulados ¡con Ag85B 2 g/ml. El VPM1002 (5xl05) en barras rojas, el ¡grupo con BCG en barras azules. Estimulo: Ag 85B 2 g/mL, el VPM1002 incrementa la respuesta de IFN-?.

Las Figuras 4a y 4b muestran los cambios medios del valor basal para la respuesta de IFN-? después del estímulo con Ag 85B en sujetos previamente inmunizados.

FIG 4A. PBMC ELISA para IFN-?, ; FIG. 4B. ELISA de sangre completa para IFN-?.

Todos los ensayos han sido estimulados con Ag85B 2 yg/ml. El VPM1002 (5x10 ) en barras rojas, el' grupo con BCG en barras azules. Estímulo: Ag 85B 2 yg/mL, el VPM1002 incrementa la respuesta de IFN-?. ! Las Figuras 5a, 5b, 5c, 5d muestran el| cambio del valor basal de células T CD4+ individual y multifuncional i en sujetos no expuestos. ' FIG. 5A. La frecuencia de células \ T CD4+ positivas individuales (expresión de IFN-?) reestimuladas con PPD FIG.5B. Frecuencia de células T CD4 multifuncionales (expresión de IFN- ? e IL-2) reestimuladas con Ag85B. ! i FIG.5C. Frecuencia de células T CD4 multifuncionales (que expresan IFN-?, IL-2 y TNF- ) reestimuladas con PPD o , j FIG.5D. Reestimuladas con Ag85B, determinado por FACS ICS de PBMC de adultos inmunizados con VPM10,02 (rojo) o BCG control (azul) .

La SEQ ID No. 1 muestra la secuencia nucleotídica de una molécula de ácido nucleico que codifica1 para un antigeno de 85B de Mycobacterium y un dominio de escape fagolisosomal de listeria.

La SEQ ID No. 2 muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente de la molécula ¡de ácido nucleico de la SEC ID No. 1. ¡ DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Ejemplo Estudio de la Fase clínica 1 para evaluar la seguridad e inmunogenicidad de una vacuna de la ' invención (VPM1002) en comparación con el BCG en voluntarios masculinos sanos estratificados por su historia de vacunación con BCG. 1. Identidad de la vacuna VPM 1002 i La VPM1002 es una vacuna de BCG modificada i genéticamente derivada de la cepa de BCG de Mycobacterium bovis Danesa subtipo Praga caracterizada como rBCG AureC :: Hly+ : : Hyg+. La VPM1002 estuvo disponible como un sedimento liofilizado de Mycobacterium bovis vivo BCGAureC :¡: Hly+ : : Hyg+ . Un frasco contenia 5 x 106 UFC (intervalo i de 2-8 x 106 UFC) de VPM1002. j El gen para la listeriolisina (Hly) había sido incorporado en el gen de ureasa C (ureC) lo cual da como resultado la supresión de la actividad de ureasa C y la introducción de la actividad de listeriolisina. j i La VPM 1002 es resistente a la higromicina (Hyg) . La resistencia a la higromicina sirvió como un marcador de selección durante la modificación genética de la cepa y i servirá como marcador específico en el plan de verificación del organismo modificado genéticamente (GMO) y el plan de emergencia del GMO. La VPM1002 sensible a los antibióticos i comúnmente usados en el tratamiento de infecciones micobacterianas , es decir, isoniazid, rifampicina y etambutol. j La VPM1002 fue suministrada como un sedimento estable por congelación (liofilizado) el cual fue reconstituido con 1 mi de H20 (agua para inyección) . La concentración después de la reconstitución , fue de aproximadamente 5 x 106 ÜFC. Para la administración de dosis de 5 x 103 y 5 x 104 UFC, la suspensión de VPM 1002 reconstituida fue diluida 1:100 o 1:10, respectivamente, usando solución de cloruro de sodio al 0.9% estéril lista para usarse. 2. Objetivos El objetivo primario de este estudio fue investigar la seguridad de una sola dosis de VPM 1002.

