JP6813872B2 - シャトルベクター及び外来蛋白質の製造方法 - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Description
[1]
下記(1)〜(3)のいずれかのポリヌクレオチドを含む、コクリア属に属する微生物において複製可能なベクター:
(1)配列番号:3若しくは4に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(2)配列番号:3若しくは4に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が置換、欠失及び/若しくは挿入された配列を有し、かつコクリア属に属する微生物内において複製可能であるポリヌクレオチド、又は
(3)配列番号:3若しくは4に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコクリア属に属する微生物内において複製可能であるポリヌクレオチド。
[2]
下記(1)〜(3)のいずれかのポリヌクレオチド及び下記(4)のポリヌクレオチドを含み、コクリア属に属する微生物及び大腸菌において複製可能なシャトルベクター。
(1)配列番号:3若しくは4に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(2)配列番号:3若しくは4に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が置換、欠失及び/若しくは挿入された配列を有し、かつコクリア属に属する微生物内において複製可能であるポリヌクレオチド、又は
(3)配列番号:3若しくは4に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコクリア属に属する微生物内において複製可能であるポリヌクレオチドを含む、
(4)大腸菌由来の複製起点ポリヌクレオチド
[3]
マルチクローニングサイト、プロモーター配列及び薬剤耐性遺伝子から成る群から選ばれる少なくとも1種の配列をさらに含む[2]に記載のベクター。
[4]
前記マルチクローニングサイトに大腸菌及びコクリア属の何れにも属さない微生物由来の蛋白質(以下、外来蛋白質)をコードするポリヌクレオチドを挿入して、前記外来蛋白質を大腸菌及びコクリア属に属する微生物において発現させるために用いる、[3]に記載のシャトルベクター。
[5]
前記薬剤耐性がカナマイシン耐性、ネオマイシン耐性、又はチオストレプトン耐性である[3]又は[4]に記載のベクター。
[6]
配列番号:5〜12のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる[2]〜[5]のいずれか1項に記載のシャトルベクター。
[7]
前記コクリア属に属する微生物が、コクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)、コクリア バリアンス(Kocuria varians)、コクリア フラバ(Kocuria flava)、又はコクリア ツルファネンシス(Kocuria turfanensis)に属する微生物である、[1]〜[6]のいずれか1項に記載のベクター。
[8]
前記コクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)に属する微生物が、コクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)DC2201株(NBRC103217)、コクリア バリアンス(Kocuria varians)に属する微生物が、コクリア バリアンス(Kocuria varians)(NBRC15358)、コクリア フラバ(Kocuria flava)に属する微生物が、コクリア フラバ(Kocuria flava)(NBRC107626)、コクリア ツルファネンシス(Kocuria turfanensis)に属する微生物が、コクリア ツルファネンシス(Kocuria turfanensis)(NBRC107627)である、[7]に記載のベクター。
[9]
[1]〜[8]のいずれか1項に記載のベクター及び該ベクターに挿入された外来蛋白質をコードするDNAを含む組換えベクター。
[10]
前記外来蛋白質が、大腸菌及びコクリア属の何れにも属さない微生物由来の蛋白質である[9]に記載の組換えベクター。
[11]
配列番号:14又は15に記載の塩基配列からなる組換えベクターである、[10]に記載の組換えベクター。
[12]
宿主及び該宿主に導入された[1]〜[8]のいずれか1項に記載のベクター又は[9]〜[11]のいずれか1項に記載の組換えベクターを含む、形質転換体。
