CN1688708A - 检测t细胞增殖的基因序列方法 - Google Patents

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Abstract

本发明指一种可用于检测待测样本中特定超表达T细胞受体V基因的诊断方法。本方法使用一种含有多位点的T细胞受体基因芯片，每个位点都含有固定核酸，与人体T细胞受体V基因群之片段互补。从样本如血液或其他体液中提取出核酸，并加以标记。标记后的核酸同芯片上的T细胞受体基因序列接触，使互补序列进行杂交。在移除未杂交的核酸后，即可鉴别出信号升高的位点，同时也可检测出超表达T细胞受体V基因。本发明还可成为检测待测样本中特定超表达的T细胞受体V基因诊断工具。本发明适用于多发性硬化症、类风湿性关节炎、胰岛素依赖型糖尿病、I型糖尿病、炎症性肠病、牛皮癣、系统性红斑狼疮及节段性肠炎等自体免疫疾病，以及T细胞白血病或T细胞淋巴瘤等与T细胞有关的恶性肿瘤的诊断检测上。

Description

检测T细胞增殖的基因序列方法
                              技术领域
本发明涉及医学诊断与疾病监控。更具体的说，本发明涉及一种检测人体病变的方法，该方法通过检测超表达T细胞受体V基因克隆性的活化与扩增特性，实现诊断疾病的目的。
                              技术背景
能够识别成熟T淋巴细胞表面抗原的受体(以下简称T细胞抗原受体或TCRs)拥有一种类似于免疫球蛋白的结构。因此，这些受体含有α和β糖蛋白链或γ和δ糖蛋白链的异源二聚体结构。
T细胞受体必须具备极大的多样性以适应外界多种多样的抗原。这可通过重组T细胞受体中不同结构区的不同及非连续基因片段的编码而达到。T细胞受体基因区所包含的片段包括V区片段(可变区片段)，多样性D区片段(多样区片段)，J区片段(连接区片段)，以及C区片段(恒定区片段)。在T细胞分化过程中，β和δ位点上的V、D及J片段重组与α和γ位点上的V及J片段重组产生了特异基因。这些特异性重组与双链配对共同产生了重组多样性。此外，还有两种补充机制，即V-D-J或V-J片段的非精确性重组，以及在N区核苷的增加(Davis et al.，Nature 334：395(1988))更加大了重组的多样性。编码T细胞受体(TCR)α与β链的基因分别由Vα、Jα及Cα或Vβ、Jβ、Dβ及Cβ片段重组产生。
根据编码区的序列类似性，对七十多种Vα和Vβ基因片段进行分子定性，可分别划分入29和25个亚科。不同且多样的TCR可产生大量T细胞，可以面对结合在MHC分子上具巨大多样性的短肽。通常认为V(D)J连接处编码的高度可变的互补决定区-3(CDR-3)是直接与抗原多肽结合的位点。TCR多肽的表征正是分析T细胞反应的方法。就这方面来说，CDR-3序列确定了一种独特的TCR克隆型。由此可以预测，体内抗原驱动T细胞扩增将导致循环TCR转录产物的发现以及表征克隆性扩增的单一克隆型多种分离物的发现。
病源T细胞的克隆性活化与扩增是人体多种自体免疫性疾病(包括类风湿性关节炎和多发性硬化症)的免疫学标志。它同时也可见于其他人类疾病的病理状况，如T细胞引起的白血病和淋巴瘤。目前，由于技术所限，要鉴定上述疾病中T细胞的克隆性活化与扩增是非常困难。尤其是，自体免疫性疾病中的自体免疫T细胞只占了所有循环T细胞的一小部分，使得鉴定工作几乎无法进行。
