JP5926183B2 - 疾患関連ｋｉｒハプロタイプの決定 - Google Patents

Description

本発明は分子診断方法に関し、より具体的には、特定の遺伝子型が疾患に関連することが既知である場合に個体の遺伝子型を決定する方法に関する。

本発明は、単一個体又は同時試験される複数個体の各々におけるナチュラルキラー細胞免疫グロブリン様受容体（natural killer cell immunoglobulin-like receptor：ＫＩＲ）遺伝子の配列を決定する方法である。

ナチュラルキラー細胞
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は先天性免疫系の一部であり、感染や腫瘍に対する早期防御に特化している。ＮＫ細胞は当初、腫瘍細胞標的を死滅させる能力を有することから発見された。細胞溶解性のＴ細胞とは異なり、ＮＫ細胞は非主要組織適合（遺伝子）複合体（非ＭＨＣ）標的に限定してこれを死滅させることができる。先天性免疫系の重要な要素の一つであるＮＫ細胞は、ヒト体内の総循環リンパ球の約１０％を占める。

他の細胞を死滅させる能力を有するＮＫ細胞は、通常は厳格な管理下に置かれている。体内の正常細胞は全て、その表面にＭＨＣクラスＩ分子を発現している。これらの分子が正常細胞を、ＮＫ細胞によって殺されないよう保護している。その理由は、ＮＫ細胞上に見られる受容体の多くが、ＭＨＣクラスＩ分子をリガンドとするためである。表面上に十分なＭＨＣクラスＩを有さない細胞は、ＮＫ細胞により「異常」として認識され、殺される。異常な細胞を死滅させると同時に、ＮＫ細胞は、サイトカイン反応も誘発する。

ナチュラルキラー細胞は、癌及びウイルス感染に対する即戦力を構成している。この特化した白血球は、骨髄で産生され、血液を循環し、脾臓等のリンパ系組織に集積される。ＮＫ細胞の活性は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タンパク質のサブセットに依存している。ＨＬＡは、健康な細胞上に生じるが、ウイルスや癌で弱まった細胞では脱落する。ＨＬＡタンパク質は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）遺伝子によってコードされる。ＮＫ細胞は、ＨＬＡタンパク質を欠いた細胞に遭遇すると、それらを攻撃して破壊し、それらがウイルス又は癌を更に拡散させるのを防いでいる。ＮＫ細胞を他の免疫系細胞から区別しているのは、その防御反応が迅速且つ広範である点である。他の白血球は、作用がより緩慢であり、通常は損傷を受けた細胞よりも、むしろ特定の病原体（例えば癌、ウイルス、細菌等）を標的とする。

ＫＩＲ遺伝子
ナチュラルキラー細胞免疫グロブリン様受容体（natural killer cell immunoglobulin-like receptor：ＫＩＲ）遺伝子ファミリーは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面上に見られる重要なタンパク質をコードする複数の受容体ファミリーのうちの１つである。ＫＩＲ遺伝子のサブセットである抑制性ＫＩＲは、ヒトＭＨＣにコードされるＨＬＡクラスＩ分子と相互作用する。斯かる相互作用によって、ＮＫ細胞と体内の他の細胞（例えば正常細胞、ウイルス感染細胞、癌細胞等）とのコミュニケーションが可能になる。ＮＫ細胞上のＫＩＲ分子と他の細胞上のＨＬＡクラスＩ分子との斯かるコミュニケーションは、体内の細胞がＮＫ細胞により自己又は非自己として認識されるか否かの決定に関与している。「非自己」と見做された細胞は、ＮＫ細胞の標的となって殺される。

ＫＩＲ遺伝子及びタンパク質の構造
ＫＩＲ遺伝子ファミリーは１６の遺伝子（KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DL1/S1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR2DP1及びKIR3DP1）からなる。ＫＩＲ遺伝子クラスターは、１９番染色体上（19q13.4）に位置する白血球受容体複合体（Leukocyte Receptor Complex：ＬＲＣ）の１００〜２００ｋｂの領域内に位置している（rowsdale J. (2001) Genetic and functional relationships between MHC and NK receptor genes. Immunity, Sep;15(3):363-374）。この遺伝子複合体は、進化過程での哺乳類及び齧歯類間の分岐後に生じた遺伝子重複によって生じたものと考えられている（Barten R., et al. (2001) Divergent and convergent evolution of NK-cell receptors. Trends Immunol., Jan;22(l):52-57）。ＫＩＲ遺伝子は、僅か２．４ｋｂの配列により隔てられた頭尾配置を取るが、3DP1と2DL4との間にある１４ｋｂの配列は除かれる。ＫＩＲ遺伝子は遺伝子重複により生じたので、これらは配列が非常に類似しており、互いに９０〜９５％の同一性を示す。継承されるＫＩＲ遺伝子の数や型はヒト個体により異なる。ＫＩＲ遺伝子型は個体間及び民族内で大きく異なる場合がある（Parham P. (2005) Immunogenetics of killer cell immunoglobulin-like receptors. Molecular immunology, Feb;42(4):459-462; and Single RM, et al. (2007) Global diversity and evidence for coevolution of KIR and HLA, Nature genetics, Sep;39(9):l 114-1119）。染色体レベルでは、異なる２種のＫＩＲハプロタイプが存在する（図１参照。出典はMartin et al. Immunogenetics. (2008) Dec;60(12):767-774）。ハプロタイプＡには、2DS4以外の刺激性ＫＩＲ遺伝子（2DS及び3DS1）も、2DL5遺伝子も、2DL2遺伝子も含まれない。ハプロタイプＢに含まれる遺伝子はより多様であり、異なるハプロタイプＢには異なる数の刺激性遺伝子（１又は２の2DL5遺伝子等）が含まれる（Martin MP, et al. (2008) ＫＩＲ haplotypes defined by segregation analysis in 59 Centre d'Etude Polymorphisme Humain (CEPH) families. Immunogenetics, Dec;60(12):767-774.）

ＫＩＲタンパク質は全て、２又は３の細胞外免疫グロブリン様ドメイン及び細胞質側末端によって、細胞膜に固定されている。９個のＫＩＲ遺伝子（KIR2DL及びKIR3DL）は、免疫チロシン系抑制性モチーフ（immune tyrosine based-inhibitory motifs：ITIM）を含む長い細胞質尾部を有するタンパク質をコードする。これらのＫＩＲタンパク質は、細胞外ドメインがそのリガンドに接触すると、ナチュラルキラー細胞に抑制シグナルを送ることができる。残りのＫＩＲ遺伝子は、短い細胞質尾部を有するタンパク質をコードする。これらのタンパク質は、DAP12等のアダプター分子を介して活性化シグナルを送ることができる（Snyder MR et al (2004) Stimulatory killer Ig-like receptors modulate T cell activation through DAP12-dependent and DAP12-independent mechanisms. J Immunol. Sep 15;173(6):3725-3731; 及びCarr WH et al. (2007) Cutting Edge: KIR3DS1, a gene implicated in resistance to progression to AIDS, encodes a DAP12-associated receptor expressed on NK cells that triggers NK cell activation. J Immunol. Jan 15;178(2):647- 651.）。

