FR3099769A1 - Mutagénèse bactérienne par conjugaison en milieu liquide - Google Patents
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Abstract
L’invention concerne un procédé de conjugaison bactérienne entre une souche bactérienne donneuse et une souche bactérienne receveuse caractérisé en ce que la conjugaison est réalisée en milieu liquide et le plasmide de conjugaison est un plasmide intégratif apte à s’intégrer dans le génome de la souche bactérienne receveuse afin de produire des transconjugants. L’invention concerne en outre une utilisation du procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes pour réaliser une mutagénèse dirigée. Pas de figure
Description
L’invention relève du domaine de la conjugaison bactérienne en particulier la conjugaison bactérienne ayant pour but des mutagénèses dirigées multiples, rapides et automatisables.
La conjugaison bactérienne est un processus naturel qui permet un échange d’ADN entre deux bactéries. Le transfert d’ADN par conjugaison se fait en général d’une souche donneuse vers une souche receveuse. Ce mécanisme naturel est donc d’un haut intérêt pour la biotechnologie. Même si de nombreuses optimisations ont été réalisées ces dernières années, beaucoup reste à faire pour pouvoir utiliser cette technologie de manière intensive et à haut débit et ceci plus particulièrement dans le domaine de la biologie de synthèse.
Le facteur F est un plasmide conjugatif naturel connu et abondamment utilisé en génétique bactérienne. Il est composé de différents éléments qui permettent la conjugaison : une origine de transfert de l’ADN (OriT) et une origine de réplication végétative (OriV) lui permettent de se répliquer de façon autonome pendant la division cellulaire. Le facteur F est également composé d’un opéron de transferttra(33kb). Cet opéron contient plus de 20 gènes codant pour les fonctions de transfert d’ADN du mécanisme de conjugaison. Un autre plasmide conjugatif naturel très connu et utilisé chezE. coliest le plasmide RP4/RK2. Ce plasmide contient également un opérontra, organisé de façon différente par rapport à l’opérontradu facteur F. Les différents gènestrade chaque opéron codent aussi pour des protéines peu homologues.
Pour utiliser la conjugaison en biotechnologie, il faut donc des souches ayant toutes les « briques » nécessaires à ce mécanisme : une souche « donneuse » qui contient les gènestraet des plasmides à transférer dans les souches « receveuses » d’intérêt, ces plasmides contenant obligatoirement une oriT compatible avec le mécanisme tra de la souche donneuse. Ces plasmides peuvent être soit des plasmides dits « réplicatifs », c’est-à-dire qu’ils ont la capacité de se répliquer dans la souche donneuse et dans la souche receveuse, soit des plasmides dits « intégratifs », qui ne peuvent pas se répliquer dans la souche receveuse et doivent nécessairement s’intégrer au chromosome pour rester dans les cellules. En cas d’intégration du plasmide dans le chromosome sur un site déterminé, on parle alors de mutagénèse dirigée.
Des plasmides portant l’opéron tra peuvent être utilisés pour la conjugaison et peuvent être transmis en même temps que le plasmide d’intérêt dans la souche receveuse. Le plasmide RK2/RP4 a donc été intégré dans le génome d’E. coli pour la première fois en 1983 (Simon et al., 1983) et ces expériences ont permis de créer la souche S17.1 très utilisée en biotechnologie. En effet, cette souche permet le transfert de tout plasmide portant une oriT_RP4 ou d’autres oriT un peu plus exotiques. Les documents US4680264, US4686184, US4626504, EP372230, EP372230, WO9726361, WO2018092171 décrivent notamment la construction de cette souche et son optimisation, ainsi que la construction et l’optimisation de toute sorte de plasmides de transfert.
Des souches avec d’autres opérons tra plus spécialisés ont également été construites notamment pour des transferts d’ADN entre E. coli et des souches bactériennes très particulières. De telles constructions bactériennes sont notamment décrites dans les documents WO200645631 et WO2014037917.
Une conjugaison particulière, la mutagenèse dirigée, est le plus souvent utilisée en recherche et développement pour effectuer une mutagénèse du chromosome de la souche receveuse grâce à un plasmide intégratif, dit également plasmide suicide. Il s’agit généralement d’une souche récalcitrante à toute manipulation génétique par les moyens classiques. Comme indiqué précédemment, un plasmide intégratif peut se répliquer dans la souche donneuse mais non dans la souche receveuse. Ainsi le plasmide intégratif s’intègre obligatoirement dans le génome bactérien de la souche receveuse pour se maintenir et entraîne ainsi une mutagenèse qui peut être dirigée. Pour que le plasmide suicide puisse s’intégrer, il faut auparavant avoir cloné dans ce plasmide des fragments d’ADN homologues à la zone chromosomique ciblée. L’insertion est en général sélectionnée grâce à une cassette de résistance à un antibiotique portée par le plasmide. Le plasmide suicide ressort ensuite du chromosome en laissant la mutation souhaitée et est ensuite éliminé de la cellule. Cette élimination est généralement sélectionnée grâce à une cassette de contre-sélection. Un plasmide suicide très utilisé pour de la mutagenèse par conjugaison est le plasmide pK18mobsacB (Schäfer et al.; 1994). Ce plasmide porte une cassette de résistance à l’antibiotique kanamycine et la cassette de contre-sélection sacB. Il comporte également une origine de réplication qui ne fonctionne que chez la bactérieE. coliet une origine de transfert oriT qui lui permet d’être transféré par conjugaison dans une autre souche bactérienne.
La conjugaison bactérienne est beaucoup utilisée en biotechnologie pour manipuler génétiquement toute sorte de bactéries. Cependant les expérimentations restent longues à réaliser selon les protocoles existants et nécessitent d’utiliser nombre de milieux de cultures différents et/ou beaucoup de matériel onéreux comme des filtres et des seringues stériles. De plus, il n’est généralement pas possible avec des procédés de conjugaison classiques d’obtenir jusqu’à plusieurs centaines de souches receveuses mutées, c’est-à-dire d’effectuer une conjugaison à haut-débit automatisable. De plus, l’automatisation est d’autant plus complexe que l’on utilise un plasmide intégratif en lieu et place d’un plasmide réplicatif.
Les expériences de conjugaison consistent en général à déposer des « gouttes » de culture de bactéries donneuses et receveuses l’une sur l’autre sur des milieux de culture spécifiques et à sélectionner ensuite les transconjugants sur d’autres milieux de culture. Les expériences de conjugaison peuvent également être réalisées grâce à des dépôts des souches donneuses et receveuses sur filtre, comme décrit notamment dans l’article Hmelo et al. (Hmelo et al. ; 2015). Ces procédés demandent cependant beaucoup de matériel coûteux et reste difficilement automatisables.
