JP6125578B2 - 適応免疫を測定する方法 - Google Patents

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本出願は２００９年６月２５日に出願された米国仮出願番号第６１／２２０，３４４号の恩恵を主張して、全体として参照することによって本明細書中に組み込まれる。
記載されるのは、適応免疫系細胞から抽出された核酸の大規模シーケンシングを用いて、Ｔ細胞受容体遺伝子又は抗体遺伝子の多様性を分析することによって、患者の適応免疫を測定する方法である。
免疫能とは、生きた生物（例えば、細菌若しくは真菌）、ウイルス、又は病原体から単離され、ワクチン中に導入された特異抗原成分であり得る病原体に暴露された後に身体が正常な免疫応答（すなわち、抗体産生及び／又は細胞性免疫）を生み出す能力である。免疫能は、免疫不全又は免疫不適格又は免疫低下の反対である。数例は、完全に機能する免疫系をまだ有さないが、母体から伝達された抗体を有する新生児（免疫不全）；免疫系が機能しなくなったか若しくは機能しなくなりつつある後期ＡＩＤＳ患者（免疫不適格）；提供された臓器を身体が拒絶しないように薬物治療を受けている移植レシピエント（免疫低下）；高齢者におけるＴ細胞機能の加齢による減弱；又は放射線若しくは化学療法薬にさらされた個体である。重複する場合があるが、これらの用語はすべて機能障害性免疫系の指標である。リンパ球に関して、免疫能とは、Ｂ細胞又はＴ細胞が成熟し、抗原を認識することができ、そして人に免疫応答を起こさせることができることを意味する。
免疫能は、適応免疫系の、Ｂ細胞によってコード化される高多形性受容体（免疫グロブリン、Ｉｇ）及びＴ細胞によってコード化される高多形性受容体（Ｔ細胞受容体、ＴＣＲ）を用いて、任意の潜在的な外来抗原に特異的な免疫応答を引き起こす能力に依存する。
Ｂ細胞によって発現されるＩｇは、４つのポリペプチド鎖、つまり２つの重鎖（Ｈ鎖）及び２つの軽鎖（Ｌ鎖）から構成され、Ｈ２Ｌ２構造を形成するタンパク質である。Ｈ及びＬ鎖の各対は、ＶＬ及びＶＨ領域からなる超可変ドメイン、並びに定常ドメインを含む。ＩｇのＨ鎖は、いくつかのタイプ、μ、δ、γ、α、及びβのものである。個体内のＩｇの多様性は、主に超可変ドメインにより決定される。Ｈ鎖のＶドメインは、３種の生殖細胞遺伝子セグメント、ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨセグメントの組み合わせ結合（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｊｏｉｎｉｎｇ）によって作製される。超可変ドメイン配列多様性は、Ｉｇ遺伝子再配列のプロセス中のＶＨ−ＤＨ、ＤＨ−ＪＨ、及びＶＨ−ＪＨジャンクションでのヌクレオチドの独立した付加及び欠失によりさらに増大する。この点に関して、免疫能はＩｇの多様性に反映される。
αβＴ細胞によって発現されるＴＣＲは、それぞれＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子から発現された２つの膜貫通ポリペプチド鎖（α及びβ）から構成されるタンパク質である。類似したＴＣＲタンパク質は、ガンマ−デルタＴ細胞において、ＴＣＲＤ及びＴＣＲＧ座から発現される。各ＴＣＲペプチドは、可変的な相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びにフレームワーク領域（ＦＲ）及び定常領域を含む。αβＴ細胞の配列多様性は、α及びβ鎖可変ドメインの第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）ループのアミノ酸配列により主に決定され、この多様性は、それぞれ、β鎖座中の変数（Ｖβ）、多様性（Ｄβ）、及び結合（Ｊβ）遺伝子セグメント間、並びにα鎖座中の同様のＶα及びＪα遺伝子セグメント間の組換えの結果である。ＴＣＲα及びβ鎖座中に複数のそのような遺伝子セグメントが存在することにより、多数の異なるＣＤＲ３配列がコード化される。ＣＤＲ３配列多様性は、ＴＣＲ遺伝子再構成の過程でＶβ−Ｄβ、Ｄβ−Ｊβ、及びＶα−Ｊαジャンクションでのヌクレオチドの独立した付加及び欠失によりさらに増大する。この点に関して、免疫能は、ＴＣＲの多様性に反映される。
自己免疫疾患において、免疫低下又は調節不全の適応免疫であるかどうかによらず、様々な設定で患者の適応免疫系を評価又は測定する方法が長年にわたり切実に必要とされている。患者の免疫能を評価することにより、病状又は加齢の効果を診断する方法に対する需要がある。同様に、免疫系を修飾する治療法の結果を、治療を受けている間、患者の免疫能を評価することによってモニタリングする必要がある。反対に、療法に対する反応をモニタリングするために、自己免疫疾患再発及び寛解に関して適応免疫系をモニタリングする方法に対する需要、又は発症前に予防的治療を開始する必要性がある。
本発明の一態様は：
・多数のＶセグメントプライマー（各プライマーは、１つの機能的Ｖセグメント又はＶセグメントの小ファミリーと相補性である配列を含む）；及び
・多数のＪセグメントプライマー（各プライマーは、Ｊセグメントと相補性である配列を含む）を含む組成物であって；
Ｖセグメント及びＪセグメントプライマーは、多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＴＣＲ ＣＤＲ３領域の増幅を可能にし、ＴＣＲ遺伝子の多様性を定量化するために十分な多数の増幅されたＤＮＡ分子が産生される。本発明の一実施形態は、各Ｖセグメントプライマーが、１つのＶβセグメントと相補性である配列を含み、各ＪセグメントプライマーがＪβセグメントと相補性である配列を含み、Ｖセグメント及びＪセグメントプライマーがＴＣＲβＣＤＲ３領域の増幅を可能にする組成物である。別の実施形態は、各Ｖセグメントプライマーが１つの機能的Ｖαセグメントと相補性である配列を含み、各ＪセグメントプライマーがＪαセグメントと相補性である配列を含み、Ｖセグメント及びＪセグメントプライマーがＴＣＲαＣＤＲ３領域の増幅を可能にする組成物である。
本発明の別の実施形態は、Ｖセグメントプライマーが保存されたセグメントとハイブリダイズし、類似したアニーリング強度を有する組成物である。別の実施形態では、Ｖセグメントプライマーが、組換えシグナル配列（ＲＳＳ）に対してＶβセグメント中の位置−４３で固定される。別の実施形態では、Ｖセグメントプライマーの多様性が、４５の異なるＶβ遺伝子に対して特異的な少なくとも４５のプライマーからなる。別の実施形態では、Ｖセグメントプライマーが、配列番号１〜４５からなる群から選択される配列を有する。別の実施形態では、Ｖセグメントプライマーは、配列番号５８〜１０２からなる群から選択される配列を有する。別の実施形態では、各ＶβセグメントのＶセグメントプライマーが存在する。
本発明の別の実施形態は、Ｊセグメントプライマーが、Ｊβセグメントの保存されたフレームワーク領域エレメントとハイブリダイズし、類似したアニーリング強度を有する組成物である。Ｊセグメントプライマーの多様性が、１３の異なるＪβ遺伝子に対して特異的な少なくとも１３のプライマーから構成される、請求項２記載の組成物。別の実施形態は、Ｊセグメントプライマーが、配列番号４６〜５７からなる群から選択される配列を有する、請求項２記載の組成物である。別の実施形態では、Ｊセグメントプライマーが、配列番号１０２〜１１３からなる群から選択される配列を有する。別の実施形態では、各ＪβセグメントのＪセグメントプライマーが存在する。別の実施形態では、全てのＪセグメントプライマーが同じ保存されたモチーフにアニールする。
本発明の別の実施形態は、増幅されたＤＮＡ分子が、前記保存モチーフから始まり、Ｊセグメントを診断によって同定するために適切な配列を増幅し、ＣＤＲ３ジャンクションを含み、Ｖセグメントに及ぶ組成物である。別の実施形態では、増幅されたＪβ遺伝子セグメントはそれぞれ、ＲＳＳ部位の下流の位置＋１１〜＋１４で独自の４個の塩基タグを有する。
本発明の別の態様は、１組のシーケンシングオリゴヌクレオチドを更に含む組成物であって、このシーケンシングオリゴヌクレオチドは増幅されたＤＮＡ分子内の領域にハイブリダイズする。一実施形態では、シーケンシングオリゴヌクレオチドがＲＳＳ部位の下流の位置＋１１〜＋１４で増幅されたＪβ遺伝子セグメント内の４個の塩基タグに隣接してハイブリダイズする。別の実施形態では、シーケンシングオリゴヌクレオチドは、配列番号５８〜７０からなる群から選択される。別の実施形態では、Ｖセグメント又はＪセグメントは、密接に関連する配列の統合による配列エラー訂正を含むように選択される。別の実施形態は、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを生成させるためのユニバーサルＣセグメントプライマーを更に含む組成物である。
本発明の別の態様は：
・多数のＶセグメントプライマー（ここで、各Ｖセグメントプライマーは、１つの機能的Ｖセグメント又はＶセグメントの小ファミリーに対して相補性である配列を含む）；及び
・多数のＪセグメントプライマー（各ＪセグメントプライマーはＪセグメントに対して相補性である配列を含む）を含む組成物であって；
Ｖセグメント及びＪセグメントプライマーにより、多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＴＣＲＧ ＣＤＲ３領域の増幅が可能になり、抗体重鎖遺伝子の多様性を定量化するために十分な多数の増幅されたＤＮＡ分子が生成する、組成物である。
本発明の別の態様は：
・多数のＶセグメントプライマー（ここで、各Ｖセグメントプライマーは、１つの機能的Ｖセグメント又はＶセグメントの小ファミリーに対して相補性である配列を含む）；及び
・多数のＪセグメントプライマー（ここで、各Ｊセグメントプライマーは、Ｊセグメントに対して相補性である配列を含む）を含む組成物であって；
Ｖセグメント及びＪセグメントプライマーにより、多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による抗体重鎖（ＩＧＨ）ＣＤＲ３領域の増幅が可能になり、抗体重鎖遺伝子の多様性を定量化するために十分な多数の増幅されたＤＮＡ分子が生成する、組成物である。
