CN109852563A - 一种禽多杀性巴氏杆菌菌影的化学制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种禽多杀性巴氏杆菌菌影的化学制备方法，旨在利用化学法制备禽多杀性巴氏杆菌菌影。利用NaOH二倍稀释法测定禽多杀性巴氏杆菌菌株的最小抑菌浓度，NaOH对巴氏杆菌的MIC为3.75mg/ml。通过MIC的NaOH对巴氏杆菌进行处理制备菌影，结果发现处理60min后裂解率达到100％，同时细菌DNA浓度随着处理时间的延长浓度在不断降低，处理60min时DNA已检测不到。通过电镜扫描发现NaOH处理会在巴氏杆菌表面形成微小的孔洞，但并未破坏其原有的正常形态。本发明成功利用MIC NaOH法制备出禽多杀性巴氏杆菌菌影，该制备方法简单、快速和高效。

Description

一种禽多杀性巴氏杆菌菌影的化学制备方法

技术领域

本发明属于菌影技术领域，涉及一种禽多杀性巴氏杆菌菌影的化学制备方法。

背景技术

禽多杀性巴氏杆菌是一种革兰氏阴性菌，感染会引起严重的家禽传染病禽霍乱病的发生，造成家禽生产性能下降，死亡率增高。虽然抗生素对该病有很好的防治效果，但多重耐药性巴氏杆菌的出现，对该病的防治带来巨大的挑战。而目前通过疫苗的免疫接种仍然是防治禽霍乱的主要防控手段。

细菌菌影是近年来出现的一种新型疫苗生产技术。菌影是一种不含核酸、核糖体等内部其它组分的细菌空壳，早期菌影的制备主要是利用PhiX174噬菌体E蛋白裂解细菌，但这种方法存在裂解不完全、仅限于革兰氏阴性菌和裂解细菌浓度过低等缺点，这些缺陷对菌影的利用和产业化形成了巨大的限制。而利用化学法制备细菌菌影能够有效的改进这些缺陷， Amro等(2014)采用布列可特-博曼设计法对抑制大肠杆菌生长的氢氧化钠、十二烷基硫酸钠和碳酸钙进行计量筛选，成功的利用化学法制备出大肠杆菌菌影。Vinod等(2015)利用单一的NaOH处理也成功制备出革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的菌影，其在活体试验中表现出了很好的免疫原性。但目前关于多杀性巴氏杆菌化学法制备菌影的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种禽多杀性巴氏杆菌菌影的化学制备方法。该方法通过化学法制备多杀性巴氏杆菌菌影，为菌影技术在禽类多杀性巴氏杆菌病的防治中提供新的技术手段。

其具体技术方案为：

一种禽多杀性巴氏杆菌菌影的化学制备方法，包括以下步骤：

步骤1菌种培养

禽多杀性巴氏杆菌接种于LB培养基中，37℃200rpm条件下扩大培养2h后进行划线纯化，挑取单菌落扩大培养48h，4℃保存备用。

步骤2最小抑菌浓度测定

首先将禽多杀性巴氏杆菌培养液调整至1×10⁸CFU/ml，配制质量分数为60mg/ml的 NaOH溶液，过滤除菌。分别配制NaOH质量分数为30mg/ml、15mg/ml、7.5mg/ml、3.75 mg/ml、1.875mg/ml和0.9375mg/ml的LB培养液，接种禽多杀性巴氏杆菌，37℃200rpm 条件下培养18h，最终根据培养液的浑浊度判断NaOH的最小抑菌浓度(MIC)。为确保试验结果准确，MIC测定重复3次，并进行涂板活菌检测。

步骤3菌影制备与裂解率计算

将培养72h的细菌培养液在10000g条件下离心10min，收集菌体，用灭菌PBS清洗3次，PBS重悬。将1ml MIC浓度的NaOH加入2ml细菌悬浊液(细菌浓度1×10⁸CFU/ml) 中37℃培养75min。为测定细菌裂解率，每15min分别取NaOH处理和未处理菌液进行平板计数，利用公式计算裂解率，裂解率＝[1-(NaOH处理菌计数/未处理菌计数)]，每个样品重复测定3次。在75min处理结束后在10000g条件下离心10min收集菌影，PBS清洗3次后重悬，4℃保存备用。

步骤4无DNA菌影分析

为进一步分析细菌裂解过程中DNA的降解，利用细菌DNA提取试剂盒分别提取NaOH处理和未处理菌液15、30、45、60和75min细菌DNA，操作过程严格按照说明书进行，提取DNA利用1％琼脂糖凝胶电泳检测，并利用超微量分光光度计检测提取DNA浓度。