Enfin, il a récemment été décrit un procédé de conjugaison liquide. A titre d’exemple de procédé de conjugaison optimisé mais non automatisé, le document Phornphisutthimas et al. (Phornphisutthimas et al. ; 2007) décrit la réalisation d’expériences de conjugaison entre deux souches d’Escherichia coli en mélangeant des cultures liquides de souches donneuses et receveuses. Ce procédé de conjugaison utilise les plasmides pARO181 (ATCC77125) et pARO190 (ATCC77124) qui sont des plasmides réplicatifs. Ce même procédé, utilisant toujours un plasmide réplicatif, a été également appliqué entre deux souches d’Escherichia coli dans des plaques multipuits (Clarke et al. ; 2005). Comme démontré à l’exemple comparatif 1 du présent document, ce procédé ne fonctionne pas lorsque l’on utilise un plasmide intégratif.
Problème technique
Selon les protocoles existants, la conjugaison bactérienne reste un procédé long et nécessitant d’utiliser nombre de milieux de cultures différents et/ou beaucoup de matériel onéreux comme des filtres et des seringues stériles. De plus, il n’est pas possible avec de tels procédés de conjugaison d’obtenir jusqu’à plusieurs centaines de souches receveuses mutées, c’est-à-dire d’effectuer une conjugaison à haut-débit automatisable.
A ce jour, la biologie de synthèse exige de tester des centaines de combinaisons possibles de voies métaboliques, il faut donc pouvoir construire à façon des centaines de souches modifiées en même temps. La miniaturisation de la conjugaison et son optimisation en vue de son automatisation représentent donc un enjeu crucial.
D’autre part, il existe un besoin d’un procédé de mutagénèse dirigée, impliquant le passage d’un plasmide d’une souche donneuse dans une souche receveuse et l’intégration de ce plasmide dans le chromosome de la souche receveuse.
A ce jour, il n’existe pas de procédé de mutagénèse dirigée à haut-débit automatisable tel qu’il permette de multiplier les conditions de conjugaison et de tester la conjugaison entre une/plusieurs souches donneuses et une/plusieurs souches receveuses.
L’un des aspects de la présente invention porte sur un procédé de mutagénèse dirigée bactérienne automatisable et réalisée à haut débit en milieu liquide. Plus particulièrement il s’agit d’un procédé de conjugaison bactérienne entre une souche bactérienne donneuse et une souche bactérienne receveuse caractérisé en ce que la conjugaison est réalisée en milieu liquide et le plasmide de conjugaison est un plasmide intégratif apte à s’intégrer dans le génome de la souche bactérienne receveuse afin de produire des transconjugants.
Selon un mode de réalisation, le plasmide intégratif comprend une origine de réplication qui ne fonctionne pas dans la bactérie receveuse et des zones d’homologie à la zone d’insertion dans le chromosome de la bactérie receveuse de taille comprise entre 500 et 1000 pb.
Avantageusement, le procédé est automatisé et l’étape de conjugaison est préférentiellement réalisée dans des plaques multi-puits.
De façon avantageuse, le procédé comprend les étapes suivantes :
culture en milieu riche de la souche bactérienne donneuse comprenant le plasmide intégratif et de la souche bactérienne receveuse ;
incubation dans un même milieu des souches bactériennes donneuse et receveuse pour l’obtention de transconjugants ;
sélection des transconjugants.
culture en milieu riche de la souche bactérienne donneuse comprenant le plasmide intégratif et de la souche bactérienne receveuse ;
incubation dans un même milieu des souches bactériennes donneuse et receveuse pour l’obtention de transconjugants ;
sélection des transconjugants.
Préférentiellement, l’étape b d’incubation est réalisée sans agitation et présente une durée supérieure à 6h, préférentiellement supérieure ou égale à 8h, plus préférentiellement supérieure à 10h et plus préférentiellement encore comprise entre 12h et 48h ou encore 12h et 24h.
Selon un mode de réalisation, l’étape b d’incubation est réalisée à une température comprise entre 20°C et 40°C, préférentiellement entre 25°C et 35°C, plus préférentiellement encore entre 28°C et 32°C.
Avantageusement, le rapport entre le nombre de cellules de la souche bactérienne donneuse et le nombre de cellules de la souche bactérienne receveuse est supérieur à 1, préférentiellement supérieur à 6 et plus préférentiellement encore compris entre 14 et 25.
Selon un mode de réalisation, la souche bactérienne donneuse est choisie parmi le genre Escherichia Coli, préférentiellement il s’agit de la souche Escherichia Coli S17.1
Selon un mode de réalisation, la souche bactérienne receveuse est choisie parmi les bactéries Gram-, préférentiellement Pseudomonas putida, Escherichia Coli ou Gram+, préférentiellement Bacillus subtilis.
Avantageusement, le plasmide intégratif est le plasmide pK18mobsacB, comprenant un site de transfert par conjugaison oriT et une cassette de contre-sélection sacB.
Selon un mode de réalisation, le plasmide intégratif est le plasmide pOAK002 ou un variant de ce plasmide dans lequel une séquence promotrice a été clonée en amont d’un gène rapporteur codant pour la protéine fluorescente mCherry.
Avantageusement, les souches bactériennes donneuse et receveuse sont, préalablement à l’étape b d’incubation, soumises conjointement à au moins une étape de centrifugation, préférentiellement à une vitesse comprise entre 2000 rpm et 6000 rpm, préférentiellement pendant une durée comprise entre 5 et 10 minutes.
Préférentiellement l’étape c de sélection est réalisée dans un milieu comprenant au moins deux antibiotiques, le plasmide intégratif comprenant un gène de résistance au premier antibiotique, la souche receveuse étant sensible audit premier antibiotique et résistante au second antibiotique et les transconjugants étant résistants aux deux antibiotiques.
L’invention concerne également une utilisation du procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes pour réaliser une mutagénèse dirigée.
Fig. 1
Fig. 2
Fig. 3
Fig. 4
La présente invention concerne un procédé de conjugaison bactérienne entre une souche bactérienne donneuse et une souche bactérienne receveuse caractérisé en ce que la conjugaison est réalisée en milieu liquide et le plasmide de conjugaison est un plasmide intégratif apte à s’intégrer dans le génome de la souche bactérienne receveuse afin de produire des transconjugants.
L’expression « apte à s’intégrer dans le génome » signifie que le plasmide intégratif est un plasmide suicide qui possède les éléments nécessaires pour s’intégrer dans le génome bactérien. Ces éléments sont bien connus de l’Homme du métier.
En particulier, il s’agit d’une origine de réplication qui ne fonctionne pas dans la bactérie receveuse, de zones d’homologie à la zone d’insertion dans le chromosome de la bactérie receveuse de taille suffisante, typiquement entre 500 et 1000 pb.
Le terme « transconjugants » désigne les cellules de la souche bactérienne receveuse ayant intégré le plasmide de conjugaison dans leur génome.