ＫＩＲ受容体の構造及び各ＫＩＲ受容体のＨＬＡクラスＩリガンドの同一性を図２に示す（Parham P. et al., Alloreactive killer cells: hindrance and help for hematopoietic transplants. Nature Rev. Immunology. (2003)3:108-122 から引用）。ナチュラルキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の命名法では、細胞外免疫グロブリン様ドメインの数（2D又は3D）及び細胞質尾部の長さ（長いものはL、短いものはS）を記述する。各免疫グロブリン様ドメインは円形に記載し、細胞質尾部中の各免疫受容体チロシン系抑制性モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif：ITIM）は楕円形（oblong shape）で、膜貫通領域内の各正電荷残基は菱形で表す。刺激性ＫＩＲはイタリック体で記す（Parham P. et al, Alloreactive killer cells: hindrance and help for hematopoietic transplants. Nature Rev. Immunology. (2003)3:108-122）。

ＫＩＲとそれらのＨＬＡクラスＩリガンドとの間の相互作用の強度は、ＫＩＲ配列及びＨＬＡ配列の双方に依存し得る。ＨＬＡ領域は４０年間以上研究されているが、ＫＩＲ分子は１９９０年代中頃に初めて報告された（Lanier et al. (1995) The NKB1 and HP-3E4 NK cells receptors are structurally distinct glycoproteins and independently recognize polymorphic HLA-B and HLA-C molecules. J Immunol. Apr l ;154(7):3320-3327及びLitwin V. et al. (1994) NKBl : a natural killer cell receptor involved in the recognition of polymorphic ＨＬＡ-B molecules. J Exp Med. Aug 1 ; 180(2):537-543）。発見当初の数年間は異なるＫＩＲ遺伝子の説明に費やされ、個々のＫＩＲ遺伝子型を決定するための方法が開発された。これらの方法を用いることで、ＫＩＲ遺伝子と自己免疫性疾患との関係や、同種異系造血細胞移植後のレシピエントの生存が示されてきた（Parham P. (2005) MHC class I molecules and KIRs in human history, health and survival. Nature reviews, Mar;5(3):201-214）。現在では、各ＫＩＲ遺伝子が複数の配列を有することが明らかになっている。すなわち、各ＫＩＲ遺伝子が、一塩基多型（ＳＮＰ）や、場合によってはコード配列内の挿入又は欠失によって、可変配列を有する。KIR3DL1多型は、ナチュラルキラー細胞上でのKIR3DL1の発現のみならず、KIR3DL1のリガンドに対する結合親和性にも影響を及ぼし得ることが、複数の研究によって示されている（Gardiner CM et al. (2001)）。DX9抗体によって定義される異なるＮＫ細胞表面表現型は、KIR3DL1遺伝子多型に起因する（J Immunol. Mar 1 ;166(5):2992-3001; Pando MJ et al. (2003)）。KIR3DL1の共通の対立遺伝子からなるタンパク質（3DL1 *004）は、Ｉｇドメイン０の位置８６及びＩｇドメイン１の位置１８２における置換のために、細胞表面では殆ど発現されない（J Immunol. Dec 15;171(12):6640-6649; O’Connor GM, et al. (2007) Functional polymorphism of the KIR3DL1/S1 receptor on human NK cells. J Immunol. Jan 1;178(1):235-241; 及びThananchai H et al. (2007) Cutting Edge: Allele-specific and peptide-dependent interactions between KIR3DL1 and HLA- A and HLA-B. J Immunol Jan l ;178(l):33-37）。

ＫＩＲと疾患との関係
ヒト疾患におけるＫＩＲの役割を調査するための複数の研究により、種々のＫＩＲ遺伝子と、ＣＭＶ、ＨＣＶ、及びＨＩＶ等のウイルス感染、自己免疫疾患、癌並びに子癇前症との関係が証明されてきた（Parham P. (2005) MHC class I molecules and KIRs in human history, health and survival. Nature reviews, Mar;5(3):201-214）。炎症性自己免疫腸疾患（inflammatory autoimmune bowel disease）であるクローン病に関する近年の研究では、KIR2DL2及びKIR2DL3がヘテロ接合性であり、C2リガンドがホモ接合性である患者は疾患に罹り易いのに対して、C1リガンドは保護性であることが明らかとなった（Hollenbach J A et al. (2009) Susceptibility to Crohn's Disease is mediated by KIR2DL2/KIR2DL3 heterozygosity and the ＨＬＡC ligand. Immunogenetics. Oct;61(10):663-71）。その他、ＫＩＲと急性骨髄白血病（ＡＭＬ）のための非血縁造血細胞移植（ＨＣＴ）とに関する複数の研究では、Ａ／Ａドナーと比較して、Ｂ／ｘドナーでは３年間の全生存率が有意に高く、無再発生存率のリスクにも３０％の改善が見られたことが示されている（Cooley S, et al. (2009) Donors with group B ＫＩＲ haplotypes improve relapse- free survival after unrelated hematopoietic cell transplantation for acute myelogenous leukemia. Blood. Jan 15;113(3):726-732;及び Miller JS, et al. (2007) Missing ＫＩＲ- ligands is associated with less relapse and increased graft versus host disease (GVHD) following unrelated donor allogeneic HCT. Blood, 109(11):5058-5061）。斯かる研究は、患者及び対照のＫＩＲ遺伝子型に関する知識に基づいて行われてきたが、ＫＩＲの対立遺伝子のレベルでは行われていない。多くの特異的ＨＬＡ対立遺伝子がヒトの疾患に重要であることが示されており（例えばHLA-DR3及びHLA-DR4とＩ型糖尿病との関係、HLA-DR8と若年性関節リウマチとの関係等）、ＫＩＲの遺伝子型を対立遺伝子レベルで同定することができれば、ＫＩＲとヒト疾患との関連付けに関する研究はより洗練されるであろう。

本発明は、１又は２以上の個体についてＫＩＲ遺伝子型を並行して決定する方法であって、各個体につき、フォワードプライマー及びリバースプライマーによる増幅反応を実施し（ここで、各プライマーは、アダプター配列、個体識別配列、及びＫＩＲハイブリダイズ配列を含む）、多型部位を含むＫＩＲ遺伝子のエキソン配列を増幅してＫＩＲアンプリコンを取得し、第１の工程で得られた複数の個体に由来するＫＩＲアンプリコンをプールし、エマルジョンＰＣＲを実施し、ピロシーケンスを用いて各個体の各ＫＩＲアンプリコン配列を並行して決定し、前工程で決定されたＫＩＲアンプリコンを既知のＫＩＲ配列と比較することにより、ＫＩＲ対立遺伝子を各個体に割り当て、どのＫＩＲ対立遺伝子が前記個体に存在するかを決定することを含む方法に関する。