本発明の別の態様は：
・多数のＶセグメントプライマー（ここで、各Ｖセグメントプライマーは、１つの機能的Ｖセグメント又はＶセグメントの小ファミリーに対して相補性である配列を含む）；及び
・多数のＪセグメントプライマー（ここで、各Ｊセグメントプライマーは、Ｊセグメントに対して相補性である配列を含む）を含む組成物であって；
Ｖセグメント及びＪセグメントプライマーにより、多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による抗体軽鎖（ＩＧＬ）ＶＬ領域の増幅が可能になり、抗体軽鎖遺伝子の多様性を定量化するために十分な多数の増幅されたＤＮＡ分子が生成する、組成物である。
本発明の別の態様は：
・多数のＶセグメントプライマー（ここで、各Ｖセグメントプライマーは、１つの機能的Ｖセグメント又はＶセグメントの小ファミリーに対して相補性である配列を含む）を選択し；そして
・多数のＪセグメントプライマーを選択し（ここで、各Ｊセグメントプライマーは、Ｊセグメントに対して相補性である配列を含む）；
・Ｖセグメント及びＪセグメントプライマーをゲノムＤＮＡの試料と組み合わせることにより、多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＣＤＲ３領域の増幅が可能になり、ＴＣＲ遺伝子の多様性を定量化するために十分な多数の増幅されたＤＮＡ分子が生成されることを含む方法である。
本発明の一実施形態は、各Ｖセグメントプライマーが１つの機能的Ｖβセグメントに対して相補性である配列を含み、各ＪセグメントプライマーがＪβセグメントに対して相補性である配列を含む方法であって；Ｖセグメント及びＪセグメントプライマーをゲノムＤＮＡの試料と組み合わせることによって、多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＴＣＲ ＣＤＲ３領域の増幅が可能になり、多数の増幅されたＤＮＡ分子を生成する方法である。別の実施形態では、各Ｖセグメントプライマーが、１つの機能的Ｖαセグメントに対して相補性である配列を含み、各Ｊセグメントプライマーが、Ｊαセグメントに対して相補性である配列を含み；Ｖセグメント及びＪセグメントプライマーをゲノムＤＮＡの試料と組み合わせることにより、多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＴＣＲ ＣＤＲ３領域の増幅が可能になり、多数の増幅されたＤＮＡ分子が生成する。
本発明の別の実施形態は、増幅されたＤＮＡ分子を配列決定するステップをさらに含む方法である。別の実施形態では、シーケンシングステップは、増幅されたＤＮＡ分子内の領域にハイブリダイズする１組のシーケンシングオリゴヌクレオチドを利用する。別の実施形態は、増幅されたＤＮＡ分子間のＴＣＲβＣＤＲ３配列の全体的な多様性を計算するステップをさらに含む方法である。別の実施形態では、当該方法は、正常なヒト対象の全体的な多様性が１＊１０６配列を超えるか、２＊１０６配列を超えるか、又は３＊１０６配列を超えることを示す。
本発明の別の態様は、ヒト患者における免疫不全を診断する方法であって、患者のＴＣＲ ＣＤＲ３配列の多様性を測定し、そして前記対象の多様性と、正常な対象から得られた多様性とを比較することを含む方法である。本発明の一実施形態は、ＴＣＲ配列の多様性の測定が：
・多数のＶセグメントプライマーを選択するステップ（ここで、各Ｖセグメントプライマーは、１つの機能的Ｖセグメント又はＶセグメントの小ファミリーに対して相補性である配列を含む）；及び
・多数のＪセグメントプライマーを選択するステップ（ここで、各ＪセグメントプライマーはＪセグメントに対して相補性である配列を含む）；
・Ｖセグメント及びＪセグメントプライマーをゲノムＤＮＡの試料と組み合わせて、多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＴＣＲ ＣＤＲ３領域の増幅を可能にして、多数の増幅されたＤＮＡ分子が生成するステップ；
・増幅されたＤＮＡ分子をシーケンシングするステップ；
・増幅されたＤＮＡ分子間のＴＣＲ ＣＤＲ３配列の全体的な多様性を計算するステップを含む方法である。
本発明の一実施形態は、多様性の比較が、次式：
Figure 0006125578
 （式中、Ｇ（λ）はパラメータλ１、…、λＳの経験分布関数であり、ｎｘはちょうどｘ回配列決定されたクローン型の数であり、
Figure 0006125578
 である）
を用いて計算することにより決定される方法である。
本発明の別の実施形態は、ゲノムＤＮＡの少なくとも２つの試料の多様性を比較する方法である。別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの１つの試料は患者由来であり、他の試料は正常な対象である。別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの１つの試料は治療的処置前の患者由来であり、他の試料は治療後の患者由来である。別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの２つの試料は、治療中の異なる時点での同じ患者由来である。別の実施形態では、疾患をゲノムＤＮＡの試料間の多様性の比較に基づいて診断する。別の実施形態では、ヒト患者の免疫能を比較により評価する。
ＴＣＲ及びＩｇ遺伝子は、体細胞突然変異により数百万もの異なるタンパク質を生成させることができる。この多様性生成メカニズムのために、これらの遺伝子の超可変相補性決定領域は、数百万のリガンドと相互作用することができる配列をコード化することができ、これらの領域は、タンパク質の同族リガンドの結合を必要とする細胞にシグナルを伝達することが得きる定常領域と連結される。
適応免疫系は、潜在的な病原体の領域を認識するために十分な多様性を有するＴ細胞及びＢ細胞抗原受容体のレパートリーを生成させるいくつかの方法を用いる。ＭＨＣ分子によって提示されるペプチド抗原を主に認識するαβ及びγδＴ細胞において、この受容体多様性のほとんどは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α及びβ鎖（又はγ及びδ鎖）の第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）内に含まれる。適応免疫系は最高１０１８までの異なるＴＣＲαβ対を生成させることができることが推定されているが、ＴＣＲＣＤＲ３多様性の直接実験評価は可能でなかった。
本明細書中に記載されていることは、単一分子ＤＮＡシーケンシングに基づくＴＣＲＣＤＲ３多様性を測定する新規方法であり、２人の健常な成人の末梢血Ｔ細胞から単離された数百万の再構成されたＴＣＲβ遺伝子においてＣＤＲ３領域を配列決定するためのこの方法の使用である。
適応免疫系が、個体がさらされ得る膨大な数の潜在的な外来抗原のいずれかに対して特異的な免疫応答を起こさせる能力は、Ｂ細胞によりコード化される高度に多形性の受容体（免疫グロブリン）及びＴ細胞によりコード化される高度に多形性の受容体（Ｔ細胞受容体；ＴＣＲ）に依存する。主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及びＩＩ分子により提示されるペプチド抗原を主に認識する、αβＴ細胞によって発現されるＴＣＲは、２つの膜貫通ポリペプチド鎖（α及びβ）からなるヘテロ二量体タンパク質であり、それぞれは１つの可変ドメイン及び１つの定常ドメインを含む。αβＴ細胞のペプチド特異性は、主にα及びβ鎖可変ドメインの第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）ループにおいてコード化されるアミノ酸配列により決定される。β及びα鎖のＣＤＲ３領域は、それぞれ、β鎖座における非隣接可変（Ｖβ）、多様性（Ｄβ）、及び結合（Ｊβ）遺伝子セグメント間、及びα鎖座における類似したＶα及びＪα遺伝子セグメント間の組換えによって形成される。ＴＣＲα及びβ鎖座における複数のそのような遺伝子セグメントの存在は、多数の異なるＣＤＲ３配列がコード化されるのを可能にする。ＣＤＲ３配列多様性は、ＴＣＲ遺伝子再構成のプロセス中のＶβ−Ｄβ、Ｄβ−Ｊβ、及びＶα−Ｊαジャンクションでのヌクレオチドのテンプレートに無関係の付加及び欠失によりさらに増大する。
成人ヒトαβＴ細胞レパートリーにおける受容体の多様性を評価する以前の試みは、レパートリーの小さく明確なサブセットにおいて発現された再構成されたＴＣＲα及びβ鎖遺伝子を調べ、続いてこれらのサブセット中に存在する多様性を全レパートリーに当てはめて個体ごとに約１０６の独自のＴＣＲβ鎖ＣＤＲ３配列を推定することに依存し、抗原に出会ったＣＤ４５ＲＯ＋区画中の細胞によりこれらの独自のＴＣＲβＣＤＲ３配列の１０〜２０％が発現される。この推定値の正確さ及び精度は、数百もの配列で観察される多様性を全レパートリーに外挿する必要性によって大幅に制限され、αβＴ細胞レパートリーにおける独自のＴＣＲβ鎖ＣＤＲ３配列の実際の数は、１×１０６よりも有意に大きい可能性がある。
ハイスループットＤＮＡシーケンシング技術における最近の進歩により、キャピラリーベースの技術よりも有意に深いシーケンシングが可能になった。各末端にユニバーサルＰＣＲアダプター配列を有するテンプレート分子の複雑なライブラリを、固体表面上に固定された相補性オリゴヌクレオチドのローン（ｌａｗｎ）にハイブリダイズさせる。固相ＰＣＲを用いて、ハイブリダイズされたライブラリを増幅させ、その結果、表面上に数百万のテンプレートクラスターが得られ、それぞれはもとのライブラリからの１つのＤＮＡ分子の多数（〜１，０００）の同じコピーを含む。各クラスター中の分子における３０〜５４ｂｐの間隔は、可逆的ダイターミネーション（ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）化学を用いて配列決定され、数百万ものＴ細胞中に含まれる再構成されたＴＣＲβ鎖ＣＤＲ３領域のゲノムＤＮＡからの同時シーケンシングを可能にする。この方法により、αβＴ細胞の集団においてかなりの割合の独自に再構成されたＴＣＲβＣＤＲ３領域の直接シーケンシングが可能になり、これによって、集団における各ＣＤＲ３配列の相対的頻度の推定が可能になる。