L’expression « conjugaison en milieu liquide » est bien connue de l’homme du métier et fait référence au fait que la conjugaison proprement dite, c’est-à-dire l’incubation dans un même milieu des souches donneuse et receveuse, est réalisée uniquement en milieu liquide, en l’absence de filtre, de milieu de croissance solide tel que par exemple un gel d’agar, etc.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon la présente invention est automatisé et l’étape de conjugaison est préférentiellement réalisée dans des plaques multi-puits.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon la présente invention comprend les étapes suivantes :
a) culture en milieu riche de la souche bactérienne donneuse comprenant le plasmide intégratif et de la souche bactérienne receveuse ;
b) incubation dans un même milieu des souches bactériennes donneuse et receveuse pour l’obtention de transconjugants ;
c) sélection des transconjugants.
a) culture en milieu riche de la souche bactérienne donneuse comprenant le plasmide intégratif et de la souche bactérienne receveuse ;
b) incubation dans un même milieu des souches bactériennes donneuse et receveuse pour l’obtention de transconjugants ;
c) sélection des transconjugants.
Le terme « milieu riche » est bien connu de l’homme du métier qui entend par ce terme un milieu de culture riche en molécules organiques et en nutriments. Typiquement, il s’agit du milieu LB (Luria Broth: Tryptone 10 g/l, extrait de levure 5 g/l, chlorure de sodium 0,5 g/l).
Avantageusement, l’étape a de culture en milieu riche est réalisée, pour chacune des souches, dans une plaque multipuits. Préférentiellement la culture de chacune des souches est réalisée en présence de l’antibiotique pour lequel ladite souche est résistante. A titre d’exemple particulier, l’étape a de culture en milieu riche est réalisée avec de la kanamycine, préférentiellement à une concentration de 50 µg/ml, pour la souche donneuse et de l’ampicilline, préférentiellement à une concentration de 100 µg/ml, pour la souche receveuse. Selon un mode de réalisation particulier, l’étape b est réalisée pendant une nuit à 30°C, avantageusement sous agitation à 180 rpm. Avantageusement, suite à l’étape b de culture séparée des souches en milieu riche, le surnageant est éliminé et les culots obtenus sont repris dans du MgSO4. Avantageusement il s’agit de MgSO4à 10 mM et la reprise est effectuée préférentiellement dans 1 mL.
Les souches sont ensuite incubées conjointement pour l’obtention de transconjugants.
Dans un mode de réalisation particulier, l’étape b d’incubation est réalisée sans agitation et présente une durée supérieure à 6h, préférentiellement supérieure ou égale à 8h, plus préférentiellement supérieure à 10h et plus préférentiellement encore comprise entre 12h et 48h ou encore 12h et 24h.
Dans un mode de réalisation particulier, l’étape b d’incubation est réalisée à une température comprise entre 20°C et 40°C, préférentiellement entre 25°C et 35°C, plus préférentiellement encore entre 28°C et 32°C.
Dans un mode de réalisation particulier, le rapport entre le nombre de cellules de la souche bactérienne donneuse et le nombre de cellules de la souche bactérienne receveuse est supérieur à 1, préférentiellement supérieur à 6 et plus préférentiellement encore compris entre 14 et 25.
Dans un mode de réalisation particulier, la souche bactérienne donneuse est une souche de l’espèce Escherichia Coli, préférentiellement il s’agit de la souche S17.1.
La souche E. coli S17.1 est une souche bien connue, de génotype recA pro hsdR RP4-2-Tc::Mu-Km::Tn7, enregistrée auprès de l’American Type Culture Collection (ATCC) sous le numéro 47055.
Dans un mode de réalisation particulier, la souche bactérienne receveuse est choisie parmi les bactéries Gram-, préférentiellement la souche bactérienne receveuse est une souche de Pseudomonas putida ou une souche d’Escherichia Coli.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la souche bactérienne receveuse est choisie parmi les bactéries Gram+, préférentiellement la souche bactérienne receveuse est une souche de Bacillus subtilis.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit plasmide suicide est le plasmide pK18mobsacB, comprenant un site de transfert par conjugaison oriT, une cassette de contre-sélection sacB permettant d’effectuer de la mutagenèse sans cicatrice dans le chromosome de la souche bactérienne receveuse, une cassette de résistance à la kanamycine et une origine de réplication ne fonctionnant que chez Escherichia coli.
Le plasmide pK18mobsacB est bien connu de l’art antérieur et est notamment décrit dans Schäfer et al. (Schäfer et al., 1994). La carte du plasmide pK18mobsacB est présentée à la figure 1.
Dans un autre mode de réalisation particulier, ledit plasmide intégratif est le plasmide pOAK002. Ce plasmide provient du plasmide suicide pK18mobsacB dans lequel ont été clonées deux séquences d’ADN homologues aux séquences en amont et en aval du gène gcd présent dans le chromosome de la bactérie receveuse Pseudomonas putida. Ce plasmide peut donc s’intégrer à la place du gène gcd dans le chromosome bactérien. L’insertion du plasmide pOAK002 est sélectionnée grâce à la résistance à la kanamycine. La carte du plasmide pOAK002 est présentée à la figure 3.
Dans un autre mode de réalisation particulier, ledit plasmide intégratif est un variant du plasmide pOAK002. Les variants peuvent être obtenus par clonage d’une séquence de paires de bases, par exemple d’une séquence d’une quarantaine de paires de bases (21), en amont d’un gène rapporteur codant pour la protéine fluorescente mCherry permettant de visualiser l’activité promotrice de ces séquences en suivant la fluorescence produite ou non par les bactéries. Les différents variants peuvent été construits de manière à ce que les séquences promotrices accolées au gène codant pour la protéine mCherry soient insérées dans le chromosome de Pseudomonas putida au niveau du gène hsdR. Les séquences des zones d’homologie en amont (SEQ ID NO 1) et en aval (SEQ ID NO 2) du gène hsdR sont données dans le paragraphe « Texte libre du listage de séquences ». La figure 4 présente la carte d’un plasmide particulier ainsi obtenu, le plasmide RDppu132. Les séquences spécifiques d’une quarantaine de paires de bases (21), en amont d’un gène rapporteur codant pour la protéine fluorescente mCherry, peuvent être l’une des séquences identifiées au tableau 4 (« Séquence du promoteur pR ») ensemble détail de séquences au paragraphe « Texte libre du listage de séquences » (SEQ ID NO 3 à 12).
Dans un mode de réalisation particulier du procédé, la souche bactérienne donneuse et la souche bactérienne receveuse sont, préalablement à l’étape b d’incubation, soumises conjointement à au moins une étape de centrifugation.
De préférence, cette étape de centrifugation est réalisée à une vitesse comprise entre 2000 rpm et 6000 rpm, en particulier entre 4000 et 6000 rpm, plus particulièrement entre 4500 et 5000 rpm, et préférentiellement pendant une durée comprise entre 5 et 10 minutes, en particulier pendant 7 minutes.
Avantageusement, suite à la centrifugation ci-dessus décrite, le culot est repris dans un milieu riche LB, par exemple dans 1 mL de milieu riche, et mélangé avec chacune des souches dans des puits de microplaque.
Dans un mode de réalisation particulier du procédé, la souche bactérienne donneuse et la souche bactérienne receveuse sont, après l’étape b d’incubation, soumises à au moins une étape de centrifugation.