一態様によれば、当該方法は、各個体に存在するＫＩＲハプロタイプを決定することを更に含む。一態様によれば、前記方法の第１の工程は、前記ＫＩＲアンプリコンの濃度を決定することを更に含む。一態様によれば、少なくとも１つのプライマーが、表２から選択されるＫＩＲ結合領域の配列を有する。一態様によれば、少なくとも１つのプライマーが、表３から選択された同定タグを有する。

他の態様によれば、当該方法は、特定のＫＩＲ対立遺伝子が前記個体に見られた場合に、当該個体に子癇前症又は自己免疫疾患の素因がある、又は、当該個体が適切な非血縁ドナーであると決定する工程を更に含む。ここで、当該方法は、割り当て工程で対立遺伝子KIRDL1が発見された場合に、前記個体に子癇前症の素因があると決定する工程を更に含む。他の態様によれば、当該方法は、割り当て工程で対立遺伝子KIRD2DS1が発見された場合に、前記個体に子癇前症の素因があると決定する工程を更に含む。更に他の態様によれば、当該方法は、割り当て工程でグループＢのＫＩＲ対立遺伝子が発見された場合に、前記個体が適切な非血縁造血幹細胞ドナーであると決定する工程を更に含む。

他の態様によれば、当該方法は、前記個体のＨＬＡ遺伝子型を決定する工程を更に含む。更に他の態様によれば、当該個体のＨＬＡ遺伝子型を決定する工程の後、特定のＫＩＲ対立遺伝子と特定のＨＬＡ対立遺伝子との組み合わせが前記個体で発見された場合に、当該個体にＨＣＶ感染を除去する素因、ＨＩＶ感染からＡＩＤＳへの緩慢な進行の素因又はクローン病の素因があると決定する工程を更に含む。ここで、当該方法は、割り当て工程で対立遺伝子KIRDL1が発見され、ＨＬＡ遺伝子型同定工程でHLA-C1が発見された場合に、当該個体にＨＩＣ感染を除去する素因があると決定する工程を更に含む。他の態様によれば、当該方法は、割り当て工程で対立遺伝子KIR3DS1が発見され、ＨＬＡ遺伝子型同定工程で対立遺伝子HLA-Bw4が発見された場合に、当該個体にＨＩＶ感染からＡＩＤＳへの緩慢な進行の素因があると決定する工程を更に含む。更に他の態様によれば、当該方法は、割り当て工程で対立遺伝子KIR2DL2及びKIR2DL3が発見され、ＨＬＡ遺伝子型同定工程で対立遺伝子HLA-C2が発見された場合に、当該個体に前記クローン病の素因があると決定する工程を更に含む。

他の態様によれば、本発明は、１又は２以上の個体のＫＩＲ遺伝子型を並行して決定するためのＫＩＲアンプリコンを得るためのキットであって、アダプター領域と、個体識別タグと、ＫＩＲハイブリダイズ領域とを含むフォワードプライマー、及び、アダプター領域と、個体識別タグと、ＫＩＲハイブリダイズ領域とを含むリバースプライマー、を含むキットに関する。当該キットの一態様によれば、少なくとも１つのプライマーは表２から選択されるＫＩＲハイブリダイズ配列を含む。当該キットの一態様によれば、少なくとも１つのプライマーは表３から選択される個体識別タグを含む。態様によれば、当該キットは、プライマーが結合したビーズの１又は２以上の集合を更に含み、当該プライマーは、前記フォワードプライマー及びリバースプライマーのアダプター領域にハイブリダイズし得る。

他の態様によれば、本発明は、１又は２以上の個体のＫＩＲ遺伝子型を並行して決定するためのＫＩＲアンプリコンを得るための反応混合物であって、アダプター領域と、個体識別タグと、ＫＩＲハイブリダイズ領域とを含むフォワードプライマー、及び、アダプター領域と、個体識別タグと、ＫＩＲハイブリダイズ領域とを含むリバースプライマー、を含む一組のプライマーを含む反応混合物に関する。当該反応混合物の一態様によれば、少なくとも１つのプライマーは、表２から選択されるＫＩＲハイブリダイズ配列を含む。当該反応混合物の一態様によれば、少なくとも１つのプライマーは、表３から選択される個体識別タグを含む。一態様によれば、当該反応混合物は、プライマーが結合したビーズの１又は２以上の集合を更に含み、当該プライマーは、前記フォワードプライマー及びリバースプライマーのアダプター領域にハイブリダイズし得る。

図１は、ＫＩＲハプロタイプの模式図である。 図２は、ＫＩＲ受容体の構造の模式図及びそれらのＨＬＡクラスＩリガンドの同一性である。 図３は、全ＫＩＲ遺伝子のエキソン５の前半の配列のヌクレオチドアラインメントを表す。 図４は、全ＫＩＲ遺伝子のエキソン５の後半の配列のヌクレオチドアラインメントを表す。

Ｉ．定義
用語「対立遺伝子」（allele）は、遺伝子の配列変異体を意味する。遺伝子上の少なくとも１つの相違が対立遺伝子を構成し得る。ＫＩＲ遺伝子の場合、通常は遺伝子上の複数の差異が、１つの対立遺伝子を構成する。

用語「アンプリコン」（amplicon）は、標的核酸配列の全体又は断片を含み、任意の適切な増幅法によりインビトロで増幅産物として形成される核酸分子を意味する。

用語「多型」（polymorphism）は、ある集団内で、特定のヌクレオチド配列又はそれによりコードされるアミノ酸配列について、２種以上の変異体が見られる状態を意味する。多型位置（polymorphic position）とは、変異体を区別する多型塩基が生じる核酸部位を指す。「一塩基多型」（single nucleotide polymorphism：ＳＮＰ）は、単一のヌクレオチドからなる多型部位を意味する。

用語「ハプロタイプ」（haplotype）は、ある個体の同一の染色体上の異なる場所（遺伝子座位又は遺伝子）にある対立遺伝子の組み合わせを意味する。

用語「遺伝子型」（genotype）は、特定の遺伝子について、ある個体又は試料に含まれる当該遺伝子の対立遺伝子の総体を意味する。

ＫＩＲ遺伝子の「遺伝子型を決定する」（determining the genotype）とは、ある対象に存在するＫＩＲ遺伝子の個々の対立遺伝子に存在する多型を決定することを意味する。

用語「標的領域」（target region）又は「標的配列」（target sequence）は、ある試料内の調査対象となるポリヌクレオチド配列を意味する。本発明の場合、標的配列は、ある個体に由来する試料に含まれるＫＩＲ遺伝子配列である。

