EA026661B1

EA026661B1 - Вакцина и способ вакцинации против туберкулеза

Info

Publication number: EA026661B1
Application number: EA201300380A
Authority: EA
Inventors: Леандер Гроде
Original assignee: Вакцине Проект Менеджмент Гмбх
Priority date: 2010-09-20
Filing date: 2011-09-16
Publication date: 2017-05-31
Also published as: US20130280287A1; EP2618837A1; PT2618837T; HUE039038T2; HRP20181387T1; DK3360569T3; JP5919276B2; LT2618837T; JP2013538225A; ES2685928T3; WO2012038348A1; PT3360569T; ZA201301187B; KR20140017484A; DK2618837T3; CA2811158A1; SI3360569T1; CU24182B1; MX2013002989A; CU20130041A7

Abstract

Изобретение относится к вакцине против туберкулеза у людей, включающей в качестве активного ингредиента рекомбинантные клетки Mycobacterium bovis, штамм Danish, подтип Prague, а также к способу вакцинации человека против туберкулеза, включающему введение фармацевтически эффективной дозы рекомбинантных клеток Mycobacterium bovis, штамм Danish, подтип Prague.

Description

(57) Изобретение относится к вакцине против туберкулеза у людей, включающей в качестве активного ингредиента рекомбинантные клетки МусоЪас1етип Ьоу1я, штамм Иатяй, подтип Ртадие, а также к способу вакцинации человека против туберкулеза, включающему введение фармацевтически эффективной дозы рекомбинантных клеток МусоЪас1етип Ьоутя, штамм Иатяй, подтип Ртадие.

Изобретение относится к новой рекомбинантной вакцине, обеспечивающей защитный иммунитет у людей, в особенности, против туберкулеза.

В 1993 г. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила туберкулез (ТБ) главной опасностью человечества. Во всем мире приблизительно 2 миллиарда человек¹’² инфицированы МусоЬас1егшт 1иЬегси1о515, микроорганизмом, являющимся причиной ТБ. Все они подвергаются риску развития клинических симптомов заболевания. У большинства индивидуумов заражение МусоЬас1егшт 1иЬегси1о515 первоначально сдерживается защитными силами организма, и инфекция остается скрытой. Однако латентная ТБ-инфекция имеет потенциал для развития в активное заболевание ТБ в любой момент, и индивидуумы с активным ТБ становятся источниками новых заражений. В 2007 г. число новых случаев заболевания по данным, приведенным в докладе ВОЗ (2009 г.), составило 9,3 млн¹ и неуклонно растет. Каждый год приблизительно 1,8 млн человек умирают от этого заболевания. Таким образом, ТБ попрежнему является ведущей причиной смертности от инфекционных заболеваний во всем мире.

С 1921 г. в качестве ТБ-вакцины применяли БЦЖ (бациллу Кальметта-Герена), ослабленный штамм МусоЬас1егшт Ьо\35. К настоящему времени было введено приблизительно 4 млрд доз³. Однако вакцинация с помощью БЦЖ недостаточно эффективна для того, чтобы остановить распространение ТБ. БЦЖ может защитить от тяжелых форм системного ТБ у детей, в особенности, от менингита, или, по меньшей мере, смягчить их протекание. БЦЖ не защищает от легочной и инфекционной формы заболевания⁴. Это, однако, необходимо для того, чтобы прервать передачу заболевания.

Существует лишь несколько доступных способов лечения с помощью антибиотиков. Они быстро теряют свою силу, поскольку все больше и больше пациентов заражаются лекарственно-устойчивыми штаммами ТБ^1,5. Ситуацию ухудшает еще и то, что получают распространение новые высокопатогенные штаммы, такие как МусоЬас!егшт 1иЬегси1о515 ВеушдЖ⁶

Цель настоящего изобретения заключается в разработке безопасной, хорошо переносимой и эффективной вакцины против ТБ, в особенности для жителей эндемичных районов и лиц, подвергающихся риску в неэндемичных районах. Эта вакцина должна заменить используемую в настоящее время БЦЖвакцину. Новая вакцина должна быть, по меньшей мере, настолько же эффективной, как имеющийся в настоящее время штамм, и должна быть безопаснее, чем БЦЖ^5,7.

МусоЬас!егшт 1иЬегси1о515 и БЦЖ подвергается фагоцитозу макрофагами хозяина. Внутрифагосомальная локализация заставляет бактериальный антиген двигаться по пути II главного комплекса гистосовместимости (МНС). Это приводит к предпочтительной стимуляции СИ4 Т-клеток. Однако было показано, что решающую роль в иммунитете к МусоЬас!егшт 1иЬегси1о515 играют СИ8 цитотоксические Тклетки с ограниченным МНС I⁸’⁹. В отличие от МусоЬас!егшт 1иЬегси1о515, БЦЖ индуцирует только слабую стимуляцию СИ8 цитотоксических Т-клеток^2,3,10. Следовательно, для того чтобы направить антигены микобактерий на путь МНС I, создают рекомбинантный штамм БЦЖ, экспрессирующий домен высвобождения из фаголизосом^2,7. Штамм секретирует листериолизин (Н1у) Ь. тоиосу1одеие5⁷'¹¹. Это позволяет штамму высвобождаться из фагосом инфицированных клеток-хозяев, путем образования пор в мембране фагосомы. Инактивация гена уреазы С необходима для обеспечения кислого рН в фагосомах для оптимальной активности Н1у. Перфорация способствует перемещению антигенов в цитоплазму и облегчает примирование перекрестно-реагирующим антигеном посредством усиления апоптоза^7,9. Этот процесс очень эффективно имитирует иммунную индукцию МусоЬас!егшт 1иЬегси1о515. Такой способ воздействия, как ожидается, приведет к эффективной и хорошо переносимой вакцине против ТБ.

Концепция была описана в \УО 99/101496 и в \УО 2004/094469, содержание которых включено в этот документ путем отсылки.

В этом исследовании рекомбинантная дефицитная по уреазе БЦЖ-вакцина впервые была применена на людях. Исследование позволило оценить безопасность, местную и системную переносимость, а также иммуногенность вакцины. Оно было проведено в соответствии с последовательным планом с наращиванием дозы в сравнении с серийно производимой БЦЖ. 80 субъектов в Германии случайным образом разбивали на 4 группы, каждая состояла из 20 субъектов, стратифицированных по их истории БЦЖвакцинации.

В дополнение к стандартному мониторингу безопасности проводили усиленный мониторинг безопасности, включавший показатели лабораторных анализов, оценки физической безопасности и подробный ЭКГ-анализ.

Объект настоящего изобретения представляет собой вакцину для применения на людях, включающую в качестве активного ингредиента рекомбинантную МусоЬас!егшт, которая дефицитна по уреазе и которая включает рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый полипептид, включающий: (а) антиген МусоЬас!егшт или его иммуногенный фрагмент и (Ь) домен высвобождения из фаголизосом.

Дополнительный объект настоящего изобретения представляет собой способ вакцинации людей, включающий введение фармацевтически эффективной дозы рекомбинантной МусоЬас!егшт, которая дефицитна по уреазе и которая включает рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый полипептид, включающий: (а) антиген МусоЬас!егшт или его иммуногенный фрагмент и (Ь) домен высвобождения из фаголизосом.

- 1 026661

В особенно предпочтительном воплощении последовательность игеС инактивируют (ДИтес), например, конструируя вектор-самоубийцу, содержащий ген игеС, нарушенный с помощью селективного маркерного гена, трансформируя клетки-мишени этим вектором и проводя скрининг для отбора положительных по маркеру клеток, имеющих негативный по уреазе фенотип¹².

Клетка предпочтительно представляет собой клетку М. Ьоущ, клетку М. !иЬетси1ок1К, в особенности ослабленную по вирулентности клетку М. !иЬетси1ок1К, или других МусоЬас!епа, например М.шютой, М.ктедтайк, М.саиейи, М.тагшит или М.&йиБит. Более предпочтительно клетка представляет собой рекомбинантную клетку М.Ьоу1К (БЦЖ), в особенности рекомбинантную клетку М.Ьоу1К из датского штамма, субтип Ргадие¹³. Наиболее предпочтительно клетка представляет собой рекомбинантный датский штамм БЦЖ, субтип Ргадие, характеризуемый как гБЦЖ ДИгес::Н1у⁺::Нуд⁺ (УРМ1002).

Клетка МусоЬас!етшт изобретения включает рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, например молекулу нуклеиновой кислоты §ЕЦ ГО Ыо. 1. Данная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность, кодирующую сигнальный пептид (нуклеотид 1-120), последовательность, кодирующую иммуногенный домен (нуклеотид 121-153), последовательность, кодирующую пептид-линкер (нуклеотид 154-210), последовательность, кодирующую домен выхода из фаголизосом (нуклеотид 2111722), последовательность, кодирующую дополнительный пептид-линкер (нуклеотид 1723-1800), и последовательность, кодирующую пептид со случайными заменами (нуклеотид 1801-1870). Соответствующая аминокислотная последовательность показана в §ЕЦ ГО Ыо. 2.