De préférence, cette étape de centrifugation postérieure à l’étape b d’incubation est réalisée à une vitesse comprise entre 2000 rpm et 6000 rpm, en particulier entre 4000 et 6000 rpm, plus particulièrement entre 4500 et 5000 rpm, et préférentiellement pendant une durée comprise entre 5 et 10 minutes, en particulier pendant 7 minutes.
Avantageusement, suite à la centrifugation postérieure à l’étape b d’incubation, le surnageant est éliminé et les culots obtenus sont repris dans du MgSO4. Avantageusement il s’agit de MgSO4à 10 mM et la reprise est effectuée préférentiellement dans 1 mL.
Dans un mode de réalisation particulier du procédé, l’étape c de sélection des transconjugants est réalisée dans un milieu comprenant au moins un premier et un deuxième antibiotiques, le plasmide intégratif comprenant un gène de résistance au premier antibiotique, la souche receveuse étant sensible audit premier antibiotique et résistante au deuxième antibiotique, la souche donneuse étant sensible au deuxième antibiotique et résistante au premier antibiotique, les transconjugants étant par conséquent résistants aux deux antibiotiques.
Avantageusement, la sélection des transconjugants est effectuée sur un milieu LB Agar avec de la kanamycine (Kn), préférentiellement à une concentration de 50 μg/ml, et de l’ampicilline (Ap), préférentiellement à une concentration de 100 μg/ml. Les bactéries donneuse et receveuse et/ou les transconjugants sont étalés sur ce milieu de sélection. Cependant, des tapis bactériens sont souvent observés si la conjugaison est trop efficace, ce qui rend incomptable le nombre de colonies isolées ou transconjugants obtenus. Avantageusement, des dilutions, par exemple à 10-1, 10-2et 10-3du milieu de conjugaison, peuvent être réalisées et ces dilutions sont étalées sur le milieu de sélection. Le nombre de colonies isolées est multiplié par le facteur de dilution pour trouver le nombre exact de transconjugants obtenus grâce au procédé de conjugaison. Il est ensuite possible de déterminer la fréquence de conjugaison, qui est le nombre de transconjugants divisé par le nombre de bactéries receveuses.
Dans un mode de réalisation particulier, les antibiotiques sont choisis parmi la kanamycine et l’ampicilline. Avantageusement, la sensibilité des souches donneuses et receveuses est testée préalablement au procédé de conjugaison et les doses efficaces de chacun des antibiotiques sont déterminées.
Un autre aspect de la présente invention porte sur l’utilisation du procédé décrit ci-dessus pour réaliser une mutagénèse dirigée.
Exemples
Exemple 1
Les souches bactériennes utilisées ont été les suivantes :
- souche donneuse : Escherichia coli S17.1 (Gram-);
- souche receveuse : Pseudomonas putida KT2440 (NBRC100650 ou ATCC47054) (Gram-).
- souche donneuse : Escherichia coli S17.1 (Gram-);
- souche receveuse : Pseudomonas putida KT2440 (NBRC100650 ou ATCC47054) (Gram-).
Les plasmides suivants ont été utilisés :
le plasmide réplicatif et transférable pBBR1-MCS2 (Kovach et al., 1995).
le plasmide intégratif et transférable pOAK002 (issu du pK18-mobsacB_ Schäfer et al., 1994) comportant des zones d’homologie pour insertion dans le chromosome de P. putida au niveau du gène PP1444 afin de déléter ce gène. Ces deux plasmides portent une cassette de résistance à l’antibiotique Kanamycine, c’est-à-dire un gène codant pour une aminoglycoside 3’-phosphotransferase ou gène aph(3’) qui inactive l’antibiotique.
le plasmide réplicatif et transférable pBBR1-MCS2 (Kovach et al., 1995).
le plasmide intégratif et transférable pOAK002 (issu du pK18-mobsacB_ Schäfer et al., 1994) comportant des zones d’homologie pour insertion dans le chromosome de P. putida au niveau du gène PP1444 afin de déléter ce gène. Ces deux plasmides portent une cassette de résistance à l’antibiotique Kanamycine, c’est-à-dire un gène codant pour une aminoglycoside 3’-phosphotransferase ou gène aph(3’) qui inactive l’antibiotique.
La résistance aux antibiotiques (Kanamycine, ROTH référence T832.4 ; Ampicilline, EUROMEDEX, référence EU0400-D) de chacune des souches a préalablement été testée afin de déterminer le milieu de culture optimal pour la sélection des transconjugants (clones de P. putida transformés par l’un ou l’autre des plasmides lors du procédé de conjugaison avec la souche S17.1 contenant l’un ou l’autre des plasmides) :
- Souches E. coli S17.1/pBBR1-MCS2 ou S17.1/pOAK002 :
croissance sur milieu riche LB Agar (Luria-Miller, Roth, référence X968.2 contenant de l’agar à 1,5%) sans antibiotique et sur milieu LB Agar comprenant de la kanamycine à une concentration de 50 μg/ml ;
absence de croissance sur milieu LB Agar comprenant de l’ampicilline à une concentration de 100 μg/ml ;
absence de croissance sur milieu LB Agar comprenant de l’ampicilline à une concentration de 100 μg/ml et de la kanamycine à une concentration de 50 μg/ml;
- Souche P. putida : croissance sur milieu LB Agar sans antibiotique et sur milieu LB Agar comprenant de l’ampicilline à une concentration de 100 μg/ml ;
absence de croissance sur milieu LB Agar comprenant de la kanamycine à une concentration de 50 μg/ml ;
absence de croissance sur milieu LB Agar comprenant de l’ampicilline à une concentration de 100 μg/ml et de la kanamycine à une concentration de 50 μg/ml.
Les transconjuguants sont donc résistants à l’ampicilline à une concentration de 100 μg/ml et à la kanamycine à une concentration de 50 μg/ml.
- Souches E. coli S17.1/pBBR1-MCS2 ou S17.1/pOAK002 :
croissance sur milieu riche LB Agar (Luria-Miller, Roth, référence X968.2 contenant de l’agar à 1,5%) sans antibiotique et sur milieu LB Agar comprenant de la kanamycine à une concentration de 50 μg/ml ;
absence de croissance sur milieu LB Agar comprenant de l’ampicilline à une concentration de 100 μg/ml ;
absence de croissance sur milieu LB Agar comprenant de l’ampicilline à une concentration de 100 μg/ml et de la kanamycine à une concentration de 50 μg/ml;
- Souche P. putida : croissance sur milieu LB Agar sans antibiotique et sur milieu LB Agar comprenant de l’ampicilline à une concentration de 100 μg/ml ;
absence de croissance sur milieu LB Agar comprenant de la kanamycine à une concentration de 50 μg/ml ;
absence de croissance sur milieu LB Agar comprenant de l’ampicilline à une concentration de 100 μg/ml et de la kanamycine à une concentration de 50 μg/ml.