步骤5电镜扫描

将细菌菌影用步骤5％戊二醛在4℃条件下固定2h，PBS洗涤三次，用1％四氧化锇在 4℃条件下固定1.5h，PBS洗涤三次，分别利用10％、30％、50％、70％和100％的酒精溶液进行梯度脱水，干燥及喷镀处理后使用扫描电镜进行观察。

进一步，步骤2中，通过浑浊度观察和涂板活菌检测，NaOH对禽多杀性巴氏杆菌菌株 (CVCC474)的最小抑菌浓度为3.75mg/ml。

进一步，步骤3中，在60min时禽多杀性巴氏杆菌裂解率已达到100％，说明处理时间达到60min，禽多杀性巴氏杆菌就无活菌。

进一步，步骤4中，通过DNA浓度测定发现NaOH处理菌DNA浓度随着处理时间的延长，DNA浓度不断减低，在60min时，已检测不到DNA。

进一步，步骤5中，通过电镜扫描发现，NaOH处理会在禽多杀性巴氏杆菌表面裂解出许多微小孔洞。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明成功利用MIC NaOH法制备出禽多杀性巴氏杆菌菌影，该制备方法简单、快速和高效，在未来大规模生产应用方面具有巨大的前景，对开发多杀性巴氏杆菌疫苗提供了新的途径。

附图说明

图1 NaOH处理下不同时间巴氏杆菌裂解率变化；

图2 NaOH处理下不同时间段巴氏杆菌DNA电泳图；

图3 NaOH处理下不同时间段巴氏杆菌DNA浓度测定；

图4电镜扫描下巴氏杆菌菌影；

图5 PMGs免疫对IgG抗体水平的影响；

图6 PMGs免疫对CD4⁺T细胞百分含量的影响；

图7 PMGs免疫对CD8⁺T细胞百分含量的影响；

图8 PMGs免疫对血清抗菌力的影响；

图9 PMGs免疫对功毒后肝脏巴氏杆菌负载量的影响；

图10 PMGs免疫对功毒后肺脏巴氏杆菌负载量的影响；

图11 PMGs免疫对功毒后脾脏巴氏杆菌负载量的影响；

图12 PMGs免疫对功毒后肾脏巴氏杆菌负载量的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1禽多杀性巴氏杆菌菌影的化学制备方法

1材料

1.1主要试剂与菌种

试验所用的禽多杀性巴氏杆菌菌株(CVCC474)购自中国兽医药品监察所。细菌DNA提取试剂盒(DP302)购自天根生化科技有限公司。NaOH、蛋白胨、酵母提取物、PBS和戊二醛等常规试剂均购自陕西博达生物科技有限公司。

1.2主要仪器

电热恒温培养箱(LRH-100)，上海精密仪器仪表有限公司；超净工作台(SW-CG-1FD)，苏州安泰空气技术有限公司生产；凝胶成像系统(Chemi Doc XRS+)，美国伯乐公司；扫描电镜(EM-30PLUS)，韩国COXEM公司；超微量分光光度计(NanoDrop 2000)，美国赛默飞世尔科技有限公司。

2方法

2.1菌种培养

禽多杀性巴氏杆菌接种于LB培养基中，37℃200rpm条件下扩大培养2h后进行划线纯化，挑取单菌落扩大培养48h，4℃保存备用。

2.2最小抑菌浓度测定

参照Vinod(2015)推荐的NaOH二倍稀释法进行。首先将禽多杀性巴氏杆菌培养液调整至1×10⁸CFU/ml，配制质量分数为60mg/ml的NaOH溶液，过滤除菌。分别配制NaOH 质量分数为30mg/ml、15mg/ml、7.5mg/ml、3.75mg/ml、1.875mg/ml和0.9375mg/ml的 LB培养液，接种禽多杀性巴氏杆菌，37℃200rpm条件下培养18h，最终根据培养液的浑浊度判断NaOH的最小抑菌浓度(MIC)。为确保试验结果准确，MIC测定重复3次，并进行涂板活菌检测。

2.3菌影制备与裂解率计算

将培养72h的细菌培养液在10000g条件下离心10min，收集菌体，用灭菌PBS清洗3次，PBS重悬。将1ml MIC浓度的NaOH加入2ml细菌悬浊液(细菌浓度1×10⁸CFU/ml) 中37℃培养75min。为测定细菌裂解率，每15min分别取NaOH处理和未处理菌液进行平板计数，利用公式计算裂解率，裂解率＝[1-(NaOH处理菌计数/未处理菌计数)]，每个样品重复测定3次。在75min处理结束后在10000g条件下离心10min收集菌影，PBS清洗3次后重悬，4℃保存备用。

2.4无DNA菌影分析

为进一步分析细菌裂解过程中DNA的降解，利用细菌DNA提取试剂盒分别提取NaOH处理和未处理菌液15、30、45、60和75min细菌DNA，操作过程严格按照说明书进行，提取DNA利用1％琼脂糖凝胶电泳检测，并利用超微量分光光度计检测提取DNA浓度。