[13]
宿主が、大腸菌又はコクリア属に属する微生物である[12]に記載の形質転換体。
[14]
前記コクリア属に属する微生物が、コクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)、コクリア バリアンス(Kocuria varians)、コクリア フラバ(Kocuria flava)、又はコクリア ツルファネンシス(Kocuria turfanensis)に属する微生物である、[13]に記載の形質転換体。
[15]
前記コクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)に属する微生物がコクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)DC2201株(NBRC103217)、コクリア バリアンス(Kocuria varians)(NBRC15358)、コクリア フラバ(Kocuria flava)(NBRC107626)、又はコクリア ツルファネンシス(Kocuria turfanensis)(NBRC107627)である、[14]に記載の形質転換体。
[16]
[12]〜[15]のいずれか1項に記載の形質転換体を培養する工程、及び培養により得られる培養物から外来蛋白質を単離する工程を含む、外来蛋白質の製造方法。
[17]
[13]〜[15]のいずれか1項に記載の形質転換体を、有機溶媒を含有する培地を用いて培養する工程、及び培養により得られる培養物から外来蛋白質を単離する工程を含む、外来蛋白質の製造方法。
(1)コクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)DC2201株(NBRC103217)などのコクリア属に属する微生物内で複製可能な新たなベクターを提供することができる。
(2)コクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)DC2201株(NBRC103217)などのコクリア属に属する微生物内及び大腸菌内で複製可能な新たなシャトルベクターを提供することができる。
(3)コクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)DC2201株(NBRC103217)などのコクリア属に属する微生物内におけるコピー数が多く、外来蛋白質を導入して発現させる際の発現効率が比較的高いシャトルベクターを提供することができる。
(4)薬剤耐性を有するシャトルベクターであって、薬剤を含まない培地においても安定的に複製及び保持が可能なシャトルベクターを提供することができる。
(5)コクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)DC2201株(NBRC103217)などのコクリア属に属する微生物に対する形質転換効率の高いシャトルベクターを提供することができる。
(6)コクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)DC2201株(NBRC103217)などのコクリア属に属する微生物において共存可能な複数のシャトルベクターを提供することができる。
本発明は、下記(1)〜(3)のいずれかのポリヌクレオチドを含む、コクリア属に属する微生物において複製可能なベクターに関する。
(1)配列番号:3若しくは4に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(2)配列番号:3若しくは4に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が置換、欠失及び/若しくは挿入された配列を有し、かつコクリア属に属する微生物内において複製可能であるポリヌクレオチド、又は
(3)配列番号:3若しくは4に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコクリア属に属する微生物内において複製可能であるポリヌクレオチド。
(1)配列番号:3若しくは4に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(2)配列番号:3若しくは4に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が置換、欠失及び/若しくは挿入された配列を有し、かつコクリア属に属する微生物内において複製可能であるポリヌクレオチド、又は
(3)配列番号:3若しくは4に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコクリア属に属する微生物内において複製可能であるポリヌクレオチドを含む、