Les transconjuguants sont donc résistants à l’ampicilline à une concentration de 100 μg/ml et à la kanamycine à une concentration de 50 μg/ml.
Le protocole de conjugaison liquide à haut-débit pour le transfert d’un plasmide réplicatif est le suivant :
- 900µL de souches donneuses et receveuses sont mises en culture séparément dans une plaque DeepWell (Greiner 96 well MASTERBLOCK®,PP,2mL ref Dutscher 780285) avec de la kanamycine à une concentration de 50 μg/ml pour la souche donneuse et de l’ampicilline à une concentration de 100 μg/ml pour la souche receveuse, pendant une nuit à 30°C et sous agitation à 180 rpm ;
- la plaque est centrifugée 7 minutes à 4860 rpm ;
- le surnageant est éliminé et les culots obtenus sont repris dans 1 mL de MgSO4à 10 mM toujours dans la plaque;
- la plaque est centrifugée 7 minutes à 4860 rpm (Eppendorf Centrifuge 5418R)
- le culot est repris dans 1 mL de milieu riche LB (ROTH art. X968.2) et 50 µL de chacune des souches (ratio 1/1) sont mélangées dans des puits de microplaques (BIORAD Hard-shell PCR plates, 96-wells, thin-wall, HSP9631)
- incubation des mélanges bactériens 4h à 30°C sans agitation,
- centrifugation de la microplaque à 4860 rpm, 10 min, température ambiante
- reprise des culots avec 100 µL de MgSO4 à 10 mM
- sélection des transconjugants sur un milieu LB Agar avec de la kanamycine (Kn) à une concentration de 50 μg/ml et de l’ampicilline (Ap) à une concentration de 100 μg/ml. Les 100 μL sont étalés sur ce milieu de sélection. Des tapis bactériens sont souvent observés lorsque la conjugaison est trop efficace, ce qui rend incomptable le nombre de colonies isolées ou transconjugants obtenus. Des dilutions à 10-1, 10-2et 10-3du milieu de conjugaison peuvent donc être réalisées et ces dilutions étalées sur le milieu de sélection. Le nombre de colonies isolées est multiplié par le facteur de dilution pour trouver le nombre exact de transconjugants obtenus dans l’expérience de conjugaison. Il est ensuite possible de déterminer la fréquence de conjugaison, qui est le nombre de transconjugants divisé par le nombre de bactéries receveuses.
Les résultats du protocole de conjugaison sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous (Légende : 0 = pas de colonies observées, / = incalculable).
- 900µL de souches donneuses et receveuses sont mises en culture séparément dans une plaque DeepWell (Greiner 96 well MASTERBLOCK®,PP,2mL ref Dutscher 780285) avec de la kanamycine à une concentration de 50 μg/ml pour la souche donneuse et de l’ampicilline à une concentration de 100 μg/ml pour la souche receveuse, pendant une nuit à 30°C et sous agitation à 180 rpm ;
- la plaque est centrifugée 7 minutes à 4860 rpm ;
- le surnageant est éliminé et les culots obtenus sont repris dans 1 mL de MgSO4à 10 mM toujours dans la plaque;
- la plaque est centrifugée 7 minutes à 4860 rpm (Eppendorf Centrifuge 5418R)
- le culot est repris dans 1 mL de milieu riche LB (ROTH art. X968.2) et 50 µL de chacune des souches (ratio 1/1) sont mélangées dans des puits de microplaques (BIORAD Hard-shell PCR plates, 96-wells, thin-wall, HSP9631)
- incubation des mélanges bactériens 4h à 30°C sans agitation,
- centrifugation de la microplaque à 4860 rpm, 10 min, température ambiante
- reprise des culots avec 100 µL de MgSO4 à 10 mM
- sélection des transconjugants sur un milieu LB Agar avec de la kanamycine (Kn) à une concentration de 50 μg/ml et de l’ampicilline (Ap) à une concentration de 100 μg/ml. Les 100 μL sont étalés sur ce milieu de sélection. Des tapis bactériens sont souvent observés lorsque la conjugaison est trop efficace, ce qui rend incomptable le nombre de colonies isolées ou transconjugants obtenus. Des dilutions à 10-1, 10-2et 10-3du milieu de conjugaison peuvent donc être réalisées et ces dilutions étalées sur le milieu de sélection. Le nombre de colonies isolées est multiplié par le facteur de dilution pour trouver le nombre exact de transconjugants obtenus dans l’expérience de conjugaison. Il est ensuite possible de déterminer la fréquence de conjugaison, qui est le nombre de transconjugants divisé par le nombre de bactéries receveuses.
Les résultats du protocole de conjugaison sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous (Légende : 0 = pas de colonies observées, / = incalculable).
| Souches pour la conjugaison | Nombre de transconjugants | Fréquence de conjugaison | Fréquence de conjugaison/insertion chromosomique |
| S17.1_pBBR1-MCS2 X P. putida | 3.104 | 1.10-6 | / |
| S17.1_pOAK002 X P. putida | 0 | / | 0 |
Exemple 2
Le procédé de l’exemple 1 a été reproduit pour le procédé de mutagénèse dirigé impliquant le plasmide intégratif pOAK002 en faisant varier le temps de contact entre les souches donneuses (D) et receveuses (S). Les résultats en termes de nombre de transconjugants obtenus selon le temps d’incubation entre souches donneuse (D) et receveuse (R) sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous.
| Conjugaison | temps d’incubation entre souches D et R |
||||
| 4h | 5h | 6h | 8h | 15h | |
| S17.1_pOAK002 (D) X P. putida (R) : nombre de transconjugants |
0 | 1 | 3 | 10 | 284 |
Un temps de contact supérieur à 6h a été nécessaire afin d’obtenir plus d’une dizaine de transconjugants.
Exemple 3
Exemple 3
Le procédé de l’exemple 2 a été reproduit pour le procédé de mutagénèse dirigé impliquant le plasmide intégratif pOAK002 avec un temps de contact entre les souches donneuses (D) et receveuses (R) de 15h. Les résultats sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous.
Différents ratios entre le nombre de souches donneuses et celui de souches receveuses (ratio D/R) ont été testés. Les résultats sont présentés dans le Tableau 3.
| Conjugaison | Nombre de transconjugants | Ratio (D/R) |
| S17.1_pOAK002/P. putida | 284 | 1 |
| S17.1_pOAK002/P. putida | 262 | 0.5 |
| S17.1_pOAK002/P. putida | 570 | 2 |
| S17.1_pOAK002/P. putida | 940 | 14 |
| S17.1_pOAK002/P. putida | 1200 | 20 |
L’efficacité de la mutagénèse dirigée augmente avec le ratio D/R.
