KR20100093562A - 당뇨병의 진단 생체마커 - Google Patents

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Abstract

전기 당뇨병 질병 상태 및 현성 제2형 당뇨병으로 진단된 환자의 PBMC에서 차등 발현되는 유전자 세트의 확인을 위한 방법을 개시하고, 여기서 3 유전자 및 10 유전자 시그너쳐가 환자에서 당뇨병 질병 상태를 정확하게 예측하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 본 출원은 현장 시설에서 환자의 당뇨병 질병 상태의 신속한 진단을 위한 키트를 설명한다.

Description

당뇨병의 진단 생체마커{Diagnostic biomarkers of diabetes}
본 발명은 의료 진단 분야에 관한 것이고, 환자에서 당뇨병 질병 상태의 현장(point-of-care) 진단을 위한 방법 및 키트를 설명한다.
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 그 전체가 본 명세서에 포함된, 2007년 11월 13일 출원된 미국 가특허 출원 제60/987,540호에 기초한 우선권을 주장한다.
당뇨병은 인슐린 생산, 인슐린 작용, 또는 둘 모두의 결함에 의해 발생하는 높은 혈당 수준을 특징으로 하는 일군의 질병이다. 치료하지 않은 상태로 방치하면, 당뇨병은 저혈당증, 케톤산증 또는 고삼투성 비케톤성 혼수의 증상을 포함하여 많은 심각한 단기 합병증을 야기할 수 있다. 장기적으로, 당뇨병은 동맥경화증, 만성 신부전, 망막 손상 (실명 포함), 신경 손상 및 미세혈관 손상 위험의 증가를 야기하는 것으로 알려져 있다.
개발도상국에서 유행병처럼 번지는 당뇨병은 미국의 보건 시스템에 심각한 충격을 가할 것으로 예측된다. 미국 질병 통제 예방 센터 (Center for Disease Control and Prevention)의 최근 연구는 미국에서 새로운 당뇨병 환자의 발생이 지난 10년 동안 거의 2배로 증가하였음을 보여준다. 2007년 현재, 미국에서 적어도 5천 7백만 명의 사람이 전기 당뇨병을 갖는다. 이미 당뇨병에 걸린 거의 2천4백만 명과 합산하면, 미국 인구의 25% 초과의 인구가 상기 질병으로 인한 추가의 합병증의 위험에 노출되어 있다. 미국 당뇨병 협회에 따르면, 2007년도에 미국에서 당뇨병에 따른 추정되는 비용은 미화 1740억 달러에 이르고, 그 중 직접적인 의료 비용은 미화 1160억 달러이다.
당뇨병의 병인은 특성상 여러 요인인 것으로 보이지만, 증가하는 실험 증거는 비만, 특히 복부 비만의 발병이 면역 및 대사 항상성을 붕괴시키고, 궁극적으로 광범한 염증성 반응을 야기함을 제시한다. 이어서, 지방 조직에서 염증성 시토킨, 예를 들어 TNF 알파의 생산은 면역 반응 및 인슐린에 반응하는 세포의 능력을 탈조절한다. 따라서, 순환 면역 세포, 예를 들어 단핵구 및 포식세포의 전사 프로필의 변경 검출은 포도당 불내성(glucose intolerance)의 더 명시적인 징후가 나타나기 전이라도 당뇨병을 진단하고 그의 진행을 모니터링하기 위한 편리한 수단을 제공한다.
이러한 이유로, 당뇨병이 발병할 위험이 있는 환자의 진단 및 모니터링을 위한 신속하고 정확한 진단 분석에 대한 충족되지 않은 요구가 존재한다. 특히, 환자를 조기 발병 당뇨병에 대해 통상적으로 스크리닝하기 위해 현장 시설에서 용이하게 사용될 수 있는 키트 방식의 진단 분석에 대한 충족되지 않은 요구가 존재한다.
전기 당뇨병 및 당뇨병 질병 상태를 진단하는 유전자 시그너쳐(signature) 발현 프로필의 결정을 위한 방법이 설명된다. 또한, 본 발명은 환자의 혈액 샘플 내 유전자 시그너쳐 발현 프로필의 신속한 측정을 위한 시약을 포함하는 진단 키트에 관련된다. 이 키트 방식은 비용 효율적이고, 현장 시설에서 사용하기 편리하다.
한 실시 형태에서, (a) 환자로부터 채취한 시험 샘플을 제공하는 단계, (b) TOP1, CD24 및 STAP1 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 포함하는 유전자 시그너쳐의 유전자 발현 프로필을 측정하는 단계, (c) 유전자 발현 프로필을 유전자 시그너쳐의 진단적 유전자 발현 프로필과 비교하는 단계, (d) 적어도 부분적으로는 유전자 발현 프로필과 진단적 유전자 발현 프로필 사이의 실질적인 일치를 기초로 하여 환자의 당뇨병 질병 상태를 결정하는 단계, (e) 결정을 의료 전문가에게 제시하는 단계를 포함하는, 환자에서 진성 당뇨병(Diabetes Mellitus)을 진단하는 방법이 설명된다.
결정 단계는 유전자 발현 신호의 선형 조합(Linear combination), 선형 회귀 모델, 로지스틱 회귀(Logistic regression) 모델, 선형 판별 분석(LDA) 모델, 최근린(The nearest neighbor) 모델 및 마이크로어레이 예측 분석(PAM)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 알고리즘을 실행하는 컴퓨터 시스템에 의해 실시될 수 있다. 결정 단계는 또한 환자의 대사 질병 프로필의 분석을 포함할 수 있다.
유전자 시그너쳐는 TOP1, CD24 및 STAP1 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 2개의 유전자 또는 3개의 유전자 모두를 포함할 수 있다. 한 실시 형태에서, 유전자 시그너쳐는 TOP1, CD24 및 STAP1 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 및 표 1 또는 표 6에 나열된 유전자들로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다.
환자는 정상 BMI를 가질 수 있다. 당뇨병 질병 상태는 전기 당뇨병 질병 상태 또는 제2형 당뇨병 질병 상태일 수 있다.
시험 샘플은 혈액 샘플이거나, PBMC 또는 CD11c+ 또는 CD11b+ 또는 Emr+ 또는 [CD11b+ CD11c+] 또는 [Emr+ CD11b+] 또는 [Emr+ CD11c+] 또는 [Emr+ CD11b+ CD11c+] 세포 또는 CD14+ 단핵구를 함유하는 시험 샘플일 수 있다.
측정은 실시간 PCR, 면역화학 분석 또는 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화를 포함할 수 있다.
다른 실시 형태에서, (a) 환자로부터 채취한 시험 샘플을 제공하는 단계, (b) TULP4, AA741300, ESCO1, EIF5B, ACTR2, WNK1, COCH, SON, TPR 및 NOG 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 포함하는 유전자 시그너쳐의 유전자 발현 프로필을 측정하는 단계, (c) 유전자 발현 프로필을 유전자 시그너쳐의 진단적 유전자 발현 프로필과 비교하는 단계, (d) 적어도 부분적으로는 유전자 발현 프로필과 진단적 유전자 발현 프로필 사이의 실질적인 일치를 기초로 하여 환자의 당뇨병 질병 상태를 결정하는 단계, (e) 결정을 의료 전문가에게 제시하는 단계를 포함하는, 환자에서 진성 당뇨병을 진단하는 방법이 설명된다.
결정 단계는 유전자 발현 신호의 선형 조합, 선형 회귀 모델, 로지스틱 회귀 모델, 선형 판별 분석(LDA) 모델, 최근린 모델 및 마이크로어레이 예측 분석(PAM)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 알고리즘을 실행하는 컴퓨터 시스템에 의해 실시될 수 있다. 결정 단계는 또한 환자의 대사 질병 프로필의 분석을 포함할 수 있다.
유전자 시그너쳐는 TULP4, AA741300, ESCO1, EIF5B, ACTR2, WNK1, COCH, SON, TPR 및 NOG 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 2개의 유전자 또는 임의의 3개의 유전자를 포함할 수 있다. 한 태양에서, 유전자 시그너쳐는 TULP4, AA741300, ESCO1, EIF5B, ACTR2, WNK1, COCH, SON, TPR 및 NOG 유전자를 포함한다. 한 태양에서, 유전자 시그너쳐는 TULP4, AA741300, ESCO1, EIF5B, ACTR2, WNK1, COCH, SON, TPR 및 NOG 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자 이외에 TOP1, CD24 및 STAP1 유전자를 포함한다. 다른 태양에서, 유전자 시그너쳐는 TULP4, AA741300, ESCO1, EIF5B, ACTR2, WNK1, COCH, SON, TPR 및 NOG 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 및 표 1 또는 표 6에 나열된 유전자들로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 포함한다.
환자는 정상 BMI를 가질 수 있다. 당뇨병 질병 상태는 전기 당뇨병 질병 상태 또는 제2형 당뇨병 질병 상태일 수 있다.
시험 샘플은 혈액 샘플이거나, PBMC 또는 CD11c+ 또는 CD11b+ 또는 Emr+ 또는 [CD11b+ CD11c+] 또는 [Emr+ CD11b+] 또는 [Emr+ CD11c+] 또는 [Emr+ CD11b+ CD11c+] 세포 또는 CD14+ 단핵구를 함유하는 시험 샘플일 수 있다.
측정은 실시간 PCR, 면역화학 분석 또는 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화를 포함할 수 있다.
한 실시 형태에서, (a) 환자로부터 채취한 시험 샘플을 제공하는 단계, (b) TCF7L2 및 CLC 유전자를 포함하는 유전자 시그너쳐의 유전자 발현 프로필을 측정하는 단계, (c) 유전자 발현 프로필을 유전자 시그너쳐의 진단적 유전자 발현 프로필과 비교하는 단계, (d) 적어도 부분적으로는 유전자 발현 프로필과 진단적 유전자 발현 프로필 사이의 실질적인 일치를 기초로 하여 환자의 당뇨병 질병 상태를 결정하는 단계, (e) 결정을 의료 전문가에게 제시하는 단계를 포함하는, 환자에서 진성 당뇨병을 진단하는 방법이 설명된다.
결정 단계는 유전자 발현 신호의 선형 조합, 선형 회귀 모델, 로지스틱 회귀 모델, 선형 판별 분석(LDA) 모델, 최근린 모델 및 마이크로어레이 예측 분석(PAM)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 알고리즘을 실행하는 컴퓨터 시스템에 의해 실시될 수 있다. 결정 단계는 또한 환자의 대사 질병 프로필의 분석을 포함할 수 있다.
유전자 시그너쳐는 TCF7L2 또는 CLC 유전자를 포함할 수 있다. 한 태양에서, 유전자 시그너쳐는 TC7L2 또는 CLC 유전자의 하나 이상의 변이체를 포함한다. 한 태양에서, 유전자 시그너쳐는 TCF7L2 또는 CLC 유전자 및 표 1 또는 표 6에 나열된 유전자들로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 포함한다.
환자는 정상 BMI를 가질 수 있다. 당뇨병 질병 상태는 전기 당뇨병 질병 상태 또는 제2형 당뇨병 질병 상태일 수 있다.
시험 샘플은 혈액 샘플이거나, PBMC 또는 CD11c+ 또는 CD11b+ 또는 Emr+ 또는 [CD11b+ CD11c+] 또는 [Emr+ CD11b+] 또는 [Emr+ CD11c+] 또는 [Emr+ CD11b+ CD11c+] 세포 또는 CD14+ 단핵구를 함유하는 시험 샘플일 수 있다.
측정은 실시간 PCR, 면역화학 분석 또는 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화를 포함할 수 있다.
한 실시 형태에서, (a) 제1 시점에서 환자로부터 채취한 제1 시험 샘플을 제공하는 단계, (b) 제1 시험 샘플에서 TOP1, CD24 및 STAP1 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 포함하는 유전자 시그너쳐의 제1 발현 프로필을 측정하는 단계, (c) 제2 시점에서 환자로부터 채취한 제2 시험 샘플을 제공하는 단계, (d) 제2 시험 샘플에서 유전자 시그너쳐의 제2 발현 프로필을 측정하는 단계, (e) 제1 발현 프로필을 제2 발현 프로필과 비교하는 단계, (f) 적어도 부분적으로는 제1 유전자 발현 프로필과 제2 유전자 발현 프로필 사이의 실질적인 차이를 기초로 하여 환자의 당뇨병 질병 상태의 변화를 결정하는 단계, (g) 결정을 의료 전문가에게 제시하는 단계를 포함하는, 환자의 당뇨병 질병 상태의 변화를 진단하는 방법을 설명한다.
한 태양에서, 결정 단계는 유전자 발현 신호의 선형 조합, 선형 회귀 모델, 로지스틱 회귀 모델, 선형 판별 분석(LDA) 모델, 최근린 모델 및 마이크로어레이 예측 분석(PAM)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 알고리즘을 실행하는 컴퓨터 시스템에 의해 실시될 수 있다. 다른 태양에서, 결정 단계는 또한 환자의 대사 질병 프로필의 분석을 포함한다.
유전자 시그너쳐는 TOP1, CD24 및 STAP1 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 2개의 유전자를 포함할 수 있다. 한 태양에서, 유전자 시그너쳐는 TOP1, CD24 및 STAP1 유전자를 포함한다. 다른 태양에서, 유전자 시그너쳐는 TOP1, CD24 및 STAP1 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 및 표 1 또는 표 6에 나열된 유전자들로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 포함한다.