目前市面上有一些诊断方法和/或诊断工具可以用于检测自体免疫疾病包括类风湿性关节炎和多发性硬化症。例如，美国专利申请号5,445,940揭示了一系列可用于检测自体免疫疾病患者的单克隆抗体、其片段及其衍生物，与人体T淋巴细胞中的T细胞受体α链可变区Vα12.1上的一个抗原决定基产生反应作用。这种单克隆抗体在正常人体的外周血液细胞中与大约2％的CD4+T淋巴细胞和大约5％的CD8+T淋巴细胞发生反应。通过与正常个体对比，显示了Vα基因在CD8+外周血液T淋巴细胞的表达增长，来确定所检测个体是否感染自体免疫疾病，尤其是类风湿性关节炎。
另一个例子是一种B细胞与T细胞克隆检验盒，用于多发性硬化症及其他所述的神经学疾病的早期诊断与鉴别中(WO 99/15696)。该专利揭示了B细胞克隆性扩增出现于大多数多发性硬化症患者，以及细胞克隆性扩增可用于该疾病的诊断。
虽然所有T细胞表达一整组的T细胞受体种群，但限制性的克隆性世系使病源性T细胞在体内活化与扩增，导致了病源性T细胞的特定T细胞受体可变(V)基因家族的超表达。检测病源性T细胞的克隆性扩增可以通过鉴定患者血液或其他体液样本中特定V基因的超表达实现。由于病源性T细胞与不同疾病的临床表现及病理特征相关，所以特定V基因超表达的鉴定符合疾病诊断与疾病监控的目的。
Rezvang，et al.，(Blood，44：1063-1069(1999))介绍了TCRBV(T细胞受体β可变区)基因用法以及使用逆转录PCR的CDR-3排列分类。Farace，et al.，(J.Immunology，153：4281(1994))介绍了通过使用一组V基因片段特定亚科的寡核苷酸引物(Vα1-29/Vβ1-24)进行TCR Vα和Vβ基因片段的PCR分析。以传统PCR技术分析TCR，须合成一套特定的V基因引物。每个样本都必须使用TCR Vα和TCR Vβ亚科不同的引物进行分析。由于每对引物对PCR状况(如退火温度)有着不同的效率和需求，所以传统的PCR方法并不适合用于定量检测血液和组织样本中T细胞受体V基因，这些样本中，经克隆性扩增的病源性T细胞种群的V基因常隐含于无关的T细胞中。此外，一个样本须进行多次PCR实验，是一种高度密集型劳动。由此可见，非常需要一种具有高度专一性和灵敏性的检测方法来定量而有效地检测特定T细胞受体v基因的超表达。
                              发明内容
本发明指一种可用于检测待测样本中特定T细胞受体V基因超表达的诊断方法。本方法使用一种含有多位点的T细胞受体基因芯片，芯片上每个位点都含有固定核酸，与人体T细胞受体V基因各种群片段互补。从样本如血液或其他体液中提取出核酸，用信号物质对核酸加以标记。标记后的核酸在互补序列杂交的条件下同芯片上的T细胞受体基因结合。在移除未杂交的核酸后，即可鉴别出带信号的位点，同时也可检测出超表达T细胞受体V基因。
本发明用于诊断自体免疫疾病或与T细胞有关的恶性肿瘤上，适用于多发性硬化症、类风湿性关节炎、胰岛素依赖型糖尿病、I型糖尿病、炎症性肠病、牛皮癣、系统性红斑狼疮及节段性肠炎等自体免疫疾病，同时也适用于白血病或淋巴瘤等与T细胞有密切关系的恶性肿瘤上。
本发明还指可用于检测待测样本中特定T细胞受体V基因超表达的诊断工具。上述样本包括含有多位点芯片的T细胞受体基因序列，每个位点都含有固定核酸，与人体T细胞受体V基因各种群片段互补。
                              附图说明
图1所示为TCR基因芯片膜片结构形式。
图2所示为在SEB刺激下，正常外周血液淋巴细胞上TCRBV基因的检测。
                            具体实施方式
本发明指一种可用于检测患者样本或细胞培养中特定T细胞受体V基因克隆性活化与扩增的方法。本方法使用一种含有多位点的T细胞受体基因芯片，芯片上每个位点都含有固定核酸，与人体T细胞受体V基因各种群片段互补。T细胞受体基因芯片用于测定样本中各种TCR V基因的数量。本发明的目的之一是提供一种鉴别各种T细胞受体V基因的检验系统及方法。