El objetivo secundario de este estudio fue investigar la inmunogenicidad de una sola dosis de VPM1002 para la vacunación contra la tuberculosis. 3. Metodología (diseño del estudio) : Esta fue la primera aplicación de la ;VPM1002 a humanos. El estudio siguió un diseño de escalamiento de dosis, controlado, aleatorio, abierto para evaluar la seguridad e inmunogenicidad de una sola dosis de VPM1002.

Una sola vacunación con VPM1002 fue administrada intradérmicamente a sujetos que no habían sido expuestos a bacilo Calmette-Guérin (BCG) o que habían sido previamente inmunizados con BCG (vacunación con BCG documentada en los documentos de vacunación cicatriz de BCG y en ambos casos más prueba en piel con derivados de proteína ; purificado (PPD) no más que débilmente positivos). Fueron estudiados tres escalamientos de dosis de VP 1002. Un grupo de sujetos de referencia recibió una sola dosis de vacuna de BCG.

Después de la vacunación los parámétros de seguridad fueron verificados estrechamente hasta' A horas después de la dosificación. Posteriormente, los, sujetos fueron dados de alta de la clínica, excepto por los primeros 3 sujetos dentro de cada grupo de dosis; quienes permanecieron en la clínica hasta 24 horas después de la vacunación. ' Las evaluaciones de seguridad y farmacqdinámicas se efectuaron hasta el día 57 nuevamente 6 meses después de la vacunación. ' Se efectuó un análisis de seguridad 1 interino después de que los resultados del día 57 estuvieron disponibles para los 3 primeros sujetos de cada cohorte.

Sobre la base de esos datos, la administración de VPM1002 i en dosis de hasta 5 x 105 UFC fue considerada comó segura y bien tolerada. Sobre la base de los puntos finales del estudio secundario de inmunogenicidad se efectuó una reestimación estadística del tamaño de la muestra. Los resultados de este análisis (pl = 0.0119) mostraron que el tamaño de muestra planeado de 80 sujetos incluidos en el estudio fue suficiente. No fue necesaria una extensión del tamaño de la muestra.

I i 4. Número de sujetos i I Se planeó incluir cuarenta (40) sujetos no expuestos a BCG y 40 con vacunación previa con BCG (o positivos a PPD) en este estudio. Los 80 sujetos en su totalidad, excepto un sujeto, cuyo seguimiento se perdió, completaron el estudio de acuerdo a lo planeado - J I I I Tratamiento: BCG = 5 x 10E5 UFC BCG (intervalo de 2-8 x 10E5), I I Grupo 1 = 5 x 10e3 CFU VP 1002 (intervalo de 2 - 8 x 10e3) Grupo 2 = 5 x 10E4 UFC VP 1002 (intervalo de 2 - 8 x 10E4), Grupo 3 = 5 x 10E5 UFC VPM1002 (intervalo de 2 - 8¡ x 10E5) I 5. Diagnóstico y criterios principales para la inclusión: Sujetos masculinos sanos, con edades ¡de 18-55 años (incluidos los extremos), sin ningún síntoma, signos físicos o valores de laboratorio que sugirieran trastornos I o sistémicas o enfermedad actual y sin ningún ¡ signo de infección por tuberculosis activa o latente (LTB1) . La prueba de tuberculina - PPD tenía que ser < 10 mm para i sujetos con vacunación con BCG previa y < 1 mm para sujetos i no expuestos en la línea basal. ¡ 6. Producto de prueba, dosis y modo de administración, número de lote : ¦ El ingrediente activo de VPM1002 fue I Mycobacterium bovis rBCGA ureC : : Hly+ : : Hyg+, Secado por congelación y estandarizad a un número micobacterias viables (unidades formadoras de colonias (UFC) ) por aplicación .