한 태양에서, 제1 시점과 제2 시점 사이의 기간은 0 내지 2년 또는 1/4 내지 2년 또는 1/2 내지 2년 또는 2 내지 5년, 또는 5 내지 10년 또는 그 이상이다.
당뇨병 질병 상태의 변화는 전기 당뇨병 질병 상태 또는 제2형 당뇨병 질병 상태로의 진행을 나타내는 것일 수 있다. 한 태양에서, 제1 시점에서의 환자는 정상 BMI를 갖는다.
제1 및 제2 시험 샘플은 혈액 샘플일 수 있다. 한 태양에서, 제1 및 제2 시험 샘플은 PBMC 또는 CD11c+ 또는 CD11b+ 또는 Emr+ 또는 [CD11b+ CD11c+] 또는 [Emr+ CD11b+] 또는 [Emr+ CD11c+] 또는 [Emr+ CD11b+ CD11c+] 세포 또는 CD14+ 단핵구를 함유하는 시험 샘플일 수 있다.
측정은 실시간 PCR, 면역화학 분석 또는 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화를 포함할 수 있다.
한 실시 형태에서, (a) 제1 시점에서 환자로부터 채취한 제1 시험 샘플을 제공하는 단계, (b) 제1 시험 샘플에서 TULP4, AA741300, ESCO1, EIF5B, ACTR2, WNK1, COCH, SON, TPR 및 NOG 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 포함하는 유전자 시그너쳐의 제1 발현 프로필을 측정하는 단계, (c) 제2 시점에서 환자로부터 채취한 제2 시험 샘플을 제공하는 단계, (d) 제2 시험 샘플에서 유전자 시그너쳐의 제2 발현 프로필을 측정하는 단계, (e) 제1 발현 프로필을 제2 발현 프로필과 비교하는 단계, (f) 적어도 부분적으로는 제1 유전자 발현 프로필과 제2 유전자 발현 프로필 사이의 실질적인 차이를 기초로 하여 환자의 당뇨병 질병 상태의 변화를 결정하는 단계, (g) 결정을 의료 전문가에게 제시하는 단계를 포함하는, 환자의 당뇨병 질병 상태의 변화를 진단하는 방법을 설명한다.
한 태양에서, 결정 단계는 유전자 발현 신호의 선형 조합, 선형 회귀 모델, 로지스틱 회귀 모델, 선형 판별 분석(LDA) 모델, 최근린 모델 및 마이크로어레이 예측 분석(PAM)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 알고리즘을 실행하는 컴퓨터 시스템에 의해 실시될 수 있다. 다른 태양에서, 결정 단계는 또한 환자의 대사 질병 프로필의 분석을 포함한다.
유전자 시그너쳐는 TULP4, AA741300, ESCO1, EIF5B, ACTR2, WNK1, COCH, SON, TPR 및 NOG 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 2개의 유전자를 포함할 수 있다. 다른 태양에서, 유전자 시그너쳐는 TULP4, AA741300, ESCO1, EIF5B, ACTR2, WNK1, COCH, SON, TPR 및 NOG 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 3개의 유전자를 포함한다. 한 태양에서, 유전자 시그너쳐는 TULP4, AA741300, ESCO1, EIF5B, ACTR2, WNK1, COCH, SON, TPR 및 NOG 유전자를 포함한다. 다른 태양에서, 유전자 시그너쳐는 TULP4, AA741300, ESCO1, EIF5B, ACTR2, WNK1, COCH, SON, TPR 및 NOG 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 및 표 1 또는 표 6에 나열된 유전자들로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 포함한다.
한 태양에서, 제1 시점과 제2 시점 사이의 기간은 0 내지 2년 또는 1/4 내지 2년 또는 1/2 내지 2년 또는 2 내지 5년, 또는 5 내지 10년 또는 그 이상이다.
당뇨병 질병 상태의 변화는 전기 당뇨병 질병 상태 또는 제2형 당뇨병 질병 상태로의 진행을 나타내는 것일 수 있다. 한 태양에서, 제1 시점에서 환자는 정상 BMI를 갖는다.
제1 및 제2 시험 샘플은 혈액 샘플일 수 있다. 한 태양에서, 제1 및 제2 시험 샘플은 PBMC 또는 CD11c+ 또는 CD11b+ 또는 Emr+ 또는 [CD11b+ CD11c+] 또는 [Emr+ CD11b+] 또는 [Emr+ CD11c+] 또는 [Emr+ CD11b+ CD11c+] 세포 또는 CD14+ 단핵구를 함유하는 시험 샘플일 수 있다.
측정은 실시간 PCR, 면역화학 분석 또는 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화를 포함할 수 있다.
다른 실시 형태에서, 평가가 시험 장치를 사용하여 실시되는, 당뇨병에 대한 환자의 감수성을 평가하기 위한 키트가 설명된다. 키트는 (a) 환자로부터 시험 샘플을 수집하기 위한 시약; 및 (b) 환자의 시험 샘플에서 TCF7L2 및 CLC 유전자 또는 그의 변이체를 포함하는 유전자 시그너쳐의 발현 프로필을 측정하기 위한 시약을 포함한다.
단계 (a) 및 단계 (b)의 시약은 복수의 시험에 사용하기에 충분하다. 환자로부터 시험 샘플을 수집하기 위한 시약은 멸균 용기에 포장될 수 있다.
유전자 시그너쳐는 TCF7L2 및 CLC 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 및 표 1 또는 표 6의 유전자 목록으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다.
시험 샘플은 혈액 샘플일 수 있다.
키트는 또한 PBMC의 단리를 위한 시약 또는 CD11c+ 또는 CD11b+ 또는 Emr+ 또는 [CD11b+ CD11c+] 또는 [Emr+ CD11b+] 또는 [Emr+ CD11c+] 또는 [Emr+ CD11b+ CD11c+] 세포의 단리를 위한 시약 또는 CD14+ 단핵구의 단리를 위한 시약을 포함할 수 있다. 유전자 시그너쳐의 발현 프로필을 측정하기 위한 시약은 실시간 PCR 시약, 면역화학 분석 시약 또는 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화를 위한 것일 수 있다.
다른 실시 형태에서, 평가가 시험 장치를 사용하여 실시되는, 당뇨병에 대한 환자의 감수성을 평가하기 위한 키트가 설명된다. 키트는 (a) 환자로부터 시험 샘플을 수집하기 위한 시약; 및 (b) 환자의 시험 샘플에서 TOP1, CD24 및 STAP1 유전자 또는 그의 변이체를 포함하는 유전자 시그너쳐의 발현 프로필을 측정하기 위한 시약을 포함한다.
유전자 시그너쳐는 TOP1, CD24 및 STAP1 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 2개의 유전자를 포함할 수 있다. 다른 태양에서, 유전자 시그너쳐는 TOP1, CD24 및 STAP1 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 포함한다. 다른 태양에서, 유전자 시그너쳐는 TOP1, CD24 및 STAP1 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 및 표 1 또는 표 6의 유전자 목록으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 포함한다.
단계 (a) 및 단계 (b)의 시약은 복수의 시험에 사용하기에 충분하다. 환자로부터 시험 샘플을 수집하기 위한 시약은 멸균 용기에 포장될 수 있다.
시험 샘플은 혈액 샘플일 수 있다.
키트는 또한 PBMC의 단리를 위한 시약 또는 CD11c+ 또는 CD11b+ 또는 Emr+ 또는 [CD11b+ CD11c+] 또는 [Emr+ CD11b+] 또는 [Emr+ CD11c+] 또는 [Emr+ CD11b+ CD11c+] 세포의 단리를 위한 시약 또는 CD14+ 단핵구의 단리를 위한 시약을 포함할 수 있다. 유전자 시그너쳐의 발현 프로필을 측정하기 위한 시약은 실시간 PCR 시약, 면역화학 분석 시약 또는 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화를 위한 것일 수 있다.
다른 실시 형태에서, 평가가 시험 장치를 사용하여 실시되는, 당뇨병에 대한 환자의 감수성을 평가하기 위한 키트가 설명된다. 키트는 (a) 환자로부터 시험 샘플을 수집하기 위한 시약; 및 (b) 환자의 시험 샘플에서 TULP4, AA741300, ESCO1, EIF5B, ACTR2, WNK1, COCH, SON, TPR 및 NOG 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 또는 그의 변이체를 포함하는 유전자 시그너쳐의 발현 프로필을 측정하기 위한 시약을 포함한다.
한 태양에서, 유전자 시그너쳐는 TULP4, AA741300, ESCO1, EIF5B, ACTR2, WNK1, COCH, SON, TPR 및 NOG 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 포함한다. 한 태양에서, 유전자 시그너쳐는 TULP4, AA741300, ESCO1, EIF5B, ACTR2, WNK1, COCH, SON, TPR 및 NOG 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 유전자를 포함한다. 한 태양에서, 유전자 시그너쳐는 TULP4, AA741300, ESCO1, EIF5B, ACTR2, WNK1, COCH, SON, TPR 및 NOG 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 유전자를 포함한다.
단계 (a) 및 단계 (b)의 시약은 복수의 시험에 사용하기에 충분하다. 환자로부터 시험 샘플을 수집하기 위한 시약은 멸균 용기에 포장될 수 있다.
또한, 유전자 시그너쳐는 TULP4, AA741300, ESCO1, EIF5B, ACTR2, WNK1, COCH, SON, TPR 및 NOG 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 및 표 1 또는 표 6의 유전자 목록으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다.
시험 샘플은 혈액 샘플일 수 있다.
키트는 또한 PBMC의 단리를 위한 시약 또는 CD11c+ 또는 CD11b+ 또는 Emr+ 또는 [CD11b+ CD11c+] 또는 [Emr+ CD11b+] 또는 [Emr+ CD11c+] 또는 [Emr+ CD11b+ CD11c+] 세포의 단리를 위한 시약 또는 CD14+ 단핵구의 단리를 위한 시약을 포함할 수 있다. 유전자 시그너쳐의 발현 프로필을 측정하기 위한 시약은 실시간 PCR 시약, 면역화학 분석 시약 또는 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화를 위한 것일 수 있다.
본 발명이 상기 개요에 개시된 실시 형태로 제한되지 않으며, 특허청구범위에 의해 규정되는, 당업자의 기술 범위 내의 변형 및 변경을 포함하고자 의도함을 이해하여야 한다.
상기한 실시 형태는 전기 당뇨병 질병 상태의 조기 진단 및 당뇨병이 발병할 위험이 있거나 이미 당뇨병에 걸린 환자의 모니터링을 위한 신규한 유전자 시그너쳐를 포함하여 많은 이점을 갖는다. 또한, 본 명세서의 개시 내용은 현장 시설의 의료진에 의한 혈액 샘플의 비용 효율적이고 신속한 시험을 위한 시약 및 사용설명서를 포함하는 키트도 설명한다.
<도 1>
도 1은 제1 실시 형태에 따라 OGTT와 비교한 CLC 유전자의 ROC 곡선 분석을 도시한 도면.
<도 2a>
도 2a는 제2 실시 형태에 따라 OGTT와 비교한 TCF7L2 세트 1의 ROC 곡선 분석을 도시한 도면.
<도 2b>
도 2b는 제3 실시 형태에 따라 OGTT 대 FPG와 비교한 TCF7L2 세트 1의 ROC 곡선 분석을 도시한 도면.
<도 3>
도 3은 제4 실시 형태에 따라 CDKN1C 유전자의 ROC 곡선 분석을 도시한 도면.
<도 4a>
도 4a는 제5 실시 형태에 따라 OGTT와 비교한 3-유전자 시그너쳐의 ROC 분석을 도시한 도면.
<도 4b>
도 4b는 제6 실시 형태에 따라 FPG 대 OGTT와 비교한 3-유전자 시그너쳐의 ROC 분석을 도시한 도면.
<도 4c>
도 4c는 제7 실시 형태에 따라 3-유전자 시그너쳐의 평균 발현 막대 차트를 도시한 도면.
<도 5a>
도 5a는 제8 실시 형태에 따라 OGTT와 비교한 10-유전자 시그너쳐의 ROC 분석을 도시한 도면.
<도 5b>
도 5b는 제9 실시 형태에 따라 FPG 대 OGTT와 비교한 10-유전자 시그너쳐의 ROC 분석을 도시한 도면.
<도 5c>
도 5c는 제10 실시 형태에 따라 10-유전자 시그너쳐의 평균 발현 막대 차트를 도시한 도면.
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에게 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 다음 정의는 본 명세서의 개시 내용 및 청구 범위의 해석을 돕기 위해 제공된다. 본 섹션의 정의가 다른 부분에서의 정의와 일치하는 않는 경우에는, 본 섹션에서 제시된 정의가 적용될 것이다.