(4)大腸菌由来の複製起点ポリヌクレオチド。
配列番号:4に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、大腸菌由来の複製起点ポリヌクレオチド、外来蛋白質発現用のプロモーター配列、マルチクローニングサイト及びカナマイシン耐性遺伝子を含む本発明のシャトルベクターとしては、例えば、図4−1に示すpKITE301を挙げることができる。
本発明は、上記本発明の発現ベクター及びこの発現ベクターに挿入された外来蛋白質をコードするDNAを含む組換えベクターに関する。外来蛋白質には特に制限はなく、例えば、酵素、ホルモン、サイトカインなどを挙げることができる。特に、非水系、例えば、有機溶媒中または有機溶媒と水との混合溶媒系において物質生産を行い得る酵素等であることができる。そのような酵素としては、エステラーゼ、リパーゼ、アミノペプチターゼ、プロテアーゼ、ヒダントイナーゼ、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、アルコールオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、チトクロームP450、モノオキシゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ハロヒドリンエポキシダーゼ、ヒドロキシラーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、アミノトランスフェラーゼ、各種イソメラーゼ、アミノ酸リガーゼなどを挙げることができる。但し、これらに限定される意図ではない。
本発明は、宿主及び該宿主に導入された上記本発明の発現ベクター又は上記本発明の組換えベクターを含む、形質転換体に関する。
本発明は、上記本発明の形質転換体を培養する工程、及び培養により得られる培養物から外来蛋白質を単離する工程を含む、外来蛋白質の製造方法を包含する。
使用ベクターおよび宿主
野生型プラスミド取得にはKocuria palustris IPUFS-1株(石川県立大学より分譲)を用いた。クローニング宿主にはE. coli JM109 およびE. coli EC100D pir-116を用いた。野生型プラスミドの取得にはEZ-Tn5TM <R6Kγori/KAN-2> Insertion Kit (epicentre)を用いた。野生型プラスミドのサブクローニングにはpTA2 (Toyobo)を、qRT-PCRコントロールプラスミド構築にはpGEM-T Easy (Promega)、E. coli-Kocuria シャトルベクター構築<にはpUC118およびpHSG298を用いた。
プラスミド抽出、ゲノムDNA抽出、制限酵素処理、シーケンス解析等、一般的な遺伝子操作は常法に従い行った。シーケンス反応はBigDye Terminator Thermal Cycler Sequencing Kit ver3.1を用いて、メーカーのプロトコルに従い行った。シーケンス解析はキャピラリーDNAシーケンサー3130を用いて行った。
K. palustris およびK. rhizophila DC2201 の培養には主にDC2201培地(1% トリプトン、1% 酵母エキス、0.5% NaCl、0.5% グルコース、0.3% カツオエキスpH 7.0)を用い、30℃で3〜7日間培養した。E. coliの培養にはLB培地を用い、37℃で培養した。それぞれ必要に応じて適宜抗生物質等を添加した。
K. palustris をDC2201寒天培地にストリークし、30℃で4日間培養した。生育したコロニーを一白金耳掻き取り、4 mLのDC2201培地に稙菌し30℃で3日間培養した。前培養液1 mLを100 mLのDC2201液体培地に稙菌し、30℃、200 rpmで3日間培養した。培養した菌体を遠心12,000 rpm、室温、5分間で集菌し、TEバッファーで洗菌した。洗菌後再び遠心により菌体を回収し、プラスミド抽出へ供した。
得られたプラスミド粗抽出液をTEバッファーで20 mLに調整し、20 gの塩化セシウムを添加し溶解した。2 mLの10 mg/mL臭化エチジウム溶液を添加・混和し、必要に応じて塩化セシウムを添加して溶液密度を1.55 g/mLに調整した。超遠心チューブに分注し、65,000 rpm、室温、20時間超遠心を行った。超遠心終了後、UVライト照射下でプラスミドと思われるバンドをシリンジ及び注射針を用いて回収し、新しいチューブに移した。3倍量のTEバッファーを添加して希釈後、等量のイソアミルアルコールを添加し混和した。12,000 rpm、室温、5分間遠心して上層のイソアミルアルコールを取り除き、再び等量のイソアミルアルコールを添加した。この操作を水相中の臭化エチジウムが除かれるまで繰り返した。臭化エチジウム除去後、水相に等量のイソプロパノールを添加し室温で10分間静置した。常法に従いアルコール沈殿、風乾を行い得られたペレットを500μLのTEバッファーに溶解し、精製プラスミドサンプルとした。