Niveles de dosis: 5 x 10 3 UFC VPM1002 (intervalo de 2-8 x 103 UFC) 5 x 104 UFC VPM1002 (intervalo de 2-8 x 104 UFC) 5 x 105 UFC VP 1002 (intervalo de 2-8 105 UFC) Se administraron aproximadamente 0.1 mi de suspensión de VPM1002 reconstituida y diluida vía inyección intradérmica con una jeringa de 1 mi subgraduada en centésimas de mi (1/100 mi), equipada con una ¡aguja de bisel corto (25G/0.50 mm o mm 26G/0.45 mm, de ,10 mm de longitud) . No se permitieron inyectores de chorro o dispositivo de punción múltiple. 7. Duración del 'tratamiento : Una sola vacunación 1 8. Terapia de referencia, dosis y modo de administración, número de lote : Vacuna de BCG SSI, polvo y solvente para i suspensión para inyección, Statens Serum Institut ¡Denmark.

Después de la reconstitución, 1 dosis, (0.1 mi) contenia: Mycobacterium bovis BCG (Bacillus 1 Calmette-Guérin) , cepa Danesa 1331, vivo atenuado, 2-8 x 105 UFC.

La administración se efectuó como describe para I VPM1002. ¡ 9. Criterios de evaluación : Parámetros de seguridad: ' • incidencia de eventos adversos, perfil de tiempo de eventos adversos, otro perfil de eventos ¡ adversos • evaluación de la reacción local en el' sitio de i vacunación y fotodocumentación de la reacción local en el sitio de la vacunación (días 1, 5, 11, 29, 57, después de 6 meses) ¡ · parámetros de laboratorio de seguridad estándar (hematología, coagulación, química clínica, incluyendo enzimas hepáticas, urianálisis) • prueba de oro QuantiFERON en la lín'ea basal, Día 57 y mes 6 ¡ · examen físico, incluyendo electrocardiograma (ECG) , signos vitales y peso corporal ¡ • rayos X torácidos • imagen sonográfica del hígado en la línea basal, día 57 y mes 6 I · evaluación de tolerancia total de los ¡ suj etos .

I Parámetros de Inmunogenicidad ¡ • Prueba de estimulación de linfocitos (LST) : cantidad de interferón (IFN)-y por célula • técnica de inmunomanchado ligada a enzima (ELISPOT) : número de células mononucleares ,de sangre I j I I I J periférica (PBMC) que secretan IFN-? por el número jtotal de PBMC ! • ensayos de sangre completa (WBA) : cantidad de IFN-? por número de linfocitos , • tinción de citosina intracelular (ICS) (análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)): número de linfocitos CD4+ I y CD8+, que fueron xxx brillantes, xxx brillantes y xxx brillantes ("células triplemente positivas"), por número total de linfocitos. 10. Puntos finales del estudio: I1 j Punto final primario: , Para evaluar la seguridad de una sola ¡ dosis de VP 1002 de acuerdo a lo evaluado por el examen físico, los I signos vitales, ECG, monografía hepática, i rayos X i torácicos, parámetros de seguridad de laboratorio (incluyendo la hematología, coagulación, química clínica y urianálisis) , tolerancia, registro » de medicación concomitante y verificación de efectos adversos. ' i Puntos finales secundarios : Inmunogenicidad, evaluada por i • LST para tuberculina (PPD) con ensayo inmunosolvente ligada a enzima (ELISA) específico i para IFN-subsecuente en sobrenadantes de PBMC. i • ELIspot específico para el número de PBMC que I secretan IFN-? después de la estimulación con PPDJ • células que estimulan WBA durante 3 días con PPD y medición de IFN-? en el plasma por ELISA. i Puntos finales exploratorios: Inmunogenicidad, evacuada por • análisis por FACS para IFN-?, factor de necrosis tumoral (TNF) -a e interleucina (IL)-2 en linfocitos CD4+ y CD8+ tras la estimulación durante la noche con PPD. 1 • análisis por FACS de tinción intracelular con succinimidil ésteres de diacetato de carboxiflupresceína (CFSE) en las células CD4+ y CD8+ tras la estimulación durante la noche con PPD.