Exemple 4
Exemple 4
Plusieurs séquences d’une quarantaine de paires de bases (21) ont été clonées en amont d’un gène rapporteur codant pour la protéine fluorescente mCherry permettant de visualiser l’activité promotrice de ces séquences en suivant la fluorescence produite ou non par les bactéries. Cette banque a été clonée chez Escherichia coli dans le plasmide pK18mobsacB. Afin de tester cette banque de promoteurs chez Pseudomonas putida, les 21 plasmides nommés RDppu ont été transférés dans cette bactérie par conjugaison haut-débit automatisée selon le protocole de l’exemple 3 et un ratio D/R de 1. Les résultats de cette mutagénèse dirigée sont présentés dans le tableau 4.
| Conjugaison | Plasmides | Séquence du promoteur pRxxx | Séquence RBS | Nombre de transconjugants |
| 1 | RDppu130 | pR057 : SEQ ID NO 3 |
RBS006 : 5’-ACGAGG-3’ |
22 |
| 2 | RDppu131 | pR057 : SEQ ID NO 3 |
RBS007 : 5’-ACGAGA-3’ |
54 |
| 3 | RDppu132 | pR056 : SEQ ID NO 4 |
RBS006 : 5’-ACGAGG-3’ | 66 |
| 4 | RDppu133 | pR056 : SEQ ID NO 4 |
RBS008 : 5’-AGAAAA-3’ |
>400 |
| 5 | RDppu134 | pR056 : SEQ ID NO 4 |
RBS012 : 5’-AGGAGG-3’ |
56 |
| 6 | RDppu135 | pR055 : SEQ ID NO 5 |
RBS012 : 5’-AGGAGG-3’ |
>300 |
| 7 | RDppu136 | pR055 : SEQ ID NO 5 |
RBS006 : 5’-ACGAGG-3’ |
>250 |
| 8 | RDppu137 | pR061 : SEQ ID NO 6 |
RBS008 : 5’-AGAAAA-3’ |
146 |
| 9 | RDppu138 | pR055 : SEQ ID NO 5 |
RBS008 : 5’-AGAAAA-3’ |
170 |
| 10 | RDppu139 | pR053 : SEQ ID NO 7 |
RBS012 : 5’-AGGAGG-3’ |
37 |
| 11 | RDppu140 | pR062 : SEQ ID NO 8 |
RBS006 : 5’-ACGAGG-3’ |
16 |
| 12 | RDppu141 | pR063 : SEQ ID NO 9 |
RBS007 : 5’-ACGAGA-3’ |
56 |
| 13 | RDppu142 | pR053 : SEQ ID NO 7 |
RBS008 : 5’-AGAAAA-3’ |
33 |
| 14 | RDppu143 | pR053 : SEQ ID NO 7 |
RBS009 : 5’- ACGAAA-3’ |
>200 |
| 15 | RDppu150 | pR051 : SEQ ID NO 10 |
RBS009 : 5’- ACGAAA-3’ |
59 |
| 16 | RDppu151 | pR050 : SEQ ID NO 11 |
RBS005 : 5’- AAGAAG-3’ |
44 |
| 17 | RDppu152 | pR050 : SEQ ID NO 11 |
RBS006 : 5’-ACGAGG-3’ |
28 |
| 18 | RDppu153 | pR050 : SEQ ID NO 11 |
pR057 : SEQ ID NO 3 |
>250 |
| 19 | RDppu154 | pR050 : SEQ ID NO 11 |
RBS008 : 5’-AGAAAA-3’ |
154 |
| 20 | RDppu157 | pR054 : SEQ ID NO 12 |
RBS005 : 5’- AAGAAG-3’ |
>350 |
| 21 | RDppu181 | pR050 : SEQ ID NO 11 |
RBS012 : 5’-AGGAGG-3’ |
74 |
Toute la banque de promoteurs a pu être transférée chez Pseudomonas putida. Les différents plasmides RDppu ont été construits de manière à ce que les séquences promotrices accolées au gène codant pour la mCherry soient insérées dans le chromosome de Pseudomonas putida au niveau du gène hsdR. Les séquences des zones d’homologie en amont (SEQ ID NO 1) et en aval (SEQ ID NO 2) du gène hsdR sont données dans le paragraphe « Texte libre du listage de séquences ». La figure 4 présente la carte du plasmide RDppu132. Les séquences spécifiques de chacun des plasmides RDppu sont données dans le tableau 4 (colonnes « séquence promoteur pRxxx» et « séquence RBS ») ensemble paragraphe « Texte libre du listage de séquences » (à titre d’exemple, le plasmide RDppu132 comprend les séquences spécifiques pR056 (SEQ ID NO 4) et RBS006 (séquence détaillée dans le tableau 4), le plasmide RDppu140 comprenant les séquences spécifique pR062 (SEQ ID NO 8) et RBS006 (séquence détaillée dans le tableau 4) pour la séquence du promoteur pRxxx et la séquence RBS respectivement, etc).
Des PCR réalisées avec des primers de part et d’autre de ce gène permettent de visualiser l’insertion correcte ou non de la banque de PCR. De telles réactions PCR ont été réalisées sur 10 transconjugants par plasmide et ont montré que les promoteurs accolés au gène codant pour la mCherry étaient bien intégrés au bon endroit dans le chromosome de la souche R Pseudomonas putida. La banque de promoteurs a donc pu être construite et testée en moins d’une semaine en suivant la fluorescence émise par les bactéries.
Dans la présente demande, il est fait référence au(x) listage(s) de séquence(s) dont le(s) identificateur(s) (ou « SEQ ID NO ») sont listés ci-après. Quelle que soit la forme sous laquelle les listages sont fournis, ces listages font partie de la présente demande.