检测待测样本如细胞培养、血液、组织或其他体液中T细胞克隆性扩增和TCR V基因分布，须先从样本中提取出RNAs，制备mRNAs/tRNAs。然后将mRNAs/tRNAs逆转录到cDNAs，用信号生成剂如放射性同位素、生物素、荧光剂或化合光剂等对cDNAs加以标志。再让标记后的cDNAs在互补序列可杂交的条件下与排列在芯片上的T细胞受体基因进行杂交。移除未杂交的核酸后，对芯片进行分析，检测信号升高的位点，这些位点即代表超表达T细胞受体V基因。
不同于其他每次只可以进行一个TCR基因的检测分析方法，如传统PCR、免疫测定法和DNA印迹分析法，本发明利用以基因为基础的TCR芯片，可以在单次杂交化验中分析多个甚至一整套TCR V基因的表达。例如，可以在一个实验中完成对一个涉及25对TCR V基因的单个轨迹的分析。由于无需多个RNA凝胶电泳和人工转化原料，执行基因TCR序列的实验过程比常规方法更为简便。此外，TCR基因结果在同一个序列膜片中显示，使解译更为容易。
制备固定DNAs.
本发明中T细胞受体基因芯片含有多位点的基因片段。每个界定的位点均含有一个与人体T细胞受体TCR V基因种群相对应的特异固定核酸(一个经过特别设计的基因)或其片段或衍生物。首选基因其片段或衍生物对应着人体T细胞受体的29个Vα基因或25个Vβ基因种群。(Wilson，et al.，Immunol.Rev.101：149(1988)；Roman-Roman，Eur J.Immunol，21：927(1991)；Ferradini，Eur J.Immunol.，21：927(1991)).该基因序列可以检测到Vα基因或Vβ基因，还可以通过芯片上的Vα和Vβ基因片段同时检测出Vα和Vβ基因。
序列中的基因，或其片段，或衍生物可通过常规方法制备。
本发明的具体应用之一是通过PCR制备基因或其片段或衍生物。将片段复制到pCR2.1质体中，则可以制备出表达TCRAV、TCRBV及TCRBC的DNA片段和β肌动蛋白基因的DNA重组体。(Ko，et al.，Am.J.Hematol.，57：124-130(1998))；Okeke，et al.，J.Clin.Microbiol.，39：3491-4(2001)；Davis，et al，Clin.Immunol.Immunopathol.，89：35-43(1998)).TCR基因片段可以利用PCR的特定亚科寡核苷酸引物来进行扩增。(Vα1-w29/Vβ1-w24)(Eur.J.Immunol.22：1261-1269(1992)).表1展示了另一个PCR引物扩增实例，即25 TCRBV基因(SEQ ID NOs：1-50)、TCRBC基因(SEQ ID NOs：51 and 52)和β肌动蛋白基因(SEQ ID NOs：53 and 54)的PCR引物扩增。这三个引物皆出于TCRBV和TCRBC的共同范围。V基因种群具有极大的序列同源性。每套引物(SEQ ID NOs：1-50)都经过严谨设计以代表一个特异V基因。每套引物通过PCR用耐热性DNA聚合酶扩增每个TCRBV基因、TCRBC基因和β肌动蛋白基因。PCR产品通过分解变成单个DNAs，并固定于芯片上的界定的位点上。
         表1：25 TCRBV、TCRBC及β肌动蛋白基因的引物
GENE#  GENE SEQUENCE 5’→3’     AMPLICON(bp)
