JP2018011519A - ストレプトマイセス属微生物用ベクター - Google Patents
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Landscapes
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
このTat分泌経路はストレプトマイセス属でも機能解析が行われているが、発現のコントロールが厳密にできないなど、その有用性は極めて限られる。
一方で、本発明者らが開発したベクターpHSA81は異種発現の実験ツールとして有用であるが、異種タンパク質は細胞内でのみでしか発現せず、さらに、pHSA81はストレプトマイセス属放線菌でしか複製できず、プラスミドの構築に時間がかかるとの課題があった。
また、本発明は、ベクターpHSA81をエシェリキア属微生物とストレプトマイセス属微生物の両方で複製可能な構成型発現シャトルベクターへと改変することを目的の一つとしている。
更にいえば、ストレプトマイセス属細菌で機能するTat分泌経路を用いることで、目的タンパク質の大量分泌生産を実現するができ、且つ、エシェリキア属微生物とストレプトマイセス属微生物の両方で複製可能な、構成型分泌発現シャトルベクターを提供することを目的の一つとしている。
(a)ストレプトマイセス属微生物を宿主として培養時に誘導剤を添加せずに目的タンパク質を発現可能なDNA領域
(b)ストレプトマイセス属微生物を宿主として培養時に目的タンパク質を分泌発現可能なDNA領域
(c)ストレプトマイセス属微生物を宿主として複製可能なDNA領域
を含む構成型分泌発現ベクターである。
(d)ストレプトマイセス属微生物を宿主として培養時に誘導剤を添加せずに目的タンパク質を発現可能なDNA領域
(e)ストレプトマイセス属微生物を宿主として複製可能なDNA領域
(f)エシェリキア属微生物を宿主として複製可能なDNA領域
を含む、構成型発現シャトルベクターである。
(g)ストレプトマイセス属微生物を宿主として培養時に誘導剤を添加せずに目的タンパク質を発現可能なDNA領域
(h)ストレプトマイセス属微生物を宿主として培養時に目的タンパク質を分泌発現可能なDNA領域
(i)ストレプトマイセス属微生物を宿主として複製可能なDNA領域
(j)エシェリキア属微生物を宿主として複製可能なDNA領域
を含む、構成型分泌発現シャトルベクターである。
前記増幅したDNA断片を、制限酵素処理した構成型分泌発現ベクターに連結する工程、
前記DNA断片が導入されたベクターでストレプトマイセス属微生物に形質転換する工程、及び
前記大腸菌を培養し、得られた培養上清から目的タンパク質を採取する工程、
を含む、目的タンパク質の製造方法が提供できる。
前記増幅したDNA断片を、制限酵素処理した構成型発現シャトルベクターに連結する工程、
前記DNA断片が導入されたベクターでストレプトマイセス属微生物に形質転換する工程、及び
前記大腸菌を培養し、得られた培養上清から目的タンパク質を採取する工程、
を含む、目的タンパク質の製造方法が提供できる。
前記増幅したDNA断片を、制限酵素処理した構成型分泌発現シャトルベクターに連結する工程、
前記DNA断片が導入されたベクターでストレプトマイセス属微生物に形質転換する工程、及び
前記大腸菌を培養し、得られた培養上清から目的タンパク質を採取する工程、
を含む、目的タンパク質の製造方法が提供できる。
また、本発明によれば、その構築を培養時間の短い、エシェリキア属微生物で行うことができ、且つ、ストレプトマイセス属微生物を宿主として目的タンパク質を発現させることができる。
本発明に係る構成型分泌発現ベクターは、ストレプトマイセス(Streptomyces)属に属する微生物(以下、「ストレプトマイセス属微生物」ともいう)を宿主として培養時に誘導剤を添加せずに目的タンパク質を発現可能なDNA領域と、ストレプトマイセス属微生物を宿主として培養時に目的タンパク質を分泌発現可能なDNA領域と、ストレプトマイセス属微生物を宿主として複製可能なDNA領域と、を含む。すなわち、本発明に係る構成型分泌発現ベクターは、ストレプトマイセス属微生物内において複製可能であり、且つ、目的タンパク質をストレプトマイセス属微生物外へ分泌発現させるのに有効なベクターである。
本発明の構成型分泌発現ベクターは、ストレプトマイセス属微生物を宿主として培養時に誘導剤を添加せずに目的タンパク質を発現可能なDNA領域を含み、宿主となるストレプトマイセス属微生物に導入することで、発現誘導剤を添加しなくても、目的タンパク質を極めて高効率で生産することができる。
より具体的には、(i)ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)のH-ニトリルヒドラターゼ(H-NHase)遺伝子のプロモーター、(ii)H-ニトリルヒドラターゼ転写調節タンパク質(以下「制御タンパク質」とも言う)(NhhC)をコードする遺伝子、(iii) 転写活性化タンパク質(NhhD)をコードする遺伝子、(iv)マルチクローニングサイト(MCS)、及び(v)ターミネーターを含み、H-NHase発現調節機構を利用するものである。前記発現調節機構を担う遺伝子の塩基配列に関しては、本発明者らが開示の特開2007−053994号公報に記載されている。
本発明において、H-NHase遺伝子のプロモーターは、H-NHase遺伝子を保有する菌体から制限酵素を用いて切り出すことができる。あるいは、適当な制限酵素認識部位を設けたプライマーを設計し、H-NHaseの構造遺伝子の上流領域中の所望のプロモーター領域を鋳型としてPCRにより増幅することにより、得ることができる。また、既に判明しているH-NHase遺伝子プロモーター領域を含む領域の塩基配列情報(例えばGenBankのAccession number:D67027)に基づいて、所望のプロモーター領域を化学合成して用いることも可能である。本発明のベクターに用いるH-NHase遺伝子のプロモーターの配列及び構成に関しては、特開2007−053994号公報に記載されている。