또한, 본 발명의 실시에서는 달리 명시하지 않으면, 당업계의 기술 범위 내에 있는 통상적인 분자 생물학 및 면역학 기술을 사용할 것이다. 그러한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있고, 문헌에 상세히 설명되어 있다. (예를 들어, 문헌[Colignan, Dunn, Ploegh, Speicher and Wingfield "Current protocols in Protein Science" (1999-2008) Volume I and II] 및 모든 증보판(John Wiley & Sons Inc.); 및 문헌[Bailey, J, E. and Ollis, D. F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986]; 문헌[Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2008)] 및 모든 증보판; 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)]; 및 문헌[Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]). ROC 분석은 문헌["An Introduction to ROC Analysis", Tom Fawcett, Pattern Recognition Letters 27 (2006) 861-874]에 검토되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "진성 당뇨병"은 고농도의 혈당 (고혈당증)을 특징으로 하는 임의의 질병을 의미한다. 진성 당뇨병은 다음 중 임의의 하나를 보일 때 진단된다: 126 ㎎/㎗ (7.0 mmol/l) 이상의 공복 혈장 혈당 수준, 또는 내당능 시험에서와 같이 75 g의 경구 포도당 부하 2시간 후에 200 ㎎/㎗ (11.1 mmol/l) 이상의 혈장 혈당, 또는 고혈당 증상과 200 ㎎/㎗ (11.1 mmol/l) 이상의 수시 혈장 혈당.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 당뇨병은 소아 발현 당뇨병, 연소성 당뇨병 및 인슐린 의존성 당뇨병 (IDDM)으로도 알려진 "제1형 당뇨병" 또는 성인 발현 당뇨병, 비만 관련 당뇨병 및 인슐린 비의존성 당뇨병 (NIDDM)으로도 알려진 "제2형 당뇨병"을 의미하거나, 다른 형태의 당뇨병은 임신성 당뇨병, 인슐린 저항성 제1형 당뇨병 (또는 "이중 당뇨병"), 성인의 잠복성 자가면역 당뇨병 (또는 LADA) 및 30세 이전에 제2형 당뇨병으로 나타나는 강한 가족력이 있는 일군의 여러 단일 유전자 질환인 소아 성인형 당뇨병 (MODY)을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "당뇨병 질병 상태"는 전기 당뇨병 질병 상태, 전기 당뇨병 질병 상태보다 더 진전된 질병 단계를 특징으로 하는 중간형 당뇨병 질병 상태 및 제1형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병을 포함하여 본 명세서에서 규정되는 현성 (overt) 당뇨병에 특유한 질병 상태를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "전기 당뇨병 질병 상태"는 환자가 공복 혈당 장애 및 내당능 장애를 갖는 상태이다. 공복 혈당 장애는 100 내지 125 ㎎/㎗ (6.1 내지 7.0 mmol/l)의 혈당 수준, 즉 악화된 공복 혈당으로서 규정된다. 혈장 혈당이 75 g의 경구 포도당 부하 2시간 후에 140 ㎎/㎗ 또는 7.8 mmol/l 이상이지만 200을 초과하지 않는 환자는 내당능 장애가 있는 것으로 간주된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "의료 전문가"는 현장 시설의 의사 또는 훈련된 의료 기술자 또는 간호사이다.
"현장" 시설은 병원 내와 같은 입원 장소에, 또는 의사 진료실 또는 예약이 필요없는 간이진료소와 같은 외래 진료 장소에 있을 수 있다. 한 실시 형태에서, 진단 분석은 혈액 샘플 내 유전자 시그너쳐 발현 프로필의 분석을 위한 기구와 함께 소비자에게 시판 키트로 공급될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 시판 키트는 혈당 수준의 모니터링을 위한 기구 및 시약과 조합될 수 있다.
용어 "혈당 수준"은 혈당의 농도를 의미한다. 정상 혈당 수준 (정상혈당)은 약 120 ㎎/㎗이다. 이 값의 변동폭은 당뇨병에 걸리지 않은 사람의 경우 30 ㎎/㎗ 정도이다.
"고혈당증" (고혈당)의 상태는 혈당 수준이 너무 높은 상태이다. 대개, 고혈당증은 혈당 수준이 180 ㎎/㎗를 초과하여 상승할 때 일어난다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "시험 샘플"은 당뇨병 질병 상태에 반응하여 유전자를 차등 발현하는 세포를 함유하는, 환자로부터 채취한 임의의 생물학적 샘플이다. 생물학적 샘플은 혈액의 세포 성분, 골수, 혈장, 혈청, 림프, 뇌척수액 또는 다른 분비물, 예를 들어 눈물, 타액, 또는 유즙; 조직 또는 장기 생검 샘플; 또는 배양된 세포를 비롯하여, 아토피 또는 비-아토피 포유동물, 예를 들어 인간으로부터 단리된 임의의 생물학적 물질일 수 있다. 바람직하게는, 생물학적 샘플은 최소의 개입을 통해 환자로부터 수집할 수 있는 세포성 샘플이다. 바람직한 실시 형태에서, 시험 샘플은 혈액 샘플 또는 PBMC (말초 혈액 단핵 세포) 또는 CD14+ 단핵구 또는 CD11b+ 또는 CD11c+ 또는 Emr+ 세포의 제제이다.
포유동물은 인간일 수 있거나, 가축, 반려 또는 동물원 동물일 수 있다. 본 명세서에서 설명되는 진단 도구가 인간의 의료적 치료에 사용하기 적합한 것으로 특히 고려되지만, 상기 진단 도구는 개 및 고양이와 같은 반려 동물 및 말, 소 및 양과 같은 가축, 동물원 동물, 예를 들어 비인간 영장류, 고양이과 동물, 개과 동물, 소과 동물, 및 유제 동물을 포함하여 수의학적 치료에도 적용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자 발현"은 유전자에 코딩된 유전 정보를 유전자 "전사" (예를 들어, RNA 중합효소의 효소 작용을 통해)를 통해 RNA (예를 들어, mRNA, rRNA, tRNA, 또는 snRNA)로, 그리고 단백질 코딩 유전자의 경우, mRNA의 "번역"을 통해 단백질로 전환시키는 과정을 의미한다.
"유전자 발현 프로필"은 생물학적 샘플에서 발현된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 확인된 발현 수준을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프라이머"는 뉴클레오티드 및 핵산 중합을 위한 물질, 예를 들어 DNA 의존성 또는 RNA 의존성 중합효소의 존재 하에 적합한 조건 (예를 들어 버퍼, 염, 온도 및 pH)에 놓이면 핵산 가닥 (주형 또는 표적 서열)에 상보성인 프라이머 연장 생성물의 합성 개시점으로서 기능할 수 있는, 천연 생성되거나 (예를 들어, 제한 단편으로서) 또는 합성 방식으로 생산된 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 프라이머는 중합제의 존재시에 연장 생성물의 합성을 프라이밍할 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 전형적인 프라이머는 표적 서열에 실질적으로 상보성이거나 상동성인, 적어도 약 10개 뉴클레오티드 길이의 서열을 함유하지만, 다소 더 긴 프라이머가 바람직하다. 대체로 프라이머는 약 15-26개의 뉴클레오티드를 함유한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "유전자 시그너쳐"는 생물학적 샘플의 특유한 동정 요소 (identifier)를 제공하는 선택된 유전자 세트의 유전자 발현 패턴을 의미한다. 유전자 시그너쳐는, 선택된 유전자 세트의 유전자 발현 패턴이 당뇨병 질병 상태가 존재하는 환자로부터 채취한 참조 샘플의 유전자 시그너쳐와 실질적으로 일치할 경우에 당뇨병 질병 상태를 진단하도록 하는 것이다. 본 출원의 목적을 위해, "유전자 시그너쳐"는 핵산 또는 폴리펩티드 서열 (유전자가 단백질 코딩 유전자일 경우)의 소정의 조합일 수 있다. 유전자 시그너쳐는 rRNA, UsnRNA, 마이크로 RNA 또는 tRNA를 포함하고 이로 제한되지 않는, 기능이 알려지지 않은 유전자 또는 개방 판독 프레임이 없는 유전자를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "진단적 유전자 발현 프로필"은 특정 질병 상태로 진단된 환자로부터 채취한 생물학적 샘플에서 유전자 시그너쳐의 유전자 발현 프로필을 의미한다. 질병 상태는 당뇨병 질병 상태 또는 비당뇨병 질병 상태일 수 있다. 환자로부터의 시험 유전자 발현 프로필과 당뇨병 질병 상태에 특유한 진단적 유전자 발현 프로필 사이의 "실질적인 일치"는 환자가 당뇨병 질병 상태를 가진 것을 나타낸다. 대안적으로, 환자로부터의 시험 유전자 발현 프로필과 비당뇨병 질병 상태에 특유한 진단적 유전자 발현 프로필 사이의 "실질적인 일치"는 환자가 당뇨병 질병 상태를 갖지 않은 것을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 유전자의 "변이체"는 이들 DNA 서열을 우세한 야생형 유전자의 핵산 서열과 비교할 때 그에 대해 적어도 약 75%, 보다 바람직하게는 적어도 약 85%, 가장 바람직하게는 적어도 90%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 95-99% 동일한 유전자 서열을 의미한다. 한 실시 형태에서, 유전자의 변이체는 DNA 서열에 점 돌연변이 또는 단일 뉴클레오티드 다형성, 결실, 삽입, 재배열, 스플라이스 공여 또는 수용 부위 돌연변이 및 위유전자 (pseudogene)에 특유한 유전자 변경을 포함하고 이로 제한되지 않는 하나 이상의 변경을 가진 유전자이다. 본 명세서 전체에 걸쳐, 유전자는 본 명세서에서 규정되는 유전자의 야생형 및 변이체 형태를 모두 함축적으로 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "실질적인 일치"는 시험 샘플 내의 유전자 시그너쳐의 유전자 발현 프로필과 확정된 질병 상태가 존재하는 환자로부터 채취한 참조 샘플 내의 유전자 시그너쳐의 유전자 발현 프로필의 비교를 나타낸다. 발현 프로필은 시험 샘플과 참조 샘플 내의 유전자 시그너쳐의 발현이 실질적으로 동일한 수준일 때, 즉 샘플의 정규화 후에 샘플들 사이에 통계적으로 유의한 차이가 존재하지 않을 때 "실질적으로 일치한다". 한 실시 형태에서, 실질적으로 일치하는 발현 프로필의 신뢰 구간은 적어도 약 50% 또는 약 50% 내지 약 75% 또는 약 75% 내지 약 80% 또는 약 80% 내지 약 85% 또는 약 85% 내지 약 90% 또는 약 90% 내지 약 95%이다. 바람직한 실시 형태에서, 실질적으로 일치하는 발현 프로필의 신뢰 구간은 약 95% 내지 약 100%이다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 실질적으로 일치하는 발현 프로필의 신뢰 구간은 약 95%와 약 100% 사이의 임의의 수치이다. 다른 바람직한 실시 형태, 실질적으로 일치하는 발현 프로필의 신뢰 구간은 약 95% 또는 약 96% 또는 약 97% 또는 약 98% 또는 약 99%, 또는 약 99.9%이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "실질적인 차이"는 한 시점에서의 유전자의 유전자 발현 프로필과 제2 시점에서의 동일한 유전자 시그너쳐의 유전자 발현 프로필의 차이를 의미한다. 발현 프로필은 제1 시점과 제2 시점에서의 유전자 시그너쳐의 발현이 상이한 수준인 경우, 즉 샘플의 정규화 후에 샘플들 사이에 통계적으로 유의한 차이가 존재하는 경우에 "실질적으로 상이한" 것이다. 한 실시 형태에서, 발현 프로필은 제1 시점과 제2 시점에서의 유전자 시그너쳐의 발현이 계산된 신뢰 구간 밖에 있을 경우 "실질적으로 상이한" 것이다. 한 실시 형태에서, 실질적으로 상이한 발현 프로필의 신뢰 구간은 약 50% 미만 또는 약 75% 미만 또는 약 80% 미만 또는 약 85% 미만 또는 약 90% 미만 또는 약 95% 미만이다.