SEQ ID NO 1
5’- TGCTAGTCACCCTTGCTTCTCGGCCATAGAGCTCATTTCGTCTTTATAGCTTCGACGTCATAGTAGGAGCCATCTTTAATCACACAATAAAATACTATAGGTTCAGTTCCCCCTCCAAAACTATGAAACGCCGCATTTACTTTTAACCGTTCGACAGCGCCATCGCGCTCCTCGCTATCTACGATCCATTCTCTGACCGTGTTCGTCGACTGGATGGAGCCTGCACCGGAAACTCGTCTCTGCAAATCTTGTATGCATGCATTTACGAGCTCATTTCTTGCCTTGGGTCTGTAAGCGTCGCTAAGCCGTATGACGCAGTCCTGGGTCTTCAAAATAATTTCAGCACGCTCCTTTGAGCCCAGCTCTTTGGAATCCATCATCGTTGCAAGTTGGGTACTCAACGAGTCCTTCATCGATGCACTGAAATCTACCCCTTTAGACTTGGTCGCATCCGCATACTGAAAAGCGCCTTTGAATGCGGCGGTTACATCTGCCGAATACCCAAGGCCACATGCCTTAATCGCCTGATCAACTGGTGCAACAGATCGATAGGGAGAAAGGCCTGAACAAGCTGACAAGAACACAGCGGAAAGCAACCAGATATGACTACGCATTAACAATTTCTCCACCCCCAAATAATGGCACTAAGCCACTATACCACTTATTCGACGTATAGGTTTGGCCAGAGTGGCAGGCGCCACTTGCGAGCATCCACCCAACGCGAAAATGTCATTAATAGTAGGGCTGAGCTAACTGAGCGCTGACAGCTGGGAACACCTTGGGCATGCGGCTTGGCTTCATGAACACCGATGAGCTTGGTATTGCAACGTACTGGCCATGCGGCTGCTGAATCATCATTTAGAAAAGCCGTGAGGTTTCCACTGCCATCAGCGCATAGGAAGGCCCGACGACCGGGCCTGAGAGCCCCCCGACGATAGTGGCAGCATGCCTCTAGCTATTTTGTTAAATTCGGCAACACGCCATAGGGACATAGCCAGCA-3’
5’- TGCTAGTCACCCTTGCTTCTCGGCCATAGAGCTCATTTCGTCTTTATAGCTTCGACGTCATAGTAGGAGCCATCTTTAATCACACAATAAAATACTATAGGTTCAGTTCCCCCTCCAAAACTATGAAACGCCGCATTTACTTTTAACCGTTCGACAGCGCCATCGCGCTCCTCGCTATCTACGATCCATTCTCTGACCGTGTTCGTCGACTGGATGGAGCCTGCACCGGAAACTCGTCTCTGCAAATCTTGTATGCATGCATTTACGAGCTCATTTCTTGCCTTGGGTCTGTAAGCGTCGCTAAGCCGTATGACGCAGTCCTGGGTCTTCAAAATAATTTCAGCACGCTCCTTTGAGCCCAGCTCTTTGGAATCCATCATCGTTGCAAGTTGGGTACTCAACGAGTCCTTCATCGATGCACTGAAATCTACCCCTTTAGACTTGGTCGCATCCGCATACTGAAAAGCGCCTTTGAATGCGGCGGTTACATCTGCCGAATACCCAAGGCCACATGCCTTAATCGCCTGATCAACTGGTGCAACAGATCGATAGGGAGAAAGGCCTGAACAAGCTGACAAGAACACAGCGGAAAGCAACCAGATATGACTACGCATTAACAATTTCTCCACCCCCAAATAATGGCACTAAGCCACTATACCACTTATTCGACGTATAGGTTTGGCCAGAGTGGCAGGCGCCACTTGCGAGCATCCACCCAACGCGAAAATGTCATTAATAGTAGGGCTGAGCTAACTGAGCGCTGACAGCTGGGAACACCTTGGGCATGCGGCTTGGCTTCATGAACACCGATGAGCTTGGTATTGCAACGTACTGGCCATGCGGCTGCTGAATCATCATTTAGAAAAGCCGTGAGGTTTCCACTGCCATCAGCGCATAGGAAGGCCCGACGACCGGGCCTGAGAGCCCCCCGACGATAGTGGCAGCATGCCTCTAGCTATTTTGTTAAATTCGGCAACACGCCATAGGGACATAGCCAGCA-3’
SEQ ID NO 2
5’- TCCGCTCTACCCGTTGGGTGGGCAACGGCGGAGCCTTGTCCACCTAAGCAGCCAACTCCATTACAATCCCCCGCTTTGCCACACCGATTGAGAATTCGTTATGTCCATCAGCTCCACCATCAAGTCCATCCAGGACATCATGCGCAAAGACGTCGGCGTCGATGGCGACGCCCAGCGCATTGGCCAGCTGGTCTGGCTGCTGTTCCTCAAGATCTTCGATGACCGCGAGCTGGAATGGGAACTGATGGACGACAACTACAAGTCGCCCATCCCCGACAGCTGCCGCTGGCGCACCTGGGCGGCCGACCCGGAAGGCATGACCGGCGATGCGCTGAAGGACTTTATCGACAACAACCTGTTCCCGCAGCTGCAGAACCTGCACGAATACAGCAACACACCCTCGGCCTTTGTGGTGCGCAGCGTGTTTGAAGACGCCTACAACTACATGAAATCCGGCCAGCTGCTGCGCCAGGTGATCAACAAGATTCAGGAAGGCGTGGACTTCAACAGGGCCCAGGAACGCCACGAGTTCGGCAACCTCTATGAACAATTGCTGCGCGACCTGCAGAACGCCGGCAACGCCGGTGAGTTCTACACACCTCGACCAGTCACCGAATTTATGGTGCGCATGGTTGATCCCAAGCTGGCTGAAAAGGTCATGGACCCGGCCTGCGGCACCGGCGGCTTTCTCACCTGCGCCATCGAGCACAAGCGCAGACGCTATGTAAAAACCGCCGAAGACGAACGCACCTTGCAGGCCAGCATTTTTGGCGTGGAGAAAAAACCGCTGCCGCACCTGCTGGCCACCACCAACATGATCCTGCATGGCATCGAAGTGCCCAGCCAGATCCGTCACGACAACACCCTGAGCAAACCGCTGATCAGCTGGGGCCCAAGCGAGCGCGTGCATTGTATCGTCGCCAACCCGCCGTTCGGCGGCATGGAAGAAGACGGTATCGAAACAAATTTTCCTGCCGCTTTCCGCACCCGGGAAACCGC-3’
5’- TCCGCTCTACCCGTTGGGTGGGCAACGGCGGAGCCTTGTCCACCTAAGCAGCCAACTCCATTACAATCCCCCGCTTTGCCACACCGATTGAGAATTCGTTATGTCCATCAGCTCCACCATCAAGTCCATCCAGGACATCATGCGCAAAGACGTCGGCGTCGATGGCGACGCCCAGCGCATTGGCCAGCTGGTCTGGCTGCTGTTCCTCAAGATCTTCGATGACCGCGAGCTGGAATGGGAACTGATGGACGACAACTACAAGTCGCCCATCCCCGACAGCTGCCGCTGGCGCACCTGGGCGGCCGACCCGGAAGGCATGACCGGCGATGCGCTGAAGGACTTTATCGACAACAACCTGTTCCCGCAGCTGCAGAACCTGCACGAATACAGCAACACACCCTCGGCCTTTGTGGTGCGCAGCGTGTTTGAAGACGCCTACAACTACATGAAATCCGGCCAGCTGCTGCGCCAGGTGATCAACAAGATTCAGGAAGGCGTGGACTTCAACAGGGCCCAGGAACGCCACGAGTTCGGCAACCTCTATGAACAATTGCTGCGCGACCTGCAGAACGCCGGCAACGCCGGTGAGTTCTACACACCTCGACCAGTCACCGAATTTATGGTGCGCATGGTTGATCCCAAGCTGGCTGAAAAGGTCATGGACCCGGCCTGCGGCACCGGCGGCTTTCTCACCTGCGCCATCGAGCACAAGCGCAGACGCTATGTAAAAACCGCCGAAGACGAACGCACCTTGCAGGCCAGCATTTTTGGCGTGGAGAAAAAACCGCTGCCGCACCTGCTGGCCACCACCAACATGATCCTGCATGGCATCGAAGTGCCCAGCCAGATCCGTCACGACAACACCCTGAGCAAACCGCTGATCAGCTGGGGCCCAAGCGAGCGCGTGCATTGTATCGTCGCCAACCCGCCGTTCGGCGGCATGGAAGAAGACGGTATCGAAACAAATTTTCCTGCCGCTTTCCGCACCCGGGAAACCGC-3’
SEQ ID NO 3
5’-TTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACC-3’
5’-TTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACC-3’
SEQ ID NO 4
5’-CGGAGTTGACAACACTCGAAAAGCCGAGTATAATCAGATGA-3’
5’-CGGAGTTGACAACACTCGAAAAGCCGAGTATAATCAGATGA-3’
SEQ ID NO 5
5’-GCCCGTTGACATGACATGGTTTTGAGGGTATAATGTGGCGA-3’
5’-GCCCGTTGACATGACATGGTTTTGAGGGTATAATGTGGCGA-3’
SEQ ID NO 6
5’-GCCCGTTGACATGACATGGTTTTGAGGGTATAATGTGTCGA-3’
5’-GCCCGTTGACATGACATGGTTTTGAGGGTATAATGTGTCGA-3’
SEQ ID NO 7
5’-TTTATTTGACATGCGTGATGTTTAGAATTATAATTTGGGGA-5’
5’-TTTATTTGACATGCGTGATGTTTAGAATTATAATTTGGGGA-5’
SEQ ID NO 8
5’-TTTATTTGACAGCGTGATGTTTAGAATTATAATTTGGGGA-3’
5’-TTTATTTGACAGCGTGATGTTTAGAATTATAATTTGGGGA-3’
SEQ ID NO 9
5’- TATATTTGACATGCGTGATGTTTAGAATTATAGTTTGGGGA-3’
5’- TATATTTGACATGCGTGATGTTTAGAATTATAGTTTGGGGA-3’
SEQ ID NO 10
5’- GCCCATTGACAAGGCTCTCGCGGCCAGGTATAATTGCACGA-3’
5’- GCCCATTGACAAGGCTCTCGCGGCCAGGTATAATTGCACGA-3’