本発明における制御タンパク質(NhhC)をコードする遺伝子は、nhhC遺伝子を保有する菌体から、制限酵素を用いて切り出すことができる。あるいは、制限酵素認識部位を設けたプライマーを用い、PCRで所望のnhhC遺伝子領域を増幅することにより得ることができる。また、既に判明しているnhhC遺伝子の塩基配列情報をもとにして、所望のnhhC遺伝子を化学合成することも可能である。この制御タンパク質(NhhC)をコードする遺伝子の配列及び構成に関しては、特開2007−053994号公報に記載されている。
本発明における転写活性化タンパク質(NhhD)をコードする遺伝子は、NhhD遺伝子を保有する菌体から、制限酵素を用いて切り出すことができる。あるいは、制限酵素認識部位を設けたプライマーを用い、PCRで所望のNhhD遺伝子領域を増幅することにより得ることができる。また、既に判明しているNhhD遺伝子の塩基配列情報をもとにして、所望のNhhD遺伝子を化学合成することも可能である。この転写活性化タンパク質(NhhD)をコードする遺伝子の配列及び構成に関しては、特開2007−053994号公報に記載されている。
本発明におけるMCSとしては特に限定されないものの、例えば、NdeI、BamHI、HindIII、NheI、SpeI、XbaIの六つの制限酵素サイトを全て含むものが好ましい。本発明におけるMCSの配列に関しては、特開2007−053994号公報に記載されている。
本発明のベクターはターミネーター領域を必須とし、当該ターミネーター領域は、上記(iv)のMCSの下流に存在させたものであることが好ましい。
このように存在させることにより、H-NHase遺伝子プロモーターからの強力な転写活性が、MCS下流域の他の領域(例えば複製領域など)へ悪影響を及ぼすことを阻止し、ベクターの安定化を図ることができる。この安定化効果は、本発明でいう遺伝子高発現系の発現効率の向上に大きく寄与しているものと考えられる。
本発明に係る構成型分泌発現ベクターは、ストレプトマイセス属微生物を宿主として培養時に目的タンパク質を分泌発現可能なDNA領域を含み、培養時、目的タンパク質をストレプトマイセス属微生物外へ分泌発現させることができる。ここで、タンパク質の分泌発現を実現するため、本発明のベクターは、所定のシグナルペプチドを含む。
本発明に係る構成型分泌発現ベクターは、前記シグナルペプチドを、ベクターpHSA81(特許文献1)のMCSの上流に導入することにより構築される。本発明に係る構成型分泌発現ベクターの一つである、pHSA81-ss1053の構成例を図1に示す。
更に、各GENEART反応溶液を用いてPEG法によりStreptomyces lividans TK24を形質転換し、コロニーを得る。そして、得られたコロニーをピックし、YEME/tsr 固体培地へ植継ぐ。植継いだYEME/tsr 固体培地上で十分に生育させた菌体を10 ml YEME/tsr液体培地に植菌し、28℃、130rpmで4日間振とう培養を行う。培養溶液から菌体を遠心により回収し、構成型分泌発現ベクターたるプラスミドを抽出する。
この抽出されたプラスミドについて、DNAシークエンス解析を行い、Nde I認識部位を残しながらその上流に目的断片が導入されていること、及び変異が入っていないことを確認する。これにより、構成型分泌発現ベクターが構築されていることが確認できる。
本発明の形質転換体は、宿主を本発明の構成型分泌発現ベクターまたは構成型分泌発現ベクターに目的タンパク質遺伝子を導入したプラスミドで形質転換することで作製できる。形質転換を行うには、常法を用いればよく、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法を用いることができる。本発明において用いる宿主は、ストレプトマイセス属微生物である。
本発明は、目的タンパク質の製造方法も提供することができる。すなわち、上記(5)の形質転換体を培養し、得られる培養物から目的タンパク質を採取することにより、目的タンパク質を製造することができる。形質転換体の培養方法は、宿主に用いるストレプトマイセス属微生物に適した方法を適宜選択すればよい。
本発明に係る構成型発現シャトルベクターは、ストレプトマイセス属微生物を宿主として培養時に誘導剤を添加せずに目的タンパク質を発現可能なDNA領域と、ストレプトマイセス属微生物を宿主として複製可能なDNA領域と、エシェリキア(Escherichia)属に属する微生物(以下、「エシェリキア属微生物」ともいう)を宿主として複製可能なDNA領域と、を含む。すなわち、本発明に係る構成型発現シャトルベクターは、ストレプトマイセス属微生物内及びエシェリキア属微生物内のいずれにおいても複製可能な構成型発現シャトルベクタープラスミドである。各DNA領域について、以下に説明する。ここで、ストレプトマイセス属微生物を宿主として培養時に誘導剤を添加せずに目的タンパク質を発現可能なDNA領域、及びストレプトマイセス属微生物を宿主として複製可能なDNA領域に関しては、前述の本発明に係る構成型分泌発現ベクターが備えているものと同一であるため、ここでは説明を省略する。
本発明のベクターは、エシェリキア属微生物内において複製可能なDNA領域を含むため、エシェリキア属に属する微生物内で複製することができる。プラスミドがエシェリキア属微生物内において複製可能であるためには、エシェリキア属微生物のプラスミド由来の複製領域(ColEI)を含有すればよい。エシェリキア属微生物内において複製可能なDNA領域としては、pBluescriptII SK(-)(アジレント・テクノロジー株式会社)、pHSG398、pHSG298(Takara Bio Inc.)などのプラスミドを用いることが可能であり、複製領域を有する限り、プラスミド全体であってもよく、あるいは一部分であってもよい。
本発明に係る構成型発現シャトルベクターの構築方法の一例を説明する。
先ず、大腸菌のプラスミド複製開始起点及びエシェリキア属微生物用抗生物質耐性遺伝子を含むDNA断片を、発現ベクターpBluescriptIIを鋳型にして、PCRにより増幅する。
次に、GENEARTを用いた組み換え反応により、制限酵素(例えばBlpI)で処理したベクターpHSA81に対して、増幅したDNA断片を連結する。更に、各GENEART反応溶液を用いて大腸菌TOP10及び大腸菌stbl2をヒートショック法によりそれぞれ形質転換し、コロニーを得る。