BV1BV2BV3BV4BV5BV6BV7BV8BV9BV10BV11BV12BV13BV14BV15BV16BV17BV18BV19BV20BV21BV22BV23BV24  AAGCACCTGATCACAGCAACT(forward)TAGTTCAGAGTGCAAGTCAGG(reverse)GGTTATCTGTAAGAGTGGAACCTAGGATGGGCACTGGTCACTGTTCGAGATATCTAGTCAAAAGGACGGGTGCTGGCGGACTCCAGAATAAGCAGGGATATCTGTCAACGTTTCAGGGCTCATGTTGCTCACGATCAAAACGAGAGGACAGCAAGCACCAAGGCGCTCACATTCACTCAGGTGTGATCCAATTTCACCCCCGCTCTGTGCGCTGGATCATGGGAATGACAAATAAGAAGTCTTGGCTGCAGGGCGTGTAGGTGCCCCGCCATGAGGTGACAGAGGAGTCCCTGGGTTCTGAGGGCCCAAAATACCTGGTCACACAGCCAGGGAATTGATGTGAAGATTACCTAGACTTCTGGTCAAAGCAGGACTGGATCTCCAAGGTACATTATAGGGACAGGAAAGAAGATCATGTGAGGGCCTGGCAGACTCCAAGACACAAGATCACAGAGACAGGCAGCAGACTCCAGAGTGAGTGAAGACAGGACAGAGCATGACACACAGATGTCTGGGAGGGAGCACCCAAGATACCTCATCACAGTGAGAGGTCTGGTTGGGGCTGGGTCACAAAGACAGGAAAGAGGATTGGGGATGGCAGACTCTAGGGAGTTCCCCAGCCACAGCGTAATACAGTTCTGCAGGCTGCACCTTGTCCCCAAAGTACCTGTTCAGAAGCTGTCGGGTTCTTTTGGGCAGACACCTGGTCAGGAGGAGGTGCCGAATCTCCTCGCACTACCCAGGACATTTGGTCAAAGGAAAACAGTGCCGTGTCTCCCGGTTCGACCCTGGTGCAGCCTGTGGAGGAGGAGCTTCTTAGAACTCCCAGATATAAGATTACAGAGAAACTGGATCTTGAGAGTGGAGTCCACAGATGGGACAGGAAGTGATCGTCCTCCAGCTTTGTGGACCGAAGAGGGAAACAGCCACTCTGCAGCTCCAAGGAGCTCATGTTCCAAGATACCAGGTTACCCAGTTTCAGGCCTGGTGAGCGGATGTC     209229228235217195214239207223224224227242215235244240246223219221207228
 BV25TCRBCβ肌动蛋白基因  AAAACATCTTGTCAGAGGGGAATGAATCCTCAAGCTTCGTAGCCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATGAGAACTGGTACCGGTAGAAGTACTCCGTGTGGATCGGAAAGCCATGCCACTCATC     238496206
TCRBV：T细胞受体β链可变区；TCRBC：T细胞受体β链恒定区。
制备序列芯片
TCR基因区芯片是检测病源性T细胞克隆性扩增与TCR基因分布的有效的研究及诊断工具。每个基因芯片都含有多个位点，利用常规方法，将与特定TCR基因种群相关的各种基因或其片段或衍生物分别固定于特定的位点上。此外，每个芯片包含了pUC6DNA及pUC18 DNA毛坯等负调控和核对的基因(如口肌动蛋白、GAPDH、clophilin及核糖体蛋白质L13a等)。这些核对基因除了起着正面调控的作用外，还可用于序列中信号的标准化，来对比不同序列上的信号。TCR基因序列可以是低密度或高密度设置。最好是采用低密度DNA设置的序列，这样可以提高检验的灵敏度。低密度DNA设置提供了检测与解译结果的简单的化验方法。芯片材料可以是任何可固定核酸的固体材料，包括薄膜片或玻璃片。普通薄膜一般可以是尼龙或硝化纤维等。基因芯片系统可大量制备以供即时或以后使用。