Домен, способный вызывать иммунный ответ, выбирают из иммуногенных пептидов или полипептидов из М.Ьоу18 или М.!иЬетси1ок1К или из их иммуногенных фрагментов, имеющих длину, равную по меньшей мере 6, предпочтительно по меньшей мере 8 аминокислотам. Конкретные примеры подходящих антигенов представляют собой Ад85В (р30) из М.!иЬетси1ок1К (НатШ е! а1., 1996), Ад85В (α-антиген) из М.Ьоу18 БЦЖ (Ма!кио е! а1., 1988), Ад85А из М.!иЬетси1ок1К (Ниудеп е! а1., 1996) и ЕБАТ-6 из М.!иЬетси1ок1К (Богепкеп е! а1., 1996, НагЬое е! а1., 1996 и АиБеткеп е! а1., 1995). Более предпочтительно иммуногенный домен получают из антигена Ад85В. Наиболее предпочтительно иммуногенный домен включает последовательность от аа.41 до аа.51 в §ЕЦ ГО Ыо. 2.

Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты дополнительно включает домен высвобождения из фаголизосом, т.е. полипептидный домен, который обеспечивает высвобождение слитого полипептида из фаголизосомы и выход его в цитозоль клеток млекопитающих. Предпочтительно домен высвобождения из фаголизосом представляет собой домен высвобождения из фаголизосом Ык1епа. который описан в И8 5733151 и включен в этот документ путем отсылки. Более предпочтительно домен высвобождения из фаголизосом получают из гена листериолизина (Н1у) Ь.топосу!одепек. Наиболее предпочтительно домен высвобождения из фаголизосом кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, которую выбирают из (а) нуклеотидной последовательности, включающей нуклеотиды 211-1722, как показано в §ЕЦ ГО Ыо. 1, (Ь) нуклеотидной последовательности, которая кодирует такую же аминокислотную последовательность, как последовательность из (а), и (с) нуклеотидной последовательности, гибридизующейся в жестких условиях с последовательностями из (а) или (Ь).

Помимо нуклеотидной последовательности, изображенной в §ЕЦ ГО Ыо. 1, настоящее изобретение также включает последовательности нуклеиновой кислоты, которые гибридизуются с ней. В настоящем изобретении термин гибридизация применяют так, как он определен в руководстве БатЬгоок е! а1. (Мо1еси1аг С1ошпд. А 1аЬога!огу тапиа1, Со1Б Брппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк (1989), 1,101-1,104). В соответствии с настоящим изобретением термин гибридизация применяют, когда положительный сигнал гибридизации можно по-прежнему наблюдать после отмывки в течение 1 ч в 1х§§С и 0,1% δΌδ при 55°С, предпочтительно при 62°С и более предпочтительно при 68°С, в особенности в течение 1-го часа в 0,2х§§С и 0,1% δΌδ при 55°С, предпочтительно при 62°С и более предпочтительно при 68°С. Последовательность, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью в соответствии с 8ЕЦ ГО Ыо. 1, в таких условиях отмывки представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую домен высвобождения из фаголизосом, которой отдают предпочтение как предмету изобретения.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая домен высвобождения из фаголизосом, такой как описан выше, может быть получена непосредственно из организма Ык!епа или из любого рекомбинантного источника, например из рекомбинантной клетки Е.соБ, содержащей соответствующую молекулу нуклеиновой кислоты Ык!еБа или ее такой вариант, как описан выше.

Предпочтительно, когда рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый полипептид, содержит последовательность, кодирующий сигнальный пептид. Более предпочтительно, когда сигнальная последовательность представляет собой сигнальную последовательность, активную в МусоЬас!ег1а, предпочтительно в М.Ьоу1К, например, нативная сигнальная последовательность М.Ьоу1К. Предпочтительный пример подходящей сигнальной последовательности представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид Ад85В и изображенную в §ЕЦ ГО Ыо. 1 от нуклеотида 1 до 120.

Кроме того, предпочтительно, чтобы между иммуногенным доменом и доменом высвобождения из фаголизосом обеспечивали пептид-линкер. Предпочтительно, чтобы указанный пептид-линкер имел

- 2 026661 длину, равную от 5 до 50 аминокислот. Более предпочтительно, чтобы последовательность кодировала такой линкер, как показан в 8ЕО ГО Νο. 1, от нуклеотида 154 до 210, или последовательность соответствовала ей с учетом вырожденности генетического кода.

Нуклеиновая кислота может быть расположена в рекомбинантном векторе. Предпочтительно рекомбинантный вектор представляет собой прокариотический вектор, т.е. вектор, содержащий элементы для репликации или/и интеграции в геном прокариотических клеток. Предпочтительно рекомбинантный вектор несет молекулу нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, функционально связанную с последовательностью, контролирующей экспрессию. Последовательность контроля экспрессии предпочтительно представляет собой последовательность контроля экспрессии, активную в МусоЬасЮпа. в особенности в Μ.Ηονίδ. Вектор может представлять собой внехромосомный вектор или вектор, подходящий для встраивания в хромосому. Примеры таких векторов известны специалисту в этой области техники и приведены, например, в руководстве 8атЬгоок с1 а1., кирга.

В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка МусоЬас1егшт может нести ген устойчивости к антибиотикам, например ген устойчивости к гигромицину (Нуд). В других воплощениях рекомбинантная клетка МусоЬас1егшт не несет гена устойчивости к антибиотикам.

Предпочтительно вакцина представляет собой живую вакцину для применения у людей, например для применения у проживающих в областях, эндемических по микобактериальным инфекциям, таким как туберкулез, или для применения у людей, находящихся в группе риска в неэндемических областях. Вакцина может быть предназначена для введения, например, субъекту, ранее не вакцинированному БЦЖ, например человеку, который предварительно не был подвергнут заражению МусоЬас1егшт, вызывающему развитие иммунитета, или человеку, который не был предварительно иммунизирован БЦЖ. Примеры таких субъектов, представляют собой, например, новорожденных или детей, например, вплоть до 8 лет, например, в районах, эндемичных по микобактериальным инфекциям, таким как туберкулез, или лиц, находящийся в группе риска в неэндемических областях. Вакцина в особенности подходит для введения субъектам с ВИЧ-положительными родителями, например матерями. Вакцина может быть введена субъектам, ранее не вакцинированным МусоЬас1егшт, например БЦЖ, в популяции эндемичной по ВИЧ-инфекциям. В других воплощениях вакцина может быть предназначена для введения субъекту, ранее вакцинированному МусоЬас1егшт, например БЦЖ, например, детям от 9 лет или взрослым, например, живущим в областях с эндемическим туберкулезом, или субъектам, ранее иммунизированным БЦЖ. У таких субъектов вакцина изобретения обладает усиливающим действием на уже существующий БЦЖиндуцированный иммунный статус.

В дополнительном предпочтительном воплощении введение вакцины приводит к усилению ответа ΙΡΝ-γ у неиммунизированных или ранее иммунизированных субъектов и к стимуляции СГО4' Т-клеток, в особенности полифункциональных СЭ4' Т-клеток.

В предпочтительном воплощении вакцина представляет собой лиофилизат, включающий клетку МусоЬас1егшт, и необязательные средства, например, глюкозу и/или декстран. Необязательно, вакцина дополнительно включает жидкость для восстановления, воду для инъекций или солевой раствор. В некоторых воплощениях вакцина включает дозу, равную примерно 10³-10⁴ КОЕ (колониеобразующие единицы), примерно 10⁴-10⁵ КОЕ или примерно 10⁵-10⁶ КОЕ.

Может быть выбран способ введения через поверхность слизистой оболочки (например, глазной, интраназальный, оральный, желудочный, кишечный, ректальный, вагинальный или через мочевыводящие пути) или через парентеральный путь (например, подкожный, внутрикожный, внутримышечный, внутривенный или внутрибрюшинный). В особенности предпочтительно внутрикожное введение.

В некоторых воплощениях вакцина предназначена для введения в однократной дозе, включая иммунизацию неиммунизированных МусоЬас1егшт субъектов или повторную вакцинацию ранее иммунизированных МусоЬас1егшт субъектов, например субъектов, которые ранее были вакцинированы вакциной на основе МусоЬас1егшт, например нативной БЦЖ вакциной для субъектов, которые вступали в контакт с МусоЬас1епа, например, с патогенной МусоЬасЮпа перед введением вакцины изобретения. Альтернативно, вакцина изобретения может быть введена в двух или более дозах. Соответствующие дозы могут быть введены с интервалом от примерно 1 недели до примерно 6 месяцев или с более длительными интервалами.

Вакцина настоящего изобретения предназначена для применения против микобактериальных инфекций, в особенности, для применения против туберкулеза.

Изобретение будет дополнительно проиллюстрировано с помощью следующих фигур, списков последовательностей и примеров.