2.5电镜扫描

将细菌菌影用2.5％戊二醛在4℃条件下固定2h，PBS洗涤三次，用1％四氧化锇在4℃条件下固定1.5h，PBS洗涤三次，分别利用10％、30％、50％、70％和100％的酒精溶液进行梯度脱水，干燥及喷镀处理后使用扫描电镜进行观察。

3结果

3.1禽多杀性巴氏杆菌MIC

通过浑浊度观察和涂板活菌检测，NaOH对禽多杀性巴氏杆菌菌株(CVCC474)的最小抑菌浓度为3.75mg/ml。

3.2禽多杀性巴氏杆菌裂解率

结果见图1。由图1可知，禽多杀性巴氏杆菌在MIC NaOH处理下迅速提高，在60min时禽多杀性巴氏杆菌裂解率已达到100％，说明处理时间达到60min，禽多杀性巴氏杆菌就无活菌。

3.3裂解过程中DNA浓度变化

结果见图2，可以明显观察到相比于未处理菌，NaOH处理菌DNA在不同的时间点DNA浓度都显著降低。通过DNA浓度测定发现NaOH处理菌DNA浓度随着处理时间的延长，DNA 浓度不断减低，在60min时，已检测不到DNA(DNA浓度<1pg/μl)。

3.4电镜观察

通过电镜扫描可以发现，NaOH处理会在禽多杀性巴氏杆菌表面裂解出许多微小孔洞(图 4箭头所示)，但NaOH处理在形成通道的同时并没有破坏禽多杀性巴氏杆菌原有的正常形态 (图3)。

实施例2禽多杀性巴氏杆菌菌影活体免疫效果评价

1材料与方法

1.1试验动物

选择80只12周龄健康的海兰灰母鸡，饲养温度21-27℃，整个饲养期内鸡只自由采食和饮水。

1.2免疫和功毒

将鸡只随机分为4组，分别命名为A、B、C和D组，每组20只鸡，A组鸡只皮下注射0.5mL灭菌PBS，B、C和D组鸡只分别通过口服、皮下注射和静脉注射三种方式免疫接种0.5ml制备好的巴氏杆菌菌影(P.multocida ghosts，PMGs)，接种量为2×10⁶菌影细胞 /ml，鸡只免疫2次，一免在饲养1周时，二免疫在饲养3周时，免疫间隔为2周。在二免后2周所有鸡只通过静脉注射功毒禽多杀性巴氏杆菌菌株(CVCC474，购自中国兽医药品监察所)，功毒量为2×10⁸CFU。功毒后2周统计鸡只死亡率，每次免疫后2周和功毒后2 周翅经脉采血备用。

1.3IgG浓度测定

为了测定菌影免疫下鸡只体液免疫情况，分别在一免前和二免后分离鸡血清，利用鸡IgG ELISA试剂盒(ZY-IgG-Ch，上海泽叶)测定鸡只血清中的IgG浓度，操作过程严格按照试剂盒推荐说明书进行。

1.4流式细胞仪分析

为了测定菌影免疫下鸡只细胞免疫情况，在二免2周后鸡只翅静脉抗凝采血，加入PBS (pH＝7.4)将抗凝血进行1:1稀释，稀释全血355g离心20min，用毛细管缓慢收集外周血白细胞，无菌PBS洗脱3次，分离的外周血白细胞利用FITC标记的鸡CD4⁺和CD8⁺单克隆抗体染色后利用流式细胞仪(美国BD)上机检测，根据FACS(fluorescence-activated cellsorter) 分析，统计出CD4⁺和CD8⁺所占的百分含量。

1.5血清抗菌能力测定

参照Vinod等(2015)^[8]推荐的方法进行。将100ml巴氏杆菌菌悬液(1×10⁶CFU/ml)加入25ml血清中，室温静置1h将涂板进行细菌计数，以灭菌的PBS处理作为对照，利用公式计算血清抗菌力，血清抗菌力＝[1-(血清处理后细菌数量/PBS处理细菌数量)]×100％。

1.6巴氏杆菌计数

在功毒后2周，每组随机选择8只鸡屠宰，无菌取出肝脏、肺脏、脾脏和肾脏，称重后加入5ml灭菌PBS，匀浆处理，10倍梯度稀释，取稀释液100μl均匀涂板计数。

1.7数据统计

试验数据利用SPSS 19.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，利用LSD post-hoc 进行多重比较，试验结果采用平均值士标准差(mean士SD)表示，以P<0.05判定结果为差异显著。