用低密度的TCR基因芯片，仔细挑选出与TCR基因如25Vβ基因种群和29Vα相关的基因，以提供较高的检测灵敏度。表1阐述了用于分析TCR Vβ基因的一套25对引物。
制备样本
T细胞的所有RNAs、mRNAs或净化过的核糖体mRNAs可用常规方法或商业工具从样本如体液(全血、血清或血浆等)或细胞培养中提取。具体来说，在冰冻的PBS里迅速漂洗T细胞，依照使用说明书用TRIzol试剂(Life Technologies，Rockville，MD)分离RNA。用凝胶影象和分光光度计测量分析(OD260/280)确保RNA的质量。然后通过逆转录用dNTP与信号剂如生物素或者荧光、化学或放射性标志剂混合，将RNAs转化为带信号的cDNA探针。
杂交与检测
在适合于互补核酸纤维退火的条件下，将已标志的cDNA探针与固定在芯片上的TCR特异基因片段杂交。然后冲洗序列，去掉未杂交的核酸。通过放射性同位素的放射自显影术或者其他化学、荧光或比色剂等常规方法记录杂交信号的强度，并用光密度计等测量器进行量化分析。
研究与诊断工具
本发明应用于检测患者特定的超表达T细胞受体V基因。所采用样本可以是患者的血液(血浆、血清)、组织(如滑液组织)或其他体液(如滑液)，或骨髓。本发明的具体应用之一是检测自体免疫疾病，如多发性硬化症、类风湿性关节炎、胰岛素依赖型糖尿病(Falta，et.al.Clin.Immunol.，90：340(1999))、炎症性肠病(Saubermann，et al.，Am.J.Physiol.，276：G163(1999))、牛皮癣(Prinz，et al.，Eur.J.Immunol，29：3360(1999))、系统性红斑狼疮(Masuko-Hongo，et al.，J.Clin.Lab.Anal.，12：162(1998))及节段性肠炎((Ogawa，et.al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，240：545(1997))。本发明的另一个具体应用是检测与T细胞有关的恶性肿瘤，如T细胞白血病或T细胞淋巴瘤。
上述两类疾病皆有表现出特定的T细胞受体V基因的升高。
类风湿性关节炎与多发性硬化症都是同T细胞具密切相关的自体免疫疾病。过往研究证明了特定TCR V基因的T细胞在患者中具克隆性扩增。本发明为类风湿性关节炎和多发性硬化症患者的病情检测与监控提供了优越的研究及诊断工具。
类风湿性关节炎是一种关节滑膜受感染的疾病，通常认为是由T细胞引起自体免疫紊乱的结果。例如，对从阳性IL2受体(IL-2R+)滑液T细胞分离出的TCR mRNA进行分析，可以检测出类风湿性关节炎患者滑液组织中具有活性T细胞种群。在类风湿性关节炎患者的滑膜中可以检测出Vβ3、Vβ14和Vβ17T细胞的克隆性活化与扩增(Howell，et al.，Proc.Natl.Acd.Sci.，88：10921-10925(1991))，这些T细胞的出现即象征着类风湿性关节炎。
多发性硬化症是由针对髓磷脂碱性蛋白的T细胞引起的疾病。Wucherpfennig，et al.，Science，248：1016-1019，采用PCR对多发性硬化患者和健康个体的83个T细胞系中TCRβ链的V区域进行了分析。该研究鉴定了Vβ17和Vβ12与MBP结合的两个高表达活性区。
本发明利用特定TCR V基因互补序列的基因芯片，为类风湿性关节炎和多发性硬化症患者提供一种有效的病情检测与监控方法。