95% 신뢰 구간 CI는 AUC + 1.96 x AUC의 표준 오차이고, 여기서 AUC는 ROC 곡선 하 면적이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "ROC"는 수용자 반응 특성 (receiver operating characteristic), 또는 간단히 ROC 곡선을 의미하고, 이는 그의 식별 역치 (discrimination threshold)가 변할 때 이진 분류 시스템에 대한 감도 대 (1 - 특이도)의 그래프이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "진단" 또는 "진단하는"은 하나의 당뇨병 질병 상태를 다른 당뇨병 질병 상태와 구분하고/하거나, "정상" 또는 "비당뇨병" (비-아토피) 상태에 비해 당뇨병 질병 상태가 환자에 존재 (아토피)하는지 결정하고/하거나, 당뇨병 질병 상태의 성질을 결정하는 방법을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "당뇨병 질병 상태를 결정하는"은 당뇨병 질병 상태 또는 병태가 존재하는 환자의 진단 및/또는 당뇨병의 분류에 유용한 모든 정보의 통합을 의미한다. 상기 정보는 가족력, 인간 유전학 데이타, BMI, 신체 활동, 대사 질병 프로필 및 환자로부터 채취한 시험 샘플에서 하나 이상의 유전자 시그너쳐의 발현 프로필에 대한 통계학적 분석 결과를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 진료 현장에서, 상기 정보는 적절한 데이타 분석 소프트웨어가 설치된 컴퓨터 시스템에 의해 분석되고 디스플레이된다. 임상 데이타의 통합은 담당의에게 환자가 당뇨병 병태를 갖는지 결정하기 위해 필요한 정보, 당뇨병의 성질 또는 분류에 관련된 정보 및 예후에 관련된 정보 및/또는 적절한 치료법을 선택하는 데 유용한 정보를 제공한다. 한 실시 형태에서, 본 명세서에서 설명되는 진단 분석은 처방된 의료 처치의 효능 판정 수단을 의료 전문가에게 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "대사 질병 프로필"은 공복 혈장 혈당, 인슐린, 프로-인슐린, c-펩티드, 무손상 인슐린, BMI, 허리 둘레, GLP-1, 아디포넥틴, PAI-1, 헤모글로빈 A1c, HDL, LDL, VLDL, 트라이글리세리드, 유리 지방산을 포함하고 이로 제한되지 않는, 당뇨병 질병 상태를 진단하게 해 줄 수 있는 임의의 수의 표준 대사 척도 및 다른 위험 인자를 의미한다. 대사 질병 프로필은 2-hr OGTT와 대등한 우수한 분류 모델을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
내당능 시험은 포도당을 투여하고 이것이 혈액으로부터 얼마나 빨리 소실되는지를 결정하는 것이다. 이 시험은 대체로 당뇨병, 인슐린 저항성 및 때때로 반응성 저혈당증에 대해 검사하기 위해 사용된다. 포도당은 가장 흔히는 경구로 투여되고, 따라서 통상적인 시험은 기술적으로 경구 내당능 시험 (OGTT)이다.
공복 혈장 혈당 시험 (FPG)은 금식 후에 혈장 또는 혈액의 포도당 수준을 측정하는 탄수화물 대사 시험이다. 공복은 호르몬 글루카곤의 방출을 자극하고, 이는 혈장 혈당 수준을 상승시킨다. 당뇨병이 없는 사람에서, 인체는 포도당 수준의 상승을 해소하기 위해 인슐린을 생산하고 처리할 것이다. 당뇨병이 있는 사람에서는 이 과정이 일어나지 않고, 검사된 포도당 수준은 높게 남아있을 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 체질량 지수 (BMI), 또는 퀘틀렛 (Quetelet) 지수는 사람의 체중과 키를 비교하는 통계학적 측정치이다. 측정 및 계산이 용이하기 때문에, 이는 비만을 확인하기 위해 가장 널리 사용되는 진단 도구이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, NGT는 정상 내당능을 의미하고, IGT는 내당능 장애를 의미하고, T2D는 제2형 당뇨병을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, CD11c+, CD11b+ 및 Emr+는 인간 단핵구/포식세포 및 골수 세포 및 그들의 전구 세포의 세포 표면 마커이다. 생쥐에서, 가장 일반적으로 사용되는 단핵구/포식세포 및 골수 세포 표면 마커는 F4/80 및 CD11b이지만, F4/80 및 CD11b 항체는 각각 호산구 및 수지상 세포, 및 NK 및 다른 T 및 B 세포 서브타입과 반응하는 것으로 보고되었다 (문헌[Nguyen, et al. (2007) J Biol Chem 282, 35279-35292]; 문헌[Patsouris, et al. (2008) Cell Metab. 8, 301-309]). 생쥐에서 F4/80 유전자는 인간 Emr1 유전자의 오솔로그 (ortholog)이다. 생쥐 CD11c 유전자의 인간 오솔로그는 ITGAX이며, 이것은 인테그린, 알파 X (보체 성분 3 수용체 4 서브유닛), SLEB6, OTTHUMP00000163299; leu M5, 알파 서브유닛; 백혈구 표면 항원 p150,95, 알파 서브유닛; 골수성 막 항원, 알파 서브유닛; p150 95 인테그린 알파 사슬 (염색체: 16; 위치: 16p11.2; 주석: 염색체 16, NC_000016.8 (31274010..31301819), MIM: 151510, GeneID:3687)로도 불린다. 생쥐 CD11b 유전자의 인간 오솔로그는 ITGAM 또는 인테그린, 알파 M (보체 성분 3 수용체 3 서브유닛)이며, 이것은 CD11B, CR3A, MAC-1, MAC1A, MGC117044, MO1A, SLEB6, 포식세포 항원 알파 폴리펩티드; 호중구 부착 수용체 알파-M 서브유닛 (염색체: 16; 위치: 16p11.2 염색체 16, NC_000016.8 (31178789..31251714), MIM: 120980, GeneID: 3684)으로도 불린다. CD11c+ , CD11b+ 및 Emr+ 및 CD14+ 세포는 적절한 인간 혈액 세포 단리 키트 (스템셀 테크놀로지스 (StemCell Technologies))를 사용하여 양성 선택에 의해 PBMC로부터 정제될 수 있다. 이어서, 단리된 세포 집단의 순도 (>85%)는 적절한 세포 표면 마커 (바이오레전드 (BioLegend))에 대한 형광-컨쥬게이팅된 항체의 유동 세포측정 염색에 의해 확인된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "실시간 PCR"은 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 (Q-PCR/qPCR) 또는 동적 (kinetic) 중합효소 연쇄 반응으로도 불리는 실시간 중합효소 연쇄 반응을 의미한다. 실시간 PCR은 표적화된 DNA 분자를 증폭시키고 동시에 정량하기 위해 사용되는 중합효소 연쇄 반응에 기반한 실험 기술이다. 이를 통해, DNA 샘플에서 특정 서열의 검출 및 정량 (절대적인 카피 수, 또는 DNA 투입량 또는 추가의 정규화 유전자에 대해 정규화된 경우 상대량으로서)을 수행할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 면역화학 분석은 항원에 대한 항체(들)의 반응을 이용하여 세포 추출물 내의 어떤 물질의 농도를 측정하는 생화학적 시험이다. 본 명세서의 개시 내용에서, 항원은 유전자 시그너쳐를 구성하는 단백질 코딩 유전자들 중 어느 하나에 의해 발현된 단백질이다. 바람직한 실시 형태에서, 면역화학 분석은 효소 연결 면역흡착 분석 (ELISA)이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화"는 고체 지지체, 예를 들어 칩 상의 프로브 서열과 환자의 시험 샘플 내의 전사체로부터 생성된 cDNA 서열 사이의 혼성화를 의미한다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 상보적이면, 시험 샘플 내의 cDNA 서열의 양에 정비례하는 혼성화가 일어난다. 이어서, 혼성화의 검출은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 달성한다. 많은 요인이 2개의 핵산, 예를 들어 어레이 상의 핵산 멤버의 표적 핵산 서열에 대한 혼성화의 효율 및 선택성에 영향을 끼친다. 이들 요인은 핵산 멤버 길이, 뉴클레오티드 서열 및/또는 조성, 혼성화 온도, 버퍼 조성 및 핵산 멤버의 혼성화가 요구되는 구역의 입체 방해 가능성을 포함한다. 핵산 멤버 길이와, 핵산 멤버가 표적 서열에 혼성화하는 효율 및 정확성 사이에 양의 상관관계가 존재한다. 특히, 서열이 길수록 짧은 서열보다 용융 온도 (TM)가 더 높고, 주어진 표적 서열 내에서 반복될 가능성이 작아 무차별적인 혼성화가 최소화된다. 혼성화 온도는 핵산 멤버 어닐링 (annealing) 효율과 반비례하며, 이것은 혼성화 혼합물에 포함될 수 있는 유기 용매, 예를 들어 포름아미드의 농도도 마찬가지이나, 염 농도의 증가는 결합을 촉진한다. 엄격한 어닐링 조건 하에서, 긴 핵산은, 보다 허용성인 조건 하에서라면 충분한 길이인 짧은 핵산보다 더 효율적으로 혼성화한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 모두 포함하고; 무손상 분자, 그의 단편 (예를 들어 Fv, Fd, Fab, Fab' 및 F(ab)'2 단편), 또는 무손상 분자 및/또는 단편의 다량체 또는 응집체일 수 있고; 천연 생성되거나 또는 예를 들어 면역화, 합성 또는 유전공학에 의해 생산될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 표 1, 표 7, 표 8, 표 9, 표 10A 및 표 10B의 프로브에 대한 모든 언급은 진칩(GeneChip) 인간 게놈 U133 Plus 2.0 어레이에 제시된 프로브 세트를 나타낸다.
다음 설명은 본 발명의 특정 실시 형태, 및 환자에서 당뇨병 질병 상태를 진단하기 위한 특정 방법에 관한 것이다. 특히, 본 출원은 이전에는 당뇨병 질병 상태와 연관된 것으로 여겨지지 않았던 일부를 포함하여, 당뇨병 질병 상태가 없는 환자에 비해 당뇨병 또는 전기 당뇨병 질병 상태가 있는 환자로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PMBC)에서 차등 발현되는 많은 유전자를 개시한다.
한 실시 형태에서, NGT 및 T2D의 PBMC에서 차등 발현되는 유전자는 마이크로어레이 분석을 통해 확인된다. NGT 및 T2D 환자의 PBMC로부터의 전사체 (본 실시예에서, 107명의 환자의 코호트 (cohort))는 처음에 아피메트릭스 (Affymetrix) 인간 게놈 HG-U133Plus2 칩을 제조자의 지시에 따라 사용하여 스크리닝되었다. 마이크로어레이 유의성 분석 (SAM) 프로그램을 사용하여, FDR (위발견율; False Discovery Rate)이 <20%, NGT와 T2D 사이의 변화 배수가 >1.7인 약 200개의 차등 발현된 유전자가 선택되었다 (표 1 참조).
초기 마이크로어레이 스크리닝에서 확인된 당뇨병 감수성 유전자의 상이한 조합의 차등 발현의 결정에 의한 당뇨병 분류 방법을 이제 설명한다 (표 12A 참조). 표 12A는 또한 각각의 선택된 유전자의 Genbank 기탁 번호를 포함한다.
당뇨병 감수성 유전자의 유전자 발현은 많은 상이한 기술을 이용하여 생물학적 샘플에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 다양한 mRNA의 혼합물 내에서 당뇨병 연관 유전자로부터의 mRNA의 확인은 역전사효소-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 및 검출가능한 잔기 (moiety)로 표지된 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브의 사용에 의해 편리하게 달성된다.
먼저, 시험 샘플을 환자로부터 수집한다. 고품질의 RNA를 얻기 위해서는, 세포 용해시에 방출되는 RNase의 활성을 최소화하는 것이 필요하다. 이것은 보통 조직을 붕괴시키면서 동시에 RNase를 불활성화 또는 억제하는 단리 방법을 사용하여 달성된다. 내인성 리보뉴클레아제가 적은 표본의 경우, 단리 프로토콜은 통상 막을 용해시키기 위한 세제 및 RNase의 억제제, 예를 들어 태반 리보뉴클레아제 억제제 또는 바나딜-리보뉴클레오시드 복합체를 함유하는 추출 버퍼를 사용한다. 보다 힘든 샘플, 예를 들어 무손상 조직 또는 내인성 리보뉴클레아제가 많은 세포로부터의 RNA 단리는 보다 공격적인 방법을 필요로 한다. 이들 경우에, 조직 또는 세포는 뉴클레아제를 비가역적으로 불활성화시키고 세포막을 가용화시키기 위해서 강력한 단백질 변성제 (대체로 구아니디늄 아이소티오시아네이트) 중에서 신속하게 균질화시킨다. 조직 샘플을 즉시 균질화할 수 없는 경우에는, 액체 질소에 침지시켜 급속 동결시킨 후, -80℃에서 보관하여야 한다. 상기 방식으로 동결된 샘플은 RNA 단리 전에는 해동되지 않아야 하며, 그렇지 않으면 RNA는 동결과정에서 일어나는 세포 용해시에 방출되는 RNase에 의해 신속하게 분해될 것이다. 조직은 액체 질소에 침지시키고, 막자 및 막자사발을 사용하여 미분말로 연마되어야 하다. 분말화된 후, 계속-동결 상태의 조직은 RNA 추출 버퍼 내에서 균질화된다. RNA 단리를 위한 많은 키트가 현재 상업적으로 이용가능하다 (앰비온 (Ambion), 퀴아겐 (Quiagen)).
당업계에 잘 공지된 바와 같이, cDNA는 처음에 RNA 의존성 DNA 중합효소 및 프라이머를 사용하여 주형 mRNA로부터 cDNA의 제1 가닥을 역전사시켜 생성된다. 본 발명에 따라 유용한 역전사효소는 HIV, HTLV-I, HTLV-II, FeLV, FIV, SIV, AMV, MMTV, MoMuLV 및 다른 레트로바이러스로부터의 역전사효소를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다 (검토를 위해, 예를 들어 문헌[Levin, 1997, Cell 88:5-8]; 문헌[Verma, 1977, Biochim. Biophys. Acta 473:1-38]; 문헌[Wu et al., 1975, CRC Crit. Rev. Biochem. 3:289-347] 참조). 보다 최근에는, 많은 키트, 예를 들어 진앰프(GeneAmp)(등록상표) 열안정성 rTth 역전사효소 RNA PCR 키트 (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems))가 열안정성 역전사효소를 사용하는 RT-PCR 반응을 위해 현재 상업적으로 이용가능하다.