用語「オリゴヌクレオチド」（oligonucleotide）は、短い核酸、典型的には１０ヌクレオチド長以上の核酸を意味する。オリゴヌクレオチドは、当業界で公知の任意の適当な方法、例えばNarang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:90-99; Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:109-151; Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862; Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191 に記載の直接化学合成法、又はそれ以外の当業界で公知の方法によって調製される。

用語「プライマー」（primer）は、鋳型核酸の相補鎖に沿った核酸合成の始点として機能し得るオリゴヌクレオチドを意味する。通常は、鋳型核酸の部分配列（subsequence）と少なくとも部分的に相補的なプライマーであれば、鋳型核酸とハイブリダイズし、伸長を生じさせるのに十分である。他のプライマー長も適宜利用できるものの、プライマーは通常約６〜約１００ヌクレオチド長、より一般的には１５〜３５ヌクレオチド長のハイブリダイズ領域を含む。所定の標的配列の増幅に適したプライマーの設計は当業界で周知であり、本明細書で引用する文献にも記載されている。並行クローン増幅及び配列決定（parallel clonal amplification and sequencing）に適したプライマーの設計については、例えば米国出願公開第２０１０−００８６９１４号に記載されている。

「熱安定性核酸ポリメラーゼ」（thermostability）又は「熱安定性ポリメラーゼ」（thermostable polymerase）は、昇温下において、例えば大腸菌（E. coli）由来のポリメラーゼと比較した場合に、相対的に安定なポリメラーゼ酵素である。本明細書で使用する場合、熱安定性ポリメラーゼとは、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）の一般的な温度サイクル条件下での使用に適したものをいう。

プライマーの「アダプター領域」（adapter region）とは、プライマー配列の５’末端の領域であって、本発明の方法で得られるＫＩＲアンプリコンに普遍的に存在し、且つ、マイクロプレート（即ちビーズ）や他のエマルジョンＰＣＲ用固体表面上に存在するオリゴヌクレオチドとアニーリングする配列を提供する領域を意味する。アダプター領域は、配列決定用プライマーの結合部位としても機能する。アダプター領域は通常１５〜３０ヌクレオチド長である。

用語「ライブラリーキータグ」（library key tag）は、ＫＩＲ特異的なプライマーをコントロールのプライマーから識別する役割を果たす、プライマー配列内のアダプター領域の一部を意味する。

用語「マルチプレックス識別タグ」（multiplex identification tag）、「個体識別タグ」（individual identification tag）又は「ＭＩＤ」は、相互交換可能に使用され、特定の対象又は試料から得られたＤＮＡのマーカーとして機能するプライマーに存在するヌクレオチド配列を意味する。

用語「核酸」（nucleic acid）とは、ヌクレオチド（例えば、天然及び非天然双方の、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチド等）のポリマーを意味する。斯かるポリマーとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらの下位概念、例えばｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ等が挙げられる。核酸は一本鎖又は二本鎖であってもよく、通常は５’−３’ホスホジエステル結合を含むが、場合によっては、ヌクレオチド類似体は他の結合を有することもある。核酸は、天然の塩基（アデノシン、グアノシン、シトシン、ウラシル及びチミジン）であってもよく、非天然の塩基であってもよい。非天然塩基の例としては、例えば、Seela et al. (1999) Helv. Chim. Acta 82: 1640に記載のものが挙げられる。ヌクレオチド類似体に使用される塩基には、融解温度（Ｔ_ｍ）変更因子として機能するものがある。例としては、７−デアザプリン（例えば７−デアザグアニン、７−デアザアデニン等）、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、プロピロニル−ｄＮ（例えばプロピニル−ｄＵ、プロピニル−ｄＣ等）等が挙げられる（例えば米国特許番号第５，９９０，３０３号参照）。他の代表的な複素環塩基としては、例えば、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチン；２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチン、の８−アザ誘導体；アデニン、グアニン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチンの７−デアザ−８−アザ誘導体；６−アザシチジン；５−フルオロシチジン；５−クロロシチジン；５−ヨードシチジン；５−ブロモシチジン；５−メチルシチジン；５−プロピニルシチジン；５−ブロモビニルウラシル；５−フルオロウラシル；５−クロロウラシル；５−ヨードウラシル；５−ブロモウラシル；５−トリフルオロメチルウラシル；５−メトキシメチルウラシル；５−エチニルウラシル；５−プロピニルウラシル、等が挙げられる。

用語「天然ヌクレオチド」（natural nucleotide）とは、細胞ＤＮＡ及びＲＮＡにおいて天然に見られるプリン及びピリミジン含有ヌクレオチド、すなわちシトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）を意味する。

用語「非天然ヌクレオチド」（non-natural nucleotide）又は「修飾ヌクレオチド」（modified nucleotide）とは、修飾塩基、糖又はリン酸基を含むヌクレオチド、又は、非天然の部分が構造内に組み込まれたヌクレオチドを意味する。非天然ヌクレオチドは、ヌクレオチドの化学修飾によって製造し得る。化学修飾は、核酸ポリマーを構成するヌクレオチドに対して行ってもよく、核酸ポリマーに修飾ヌクレオチドを組み込む前に行ってもよい。別のアプローチとして、非天然ヌクレオチドは、核酸の酵素合成又は化学合成時に、修飾ヌクレオシド三リン酸をポリマー鎖内に組み込むことにより製造することもできる。非天然ヌクレオチドの例としては、ジデオキシヌクレオチド、ビオチニル化ヌクレオチド、アミノ化ヌクレオチド、脱アミノ化ヌクレオチド、アルキル化ヌクレオチド、ベンジル化ヌクレオチド及びフルオロフォア標識ヌクレオチドが挙げられる。

用語「核酸ポリメラーゼ」（nucleic acid polymerases）或いは単に「ポリメラーゼ」（polymerases）とは、核酸に対するヌクレオチドの組み込みを触媒する酵素、例えばＤＮＡポリメラーゼを指す。熱安定ＤＮＡポリメラーゼの例としては、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）、サーマス・カルドフィラス（Thermus caldophilus）、サーマス種Z05株（Thermus sp. ZO5）由来のもの（例えば米国特許第５，６７４，７３８号参照）、サーマス種Z05株（Thermus sp. ZO5）ポリメラーゼの変異体（例えば米国特許出願第１１／８７３，８９６号（２００７年１０月１７日出願）参照）、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）、サーマス・フラバス（Thermus flavus）、サーマス・フィリフォルミス（Thermus filiformis）、サーマス種sps17株（Thermus sp. sps17）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）、ホットスポリングファミリーＢ／クローン７（Hot Spring family B/clone 7）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・カルドテナクス（Bacillus caldotenax）、エシェリヒア・コリ（大腸菌）（Escherichia coli）テルモトガ・マリティマ、（Thermotoga maritima）、テルモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapolitana）及びテルモシフォ・アフリカナス（Thermosipho africanus）が挙げられる。多数の熱安定ＤＮＡポリメラーゼの全長核酸及びアミノ酸配列が、公共データベースから入手可能である。