得られたコロニーをピックし、各薬剤を含んだ2YT固体培地へ植継ぐ。さらに、各薬剤を含んだ2YT固体培地上に生育させた各菌体を5 ml各薬剤を含んだ2YT液体培地に植菌し、37 ℃、150 rpmで培地が十分な濁度になるまで(12時間程度)培養を行う。培養後の菌体からプラスミドを抽出し、構成型発現シャトルベクターを得る。
このようにして構築された構成型発現シャトルベクターにおいて、シャトル化を確認すべく、プラスミドの安定性を試験する必要がる。本発明に係る構成型発現シャトルベクターにおける安定性試験は、例えば以下のように行うことができる。
前液体培養液から新しい5 ml各薬剤を含んだ2YT液体培地へと1%植菌を行い、再び12時間の培養を行う。これを再び植え継ぎ、3回目の継代培養の後に集菌を行い、プラスミドを抽出する。
一方、各プラスミドを用いてPEG法によりS. lividans TK24を形質転換し、コロニーを得る。
YEME/tsr 固体培地上で十分に生育させた各菌体を10 ml YEME/tsr液体培地に2mm四方分植菌し、28 ℃、130 rpmで4日間振とう培養を行う。次に、新たな10 ml YEME/tsr 液体培地培養溶液に培養溶液を1 %植菌で継代し、計3回の継代培養を行った菌体からプラスミドを抽出する。
大腸菌で3回継代培養後、そして放線菌で3回継代培養後の各プラスミドをそれぞれ制限酵素(例えば、BlpI)で処理し、アガロースゲル電気泳動に供する。そして、DNA断片のバンドのパターンから、プラスミドの安定性を検討する。
本発明の形質転換体は、宿主を本発明の構成型発現シャトルベクターまたは構成型発現シャトルベクターに目的タンパク質遺伝子を導入したプラスミドで形質転換することで作製できる。形質転換を行うには、常法を用いればよく、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法を用いることができる。本発明において用いる宿主は、ストレプトマイセス属微生物、エシェリキア属微生物である。目的タンパク質を分泌発現させるために用いる宿主は、好ましくはストレプトマイセス属微生物である。ベクタープラスミドの増殖、回収に用いる宿主は、ストレプトマイセス属微生物またはエシェリキア属微生物を用いることができるが、好ましくはエシェリキア属微生物である。
本発明は、目的タンパク質の製造方法も提供することができる。すなわち、上記(4)の形質転換体を培養し、得られる培養物から目的タンパク質を採取することにより、目的タンパク質を製造することができる。形質転換体の培養方法は、宿主に用いるストレプトマイセス属微生物に適した方法を適宜選択すればよい。
本発明に係る構成型分泌発現シャトルベクターは、ストレプトマイセス属微生物を宿主として培養時に誘導剤を添加せずに目的タンパク質を発現可能なDNA領域、ストレプトマイセス属微生物を宿主として培養時に目的タンパク質を分泌発現可能なDNA領域、ストレプトマイセス属微生物を宿主として複製可能なDNA領域、エシェリキア属微生物を宿主として複製可能なDNA領域を含む。すなわち、本発明に係る構成型分泌発現シャトルベクターは、ストレプトマイセス属微生物内及びエシェリキア属微生物内のいずれにおいても複製可能なシャトルベクタープラスミドであり、目的タンパク質をストレプトマイセス属微生物内で分泌発現させるのに有効なベクターである。
本発明の構成型分泌発現シャトルベクターの構築方法としては先ず、前述と同様の方法により、前記シグナルペプチドを、ベクターpHSA81のMCSの上流に導入することにより、本発明に係る構成型分泌発現ベクターを構築する。
その後、本発明に係る構成型発現シャトルベクターの構築方法と同様の方法により、構築された構成型分泌発現ベクターをシャトル化する。
構成型分泌発現ベクターの構築方法及びシャトル化の方法は、前述の方法と同一であるため、ここではその説明を省略する。
更に、本発明に係る構成型分泌発現シャトルベクターに関しても、シャトル化を確認すべく、プラスミドの安定性を試験する必要がある。当該安定性試験は、本発明に係る構成型発現シャトルベクターにおける安定性試験と同様の方法により行われる。このため、ここでは本試験の方法説明は省略する。
本発明の形質転換体は、宿主を本発明の構成型分泌発現シャトルベクターまたは構成型分泌発現シャトルベクターに目的タンパク質遺伝子を導入したプラスミドで形質転換することで作製できる。形質転換を行うには、常法を用いればよく、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法を用いることができる。本発明において用いる宿主は、ストレプトマイセス属微生物、エシェリキア属微生物である。目的タンパク質を発現させるために用いる宿主は、好ましくはストレプトマイセス属微生物である。ベクタープラスミドの増殖、回収に用いる宿主は、ストレプトマイセス属微生物またはエシェリキア属微生物を用いることができるが、好ましくはエシェリキア属微生物である。
本発明は、目的タンパク質の製造方法も提供することができる。すなわち、上記(3)の形質転換体を培養し、得られる培養物から目的タンパク質を採取することにより、目的タンパク質を製造することができる。形質転換体の培養方法は、宿主に用いるストレプトマイセス属微生物に適した方法を適宜選択すればよい。
(1)シグナルペプチドスクリーニング用レポータープラスミドの構築
タンパク質を分泌発現させるためには、シグナルペプチドというN末端領域が必要となる。このため、まず、より強い分泌能を持つシグナルペプチドのスクリーニングを行った。
スクリーニングのレポータータンパク質としては、Streptomyces griseus由来の分泌酵素である、ロイシンアミノペプチダーゼ(sgLAP)を選択した。本酵素は同属放線菌由来であり、かつSec経路で分泌される分泌酵素であることがわかっていること、及び発色基質を用いることで酵素活性測定が容易に行うことができることから、S. lividans TK24株での異種分泌発現が容易であると考えられる。
鋳型としてS. griseus のゲノムを用いてPCR反応を行い、sgLAP遺伝子及びmsgLAP遺伝子断片を増幅した。PCR反応後の溶液の一部をそれぞれアガロースゲル電気泳動に供し、msgLAP及びsgLAP遺伝子断片の増幅を確認した。
GATGAAAGGAATGAGCATatgagaccgaaccgcttctccctgc
GATGAAAGGAATGAGCATATGgccggcgccgcggcc