精製プラスミドへのトランスポゾン挿入反応は、メーカーのマニュアルに従い行った。
200 ng プラスミドDNA
等モル量 EZ-Tn5 <R6Kγori/KAN-2> transposon
1μL 10x反応バッファー
1μL EZ-Tn5 transposase
滅菌水
Total 10μL
反応液1μLを用いて、50μLのE. coli EC100D pir-116コンピテントセル(epicentre)をエレクトロポレーション法により形質転換した。エレクトロポレーション後、950μLのSOC培地を添加して回復培養を行い、回復培養液100μLを50μg/mL カナマイシン入りLB寒天培地に塗布し37℃で一晩培養した。培養後生育したコロニーを新たなLBカナマイシンプレートにレプリカし、野生型プラスミドの解析に供した。
K. rhizophila DC2201 野生株を4 mL DC2201液体培地に稙菌し、30℃、130 rpmで二日間培養した。培養液100μLを各薬剤1〜500μg/mLを含むDC2201寒天培地上に撒き、30℃で3〜7日間培養した。薬剤にはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ハイグロマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、エリスロマイシン、アプラマイシン、チオストレプトンを検討した。培養後コロニー形成の有無を確認し、コロニーを形成しない薬剤濃度を最少生育阻止濃度(MIC)とした。
K. rhizophila DC2201 で機能する薬剤耐性遺伝子として、チオストレプトン耐性遺伝子(tsr; Accession no. CAA38132)、クロラムフェニコール耐性遺伝子(catSa; AGI91459)、テトラサイクリン耐性遺伝子(tetSl; AAA26830)、ゲンタマイシン耐性遺伝子(aacC1; AAB60000)、およびネオマイシン耐性遺伝子(aph1; AAA26699)を用いた。各遺伝子配列をデータベースより取得し、K. rhizophila DC2201 にコドンを最適化した後に合成した。合成はGenewiz 社に委託した。
得られたプラスミド配列を基にPCRプライマーを設計し、特定領域を順次欠失させたPCR断片を増幅した。ドナーベクターとしてInverse PCRにより増幅したpHSG298増幅断片を制限酵素Bgl II/Nco IないしBgl II/Nde Iで処理し、アガロースゲル電気泳動にて分離精製した。精製したドナーベクターに各プラスミド増幅断片をライゲーションしE. coli JM109へ形質転換した。得られた形質転換体からプラスミド抽出を行い、制限酵素処理によるインサート導入確認およびシーケンスによる配列確認後、K. rhizophila DC2201の形質転換に供した。
解析したプラスミドの複製最小領域を増幅するPCRプライマーを設計し、超遠心精製したプラスミドサンプルをテンプレートとしてinverse PCRを行った。得られたPCR増幅断片を制限酵素Bgl II/Nco Iで処理し、アガロースゲル電気泳動による分離、精製後インサートとした。同様にpHSG298およびpUC118に対してもinverse PCRを行い、増幅断片の制限酵素処理を行った。使用したPCRプライマーは表1-1に記載した。制限酵素処理後、アガロースゲル電気泳動により分離・精製したインサートおよびベクターの断片を用いてライゲーションし、E. coli JM109 へ形質転換した。得られたコロニーをピックアップし、プラスミド抽出・制限酵素処理により断片挿入を確認した。さらに、必要に応じて薬剤耐性遺伝子を導入する場合には、薬剤耐性遺伝子の両末端にBgl IIおよびBamH I制限酵素サイトを付加してPCR増幅を行い、同制限酵素で処理後、構築したプラスミドのBgl IIサイトに導入した。それぞれ構築したプラスミドを用いて、K. rhizophila DC2201の形質転換を行った。
K. rhizophila DC2201は4 mL DC2201培地で2日間前培養した。100 mLのLB液体培地(1.5 % グリシン含有)に1 mLの前培養液を稙菌し、30℃、150 rpmでOD600が0.7になるまで培養した。培養液を10分間氷上で冷却し、1,500×g、4℃、10分間遠心し菌体を回収した。菌体を氷冷した滅菌水30 mLで洗菌後、再び遠心により集菌した。洗菌作業を2回繰り返した後、1 mLの10%グリセロール溶液に菌体を懸濁し、OD600を測定した。測定後、OD600が50になるように菌体懸濁液を希釈し、エッペンチューブに100μLずつ分注して液体窒素で凍結しコンピテントセルとした。