2结果

2.1体液免疫反应

结果见图5。在饲养1周未免疫前，所有组别在血清IgG水平上并差异(P>0.05)，但在一免和二免后相对于对照组A组，菌影免疫组(B、C和D组)显著提高血清IgG水平(P<0.05)，三个免疫组之间并无显著差异(P>0.05)。而在功毒后免疫组相比于对照组均显著提高血清 IgG水平(P<0.05)，其中C组表现出最大的IgG抗体水平。

2.2体液免疫反应

结果见图6和图7。在二免后二周相比于对照组，免疫组(B、C和D组)显著提高了外周血白细胞中CD4⁺和CD8⁺T细胞的百分含量(P<0.05)，其中C组表现出最大的CD4⁺和CD8⁺T细胞的百分含量，而各免疫组(B、C和D组)之间并无显著差异(P>0.05)。

2.3血清抗菌力

结果见图8、图9、图10、图11和图12。在饲养1周未免疫前，所有组别血清抗菌力上并无显著差异，但在一免和二免后2周免疫组(B、C和D组)相比于对照组均显著提高了血清抗菌力(P<0.05)(图8)。而在鸡只功毒后，菌影免疫组(B、C和D组)相比于对照组显著降低了肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中巴氏杆菌的数量(P<0.05)，而各免疫组(B、C 和D组)之间并无显著差异(P>0.05)(图9-图12)。

2.4保护率

结果见表1。在二免后2周，每组鸡只功毒高致病性多杀性巴氏杆菌2周后，免疫组(B、 C和D组)的保护率为100％，而未免疫组(A组)的保护率只有50％。

表1功毒下鸡只的存活率％

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种禽多杀性巴氏杆菌菌影的化学制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1 菌种培养

禽多杀性巴氏杆菌接种于LB培养基中，37℃200rpm条件下扩大培养2h后进行划线纯化，挑取单菌落扩大培养48h，4℃保存备用；

步骤2 最小抑菌浓度测定

首先将禽多杀性巴氏杆菌培养液调整至1×10⁸CFU/ml，配制质量分数为60mg/ml的NaOH溶液，过滤除菌；分别配制NaOH质量分数为30mg/ml、15mg/ml、7.5mg/ml、3.75mg/ml、1.875mg/ml和0.9375mg/ml的LB培养液，接种禽多杀性巴氏杆菌，37℃200rpm条件下培养18h，最终根据培养液的浑浊度判断NaOH的最小抑菌浓度；为确保试验结果准确，MIC测定重复3次，并进行涂板活菌检测；

步骤3 菌影制备与裂解率计算

将培养72h的细菌培养液在10000g条件下离心10min，收集菌体，用灭菌PBS清洗3次，PBS重悬；将1ml MIC浓度的NaOH加入2ml细菌悬浊液中37℃培养75min，细菌浓度1×10⁸CFU/ml；为测定细菌裂解率，每15min分别取NaOH处理和未处理菌液进行平板计数，利用公式计算裂解率，裂解率＝[1-(NaOH处理菌计数/未处理菌计数)]，每个样品重复测定3次；在75min处理结束后在10000g条件下离心10min收集菌影，PBS清洗3次后重悬，4℃保存备用；

步骤4 无DNA菌影分析

为进一步分析细菌裂解过程中DNA的降解，利用细菌DNA提取试剂盒分别提取NaOH处理和未处理菌液15、30、45、60和75min细菌DNA，操作过程严格按照说明书进行，提取DNA利用1％琼脂糖凝胶电泳检测，并利用超微量分光光度计检测提取DNA浓度；

步骤5 电镜扫描

将细菌菌影用步骤5％戊二醛在4℃条件下固定2h，PBS洗涤三次，用1％四氧化锇在4℃条件下固定1.5h，PBS洗涤三次，分别利用10％、30％、50％、70％和100％的酒精溶液进行梯度脱水，干燥及喷镀处理后使用扫描电镜进行观察。

2.根据权利要求1所述的禽多杀性巴氏杆菌菌影的化学制备方法，其特征在于，步骤2中，通过浑浊度观察和涂板活菌检测，NaOH对禽多杀性巴氏杆菌菌株的最小抑菌浓度为3.75mg/ml。

3.根据权利要求1所述的禽多杀性巴氏杆菌菌影的化学制备方法，其特征在于，步骤3中，在60min时禽多杀性巴氏杆菌裂解率已达到100％，说明处理时间达到60min，禽多杀性巴氏杆菌就无活菌。

4.根据权利要求1所述的禽多杀性巴氏杆菌菌影的化学制备方法，其特征在于，步骤4中，通过DNA浓度测定发现NaOH处理菌DNA浓度随着处理时间的延长，DNA浓度不断减低，在60min时，已检测不到DNA。

5.根据权利要求1所述的禽多杀性巴氏杆菌菌影的化学制备方法，其特征在于，步骤5中，通过电镜扫描发现，NaOH处理会在禽多杀性巴氏杆菌表面裂解出许多微小孔洞。