CCGCTTTTGCGGGGATCTAGAtcaggtgggcggttcgccgg
前記方法で構築されたpHSA81-sgLAP及びpHSA81-msgLAP、更にコントロールとしてのpHSA81をそれぞれ保持するS. lividans TK24株を、YEME/tsr固体培地で28℃、5日間培養した。更に、菌体を10 mlYEME/tsr液体培地に2mm四方植菌し、28℃、130 rpmで7日間振とう培養を行った。そして、培養液1mlを遠心により集菌し、培養上清を回収した。沈殿した菌体を1ml 10mM KPB(pH7.5)で懸濁後、ハンディソニケーターによって破砕した。破砕液を遠心した上清を無細胞抽出液(CFE)とし、沈殿物を1 ml 10 mM KPB(pH 7.5)に懸濁したものを不溶性画分溶液とした。
そして、培養上清20 μl、CFE 8 μlをそれぞれSDS-PAGEに供し、発現の有無を検討した。結果を図2に示す。
一方で、pHSA81-msgLAP / S. lividansTK24は培養上清にmsgLAPのバンドはわずかにしか確認できず、CFEにmsgLAPのバンドが確認できた。これは、msgLAPがシグナルペプチドを持たない成熟型の状態で細胞内に発現し、細胞外へ分泌されないことが示唆された。
このように、シグナルペプチドを除去したmsgLAPが細胞外へ分泌されず細胞内に蓄積されたことから、msgLAPがレポータータンパク質として使用可能と考えられた。
前記方法により構築されたシグナルペプチドスクリーニング用レポータープラスミドを用いて、シグナルペプチドのスクリーニングを行った。スクリーニング源としては、ストレプトマイセス属微生物であって全ゲノム配列が決定され、全分泌タンパク質の予測が可能であることから、S. avermitilis K139を用いた。そして、S. avermitilis K139からの全分泌タンパク質の中から、Tat分泌経路に依存すると予測されるものを選定し、更にシグナルペプチド予測サーバーSignalP4.0によって算出されたD値に基づいて、21個のシグナルペプチドを選抜した(表1参照)
具体的には、各菌体を、YEME/tsr 固体培地上で十分に生育させ、10 ml YEME/tsr液体培地に2 mm四方分植菌し、28℃、130 rpmで7日間振とう培養を行った。培養液1 mlに1 mlの10 mM KPB(pH 7.5)を加えた後、遠心により菌を沈殿させ、培養上清を回収した。1種類の形質転換体につき、それぞれ培養を行った。そして、培養液を遠心することで、培養上清を調製し、LAP活性の測定を行った。その結果を図3に示す。
この結果から、分泌させたい目的タンパク質とシグナルペプチド間に相性が存在する可能性が考えられた。
図4に示された結果により、分泌させたい目的タンパク質とシグナルペプチド間に相性が存在する可能性が考えられたことから、比活性が比較的高かった8個のシグナルペプチドを、分泌型発現ベクターに使用するシグナルペプチドとして用いて、構成型分泌発現ベクターの構築を行った。
先ず、鋳型としてS. avermitilis K139株のゲノムを用いてPCR反応を行い、8個のシグナル配列断片をそれぞれ増幅した。
各GENEART反応溶液を用いてPEG法によりS. lividans TK24を形質転換し、コロニーを得た。得られたコロニーをピックし、YEME/tsr固体培地へ植継いだ。植継いだYEME/tsr固体培地上で十分に生育させた菌体を10 ml YEME/tsr液体培地に植菌し、28℃、130 rpmで4日間振とう培養を行った。培養溶液から菌体を遠心により回収し、プラスミドを抽出した。これらについてDNAシークエンス解析を行い、Nde I認識部位を残しながらその上流に目的断片が導入されていること、及び変異が入っていないことを確認し、8個の構成型分泌発現ベクター(pHSA81-ss1053、pHSA81-ss1857、pHSA81-ss3789、pHSA81-ss5891、pHSA81-ss6579、pHSA81-ss7089、pHSA81-ss7207、pHSA81-ss7442)を構築した。
そして、転写・翻訳されると、シグナルペプチドと目的タンパク質の融合タンパク質が発現する。このシグナルペプチドが分泌経路に認識され、目的タンパク質は細胞外に分泌される。シグナルペプチドは分泌の際にプロセシングされ、分泌された目的タンパク質のN末端にはシグナルペプチドのCleavage Siteから1残基C末端側にあるアラニンに加え、Nde I認識部位ATGCAT由来のヒスチジンとメチオニンの計3残基分がN末端に残ると予想される。
構築した8個の構成型分泌発現ベクターのうち、ベクターpHSA81-ss1053を用いて機能解析を行った。
具体的には、pulA (Pullulanase)の発現、PP3812 (Esterase)の発現、chiH (Chitinase)の発現、pla2 (Phospholipase A2)の発現、apkA (Amylase)の発現を確認した。各酵素の発現を確認する方法は以下の通りである。
Klebsiella aerogenes W70のゲノムDNAを由来として、プライマー81ss1053(/Nde)-mpulA_F(下記配列番号62)およびpHSA81(/Xba)-pulA_R(下記配列番号63)を用いてPCRを行った。
更に、増幅したDNA断片を、制限酵素NdeI及びXbaI(Takara Bio Inc.)で切断したベクターpHSA81-ss1053に連結し、放線菌S. lividans TK24を宿主としてpHSA81-ss1053-pulAを構築した。尚、コントロールとして、ベクターpHSA81-ss1053を用いて、S. lividans TK24を形質転換した。
TCGGCCGAGGCCGCGCATATGtgtgataacagctcttcctcttctacctctgg
CCGCTTTTGCGGGGATCTAGAttatttactgctcaccggcaggccag
酵素活性測定方法としては、基質としてPullulanを用いて40℃、5 minの反応を行い、Pullulanaseによって分解され生じた還元糖量を、Somogyi-Nelson法を用いて定量した結果、pHSA81-ss1053-pulA/S. lividans TK24の比活性は1.36 units/mg、pHSA81-ss1053/S. lividans TK24の比活性は0.0351 units/mgであった。