本发明还可应用于检测白血病与淋巴瘤患者的克隆性T细胞增殖。变态B细胞和T细胞的克隆性鉴定是诊断淋巴肿瘤的关键。早前，McCarthy et al.(American Journalof Pathology 138：821-828)报导了淋巴肿瘤患者的分析结果，该研究应用传统PCR技术对外周血液、骨髓或组织样本中一连串T细胞增殖进行克隆性分析，TCRβ链基因的部位，进行扩增重排在这些部位中检测出β链等位基因的重排。
本发明还应用于临床表现如骨髓移植中T细胞的分析与监控。分析局部或系统性免疫反应中的T细胞是许多临床表现的重要标记，包括自体免疫如自体移植排斥反应及肿瘤免疫与病毒或细菌引起的超抗原反应。Gorski，et al.(J Immunol，152：5109-5119(1994))采用传统PCR分析骨髓移植成人患者中循环T细胞的复杂性与稳定性。Gorski等人发现骨髓接受者T细胞的复杂性同他们的免疫功能的状态有着密切的关系。以基因为基础的TCR芯片为骨髓移植捐赠者和接受者的T细胞监控提供一套有效的诊断工具。
本发明的另一个具体应用是以上述TCR基因区序列系统为基础，作为一种即用型检测工具提供供即时的使用。这套测试盒中包括了膜片或其它适当芯片材料，芯片上固定了代表各种T细胞V基因群编码的DNA，还包括了用于量化的内控(核封基因)。这套盒可用于检测Vα基因或Vβ基因，还可应用于含有Vα和Vβ基因片段的基因序列同时进行检测。测试盒中还可以根据检验上的需要附上其他所需的溶液。利用患者样本制备mRNA，再与芯片杂交，即可检测TCR V基因分布，并进一步鉴定T细胞克隆性扩增，具有快速精确及高度的特异性与灵敏性等特点。本测试可应用于实验室研究和临床进行人体各种自体免疫疾病及其它疾病的病源性T细胞检测。即用型检测工具可大批量生产。
本发明还包括基因芯片，包含人体T细胞受体与29个Vα基因和25个Vβ基因相对应的基因片段或其衍生物。
以下实例对本发明作进一步阐明，并不对本发明构成任何形式范围的限制。
                                 实例
实施例1.以基因为基础的TCR序列方案
制备尼龙膜片
制备PCR产物
*质体DNA(1ng/μl)前特异引物(BV1-25中的一个，或BC)后特异引物(BV1-25中的一个，或BC)10mM dNTPs10×反应缓冲液(Invitrogen)50mM MgCl2(Invitrogen)5U/μl耐热性DNA聚合酶(Invitrogen)ddH2O总体积     2.0μl0.5μl0.5μl1.0μl5.0μl1.5μl0.25μl39.25μl50.00μl
*质体DNA是TCBRV 1-25、TCRBC或β肌动蛋白基因其中一段DNA片段，由DNA重组体表达。
PCR反应参数(最佳条件)
变质前     95℃×3min
变质退火扩增     94℃×30sec57℃×30sec72℃×30sec 40cycles
扩增     72℃×5min
尼龙膜片上的DNA点样
1.TCR PCR产物(每尼龙膜片10μl)在100℃下经5分钟变质后迅速置于冰块上至少3分钟。每个TCR PCR特异产物转化为90μl2×SSC。
2.将尼龙膜片置于2×SSC中湿润5分钟后，移至吸水装置(Bio-dotTM Apparatus，Bio-rad laboratories)。
3.以3inch Hg真空抽空，在每个孔中放入100μl DNA溶液。完成所有TCRBV组成与核对组的注入后，将膜片放于两个3M滤器间，在80℃温度下烘焙3小时。干膜片室温下保存。
图1展示了芯片膜片的图样形式。每个界定位点都固定了BVl-BV24、β肌动蛋白或PCR 2.1的特定基因。
探针标记与杂交