• LST, ELIspot, ICS y WBA para la estimulación i cóctel de péptido 85B antígeno de la tuberculosis (TB-Ag) .

• Concentración de anticuerpos en suero contra PPD o el cóctel de péptidos TB-Ag85B; cuantificacijón de los subtipos G de inmunoglobulina (Ig) de esos anticuerpos en suero. ! 11. Métodos estadísticos : Se usaron estadísticas descriptivas , para la evaluación de los parámetros de seguridad. , Se usaron los siguientes procedimientos de prueba estadísticos para los datos de inmunogenicidad: • prueba de Jonckheere Terpstra (a = 0.05) para detectar una relación dosis-respuesta en los cambios ajustados en la línea basal en un escenario de medición i i repetida en comparación con el grupo con BCG. 1 • Modelo de regresión lineal para ajujstar los i cambios de la linea basal a las visitas individuales después de la linea basal en el parámetro respectivo con las covarianzas putativas definidas de manera prospectiva y cofactores del factor de tratamiento (selección hacia atrás) • Estimación de los efectos del tratamiento I (cambios de la linea basal) usando intervalos de confianza de 95%, ambos dentro de grupos y comparando los grupos con VPM1002 y el grupo con BCG. j • Eliminación restrospectiva de covarianzas / cofactores estadísticamente irrelevantes y los mbdelos de i regresión de ajuste.

• Prueba X 2, prueba t, prueba i U para comparaciones exploratorias entre dos grupos de tratamiento • regresión lineal multivariable en lugar de la I prueba de Jonckheere-Terpstra que estima la sensibilidad de los análisis no paramétricos . 1 12. Resumen de Población de estudio: Todos los 80 sujetos fueron incluidos en la población de seguridad y la población con Inatención a Tratar (ITT) . Todos los 80 sujetos proporcionaron evaluaciones válidas e interpretativas para parámetros de inmunogenicidad y no tuvieron una desviación mayor del I protocolo, por lo tanto todos los sujetos fueroni válidos para la inmunogenicidad (I ) y la población por protocolo (PP) . ; La edad promedio total fue de 33.1 años (medias para las diferentes cohortes entre 25.2 y 38.7 años). La I altura media fue de 179.7 cm (entre 177.2 y 181.8 cm) , el peso medio fue de 78.8 kg (entre 73.0 y 82.5 kg) y1 la media de BMI media fue de 24.38 kg/m 2 (entre 22.98,' y 25.78 kg/m2) . Las diferencias entre los grupos de tratamiento fueron consideradas no clínicamente relevantes. 13. Resumen farmacodinamico : 1 El objetivo secundario de este estudio fue i mostrar la inmunogenicidad de la VPM1002. El i objetivo secundario fue satisfecho. El estudio muestra que la VP 1002 induce cuantitativa y cualitativamente respuestas inmunocelulares muy buenas en ambos estratos y los sujetos "no expuestos" y los "preinmunizados" con BCG. iTodos los datos mostraron una respuesta inmune tipo Thl clara producida por la VPM1002. La meta inicial del desarrollo de esa cepa de vacuna particular VP 1002 fue incrementar la respuesta inmune mediada por células e inducir respuestas inmunes cualitativamente mejores que las del ;BCG. Esas metas pudieron ser cumplidas. Además, se muestra también un potencial para una vacunación de refuerzo sobre una respuesta inmune preexistente inducida por BCG. ¡ i i Para la cantidad de IFN-? por número de i linfocitos (LST y WBA de los puntos finales secundarios) se observó una correlación dosis-respuesta entre los grupos que recibieron VPM1002 de estadísticas no param tricas y paramétricas . Dentro de cada estrato, los cambios medios de la línea basal fueron más altos en el grupo con 5 x 105 UFC I de VPM1002 y más bajo en el 5 x 103 UFC de VPM1002(' en todos los días de estudio. Esto prueba el efecto de la VPM1002 al receptor. J El análisis de regresión lineal de los cambios de i la línea basal en los puntos finales secundarios mostró que i la edad, peso, PBMC totales en la línea basal y linfocitos totales en la línea basal no tuvo uri efecto i estadísticamente significativo sobre los resultado¡s.