Pseudomonas putida KT2440のゲノムDNAを由来として、プライマー81ss1053(/Nde)-mPP3812_F(下記配列番号64)およびpHSA81(/Xba)-PP3812_R(下記配列番号65)を用いてPCRを行った。
更に、増幅したDNA断片を、制限酵素NdeI及びXbaI(Takara Bio Inc.)で切断したpHSA81-ss1053に連結し、放線菌S. lividans TK24を宿主としてpHSA81-ss1053-PP3812を構築した。コントロールとして、pHSA81-ss1053を用いて、S. lividans TK24を形質転換した。
各形質転換体を10 ml YEME/Tsr培地を用いて28℃で4日間前培養した後、湿菌体重量2 mg分の培養液を植継ぎ7日間本培養し、遠心により培養上清を調製し、酵素活性を測定した。酵素活性測定方法は、基質としてp-Nitrophenyl acetateを用いて30℃で反応を行い、2 secごとの405 nmでの吸光を60 secまで測定し、生成したp-Nitrophenolをp-Nitrophenolのモル吸光係数から定量した。
その結果、pHSA81-ss1053-PP3812/S. lividans TK24の比活性は0.489 units/mg、pHSA81-ss1053/S. lividans TK24の比活性は0 units/mgであった。
TCGGCCGAGGCCGCGCATATGgcaggcagccctggtgtcgaac
CCGCTTTTGCGGGGATCTAGAtcactgcagatgcactttaagttcgttgcc
Streptomyces coelicolor A3(2) のゲノムDNAを由来として、プライマー81ss1053(/Nde)-mchiH_F(下記配列番号66)およびpHSA81(/Xba)-chiH_R(下記配列番号67)を用いてPCRを行った。
更に、増幅したDNA断片を、制限酵素NdeI及びXbaI(Takara Bio Inc.)で切断したpHSA81-ss1053に連結し、放線菌S. lividans TK24を宿主としてpHSA81-ss1053-chiHを構築した。コントロールとして、pHSA81-ss1053を用いて、S. lividans TK24を形質転換した。
各形質転換体を10 ml YEME/Tsr培地を用いて28℃で4日間前培養したのち、湿菌体重量2 mg分の培養液を植継ぎ7日間本培養し、遠心により培養上清を調製し、酵素活性を測定した。
酵素活性測定方法は、基質として4-Methylumbelliferyl-(GlcNAc)3を用いて37℃、10 minの反応を行い、生成した4-Methylumbelliferoneの蛍光を測定し(励起:360 nm、計測:450 nm)定量した。
その結果、pHSA81-ss1053-chiH/S. lividans TK24の比活性は4.24 units/mg、pHSA81-ss1053/S. lividans TK24の比活性は0.181 units/mgであった。
TCGGCCGAGGCCGCGCATATGgcgaccccgctgccgga
CCGCTTTTGCGGGGATCTAGAtcagcaggcgccgaggtcct
また、各形質転換体を用いてプレートアッセイを行った。プレートアッセイに用いた培地組成は、Colloidal chitin単一炭素源培地である。図6に示すように、28℃で、7日間培養した結果、pHSA81-ss1053-chiH/S. lividans TK24のみにハロー形成がみられた。以上より、Chitinaseの細胞外への分泌発現が確認できた。
S. coelicolor A3(2) のゲノムDNAを由来として、プライマー81ss1053(/Nde)-mplaA2_F(下記配列番号68)およびpHSA81(/Xba)-plaA2_R(下記配列番号69)を用いてPCRを行った。
更に、増幅したDNA断片を、制限酵素NdeI及びXbaI(Takara Bio Inc.)で切断したpHSA81-ss1053に連結し、放線菌S. lividans TK24を宿主としてpHSA81-ss1053-pla2を構築した。コントロールとして、pHSA81-ss1053を用いて、S. lividans TK24を形質転換した。
各形質転換体を10 ml YEME/Tsr培地を用いて28℃で4日間前培養したのち、湿菌体重量2 mg分の培養液を植継ぎ7日間本培養し、遠心により培養上清を調製し、酵素活性を測定した。酵素活性測定方法は、sPLA2Assay Kit (Cayman Chemical Company) を用いて行った。
その結果、pHSA81-ss1053-pla2/S. lividans TK24の比活性は8.13 units/mg、pHSA81-ss1053/S. lividans TK24においては活性は認められなかった。
TCGGCCGAGGCCGCGCATATGgctcccgccgacaaggcaca
CCGCTTTTGCGGGGATCTAGAtcagccgaacaccttcacggcct
Thermococcus kodakaraensis KOD1のゲノムDNAを由来として、プライマー81ss1053(/Nde)-mapkAH_F(下記配列番号70)およびpHSA81(/Xba)-apkA_R(下記配列番号71)を用いてPCRを行った。
更に、増幅したDNA断片を、制限酵素NdeI及びXbaI(Takara Bio Inc.)で切断したpHSA81-ss1053に連結し、放線菌S. lividans TK24を宿主としてpHSA81-ss1053-apkAを構築した。コントロールとして、pHSA81-ss1053を用いて、S. lividans TK24を形質転換した。
各形質転換体を10 ml YEME/Tsr培地を用いて28℃で4日間前培養したのち、湿菌体重量2 mg分の培養液を植継ぎ7日間本培養し、遠心により培養上清を調製し、酵素活性を測定した。酵素活性測定方法は、基質としてStarchを用いて40℃、5 minの反応を行い、Amylaseによって分解され生じた還元糖量を、Somogyi-Nelson法を用いて定量した。