Ｔ細胞の有限の試料において測定された多様性からの、全αβＴ細胞レパートリーにおけるＴＣＲβＣＤＲ３配列の多様性の正確な推定は、試料中で観察されなかったレパートリー中に存在するＣＤＲ３配列の数の推定を必要とする。全αβＴ細胞レパートリーにおけるＴＣＲβ鎖ＣＤＲ３多様性を、数百万のαβＴ細胞を含む血液試料において観察される独自のＴＣＲβＣＤＲ３配列の数の直接測定を用いて推定した。本明細書における結果は、先の推定値より数倍高い、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞区画におけるＴＣＲβＣＤＲ３多様性の下限を特定した。加えて、本明細書における結果は、抗原に出会ったＴ細胞のＣＤ４５ＲＯ＋区画において少なくとも１．５×１０６の独自のＴＣＲβＣＤＲ３配列が存在し、その大部分は低い相対的頻度で存在することを証明する。抗原に出会った細胞におけるＴＣＲβＣＤＲ３配列のそのような多様な集団の存在は、以前には証明されていない。
それぞれの健常な個体におけるＴＣＲβ鎖の多様なプールは、１０１１を超える可能な配列の推定される理論的空間から得られる試料である。しかし、再構成されたＴＣＲの実現されたセットは、この理論的空間から均一にサンプリングされない。異なるＶβ’及びＪβ’は、１０００倍を超える頻度差で見いだされる。さらに、ヌクレオチドの挿入率は強く偏る。実現されたＴＣＲβ配列の空間のこのような減少は、人々の間でβ鎖が共有される可能性に至る。本明細書中で記載される方法により生成した配列データを用いて、インビボＪ使用、Ｖ使用、モノヌクレオチド及びジヌクレオチドバイアス、及び位置に依存したアミノ酸使用を計算することができる。これらのバイアスは、ＴＣＲβが選択される配列空間のサイズを有意に狭め、このことは異なる個体が同じアミノ酸配列とＴＣＲβ鎖を共有することを示唆する。本明細書中の結果は、数千ものこのような同じ配列が個々のヒトゲノム間でペアごとに共有されることを示す。
アッセイ技術は、高多重化ＰＣＲ反応を提供するためにプライマーの２つのプールを使用する。「順方向」プールは、遺伝子中の各Ｖセグメントに特異的なプライマーを有する（高度に保存された領域を標的とするいくつかのプライマーを使用して、多くのＶセグメントを同時に捕捉する）。「逆」プールプライマーは、結合（「Ｊ」）セグメント中の保存された配列にアニールする。増幅されたセグメントプールは、各Ｊセグメントを同定し、またＪセグメント特異性プライマーが再配列化のためにアニールすることを可能にするために適切な配列を含む。これにより、個体中に存在する大部分の体細胞再構成の直接的観察が可能になる。これは次に、自己免疫障害（又は他の標的疾患徴候）を有する個体におけるＴＣＲレパートリーの、対照のＴＣＲレパートリーとの迅速な比較を可能にする。
適応免疫系は、理論的には、非常に多様な（常にいずれか１つの個体で発現される可能性が高いものよりもはるかに多くの）Ｔ細胞受容体ＣＤＲ３配列を生成することができる。しかし、この理論的多様性のどれくらいの割合が成人αβＴ細胞レパートリーにおいて実際に用いられるかを評価するための以前の試みによって、多様性の正確な評価はできなかった。本明細書中で記載されるのは、単一分子ＤＮＡシーケンシングに基づいたこの問題に対する新規取り組み及び有限試料における多様性測定を用いたレパートリー多様性の推定に対する分析計算論的取り組みの開発である。分析により、成人レパートリー中の独自のＴＣＲβＣＤＲ３配列の数が、レパートリーの小セグメントの徹底的なキャピラリーシーケンシングに基づいた事前の推定値を有意に超えることが証明された。本明細書中で記載される方法を用いて観察されるＣＤ４５ＲＯ−集団（ナイーブＴ細胞が多い）におけるＴＣＲβ鎖多様性は、以前に報告されているよりも５倍大きい。重大な発見は、抗原に出会ったＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞で発現された独自のＴＣＲβＣＤＲ３配列の数であり、本明細書における結果は、この数が、他者の以前の結果に基づいて予想されるよりも１０〜２０倍大きいことを示す。ＣＤ４５ＲＯ＋細胞におけるＣＤＲ３配列の度数分布は、Ｔ細胞レパートリーが小さなクローンサイズの多数のクローンを含むことを示唆する。
本明細書中の結果は、ＴＣＲβ鎖の実現されたセットが、配列の巨大な潜在的空間から不均一にサンプリングされることを示す。特に、生殖細胞系により近いβ鎖配列（Ｖ−Ｄ及びＤ−Ｊ境界でほとんど挿入及び欠失がない）が比較的高頻度で作成されるようである。生殖細胞系に近いＴＣＲ配列は、様々な人の間で共有される。なぜなら、Ｖ、Ｄ及びＪの生殖細胞系配列が、少数の多型を法として、ヒト集団間で共有されるからである。
成熟αβＴ細胞により発現されたＴ細胞受容体は、その２つの構成鎖がＴＣＲα及びβ鎖可変座の独立した再構成現象により生成するヘテロ二量体である。α鎖はβ鎖よりも低い多様性を有するので、より高率のαが個体間で共有され、数百もの正確なＴＣＲαβ受容体が個体の任意の対間で共有される。
細胞
Ｂ細胞及びＴ細胞は、骨髄、胸腺、リンパ腺、末梢組織及び血液をはじめとする様々な組織試料から得ることができるが、末梢血が最も容易に利用される。末梢血試料は、対象から静脈切開によって得られる。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、当業者に公知の技術により、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（登録商標）密度勾配分離によって単離される。好ましくは、全ＰＢＭＣが分析に用いられる。Ｂ及び／又はＴリンパ球は、その代わりに、蛍光標識された抗ヒト抗体、例えばＣＤ４ＦＩＴＣ（クローンＭ−Ｔ４６６、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＣＤ８ＰＥ（クローンＲＰＡ−Ｔ８、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４５ＲＯ ＥＣＤ（クローンＵＣＨＬ−１、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、及びＣＤ４５ＲＯ ＡＰＣ（クローンＵＣＨＬ−１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、各対象の複数の区画：例えば、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＯ＋／−及びＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋／−に流動選別することができる。全ＰＢＭＣの染色は、抗体の適切な組み合わせを用いて実施することができ、続いて細胞を洗浄した後、分析する。リンパ球サブセットを、ＦＡＣＳ選別により、例えば、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（登録商標）細胞選別システム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、そして結果をＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ Ｉｎｃ．）で分析することにより、また表面若しくはビーズに固定された特異的抗体を含む概念的に類似した方法によって単離することができる。
核酸抽出
全ゲノムＤＮＡを細胞から、例えば、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を用いることによって抽出する。１つのハプロイドゲノムのおよその質量は３ｐｇである。好ましくは、少なくとも１００，０００〜２００，０００細胞を多様性の分析に使用する（すなわち、ジプロイドＴ細胞から約０．６〜１．２μｇのＤＮＡ）。供給源としてＰＢＭＣを用いて、Ｔ細胞の数は、全細胞の約３０％であると推定できる。
別法として、全核酸は、ゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡの両方を含む細胞から単離することができる。多様性が核酸抽出物中のｍＲＮＡから測定されるならば、ｍＲＮＡは測定前にｃＤＮＡに変換しなければならない。これは、通常の技術の方法によって容易に実施することができる。
ＤＮＡ増幅
多重ＰＣＲシステムを用いて、ゲノムＤＮＡから、好ましくはＣＤＲ３領域から、更に好ましくはＴＣＲα、ＴＣＲγ又はＴＣＲδＣＤＲ３領域から、最も好ましくはＴＣＲβＣＤＲ３領域から、再構成されたＴＣＲ座を増幅する。
一般的に、多重ＰＣＲシステムは、少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５、好ましくは２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、又は３９、最も好ましくは４０、４１、４２、４３、４４、又は４５の順方向プライマー（この場合、各順方向プライマーは、配列番号１１４〜２４８で示される１以上のＴＲＢ Ｖ領域セグメントに対応する配列に対して特異的である）；少なくとも３、４、５、６、又は７、好ましくは８、９、１０、１１、１２又は１３の逆プライマー（この場合、各逆プライマーは、配列番号２４９〜２６１で示される１以上のＴＲＢ Ｊ領域セグメントに対応する配列に対して特異的である）を用いることができる。最も好ましくは、全てのＪセグメントに関してＪセグメントプライマーが存在する。
好ましくは、プライマーはイントロン／エクソン境界を越えないように設計される。順方向プライマーは、好ましくはＶセグメント間の比較的強力な配列保存の領域中のＶセグメントにアニールして、これらのプライマー間の配列の保存を最大にするようでなければならない。したがって、これにより、各プライマーの差次的アニーリング特性の可能性は最小限に抑えられ、したがって、Ｖ及びＪプライマー間の増幅された領域は、用いられる特定のＶ遺伝子セグメントを同定するために十分なＴＣＲ Ｖ配列情報を含む。
好ましくは、ＪセグメントプライマーはＪセグメントの保存エレメントとハイブリダイズし、類似したアニーリング強度を有する。最も好ましくは、全てのＪセグメントプライマーは同じ保存フレームワーク領域モチーフにアニールする。順方向及び逆プライマーはどちらも好ましくは５’末端で、ＤＮＡシーケンサーに適合するユニバーサル順方向プライマー配列で修飾される。