"중합효소 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 본 명세서에서 사용될 때 일반적으로 그 내용 전체가 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제4,683,202호, 제4,683,195호, 제4,800,159호, 및 제4,965,188호에 설명된, 원하는 뉴클레오티드 서열의 시험관 내 증폭 방법을 의미한다. PCR 반응은 반복적인 일련의 온도 사이클을 포함하고, 대개 10-100 ㎕의 부피로 수행된다. 반응 혼합물은 dNTP (각각 4가지의 데옥시뉴클레오티드, 즉 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP), 프라이머, 버퍼, DNA 중합효소, 및 핵산 주형을 포함한다. PCR 반응은 제1 프라이머가 핵산 주형 서열의 한 가닥 내의 한 구역에 상보성인 서열을 함유하여 상보성 DNA 가닥의 합성을 프라이밍하고, 제2 프라이머가 표적 핵산 서열의 제2 가닥 내의 한 구역에 상보성인 서열을 함유하여 상보성 DNA 가닥의 합성을 프라이밍하는 폴리뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공하고, (i) 증폭에 필요한 프라이머를 주형 서열 내에 함유된 표적 핵산 서열에 어닐링시키고, (ii) 프라이머를 연장시키는 (여기서, 핵산 중합효소가 프라이머 연장 생성물을 합성함) PCR 순환 단계를 허용하는 조건 하에서 주형-의존성 중합화제로서 핵산 중합효소를 사용하여 핵산 주형 서열을 증폭하는 것을 포함한다.
다른 증폭 방법은 리가제 연쇄 반응 (LCR), 폴리뉴클레오티드 특이적 기반 증폭 (NSBA)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
목적하는 핵산 구역에 대한 프라이머는 당업자에 의해 쉽게 설계되고 합성될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 적합한 프라이머는 임의의 적합한 방법을 이용하여 설계될 수 있음을 알 것이다. PCR을 위한 프라이머 선택은 예를 들어 미국 특허 제6,898,531호 (2005년 5월 24일 허여, 발명의 명칭 "Algorithms for Selection of Primer Pairs") 및 미국 특허 출원 제10/236,480호 (2002년 9월 5일 출원)에 설명되어 있고; 단범위 (short-range) PCR에 대해서는 미국 특허 출원 제10/341,832호 (2003년 1월 14일 출원)가 프라이머 선택에 관한 지침을 제공한다. 또한, 공개적으로 이용가능한 프로그램, 예를 들어 "Oligo", 레이저진(LASERGENE)(등록상표), 프라이머 프리미어 5 (프리미어 바이오소프트(Premier Biosoft)사의 웹사이트에서 이용가능함) 및 프라이머3 (화이트헤드 인스티튜트 포 바이오메디칼 리서치 (Whitehead Institute for Biomedical Research, 미국 매사추세츠주 캠브리지)의 웹사이트에서 이용가능함)이 존재한다. 프라이머 설계는 많은 파라미터, 예를 들어 사용할 혼성화 조건에 대한 최적 용융온도 (Tm) 및 올리고뉴클레오티드 프로브의 목적하는 길이를 기초로 한다. 또한, 올리고뉴클레오티드 설계는 분자가 함유할 수 있는 잠재적인 2차 구조, 예를 들어 헤어핀 구조 및 프로브 사이의 이량체를 최소화하려고 시도하며, 그 목적은 생성되는 프로브의 혼성화를 위한 이용가능성을 최대화하기 위한 것이다. 바람직한 실시 형태에서, PCR 방법에 사용되는 프라이머는 cDNA 주형 내의 뉴클레오티드 서열에, 바람직하게는 엑손-인트론 경계 상에서 상보성일 것이다.
한 실시 형태에서, PCR 반응에서는 이중 (nested) PCR 프라이머를 사용할 수 있다.
한 실시 형태에서, 검출가능한 표지가 증폭 반응에 포함될 수 있다. 적합한 표지는 형광색소, 예를 들어 플루오레세인 아이소티오시아네이트 (FITC), 로다민, 텍사스 레드, 피코에리트린, 알로피코시아닌, 6-카르복시플루오레세인 (6-FAM), 2',7'-다이메톡시-4',5'-다이클로로-6-카르복시플루오레세인 (JOE), 6-카르복시-X-로다민 (ROX), 6-카르복시-2',4',7',4,7-헥사클로로플루오레세인 (HEX), 5-카르복시플루오레세인 (5-FAM) 또는 N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민 (TAMRA), 방사성 표지, 예를 들어 32P, 35S, 3H; 및 기타 물질을 포함한다. 표지는 2단계 시스템일 수 있고, 이 경우 증폭된 DNA는 고친화도 결합 파트너, 예를 들어 아비딘, 특이적 항체 등을 갖는 비오틴, 합텐 등에 컨쥬게이팅되고, 결합 파트너는 검출가능한 표지에 컨쥬게이팅된다. 표지는 프라이머 중 하나 또는 둘 모두에 컨쥬게이팅될 수 있다. 대안적으로, 증폭에 사용되는 뉴클레오티드 풀 (pool)을 표지하여 표지가 증폭 생성물 내로 포함되도록 한다.
특히 바람직한 실시 형태에서, 본 명세서는 그 전부가 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제6,140,054호 및 제6,174,670호에 개시되어 있는 FRET 프로브의 사용과 같은 분석 시스템을 이용하기 위해서 조합된 PCR 및 혼성화 프로빙 (probing) 시스템을 사용한다. 그의 가장 단순한 구성의 하나에서, FRET 또는 "형광 공명 에너지 전달" 방법은 증폭되는 핵산의 동일한 가닥 상의 인접 부위에 결합하는 2개의 올리고뉴클레오티드를 이용한다. 하나의 올리고뉴클레오티드는 제1 파장에서 광을 흡수하고 반응하여 광을 방출하는 공여 형광단으로 표지되고, 다른 하나의 뉴클레오티드는 제1 공여 형광단의 방출된 광에 반응하여 형광을 낼 수 있는 (그러나, 실질적으로 제1 공여 형광단을 여기시키는 광원에 의해서는 아니고, 그 방출은 제1 형광단의 방출과 구별될 수 있는) 수용 형광단으로 표지된다. 이러한 구성에서, 제2 또는 수용 형광단은 제1 또는 공여 형광단과 매우 근접하여 위치할 때, 이를테면 이들 2개의 올리고뉴클레오티드가 예를 들어 PCR의 어닐링기에 증폭되는 핵산 상의 인접 부위에 혼성화할 때 서로 매우 근접하게 될 때, 형광의 실질적인 증가를 보여 형광 복합체를 형성한다. 증폭되는 핵산이 점점 더 많이 축적되면서, 보다 많은 형광 복합체가 형성될 수 있고, 수용 프로브로부터의 형광이 증가하고, 이를 측정할 수 있다. 따라서, 이 방법을 사용하여 형성되는 생성물의 양을 검출할 수 있다.
증폭의 검출이 당업계의 수많은 수단을 이용하여, 예를 들어 PCR 반응에서 TaqMan™ 혼성화 프로브를 이용하고 충분한 증폭이 일어난 후에 표적 핵산에 특이적인 형광을 측정함으로써 수행될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. TaqMan 실시간 PCR은 통상적인 PCR에서와 같은 종료점이 아니라 PCR의 기하급수기 동안 형광단을 통해 생성물의 축적을 측정한다. 생성물의 기하급수적 증가는 역치 사이클, CT, 즉 형광의 유의한 기하급수적 증가가 검출되고 반응물에 존재하는 DNA 주형의 카피 수와 직접적인 상관관계가 있는 PCR 사이클의 수를 결정하기 위해 사용된다.
당업자가 알 수 있는 바와 같이, 다른 유사한 정량적 "실시간" 및 균질 핵산 증폭/검출 시스템, 예를 들어 TaqMan 방법에 기반한 방법 (미국 특허 5,538,848 및 5,691,146 참조, 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함된), 형광 편광 분석 (예를 들어, 문헌[Gibson et al., 1997, Clin Chem., 43: 1336-1341]), 및 인베이더 (Invader) 분석 (예를 들어, 문헌[Agarwal et al., Diagn Mol Pathol 2000 September; 9(3): 158-164]; 문헌[Ryan D et al., Mol Diagn 1999 June; 4(2): 135-144])이 존재한다. 상기 시스템은 또한 본 명세서에서 설명된 방법에 사용하기 위해 변용하여 핵산 증폭의 실시간 모니터링이 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 각각 기지의 서열의 올리고뉴클레오티드를 함유하는 로커스의 어레이를 함유하도록 매트릭스 또는 마이크로칩을 제조한다. 본 명세서의 개시 내용에서, 각각의 로커스는 당뇨병 감수성 유전자의 요구되는 부분에 대한 상보성 서열을 함유하도록 합성된, 몰과량의 선택되고 고정된 합성 올리고머를 함유한다. PBMC에 존재하는 당뇨병 감수성 유전자의 전사체는 RT-PCR에 의해 증폭되고, 본 명세서에 설명된 바와 같이 표지된다. 이어서, 마이크로칩 상의 올리고머가 표지된 RT-PCR 증폭된 당뇨병 감수성 유전자 핵산과 혼성화된다. 혼성화는, 혼성화 동안 마이크로칩에 매립된 서열과 표적 서열 사이의 완전하거나 거의 완전한 매치만이 발생하도록 보장하는 엄격한 조건 하에 일어난다. 각각의 로커스에서 생성되는 형광은 PBMC에서 하나 이상의 당뇨병 감수성 유전자의 발현 수준과 비례한다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 단백질 코딩 유전자의 유전자 시그너쳐 발현 프로필은 예를 들어 항체 기반 결합 분석, 예를 들어 ELISA 또는 방사성 면역분석 또는 본 명세서에 규정된 바와 같은 소정의 시그너쳐 내의 유전자의 단백질 생성물에 대해 작용하는 항체를 함유하는 단백질 어레이를 포함하여 면역화학 분야에 잘 공지된 기술을 이용하여 결정된다.
한 실시 형태에서, 정상 내당성 및 제2형 당뇨병 환자로부터의 말초 혈액 단핵 세포에서 TCF7L2 및 CLC 유전자의 발현 프로필을 분석하였다.
인간 샤르코-라이덴 (Charcot-Leyden) 결정 단백질 유전자는 주로 호산구에서 발현된다. CLC는 NGT, IGT, T2D의 PBMC에서 순차적으로 하향 조절된다. 107-환자 코호트의 마이크로어레이에서 그의 발현의 평균 신호 강도를 아래 표 2에 제시한다. ROC 분석은 CLC 유전자 발현 수준이 IGT/T2D로부터 NGT를 분리하기 위해 사용될 수 있음을 입증하였다.
[표 2]
Figure pct00001
ROC 분석을 사용하여 임상 상태를 예측하는 데 있어서 CLC 유전자의 효능을 추가로 조사하였다. ROC 곡선은 감도와 특이도 사이의 관계를 보여준다. 즉, 감도의 증가는 특이도의 감소를 수반할 것이다. 곡선이 좌측 축, 이어서 ROC 공간의 상부 가장자리에 보다 가깝게 존재할수록 시험이 보다 정확하게 된다. 반대로, 곡선이 ROC 그래프의 45도 대각선에 가까워질수록 시험이 보다 덜 정확하게 된다. ROC 하 면적은 시험 정확성의 척도이다. 시험의 정확성은 시험이 시험되는 군을 문제의 질병이 존재하는 대상과 존재하지 않는 대상으로 얼마나 잘 분리하는지에 따라 결정된다. 1의 곡선 하 면적 ("AUC"로 칭함)은 완벽한 시험을 나타내고, 0.5의 면적은 시험이 덜 유용함을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 바람직한 유전자 및 진단 방법은 0.50 초과의 AUC를 갖고, 보다 바람직한 시험은 0.60 초과의 AUC를 갖고, 보다 바람직한 시험은 0.70 초과의 AUC를 갖는다.
곡선 하 면적 (AUC)은 환자 상태를 예측하는 데 있어서 CLC 유전자의 효능의 척도로서 계산되었다. CLC 유전자 데이타의 ROC 분석은 CLC 유전자 발현 수준이 IGT/T2D로부터 NGT를 분리하기 위해 사용될 수 있음을 보여주었다 (도 1 참조).
전사 인자-7-유사 2 (TCF7L2)를 코딩하는 유전자에서 유전자 변이체는 제2형 당뇨병 발병 및 β-세포 인슐린 기능 장애의 위험과 강하게 연관되었다 (그 내용 전부가 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2006/0286588호 참조). 전장 유전체 연관 (Genome-wide association) 연구는 TCF7L2 내의 SNP가 CDKAL1, CDKN2A/2B, FTO, IGF2BP2, 및 SLC30A8 (위험 스코어 범위 1.12 - 1.20)을 포함하는 다른 마커 유전자에서의 SNP에 비해 제2형 당뇨병 진행을 예측하기 위한 가장 높은 평생 위험 스코어를 제시함을 보여준다. TCF7L2는 널리 발현되고, 이 전사 인자는 Wnt 단백질 패밀리의 멤버로부터의 발달 신호에 반응하는 것으로 알려져 있다. 기능 및 유전자 연구는 장의 발달 및 장 내분비 세포에서 전구글루카곤 유전자 발현에서 TCF7L2의 중요한 역할을 제시한다.