用語「ポリメラーゼ連鎖反応増幅条件」（polymerase chain reaction amplification conditions）又は「ＰＣＲ条件」（PCR conditions）とは、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction：ＰＣＲ）時にポリメラーゼにより伸長される鋳型核酸にプライマーがハイブリダイズする条件を意味する。当業者には周知のように、斯かる条件には種々のものが存在し、通常はプライマー及び鋳型の性質による影響を受ける。種々のＰＣＲ条件が「PCR Strategies」（M. A. Innis, D. H. Gelfand, and J. J. Sninsky eds., 1995, Academic Press, San Diego, CA）の「Chapter 14; ＰＣＲ Protocols : A Guide to Methods and Applications」(M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White eds., Academic Press, NY, 1990）に記載されている。

用語「試料」（sample）とは、個体由来の核酸を含む（或いは含むと予想される）任意の組成物を意味する。試料は当業者に公知の任意の手法で取得し得る。斯かる試料としては、１又は２以上の個体から単離された一定量の組織又は流体、或いはその精製画分が上げられる。例としては、皮膚、血漿、血清、全血、血液成分、髄液、唾液、腹水、リンパ液、房水、硝子体液、滑液、尿、涙、精液、膣液、肺滲出液、漿膜滲出液、器官、気管支−肺胞洗液、腫瘍、及びパラフィン包埋組織等の種々の組織又は流体が挙げられる。試料としては更に、個体から得られた細胞を含むインビトロ培養物の成分又は要素、例えばこれらに限定されるものではないが、細胞培養培地中の細胞増殖により得られる馴化培地、組換細胞及び細胞要素が挙げられる。

II．緒言
個々のＫＩＲ遺伝子の配列を一度に一つずつ決定する手法によって報告されてきたＫＩＲ遺伝子の対立遺伝子は多数にのぼるが（表１：対立遺伝子数３３５）、患者の試料内に存在する全てのＫＩＲ対立遺伝子を一度で効率的に決定することが可能な方法は、これまで開発されていなかった。

本発明が提供するＫＩＲの遺伝子型の決定方法は、多重並行クローン配列決定（multiplex, parallel clonal sequencing）分析を用いることによって、全部で１６のＫＩＲ遺伝子に存在する少なくとも１つのエキソンの遺伝子型を、複数の個体について同時に決定することが可能となる、という知見に基づくものである。「高度多重化アンプリコン配列決定法」（highly multiplexed amplicon sequencing）と呼ばれる次世代の配列決定法によれば、数百万の核酸分子を並行にクローン増殖させ、続いてこれらの配列を並行して決定することができる。近年ではチタン化学を用いることにより、斯かる次世代の配列決定法により取得し得る読み取り長（read lengths）は、４００ヌクレオチド長を超えるに至っている。斯かるクローン読み取り長（clonal read lengths）によって、複数の多型を連結した相をＫＩＲ遺伝子のエキソン内に設定することができ、惹いては各ＫＩＲ遺伝子の各対立遺伝子を同定することが可能となる。本発明の系は、一回の配列決定操作により、最大１０の個体について、１６種のＫＩＲ遺伝子の各々に関し、（各々複数の多型を有する）９つのエキソンの各々の遺伝子型を同時に決定できるほど、高いスループットを有する。

本発明の方法は、長い読み取りを生成可能な高スループット配列決定技術を利用する。特に、ピロシーケンス（pyrosequencing）技術を用いた高度多重化アンプリコン配列決定法を利用するのが有利である。この技術は、ピロリン酸の放出及び同時酵素ヌクレオチド分解による塩基組み込みの検出に基づくものである。これは例えば、米国特許第６，２７４，３２０号、第６，２５８，５６８号及び第６，２１０，８９１号に記載されている。ある実施例によれば、この技術には、エマルジョンＰＣＲ（emPCR^（商標））を用いる。これは米国特許出願公開第２０１０−００８６９１４号に記載されている。

ＫＩＲ遺伝子型決定に伴う技術的な課題の一つは、多数の多型を連結した相（phase）の設定の困難性にある。本発明は、相の曖昧さの課題を、クローン配列決定を用いて解決するものである。クローン化により得られる長配列決定反応によって、「ＫＩＲ遺伝子シグナチュアモチーフ」（KIR gene signature motif）を、多型部位を含むより長い配列に特異的に連結し、特定のＫＩＲ対立遺伝子を他のＫＩＲ配列から識別することが可能になる。クローン配列決定反応によって得られる配列が長いほど、各ＫＩＲ遺伝子に属する配列の同定はより容易となる。次世代配列決定法によれば、短時間で得られる連続配列の読み取りの数は桁違いに増大する。クローン配列決定用の殆どのプラットフォームでは、ペアードエンド配列決定（paired-end sequencing）で達成可能な読み取り長は２５〜６０塩基対（ｂｐ）にすぎない。454 Life Sciences（Branford, Conn.）によって開発され、Margulies M. 等（2005）（Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature. Sep 15;437(7057):376-380）によって報告されるクローン化ピロシーケンス法のみが、454 GS FLX チタニウムシステム（454 Life Sciences, Branford, Conn.）を用いて４００ｂｐを超える読み取り長を達成したのである。

Ｉ．プライマー
本発明の方法では、個体由来の各試料の各ＫＩＲエキソンが増幅される。本発明の方法に使用されるプライマーは、ＫＩＲプライミング領域（別名ＫＩＲ特異領域）を含む。ＫＩＲ特異領域は所望のＫＩＲ配列（例えばエキソン、エキソンの一部、又はエキソンとイントロンの一部等）に結合する。ある実施形態によれば、プライマーは、単一のＫＩＲ遺伝子に対して特異性を有する。即ち、プライマーは、単一のＫＩＲ遺伝子のエキソン又はエキソンの多型領域を、特異的に標的化して増幅する。他の実施形態によれば、プライマーは全てのＫＩＲ遺伝子に対し汎用である。即ち、全てのＫＩＲ遺伝子にある同一のエキソンにハイブリダイズして増幅させる。ある実施形態によれば、プライマーはイントロン配列の一部を含んでいてもよい。場合によっては、イントロン配列は、配列を割り当てるべきＫＩＲ遺伝子を同定するのに有用である。ある実施形態によれば、他の全てのＫＩＲ遺伝子と実質的に異なるイントロン配列を有するＫＩＲ遺伝子（例えば遺伝子KIR2DL4）のエキソンを増幅するべく、別のプライマーの組を加えてもよい。

例えば、表２に示すように、ある実施形態によれば、ＫＩＲ遺伝子のエキソン１及び２を標的化するプライマーは汎用である。ある実施形態によれば、ＫＩＲ遺伝子のエキソン３を標的化するプライマーのうち、一部のプライマーは全てのＫＩＲ遺伝子に汎用であり、他のプライマーはＫＩＲ遺伝子のサブセットに汎用であり、一部のプライマーは遺伝子特異的である。プライマーの選択は、検査対象となる各ＫＩＲ遺伝子内の各エキソンが、配列からＫＩＲ遺伝子型を一義的に決定するのに十分な特異性を以って増幅されるように行う。