例えば、多重ＰＣＲシステムは４５の順方向プライマー（表１）（それぞれ機能的ＴＣＲ Ｖβセグメントに対して特異的）、及び１３の逆プライマー（表２）（それぞれ、ＴＣＲ Ｊβセグメントに対して特異的）を用いることができる。Ｘｎ及びＹｎは、それぞれ長さｎ及びｍのポリヌクレオチドに対応し、これは、アッセイを読み取るために用いられる単一分子シーケンシング技術に対して特異的である。
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表１の４５の順方向ＰＣＲプライマーは、４８の機能的可変セグメントのそれぞれに対して相補性であり、表２の１３の逆ＰＣＲプライマーは、ＴＲＢ座からの機能的結合（Ｊ）遺伝子セグメント（ＴＲＢＪ）のそれぞれに対して相補性である。ＴＲＢ Ｖ領域セグメントは、配列番号１１４〜２４８で配列表において特定され、ＴＲＢ Ｊ領域セグメントは、配列番号２４９〜２６１で特定される。プライマーは、Ｖ及びＪ遺伝子の両方を独自に同定するために適切な情報が増幅された配列内に存在する様に設計されている（Ｖ遺伝子組換えシグナル配列（ＲＳＳ）の上流の配列の＞４０塩基対、及びＪ遺伝子ＲＳＳの下流の＞３０塩基対）。別のプライマーは、各ＴＣＲサブユニットの遺伝子のＶ及びＪ領域から当業者が選択することができる。
順方向プライマーは、５’末端で、ＤＮＡシーケンサーに適合性であるユニバーサル順方向プライマー配列（表１のＸｎ）で修飾される。同様に、逆プライマーの全ては、ユニバーサル逆プライマー配列（表２のＹｍ）で修飾される。そのようなユニバーサルプライマーの一例を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＧＡＩＩシングルエンドリードシーケンシングシステムについて、表３及び４に示す。４５のＴＣＲ Ｖβ順方向プライマーはＶβセグメント間の比較的強力な配列保存の領域中のＶβセグメントにアニールし、したがって、これらのプライマー間の配列の保存を最大にする。
Figure 0006125578
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このシステムを用いた再構成ＴＣＲβＣＤＲ３領域の全ＰＣＲ産物は、約２００ｂｐの長さであることが予想される。ゲノムテンプレートは、４５のＴＣＲ Ｖβ Ｆプライマーのプール（「ＶＦプール」）及び１２のＴＣＲ Ｊβ Ｒプライマーのプール（「ＪＲプール」）を用いてＰＣＲ増幅される。例えば、５０μｌのＰＣＲ反応を、１．０μＭのＶＦプール（それぞれの独自のＴＣＲ Ｖβ Ｆプライマーについて２２ｎＭ）、１．０μＭのＪＲプール（それぞれの独自のＴＣＲＢＪＲプライマーについて７７ｎＭ）、１ＸＱＩＡＧＥＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＰＣＲマスターミックス（ＱＩＡＧＥＮ品番２０６１４５）、１０％のＱ溶液（ＱＩＡＧＥＮ）、及び１６ｎｇ／ｕｌのｇＤＮＡとともに用いることができる。
ＩＧＨプライマーセットを、ナイーブＢ細胞の最初の刺激後に観察されるように、再構成ＩＧＨ遺伝子内の体細胞超変異の可能性を調節することを試みるように設計した。その結果として、全てのプライマーは、通常よりも若干長くなり、そして機能的体細胞突然変異及び非機能的体細胞突然変異の両方に対して耐性である３以上のヌクレオチドの高度に保存された配列中に各プライマーの３’末端を固定するように設計された。
ＩＧＨＪ逆プライマーは、ＩＧＨＪセグメント内の高度に保存されたＧＧＧＧ配列モチーフ上に各ＰＣＲプライマーの３’末端を固定するように設計された。これらの配列を表５に示す。下線を施した配列は、欠失させることができるＲＳＳからの１０の塩基対である。これらを、バーコードデザインから除外した。太字配列は、ＩＧＨ Ｊ逆ＰＣＲプライマーの逆補体である。イタリック体配列は、Ｊ識別のためのバーコードである（８のバーコードにより、６の遺伝子、及び遺伝子内の２の対立遺伝子が明らかになる）。下線セグメント内のさらなる配列は、更なる対立遺伝子識別を明らかにし得る。
Figure 0006125578
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Ｖプライマーは、２つの保存トリプトファン（Ｗ）コドン間のＦＲ２の保存領域中で設計された。
プライマー配列を、このコドンを保存するすべてのＩＧＨＶファミリーのトリプトファンコドンの３’末端で固定する。これによって、最後の３つのヌクレオチド（トリプトファンのＴＧＧ）が体細胞超変異に対して耐性であると予想される配列上に固定され、各プライマーの６つのヌクレオチドのうち５つの３’アンカーを提供する。上流配列は通常よりもさらに延長され、変性ヌクレオチドを含んで、表７に示されるように、プライマーのアニーリング特性を大幅に変更することなく、超変異により誘発されるミスマッチ（又は密接に関連したＩＧＨ Ｖファミリー間）を可能にする。Ｖ遺伝子セグメントの配列は、配列番号２６２〜４２０である。
Figure 0006125578
熱循環条件は、当業者の方法に従う。例えば、ＰＣＲ Ｅｘｐｒｅｓｓサーマルサイクラー（Ｈｙｂａｉｄ、英国アシュフォード）を用いて、以下の循環条件を用いることができる：９５℃で１５分を１サイクル、９４℃で３０秒、５９℃で３０秒、及び７２℃で１分を２５〜４０サイクル、続いて７２℃で１０分を１サイクル。
シーケンシング
シーケンシングは、増幅されたＤＮＡ分子内の所定の領域にハイブリダイズする１組のシーケンシングオリゴヌクレオチドを用いて行われる。
好ましくは、増幅されたＪ遺伝子セグメントはそれぞれ、ＲＳＳ部位から下流の位置＋１１〜＋１４で独自の４個の塩基タグを有する。したがって、シーケンシングオリゴヌクレオチドは、ＲＳＳ部位の下流の位置＋１１〜＋１４で増幅されたＪβ遺伝子セグメント内の４個の塩基タグに隣接してハイブリダイズする。
例えば、ＴＣＲＢのシーケンシングオリゴヌクレオチドは、この「タグ」のすぐ下流で観察されるコンセンサスヌクレオチドモチーフにアニールして、読み取られた配列の最初の４個の塩基が独自にＪセグメントを同定するように設計することができる（表８）。
Figure 0006125578
読み取られた配列のＪ及びＶセグメントを帰属するために用いられる情報は、増幅された配列内に完全に含まれ、ＰＣＲプライマーの同一性に依存しない。これらのシーケンシングオリゴヌクレオチドは、別のＪセグメントについて特異的なオリゴヌクレオチドによる１つのＪセグメントのシーケンシング反応の雑多なプライミングが、正しいシーケンシングオリゴヌクレオチドからの配列データとちょうど同じヌクレオチドから始まる配列データを生成するように選択された。このように、シーケンシングオリゴヌクレオチドの雑多なアニーリングは、生成した配列データの質に影響を及ぼさなかった。
Ｖセグメントの第２の保存されたシステイン及びＪセグメントの保存されたフェニルアラニン間のヌクレオチドとして定義されるＣＤＲ３領域の平均長さは３５＋／−３であり、したがってＪβセグメントタグから始まる配列は、読み取られた５０塩基対中の完全なＶ−Ｄ−Ｊジャンクションをほぼ常に確保するであろう。
ＴＣＲ βＪ遺伝子セグメントはおよそ５０塩基対の長さである。ミスマッチ配列にまで及び、これとアニールするＰＣＲプライマーは、雑多なプライマーと呼ばれる。多重ＰＣＲとの関連で雑多なプライミングを最小限に抑えるためにシーケンシングオリゴヌクレオチドとの重複を最小限に抑えるように、ＴＣＲ Ｊβ逆ＰＣＲプライマーを設計した。１３のＴＣＲ Ｊβ逆プライマーを、シーケンシングプライマーの重複を最小限にして、コンセンサススプライス部位モチーフの３’末端で固定する。ＴＣＲ Ｊβプライマーは、デフォルトパラメータのもとで、シーケンサープログラムを用いて一定のアニーリング温度を提供する。
シーケンシング反応に関して、ＩＧＨＪシーケンシングプライマーは、表９に示すように保存されたＣＡＧ配列を超えて３ヌクレオチド伸長する。
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シーケンシング結果の迅速な分析のために、当業者はアルゴリズムを開発することができる。好ましい方法は次の通りである。
シーケンシング前にＴＣＲβＣＤＲ３領域を増幅するためにＰＣＲステップを使用することにより、異なるＶβ及びＪβ遺伝子セグメントを利用するＣＤＲ３領域のＰＣＲ増幅の効率の違いによって、配列の推測される相対量に系統的バイアスが潜在的に導入され得る。ＰＣＲ増幅の各サイクルは、潜在的に平均１．５１／１５＝１．０２７の大きさのバイアスを潜在的に導入する。したがって、２５サイクルのＰＣＲは、異なるＣＤＲ３領域配列の相対量に平均１．０２７２５＝１．９５の合計バイアスを導入する。
配列決定された読み取り値を、ＣＤＲ３配列を含むものについてフィルタリングした。シーケンサーデータプロセッシングは、各読み取り値の一次配列におけるエラーを除去するため、及びデータを圧縮するための一連のステップを含む。複雑なフィルターにより、シーケンサーから誤って読み取られた配列の約２０％が除去される。次いで、配列は、１３のＴＣＲＢ Ｊ領域のうちの１つ及び５４のＶ領域のうちの１つの両方と最低６塩基がマッチすることが必要であった。ファージ配列を含む対照レーンにフィルターを適用して、７〜８百万中平均で１つの配列しかこれらのステップを通過しなかった。最後に、最近傍アルゴリズムを用いて、ＰＣＲエラー及びシーケンシングエラーの両方を除くために、密接に関連する配列を統合することによって、データを１つの配列に折りたたんだ。
データを分析して、ＰＣＲ産物中の配列の割合は、血液中のクローン型の真の分布を推定する前の配列データから逆行して誘導されなければならない。本明細書中のデータにおいて所定の回数で観察される各配列について、その配列が特定のサイズのＰＣＲプールからサンプリングされた可能性を推定した。配列決定されたＣＤＲ３領域はＰＣＲ産物の大きなプールからランダムにサンプリングされるので、各配列についての観察数は、ポアソン分布から引き出される。ポアソンパラメータは、ＰＣＲのテンプレートを提供したＴ細胞ゲノムの数にしたがって定量化される。簡単なポアソン混合モデルは、これらのパラメータを推定し、かつ各配列が各分布から引き出されるペアワイズの確率を出す。これは、血液から引き出された各配列の量を再構築する予想最大化法である。