RT-qPCR(Real Time-quantitative PCR)にはニッポンジーン社のGeneAce SYBR(R) qPCR Mix α Low ROX を用い、Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Systemにより行った。
1μL 鋳型DNA
25μM primers
2x GeneAce SYBR qPCR Mix a Low ROX
MilliQ 水
total 25μL
構築したプラスミドベクターを導入したK. rhizophila DC2201菌体を4 mL DC2201液体培地(400μg/mL カナマイシン)で2日間培養した。培養液40μLを抗生物質を含まない4 mL DC2201液体培地に稙菌し、30℃、130 rpmで12時間培養した。培養12時間ごとに植え継ぎを繰り返すと同時に、106倍希釈した培養液100μLをDC2201寒天培地(カナマイシン含有および非含有)に撒き30℃で3日間培養した。カナマイシン含有および非含有培地にそれぞれ生育したコロニーの数を計数し、プラスミド保持率を算出した。
構築したシャトルベクターpKITE102をK. rhizophila DC2201へ導入し、得られた形質転換体を用いてコンピテントセルを調製した。調製したコンピテントセルにpKITE303を導入し、二剤耐性形質転換体を選抜した。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、アガロースゲル電気泳動により2種のプラスミドの共存を確認した。
構築したE. coli-Kocuria シャトルベクターが遺伝子発現に利用できるか調べるため、Leifsonia sp. S749 由来アルコール脱水素酵素(LSADH)をpKITE103およびpKITE303へ導入し、K. rhizophila DC2201 による発現を試みた。構築したpKITE103 およびpKITE303のマルチクローニングサイト内にNde I 認識配列を導入するため、変異導入用プライマー(表1-3)を用いたPCRを行った。K. rhizophila DC2201 ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、グリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)遺伝子のプロモーター配列を増幅し、制限酵素Nco IおよびNde Iで処理後、同制限酵素で切断処理を行った上記ベクターのNco I サイトおよびNde I サイトに導入した。得られたGAPDHプロモーター導入ベクターのNde IサイトおよびHind III サイトを用いて、Leifsonia sp. S749 ゲノムDNAより増幅したLSADH遺伝子をライゲーションしE. coli JM109へ形質転換した。得られたプラスミドをK. rhizophila DC2201へ形質転換し、10μg/mLのチオストレプトンを含む選択培地上で形質転換体を得た。得られた形質転換体を10 mLのDC2201液体培地に稙菌し、30℃で2日間培養した。培養菌体を遠心回収し、50 mM KPB (pH 7.0)で洗菌後、LSADH活性測定へと供した。
集菌したK. rhizophila DC2201 菌体を50 mM KPB (pH 7.0)へ再懸濁し、超音波破砕機により菌体を破砕した。遠心(15,000 rpm, 10分間)により上清を回収し、酵素液としてLSADH活性測定に供した。LSADH活性測定は以下の通りに行った。反応液として50 mM KPB (pH 6.0)、10 mM トリフルオロアセトフェノン、0.2 mM NADHが全量990μLになるように調製し、30℃で3分間予備加温した。10μLの酵素液を予備加温した反応液に添加・懸濁後、分光光度計(島津UV2550)を用いて340 nmの吸光度の減少を測定した。LSADH活性はNADHの分子吸光係数6,220 M-1cm-1を用いて算出した。
K. palustris からのプラスミド精製
石川県立大学より分譲頂いたK. palustris IPUFS-1株をDC2201液体培地で培養し、Wizard SV DNA purification system (Promega)によりプラスミド精製を行った。アガロースゲル電気泳動により複数のバンドが確認できたことから、本菌株が数種類の内在性プラスミドを有することが示唆された。