Фиг. 1 - средний размер уплотнения по группам обработки и дням исследования;

фиг. 2 - корреляция среднего размера эритемы по группам обработки и дням исследования;

фиг. 3 - средние изменения по сравнению с исходным уровнем ответа ΙΡΝ-γ после стимуляции с помощью Ад85В у неиммунизированных субъектов.

A. РВМС ЕЬ18А для ΙΡΝ-γ,

B. ЕЬ18ро1,

- 3 026661

С. ЕШЛ на цельной крови для ΙΡΝ-γ.

Во всех опытах стимуляцию проводили с помощью 2 мкг/мл Ад85В. УРМ1002 (5х 10⁵) в красных столбиках, группа БЦЖ в синих столбиках. Стимуляция: 2 мкг/мл Ад85В. УРМ1002 увеличивает ответ ΙΡΝ-γ;

фиг. 4 - средние изменения по сравнению с исходным уровнем ответа ΙΡΝ-γ после стимуляции с помощью Ад85В у ранее иммунизированных субъектов.

A. РВМС ЕША для ΙΡΝ-γ,

B. ЕША на цельной крови для ΙΡΝ-γ.

Во всех опытах стимуляцию проводили с помощью 2 мкг/мл Ад85В. УРМ1002 (5х 10⁵) в красных столбиках, БЦЖ группа в синих столбиках. Стимуляция: 2 мкг/мл Ад85В. УРМ1002 увеличивает ответ ΙΡΝ-γ;

фиг. 5 - изменения по сравнению с исходным уровнем одинарных и многофункциональных СЭ4' Тклеток у неиммунизированных субъектов.

A. Частота встречаемости одинарно положительных СЭ4' Т-клеток (экспрессия ΙΡΝ-γ), повторно стимулированных с помощью РРЭ.

B. Частота встречаемости полифункциональных СИ4 Т-клеток (экспрессия ΙΡΝ-γ и Ш-2), повторно стимулированных с помощью Ад85В.

C. Частота встречаемости полифункциональных СИ4 Т-клеток (экспрессирующих ΙΡΝ-γ, Ιί-2 и ΤΝΡ-α), повторно стимулированных с помощью РРЭ, или

Ό. Повторно стимулированных с помощью Ад85В, была определена с помощью ΡАСδ ΙΟ8 РВМС от взрослых, иммунизированных УРМ1002 (красный) или контрольными БЦЖ (синие).

5>ЕО ΙΌ Νο. 1 показывает нуклеотидную последовательность молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген МусоЪас1етшт 85В и домен высвобождения из фаголизосом из листерии.

5>ЕО ГО Νο. 2 показывает аминокислотную последовательность, соответствующую молекуле нуклеиновой кислоты 5>ЕО ГО Νο. 1.

Пример.

Фаза 1 клинического исследования для оценки безопасности и иммуногенности вакцины изобретения (УРМ1002) в сравнении с БЦЖ у здоровых мужчин-волонтеров, стратифицированных по истории БЦЖ-вакцинации.

1. Идентичность вакцины УРМ1002.

УРМ1002 представляет собой генетически идентифицированную БЦЖ-вакцину, полученную из штамма БЦЖ МусоЪас1етшт Ъоур, датский субтип Ргадие, охарактеризованную как гБЦЖ АитеС::Н1у⁺:: Нуд'. УРМ1002 доступна в виде лиофилизированной лепешки живой БЦЖ МусоЪас1етшт Ъоур АитеС::Н1у⁺::Ну§⁺. Один флакон содержит 5х10⁶ КОЕ (диапазон 2-8х10⁶ КОЕ) УРМ1002.

Ген листериолизина (Н1у) был встроен в ген уреазы С (игеС), что привело к удалению активности уреаза С и к введению активности листериолизина.

УРМ1002 устойчив к гигромицину (Нуд). Устойчивость к гигромицину применяют в качестве селективного маркера в процессе генно-инженерной модификации штамма, и она служит в качестве специфического маркера для осуществления (ОМО)-мониторинга и связанного с ОМО плана действий в чрезвычайной ситуации для генетически идентифицированного организма. УРМ1002 чувствителен к антибиотикам, традиционно применяемым при лечении микобактериальных инфекций, т.е. к изониазиду, рифампицину и этамбутолу.

УРМ1002 поставляют в виде высушенной сублимации (лиофилизированной) лепешки, которую восстанавливают в 1 мл Н₂О (вода для инъекций). Концентрация после восстановления равна примерно 5х10⁶ КОЕ. Для введения доз, равных 5х10³ и 5х10⁴ КОЕ, восстановленную суспензию УРМ1002 разводят 1:100 или 1:10 соответственно, применяя стерильный, готовый к употреблению 0,9%-ный раствор хлорида натрия.

2. Цели исследования.

Основная цель данного исследования заключалась в изучении безопасности однократных доз УРМ1002.

Дополнительной целью данного исследования было изучение иммуногенности однократных доз УРМ1002 для вакцинации против туберкулеза.

3. Методика исследования (план исследования).

Это было первое применение УРМ1002 на людях. Исследование следовало открытому, рандомизированному, контролируемому плану с увеличением дозы для оценки безопасности и иммуногенности однократной дозы УРМ1002.

При однократной вакцинации УРМ1002 вводят внутрикожно субъектам, которые или не были иммунизированы бациллой Кальметта-Герена (БЦЖ), или были ранее иммунизированы БЦЖ (задокументированная БЦЖ-вакцинация в документах о вакцинации, или рубец от БЦЖ, и в обоих случаях, плюс кожный тест на очищенный туберкулин (РРИ) не более чем слабо положительный). Исследовали три возрастающие дозы УРМ1002. Субъекты в группе сравнения получали однократную дозу БЦЖ-вакцины.

- 4 026661

После вакцинации тщательно контролировали параметры безопасности в течение 4 ч после введения дозы. После этого субъектов выписывали из клиники, за исключением первых 3 субъектов из каждой группы, различавшейся по величине получаемой дозы, которых оставляли в клинике на 24 ч после вакцинации.

Безопасность и фармакодинамические оценки проводили до дня 57 и снова через 6 месяцев после вакцинации.

Промежуточный анализ безопасности проводили после получения результатов анализов дня 57 от первых 3 субъектов из каждой когорты. На основании этих данных введение УРМ1002 в дозах, вплоть до 5х10⁵ КОЕ, рассматривали как безопасное и хорошо переносимое. На основании вторичных конечных критериев оценки иммуногенности проводили статистическую переоценку размера выборки. Результаты этого анализа (р1 = 0,0119) показали, что запланированный размер выборки, равный 80 субъектам, которых включили в исследование, был достаточным. Не было необходимости в расширении размера выборки.

4. Число субъектов.

В это исследование планировали включить сорок (40) БЦЖ-неиммунизированных субъектов и 40 субъектов, ранее вакцинированных БЦЖ (или ΡΡΌ-положительных). Все 80 субъектов, за исключением 1 субъекта, который был потерян для наблюдения, завершили исследование, как было запланировано.

Когорты исследования без предварительной БЦЖ- ί с предварительной БЦЖ-вакцинацией вакцинации и РРР-отрицательные ί___или РРР-положительные

ТМ/Т+м »гггг« Ί ΐη™’,™» I I I СГЧМ/ 1 ' Глч.пгте. Π ' Γηνππο'

; Группа обработки	БЦЖ	Группа 1	' Группа 2	Группа 3	“ЁЦЖ	Группа 1	Группа 2	Группа 3	Сумма
	! п{%)	η (%)	Г η (%)	η (%)	π(%)	η (%)	η (%)	η(%)	η(%)
: Включенных .субъектов		10	¹⁰	10	10	10	10	10	80
Завершивших ϊсубъектов	10 (100)	10 (100)	: ю ί (100)	Ь ; ίίΊ !	10 (100)	10 (100)	10 (100)	9 (90)	79 (98,8)
Исключенных субъектов Основание	: ⁰	0	' 0 1	0	0	о	0	1 _._0°λ......	1 _„ίΐ.3ϊ__
Другие основания	-	-	ί -					.4 ПОД

Обработка: БЦЖ = 5х 10Е5 КОЕ БЦЖ (диапазон 2-8х 10Е5)

Группа 1 = 5х10Е3 КОЕ УРМ1002 (диапазон 2-8х10Е3)

Группа 2 = 5х 10Е4 КОЕ УРМ1002 (диапазон 2-8х 10Е4),

Группа 3 = 5х10Е5 КОЕ УРМ1002 (диапазон 2 - 8х10Е5).

5. Диагноз и основной критерий для включения.

Здоровые субъекты-мужчины в возрасте 18-55 лет (предельные значения включены) без каких-либо симптомов, физических признаков или данных лабораторных анализов, на основании которых можно было предположить наличие системных заболеваний или текущего заболевания, и без каких-либо признаков активной или латентной туберкулезной инфекции (ЬТВ1). Туберкулин-РРО тест на исходном уровне должен был быть <10 мм для субъектов, ранее вакцинированных БЦЖ, и <1 мм для неиммунизированных субъектов.