多様性を推定するために、「不可視種」式を使用する。この式を適用するために、独自の適応免疫受容体（例えば、ＴＣＲＢ）クローン型が種の代わりをする。数学的解法により、ＴＣＲβ「種」又はクローン型の総数Ｓについて、シーケンシング実験によりｘｓ個の配列ｓが観察されるとする。観察されないクローン型のすべてについて、ｘｓ＝０であり、各ＴＣＲクローン型は、パラメータλｓでポアソンプロセスにしたがって採血中に「捕捉」される。第１の測定１で、及び第２の測定で配列決定されたＴ細胞ゲノムの数。多数の独自配列が存在するので、積分は合計を意味するであろう。Ｇ（λ）がパラメータλ１，…，λＳの経験分布関数であり、ｎｘがちょうどｘ回配列決定されたクローン型の数であるならば、クローン型の総数、すなわち、多様性Ｅの測定値は次式によって与えられる：
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Ｔ細胞がある任意の供給源（例えば、採血）からサンプリングされる所定の実験に関して、この式を使用して、供給源全体中の種の全多様性を推定する。概念は、各サイズのクローン型のサンプリングされた数は、供給源全体のクローン型の基本的な分布を推定するために十分な情報を含むということである。式を導き出すために、正確な測定が繰り返される場合に予想される新規種の数を推定した。測定を無限回数繰り返すかのような式の範囲。結果は、基本的な供給源集団中の種の予想される数である。Δ（ｔ）の値（第２の測定で観察される新しいクローン型の数）は、好ましくは次式を用いて決定されるはずである：
Figure 0006125578
 （式中、ｍｓｍｔ１及びｍｓｍｔ２は、それぞれ、測定１及び２から得られるクローン型の数である）。１−ｅ−λｔのテイラー展開により、Δ（ｔ）＝Ｅ（ｘ１）ｔ−Ｅ（ｘ２）ｔ２＋Ｅ（ｘ３）ｔ３−・・・が得られ、これは、期待値Ｅ（ｎｘ）を第１の測定における観察された数と置き換えることにより近似することができる。第１の測定で観察された数で使用して、この式は、１．６＊１０５個の新規独自配列が第２の測定で観察されることを予測する。第２の測定の実際の値は、１．８＊１０５個の新規ＴＣＲβ配列であり、このことは、予測により全多様性の妥当な下限が得られたことを意味する。オイラーの変換を用いて、Δ（ｔ）を正規化して、Δ（\）の下限を得る。
疾患を診断するための多様性の測定の使用
以下のとおり、多様性の測定を用いて、疾患又は治療の効果を診断することができる。Ｔ細胞及び／又はＢ細胞受容体レパートリーを、例えば、白血病のための造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）治療後などの様々な時点で測定することができる。多様性の変化及びＴＣＲＢレパートリーの全体的な多様性はどちらも、免疫能を測定するために利用することができる。移植後の予想される免疫再構成率の標準を用いることができる。任意の２つの時点間の多様性の変化率を用いて、治療を積極的に変更することができる。一定の時点での全体的な多様性も重要な手段である。なぜなら、この標準を用いて、異なる患者を比較することができるからである。特に、全体的な多様性は、免疫再構成の臨床的定義と相関しなければならない手段である。この情報を用いて、例えばＨＳＣＴ後に、抗生物質、抗ウイルス薬、及び抗真菌薬の予防的投薬計画を変更することができる。
同種異系造血細胞移植後の免疫再構成の評価は、多様性の変化を測定することによって決定できる。これらの技術はまた、予防接種に対するＴ細胞反応の分析によって測定されるように、年齢とともにどのようにリンパ球多様性が減少するかの分析を拡張する。さらに、本発明の方法は、αβＴ細胞の生成、増殖、及び発生に対して直接的影響を及ぼす治験中の治療薬（例えば、インターロイキン−７（ＩＬ−７））を評価するための手段を提供する。さらに、これらの技術を胸腺Ｔ細胞集団の研究に適用することにより、Ｔ細胞受容体遺伝子再配列並びに胸腺細胞の正及び負の選択の両方のプロセスに関する洞察が得られるであろう。
まだ完全に機能する免疫系を有していないが、母親から伝達された抗体を有する可能性がある新生児は、免疫不全である。新生児は、自身の免疫系が自発的に発生するまでは、多くの疾患に罹りやすく、適応免疫系の本発明者らの測定は、新生児患者に有用であることが判明する可能性が高い。
リンパ球多様性は、先天性又は後天性免疫不全の他の状態において評価することができる。免疫系が機能しないか又は機能しなくなりつつあるＡＩＤＳ患者をモニタリングして、疾患の状態を確定し、かつ免疫能を再構成することを目的とする治療に対する患者の反応を測定することができる。
本発明の方法の別の応用は、提供された臓器を身体が拒絶しないように薬物治療を受けている固形臓器移植レシピエントの診断手段を提供することである。一般的に、これらの患者は免疫低下療法を受けている。宿主の免疫能をモニタリングするで、移植前後を支援する。
放射線又は化学療法薬にさらされた個体は、骨髄移植を受けるか、又は他の方法ではＴ細胞集団の補充を関連する免疫能とともに必要とする。本発明の方法は、骨髄移植片、又はこれらの治療の過程でのリンパ球の再構成を質的および量的に評価するための手段を提供する。
多様性を測定する一方法は、ゲノムＤＮＡの少なくとも２つの試料（好ましくはゲノムＤＮＡの１つの試料が患者由来であり、他の試料が正常な対象由来であるか、或いは、ゲノムＤＮＡの１つの試料が治療的処置前の患者由来であり、他の試料が治療後の患者由来であるか、又はゲノムＤＮＡの２つの試料が治療中の異なる時点の同じ患者由来である）を比較することによる。別の方法は、ゲノムＤＮＡの試料間の多様性の比較に基づいてもよく、例えばこの場合、ヒト患者の免疫能は比較によって評価される。
バイオマーカー
個体間の共有されたＴＣＲ配列は、癌、自己免疫疾患、及び感染症をはじめとする種々の疾患に関する新種の潜在的なバイオマーカーである。これらは、多数のヒト疾患について報告されているパブリックＴ細胞である。Ｔ細胞が、それにより免疫系が急速な細胞分裂によりこれらのバイオマーカーを増幅するクローン増殖の結果であるために、ＴＣＲはバイオマーカーとして有用である。増幅後、ＴＣＲは、標的が小さくても（例えば、初期腫瘍）容易に検出される。多くの場合、Ｔ細胞はさらに疾患の原因となり得、したがって薬物標的を構成し得るので、ＴＣＲもバイオマーカーとして有用である。Ｔ細胞自己相互作用は、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、及び関節リウマチなどの自己免疫に関連するいくつかの疾患において重要な役割を果たすと考えられる。
実施例
実施例１：試料取得、ＰＢＭＣ単離、ＦＡＣＳ分類及びゲノムＤＮＡ抽出
２人の健常な男性ドナー（３５才及び３７才）由来の末梢血試料を、Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＦＨＣＲＣ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄにより承認された書式を用いた書面でのインフォームドコンセント付で得た。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（登録商標）密度勾配分離によって単離した。Ｔリンパ球を、各対象について４区画：ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＯ＋／−及びＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋／−に流動選別した。リンパ球の特性化のために、以下の共役抗ヒト抗体：ＣＤ４ＦＩＴＣ（クローンＭ−Ｔ４６６， Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＣＤ８ＰＥ（クローンＲＰＡ−Ｔ８、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４５ＲＯ ＥＣＤ（クローンＵＣＨＬ−１、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、及びＣＤ４５ＲＯ ＡＰＣ（クローンＵＣＨＬ−１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。全ＰＢＭＣの染色を、抗体の適切な組み合わせを用い、２０分間４℃で実施し、染色された細胞を分析前に一度洗浄した。リンパ球サブセットをＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（登録商標）細胞選別システム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのＦＡＣＳ分類により単離した。データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ Ｉｎｃ．）で分析した。
全ゲノムＤＮＡを、分類された細胞からＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を用いて抽出した。１つのハプロイドゲノムのおよその質量は３ｐｇである。試料各Ｔ細胞区画中の数百万の再構成されたＴＣＲＢをサンプリングするために、６〜２７マイクログラムのテンプレートＤＮＡを各区画から得た（表１０を参照）。
Figure 0006125578
実施例２：仮想Ｔ細胞受容体β鎖スペクトラタイピング