精製したプラスミドを用いて、EZ-Tn5TM <R6Kγori/KAN-2> Insertion Kit(http://arb-ls.com/products/eztn5_r6kgammaori_kan2_tnp_transposome_kit/)によるトランスポゾン挿入及びE. coli EC100D pir-116 への形質転換を行った。得られた形質転換体をランダムに選抜し、プラスミド抽出および制限酵素処理によるサイズ確認を行った。その結果、複数のクローンにおいて野生型プラスミドへのトランスポゾン挿入の結果と推測されるバンドが確認された。これらのクローンについて、シーケンスによる配列確認を行った。シーケンスプライマーにはキットに付属のトランスポゾン配列に対応するプライマーを用いた。その結果、これらのクローンでプラスミドの一部に相当すると思われる配列が確認された。プライマーウォーキング法によりこれらのクローンの塩基配列を解析した結果、得られたクローンは3種類のプラスミド1〜3に分類されることが明らかになった。
3種のプラスミドの内、プラスミド1[配列番号1]及びプラスミド3[配列番号2]の遺伝子構造を図1に示す。プラスミド1及びプラスミド3はそれぞれ2251, 4443 塩基対からなる環状プラスミドであった。プラスミド2からは、後述するように形質転換体は得られなかった。プラスミド1は、replicase ABから構成される複製遺伝子を有していた。これに対しプラスミド3には、replicaseのような複製遺伝子は見いだされなかった。しかし、塩基配列の相同性検索の結果、プラスミド3の配列の一部でK. rhizophilaのゲノムDNA配列と高度に一致する領域が見出された(図1 plasmid3 黒色BOX領域)。ORF検索プログラムによる検索結果、プラスミド1 にはRepABのみがコードされていた。またこのプラスミドには他の細菌類プラスミドの複製開始起点(ori)と相同な配列がコードされていた(表2-1)。プラスミド3には6つのORFが見出され、そのうちの一つはDNA組換え酵素の一種であるリコンビナーゼと50%程度の相同性を示した。しかし、他のORFについては該当する遺伝子が無いか、もしくは未同定のhypothetical proteinとのみ相同性を示した。各プラスミドに見出されたORFの相同性検索の結果を表2-2に示す。
シャトルベクター構築に当たり、K. rhizophila DC2201で選択マーカーとして使用可能な薬剤を検討した。各薬剤のK. rhizophila DC2201に対する最少生育阻止濃度(MIC)を表3に示す。アンピシリンおよびエリスロマイシンは1μg/mL以下の濃度で生育を阻害することが明らかとなり、使用薬剤としては適さないと考えられた。またアプラマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシンは500μg/mLの濃度においても生育するコロニーが見られたことからこれらも選択マーカーとしては適さないと考えられる。最終的にカナマイシン、テトラサイクリン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、チオストレプトンを選択マーカーとして検討することとした。
各プラスミドの複製最小領域を特定するため、各プラスミドをそれぞれPCRにより増幅し各領域を欠失した増幅断片を得た。これらの増幅断片をpHSG298にクローニングしK. rhizophila DC2201への形質転換を行った結果、プラスミド1およびプラスミド3をクローニングしたクローンでのみ形質転換体が得られた。しかし、プラスミド2由来の形質転換体は得られなかった。またプラスミド1の複製最小領域はレプリカーゼA,Bおよびその上流に位置する複製起点(ori)を含む領域であることが明らかとなった(図3)。一方、プラスミド3の複製最小領域は、K. rhizophila DC2201 ゲノム配列と高度に相同性を有する領域であることが分かり、リコンビナーゼ(XerD)と推測される領域は複製には必須ではないことが明らかとなった(図4)。プラスミド1の複製最小領域の塩基配列は[配列番号3]に示す。プラスミド3の複製最小領域の塩基配列は、[配列番号4]に示す。
pKITE101またはpKITE301を導入した K. rhizophila DC2201よりDNAを抽出し、解糖系遺伝子(TPI、PGK、ENO)およびカナマイシン耐性遺伝子(kan)に対するRT-qPCRを行った。絶対定量法により各増幅断片を定量しプラスミドコピー数を算出した結果、一細胞あたりpKITE101は約50〜90コピー、pKITE301は約10〜30コピーであることが明らかとなった。