I En los puntos finales exploratorios se observó un efecto considerable sobre la inducción de células T CD4+ multifuncionales en ambos estratos. 1 I Para concluir, la VPM1002 produce una ¡ respuesta I inmune Thl induciendo IFN-?, no sólo cuantitativamente diferente del BCG sino también cualitativamente j diferente con células T multifuncionales . Estos resultados alientan I el desarrollo adicional de la vacuna. 14. Resumen de seguridad: El punto final primario de este estudio de la fase I fue la evaluación de seguridad de la VPM1002. En realidad, el estudio no reveló ningún problema de seguridad para la VPM1002. ¡ En detalle, una sola vacunación con hasta 5 x 105 CFU de VP 1002 fue bien tolerada. No ocurrió ningún efecto de evento adverso serio (AE) . ' Un total de 80.7% de todos los AE fueron considerados como relacionados con la medicación de estudio I (reacciones adversas a fármacos (ADR) : relación 1 evaluada como "cierto", "probable" o "posible") por el investigador.

I Fueron reportadas ADR por todos los sujetos. Casi Í todos los ADR fueron trastornos en el sitio de ¡inyección (98.0% de todos los ADR).

El número de ADR se incrementó con el incremento I de la dosis. Sin embargo, la frecuencia e intensidad de las ADR fue siempre médicamente aceptable, aún a la dosis más alta de VPM1002 (5 x 105 UFC) . También hubo una ! tendencia i hacia una incidencia mayor de ADR en sujetos con ¡vacunación previa con BCG en comparación con los grupos de tratamiento respectivos sin preinmunización con BCG (239 contra 204 I ADR, respectivamente) . ! Todos los sujetos experimentaron AE. E1J número de AE fue similar en los grupos con BCG 5 x 105 UFC ¡de VPM1002 en sujetos no preinmunizados con vacunación con¡ BCG (76 y 82 AE, respectivamente) y menor en los otros 2 grupos (47 AE después de 5 x 103 CFU de VPM1002 y 53 AE después de 5 x 104 UFC de VPM1002) . En el grupo de sujetos con vacunación previa con BCG el número de ?? fue más alto en el grupo con 5 x 105 UFC de VPM1002 (97 AE) , en comparación con 72 AE en el grupo con BCG y 61 AE en ambos grupos con 5 x 103 CFU y 5 x 10" CFU de VPM1002.

Dentro del estrato de sujetos no expuestos a BCG las ADR observadas en los grupos de tratamiento que recibieron BCG. y VPM1002 en el mismo intervalo de dosis (5 x 105 CFU) fueron de incidencia y severidad comparable (64 contra 72 después de BCG y VP 1002, respectivamente) .

Dentro del estrato de los sujetos preinmunizados con BCG la incidencia de ADR fue ligeramente mayor en los sujetos que recibieron 5 x 105 CFU de VPM1002 en comparación con 5 x 105 UFC de BCG (78 ADR después de VPM1002 cont|ra 60 ADR después de BCG) . Sin embargo la intensidad de las ADR fue comparable entre ambas cohortes y tras una inspección cercana una razón principal de este desequilibrio parece ser una incidencia ligeramente mayor de ulceración del sitio de inyección después de la VP 1002 (4 y 8 eventos después de BCG y VPM1002, respectivamente; 1 á 8 mm de diámetro) asociados con eventos de seguimiento relacionados como costras y exfoliación en el sitio de inyección (6 contra 9 y 4 contra 7 ADR, respectivamente, después de BCG y VPM1002) , todas clasificadas a la mitad de la intensidad y siendo otro indicador de inducción de inmunogenicidad. 1 La mayoría de los AE fueron de intensidad moderada (95.3% de todos los AE) , 25 AE (4.6% de todos los AE) fueron de intensidad moderada y 1 AE ¡(0.1% de todos los AE, reportados después de BCG) fueron de intensidad severa. ! Ningún sujeto descontinuado debido a AE. ' Resumen del número total de AE y trastornos en el sitio de inyección.