6. Тестируемый продукт, доза и способ введения, номер серии.

Активный ингредиент УРМ1002 представляет собой МусоЪас1епиш ЪоуЬ гБЦЖ ДигеС::Н1у⁺::Ну§⁺, высушенную сублимацией и стандартизированную по числу жизнеспособных (колониеобразующих единиц (СРИ)) микобактерий на аппликацию.

Уровень дозы: 5х10³ КОЕ УРМ1002 (диапазон 2-8х10³ КОЕ)

5х 10⁴ КОЕ УРМ1002 (диапазон 2-8х 10⁴ КОЕ)

5х10⁵ КОЕ УРМ1002 (диапазон 2-8х10⁸ КОЕ).

Приблизительно 0,1 мл реконструированной и разведенной суспензии УРМ1002 вводят посредством внутрикожной инъекции шприцом на 1 мл, отградуированным на сотые доли мл (1/100 мл) и оснащенным короткой конической иглой (250/0,50 мм или 260/0,45 мм, 10 мм в длину). Не разрешено применять безыгольный шприц или устройство для множественных инъекций.

7. Длительность обработки: одна однократная вакцинация.

8. Препарат сравнения, доза и способ введения, номер серии: БЦЖ-вакцина 881, порошок и растворитель для суспензии для инъекции Государственного института сывороток (81а1еп5 8егит ΙηκΙίΙι,ιΙ), Дания.

После восстановления 1 доза (0,1 мл) содержит МусоЪас1егшт ϋονίδ БЦЖ (бацилла КальметтаГерена), датский штамм 1331, живая ослабленная, 2-8х10⁵ КОЕ.

Введение проводили, как описано для УРМ1002.

9. Критерии оценки: параметры безопасности:

частота возникновения нежелательных явлений, временной профиль нежелательных явлений, другие профили нежелательных явлений, оценка местной реакции в месте вакцинации и фотодокументирование местной реакции в месте

- 5 026661 вакцинации (в день 1, 5, 11, 29, 57, через 6 месяцев), стандартные лабораторные исследования на безопасность (гематология, коагуляция, клиническая биохимия, включая, ферменты печени, общий анализ мочи), квантифероновый тест (ОиапИРсгоп §о16 1сь1) на исходном уровне, в день 57 и на месяц 6, врачебный осмотр, включая электрокардиограмму (ЕСО), основные показатели состояния организма и масса тела:

рентгенография органов грудной клетки, ультразвуковое изображение печени на исходном уровне, в день 57 и месяц 6, даваемая субъектами оценка переносимости в целом.

Параметры иммуногенности:

тест стимуляции лимфоцитов (Ь8Т): количество интерферона (ΙΡΝ)-γ на клетку, точечный иммуноферментный метод (ΕΜκροΐ): число секретирующих ΙΡΝ-γ мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) на общее число РВМС, анализ цельной крови (\УВА): количество ΙΡΝ-γ на число лимфоцитов, окрашивание внутриклеточных цитокинов (1С8) (анализ с помощью сортировки флуоресцентноактивированных клеток (РЛС8)): число СЭ4+ и СЭ8+ лимфоцитов; которые были ххх-яркие, ххх-яркие и ххх-яркие (тройные положительные клетки); на общее число лимфоцитов.

10. Критерии оценки исследования.

Основной критерий оценки.

Оценить безопасность однократной дозы УРМ1002, определяемой по врачебному осмотру, основным показателями состояния организма, ЭКГ, ультразвуковому исследованию печени, рентгенографии органов грудной клетки, лабораторным исследованиям на безопасность (включая гематологию, коагуляцию, клиническую биохимию и общий анализ мочи), переносимости, регистрации сопутствующей лекарственной терапии и мониторингу нежелательных явлений.

Вторичные критерии оценки: иммуногенность, оцениваемая по

Ь8Т на туберкулин (РРЭ) с последующим проведением специфического к ΙΡΝ-γ твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЬ18Л) на супернатантах от РВМС,

ЕЬНроЕанализу, специфическому на число секретирующих ΙΡΝ-γ РВМС, после стимуляции с помощью РРЭ.

\УВЛ стимулированных клеток в течение 3 дней с РРЭ и измерение ΙΡΝ-γ в плазме методом ЕБ-ΙδΑ.

Поисковые критерии оценки.

Иммуногенность, оцениваемая по

РЛС8-анализу Ιί’δ для ΙΡΝ-γ, фактора некроза опухоли (ΤΝΡ)-α и интерлейкина (ЕЬ)-2 в СЭ4+ и СЭ8+ лимфоцитах после стимуляции в течение ночи с помощью РРЭ,

ΡΑСδ-анализу внутриклеточного окрашивания карбоксифлуоресцеин диацетат-сукцинимидил эфирами (СΡδΕ) в СЭ4+ и СЭ8+ лимфоцитах после стимуляции в течение ночи с помощью РРЭ,

ΕδΤ, ЕЫбро!, Ιί'δ и \УВЛ для стимуляции смесью пептидов туберкулезного антигена (ТБ-Ад) 85Ь, концентрации в сыворотке антител к РРЭ или к смеси пептидов ТВ-Ад85В; количественному определению иммуноглобулинов подтипа (Ι§)0 в этих сывороточных антителах.

11. Статистические методы.

Для оценки параметров безопасности применяли описательную статистику.

Для данных по иммуногенности применяли следующую статистическую проверку:

критерий Джонкхиера-Терпстра (α = 0,05) для установления зависимости доза-ответ в скорректированных изменениях по отношению к исходному уровню в повторных наборах измерений в сравнении с БЦЖ-группой, линейная регрессионная модель для корректировки изменений от исходного уровня до индивидуальных визитов после исходного уровня в соответствующем параметре, с проспективно определенными предполагаемыми ковариатами и кофакторами фактора обработки (пошаговое исключение), оценка эффектов обработки (изменения по сравнению с исходным уровнем) применяя 95%-ные доверительные интервалы как в пределах групп, так и при сравнении УРМ1002-групп с БЦЖ-группой, обратное исключение статистически несущественных ковариат/кофакторов в сглаживающей регрессионной модели, %2-критерий, ΐ-критерий, И-критерий для поискового сравнения между двумя группами обработки, многофакторная линейная регрессия вместо критерия Джонкхиера-Терпстра для оценки чувствительности непараметрических анализов.

12. Популяция исследования в целом.

Все 80 субъектов были включены в популяцию по исследованию безопасности и в популяцию в зависимости от назначенного лечения (ΙΤΤ). Все 80 субъектов предоставили действительные и интерпретируемые оценки для критериев иммуногенности и не имели никаких серьезных отклонений от протокола; следовательно, включение всех субъектов в популяцию на иммуногенность (ΙΜ) и в популяцию в соответствии с протоколом (РР) было правомерно.

- 6 026661

Общий средний возраст составил 33,1 года (среднее для разных когорт между 25,2 и 38,7 годами). Средний рост был равен 179,7 см (между 177,2 и 181,8 см), средняя масса тела была равна 78,8 кг (между 73,0 и 82,5 кг) и средний ΒΜΙ был равен 24,38 кг/м² (между 22,98 и 25,78 кг/м²). Считали, что различия между группами обработки не имели клинического значения.

13. Общая фармакодинамика.

Дополнительная цель этого исследования заключалась в том, чтобы продемонстрировать иммуногенность УРМ1002. Дополнительная цель была достигнута. Исследование показало, что УРМ1002 индуцирует количественно и качественно очень хорошие клеточные иммунные ответы в обеих стратах неиммунизированных БЦЖ субъектов и ранее иммунизированных БЦЖ субъектов.

Все полученные данные показали ясный иммунный ответ по типу ТЫ, вызываемый УРМ1002. Первоначальная цель разработки этого конкретного вакцинного штамма УРМ1002 заключалась в увеличении опосредуемого клетками иммунного ответа и в индукции качественно лучших иммунных ответов, по сравнению с БЦЖ. Эти цели могут быть достигнуты. Кроме того, оно демонстрирует также потенциал добавочной вакцинации на существовавший ранее иммунный ответ, индуцированный БЦЖ.

Что касается количества ΙΡΝ-γ на число лимфоцитов (вторичные критерии оценки Ь8Т и ΑΒΆ), корреляцию в зависимости доза-ответ между группами, которые получали УРМ1002, наблюдали с помощью параметрических и параметрических критериев. В рамках каждой страты, средние изменения по сравнению с исходным уровнем были самыми высокими в группе, получавшей 5х10⁵ КОЕ УРМ1002, и были самыми низкими в группе, получавшей 5х10³ КОЕ УРМ1002, на каждый день исследования. Это доказывает влияние УРМ1002 на реципиента.

Линейный регрессионный анализ изменений по сравнению с исходным уровнем во вторичных критериях оценки показал, что возраст, масса тела, общие РВМС на исходном уровне и суммарные лимфоциты на исходном уровне не имели статистически значимого влияния на результаты.