TCF7L2 및 CLC 유전자가 당뇨병의 진단 마커인지를 확인하기 위해서, 180명의 대상을 개별적으로 또는 함께 독일 마인즈 소재의 인스티튜트 포 클리니컬 리서치 앤드 디벨롭먼트(Institute for Clinical Research & Development; IKFE)와 연합하여 독일 국민으로부터 모집하였다. 적절한 IRB 동의서는 환자 샘플 수집 전에 얻었다. 포함 기준은 이전에 당뇨병으로 진단되지 않았고, 체질량 지수 (BMI)가 30 이상이며, 법적 능력 및 임상 연구 및 요구되는 절차의 특성 및 정도를 이해하는 능력을 갖는 18-75세의 환자로 이루어졌다. 배제 기준은 지난 30일 이내의 헌혈, 인슐린 의존성 당뇨병, 수유 또는 임신 여성, 또는 연구 과정 동안 임신 의사가 있는 여성, 피임을 하지 않은 성생활이 왕성한 여성, 중증/다중 알레르기 병력, 약물 또는 알콜 남용, 및 연구 요건에 대한 순응도 결여로 이루어졌다. 75 g 경구 내당능 시험 결과 (OGTT)를 포함한 모든 임상 측정치는 표준 절차를 이용하여 얻었다.
혈액 샘플을 정맥 천자에 의해 CPT 튜브 (비디 바이오사이언시스 (BD Biosciences)) 내로 빨아들였다. PBMC는 제조자의 프로토콜에 따라 단리하고, 최종 세포 펠렛은 1 ml의 트라이졸(Trizol, 인비트로겐(Invitrogen))에 재현탁하고 -80℃에서 저장하였다. 후속적으로, 총 RNA를 제조자의 프로토콜을 이용하여 정제하고, DEPC-처리된 ddH2O에 재현탁하였다. RNA 정량 및 품질 평가는 ND-1000 분광광도계 (나노드롭 (NanoDrop))를 이용하여 수행하고, 리보그린(RiboGreen) 키트 (몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes))를 사용한 분광광도 정량에 의해 재확인하였다. RNA 주형의 품질은 바이오어낼라이저(Bioanalyzer) 2100 (애질런트 테크놀로지스 (Agilent Technologies))을 사용하여 측정하였다.
제1 가닥 cDNA 합성은 고용량 (High Capacity) cDNA 역전사 키트 (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 각각의 환자 PBMC 샘플로부터 얻은 200 ng의 총 RNA를 사용하여 수행하였다. 이어서, 반응 혼합물을 ddH2O로 10배 희석하고, 4 ㎕를 에이아이 프리즘(ABI Prism) 7900HT 서열 검출 시스템의 10 ㎕ TaqMan PCR 반응에서의 주형으로 사용하였다. 반응 성분은 2X TaqMan PCR 매스터 믹스 (어플라이드 바이오시스템즈), 0.9 μM의 각각의 프라이머, 및 0.25 μM의 형광-표지된 프로브 (바이오서치 테크놀로지스 (Biosearch Technologies))로 구성되었다. RT-PCR TaqMan 분석에서 사용된 프라이머/프로브 세트에 대한 서열을 표 3에 제시한다.
역전사 단계를 위한 사이클링 조건은 다음과 같았다:
Figure pct00002
[표 3]
Figure pct00003
TCF7L2에 특이적인 2개의 상이한 프라이머/프로브 조합물 및 CLC에 특이적인 1개의 프라이머/프로브 세트를 사용하는 Taqman 분석에 의한 정량적 실시간 RT-PCR을 개별 환자로부터의 PBMC로부터 단리된 RNA에 대해 수행하였다. PCR 단계에 대한 온도 순환 프로필은 다음과 같았다: 95℃ 10분, 이어서 95℃ (15초) 및 60℃ (1분)의 40 사이클. Ct 값은 역치가 0.2 내지 0.3으로 설정된 소프트웨어 SDS 버전 2.1 (어플라이드 바이오시스템즈)을 사용하여 미가공 데이타로부터 계산되었다. 피어슨 (Pearson) 상관분석에 의한 실행별 (run-to-run) 재현성은 상기 마커에 대해 R2=0.96-0.98이었다. 델타 Ct (사이클 역치) 값은 목적하는 마커, 예를 들어 TCF7L2의 Ct로부터 하우스키핑 (housekeeping) β-액틴 유전자의 Ct를 차감함으로써 계산되었다 (Ct TCF7L2 - Ct 액틴). β-액틴에 비교하여 TCF7L2의 발현을 표시하기 위해 [2-(델타 Ct ) x 1000]의 값을 사용하였다. OGTT 결과를 진정한 임상 상태로서 사용하였다. 정규화된 Ct 값을 사용하여 유전자 마커의 발현 수준 사이의 통계학적 유의성을 결정하기 위해 스튜던트 (Student's) T-검정을 사용하였다.
2-hr OGTT 측정 및 현행 ADA 지침을 기초로 하여, 연구에 참여한 180명의 환자 중에서, 104명의 환자는 NGT (정상 내당능)로 분류되고, 49명의 환자는 IGT (내당능 장애)로 분류되고, 27명의 환자는 T2D (제2형 당뇨병)로 간주되었다. T2D 대상은 본 연구에서 처음으로 당뇨병으로 진단되었으므로, 각 환자에 대한 질병의 지속 기간, 및 PBMC가 고혈당 미세환경 내에서 유지된 기간은 알려지지 않았다.
프라이머/프로브 세트 값을 기초로 하여 내당능에 의해 분리된 각각의 환자에 대해 β-액틴에 정규화된 TCF7L2 및 CLC의 발현 수준에 대한 T-검정 분석을 표 4에 제시한다. NGT 및 IGT + T2D 환자군은 스튜던트 T-검정에 의할 때 발현 수준 사이에 통계적으로 유의한 차이를 갖고, 여기서 p-값은 TCF7L2 세트 1, 세트 3 및 CLC에 대해 각각 0.004; 0.021 및 0.022이었다. 이들 결과는 NGT에 비해 전기 당뇨병 (IGT) 환자 또는 합쳐진 전기 당뇨병 및 T2D 환자의 PBMC에서 TCF7L2 및 CLC 유전자의 차등 발현을 나타낸다.
[표 4]
Figure pct00004
이어서, 2-hr OGTT에 비해, 정상 또는 전기 당뇨병/당뇨병으로 환자를 분류하기 위한 진단 도구로서 TCF7L2 및 CLC Taqman 분석의 성능을 평가하였다. 각각의 TCF7L2 및 CLC 프라이머/프로브 세트 정규화된 델타 Ct 값에 대한 ROC 곡선을 생성하였다 (표 5, 도 2a 및 도 2b). TCF7L2 세트 1 및 CLC PCR 분석에 대한 AUC 값은 각각 0.63 및 0.61이었다. 2-hr OGTT 분류에 비해, PBMC로부터 TCF7L2 세트 1 발현은 FPG 시험과 함께 사용될 때 0.73의 AUC로, 정상 또는 전기 당뇨병/당뇨병으로 환자를 정확하게 분류할 수 있다 (도 2a 및 도 2b). CLC는 TCF7L2 세트 1에 대해 상가적인 값을 갖지 않았고, 진단 알고리즘에 대해 고려하지 않았다. 추가로, FPG ≥ 126 ㎎/㎗ (또한 당뇨병으로 간주됨)인 14명의 환자를 배제하는 것은 분석의 성능을 변화시키지 않았다.
[표 5]
Figure pct00005
한 실시 형태에서, 마이크로어레이 분석에서 선택된 각각의 유전자 (표 1 참조)는 2-hr OGTT 결과에 보다 근접하게 합치시키기 위해 TCF7L2 세트 1의 성능과 조합될 수 있다.
다른 실시 형태에서, 제2형 당뇨병의 위험과 강하게 연관된 유전자 (표 6 참조) 또한 2-hr OGTT 결과에 보다 근접하게 합치시키기 위해 TCF7L2 세트 1의 성능과 조합될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 표 6의 유전자는 표 1의 하나 이상의 유전자와 조합되어 당뇨병 질병 상태를 진단하게 할 수 있는 유전자 시그너쳐인지에 대해 본 명세서에서 설명되는 바와 같이 시험될 수 있다.
[표 6]
Figure pct00006
다른 실시 형태에서, CDKN1C (CIP/KIP 패밀리의 멤버)의 발현 역시 NGT 및 T2D로부터의 PBMC에서 차등 발현되었다.
CIP/KIP 패밀리는 3개의 멤버, 즉 CDKN2A, CDKN2B 및 CDKN1C로 이루어진다. 3개의 멤버는 모두 포유동물 세포 사이클을 조절하는 데 중심 역할을 수행하는 CDK4의 활성을 억제할 수 있다. 섬 β-세포 복제는 β-세포 질량 항상성을 유지하는 데 필수 역할을 한다. CDK4는 체중 및 췌장 β-세포 증식의 조절에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 생쥐에서, CDK4 유전자의 손실은 β-세포의 질량 감소로 인해 인슐린-결핍 당뇨병을 일으킨 반면, CDK4의 활성화는 β-섬 세포 과다형성을 유발하였다. 최근에, 제2형 당뇨병의 전장 유전체 연관 연구에서는 CDKN2A 및 CDKN2B 유전자 근처의 뉴클레오티드 변이가 제2형 당뇨병 위험과 연관됨을 밝혀내었다. 또한, CDKN2A의 과다발현은 노화된 생쥐에서 감소된 섬 증식을 일으키고, CDKN2B의 과다발현은 쥐 모델에서 섬 형성저하증 및 당뇨병에 관련된다. CDKN1C는 염색체 11p15.5 상에 위치하는 모성 발현 유전자이고, 베크위드-위드만 (Beckwith-Wiedemann) 증후군 (BWS) (신생아 고인슐린혈성 저혈당증을 특징으로 하는 질환)의 병인, 및 출생 전후의 과도발육에 관여한다. 최근의 연구에서는 또한 CDKN1C가 인슐린에 의해 하향-조절되고, CDKN1C의 변이체는 제2형 당뇨병 환자에서 증가된 출생시 체중에 연관될 수 있음을 보여주었다. 세포 사이클 조절에 더하여, CIP/KIP 패밀리는 다른 생물학적 과정, 예를 들어 세포자멸, 전사 조절, 분화 및 세포 이동에서 중요한 역할을 한다. 107명의 환자 코호트에서 3개의 유전자의 발현을 분석하였다. CDKN1C만이 NGT, IGT 및 T2D 사이에서 차등적인 발현을 보였다 (표 7 참조). HG-U133Plus2 GeneChip 상에서 CDKN1C에 대한, PBMC에서 발현하는 5개의 프로브가 존재한다. 이들 각각은 NGT 및 IGT/T2D 사이에서 차등적인 발현을 보였다 (표 7). ROC 분석은 이들 5개의 프로브의 발현 수준이 NGT를 T2D로부터 구분하기 위해 사용될 수 있음을 보여주었다 (도 3).
[표 7]
Figure pct00007
당업자는 설명된 실시 형태가 당뇨병의 진단 도구로서 유전자 시그너쳐를 조사하기 위한 전제를 제공함을 알 것이다. 정상 대상과 전기 당뇨병 및 당뇨병 환자 사이의 바탕을 이루는 생물학적 과정을 조사하기 위해, 경로 분석을 수행하였다. 즉, HG-U133Plus2 칩 상의 프로브를 문헌[Yu et al. BMC Cancer 7:182 (2007)]에 설명된 바와 같이 유전자 온톨로지 (Ontology) 생물학적 과정 (GOBP)에 매핑하였다. 매우 낮게 발현하는 유전자는 보다 높은 변이를 보이는 경향이 있으므로, 데이타세트 내에서 평균 강도가 200 미만인 유전자를 경로 분석으로부터 제외하였다. 그 결과, 21247개의 프로브를 유지하였다. 전기 당뇨병 또는 당뇨병의 발병과 유의한 연관성을 갖는 경로를 확인하기 위해서, NGT 대 IGT, NGT 대 T2D, 또는 NGT 대 IGT+T2D를 비교함으로써 전체 (global) 시험 프로그램을 실행하였다. 적어도 10개의 프로브 및 유의한 p 값 (p < 0.05)을 갖는 경로가 각각의 비교에 대해 확인되었다. 3가지 비교를 통해 환자 결과와 일관된 연관성을 갖는 3개의 경로가 존재하였다. 이들은 B 세포 활성화 (GO0042113), 체액성 면역 반응 (GO0006959), 및 복제시의 DNA 풀림 (unwinding) (GO0006268)이다. 3개의 경로 중에서, B 세포 활성화 및 체액성 면역 반응은 당뇨병과 우세하게 음성 연관성을 갖는 반면 (IGT/T2D에서 보다 낮은 발현), 복제시의 DNA 풀림은 당뇨병과 양성 연관성을 갖는다 (IGT/T2D에서 보다 높은 발현).
3개의 핵심 경로로부터 경로 기반 유전자 시그너쳐를 수립하기 위해, p < 0.05인 유전자를 모으고, 그들의 통계학적 유의성을 기초로 하여 분류하였다 (전체 시험으로부터의 z 스코어). 유전자가 목록에서 하나 초과의 프로브를 갖고 그들의 거동이 일관되면, 최고 유의성을 갖는 유전자를 유지하였다. 유전자가 목록에서 하나 초과의 프로브를 갖고 그들의 거동이 반대되면, 상기 유전자에 대한 모든 프로브를 제거하였다. 그 결과, 14개의 특유한 유전자가 얻어졌다 (아래 표 8 참조).