32P-cDNA探针系统
1.对每个完整RNA样本，将下列原料置于无菌试管中：
完整RNA                             nμl(＜5μg)
Cb515引物(10pmol/μl)             1.0μl
*dNTPmix                            1.0μl
RNase-free H2O                     to 12.5μl
Figure A0380202500132
Cb515是TCRBC的引物，供逆转录制备cDNA用。
*dNTPmix由10mM dATP、dGTP、dTTP、1mM dCTP及10μCi/μl组成
[α]32P-dCTP，于65℃温度下培育样本5分钟后迅速置于冰上。
2.依下列次序加入每一组成成分：
5×RT buffer                        4.0μl
0.1M DTT                            2.0μl
RNase Inhibitor(10U/μl)            1.0μl
将样本在42℃温度下培育2分钟。
3.在每个样本中加入0.5μl(200U/μl)Superscript RNase H-逆转录酶(Invitrogen)，混合后在42℃下培育25分钟。该反应在70℃下进行15分钟后终止。
4.将cDNA探针在95℃温度下加热5分钟变性，然后迅速用冰块冷却至少2分钟。
芯片杂交与检测
1.为每个样本预先加热5ml杂交溶液(6×SSC，5×Denhardt’s，0.5％SDS)至60℃。
2.将剪下的鲑鱼精液DNA(100μg/ml)加热至95℃5分钟进行热变质，然后迅速用冰块冷却至少3分钟。将热变质后的精液DNA加入预先加热的杂交溶液中，最后浓缩为浓度100μg/DNA/ml的溶液，于60℃温度下保存至使用。
3.在含有芯片的杂交试管中加入3ml非电离水湿润TCRBV芯片尼龙膜片。待膜片完全湿润后倒出非电离水。
4.在杂交试管中加入3ml杂交溶液。剩余的2ml杂交溶液依旧于60℃温度下保存至使用。
5.将杂交试管置于一个杂交量筒中。让TCRBV芯片膜片在60℃温度下预先杂交一到两个小时，并以5-10rpm/min的频率不断搅动。
6.将预先杂交溶液导出并丢弃。
7.经过变性的cDNA探针与剩余的2ml杂交溶液预先混合，于60℃温度下杂交一夜，并不断搅动。
8.在杂交试管加入5ml预先加热洗涤溶液(1×SSC，0.1％SDS)将膜片清洗两次，放入60℃的杂交烤箱中培育15分钟，并以30-40rpm/min的频率不断搅动。
9.在杂交试管加入5ml预先加热洗涤溶液(1×SSC，0.1％SDS)将膜片清洗两次，放入60℃的杂交烤箱中培育15分钟，并以30-40rpm/min的频率不断搅动。然后取出膜片，用X线片包装好，置于-80℃的环境下6-24小时，使X线片显像。
实施例2.检测SEBs的TCRBV基因
本实例的目的在于研究TCR基因序列。首先用葡萄球菌肠毒素(SEB)激活外周血液淋巴细胞(PBL)，SEB是刺激大规模T细胞增殖的超抗原。PBL被激活48小时后，用已制备的TCRBV膜片检测TCRBV基因。
如实施例1所述，用特异于TCBRV1-25、TCRBC、β肌动蛋白及pCR2.1的PCR产物点样尼龙膜片。分离出每个样本的完整RNAs，并通过逆转录转化为cDNA探针。此步骤中使用Cb515作为引物，并应用放射性同位素标记的核苷酸膜板混合剂。在此过程中，放射性同位素标记的探针(样本)与TCR BV序列膜片杂交，以检测样本中TCR BV基因的存在。图2展示了刺激正常PBLs的SEB TCR BV基因的检测过程。