В поисковых критериях оценки в обеих стратах наблюдали значительное влияние на индукцию полифункциональных СЭ4+ Т-клеток.

В заключение, УРМ1002 вызывает иммунный ответ ТЫ, индуцируя ΙΡΝ-γ, не только количественно отличный от БЦЖ, но также качественно различимый с многофункциональными Т-клетками. Эти результаты служат поводом для дальнейшей разработки вакцины.

14. Суммарные результаты по безопасности.

Основной критерий оценки этой фазы I исследования заключался в оценке безопасности УРМ1002. Действительно, исследование не выявило никаких проблем с безопасностью для УРМ1002.

Конкретнее, однократная вакцинация УРМ1002 в дозе вплоть до 5х10⁵ КОЕ была хорошо переносимой. Не возникало никаких серьезных неблагоприятных событий (АЕ).

В целом 80,7% всех АЕ рассматривались исследователем как связанные с исследуемым лекарственным препаратом (нежелательные реакции на лекарственный препарат (ΑΌΚ): воздействие, оцененное как некоторое, вероятное или возможное).

Об ΑΌΚ сообщали все субъекты. Практически все ΑΌΚ представляли собой нарушения в месте инъекции (98,0% от всех ΑΌΚ).

Число ΑΌΚ увеличилось с увеличением дозы. Однако частота и интенсивность ΑΌΚ всегда была медицински приемлемой, даже при самой высокой дозе УРМ1002 (5х 10⁵ КОЕ). Существовала также тенденция к увеличению случаев ΑΌΚ у субъектов, предварительно вакцинированных БЦЖ по сравнению с соответствующими группами обработки без предварительной БЦЖ-иммунизации (239 против 204 ΑΌΚ соответственно).

Все субъектам испытывали АЕ. Число АЕ было одинаковым в группах БЦЖ и 5х 10⁵ КОЕ УРМ1002 у субъектов, ранее неиммунизированных БЦЖ вакцинацией (76 и 82 АЕ соответственно), и ниже в 2 других группах (47 АЕ после 5х10³ КОЕ УРМ1002 и 53 АЕ после 5х10⁴ КОЕ УРМ1002). В группе субъектов с предварительной БЦЖ-вакцинацией число АЕ было самым высоким в группе 5х10⁵ КОЕ УРМ1002 (97 АЕ) по сравнению с 72 АЕ в БЦЖ-группе и 61 АЕ в обеих группах 5х 10³ КОЕ и 5х 10⁴ КОЕ УРМ1002.

В рамках страты БЦЖ-неиммунизированных субъектов ΑΌΚ, наблюдаемые в группах с обработкой, которые получали БЦЖ и УРМ1002 в одном и том же диапазоне дозы (5х 10⁵ КОЕ), были сопоставимы по частоте возникновения и тяжести (64 против 72 после БЦЖ и УРМ1002 соответственно). В рамках страты предварительно иммунизированных БЦЖ субъектов частота возникновения ΑΌΚ была незначительно выше у субъектов, которые получали 5х10⁵ КОЕ УРМ1002 по сравнению с 5х10⁵ КОЕ БЦЖ (78 ΑΌΚ после УРМ1002 против 60 ΑΌΚ после БЦЖ). Однако интенсивность ΑΌΚ была сопоставима между обеими когортами, и при ближайшем рассмотрении представляется, что основная причина этого несоответствия заключается в незначительно более высокой частоте случаев появления изъязвлений на месте инъекции после УРМ1002 (4 и 8 случаев после БЦЖ и УРМ1002 соответственно; 1-8 мм в диаметре), связанных с соответствующими последовавшими случаями, такими как образование струпьев и шелушение в месте инъекции (6 против 9 и 4 против 7 ΑΌΚ соответственно, после БЦЖ и УРМ1002), все они, по оценкам, были легкими по интенсивности и представляли собой еще один индикатор индукции иммуногенности.

- 7 026661

Большинство из АЕ были легкими по интенсивности (95,3% от всех АЕ), 25 АЕ (4,6% от всех АЕ) были умеренными по интенсивности и 1 АЕ (0,1% от всех АЕ, зарегистрировано после БЦЖ) было тяжелым по интенсивности.

Ни один из субъектов не выбыл из исследования из-за АЕ.

Сводная таблица по общему числу АЕ и нарушениям в месте инъекций

Класс системы органов Предпочти- тельный Термин	без предварительной БЦЖ-вакцинации и ΡΡϋ-отрицательные	с предварительной БЦЖ-вакцинацией или ΡΡϋ-пол ожите л ьны е
БЦЖ	Группа 1	Группа 2	Группа 3	БЦЖ	Группа 1	Группа 2	Группа 3
п—10	п=10	п=10	п=10	п=10	п=10	п=10	п=10
X (у, Ζ%)	X (у, ζ%)	х (у, ζ%)	х (у, ζ%)	X (у, ζ%)	х (у, ζ%)	х (у, ζ%)	X (у, ζ%)
Сумма	76 (10, 100)	47 (10, 100)	53 (10, 100)	«2 (10, 100)	72 (10, 100)	61 (10, 100)	61 (ίο, юо)	97 (10, 100)
Общие нарушения и состояние места введения
Всего	63 (10, 100)	30 (10, 100)	34 (10, 100)	6В (10, 100)	60 (10, 100)	46 (10, 100)	51 (10,100)	72 (10, 100)
Дискомфорт в месте инъекции	-	-	-	-	1 (1, 10.0)	-	1 (1, 10.0)	2 (2,20.0)
Эритема в месте инъекции	11 (10, 100)	10 (10, 100)	10 (10, 100)	10 (10, 100)	10 (10, 100)	10 (10, 100)	10 (10, 100)	10 (10, 100)
Шелушение в месте инъекции	3 (3, 30.0)	-	-	7 (7, 70.0)	4 (4, 40.0)	2 (2, 20.0)	4 (4, 40.0)	7 (7, 70.0)
Уплотнение в месте инъекции	12 (10, 100)	13 (8, 80.0)	12 (10, 100)	13 (10, 100)	15 (10, 100)	14 (10, 100)	11 (10, 100)	14 (10, 100)
Боль в месте инъекции	3 (3, 30.0)	1 (1, 10.0)	2 (2, 20.0)	4 (4, 40.0)	2 (2, 20,0	2 (2, 20.0)	-	4 (4,40.0)
Зуд в месте инъекции	7 (7, 70.0)	2 (2,20.0)	3 (3, 30.0)	7 (7, 70.0)	7 (7, 70.0)	4 (3, 30.0)	6 (5, 50.0)	7 (7, 70.0)
Струпья в месте инъекции	9 (6, 60.0)	1 (1, Ю.0)	2 (2, 20.0)	9 (8, 80.0)	6 (5, 50.0)	5 (4, 40.0)	8 (7, 70.0)	9 (8, 80.0)
Опухание в месте инъекции	11 (8, 80.0)	2 (2,20.0)	4 (4,40.0)	13 (8, 80.0)	ю (6, 60.0)	5 (4, 40.0)	8 (6, 60.0)	11 (9, 90.0)
Изъязвление в месте инъекции	6 (5, 50.0)	1 (1, 10.0)	1 (1, 10.0)	5 (5, 50.0)	4 (4, 40.0)	2 (2, 20.0)	3 (3, 30.0)	8 (8, 80.0)
Нагноение в месте инъекции	-	-	-	-	1 (1, 10.0)	-	2 (2,20.0)	3 (3, 30.0)
Пустулы	1	-	1	3	-	-	-	3
в месте инъекции	(1, 10.0)		(1, 10.0)	(3, 30.0)				(3,30.0)

Обработка: БЦЖ = 5х 10Е5 КОЕ БЦЖ (диапазон 2-8х 10Е5),

Группа 1 = 5х10Е3 КОЕ ΥΡΜ1002 (диапазон 2-8х10Е3),

Группа 2 = 5х 10Е4 КОЕ ΥΡΜ1002 (диапазон 2-8х 10Е4),

Группа 3 = 5х10Е5 КОЕ ΥΡΜ1002 (диапазон 2-8х10Е5).

В целом, число субъектов с местными реакциями и интенсивность местной реакции возрастало с увеличением дозы и было сопоставимо для групп 5х10⁵ КОЕ БЦЖ и УРМ1002. Результаты у БЦЖ неиммунизированных субъектов и субъектов, ранее иммунизированных БЦЖ, были, в общем, похожи, не наблюдали четкой тенденции в различиях для местной реакции. Наиболее заметные местные реакции представляли собой эритему и уплотнение. Эритему наблюдали у всех субъектов. Средний размер эритемы увеличивался с увеличением дозы. Средний размер эритемы был одинаковым после вакцинации 5х10⁵КОЕ БЦЖ и УРМ1002. У субъектов, которые получали 5х10⁵ КОЕ УРМ1002, средний размер эритемы был устойчиво выше у ранее иммунизированных субъектов, в то время как в БЦЖ-группе средний размер был выше в группе субъектом, предварительно иммунизированных БЦЖ.