Tratamiento: BCG = 5 x 10E5 UFC BCG (intervalo de 2-8 x 10E5), Grupo 1 = 5 x 10E3 UFC VPM 1002 (intervalo de 2 - 8 x 10E3) Grupo 2 = 5 x 10E4 UFC VPM 1002 (intervalo de 2 - 8 x 10E4), ! Grupo 3 = 5 x 10E5 UFC VPM1002 (intervalo de 2 - 8 ; x 10E5) En total, el número de sujetos con reacciones locales y la intensidad de la reacción local se incrementaron con el incremento de la dosis ¡ y fueron comparables para los grupos con 5xl05 UFC de BCG y VPM1002.

Los resultados en sujetos no expuestos a BCG y sujetos preinmunizados con BCG fueron muy similares, no se observo una tendencia clara hacia una reacción local diferente. Las reacciones locales más prominentes fueron eritema e induración. El eritema fue observado en todos los sujetos. El tamaño medio del eritema se incrementó con la; dosis. El tamaño medio del eritema fue similar después de la vacunación con 5xl05 UCF de BCG y VPM1002. En sujetos que recibieron 5xl05 UCF de BCG y VPM1002 el tamaño! medio del eritema fue consistentemente mayor en los sujetos preinmunizados, mientras que en el grupo con BCG el tamaño medio fue mayor en el grupo de sujetos sin inmunización previa con BCG.

Se observó una relación clara con la dosis para el número de sujetos con induración. El tamaño medio de la induración fue mayor en los grupos de tratamiento,1 quienes recibieron 5xl05 UCF de BCG o VPM1002. La induración máxima ocurrió en los grupos vacunados con 5xl05 UCF! de BCG alrededor del día 3 al 5, la cual fue antes qué en los grupos vacunados con 5x10 UCF de VPM1002 que es mostrado en el tamaño máximo los días 11 a 29. El tamaño de la induración local es una medida de una respuesta inmune celular local. El perfil de tiempo característico en los I grupos con VPM1002 difiere del perfil del tiemp!o de los grupos con BCG lo cual concuerda con los resultados de ¡ inmunogenicidad farmacodinámica. j La correlación del tamaño medio del Eritema por grupo de tratamiento y día de estudio se muestra en la figura 1.

La correlación del tamaño medio de la induración por grupo de tratamiento y día de estudio se muestra en la figura 2. ' La tolerancia global fue casi siempre evaluada como buena (42%) o muy buena (57%) por los; sujetos. Únicamente un sujeto (BCG, sin vacunación) califico la i I tolerancia global como mala en el día 57, pero no más a los 6 meses después de la vacunación.

Los datos del laboratorio no < mostraron diferencias relacionadas con el tiempo o ; la dosis clínicamente relevantes. Algunos sujetos tuvierón valores superiores al intervalo normal ya en la linea basal. El parámetro de función hepática, especialmente !ALT, se incrementó por encima del intervalo normal en! algunos sujetos (19 sujetos, 13 sujetos no expuestos a , BCG y 6 sujetos con vacunación previa a BCG). El número de sujetos con valores de ALT a normales después de la vacunación fue mayor en el grupo de sujetos, que no se habían expuesto a BCG y recibieron 5xl05 UCF de VPM1002, pero se observó un incremento más pronunciado en los grupos de dosis' más baja y nunca excedió el intervalo normal de 6 veces y disminuyo hasta el final del estudio. Los signos vitales y parámetros de ECG no mostraron diferencia relacionadas con el tiempo o la dosis.