SEQ ID NO 11
5’-TCTACTTGACATCCGACATTCGCGACTGTATAATAAGTTGA-3’
5’-TCTACTTGACATCCGACATTCGCGACTGTATAATAAGTTGA-3’
SEQ ID NO 12
5’- CTAGGTTGACATGGATATAATGTATGTA-3’
5’- CTAGGTTGACATGGATATAATGTATGTA-3’
À toute fin utile, le(s) document(s) brevet(s) suivant(s) est (sont) cité(s) :
- US4680264
- US4686184
- US4626504
- EP372230
- EP372230
- WO9726361
- WO2018092171
- WO200645631
- WO2014037917
- US4680264
- US4686184
- US4626504
- EP372230
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- WO9726361
- WO2018092171
- WO200645631
- WO2014037917
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- Hmelo L.R., Borlee B.R., Almblad H., Love M.E., Randall T.E., Tseng B.S., Lin C., Irie Y., Storek K.M., Yang J.J., Siehnel R.J., Howell P.L., Singh P.K., Tolker-Nielsen T., Parsek M.R., Schweizer H.P., Harrison J.J.; Precision-engineering the Pseudomonas aeruginosa genome with two-step allelic exchange; Nat Protoc. 2015 Nov;10(11):1820-41; doi: 10.1038/nprot.2015.115; Epub 2015 Oct 22.
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Claims (14)
- Procédé de conjugaison bactérienne entre une souche bactérienne donneuse et une souche bactérienne receveuse caractérisé en ce que la conjugaison est réalisée en milieu liquide et le plasmide de conjugaison est un plasmide intégratif apte à s’intégrer dans le chromosome de la souche bactérienne receveuse afin de produire des transconjugants.
- Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le plasmide intégratif comprend une origine de réplication qui ne fonctionne pas dans la bactérie receveuse et des zones d’homologie à la zone d’insertion dans le chromosome de la bactérie receveuse de taille comprise entre 500 et 1000 pb.
- Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu’il est automatisé, l’étape de conjugaison étant préférentiellement réalisée dans des plaques multi-puits.
- Procédé selon l’une des revendications précédentes comprenant les étapes suivantes :
- culture en milieu riche de la souche bactérienne donneuse comprenant le plasmide intégratif et de la souche bactérienne receveuse ;
- incubation dans un même milieu des souches bactériennes donneuse et receveuse pour l’obtention de transconjugants ;
- sélection des transconjugants.
- Procédé selon la revendication 4 caractérisée en ce que l’étape b d’incubation est réalisée sans agitation et présente une durée supérieure à 6h, préférentiellement supérieure ou égale à 8h, plus préférentiellement supérieure à 10h et plus préférentiellement encore comprise entre 12h et 48h ou encore 12h et 24h.
- Procédé selon la revendication 4 ou 5 caractérisée en ce que l’étape b d’incubation est réalisée à une température comprise entre 20°C et 40°C, préférentiellement entre 25°C et 35°C, plus préférentiellement encore entre 28°C et 32°C.
- Procédé selon l’une quelconques des revendications 4 à 6 caractérisé en ce que le rapport entre le nombre de cellules de la souche bactérienne donneuse et le nombre de cellules de la souche bactérienne receveuse est supérieur à 1, préférentiellement supérieur à 6 et plus préférentiellement encore compris entre 14 et 25.
- Procédé selon l’une des revendications précédentes tel que la souche bactérienne donneuse est choisie parmi le genre Escherichia Coli, préférentiellement il s’agit de la souche Escherichia Coli S17.1
- Procédé selon l’une des revendications précédentes tel que la souche bactérienne receveuse est choisie parmi les bactéries Gram-, préférentiellement Pseudomonas putida, Escherichia Coli ou Gram+, préférentiellement Bacillus subtilis.
- Procédé selon l’une des revendications précédentes caractérisé en ce que le plasmide intégratif est le plasmide pK18mobsacB, comprenant un site de transfert par conjugaison oriT et une cassette de contre-sélection sacB.
- Procédé selon l’une des revendications précédentes caractérisé en ce que le plasmide intégratif est le plasmide pOAK002 ou un variant de ce plasmide dans lequel une séquence promotrice a été clonée en amont d’un gène rapporteur codant pour la protéine fluorescente mCherry.
- Procédé selon la revendication 4 tel les souches bactériennes donneuse et receveuse sont, préalablement à l’étape b d’incubation, soumises conjointement à au moins une étape de centrifugation, préférentiellement à une vitesse comprise entre 2000 rpm et 6000 rpm, préférentiellement pendant une durée comprise entre 5 et 10 minutes.
- Procédé selon l’une quelconques des revendications 4 à 12 tel que l’étape c de sélection est réalisée dans un milieu comprenant au moins deux antibiotiques, le plasmide intégratif comprenant un gène de résistance au premier antibiotique, la souche receveuse étant sensible audit premier antibiotique et résistante au second antibiotique et les transconjugants étant résistants aux deux antibiotiques.
- Utilisation du procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes pour réaliser une mutagénèse dirigée.
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