Не наблюдали ясной зависимости от дозы для числа субъектов с уплотнением. Средний размер уплотнения был наибольшим в группах обработки, получавших 5х10⁵ КОЕ БЦЖ или УРМ1002. Максимальное уплотнение имело место в группах, вакцинированных 5х10⁵ КОЕ БЦЖ примерно на 3-5 день, что раньше по сравнению с группами, вакцинированными 5х10⁵ КОЕ УРМ1002, которые продемонстрировали максимальный размер на дни 11-29. Размер местного уплотнения представляет собой меру местного клеточного иммунного ответа. Характеристический временной профиль в группах УРМ1002 отличался от временного профиля в БЦЖ-группах, что согласуется с фармакодинамическими данными об

- 8 026661 иммуногенности.

Соотношение среднего размера уплотнения по группам обработки и днями исследования показано на фиг. 1.

Соотношение среднего размера эритемы по группам обработки и днями исследования показано на фиг. 2.

Субъекты, в целом, почти всегда оценивали переносимость как хорошую (42%) или очень хорошую (57%). Только 1 субъект (БЦЖ, без предварительной вакцинации) оценил общую переносимость как плохую на день 57, но не дольше чем на 6 месяц после вакцинации.

Данные лабораторных анализов не показали клинически значимых различий, зависимых от времени или величины дозы. Некоторые субъекты имели величины, превышавшие нормальные границы уже на исходном уровне. Печеночный функциональный критерий, в особенности, ЛЬТ, вырос выше границы нормы у некоторых субъектов (у 19 субъектов, 13 БЦЖ-неиммунизированных субъектов и 6 субъектов с предварительной БЦЖ-вакцинацией). Число субъектов с аномальными значениями ЛЬТ после вакцинации было наибольшим в группе субъектов, которые не были иммунизированы БЦЖ и получали 5х10⁵КОЕ УРМ1002, но более выраженные увеличения наблюдали в группе, получавшей более низкую дозу, и они никогда не превышали границу нормы более чем в 6 раз и снижались до конца исследования.

Основные показатели состояния организма и показатели ЭКГ не продемонстрировали различий, связанных со временем или величиной дозы.

Никаких клинически значимых результатов не обнаружили в ходе врачебного осмотра после вакцинации, ультразвукового исследования печени и рентгенографии органов грудной клетки. Все результаты квантифероновых тестов были отрицательными.

15. Выводы.

Фармакодинамика (дополнительная цель клинического исследования).

Дополнительная цель клинического исследования была достигнута.

УРМ1002 показывает иммуногенность, как было детектировано по дозозависимой стимуляции ΙΡΝγ. Результаты показаны на фиг. 3 и 4.

УРМ1002 индуцирует количественно и качественно отличный иммунный ответ по сравнению с БЦЖ.

УРМ1002 обладает эффектом повышения на уже существующий, БЦЖ-индуцированный, иммунный статус.

Многофункциональные СЭ4' Т-клетки стимулируются во всех когортах УРМ1002 (5х 10⁵ КОЕ). Результаты показаны на фиг. 5.

Безопасность (основная цель исследования).

Основная цель исследования была достигнута: однократная вакцинация УРМ1002 вплоть до 5х10⁵КОЕ была безопасной и хорошо переносимой.

Неблагоприятные события, рассматриваемые как связанные с лекарственным препаратом, почти всегда представляли собой нарушения на месте инъекции. Число АЕ возрастало с увеличением дозы и было сходным после 5х 10⁵ КОЕ УРМ1002 и после вакцины сравнения 5х 10⁵ КОЕ БЦЖ.

Число и интенсивности местных реакций возрастали с увеличением дозы УРМ1002, в самой высокой дозе число случаев возникновения местных реакций было сходным с числом, наблюдаемым после вакцинации БЦЖ.

Общая переносимость УРМ1002 всегда оценивалась субъектами как хорошая или очень хорошая.

Данные лабораторных анализов, основные показатели состояния организма и результаты ЭКГ не показали клинически значимых различий, зависимых от времени или от величины дозы.

16. Заключение.

Профиль безопасности УРМ1002 был отличным. УРМ1002 демонстрирует иммуногенность. Иммуногенный профиль УРМ1002 отличался от такового для БЦЖ. Соотношение ожидаемая польза-риск позволяет продолжить клиническую разработку этой вакцины-кандидата.

- 9 026661

Список литературы

1. 1Уог1д НеаНЬ ОгдашгаХюп (ΨΗΟ) (2009). ΨΗΟ ЕерогХ 2009 - О1оЬа1ХиЬегси1оз13 сопХго1-ер1детхо1оду, зХгахеду, йпапстд. λΥΉΟ, Оепеуа.

2. Апдетзеп Р. (2007). ТиЬегси1оз1з уасстез - ап ирдаХе. ШХ. Ε,βν. МхсгоЫок 5,484487.

3. Мшгискег ΗλΥ, 8χείηΗοίϊ и, КоЫег А, Кгаизе М, Ьагаг Ό, Мех Р, М!ек1еу О, Каийпапп ЗН. (2007). Роог согге1аХюп ЬеХхуееп ВСО уасстаХюп-тдисед Т сеП гезропзез апд ргоХссХюп адахпзХ ХиЬегси1оз1з. Ргос. ЫаЙ. Асад. Зек Б. 3. А. 104,12434-12439.

4. Уоипд О, Буе С. (2006). Тке деуе1ортепх апд ЬпрасХ οί ХиЬегси1оз18 уасстез. СеП. 124, 683-687.

5. Каийпапп ЗН. (2007). ТЬе сопхпЬихкт οί хттипо1оду Ιο ХЬе гаХюпа! дезхдп οί ηονεί апХ1Ьас!ег1а1 уасстез. №1. Κ,εν. МхсгоЫок 5,491-504.

6. Оадпеих 8, БеЕхетег К, Уап Т, КаХо-Маеда М, де Лопд ВС, Багауапап 8, Νΐοοί М, ЬНетапп 8, Кгетег К, ОиХхеггег МС, НПХу Μ, НорехуеН РС, Зта11 РМ, (2005). УапаЫе ЬозХраХЬодеп сотраХхЪШху ίη МусоЬаыегтт СиЬегси1оз1з. Ргос. Νβΐΐ. Асад. Зек и. 8. А. 103 , 2869-2873.

7. Огоде Ь, ЗеПег Р, Ваитапп 3, Незз 1, Вппктапп V, Каззег Еддте А, Мапп Р, Ооозтапп С, Вапдегтапп 8, ЗтххЬ О, ВапсгоЙ 01, ЕеугаХ 1М, уап 8оо1опдеп Б, ЕаирасЬ В, Каийпапп ЗН. (2005). 1псгсазед уассте екйсасу адатз! ХиЪегси1озхз о£ гесотЫпап! МусоЪас(епит Βονί® ЪасШе Са1теХ1е-Оиёпп тиХапХз (ЬаХ зесге1е 1хзХепо1узт. ТЬе 1оита1 οί С1хпхса11пуезйдайоп 115,2472-2479.

8. СЬо 3, МеЬга V, ТЬота-Бзгупзкх 3, ЗХепдег 3, ЗегЫпаМ, Маггассаго ЕЛ, Пухт ЛЬ, Ватез РР, ЗоиХЬхуоод 3, СеНз Е, Βίοοχη ВЕ., МодПп ЕЬ, Зеххе А. (2000). АпХхгшсгоЫа1 асхххтХу οί МНС с1азз Ι-гезХпсХед СБ8+ Т се11з ίη Ьишап ХиЬегсЫозхз, Ргос. Ыахк Асад. Зек Ы. 3, А, 97, 12210-12215.

9. НУтаи Р, УУеЬег 8, Зад 3, деБ1его Л, Ьоса1еШ Ноорз 3, Вгехдеп В, ЗапдЬоГГ К, Вппктапп V, КаиГтапп 8НЕ, ЗсЬахЫе БЕ. (2006). АрорХоХхс уезкЛез сгоззрпте СБ8 Т се11з апд ргоХес! адатз! хиЪегси1озхз.1ттипйу. 24,105-117.

10. ЗсЬахЫе БЕ, Утаи р, ЗхеНпд РА, РхзсЬет К, СоПтз НЬ, Надепз К, МодНп КЬ, Вппктапп V, Каийпапп ЗН. (2003). АрорХозхз ГасхНХаСез апХхдеп ргезепХайоп Хо Т 1утрЬосуХез ХЬгоидЬ МНС-Ι апд СБ1 ίη ХиЬегси1озхз. Ναΐ. Мед. 9,1039-1046.

11. Незз Л, М1ко Б, СаХхс А, ЬеЬтепз1ек V, Киззе! Б, Каийпапп ЗН. (1998). МусоЬас(егшт Ьоухз ЬасШе СакпеХХе-Оиеггп зХгатз зесгехтд Нзхегкдузт οί Ьхзхепа топосуХодепез. Ргос ЬТаХ! Асад Зсх 95,5299-5304.