増幅反応に使用されるプライマーは付加配列を含む。即ち、エマルジョンＰＣＲ用のアダプター配列と、単一の個体由来のＤＮＡのマーカーとして機能する同定配列である。クローン化ピロシーケンスに使用されるプライマー用のタグやアダプター等の機能要素についての説明は、米国特許出願第１０／７６７，８９４号（２００４年１月２８日出願）、第１２／１５６，２４２号（２００８年５月２９日出願）、第１２／２４５，６６６号（２００８年１０月３日出願）、及び第１２／３８０，１３９号（２００９年２月２３日出願）を参照のこと。

プライマー配列のアダプター部位はプライマーの５’末端に存在する。アダプターは配列決定プライマーのアニーリングの部位として機能するとともに、エマルジョンＰＣＲに使用される固体支持体（ビーズ等）上に存在する配列に対応し、アンプリコンが固体支持体にアニールするのを可能としている。

本発明の方法に使用されるプライマーは、更に個体識別タグ又はＭＩＤタグを含む。ＭＩＤタグはプライマーのアダプター領域とＫＩＲプライミング領域との間に存在する。これらのタグは、試験対象の各個体由来のＫＩＲアンプリコンをマークするのに使用される。結果として、同一の対象から得られるＫＩＲアンプリコンは全てが同一のタグによってマークされる。ＭＩＤタグも配列決定反応によって配列決定される。

ＭＩＤタグは通常少なくとも４ヌクレオチド長であるが、より長いＭＩＤタグ、たとえば６、８、又は１０以上のヌクレオチド長のものも有用である。斯かる配列の使用は当業界では周知である（Thomas, et al. (2006) Nat. Med., 12:852-855; Parameswaran et al,. (2007) Nucl. Acids Res., 35:e130; 及び Hofmann et al., (2007) Nucl. Acids Res. 35:e91参照）。

II．増幅及び配列決定
ＫＩＲアンプリコンは任意の種類の増幅反応によって得ることができる。本発明では、ＫＩＲアンプリコンは通常、上述のプライマー対を用いたＰＣＲによって形成される。通常は「高忠実度」（high-fidelity）核酸ポリメラーゼ、即ち低エラー率のポリメラーゼを使用することが好ましい。例としては高忠実度Taqポリメラーゼ（Roche Diagnostics）が挙げられる。

遺伝子型決定の各対象の増幅は個別に行う。個体対象由来のアンプリコンをプールしてその後のエマルジョンＰＣＲ及び配列分析に供する。

得られたＫＩＲアンプリコンのプールをビーズに結合させ、エマルジョンＰＣＲに供する。エマルジョンＰＣＲ当業界で公知である（米国特許出願公開第２０１０−００８６９１４号及び本文献内で引用される文献を参照）。エマルジョンＰＣＲでは、増幅されるべき鋳型（この場合はＫＩＲアンプリコン）を、固体支持体（好ましくは球状ビーズ）に対して、ビーズに連結されたプライマーへのハイブリダイゼーションを介して結合させる。

エマルジョンＰＣＲ増幅後、アンプリコンを有するビーズを単離する。続いてアンプリコンの配列を、ピロリン酸の放出及び同時酵素ヌクレオチド分解による塩基組み込みの検出に基づくＤＮＡ配列決定技術（米国特許第６，２７４，３２０号、第６，２５８，５６８号及び第６，２１０，８９１号に記載）を用いて決定する。

III．遺伝子配列の決定
個体ＤＮＡ分子の配列決定データが得られたら、エキソン配列を一義的に決定する。ＨＬＡ等の既知の遺伝子の中には、配列ファイルをＨＬＡ配列データベースと比較することにより、対立遺伝子配列が確立できるものもある。しかし、ＫＩＲ遺伝子の場合は、配列データベースが未完成である。

本発明が記載する方法は、ソフトウェアプログラムによって、複数患者由来のＫＩＲ遺伝子の１又は２以上のエキソンの配列を同時に決定し、存在するＫＩＲ遺伝子の対立遺伝子を決定するものである。

本発明の方法に関して例示するソフトウェアは、Conexio Genomics Pty. Ltd.（Fremantle, Western Australia）によって開発された。このソフトウェアは、この遺伝子ファミリー内の配列同一性を明白に決定することができる。本発明において有用なソフトウェアの典型例は、配列データをクローン配列決定装置からインポートできるソフトウェアである。ある実施形態によれば、塩基読み出しの正確性（base call accuracy）を向上させるべく、流通グラム数（flow grams）もインポート可能である。ある実施形態によれば、データセットを圧縮するべく、配列読み取りを統合するのが有利である。本ソフトウェアは続いて、試料タグ(ＭＩＤタグ)及びプライマーを同定する。タグを使用することで、複数試料を単一プレート上で一緒に試験することが可能となる。ソフトウェアは、タグ部位内での塩基スキッピング又は塩基挿入を許容し、これによってラベルの割り当てが不正確とならないように設計されていてもよい。

本ソフトウェアは、各クローン配列に適切な参照を割り当てるべく、標的遺伝子座及び共増幅され得る関連遺伝子の配列相同性を調べる能力を有する。エマルジョンＰＣＲにおいては、全ての標的及び共増幅遺伝子座位から得られたＤＮＡのクローンが混合されるため、固有の割り当てを得るためには、増幅され得る遺伝子座位の各々に対してこれらを検証し、配列を同定する必要がある。このプロセスは、イントロン配列を調べて遺伝子座位を相互に識別することにより支援することができる。

本ソフトウェアは更に、各標的遺伝子座のコンセンサス配列を生成する能力を有する。この配列は、各遺伝子座の２つの対立遺伝子の各々に由来する塩基の組み合わせを含む。初回マッチング段階では、配列間の相関係は考慮しない。

本発明のある実施形態によれば、初回遺伝子型決定は各遺伝子座の配列に基づいて実施してもよい。この工程が必要となるのは、ゲノム参照ライブラリーが不完全であり、ゲノム配列との完全な一致による結果が、非コーディング領域内の参照されていない対立遺伝子にバイアスされてしまうような場合である。本発明のある実施形態によれば、イントロン内の情報に基づいて、第２レベルの遺伝子型決定を実施する。これによって、初回遺伝子型の結果を改善し、分離能を向上させることが可能となる。

本発明のある実施形態によれば、クローン配列由来の相情報を用いて、配列決定された領域内における完全且つ一義的な対立遺伝子の照合を行ってもよい。本ソフトウェアによれば、ヘテロ接合配列の位置があまりに離れすぎていて、コンセンサス全体を通じて完全な相分離を行うことができない場合も、自動的に処理することが可能となる。