仮想ＴＣＲβ鎖スペクトラタイピングを以下のように実施した。相補性ＤＮＡを分類されたＴ細胞集団から抽出されたＲＮＡから合成し、再構成されたＴＣＲβ鎖ＣＤＲ３領域の多重ＰＣＲ増幅用テンプレートとして使用した。各多重反応は、ＴＣＲβ鎖定常領域に特異的な６−ＦＡＭ標識アンチセンスプライマー、及び２〜５のＴＣＲβ鎖可変（ＴＲＢＶ）遺伝子特異的センスプライマーを含んでいた。２３の機能的Ｖβファミリーすべてを研究した。ＰＣＲ反応は、Ｈｙｂａｉｄ ＰＣＲ Ｅｘｐｒｅｓｓサーマルサイクラー（Ｈｙｂａｉｄ， Ａｓｈｆｏｒｄ， ＵＫ）で、以下のサイクリング条件下で実施した：１サイクルは９５℃で６分間、４０サイクルは９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、そして７２℃で４０秒間、続いて１サイクルは７２℃で１０分間。各反応は、ｃＤＮＡテンプレート、５００μＭのｄＮＴＰ、２ｍＭのＭｇＣｌ２及び１単位のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ緩衝液中ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を２０μｌの最終体積で含んでいた。完了後、ＰＣＲ産物のアリコートを１：５０に希釈し、ＤＮＡアナライザーを用いて分析した。ＤＮＡアナライザーの出力を、既知サイズの標準を含む参考試料の蛍光強度波形と比較することにより、蛍光強度対長さの分布に変換した。
実施例３：ＴＣＲβＣＤＲ３領域の多重ＰＣＲ増幅
ＣＤＲ３ジャンクション領域を操作上、以下のように定義した。ジャンクショは、Ｖ領域の第２の保存システインから始まり、Ｊ領域の保存フェニルアラニンで終わる。観察される配列の逆補体をとり、フランキング領域を翻訳して、ジャンクション境界を規定するアミノ酸を特定した。これらの境界間のヌクレオチドの数は、長さを決定し、したがってＣＤＲ３領域のフレームを決定する。シーケンシング用のテンプレートライブラリを生成するために、多重ＰＣＲシステムを選択して、ゲノムＤＮＡから再配列されたＴＣＲβ座を増幅した。多重システムは、それぞれが機能的ＴＣＲ Ｖβセグメントに対して特異的である４５の順方向プライマー（表３）、及びそれぞれがＴＣＲ Ｊβセグメントに対して特異的である１３の逆プライマー（表４）を使用する。Ｖ及びＪ遺伝子の両方（Ｖ遺伝子組換えシグナル配列（ＲＳＳ）の上流の配列の＞４０塩基対、及びＪ遺伝子ＲＳＳの下流の＞３０塩基対）を独自に同定するために適切な情報が増幅された配列内に存在するようにプライマーを選択した。
順方向プライマーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＧＡ２クラスターステーション固相ＰＣＲに適合性のユニバーサル順方向プライマー配列を用いて５’末端で修飾した。同様に、逆プライマーのすべてをＧＡ２ユニバーサル逆プライマー配列で修飾する。各順方向プライマーの３’末端を、組換えシグナル配列（ＲＳＳ）に対してＶβセグメント中の位置−４３で固定し、これにより増幅された領域内に独自のＶβタグ配列を提供する。各Ｊβセグメントに対して特異的な１３の逆プライマーを３’イントロン中に固定し、各プライマーの３’末端がイントロン／エクソンジャンクションを交差する。Ｊβセグメントに対して相補性である１３のシーケンシングプライマーは、Ｊβセグメントの増幅された部分に対して相補性であり、したがって生成した最初の数個の塩基が独自のＪβタグ配列を捕捉するように設計された。
平均して、Ｊ欠失は４ｂｐ＋／−２．５ｂｐであり、このことは、１０ヌクレオチドを超えるＪ欠失が配列の１％未満で起こることを意味する。１３の異なるＴＣＲ Ｊβ遺伝子セグメントはそれぞれＲＳＳ部位の下流の位置＋１１〜＋１４で独自の４個の塩基タグを有していた。したがって、シーケンシングオリゴヌクレオチドは、この「タグ」のすぐ下流で観察されるコンセンサスヌクレオチドモチーフとアニールし、したがって読み取られた配列の最初の４個の塩基が独自にＪセグメント（表５）を同定するように設計された
読み取られた配列のＪ及びＶセグメントを帰属するために用いられる情報は、増幅された配列内に完全に含まれ、ＰＣＲプライマーの同一性に依存しない。これらのシーケンシングオリゴヌクレオチドは、別のＪセグメントに対して特異的なオリゴヌクレオチドにより１つのＪセグメントに関するシーケンシング反応の雑多なプライミングが、正しいシーケンシングオリゴヌクレオチドからの配列データとちょうど同じヌクレオチドで始まる配列データを生成するように選択された。このようにして、シーケンシングオリゴヌクレオチドの雑多なアニーリングは、生成した配列データの質に影響を及ぼさなかった。
慣例にしたがってＶセグメントの第２の保存システインとＪセグメントの保存フェニルアラニンとの間のヌクレオチドとして定義されるＣＤＲ３領域の平均長さは３５＋／−３であり、したがってＪβセグメントタグから始まる配列は、読み取られた５０ｂｐ中にほぼ常に完全ＶＮＤＮＪジャンクションを確保する。
ＴＣＲ βＪ遺伝子セグメントはほぼ５０ｂｐの長さである。ミスマッチ配列まで及び、これとアニールするＰＣＲプライマーは雑多なプライマーと呼ばれる。多重ＰＣＲに関連し、特に遺伝子ファミリーに関連した雑多なプライミングの危険性のために、ＴＣＲ Ｊβ逆ＰＣＲプライマーは、シーケンシングオリゴヌクレオチドとの重複を最小限に抑えるように設計された。したがって、１３のＴＣＲ Ｊβ逆プライマーは、コンセンサススプライス部位モチーフの３’末端で固定され、シーケンシングプライマーの重複は最小である。ＴＣＲ Ｊβプライマーは、デフォルトパラメータのもとでＯｌｉｇｏＣａｌｃプログラムを使用して（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂａｓｉｃ．ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ．ｅｄｕ／ｂｉｏｔｏｏｌｓ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ｈｔｍｌ）、一貫したアニーリング温度（５０ｍＭの塩中５８度）について設計された。
ＴＣＲ Ｖβ順方向プライマーは、２つの明確な目的のために、Ｖβセグメント間の比較的強い配列保存の領域においてＶβセグメントにアニールするように設計された。まず、これらのプライマー間の配列の保存を最大にすることにより、各プライマーの差次的アニーリング特性の可能性が最小限に抑えられる。第２に、プライマーは、Ｖ及びＪプライマー間の増幅された領域が、使用される特定のＶβ遺伝子セグメントを特定するために十分なＴＣＲ Ｖβ配列情報を含むように選択された。このことは、ＴＣＲ Ｖβプライマーによる雑多なプライミングの場合に、誤ったＴＣＲ Ｖβ遺伝子セグメント帰属の危険性を防止する。ＴＣＲ Ｖβ順方向プライマーは、ＴＣＲβ座におけるすべての既知非偽遺伝子について設計された。
このシステムを用いてうまく再構成されたＴＣＲβ ＣＤＲ３領域の全ＰＣＲ産物は、約２００ｂｐの長さであることが予想される。ゲノムテンプレートは、４５のＴＣＲ Ｖβ Ｆプライマーの等モル濃度のプール（「ＶＦプール」）及び１３のＴＣＲ Ｊβ Ｒプライマーの等モル濃度のプール（「ＪＲプール」）を用いてＰＣＲ増幅された。５０μｌのＰＣＲ反応を、１．０μＭのＶＦプール（各独自のＴＣＲ Ｖβ Ｆプライマーについて２２ｎＭ）、１．０μＭのＪＲプール（各独自のＴＣＲＢＪＲプライマーについて７７ｎＭ）、１Ｘ ＱＩＡＧＥＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＰＣＲマスターミックス（ＱＩＡＧＥＮ品番２０６１４５）、１０％のＱ溶液（ＱＩＡＧＥＮ）、及び１６ｎｇ／ｕｌのｇＤＮＡで準備した。以下の熱循環条件を、ＰＣＲ Ｅｘｐｒｅｓｓサーマルサイクラー（Ｈｙｂａｉｄ、英国アシュフォード）中、以下のサイクリング条件下で使用した：１サイクルは９５℃で１５分間、２５〜４０サイクルは９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間そして７２℃で１分間、続いて１サイクルは７２℃で１０分間。数十万〜数百万の再構成されたＴＣＲβ ＣＤＲ３座をサンプリングするために、１２〜２０ウェルのＰＣＲを各ライブラリについて実施した。
実施例４：配列データのプレプロセッシング
シーケンサーデータプロセッシングは、各読み取り値の一次配列におけるエラーを除去するため、及びデータを圧縮するための一連のステップを含む。まず、複雑なフィルターは、シーケンサーから誤って読み取られた配列の約２０％を除去する。次いで、配列は、１３のＪ領域のうちの１つ及び５４のＶ領域のうちの１つの両方とマッチする最低６個の塩基を有することが必要とされた。フィルターを、ファージ配列を含む対照レーンに適用すると、７〜８百万中平均して１つの配列（偽陽性なし）しかステップを通過しなかった。最後に、最近傍アルゴリズムを使用して、ＰＣＲエラー及びシーケンシングエラーの両方を除去するために、密接に関連する配列を統合することによって、データを１つの配列に折り畳んだ（表１０を参照）。
実施例５：ＰＣＲプール及び血液試料中の相対的ＣＤＲ３配列量の推定
データを折り畳んだ後、再構築する血液中のＴ細胞配列の基本分布は、配列データから誘導された。手順は３つのステップ；１）末梢血から採取されたＴ細胞の流動選別、２）ＰＣＲ増幅、及び３）シーケンシングを使用した。データを分析すると、ＰＣＲ産物中の配列の割合は、血液中のクローン型の真の分布を推定する前の配列データから逆行して誘導しなければならない。
本明細書中のデータで所定の回数観察される各配列について、その配列が特定のサイズのＰＣＲプールからサンプリングされた確率を推定する。配列決定されたＣＤＲ３領域は、ＰＣＲ産物の大きなプールからランダムにサンプリングされるので、各配列についての観察数は、ポアソン分布から導き出される。ポアソンパラメータを、ＰＣＲのテンプレートを提供したＴ細胞ゲノムの数にしたがって定量化する。簡単なポアソン混合モデルは、これらのパラメータを推定し、かつ各配列が各分布から引き出されるペアごとの可能性をだす。これは、血液から引き出された各配列の度数を再構築する期待値最大化法である。
実施例６：真の多様性を推定するための不可視種のモデル
混合モデルは、血液から引き出された各ＴＣＲβ ＣＤＲ３種の頻度を再構築できるが、更に大きな問題は、どれほど多くの独自のＣＤＲ３種がドナー中に存在するか？である。これは、利用可能な試料が各ドナー中に限定されるので、回答を必要とする基本的な問題であり、これらの技術は、治療を受けている患者から適度に採取できるより少ない量の血液に推定されるので、将来更に重要になるであろう。