[표 8]
Figure pct00008
비교적 높은 변이를 갖는 유전자를 사용하여 시그너쳐를 수립하기 위해서, CV > 0.25인 10개의 유전자를 유지하였다. 시그너쳐를 위한 유전자의 최적 수를 결정하기 위해서, 상위 2 - 10개의 유전자의 조합을 데이타세트에서 검사하였다. 결과는 상위 3개의 유전자가 환자 결과의 예측에서 최상의 성능을 제공하였음을 나타냈다. 3개의 유전자는 하기 표 9에 제시된 TOP1, CD24 및 STAP1이다.
[표 9]
Figure pct00009
107-환자 코호트에서 3-유전자 시그너쳐의 ROC 분석 (도 4a 및 도 4b)은 상기 시그너쳐가 NGT를 IGT/T2D로부터 구분할 수 있음을 입증한다. 유전자의 평균 발현을 도시하는 막대그래프를 도 4c에 제시한다.
비정보성 유전자를 제거하기 위해, 코호트에서 10 이상의 존재 콜 (presence call)을 보이는 유전자만을 유지하였다. 이어서, 107-환자 코호트를 54-환자 훈련 세트 및 53-환자 시험 세트로 나누었다. OGTT 분류를 기초로 하여, 훈련 세트에는 28 NGT, 17 IGT 및 9 T2D가 존재하고, 시험 세트에는 29 NGT, 16 IGT 및 8 T2D가 존재한다. NGT와 IGT + T2D 환자 사이에 차등 발현을 하는 유전자를 확인하기 위해, 마이크로어레이 유의성 분석 (SAM) 프로그램을 수행하였다. 유전자는 위발견율 (FDR)이 20% 미만일 때 선택되었다. 그 결과, 235개의 유전자가 선택되었다. 유전자 목록을 더욱 좁히기 위해, 2개의 군 사이에서 변화 배수가 1.5보다 크고, 데이타세트 내에서 유전자의 평균 강도가 200을 초과하는 유전자를 유지하였다. 그 결과, 17개의 프로브 세트를 얻었다. 이들 중에서, 4개가 헤모글로빈 유전자를 대표하는 프로브였다. 헤모글로빈은 적혈구 세포에서 극히 고도로 발현됨을 고려하여, 가능한 오염을 제거하기 위해 이들 4개의 프로브를 제외하였다. 시그너쳐로서 유전자의 최적 수를 결정하기 위해, 상위 유전자의 조합 성능을 훈련 세트에서 2 내지 13의 조합에 대해 조사하였다. 결과는 상위 10개의 유전자가 곡선 하 면적 (AUC)에 기초하여 최상의 성능을 제공하였음을 나타낸다 (표 10 참조).
[표 10A]
Figure pct00010
[표 10B]
Figure pct00011
유전자 시그너쳐를 추가로 평가하기 위해, 시험 세트 내의 환자 결과를 결정하였다. 공복 혈장 혈당 (FPG) 수준을 이용한 전기 당뇨병 및 당뇨병의 예측을 또한 검사하였다. 유전자 시그너쳐와 FPG 수준 사이의 상호보완적 효과를 조사하기 위해, 이들 2개의 예측인자의 조합을 사용하여 환자 결과를 예측하였다. 시험 세트에서 FPG, 또는 10-유전자 시그너쳐, 또는 FPG와 10-유전자 시그너쳐의 조합을 사용한 ROC 분석의 비교를 도 5에 도시한다. 10-유전자 시그너쳐는 NTG를 IGT/T2D로부터 독립적으로 분리할 수 있고, FPG 및 10-유전자 시그너쳐는 보다 우수한 예측을 위해 상호보완적임이 입증되었다 (도 5a 및 도 5b). 107-환자 코호트 내의 10개의 유전자의 평균 발현 신호를 도 5c의 표 및 막대 그래프에 제시한다.
임상 데이타의 통계학적 분석을 통해, NGT 및 T2D에서 차등 발현되는 3개의 유전자 및 10개의 유전자로 된 시그너쳐를 확인하였다.
다른 실시 형태에서, 정상 대 전기 당뇨병/당뇨병의 현장 분류를 위한, 또는 규정된 기간, 예를 들어 1/2 내지 2년 또는 2 내지 5년, 또는 5 내지 10년 또는 그 이상에 걸친 전기 당뇨병/당뇨병으로의 진행의 예측을 위한 진단 분석을 설명한다.
대안적으로, 유전자 발현 프로필은 예를 들어 ELISA 또는 프로테오믹 (proteomic) 어레이를 사용하여 mRNA에 의해 코딩된 단백질의 검출에 의해 결정된다. 이들 모든 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.
본 발명은 또한 환자에서 당뇨병 질병 상태의 진단을 위한 하나 이상의 시약을 갖는 포장 단위 (package unit)를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 또한 하나 이상의 다음 품목을 포함할 수 있다: 버퍼, 사용설명서, 및 양성 또는 음성 대조군. 키트는 본 명세서에 설명되는 방법을 수행하기 위해 적합한 비율로 함께 혼합된 시약의 용기를 포함할 수 있다. 시약 용기는 바람직하게는 본 발명의 방법을 수행할 때 측정 단계가 불필요하도록 단위량의 시약을 함유한다.
키트는 환자의 혈액을 수집하기 위한 멸균 바늘 및 튜브/용기를 포함할 수 있다. 수집 튜브는 일반적으로 특정 첨가제, 예를 들어 혈액 응고를 억제하기 위한 헤파린을 함유할 것이다.
키트는 또한 환자의 샘플 내 유전자 시그너쳐 발현 프로필의 측정을 위한 시약을 함유할 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 유전자 시그너쳐의 발현 프로필은 RT-PCR 분석, 마이크로칩을 이용하는 올리고뉴클레오티드 기반 분석 또는 단백질 기반 분석, 예를 들어 ELISA 분석을 포함하여 당업계에 공지된 다양한 수단에 의해 측정될 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 유전자 시그너쳐 발현 프로필은 실시간 RT-PCR에 의해 측정된다.
본 발명의 한 실시 형태에서, 키트는 환자의 혈액 샘플에서 유전자 시그너쳐 발현 프로필의 증폭 및 검출을 위한 프라이머를 포함한다. 프라이머는 TOP1, CD24, STAP1, TULP4, AA741300, ESCO1, EIF5B, ACTR2, WNK1, COCH, SON, TPR, NOG 유전자 또는 표 1 또는 표 6에 나열된 임의의 유전자를 포함하여 본 명세서에 규정된 당뇨병 감수성 유전자들 중 어느 하나에 상보성인 서열을 가질 수 있다.
당뇨병 감수성 유전자의 실시간 RT-PCR에 사용되는 프라이머 서열의 예가 표 12B 및 표 12C에 개시된다.
바람직한 실시 형태에서, 키트 시약은 FDA-OIVD (FDA's Office of In Vitro Diagnostics)에서 승인된 PCR-기반 기술인 7500 Fast Dx 실시간 PCR 기기 (어플라이드 바이오시스템즈)에서 기능하도록 설계된다.
또 다른 실시 형태에서, 키트는 3개의 유전자 (TOP1, CD24 및 STAP1) 또는 10개의 유전자 (TULP4, AA741300, ESCO1, EIF5B, ACTR2, WNK1, COCH, SON, TPR 및 NOG) 시그너쳐에 대한 혼성화 프로브의 어레이를 포함하는 마이크로칩을 포함한다. 다른 태양에서, 마이크로칩은 표 1 또는 표 6에 나열된 하나 이상의 유전자에 대한 하나 이상의 혼성화 프로브의 어레이를 추가로 포함할 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 마이크로칩은 1 내지 55,000 초과의 mRNA의 유전자 발현을 동시에 측정할 수 있는 아피메트릭스 GeneChipDx 기술에서 기능하도록 설계된다. FDA-OIVD는 상기 플랫폼을 앰플리칩(AmpliChip) P450 제품 (로슈 몰레큘라 다이아그노스틱스 (Roche Molecular Diagnostics)) 및 패쓰워크 다이그나스틱스 티슈즈 오브 오리진(Pathwork Diagnostics Tissue of Origin) 시험에 사용하는 데 승인하였다.
[표 1]
Figure pct00012

[표 1] (계속)
Figure pct00013
[표 1] (계속)
Figure pct00014
[표 1] (계속)
Figure pct00015
[표 1] (계속)
Figure pct00016
[표 1] (계속)
Figure pct00017
[표 1] (계속)
Figure pct00018
[표 1] (계속)
Figure pct00019
[표 11]
Figure pct00020
[표 11]
Figure pct00021
[표 11]
Figure pct00022
[표 11] (계속)
Figure pct00023
[표 11] (계속)
Figure pct00024
[표 11] (계속)
Figure pct00025
[표 12A]
Figure pct00026
[표 12B]
Figure pct00027
[표 12C]
Figure pct00028
<110> Veridex, LLC <120> Diagnostic biomarkers of diabetes <130> 3035534 (VDX5053) <150> US 60/987,540 <151> 2007-11-13 <160> 87 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ccctgtactt catcgacaag c 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gccagggcaa tgatgaatg 19 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tgaaaagaac tgtgcgaaat tc 22 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 agcagcagcc cacagtgt 18 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ctcaatatgg ataatcaaga gttgct 26 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 cactttctgt gttctctgtc ttcag 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 agagcaggca atgaaaagga ggaag 25 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 tctaccccca gatccaagca gcct 24 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 ccttgttttg ccgaaagagg aagtaca 27 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 tgaaaagaac tgtgcgaaat tc 22 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 cactttctgt gttctctgtc ttcag 25 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ccttgttttg ccgaaagagg aagtaca 27 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gccagggcaa tgatgaatg 19 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 ctcaatatgg ataatcaaga gttgct 26 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 tctaccccca gatccaagca gcct 24 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 ccctgtactt catcgacaag c 21 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 agcagcagcc cacagtgt 18 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 agagcaggca atgaaaagga ggaag 25 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 gaagagtgtg tgtctatgtg catttaaa 28 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 ctaaacggca gcacaaaagg a 21 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 cagccaaggc atcaagatca 20 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 cattcaactc caggacatgg aa 22 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 gcatgcttga gatggctaca tc 22 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 ccatttaggc aaataagcac tcctt 25 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 gctctgctca gccctaaaga aa 22 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 ctgcccaagt ctgtccagaa c 21 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 cacccggaca cttgatcgat 20 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 caagttgctc catctgattc ttaaatt 27 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 catgtcttat ggctaacacg tttctt 26 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 gagcgccatt gacaagcaat 20 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 tccccaagac accagaataa aact 24 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 tggtcacgcg acggtagat 19 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 gcctcagcag tgtttttaac aaag 24 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 tcctcaatat tggcagaaaa tcct 24 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 cctgactgtg ggacaacctc tt 22 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 gttcattgaa aaccctcgct aga 23 <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 cacattcaca cgggaagaca ggctca 26 <210> 38 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 tgcaaaccaa cagactcagc aaacaagg 28 <210> 39 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 tcatccttgg tgctgtcttc gctcttgtt 29 <210> 40 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 aggcctctct ctgccctttg actgga 26 <210> 41 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 tccttactcg gagtgccaaa atgctgc 27 <210> 42 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 aagccgctgc cttctggtta caatttaca 29 <210> 43 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 cctccccctc ctaaagagac actgcctg 28 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 atcagcaatc cgagatcgat ggcct 25 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 accgcctcca accagttcca ccac 24 <210> 46 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 gaagagtgtg tgtctatgtg catttaaa 28 <210> 47 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 caagttgctc catctgattc ttaaatt 27 <210> 48 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 cacattcaca cgggaagaca ggctca 26 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 ctaaacggca gcacaaaagg a 21 <210> 50 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 catgtcttat ggctaacacg tttctt 26 <210> 51 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 tgcaaaccaa cagactcagc aaacaagg 28 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 cacccggaca cttgatcgat 20 <210> 53 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 gttcattgaa aaccctcgct aga 23 <210> 54 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 accgcctcca accagttcca ccac 24 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 gcatgcttga gatggctaca tc 22 <210> 56 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 tggtcacgcg acggtagat 19 <210> 57 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 tccttactcg gagtgccaaa atgctgc 27 <210> 58 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 ccatttaggc aaataagcac tcctt 25 <210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 gcctcagcag tgtttttaac aaag 24 <210> 60 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 aagccgctgc cttctggtta caatttaca 29 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 gctctgctca gccctaaaga aa 22 <210> 62 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 tcctcaatat tggcagaaaa tcct 24 <210> 63 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 63 cctccccctc ctaaagagac actgcctg 28 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 cagccaaggc atcaagatca 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 gagcgccatt gacaagcaat 20 <210> 66 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 tcatccttgg tgctgtcttc gctcttgtt 29 <210> 67 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 cattcaactc caggacatgg aa 22 <210> 68 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 68 tccccaagac accagaataa aact 24 <210> 69 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 aggcctctct ctgccctttg actgga 26 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 ctgcccaagt ctgtccagaa c 21 <210> 71 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 71 cctgactgtg ggacaacctc tt 22 <210> 72 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 72 atcagcaatc cgagatcgat ggcct 25 <210> 73 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 73 acctgagcgc tcctaagaaa tg 22 <210> 74 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 74 agggccgcac cagttattc 19 <210> 75 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taqman probe <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 6-carboxyfluorescein (FAM)-dATP <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> dCMP - BHQ1 (Black Hole Quencher-1) <400> 75 ngcgcgcttt ggccttgatc aan 23 <210> 76 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 76 cgtcgacttc ttggttacat tcc 23 <210> 77 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 77 cacgacgcta aagctattct aaagac 26 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taqman probe <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 6-carboxyfluorescein (FAM)-dCTP <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> dCMP - BHQ1 (Black Hole Quencher-1) <400> 78 nagccgctgt cgctcgtcac n 21 <210> 79 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 79 gaaagcgcgg ccatcaac 18 <210> 80 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 80 cagctcgtag tatttcgctt gct 23 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taqman probe <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 6-carboxyfluorescein (FAM)-dTTP <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> dGMP - BHQ1 (Black Hole Quencher-1) <400> 81 nccttgggcg gaggtggcat n 21 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 82 gctacccgtg ccatacacag a 21 <210> 83 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 gcagatatgg ttcattcaag aaaca 25 <210> 84 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taqman probe <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 6-carboxyfluorescein (FAM)-dTTP <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> dAMP - BHQ1 (Black Hole Quencher-1) <400> 84 ntctactgtg acaatcaaag ggcgaccn 28 <210> 85 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 85 cctggcaccc agcacaat 18 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 86 gccgatccac acggagtact t 21 <210> 87 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taqman probe <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 6-carboxyfluorescein (FAM)-dATP <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> dCMP - BHQ1 (Black Hole Quencher-1) <400> 87 ntcaagatca ttgctcctcc tgagcgn 27

Claims (40)

  1. a. 환자로부터 채취한 시험 샘플을 제공하는 단계;
    b. TOP1, CD24 및 STAP1 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 유전자를 포함하는 유전자 시그너쳐 (signature)의 유전자 발현 프로필을 측정하는 단계;
    c. 상기 유전자 발현 프로필을 상기 유전자 시그너쳐의 진단적 유전자 발현 프로필과 비교하는 단계;
    d. 적어도 부분적으로는 상기 유전자 발현 프로필과 상기 진단적 유전자 발현 프로필 사이의 실질적인 일치를 기초로 하여 상기 환자의 당뇨병 질병 상태를 결정하는 단계;
    e. 상기 결정을 의료 전문가에게 제시하는 단계를 포함하는, 환자에서 진성 당뇨병을 진단하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 결정 단계가 유전자 발현 신호의 선형 조합, 선형 회귀 모델, 로지스틱 회귀 모델, 선형 판별 분석 (LDA) 모델, 최근린 모델 및 마이크로어레이 예측 분석 (PAM)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 알고리즘을 실행하는 컴퓨터 시스템에 의해 실시되는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 결정 단계가 환자의 대사 질병 프로필의 분석을 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 유전자 시그너쳐가 표 1 또는 표 6에 나열된 유전자들로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 당뇨병 질병 상태가 전기 당뇨병 질병 상태 또는 제2형 당뇨병 질병 상태인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 시험 샘플이 혈액 샘플인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 시험 샘플이 PBMC 또는 CD11c+ 또는 CD11b+ 또는 Emr+ 또는 [CD11b+ CD11c+] 또는 [Emr+ CD11b+] 또는 [Emr+ CD11c+] 또는 [Emr+ CD11b+ CD11c+] 세포 또는 CD14+ 단핵구를 포함하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 측정 단계가 실시간 PCR 또는 면역화학 분석 또는 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화를 포함하는 방법.