本発明で教示するような、ＫＩＲ複合体の対立遺伝子の高スループットな配列決定法の開発は、疾病関連性の研究に有用である。ある実施形態によれば、ＫＩＲ複合体の対立遺伝子の高スループットな配列決定によって、個体試料に存在するＫＩＲ対立遺伝子の特性に基づく、個体の疾病又は状態の予後や、治療に対する個体応答の予測が可能となる。

IV．セット及びキット
一実施形態によれば、本発明は、ＫＩＲ配列決定用のオリゴヌクレオチドプライマーのセットを提供する。このセットは、ＫＩＲ遺伝子の特定の部分を増幅するプライマーを含む。より具体的には、このセットは、ＫＩＲ遺伝子のエキソン又はエキソンの一部の増幅に適した、１又は２以上のプライマー対を含む。ある実施形態によれば、このセットは、患者に存在する各ＫＩＲ遺伝子内の各エキソン（又は各エキソンの一部）を増幅するためのプライマー対を含む。このセットのプライマーは、全てのＫＩＲ遺伝子に汎用である、即ち、全てのＫＩＲ遺伝子内の同じエキソンを増幅可能であることが（必須ではないが）好ましい。これらのプライマーは更に、エマルジョンＰＣＲ及び高スループットクローン配列決定に有用な付加配列を含む。これらの付加配列は、個体識別タグ（ＭＩＤタグ）と、（ライブラリータグを含む）アダプターとを含む。

ある実施形態によれば、本発明は、ＫＩＲ遺伝子の増幅及び配列決定のためのキットである。本発明のキットは通常、ＫＩＲ遺伝子のエキソン又はエキソンの一部の増幅に適した複数のプライマー対を含む。これらのプライマー対は、アダプター領域と、個体識別タグ（ＭＩＤタグ）と、ＫＩＲハイブリダイズ領域とを含むフォワードプライマー、及び、アダプター領域と、個体識別タグ（ＭＩＤタグ）と、ＫＩＲハイブリダイズ領域とを含むリバースプライマーを含む。本発明のキットは、多くの場合、複数の対象由来の２以上のＫＩＲ遺伝子における２以上のエキソンを増幅するプライマー対を含む。多くの場合、本発明のキットは、複数の個体（例えば１２以上の個体）の全てのＫＩＲ遺伝子について、ＫＩＲの遺伝子型を決定するのに十分な数のプライマー対を含む。これらのプライマーは、表２に示すように、遺伝子特異的であってもよく、２以上のＫＩＲ遺伝子に対して汎用であってもよい。

ある実施形態によれば、キットは更に、エマルジョンＰＣＲに使用可能なビーズの１又は２以上の集合を含んでいてもよい。各ビーズには、増幅プライマーのアダプター領域にハイブリダイズすることが可能なプライマーが連結される。ある実施形態によれば、キットは、反応要素（例えば酵素、緩衝液、ヌクレオチド、対照ポリヌクレオチド等）を含む１又は２以上の容器を含んでいてもよい。また、キットは、エマルジョンＰＣＲ及びピロシーケンスに必要な試薬を含んでいてもよい。これらは例えば、米国特許出願公開第２０１０−００８６９１４号、及び本文献で引用されている文献に記載されている。

Ｖ．反応混合物
一実施形態によれば、本発明は、ＫＩＲ配列決定用の反応混合物である。この反応混合物は、ＫＩＲ遺伝子の特定の部分を増幅するプライマーのセットを含む。反応混合物中のプライマーは、エマルジョンＰＣＲ及び高スループットクローン配列決定に有用な付加配列を含んでいてもよい。この付加配列には、例えば、ＭＩＤタグ、アダプター、及びライブラリータグが含まれる。

ある実施形態によれば、反応混合物は更に、エマルジョンＰＣＲに使用可能なビーズの１又は２以上の集合を含んでいてもよい。各ビーズには、増幅プライマーのアダプター領域にハイブリダイズすることが可能なプライマーが連結される。ある実施形態によれば、反応混合物は、反応要素（例えば酵素、緩衝液、ヌクレオチド、対照ポリヌクレオチド等）を含む１又は２以上の容器を含んでいてもよい。また、反応混合物は、エマルジョンＰＣＲ及びピロシーケンスに必要な更なる試薬を含んでいてもよい。これらは例えば、米国特許出願公開第２０１０−００８６９１４号、及び本文献で引用されている文献に記載されている。

VI．疾病状態を評価するためのＫＩＲ遺伝子型決定の使用
ある実施形態によれば、本発明は、個体のＫＩＲ遺伝子型を検出することにより、個体の疾病又は状態に対する素因を検出する方法に関する。

ある実施形態によれば、本方法は更に、個体のＨＬＡ遺伝子型を決定すること、即ち、個体にどのＨＬＡ対立遺伝子が存在するかを決定することを含む。ＨＬＡ遺伝子型は、当業者に公知の任意の手法で決定できる。斯かる手法の例としては、限定するものではないが、Bentley et al., (2009) Tissue Antigens, 74:393-403 に記載のような次世代配列決定法を用いてＨＬＡ遺伝子型を決定する方法が挙げられる。

ある実施形態によれば、この方法は、本明細書の記載に従って女性のＫＩＲ遺伝子型を決定し、KIR2DL1対立遺伝子の存在が発見された場合に、その女性に子癇前症の素因があると決定することを含む。

他の実施形態によれば、この方法は、本明細書の記載に従って個体のＫＩＲ遺伝子型を決定し、KIR2DL3対立遺伝子の存在が発見された場合に、その個体にＨＣＶ感染を除去する素因があると決定することを含む。ある実施形態によれば、この方法は更に、個体のHLA-C遺伝子型を決定し、KIR2DL3対立遺伝子とHLA-C1対立遺伝子との組み合わせの存在が発見された場合に、その個体にＨＣＶ感染を除去する素因があると決定することを含む。

他の実施形態によれば、この方法は、本明細書の記載に従って個体のＫＩＲ遺伝子型を決定し、KIR3DS1対立遺伝子の存在が発見された場合に、その個体はＨＩＶ感染からＡＩＤＳに進行する可能性が少ない、と決定することを含む。ある実施形態によれば、この方法は更に、個体のＨＬＡ遺伝子型を決定し、KIR3DS1対立遺伝子とHLA-Bw4対立遺伝子との組み合わせの存在が発見された場合に、その個体はＨＩＶ感染からＡＩＤＳに進行する可能性が少ない、と決定することを含む。

更に他の実施形態によれば、この方法は、本明細書の記載に従って個体のＫＩＲ遺伝子型を決定し、KIR2DS1対立遺伝子の存在が発見された場合に、その個体に自己免疫疾病を発症する素因があると決定することを含む。