構築したシャトルベクターのK. rhizophila DC2201細胞内における安定性・保持率を調べるために、薬剤を含まない培地で継代培養を行い、一定の継代回数ごとに薬剤含有プレート上に撒きコロニー形成率を算出した(図6)。pKITE101については100回継代培養を行った後でもコロニー形成率は99%を超えていた。このことからpKITE101は薬剤を含まない培地中においても安定に複製、保持されることが明らかとなった。一方でpKITE301については継代10回目においてコロニー形成率が約3%以下にまで低下し、選択圧がない条件下ではプラスミドが安定に保持されないことが推測される。両プラスミドはそのコピー数がそれぞれ異なり、pKITE101は50〜90コピー、pKITE301は10〜30コピーとpKITE101の方がコピー数が多いことが明らかとなっている。これらのプラスミドは細胞分裂の際に自然拡散的にそれぞれの娘細胞に受け継がれると考えられることから、コピー数の違いがプラスミドの安定保持率に大きく寄与していることが推測される。
pKITE101のK. rhizophila DC2201に対する形質転換効率は 5〜10×102 cfu(コロニー生成単位)/μgDNA、pKITE301では 2〜5×106 cfu/μgDNAであった。
構築したE. coli-Kocuria シャトルベクターがK. rhizophila DC2201内で共存できるか調べるため、pKITE102およびpKITE303を同時に導入した形質転換体を作成した。得られた形質転換体はネオマイシンおよびチオストレプトンの両薬剤に対して耐性を示した。またこれらの形質転換体を培養しプラスミドを抽出したところ、それぞれのプラスミドに由来すると考えられるバンドが確認できた(図7)。
構築したE. coli-Kocuria シャトルベクターの実用性を確認するため、Leifsonia sp. S749 由来アルコール脱水素酵素LSADHの導入、発現を試みた。pHSG298が有するlacZプロモーターはK. rhizophila DC2201内で機能しない可能性が推測されたため、K. rhizophila DC2201由来のプロモーターの使用を検討した。解糖系酵素GAPDHは比較的高発現であることが知られていることから、本遺伝子プロモーターの使用を検討した。K. rhizophila DC2201ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、GAPDH開始コドン上流の約300塩基対の配列を増幅した。同時に、pKITE103およびpKITE303のマルチクローニングサイトのEcoR I サイト直上にNde I サイトを導入するため、変異導入プライマーを用いたPCRを両ベクターに対して行った。得られたNde I サイト導入ベクターpKITE103nde [配列12]およびpKITE303nde [配列13]を制限酵素Nco I, Nde I で切断処理後、増幅したGAPDHプロモーター断片[配列14を挿入しpKITE103PgapおよびpKITE303Pgap を得た。これらのベクターを制限酵素Nde I、Hind III により切断し、PCR増幅したLSADH遺伝子を導入し最終的にpKITE103PgapLSADHおよびpKITE303PgapLSADHを得た[図5、配列15、16]。これらのプラスミドをK. rhizophila DC2201へ形質転換し、チオストレプトン耐性を示す形質転換体を選抜した。
配列番号2:プラスミド3の塩基配列
配列番号3:プラスミド1の複製最小領域の塩基配列
配列番号4:プラスミド3の複製最小領域の塩基配列
配列番号5:pKITE101塩基配列
配列番号6:pKITE102塩基配列
配列番号7:pKITE103塩基配列
配列番号8:pKITE301塩基配列
配列番号9:pKITE302塩基配列
配列番号10:pKITE303塩基配列
配列番号11:pKITE103nde塩基配列
配列番号12:pKITE303nde塩基配列
配列番号13:GAPDHプロモーター断片
配列番号14:pKITE103PgapLSADH
配列番号15:pKITE303PgapLSADH
配列番号16〜21:複製起点付近配列。pColE2-P9; Shigella sp. (Accession no. D30054), pB264; Rhodococcus sp. B264 (AY297818), pNC903; Rhodococcus ruber (NG_036129), pRGI00846; Uncultured bacterium plasmid (HG796382), pCASE1; Corynebacterium casei (CP004351).