数学的解法は、ＴＣＲβ「種」又はクローン型の総数Ｓについて、シーケンシング実験ではｘｓ個の配列ｓが観察されるとする。観察されないクローン型の全てについて、ｘｓ＝０であり、各ＴＣＲクローン型は、パラメータλｓでポアソンプロセスにしたがって採血中に「確保」される。最初の測定１で、及び第２の測定で配列決定されたＴ細胞ゲノムの数。多数の独自の配列が存在するので、積分は合計である。Ｇ（λ）がパラメータλ１、…、λＳの経験分布関数であり、ｎｘがちょうどｘ回配列決定されたクローン型の数であるならば、
Figure 0006125578
 である。
Δ（ｔ）値は、第２のシーケンシング実験で観察される新規クローン型の数である
Figure 0006125578
１−ｅ−λｔのテイラー展開により、Δ（ｔ）＝Ｅ（ｘ１）ｔ−Ｅ（ｘ２）ｔ２＋Ｅ（ｘ３）ｔ３−…が得られ、これは期待値（Ｅ（ｎｘ））を第１の測定で観察される数で置き換えることによって近似することができる。第１の測定で観察される数で用いて、この式は、１．６＊１０５の新規独自配列が第２の測定で観察されることを予測する。第２の測定の実際の値は１．８＊１０５の新規ＴＣＲβ配列であり、これは、予測により全多様性の有効な下限が提供されたことを意味する。オイラー変換を使用して、Δ（ｔ）を正規化して、Δ（\）の下限を得た。
実施例７：エラー訂正及びバイアス評価
一次配列データ中の配列エラーは、主に２つの起源：（１）ＴＣＲβ ＣＤＲ３テンプレート配列のＰＣＲによる増幅中に起こるヌクレオチド誤取り込み、及び（２）ＣＤＲ３配列のＰＣＲ増幅されたライブラリのシーケンシング中に導入されたベースコール中のエラーに由来する。多量のデータにより、本発明者等は直接エラー訂正コードを実施して、これらの２つの起源に起因する一次配列データ中のエラーの大部分を修正することが可能になる。エラー訂正後、独自のフレーム内ＣＤＲ３配列の数及び各独自配列の観察数を、２人のドナーからの４つの流動選別されたＴ細胞集団のそれぞれについて表にした。４つのフローサイトメトリーで規定された集団におけるＣＤＲ３配列の相対的度数分布は、抗原に出会ったＣＤ４５ＲＯ＋集団がＣＤ４５ＲＯ−集団よりも高い相対的頻度で有意により多くの独自ＣＤＲ３配列を含んでいたことを証明した。ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ４５ＲＯの発現により区別され、血液中に存在する４つの異なる細胞サブセットにおいて観察されるＴＣＲβ ＣＤＲ３配列の度数ヒストグラムは、１０の独自の配列がＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋（抗原経験）Ｔ細胞試料中でそれぞれ２００回観察されることを示し、これはＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ-集団で観察されるものの２倍を越える頻度であった。
シーケンシング前にＴＣＲβ ＣＤＲ３領域を増幅するためのＰＣＲステップの使用は、異なるＶβ及びＪβ遺伝子セグメントを利用するＣＤＲ３領域のＰＣＲ増幅の有効性の差のために、配列の推測される相対量に系統的バイアスを潜在的に導入する可能性がある。任意のそのようなバイアスの大きさを推定するために、約３０，０００の独自ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔリンパ球ゲノムの試料からのＴＣＲβ ＣＤＲ３領域を２５サイクルのＰＣＲにより増幅し、この時点で、ＰＣＲ産物を半分に分けた。半分をとっておき、ＰＣＲ産物のもう半分をさらに１５サイクルのＰＣＲ、合計４０サイクルで増幅した。２５〜４０サイクルで増幅されたＰＣＲ産物を次いで配列決定し、比較した。２５サイクル配列の９５％超も４０サイクル試料で見出され：これらの試料間で配列の頻度を測定する場合、直線的関係が観察される。２５サイクルレーンで所定の回数観察される配列について、ＰＣＲバイアスとサンプリング相違の組み合わせは、４０サイクルでの観察回数の平均付近の分散の原因となる。直線のまわりの平均分散（１．５倍）を全体としてＰＣＲバイアスに保存的に起因するとして、ＰＣＲ増幅の各サイクルは、１．５１／１５＝１．０２７の平均的大きさのバイアスを潜在的に導入する。したがって、２５サイクルのＰＣＲにより、別個のＣＤＲ３領域配列の推定される相対量において、１．０２７２５＝１．９５の平均的大きさの全バイアスが導入される。
実施例８：Ｊβ遺伝子セグメント使用
各ＴＣＲβ鎖中のＣＤＲ３領域は、１３のＪβ遺伝子セグメントのうちの１つ由来の配列を含む。２人のドナー由来の４つの異なるＴ細胞集団におけるＣＤＲ３配列の分析によって、１３の異なるＪβ遺伝子セグメント由来の配列を組み入れた全配列の割合は、２０倍を超えて変動することが証明された。１人のドナー由来の異なるＴフローサイトメトリーにより規定されたＴ細胞間でのＪβ利用は、所定のドナー内で比較的一定であった。さらに、ＧＡを用いて配列決定されたＴ細胞由来のゲノムＤＮＡの分析から推定される２人のドナーで観察されたＪβ利用パターンは、臍帯血及び健常な成人ドナー由来のＴ細胞で観察されるものと定量的に類似し、どちらも綿密なキャピラリーベースの技術を用いて配列決定されたＴ細胞由来のｃＤＮＡの分析から推定された。
実施例９：ヌクレオチド挿入バイアス
ＴＣＲα及びβ鎖中のＣＤＲ３ジャンクションでの多様性の多くは、酵素末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｏｅｔｉｄｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＴｄＴ）による非テンプレートヌクレオチド挿入によって作製される。しかし、インビボでは、選択が予期せず生じるＴＣＲレパートリーの形成において重要な役割を果たす。ＴｄＴヌクレオチド挿入頻度は、選択と無関係に、フレーム外ＴＣＲ配列を用いて計算された。これらの配列は、第２の対立遺伝子が機能的再構成を有するＴ細胞において１つの対立遺伝子に関して実施される非機能的再構成である。ＴｄＴのモノヌクレオチド挿入バイアスはＣ及びＧで優勢である（表１１）。
Figure 0006125578
類似したヌクレオチド頻度がフレーム内配列において観察される（表１２）。
Figure 0006125578
フレーム外ＴＣＲ配列由来のＮ領域を用いて、ジヌクレオチドバイアスを測定した。ジヌクレオチドバイアスの重要でない寄与を分離するために、ジヌクレオチド頻度を２つの塩基のそれぞれのモノヌクレオチド頻度で割った。約数は
Figure 0006125578
 である。
ｍ由来のマトリックスは表１３で見いだされる。
Figure 0006125578
ジヌクレオチドの多くは過小評価又は過大評価される。一例として、ＧＧ対を見出す確率は非常に高い。コドンＧＧＮはグリシンに翻訳されるので、多くのグリシンはＣＤＲ３領域にあることが予想される。
実施例１０：ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸分布
ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３領域におけるアミノ酸の分布は、Ｖ、Ｄ、及びＪ領域の生殖細胞系配列、ＴｄＴの挿入バイアス、及び選択によって形成される。４つの異なる細胞サブコンパートメントについてこの領域におけるアミノ酸の分布は、異なる細胞間で非常に類似している。配列を固定長のβ鎖に分けて、小さい、特別な、及び大きな疎水性、中性極性、酸性及び塩基性の６つの化学的特性によって分類されるアミノ酸間の位置に依存した分布。分布は、特に位置５で酸性塩基の割合が高いＣＤ８＋抗原に出会ったＴ細胞以外は実質的に同一である。
特に興味深いのは、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋ＴＣＲ配列間の比較である。なぜなら、これらはそれぞれクラスＩ及びクラスＩＩのＨＬＡ分子によって提示されるペプチドに結合するからである。ＣＤ８＋抗原に出会ったＴ細胞は酸性アミノ酸の割合が高い小数の位置を有する。これは、ＨＬＡクラスＩ分子で見出される塩基性残基と結合することができるが、クラスＩＩで見出される塩基性残基とは結合できなかった。
実施例１１：様々な人で見出される同じアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖
ＴＣＲβ鎖配列をアミノ酸に翻訳し、次いで２人のドナー間でペアごとに比較した。数千もの完全な配列マッチが観察された。例えば、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ−サブコンパートメントを比較して、ドナー１由来の２５０，０００の独自のアミノ酸配列のうち約８，０００はドナー２と完全にマッチした。アミノ酸レベルでこれらのマッチする配列の多くは、第３のコドン位置で複数のヌクレオチド相違を有する。前記例を受けて、１，５００／８，０００の同じアミノ酸マッチは、＞５のヌクレオチドミスマッチを有していた。２つのＴ細胞サブタイプ間で、独自のＴＣＲβ配列の４〜５％は同じアミノ酸マッチを有することが判明した。
２つの可能性：１）ＴＣＲ発生中の選択が、これらの共通配列を産生すること、及び２）ＴｄＴによるヌクレオチド挿入頻度における大きなバイアスが類似したヌクレオチド配列を作成すること、について調べた。フレーム内ペアワイズのマッチを、フレーム外ペアワイズマッチと比較した（前記実施例１〜４を参照）。フレームの変更は遺伝子コードの特性の全てを保存し、したがって配列バイアスが全ての観察結果の原因であるならば、同じ数のマッチが見つかるはずである。しかし、フレーム外マッチのほぼ２倍のフレーム内マッチが見出され、このことは、タンパク質レベルでの選択が重要な役割を果たすことを示唆する。
数千もの同じＴＣＲβ鎖アミノ酸配列のこの知見を確認するために、２人のドナーを第３のドナー（４４才のＣＭＶ＋白人女性）由来のＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋（ナイーブ様）ＴＣＲに関して比較した。第３のドナーと、もとの２人のドナーのそれぞれとの間で、アミノ酸レベルで数千もの配列の同じペアワイズマッチが見出された。対照的に、４６０の配列が３人のドナー全てで共有されていた。ドナー間の独自配列の総数における大きな変動は、出発物質及びシーケンサーへのローディングの変動の積であって、ドナーの血液における真の多様性における変動をあらわすものではない。