その結果、pHSA81-ss1053-apkA/S. lividans TK24の比活性は5.32 units/mg、pHSA81-ss1053/S. lividans TK24の比活性は0.172 units/mgであった。
TCGGCCGAGGCCGCGCATATGgcaaagtattccgaactcgaagaaggcgg
CCGCTTTTGCGGGGATCTAGAtcatccaaccccgcagtagctccag
(1)構成型発現シャトルベクターの構築
先ず、大腸菌のプラスミド複製開始起点及びエシェリキア属微生物用抗生物質耐性遺伝子(カナマイシン耐性遺伝子Km、クロラムフェニコール耐性遺伝子Cm、アンピシリン耐性遺伝子Ap)を含むDNA断片を、PCRにより増幅した。
かかる際、プライマーとしては、pHSA81(BlpI)-ori_F(下記配列番号72)及びpHSA81(BlpI)-ori_KmR(F)_R(下記配列番号73)を用い、カナマイシン耐性遺伝子KmはH-NHase遺伝子プロモーターと同一方向に導入するDNA断片ori_Km(F)を増幅した。
また、プライマーとしては、pHSA81(BlpI)-ori_KmR(R)_F(下記配列番号74)及びpHSA81(BlpI)-ori_R(下記配列番号75)を用い、カナマイシン耐性遺伝子KmはH-NHase遺伝子プロモーターと逆方向に導入するDNA断片ori_Km(R)を増幅した。
また、プライマーとしては、pHSA81(BlpI)-ori_F(下記配列番号72)及びpHSA81(BlpI)-ori_CmR(F)_R(下記配列番号76)を用い、クロラムフェニコール耐性遺伝子CmはH-NHase遺伝子プロモーターと同一方向に導入するDNA断片ori_Cm(F)を増幅した。
また、プライマーとしては、pHSA81(BlpI)-ori_CmR(R)_F(下記配列番号77)及びpHSA81(BlpI)-ori_R(下記配列番号75)を用い、クロラムフェニコール耐性遺伝子CmはH-NHase遺伝子プロモーターと逆方向に導入するDNA断片ori_Cm(R)を増幅した。
また、プライマーとしては、pHSA81(BlpI)-ori_ampR(F)_F(下記配列番号78)及びpHSA81(BlpI)-ori_R(下記配列番号75)を用い、アンピシリン耐性遺伝子ApはH-NHase遺伝子プロモーターと同一方向に導入するDNA断片ori_Ap(F)を増幅した。
また、プライマーとしては、pHSA81(BlpI)-ori_F(下記配列番号72)及びpHSA81(BlpI)-ori_ampR(R)_R(下記配列番号79)を用い、アンピシリン耐性遺伝子ApはH-NHase遺伝子プロモーターと逆方向に導入するDNA断片ori_Km(R)を増幅した。
ここで、DNA断片の増幅に用いたプライマー、伸長したDNA断片は、以下の通りである(配列番号72〜79)。また、各DNA断片の増幅に用いた鋳型は、下表3に示すとおりである。
CCCAGTCGCAACCGGGCTCAGCacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggc
GGTCCGCCCACTGCGCTGAGCtcgatttattcaacaaagccgccgtccc
CCCAGTCGCAACCGGGCTGAGCtcgatttattcaacaaagccgccgtccc
GGTCCGCCCACTGCGCTCAGCacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggc
GGTCCGCCCACTGCGCTGAGCtcgaatttctgccattcatccgcttattatcacttattcag
CCAGTCGCAACCGGGCTGAGCtcgaatttctgccattcatccgcttattatcacttattcag
CCCAGTCGCAACCGGGCTGAGCgacgtcaggtggcacttttcgggg
GGTCCGCCCACTGCGCTGAGCgacgtcaggtggcacttttcgggg
前培養として、 2YT固体培地上に生育させた各菌体を5 ml 2YT液体培地に植菌し、37℃、150 rpmで培地が十分な濁度になるまで(12時間程度)培養を行った。培養後の菌体からプラスミドを抽出した。
前培養から新しい5 ml 2YT液体培地へと1 %植菌を行い、再び12時間の培養を行った。これを再び植え継ぎ、3回目の継代培養の後に集菌を行い、プラスミドを抽出した。
YEME/tsr 固体培地上で十分に生育させた各菌体を10 ml YEME/tsr液体培地に2mm四方分植菌し、28 ℃、130 rpmで4日間振盪培養を行った。新しい10 ml YEME/tsr 液体培地培養溶液に培養溶液を1 %植菌で継代し、計3回の継代培養を行った菌体からプラスミドを抽出し、構成型発現シャトルベクター(pEHSA81k、pEHSA81k(r)、pEHSA81c、pEHSA81c(r)、pEHSA81a、pEHSA81a(r))を得た。各構成型発現シャトルベクターの構成を図7に示す。
尚、図7中、pHSA81に対して、DNA断片ori_Km(F)を連結したベクターがpEHSA81k、DNA断片ori_Km(R)を連結したベクターがpEHSA81k(r)、DNA断片ori_Cm(F)を連結したベクターがpEHSA81c、DNA断片ori_Cm(R)を連結したベクターがpEHSA81c(r)、DNA断片ori_Ap(F)を連結したベクターがpEHSA81a、DNA断片ori_Ap(R)を連結したベクターがpEHSA81a(r)で示されている。
大腸菌で3回継代培養後、または放線菌で3回継代培養後の各プラスミドをそれぞれ制限酵素BlpIで処理し、アガロースゲル電気泳動に供した。そして、DNA断片のバンドのパターンから、プラスミドの安定性を検討した。
その結果、pHSA81aおよびpHSA81a(r)においては大腸菌stbl2、TOP10を宿主にした場合に欠損すること無く安定的に保持されていることが確認された。ベクターが欠損すること無く安定的に保持される宿主であれば、これら菌株に限定されない。
pHSA81cおよびpHSA81c(r)においては大腸菌TOP10を宿主とした場合には欠損したが、大腸菌stbl2を宿主にした場合に欠損すること無く安定的に保持されていることが確認された。ベクターが欠損すること無く安定的に保持される宿主であれば、これら菌株に限定されない。