配列番号22:改変pBR322ori(pUCori)塩基配列
配列番号23〜24:Tn5 プライマー
配列番号25〜42:プラスミド1 シーケンス用プライマー
配列番号43〜56:プラスミド3 シーケンス用プライマー
配列番号57〜62:シャトルベクター構築用プライマー
配列番号63〜74:RT-qPCR 用プライマー
配列番号75〜80:プロモーター、LSADH遺伝子導入用プライマー
Claims (17)
- 下記(1)〜(3)のいずれかのポリヌクレオチドを含む、コクリア属に属する微生物において複製可能なベクター:
(1)配列番号:3若しくは4に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(2)配列番号:3に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が置換、欠失及び/若しくは挿入された配列を有し、コクリア属に属する微生物内において複製可能であり、かつコクリア属に属する微生物内において存在可能なコピー数が50〜90の範囲であるポリヌクレオチド、
(3)配列番号:4に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が置換、欠失及び/若しくは挿入された配列を有し、コクリア属に属する微生物内において複製可能であり、かつコクリア属に属する微生物内において存在可能なコピー数が10〜30の範囲であるポリヌクレオチド。 - 下記(1)〜(3)のいずれかのポリヌクレオチド及び下記(4)のポリヌクレオチドを含み、コクリア属に属する微生物及び大腸菌において複製可能なシャトルベクター。
(1)配列番号:3若しくは4に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(2)配列番号:3に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が置換、欠失及び/若しくは挿入された配列を有し、コクリア属に属する微生物内において複製可能であり、かつコクリア属に属する微生物内において存在可能なコピー数が50〜90の範囲であるポリヌクレオチド、
(3)配列番号:4に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が置換、欠失及び/若しくは挿入された配列を有し、コクリア属に属する微生物内において複製可能であり、かつコクリア属に属する微生物内において存在可能なコピー数が10〜30の範囲であるポリヌクレオチド、
(4)大腸菌由来の複製起点ポリヌクレオチド。 - マルチクローニングサイト、プロモーター配列及び薬剤耐性遺伝子から成る群から選ばれる少なくとも1種の配列をさらに含む請求項2に記載のベクター。
- 前記マルチクローニングサイトに大腸菌及びコクリア属の何れにも属さない微生物由来の蛋白質(以下、外来蛋白質)をコードするポリヌクレオチドを挿入して、前記外来蛋白質を大腸菌及びコクリア属に属する微生物において発現させるために用いる、請求項3に記載のシャトルベクター。
- 前記薬剤耐性がカナマイシン耐性、ネオマイシン耐性、又はチオストレプトン耐性である請求項3又は4に記載のベクター。
- 配列番号:5〜12のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる請求項2〜5のいずれか1項に記載のシャトルベクター。
- 前記コクリア属に属する微生物が、コクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)、コクリア バリアンス(Kocuria varians)、コクリア フラバ(Kocuria flava)、又はコクリア ツルファネンシス(Kocuria turfanensis)に属する微生物である、請求項1〜6のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記コクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)に属する微生物が、コクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)DC2201株(NBRC103217)、コクリア バリアンス(Kocuria varians)に属する微生物が、コクリア バリアンス(Kocuria varians)(NBRC15358)、コクリア フラバ(Kocuria flava)に属する微生物が、コクリア フラバ(Kocuria flava)(NBRC107626)、コクリア ツルファネンシス(Kocuria turfanensis)に属する微生物が、コクリア ツルファネンシス(Kocuria turfanensis)(NBRC107627)である、請求項7に記載のベクター。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のベクター及び該ベクターに挿入された外来蛋白質をコードするDNAを含む組換えベクター。
- 前記外来蛋白質が、大腸菌及びコクリア属の何れにも属さない微生物由来の蛋白質である請求項9に記載の組換えベクター。
- 配列番号:14又は15に記載の塩基配列からなる組換えベクターである、請求項10に記載の組換えベクター。
- 宿主及び該宿主に導入された請求項1〜8のいずれか1項に記載のベクター又は請求項9〜11のいずれか1項に記載の組換えベクターを含む、形質転換体。
- 宿主が、大腸菌又はコクリア属に属する微生物である請求項12に記載の形質転換体。
- 前記コクリア属に属する微生物が、コクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)、コクリア バリアンス(Kocuria varians)、コクリア フラバ(Kocuria flava)、又はコクリア ツルファネンシス(Kocuria turfanensis)に属する微生物である、請求項13に記載の形質転換体。
- 前記コクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)に属する微生物がコクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)DC2201株(NBRC103217)、コクリア バリアンス(Kocuria varians)(NBRC15358)、コクリア フラバ(Kocuria flava)(NBRC107626)、又はコクリア ツルファネンシス(Kocuria turfanensis)(NBRC107627)である、請求項14に記載の形質転換体。
- 請求項12〜15のいずれか1項に記載の形質転換体を培養する工程、及び培養により得られる培養物から外来蛋白質を単離する工程を含む、外来蛋白質の製造方法。
- 請求項13〜15のいずれか1項に記載の形質転換体を、有機溶媒を含有する培地を用いて培養する工程、及び培養により得られる培養物から外来蛋白質を単離する工程を含む、外来蛋白質の製造方法。
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