12. ЕеугаХ ЛМ, ВегхЬех РХ, О1сцие1 В., (1995) ТЬе игеазе 1осиз οί МусоЪасгегпт ХиЬегси1оз15 апд ΪΧ5 ихШгаХхоп Гог хЬе детопзХгаХхоп оГ аИеНс ехсЬапде ίη МусоЬас!епит Βονΐ3 ЬасШиз Са1теХХе-Оиепп. Ргос 1Чах1 Асад Зсх БЗА.92(19):8768-72

13. ВгозсЬ Е, Оогдоп ЗУ, Оаппег Т, Е1§1те1ег К, Рпдш Уа1епХ1 Р, Боз ЗапХоз 3, БихЬоу 3, Ьасго1х С, Оагаа-Ре1ауо С, 1п\уа1д ЛК, Оо1Ьу Р, Оагсха ЛК Нетпзоп ΕΘ, ВеЬг МА, (^иах1 МА, СЬххгсЬег С, ВаггеН ВО, РагкЬШ Л, Со1е ЗТ, Ргос ЯаХ1 Асад Зсх Б 8 А, 2007 Маг27;104(13):5596-601. ЕриЬ2007 Маг 19.

- 10 026661

Список последовательностей <110> Уакглпе Рго)‘екх мападетепх стЬн <120> Вакцина и способ вакцинации против туберкулеза <130> 49047Р мо <150> и$61/384375 <151> 2010-09-20 <160> 2 <170> ΒΊ55ΑΡ 1.0 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<221> источник <222> 1..1881 <223> тип молекулыднк рекомбинантная нуклеотидная последовательность искусственная последовательность <220>

<221> источник <222> 1..1881 <223> тип молекулы ДНК последовательность, содержащая домен высвобождения из фаголизосом (211-1722 нт) и стоп кодон (1879-1881)

Искусственная последовательность <400> 1 ахдасадасд хдадссдааа даххсдадсх хддддасдсс даххдахдах сддсасддса 60 дсддсхдхад хссххссддд ссхддхдддд сххдссддсд дадсддсаас сдсдддсдсд 120 ххсхсссддс сддддсхдсс ддхсдадхас схдсадхсхд сааадсаахс сдсхдсааах 180 аааххдсасх садсаддаса аадсасдааа дахдсахсхд саххсаахаа адааааххса 240 ахххсахсса хддсассасс адсахсхссд ссхдсаадхс схаадасдсс аахсдаааад 300 ааасасдсдд ахдааахсда хаадхахаха сааддаххдд аххасаахаа ааасаахдха 360 ххадхахасс асддадахдс адхдасааах дхдссдссаа дааааддхха сааадахдда 420 аахдаахаха ххдххдхдда дааааадаад ааахссахса ахсаааахаа хдсадасахх 480 саадххдхда ахдсаахххс дадссхаасс ХаХссаддХд схсхсдхааа адсдааххсд 540 дааххадхад аааахсаасс адахдххсхс ссхдхаааас дхдаххсахх аасасхсадс 600 аххдахххдс саддхахдас хаахсаадас аахаааахсд ххдхаааааа хдссасхааа 660 хсааасдхха асаасдсадх ааахасахха дхддааадах ддаахдаааа ахахдсхсаа 720 дсххахссаа ахдхаадхдс аааааххдах хахдахдасд ааахддсхха садхдаахса 780 сааххааххд сдааахххдд хасадсаххх ааадсхдхаа ахаахадсхх даахдхааас 840 ххсддсдсаа хсадхдаадд даааахдсаа даадаадхса ххадххххаа асааахххас 900 хахаасдхда ахдххаахда ассхасаада ссххссадах ххххсддсаа адсхдххасх 960

ааададсадх	хдсаадсдсх	хддадхдаах	дсадаааахс	схссхдсаха	хахсхсаадх	1020
дхддсдхахд	дссдхсаадх	ххахххдааа	ххахсаасха	аххсссахад	хасхааадха	1080
ааадсхдстх	ххдахдсхдс	сдхаадсдда	ааахсхдхсх	саддхдахдх	адаастааса	1140
аахахсахса	ааааххсххс	сххсааадсс	дхаахххасд	даддххссдс	аааадасдаа	1200
дххсааахса	хсдасддсаа	ссхсддадас	ххасдсдаха	ххххдааааа	аддсдсхасх	1260
хххаахсдад	ааасассадд	адххсссахх	дсххахасаа	сааасххссх	аааадасаах	1320
дааххадсхд	ххатхааааа	саасхсадаа	хахаххдааа	саасххсааа	адсхтахаса	1380
дахддааааа	ххаасахсда	хсасхсхдда	ддахасдххд	схсааххсаа	сахххсххдд	1440
дахдаадхаа	аххахдахсс	хдааддхаас	даааххдххс	аасахааааа	схддадсдаа	1500
аасаахаааа	дсаадсхадс	ХсаХХХсаса	хсдхссахсх	ахххдссадд	хаасдсдада	1560
аахаххаахд	хххасд схаа	адааХдсасх	ддХХХадсХХ	дддааХддХд	дадаасддХа	1620
аххдахдасс	ддаасххасс	асххдхдааа	аахадаааха	хсхссахсхд	дддсассасд	1680
схххахссда	аахахадхаа	ХааадХадаХ	ааХссааХсд	аахахдсахх	адссхахдда	1740
адхсадддхд	ахсххаахсс	аххааххаах	дааахсадса	ааахсахххс	адсхдсадхх	1800
схххссхсхх	хаасахсдаа	дсхассхдса	дадххсдхха	ддсдсддахс	сддааххсда	1860
адсххахсда	хдхсдасдха	д				1881

<210> 2 <211> 626 <212> Белок <213> искусственная последовательность <22О>

<221> источник <222> 1..626 <223> тип молекулы белок соответствует аминокислотной последовательности зе<з ίο νο: 1. Искусственная последовательность <400> 2

мех

тКг

АЗр

УаТ

5ег

Агд

ьуз

Пе

Агд

АТа

тгр

СТу

Агд

ьеи

мех

Пе

СТ у

ТНг

АТа

А1а

УаТ

1_еи

Рго

СТу

1еи

УаТ

СТу

1_еи

АТа

20

25

30

01у

СТу

АТа 25

АТ а

тЬг

АТа

СТу

АТа 40

рпе

5ег

Агд

РГО

СТу 45

Беи

РГО

УаТ

СТи

туг

1_еи

сТп

5ег

АТа

1_уз

СТп

зег

АТа

АЗП

ьуз

|_еи

НТ 5

Зег

50

55

60

АТа

СТу

СТп

Зег

ТНг

ьуз

АЗр

А1а

Зег

АТа

РЬе

АЗП

ьуз

СТи

АЗП

Зег

65

70

75

80

Пе

5ег

Зег

мех

АТа

Рго

АТа

зег

РГО

АТа

Зег

РГО

|_уз

тКг

85

90

95

Рго

Не

СТи

Ьуз

1-У5

Н15

АТ а

Азр

СТи

Пе

Азр

1-У5

Туг

Пе

СТп

СТу

100

105

110

Беи

Азр

туг

АЗ П

1_уз

А5П

АЗП

УаТ

Ьеи

УаТ

туг

Н15

СТу

АЗР

АТа

УаТ

115

120

125

тНг

А5П

УаТ

РГО

Рго

Агд

!_У5

СТу

туг

ьуз

Азр

ОТ у

АЗП

СТи

Туг

Пе

130

135

140

УаТ

СТи

1_У5

1-У5

|_уз

1-У5

Зег

Пе

АЗП

СТ η

АЗП

АТа

АЗР

Пе

145

150

155

160

сТп

Уа1

УаТ

АЗП

АТ а

Пе

5ег

1_еи

ТКг

туг

Рго

СТу

АТа

Беи

УаТ

165

170

175

- 11 026661

ЬУ5

д!а Азп зег 180

01и

Ьеи Уа1 с1и азп Οίη рго Азр Уа1 185

ьеи 190

РГО

Уа!

ьуз

Агд

АЗР

5ег

ьеи

ТНг

ьеи

зег

11е

Азр

ьеи

РГО

С1у

мет

тНг

АЗП

195

200

205

Οίη

Азр

АЗП

|_уз

Пе

Уа!

Уа1

.‘-У⁵

АЗП

А1а

тНг

ьуз

зег

Азп

Уа1

АЗП

210

21!

220

АЗП

А1а

Уа1

АЗП

ТНг

ьеи

Уа!

01 и

Агд

тгр

АЗП

о!и

ьуз

туг

д1а

01 п

225

230

235

240

А1а

туг

РГО

АЗП

Уа1 245 οίη

Зег

а! а

Ьуз

Пе

А5р Туг 250 РНе 01 у

АЗр

АЗР

01ц

мет 255 ьуз

А1а

туг

зег

01и

5ег

ьеи

Пе

А1а

тНг

А1а

РНе

А1а

260

270

Уа!