pHSA81kおよびpHSA81k(r)においては大腸菌stbl2を宿主とした場合には欠損したが、大腸菌TOP10を宿主にした場合に欠損すること無く安定的に保持されていることが確認された。ベクターが欠損すること無く安定的に保持される宿主であれば、これら菌株に限定されない。
また、大腸菌における1回目の液体培養後の各プラスミド(pEHSA81k、pEHSA81k(r)、pEHSA81c、pEHSA81c(r)、pEHSA81a、pEHSA81a(r))では、大腸菌stbl2、TOP10のどちらを宿主にした場合でも欠損すること無く安定的に保持されていることが確認された。
一方、S. lividans TK24での3回の継代培養後のプラスミドについては、目的以外のバンドは見られず、S. lividans TK24内で安定に保持されることが確認された。
S. lividans TK24では全てのプラスミドについて安定的に保持されることが確認できたため、これらのプラスミドは構成型発現シャトルベクターとしての機能を持っていると推認できる。
次に、前記構成型発現シャトルベクターpEHSA81k、pEHSA81c及びpEHSA81aに、Green Fluorescent Protein(GFP)、をレポーター遺伝子として組込み、S. lividans TK24における発現をSDS-PAGEで確認することでその機能性の検討を行った。尚、コントロールとして、ベクターpHSA81に、各レポーター遺伝子を組み込み、比較した。
また、構成型発現シャトルベクターpEHSA81kに、S. griseus由来の分泌酵素である、ロイシンアミノペプチダーゼ(sgLAP)、及びPseudomonas putida由来のカテコール2,3-ジオキシゲナーゼ遺伝子(xylE)をレポーター遺伝子として組込み、S. lividans TK24における発現をSDS-PAGEで確認することでその機能性の検討も行った。尚、コントロールとして、ベクターpHSA81に、各レポーター遺伝子を組み込み、比較した。
先ず、pAcGFP(Takara Bio Inc.)を鋳型にして、GFPをPCRにより増幅した。次に、PCRによって得られたDNA断片を、XbaI及びSacI(Takara Bio Inc.)で制限酵素処理した各構成型発現シャトルベクター及びベクターpHSA81にIn-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio Inc.)を用いて連結し、pEHSA81k-GFP、pEHSA81c-GFP、pEHSA81a-GFPはE. coli TOP10を宿主として、pHSA81-GFPはS. lividans TK24を宿主として構築した。
先ず、S. griseusを鋳型にして、sgLAPをPCRにより増幅した。次に、PCRによって得られたDNA断片を、XbaI及びSacI(Takara Bio Inc.)で制限酵素処理した構成型発現シャトルベクターpEHSA81k及びベクターpHSA81にIn-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio Inc.)を用いて連結し、pEHSA81k-sgLAPはE. coli TOP10を宿主として、pHSA81-sgLAPはS. lividans TK24を宿主として構築した。
先ず、Pseudomonas putida(Nakai et al. 1983, Worsey and Williams. 1975)を鋳型にして、xylEをPCRにより増幅した。
次に、PCRによって得られたDNA断片を、XbaI及びSacI(Takara Bio Inc.)で制限酵素処理したベクターpEHSA81k及びベクターpHSA81にIn-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio Inc.)を用いて連結し、pEHSA81k-xylEはE. coli TOP10を宿主として、pHSA81-xylEはS. lividans TK24を宿主として構築した。
そして、構築したプラスミドを用いてS. lividans TK24をそれぞれ形質転換した。培養後、無細胞抽出液を調製し、カテコール2,3-ジオキシゲナーゼ活性を測定した。その結果、pHSA81-xylE /S. lividans TK24が0.56 units/mg、pEHSA81k-xylE /S. lividans TK24が1.93 units/mgであり、今回構築した構成型発現シャトルベクターpEHSA81k の方が、pHSA81より発現量が多かった。
(1)構成型分泌発現シャトルベクターの構築方法
先ず、上記「4.構成型分泌発現ベクターの構築」で述べた方法と同様の方法で、8個の構成型分泌発現ベクター(pHSA81-ss1053、pHSA81-ss1857、pHSA81-ss3789、pHSA81-ss5891、pHSA81-ss6579、pHSA81-ss7089、pHSA81-ss7207、pHSA81-ss7442)を構築した。
次に、上記「5.構成型発現シャトルベクターの構築」で述べた方法と同様の方法により、大腸菌のプラスミド複製開始起点及びカナマイシン耐性遺伝子Kmを含むDNA断片を、発現ベクターpHSA81を鋳型にして、PCRにより増幅した。
そして、In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio Inc.)を用いた組換え反応により、PCRで増幅した複製領域とカナマイシン耐性遺伝子Kmを持つDNA断片ori-rep-KmR(F)と、制限酵素BlpI(Takara Bio Inc.)で処理した各構成型分泌発現ベクターとを連結し、構成型分泌発現シャトルベクター(pEHSA81-ss1053、pEHSA81-ss1857、pEHSA81-ss3789、pEHSA81-ss5891、pEHSA81-ss6579、pEHSA81-ss7089、pEHSA81-ss7207、pEHSA81-ss7442)を得た。図8に、構成型分泌発現シャトルベクターpEHSA81-ss1053の構成を示す。
構築した8個の構成型分泌発現シャトルベクターのうち、ベクターpEHSA81-ss1053を用いて機能解析を行った。
具体的には、pulA (Pullulanase)の発現、PP3812 (Esterase)の発現、chiH (Chitinase)の発現、pla2 (Phospholipase A2)の発現、apkA (Amylase)の発現を確認した。尚、各酵素の発現を確認する方法は、大腸菌TOP10を宿主としてプラスミドを構築し、構築したプラスミドを用いてS. lividans TK24を形質転換した以外は、前述の本発明に係る構成型分泌発現ベクターの機能解析方法と同一であるため、ここでは説明を省略する。
pulAの酵素活性を測定した結果、pEHSA81k-ss1053-pulA/S. lividans TK24の比活性は1.23 units/mg、pEHSA81k-ss1053/S. lividans TK24の比活性は0.0754 units/mgであった。尚、pEHSA81k-ss1053-pulAは、pulAが導入されたpEHSA81k-ss1053-を示す。
更に、調製した培養上清をSDS-PAGEに供した。その結果を図9に示す。図9に示されるように、pEHSA81k-ss1053-pulA/S. lividans TK24のみに、117 kDaのバンドが確認できた。
また、形質転換体を用いてプレートアッセイを行った。その結果を図10に示す。尚、プレートアッセイに用いた培地組成は、2YT + Red pullulan (基質)である。
図10に示されるように、28℃で、7日間培養した結果、pEHSA81k-ss1053-pulA/S. lividans TK24のみにハロー形成がみられた。以上より、Pullulanaseの細胞外への分泌発現が確認できた。
PP3812の酵素活性を測定した結果、pEHSA81k-ss1053-PP3812/S. lividans TK24の比活性は0.816 units/mg、pEHSA81k-ss1053/S. lividans TK24の比活性は0 units/mgであった。尚、pEHSA81k-ss1053-PP3812は、PP3812が導入されたpEHSA81k-ss1053-を示す。
更に、調製した培養上清をSDS-PAGEに供したところ、pEHSA81k-ss1053-PP3812/S. lividans TK24のみに、34.1 kDaのバンドが確認できた(図9参照)。以上より、Esteraseの細胞外への分泌発現が確認できた。
chiHの酵素活性を測定した結果、pEHSA81k-ss1053-chiH/S. lividans TK24の比活性は7.89 units/mg、pEHSA81k-ss1053/S. lividans TK24の比活性は0.321 units/mgであった。尚、pEHSA81k-ss1053-chiHは、chiHが導入されたpEHSA81k-ss1053を示す。
更に、調製した培養上清をSDS-PAGEに供したところ、pEHSA81k-ss1053-chiH/S. lividans TK24のみに、49.5 kDaのバンドが確認できた(図9参照)。
また、プレートアッセイを行った結果、pEHSA81k-ss1053-chiH/S. lividans TK24のみにハロー形成がみられた(図10参照)。以上より、Chitinaseの細胞外への分泌発現が確認できた。
pla2の酵素活性を測定した結果、pEHSA81k-ss1053-pla2/S. lividans TK24の比活性は6.06 units/mgであったが、pEHSA81k-ss1053/S. lividans TK24では酵素活性が認められなかった。尚、pEHSA81k-ss1053-pla2は、pla2が導入されたpEHSA81k-ss1053を示す。
更に、調製した培養上清をSDS-PAGEに供したところ、pEHSA81k-ss1053-pla2/S. lividans TK24のみに、14 kDaのバンドが確認できた(図9参照)。
以上より、Phospholipase A2の細胞外への分泌発現が確認できた。
apkAの酵素活性を測定した結果、pEHSA81k-ss1053-apkA/S. lividans TK24の比活性は1.54 units/mg、pEHSA81k-ss1053/S. lividans TK24の比活性は0.141 units/mgであった。尚、pEHSA81k-ss1053-apkAは、apkAが導入されたpEHSA81k-ss1053を示す。
更に、プレートアッセイを行った結果、pEHSA81k-ss1053-apkA/S. lividans TK24のみハロー形成がみられた(図10参照)。以上より、Amylaseの細胞外への分泌発現が確認できた。
Claims (5)
- 以下の(a)〜(c)の領域を含む構成型分泌発現ベクター。
(a)ストレプトマイセス属微生物を宿主として培養時に誘導剤を添加せずに目的タンパク質を発現可能なDNA領域
(b)ストレプトマイセス属微生物を宿主として培養時に目的タンパク質を分泌発現可能なDNA領域
(c)ストレプトマイセス属微生物を宿主として複製可能なDNA領域 - 以下の(d)〜(f)の領域を含む構成型発現シャトルベクター。
(d)ストレプトマイセス属微生物を宿主として培養時に誘導剤を添加せずに目的タンパク質を発現可能なDNA領域
(e)ストレプトマイセス属微生物を宿主として複製可能なDNA領域
(f)エシェリキア属微生物を宿主として複製可能なDNA領域 - 以下の(g)〜(j)の領域を含む構成型分泌発現シャトルベクター。
(g)ストレプトマイセス属微生物を宿主として培養時に誘導剤を添加せずに目的タンパク質を発現可能なDNA領域
(h)ストレプトマイセス属微生物を宿主として培養時に目的タンパク質を分泌発現可能なDNA領域
(i)ストレプトマイセス属微生物を宿主として複製可能なDNA領域
(j)エシェリキア属微生物を宿主として複製可能なDNA領域 - 請求項1〜3のいずれか一項に記載のベクターにより、ストレプトマイセス属微生物を形質転換した形質転換体。
- 請求項4に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物から目的タンパク質を採取することを含む、目的タンパク質の製造方法。
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