実施例１２：クローン型頻度が高いほど生殖細胞系に近い
全てのＴ細胞サブコンパートメント内の異なる配列間のコピー数の変動は、１０，０００倍を超える範囲であった。コピー数と相関する唯一の特性は（挿入数＋欠失数）であり、これは逆相関する。分析の結果は、欠失が、コピー数との逆相関において挿入よりも果たす役割が小さいことを示した。
挿入及び欠失が少ない配列は、生殖細胞系に近い受容体配列を有する。生殖細胞系により近い配列の数の増大についての１つの可能性は、Ｔ細胞発生中に複数回作成されたものであるということである。生殖細胞系配列は人々の間で共有されるので、共有されるＴＣＲβ鎖は、少数の挿入及び欠失を有するＴＣＲによって作成される可能性が高い。
実施例１３：Ｖ遺伝子セグメント利用及びＣＤＲ３長さによるＴＣＲβＣＤＲ３配列の「スペクトラタイプ」分析
ＴＣＲ多様性は、一般的に、ＴＣＲスペクトラタイピング技術を用いて評価され、このＴＣＲスペクトラタイピング技術は、ＴＣＲＣＤＲ３多様性を配列レベルで評価しないが、同じＶα又はＶβ遺伝子セグメントを使用するαβＴ細胞のサブセットにおけるｍＲＮＡとして表されるＴＣＲα又はＴＣＲβＣＤＲ３長さの多様性を評価するＲＴ−ＰＣＲに基づく技術である。臍帯血又は健常な若年成人の末梢血においてみられるようなＴＣＲＣＤＲ３配列の多様なレパートリーを有するポリクローナルＴ細胞集団のスペクトラタイプは、３つのヌクレオチドの倍数である８〜１０の異なる長さのＣＤＲ３配列を含み、これはフレーム内転写物の選択を反映する。スペクトラタイピングは、それぞれの特定の長さを有するＣＤＲ３配列の相対的頻度についてのおおまかな量的情報も提供する。シーケンサーを用いてＴ細胞ゲノムＤＮＡ由来のＴＣＲβＣＤＲ３領域の直接シーケンシングが、スペクトラタイピングによって同定されるＣＤＲ３長さ多様性の全てを忠実に確保できるかどうかを判断するために、「仮想」ＴＣＲβスペクトラタイプ（前記実施例を参照）を配列データから生成させ、通常のＰＣＲ技術を用いて生成させたＴＣＲβスペクトラタイプと比較した。仮想スペクトラタイプは、通常のスペクトラタイプにおいて存在するＣＤＲ３長さ及び相対的頻度情報の全てを含んでいた。直接ＴＣＲβＣＤＲ３シーケンシングは、通常のスペクトラタイプにおいて存在するＴＣＲ多様性情報の全てを取得する。標準的ＴＣＲβスペクトラタイプデータと、代表的ＴＣＲＶβ遺伝子セグメントを利用し、ドナー１由来のＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋細胞中に存在する配列に関して計算されたＴＣＲβＣＤＲ３長さ分布の比較。配列データ中に含まれる情報を、各Ｖβファミリー内で異なる長さを有する独自ＣＤＲ３配列の頻度ヒストグラムで表すことにより、スペクトラタイプデータに含まれる情報の全てを容易に再現する。加えて、仮想スペクトラタイプは、従来のＰＣＲベースのスペクトラタイピングにより検出されなかった、非常に短いＣＤＲ３長さ及び非常に長いＣＤＲ３長さの両方を有する希少ＣＤＲ３配列の各Ｖβファミリー内の存在を明らかにした。
実施例１４：全体的なＣＤＲ３配列多様性の推定
エラー訂正後、シーケンサーフローセルの各レーンで観察される独自ＣＤＲ３配列の数は、通常、１×１０５を上回った。各レーンで配列決定されたＰＣＲ産物が２人のドナーのそれぞれにおいて存在するわずかなＴ細胞ゲノムから必然的に誘導されたと仮定すると、各個人の全Ｔ細胞レパートリーにおける独自ＴＣＲβＣＤＲ３配列の総数は、はるかに高くなる可能性が高い。全レパートリー中の独自配列の数を推定することは、したがって、血液中に存在するが、試料中で観察されないさらなる独自ＣＤＲ３配列の数を推定することを必要とする。有限試料中に存在する種多様性の測定を用いて、大きく複雑な集団における全体的な種多様性を推定することは、「不可視種の問題」と歴史的に呼ばれている（前記実施例を参照）。解決案は、実験を繰り返すと、すなわち末梢血Ｔ細胞の同じ試料、例えばシーケンサーフローセルの異なるレーンにおけるＴＣＲβＣＤＲ３ＰＣＲ産物の同じように調製されたライブラリに関してシーケンシングが繰り返される場合に観察される、新規種、又はＴＣＲβＣＤＲ３配列の数を測定し、新規ＣＤＲ３配列の数を数えることから始める。ドナー２由来のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＯ-細胞に関して、第２レーンで予想され、観察される新規ＣＤＲ３配列の数は５％以内（前記実施例を参照）であり、このことは、この分析的解決法を実際に用いて、全レパートリー中の独自ＴＣＲβＣＤＲ３配列の総数を推定することができることを示唆する。
４つのフローサイトメトリーにより規定されたＴ細胞区画中の独自のＴＣＲβＣＤＲ３配列の総数の結果としての推定値を表１４に示す。
Figure 0006125578
注目すべきことは、これらの集団における全ＴＣＲβ多様性が、末梢血中の３〜４百万の独自配列間にあることである。驚くべきことに、ＣＤ４５ＲＯ＋、又は抗原と出会った区画は約１５０万のこれらの配列を構成する。これは、予想されるよりも少なくとも一桁大きい。この矛盾は、ディープシーケンシングによってのみ検出できる、低い相対的頻度で観察される多数のこれらの配列に起因する可能性が高い。２人のドナーにおける各区画の推定されるＴＣＲβＣＤＲ３レパートリーサイズは互いに２０％以内である。
本明細書中の結果は、実現されたＴＣＲβ受容体多様性が、事前の推定値よりも少なくとも５倍高いことを示し（〜４＊１０６の別個のＣＤＲ３配列）、特に、ＣＤ４５ＲＯ＋抗原経験αβＴ細胞間で、以前に報告されている（〜１．５＊１０６の別個のＣＤＲ３配列）よりもはるかに大きなＴＣＲβ多様性を示唆する。しかし、ＴＣＲ配列データの生物情報科学分析により、モノヌクレオチド及びジヌクレオチド含有量において強力なバイアスが示され、このことは、使用されるＴＣＲ配列が、理論的サイズよりもはるかに小さな分布からサンプリングされることを意味する。高度に圧縮された配列空間からサンプリングされた各人のＴＣＲβ鎖の多様性が大きいので、各人間でＴＣＲ配列プールの重複が予想できる。実際、結果は、完全なアミノ酸マッチを有するＣＤ８＋ナイーブＴＣＲβ鎖の約５％が、３人の異なる個人の各対間で共有されていることを示す。ＴＣＲαプールは、理論的なＴＣＲβ多様性よりも実質的に小さいと以前に測定されているので、これらの結果は、数百〜数千の真性パブリックαβＴＣＲを見出すことができることを示す。

Claims (10)

  1. （ａ）配列番号１〜４５のＶセグメントプライマーまたは配列番号５８〜１０２のＶセグメントプライマーと、
    （ｂ）配列番号４６〜５７および４８３のＪセグメントプライマーまたは配列番号１０３〜１１３、４６８および４８４のＪセグメントプライマーと、
    を含む組成物であって、
    前記Ｖセグメントプライマー及び前記Ｊセグメントプライマーが、多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＴＣＲのＣＤＲ３領域の増幅を可能にする、組成物。
  2. 請求項１に記載の組成物を用いて増幅されたＰＣＲ産物をシーケンスするための組成物であって、配列番号４７０〜４８２のシーケンシングオリゴヌクレオチドを含む組成物。
  3. （ａ）配列番号１〜４５のＶセグメントプライマーまたは配列番号５８〜１０２のＶセグメントプライマー、および
    （ｂ）配列番号４６〜５７および４８３のＪセグメントプライマーまたは配列番号１０３〜１１３、４６８および４８４のＪセグメントプライマー、
    をゲノムＤＮＡの試料と組み合わせて、多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＴＣＲのＣＤＲ３領域を増幅することを含む方法。
  4. 増幅されたＤＮＡ分子をシーケンシングするステップをさらに含む、請求項３記載の方法。
  5. 前記シーケンシングするステップが、前記増幅されたＤＮＡ分子内の所定の領域にハイブリダイズする１組のシーケンシングオリゴヌクレオチドを利用する、請求項４記載の方法。
  6. 前記１組のシーケンシングオリゴヌクレオチドが、配列番号４７０〜４８２のシーケンシングオリゴヌクレオチドを含む、請求項５記載の方法。
  7. 前記増幅されたＤＮＡ分子の間でのＴＣＲのＣＤＲ３配列の全体的な多様性を計算するステップをさらに含む、請求項４記載の方法。
  8. （ａ）配列番号１〜４５のＶセグメントプライマーまたは配列番号５８〜１０２のＶセグメントプライマーと、（ｂ）配列番号４６〜５７および４８３のＪセグメントプライマーまたは配列番号１０３〜１１３、４６８および４８４のＪセグメントプライマーと、を含む、ヒトの対象における免疫不全を診断する方法において使用するための組成物であって、前記方法が、
    （ｉ）前記ヒトの対象由来の第１の試料における再構成されたＴＣＲのＣＤＲ３配列の多様性を測定することであって、
    （ａ）前記組成物を、前記対象から得られたリンパ球由来のＴＣＲのＣＤＲ３領域の再構成された核酸分子を含むゲノムＤＮＡの試料と組み合わせるステップ、
    （ｂ）前記組成物を用いて、前記試料から前記再構成された核酸分子を増幅し、それにより前記試料中のＴＣＲのＣＤＲ３遺伝子の多様性を表す別個の増幅産物をもたらすステップ、
    （ｃ）前記別個の増幅産物をシーケンシングするステップ、および
    （ｄ）前記対象について、前記別個の増幅産物の間でのＴＣＲのＣＤＲ３配列の多様性を計算するステップ
    を含む、測定することと、
    （ｉｉ）前記対象のＴＣＲのＣＤＲ３配列の多様性を、第２の試料から決定されたＴＣＲのＣＤＲ３配列の多様性と比較することと、
    を含む、組成物。
  9. 前記シーケンシングするステップが、前記増幅されたＤＮＡ分子内の所定の領域にハイブリダイズする１組のシーケンシングオリゴヌクレオチドを利用する、請求項８記載の組成物。
  10. 前記１組のシーケンシングオリゴヌクレオチドが、配列番号４７０〜４８２のシーケンシングオリゴヌクレオチドを含む、請求項９記載の組成物。
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