No se observaron descubrimientos clínicamente relevantes en el examen físico después de la vacunación, sonografía hepática y rayos X torácicos. Todas las pruebas con QuantiFeron fueron negativas. | 15. Conclusiones Farmacodinámica (objetivo del estudio secundario) El objetivo del estudio secundario fue satisfecho. 1 - La VPM1002 muestra inmunogenecidad dé acuerdo a lo detectado por el estímulo de IFN-? dependiente de la dosis. Los resultados se muestran en las figuras 3a, 3b-3c La VP 1002 induce cuantitativamente y i cualitativamente una respuesta inmune diferente 'a la de BCG . ¡ I - La VP 1002 tiene efectos de refuerzos ' sobre el estado inmune, inducido por BCG ya existente. j - Las células de CD4+T multifuncionales fueron sobrerreguladas en todos los cortes del VP 1002 (5xl05 UFC) . Los resultados se muestran en las figuras 5a, 5b, 5c, 5d.

Seguridad (objetivo del estudio primario) - El objetivo del estudio primario fue satisfecho: Una sola vacunación con hasta 5xl05 d 1e UFC de VPM1002 fue segura y bien tolerada.

Los eventos adversos consideradios como relacionados con el fármaco fueron casi siempre trastornos Í del sitio de inyección. El número de AE se incrementó con la dosis y fue similar después de 5xl05 UFC de VP^1002 y la vacuna de referencia de 5xl05 UFC de BCG.

El número e intensidad de las reacciones I locales se incrementó con la dosis de VPM1002, a la dosis más alta la incidencia de reacciones locales fue¡ similar a la observada después de la vacunación con BCG.

- La tolerancia global de la VPM1002 fue siempre evaluada como buena o muy buena por los sujetos, - Los datos de laboratorio, signos vitales y datos de ECG no mostraron diferencias relacionadas con el tiempo o la dosis clínicamente relevantes. 16. Total I El perfil de seguridad de la VP 1002 fue fino.

La VPM1002 mostró inmunogenicidad . El perfil inmünogénico de VPM1002 difiere del BCG. La relación riesgo-beneficio permite continuar el desarrollo clínico de esta vacuna candidata.

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una vacuna para usarse en ; humanos caracterizada porque comprende como un ingrediente activo un Mycobacterium recombinante el cual es deficiente en ureasa y que comprende una molécula de ácido > nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de fusión que comprende (a) un antigeno de Mycobacterium o un fragmento inmunogénico del mismo, y (b) un dominio de escape fagolisosomal .

2. La vacuna de conformidad- con la reivindicación 1, caracterizada porque la célula de Mycobacterium recombinante es una célula de Mycobacterium bovis (BCG) recombinante, particularmente una célula M. bovis recombinante de la cepa europea subtipo Praga. 1

3. La vacuna de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque el antigeno de Mycobacterium es Ag85B.

4. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque la ¦ célula de Mycobacterium recombinante contiene un gen de resistencia a antibióticos, por ejemplo, un gen de resistencia a la higromicina.

5. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque la célula de Mycobacterium recombinante no contiene ningún gen la resitencia a antibióticos. ¡

6. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque es rBCG AUrec: :Hly+: : Hyg+ '(VP 1002) .

. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque 'es para administrarse a un sujeto no expuesto con Mycobacterium, por ejemplo, un recién nacido.

8. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque ¡ es para administrarse a un sujeto previamente expuesto a Mycobacterium. ¡

9. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizada porque ¡ es un liofilizado opcionalmente junto con un fluido de reconstrucción.

10. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizada porque; comprende una dosis de aproximadamente 103-104 UFC, aproximadamente 10 -105 UFC o aproximadamente 105-106 UFC. '

11. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para administración intradérmica .

12. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para administración en una sola dosis o dosis. !

13. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para la sobrerregulación de células CD4+ T multifuncionales .

14. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, para usarse contra tuberculosis.

15. Un método para vacunar un sujeto humano, caracterizado porque comprende administrar una dosis farmacéuticamente efectiva de un Mycobacterium recombinante el cual es deficiente en ureasa que > comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de fusión que comprende (a) un antigeno de Mycobacterium o un fragmento inmunogénico deí mismo, y (b) un dominio de escape fagolisomal.