  9. a. 환자로부터 채취한 시험 샘플을 제공하는 단계;
    b. 상기 시험 샘플에서 TULP4, AA741300, ESCO1, EIF5B, ACTR2, WNK1, COCH, SON, TPR 및 NOG 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 유전자를 포함하는 유전자 시그너쳐의 유전자 발현 프로필을 측정하는 단계;
    c. 상기 유전자 발현 프로필을 상기 유전자 시그너쳐의 진단적 유전자 발현 프로필과 비교하는 단계;
    d. 적어도 부분적으로는 상기 유전자 발현 프로필과 상기 진단적 유전자 발현 프로필 사이의 실질적인 일치를 기초로 하여 상기 환자의 당뇨병 질병 상태를 결정하는 단계; 및
    e. 상기 결정을 의료 전문가에게 제시하는 단계를 포함하는, 환자에서 진성 당뇨병을 진단하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 유전자 시그너쳐의 유전자 발현 프로필이 TULP4, AA741300, ESCO1, EIF5B, ACTR2, WNK1, COCH, SON, TPR 및 NOG 유전자를 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 결정 단계가 유전자 발현 신호의 선형 조합, 선형 회귀 모델, 로지스틱 회귀 모델, 선형 판별 분석 (LDA) 모델, 최근린 모델 및 마이크로어레이 예측 분석 (PAM)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 알고리즘을 실행하는 컴퓨터 시스템에 의해 실시되는 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 결정 단계가 환자의 대사 질병 프로필의 분석을 추가로 포함하는 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 당뇨병 질병 상태가 전기 당뇨병 질병 상태 또는 제2형 당뇨병 질병 상태인 방법.
  14. 제9항에 있어서, 상기 시험 샘플이 혈액 샘플인 방법.
  15. 제9항에 있어서, 상기 시험 샘플이 PBMC 또는 CD11c+ 또는 CD11b+ 또는 Emr+ 또는 [CD11b+ CD11c+] 또는 [Emr+ CD11b+] 또는 [Emr+ CD11c+] 또는 [Emr+ CD11b+ CD11c+] 세포 또는 CD14+ 단핵구를 포함하는 방법.
  16. 제9항에 있어서, 상기 측정 단계가 실시간 PCR, 면역화학 분석 또는 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화를 포함하는 방법.
  17. a. 환자로부터 채취한 시험 샘플을 제공하는 단계;
    b. 상기 시험 샘플에서 TCF7L2 및 CLC 유전자를 포함하는 유전자 시그너쳐의 유전자 발현 프로필을 측정하는 단계;
    c. 상기 유전자 발현 프로필을 상기 유전자 시그너쳐의 진단적 유전자 발현 프로필과 비교하는 단계;
    d. 적어도 부분적으로는 상기 유전자 발현 프로필과 상기 진단적 유전자 발현 프로필 사이의 실질적인 일치를 기초로 하여 상기 환자의 당뇨병 질병 상태를 결정하는 단계; 및
    e. 상기 결정을 의료 전문가에게 제시하는 단계를 포함하는, 환자에서 진성 당뇨병을 진단하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 결정 단계가 유전자 발현 신호의 선형 조합, 선형 회귀 모델, 로지스틱 회귀 모델, 선형 판별 분석 (LDA) 모델, 최근린 모델 및 마이크로어레이 예측 분석 (PAM)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 알고리즘을 실행하는 컴퓨터 시스템에 의해 실시되는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 결정 단계가 환자의 대사 질병 프로필의 분석을 추가로 포함하는 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 유전자 시그너쳐가 표 1 또는 표 6에 나열된 유전자들로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 추가로 포함하는 방법.
  21. 제17항에 있어서, 상기 당뇨병 질병 상태가 전기 당뇨병 질병 상태 또는 제2형 당뇨병 질병 상태인 방법.
  22. 제17항에 있어서, 상기 시험 샘플이 혈액 샘플인 방법.
  23. 제17항에 있어서, 상기 시험 샘플이 PBMC 또는 CD11c+ 또는 CD11b+ 또는 Emr+ 또는 [CD11b+ CD11c+] 또는 [Emr+ CD11b+] 또는 [Emr+ CD11c+] 또는 [Emr+ CD11b+ CD11c+] 세포 또는 CD14+ 단핵구를 포함하는 방법.
  24. 제17항에 있어서, 상기 측정 단계가 실시간 PCR, 면역화학 분석 또는 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화를 포함하는 방법.
  25. a. 제1 시점에서 환자로부터 채취한 제1 시험 샘플을 제공하는 단계;
    b. 상기 제1 샘플에서, TOP1, CD24 및 STAP1 유전자를 포함하는 제1 군의 유전자로부터, 또는 TULP4, AA741300, ESCO1, EIF5B, ACTR2, WNK1, COCH, SON, TPR 및 NOG 유전자를 포함하는 제2 군의 유전자로부터 선택된 유전자 시그너쳐의 제1 발현 프로필을 측정하는 단계;
    c. 제2 시점에서 상기 환자로부터 채취한 제2 시험 샘플을 제공하는 단계;
    d. 상기 제2 시험 샘플에서 상기 유전자 시그너쳐의 제2 발현 프로필을 측정하는 단계;
    e. 상기 제1 발현 프로필을 상기 제2 발현 프로필과 비교하는 단계;
    f. 적어도 부분적으로는 상기 제1 유전자 발현 프로필과 상기 제2 유전자 발현 프로필 사이의 실질적인 차이를 기초로 하여 상기 환자의 당뇨병 질병 상태의 변화를 결정하는 단계; 및
    g. 상기 결정을 의료 전문가에게 제시하는 단계를 포함하는, 환자의 당뇨병 질병 상태의 변화를 진단하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 결정 단계가 유전자 발현 신호의 선형 조합, 선형 회귀 모델, 로지스틱 회귀 모델, 선형 판별 분석 (LDA) 모델, 최근린 모델 및 마이크로어레이 예측 분석 (PAM)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 알고리즘을 실행하는 컴퓨터 시스템에 의해 실시되는 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 결정 단계가 환자의 대사 질병 프로필의 분석을 추가로 포함하는 방법.
  28. 제25항에 있어서, 상기 제1 시점과 상기 제2 시점 사이의 기간이 0 내지 2년 또는 1/4 내지 2년 또는 1/2 내지 2년 또는 2 내지 5년, 또는 5 내지 10년 또는 그 이상인 방법.
  29. 제25항에 있어서, 상기 당뇨병 질병 상태가 전기 당뇨병 질병 상태 또는 제2형 당뇨병 질병 상태인 방법.
  30. 제25항에 있어서, 상기 제1 및 제2 시험 샘플이 혈액 샘플인 방법.
  31. 제25항에 있어서, 상기 측정 단계가 실시간 PCR, 면역화학 분석 또는 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화를 포함하는 방법.
  32. 당뇨병에 대한 환자의 감수성을 평가하기 위한 키트로서, 상기 평가가 시험 장치를 사용하여 실시되고, 상기 키트가
    a. 환자로부터 시험 샘플을 수집하기 위한 시약; 및
    b. 환자의 시험 샘플에서 TCF7L2 및 CLC 유전자 또는 이들의 변이체를 포함하는 유전자 시그너쳐의 발현 프로필을 측정하기 위한 시약, 및 이에 대한 포장재를 포함하는 키트.
  33. 제32항에 있어서, 시험 샘플을 수집하기 위한 상기 시약이 혈액 샘플을 수집하기 위한 시약인 키트.
  34. 제32항에 있어서, 유전자 시그너쳐의 발현 프로필을 측정하기 위한 상기 시약이 실시간 PCR 또는 면역화학 분석 또는 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화를 위한 시약인 키트.
  35. 당뇨병에 대한 환자의 감수성을 평가하기 위한 키트로서, 상기 평가가 시험 장치를 사용하여 실시되고, 상기 키트가
    a. 환자로부터 시험 샘플을 수집하기 위한 시약; 및
    b. 환자의 시험 샘플에서 TOP1, CD24 및 STAP1 유전자를 포함하는 유전자 시그너쳐의 유전자 발현 프로필을 측정하기 위한 시약, 및 이에 대한 포장재를 포함하는 키트.
  36. 제35항에 있어서, 시험 샘플을 수집하기 위한 상기 시약이 혈액 샘플을 수집하기 위한 시약인 키트.
  37. 제35항에 있어서, 유전자 시그너쳐의 발현 프로필을 측정하기 위한 상기 시약이 실시간 PCR 또는 면역화학 분석 또는 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화를 위한 시약인 키트.
  38. 당뇨병에 대한 환자의 감수성을 평가하기 위한 키트로서, 상기 평가가 시험 장치를 사용하여 실시되고, 상기 키트가
    a. 환자로부터 시험 샘플을 수집하기 위한 시약; 및
    b. 환자의 시험 샘플에서 TULP4, AA741300, ESCO1, EIF5B, ACTR2, WNK1, COCH, SON, TPR 및 NOG 유전자를 포함하는 유전자 시그너쳐의 유전자 발현 프로필을 측정하기 위한 시약, 및 이에 대한 포장재를 포함하는 키트.
  39. 제38항에 있어서, 시험 샘플을 수집하기 위한 상기 시약이 혈액 샘플을 수집하기 위한 시약인 키트.
  40. 제38항에 있어서, 유전자 시그너쳐의 발현 프로필을 측정하기 위한 상기 시약이 실시간 PCR 또는 면역화학 분석 또는 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화를 위한 시약인 키트.
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