在此对本发明，包括制造和使用的方法及过程，作出完整清晰且简明精确的说明，以便所有适用的人员制造和使用。当然，以上所述只是本发明的最佳应用范围，在不背离本权利要求书中所述的发明范围前提下可以作出改变或修正。需要特别指出并清楚声明的是本发明的主旨，以下声明给出了本说明书的结论。

Claims (13)

1.一种检测待测样本中特定T细胞受体V基因超表达的方法，包括：提供一种含有多位点的T细胞受体基因芯片，每个位点都含有固定核酸，与人体T细胞受体V基因各种群片段互补；
从样本提取RNAs；
通过逆转录从RNAs中制备带标记的cDNAs；
在互补序列可以杂交的条件下将上述标志的cDNAs同上述序列接触；
移除未杂交的核酸；并且
与其它位点的信号比较，检测出带信号升高的位点，这些位点代表超表达T细胞受体V基因。
2.根据权利要求书1所述的检测待测样本中特定T细胞受体V基因超表达的方法，其特征在于，V基因是指Vα基因、Vβ基因或兼指两者。
3.权利要求书2中所述的检测待测样本中特定T细胞受体V基因超表达的方法，特征在于，人体T细胞受体Vβ基因各种群是从Vβ1、Vβ2、Vβ3、Vβ4、Vβ5、Vβ6、Vβ7、Vβ8、Vβ9、Vβ10、Vβ11、Vβ12、Vβ13、Vβ14、Vβ15、Vβ16、Vβ17、Vβ18、Vβ19、Vβ20、Vβ21、Vβ22、Vβ23、Vβ24及Vβ25所组成的群体中挑选的。
4.权利要求书2中所述的检测待测样本中特定T细胞受体V基因超表达的方法，其特征在于，人体T细胞受体Vα基因各种群是从Vα1、Vα2、Vα3、Vα4、Vα5、Vα6、Vα7、Vα8、Vα9、Vα10、Vα11、Vα12、Vα13、Vα14、Vα15、Vα16、Vα17、Vα18、Vα19、Vα20、Vα21、Vα22、Vα23、Vα24、Vα25、Vα26、Vα27、Vα28及Vα29所组成的群体中挑选的。
5.根据权利要求书1的所述的检测待测样本中特定T细胞受体V基因超表达的法，其特征在于，所检测的疾病是自体免疫疾病或与T细胞相关的恶性肿瘤。
6.权利要求书5所述的检测待测样本中特定T细胞受体V基因超表达的方法，其特征在于，所述的自体免疫疾病是指多发性硬化症、类风湿性关节炎、胰岛素依赖型糖尿病、I型糖尿病、炎症性肠病、牛皮癣、系统性红斑狼疮或节段性肠炎。
7.权利要求书5所述的检测待测样本中特定T细胞受体V基因超表达的方法，其特征在于，与T细胞相关的恶性肿瘤是指T细胞白血病或T细胞淋巴瘤。
8.根据权利要求书3所述的检测待测样本中特定T细胞受体V基因超表达的方法，其特征在于，所述的固定核酸是使用引物通过聚合酶链反应而制备的，所用引物选自由SEQ ID：NOs.1-50所组成的群体。
9.一种检测待测样本中特定T细胞受体V基因超表达的诊断工具，以T细胞受体基因芯片上含有多个位点，每个位点都含有固定核酸，与人体T细胞受体V基因各种群片段互补。
10.根据权利要求书9所述的检测待测样本中特定T细胞受体V基因超表达的诊断工具，其特征在于，所述芯片还含有带固定核酸的位点，位点上的固定核酸与正常人体T细胞所表达的基因互补。
11.权利要求书9所述的检测待测样本中特定T细胞受体V基因超表达的诊断工具，其特征在于，所述诊断工具所检测的是超表达的Vα基因、Vβ基因或两者。
12.权利要求书9所述的检测待测样本中特定T细胞受体V基因超表达的诊断工具，其特征在于，所述诊断工具含有互补于Vα、Vβ基因或两者的固定核酸。
13.权利要求书10所述的检测待测样本中特定T细胞受体V基因超表达的诊断工具，其特征在于，所述诊断工具中的芯片是指尼龙膜片、硝化纤维或玻璃片。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication