JP5284804B2 - 新規発現ベクター - Google Patents
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Description
〔1〕配列番号:1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号:1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件化でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、微生物内で外来蛋白質を発現可能なベクター。
〔2〕配列番号:2に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号:2に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件化でハイブリダイズするポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、〔1〕に記載のベクター。
〔3〕配列番号:3または4に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号:3または4に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件化でハイブリダイズするポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、〔1〕または〔2〕に記載のベクター。
〔4〕前記外来蛋白質の発現させる微生物がコクリア属、ミクロコッカス属、またはアルスロバクター属に属する微生物であることを特徴とする、〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のベクター。
〔5〕前記コクリア属に属する微生物が、コクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)NBRC 103217株である、〔4〕に記載のベクター。
〔6〕〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載のベクターに外来蛋白質をコードするDNAを挿入した組換えベクター。
〔7〕〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載のベクター及び〔6〕に記載の組換えベクターにより、宿主を形質転換した形質転換体。
〔8〕〔7〕に記載の形質転換体を培養する工程、及び得られる培養物から外来蛋白質を単離する工程を含む、外来蛋白質の製造方法。
〔9〕〔7〕に記載の形質転換体を、非水系反応場で目的物質を生産するための生体触媒として使用することを特徴とする、目的物質の生産方法。
コクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)NBRC 103217株のゲノムの全塩基配列(2.7Mb)を決定し、その塩基配列から2356個のORF推定を行った。これらのORF情報を基に、翻訳に最適なSD配列の前後配列を予測した。
次に、コクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)NBRC 103217株内で複製できるプラスミドベクターの作製を行った。コクリア バリアンス(Kocuria varians) NBRC15358由来のプラスミド(pKV15358-1)のレスキュープラスミド(配列番号:5)は、コクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)NBRC 103217株で複製可能であったことから、同プラスミドを小型化し、さらに実施例1で見出したSD前後配列(配列番号:2)を付加することにより、コクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)NBRC 103217株用ベクターpKV15358-3 (4.3kb)(配列番号:7)を構築した。
実施例2において構築したベクターpKV15358-3を用いてArthrobacter sp. F73株由来のニトリラーゼ遺伝子をコクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)NBRC 103217株で発現させた。
大腸菌ではマンデル酸の生成が見られない酢酸エチルと水との二相系反応において、同形質転換体を用いたところ、酢酸エチルを60%含む系においても水相での反応の60%の活性を示した。より具体的には以下の検討を行った。
外来遺伝子の発現量を増やすためのプロモーターを得るために、培養の定常期に高生産されるタンパク質の一つとしてスーパーオキシドジスムターゼを見出した。ゲノム情報から同酵素をコードする遺伝子を発現するプロモーター領域を特定してクローニングし、コクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)NBRC 103217株用ベクターに導入することにより、ニトリラーゼ遺伝子の発現が150倍に増加することが明らかとなった。より具体的には以下の検討を行った。
Claims (9)
- 配列番号:1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号:1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって該ポリヌクレオチドにより該ポリヌクレオチドを含むプラスミドをコクリア属に属する微生物内で複製可能にする機能を有するポリヌクレオチドを含む、微生物内で外来蛋白質を発現可能なベクター。
- 配列番号:2に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載のベクター。
- 配列番号:3または4に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項1または2に記載のベクター。
- 前記外来蛋白質の発現させる微生物がコクリア属、ミクロコッカス属、またはアルスロバクター属に属する微生物であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載のベクター。
- 前記コクリア属に属する微生物が、コクリア リゾフィラ(Kocuria rhizophila)NBRC 103217株である、請求項4に記載のベクター。
- 請求項1〜5のいずれかに記載のベクターに外来蛋白質をコードするDNAを挿入した組換えベクター。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のベクターにより、宿主を形質転換した形質転換体。
- 請求項6に記載のベクターを保持する形質転換体を培養する工程、及び得られる培養物から外来蛋白質を単離する工程を含む、外来蛋白質の製造方法。
- 請求項6に記載のベクターを保持する形質転換体を、非水系反応場で目的物質を生産するための生体触媒として使用することを特徴とする、目的物質の生産方法。
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