А5П

АЗП

5ег

ьеи

А5П

Уа1

АЗП

рНе

е1у

А1а

Пе

зег

о1и

01у

ЬУ5

275

280

285

Μβΐ

01 η

О1и

о!и

уа!

Пе

зег

РНе

ьуз

С1п

Пе

туг

АЗП

уа!

АЗП

290

295

300

Уа!

АЗП

С1и

рго

тНг

Ага

РГО

5ег

Агд

рНе

РНе

О1у

Ьуз

А1а

Уа1

ТНг

305

310

315

320

Ьуз

С1и

Οίη

Ьеи

С1п

А! а

Ьеи

01 у

уа1

Азп

А! а

О1и

Азп

Рго

А1а

325

330

335

Туг

Пе

Зег

Уа1

А! а

Туг

01 у

Агд

01 п

Уа!

Туг

ьеи

ьуз

ьеи

Зег

340

34!

350

тНг

А5П

зег

НТ 5

зег

тНг

ьуз

Уа1

У¹

А1а

РНе

Азр

А1а

Уа!

355

Зб(

365

5€Г

с1у

ьуз

зег

Уа1

зег

с!у

Азр

Уа1

о1и

ьеи

тНг

АЗП

ίί е

Пе

ьуз

370

37!

380

АЗП

зег

рКе

|_уз

а! а

Уа!

Пе

туг

01 у

зег

А1а

ьуз

АЗр

01 и

385

390

395

400

Уа1

οίη

Пе

11 е

Азр

01 у

АЗП

Ьеи

О1у

Азр

Ьеи

АГд

Азр

Пе

Ьеи

Ьуз

405

410

415

ЬУ5

01 у

А1а

ТНг

р|те

Азп

Агд

01 и

ТНг

РГО

О1у

уа!

РГО

11 е

д1а

Туг

420

425

430

тНг

АЗП

рНе

ьеи

ьуз

АЗр

АЗП

о! и

ьеи

А! а

уа1

ίί е

ЬУ5

АЗП

Азп

435

440

445

Зег

01и

туг

Пе

01и

тНг

ТНг

зег

1-У5

А1а

Туг

тНг

А5Р

с!у

ьуз

Пе

450

455

460

АЗП

Пе

Азр

НТ 3

зег

С! у

С1у

туг

Уа!

д1а

01 п

РНе

АЗП

Пе

Зег

тгр

465

470

475

480

Азр

01и

Уа!

А5П

туг

Азр

рго

С1и

о1у

АЗП

01 и

Пе

Уа1

01 п

НТ5

ьуз

485

490

495

АЗП

тгр

Зег

о!и

Азп

АЗП

ьуз

Зег

Ьу$

Ьеи

А1а

н-ί 5

РНе

ТНг

Зег

5ег

500

505

510

Пе

Туг

ьеи

Рго

С1у

А5П

А1а

Агд

АЗП

Не

АЗП

Уа!

Туг

А1а

Ьуз

01 и

515

520

525

суз

ТНг 530 ьеи

о1у

ьеи

А1а

тгр

о1и тгр 535 Азп Агд

тгр

Агд

ТНг

ναΐ 540 Пе

П е

А5р

АЗР

Агд

АЗП

РГО

ьеи

Уа!

|_У5

АЗП

Пе

Зег

тгр

01 у

тНг

ТНг

545

550

555

560

Ьеи

туг

Рго

ьуз

туг

5ег

АЗП

ьуз

Уа1

АЗР

Азп

РГО

Пе

о!и

туг

А1а

565

570

575

Ьеи

А1а

Туг

01у

Зег

01 п

01у

АЗр

Ьеи

Азп

Рго

Ьеи

Пе

Азп

С1и

Пе

580

585

590

5ег

ьуз

ΐΐβ

Пе

Зег

а! а

А1а

Уа!

Ьеи

Зег

Ьеи

ТНг

Зег

Ьуз

Ьеи

595

600

605

РГО

А1а 610

с!и

рНе

Уа!

Агд

Агд 61!

01у Бег с!у

Пе

Агд 620

зег

ьеи

зег

мет

зег тНг 625

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Вакцина против туберкулеза у людей, включающая в качестве активного ингредиента рекомбинантные клетки МусоЪас1егшт Βονίδ, штамм Иашкй, подтип Ргадие, дефицитные по уреазе и включающие рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый полипептид, включающий:

(a) антиген МусоЪас1егшт Ад85В, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидами 121-153 последовательности БЕЦ ГО N0: 1, или его иммуногенный фрагмент, (b) домен высвобождения из фаголизосом, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидами 211-1722 последовательности БЕЦ ГО N0: 1.
2. Вакцина по п.1, в которой рекомбинантные клетки МусоЪас1егшт имеют ген устойчивости к антибиотикам, например ген устойчивости к гигромицину.
3. Вакцина по п.1, в которой рекомбинантные клетки МусоЪас1егшт не имеют гена устойчивости к антибиотикам.
4. Вакцина по любому из пп.1 или 2, которая представляет собой гВСС ДИгес::Н1у⁺::Ну§⁺(УРМ1002).
5. Вакцина по любому из пп.1-4, предназначенная для введения субъекту, неиммунизированному против МусоЪас1егшт, например новорожденному.
6. Вакцина по любому из пп.1-4, предназначенная для введения субъекту, ранее иммунизированному против МусоЪас1егшт.
7. Вакцина по любому из пп.1-6, изготовленная в лиофилизированной форме.
8. Вакцина по любому из пп.1-7, изготовленная в форме для внутрикожного введения.
9. Вакцина по любому из пп.1-8 для активации полифункциональных СИ4+ Т-клеток.
10. Способ вакцинации человека против туберкулеза, включающий введение фармацевтически эффективной дозы рекомбинантных клеток МусоЪас1егшт Ьо\35, штамм Иашкй, подтип Ргадие, дефицитных по уреазе и включающих рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый полипептид, включающий:

(a) антиген МусоЪас1егшт Ад85В, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидами 121-153 последовательности БЕЦ ГО N0: 1, или его иммуногенный фрагмент, (b) домен высвобождения из фаголизосом, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидами 211-1722 последовательности БЕЦ ГО N0: 1.

- 12 026661

- · «Он-» БЦЖ без предварительной БЦЖ-ваицичации группа 1 без предварительной БЦЖ-в&кцинации

- - 0. . Группа 2 без предварительной 6ЦЖ-взкивнэции * - ф . Группа 3 без предварительной 6ЦЖ-вакци нации

..........·♦—» БЦЖ с предварительной БЦЖ-ыкцин»цией .....- Группа 1 « предварительной БЦЖ-Ввкцинацией группа 2 с предварительной ВЦЖ-ваицииацией Группа 3 с предварнт-вльнай бцж-ващинацней I

Обработка: БЦЖ = 5 х 10Е5 КОЕ БЦЖ (диапазон 2 - 8 х 10Е5),

Группа 1 в 5 х 10ЕЗ КОЕ УРМ1002 (диапазон 2 - 8 х 10ЕЗ),

Группа 2 = 5 х 10Е4 КОЕ УРМ1002 (диапазон 2 - 8 х 10Е4),

Группа 3 = 5 х 10Е5 КОЕ УРМ1002 (диапазон 2 - 8 х 10Е5).

Фиг. 1

Средний размер уплотнения по группам обработки и дням исследования

Л

День 1 День 2 ДеньЗ День 5 День 11 День 29 День 57 б месяцев

БЦЖ без предварительной БЦЖ-вакцинации . . & . Группа 1 без предварительной БЦЖ-вакцинации

- · - Группа 2 без предварительной БЦЖ-вакцинации - - а· . группа 3 без предварительной БЦЖ-вакцинации • БЦЖ с предварительной БЦЖ-вакцинацией .......Группа 1 с предварительной БЦЖ-вакцинацией —К-·—Группа 2 с предварительной БЦЖ-вакцинацией - ...¾ группа 3 с предварительной БЦЖ-вакцинацией

Обработка: БЦЖ = 5 х 10Е5 КОЕ БЦЖ (диапазон 2 · 8 х 10Е5),

Группа 1 = 5 х 10ЕЗ КОЕ УРМ1002 (диапазон 2 - 8 х 10ЕЗ),

Группа 2 = 5 х 10Е4 КОЕ УРМ1002 (диапазон 2 - 8 х 10Е4),

Группа 3 = 5 х 10Е5 КОЕ УРМ1002 (диапазон 2 - 8 х 10Е5).

Фиг. 2

Средний размер эритемы по группам обработки и дням исследования

Средние изменения по сравнению с исходным уровнем ответа ΙΡΝ-γ после стимуляции с помощью Ад85В у неиммунизированных субъектов

- 13 026661

Средние изменения по сравнению с исходным уровнем ответа ΙΡΝ-γ после стимуляции с помощью Ад85В у ранее иммунизированных субъектов

Изменения по сравнению с исходным уровнем одинарных и многофункциональных СО4⁺ Т-клеток у неиммунизированных субъектов