更に他の実施形態によれば、この方法は、本明細書の記載に従って個体のＫＩＲ遺伝子型を決定し、KIR2DL2/KIR2DL3ヘテロ接合性の存在が発見された場合に、その個体にクローン病を発症する素因がある、と決定することを含む。ある実施形態によれば、この方法は更に、個体のＨＬＡ遺伝子型を決定し、KIR2DL2/KIR2DL3ヘテロ接合性とHLA-C2対立遺伝子との組み合わせの存在が発見された場合に、その個体にクローン病を発症する素因がある、と決定することを含む。

更に他の実施形態によれば、この方法は、本明細書の記載に従って個体のＫＩＲ遺伝子型を決定し、グループＢのＫＩＲハロタイプの存在が発見された場合に、その個体が非血縁造血細胞移植におけるドナーとして適した候補であるかを決定することを含む。

VII．実施例
実施例１：個体試料中の全ＫＩＲ遺伝子内のエキソン５配列の取得
例として、ＫＩＲ遺伝子内の９つのエキソン全ての増幅に適した１３のプライマー対を表２に列記する。各プライマーセットは、ＫＩＲ遺伝子内の単一のエキソンと、更にイントロン配列を増幅する。

各プライマーは更に、多重識別子タグ（ＭＩＤタグ）と呼ばれる試料特異的識別配列が、各プライマーの５’末端に付加されてなる。ＭＩＤタグの例を表３に示す。

各プライマーは更に、４−ｂｐのライブラリータグを含む（明示せず）。これらの付加プライマー配列は表２には示していない。表２に示すアンプリコンサイズは、付加プライマー配列、即ち、５−ｂｐの個体識別タグ（ＭＩＤタグ）及び１５−ｂｐのアダプター配列（４−ｂｐのライブラリータグを含む）を含む。

この例では、国立骨髄提供者プログラム（National Marrow Donor Program）から得られた８つの試料のＫＩＲ配列を、表２に示すプライマーを用いて増幅した。増幅された核酸は、Agencourt ＤＮＡ精製システム（Beckman Coulter, Brea, Calif.）を用いて精製した。精製された核酸を定量し、適切な濃度に希釈した。これらの核酸を一緒にプールし、全試料由来の全アンプリコンを含むプールを作製した。この混合物のアリコットを調製し、454 GS-FLXプラットフォーム（454 Life Sciences, Branford, Conn.）のピロシーケンスプロトコールを用いた配列決定に供した。配列決定データの分析にはConexio ATF ソフトウェア（Conexio Genomics, Aus.）を用いた。

図３及び４に、全ＫＩＲ遺伝子のエキソン５の配列を示す。イタリック体のヌクレオチドは、特定のＫＩＲ遺伝子のエキソン５に独自のヌクレオチドである。即ち、この特定の配列モチーフに連結された任意の配列は、他のＫＩＲ遺伝子から即時に識別される。太字のヌクレオチドは、幾つかのＫＩＲ遺伝子に共通であるが、全てのＫＩＲ遺伝子に共通ではない。灰色四角内のヌクレオチドはＫＩＲ遺伝子の多型である。

この結果は、これらの遺伝子を識別するためには、長い配列決定操作（３００ｂｐ）が必要であることを示している。図４から明らかなように、従来技術のような５０〜６０塩基対の配列しか決定できない配列決定操作では、ＫＩＲ遺伝子２ＤＬ２、２ＤＬ３、２ＤＳ３、２ＤＳ５、又は２ＤＰ１を識別できないものと思われる。

本発明を具体的な実施例に即して説明したが、当業者であれば理解するように、本発明の範囲内で種々の改変を加えることが可能である。即ち、本発明の範囲は、本明細書記載の実施例に限定すべきではなく、添付の特許請求の範囲によって定めるべきである。

Claims (12)

1. １又は２以上の個体の全てのＫＩＲ遺伝子の少なくとも１つのエキソンを分析することにより、前記１又は２以上の個体のＫＩＲ遺伝子型を並行して決定する方法であって：
   （ａ）各個体について、アダプター配列と、個体識別配列と、ＫＩＲハイブリダイズ配列とを夫々含むフォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマー対を少なくとも１対用いて増幅反応を実施し、多型部位を含むＫＩＲ遺伝子のエキソン配列を増幅してＫＩＲアンプリコンを取得し；
   （ｂ）工程（ａ）で得られた前記１又は２以上の個体の各々由来のＫＩＲアンプリコンをプールし；
   （ｃ）エマルジョンＰＣＲを実施し；
   （ｄ）ピロシーケンスを用いて、各個体の各ＫＩＲアンプリコンの配列を並行して決定し；及び
   （ｅ）工程（ｄ）で決定されたＫＩＲアンプリコンの配列を既知のＫＩＲ配列と比較することにより、ＫＩＲ対立遺伝子を各個体に割り当て、どのＫＩＲ対立遺伝子が当該個体に存在するのかを決定すること、
   を含み、
   前記プライマー対のうち少なくとも１対が、全てのＫＩＲ遺伝子又はそのサブセットに汎用であると共に、前記ＫＩＲ遺伝子の各々の前記少なくとも１つのエキソンの各々が、前記アンプリコンから遺伝子型を一義的に決定するのに十分な特異性を以って増幅されるように、前記フォワードプライマー及びリバースプライマーが選択されると共に、
   少なくとも１つのプライマー対が、下記Ａ群から選択されるＫＩＲ結合領域の配列の対を有し、且つ、少なくとも１つのプライマー対が、下記Ｂ群から選択される個体識別タグの対を有する、方法。
   

   

   
2. 各個体に存在するＫＩＲハプロタイプを決定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
3. 工程（ａ）が更に前記ＫＩＲアンプリコンの濃度を決定することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 工程（ｅ）で対立遺伝子ＫＩＲＤＬ１が発見された場合に、個体に子癇前症の素因があると決定する工程（ｆ）を更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 工程（ｅ）で対立遺伝子ＫＩＲＤ２ＤＳ１が発見された場合に、個体に自己免疫疾患の素因があると決定する工程（ｆ）を更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
6. 工程（ｅ）でグループＢのＫＩＲ対立遺伝子が発見された場合に、個体が造血幹細胞の適切な非血縁ドナーであると決定する工程（ｆ）を更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
7. 個体のＨＬＡ遺伝子型を決定する工程（ｆ）を更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
8. 工程（ｅ）で対立遺伝子ＫＩＲＤＬ１が発見され、且つ、工程（ｆ）で対立遺伝子ＨＬＡ−Ｃ１が発見された場合に、個体にＨＣＶ感染を除去する素因があると決定する工程（ｇ）を更に含む、請求項７に記載の方法。
9. 工程（ｅ）で対立遺伝子ＫＩＲ３ＤＳ１が発見され、且つ、工程（ｆ）で対立遺伝子ＨＬＡ−Ｂｗ４が発見された場合に、個体にＨＩＶ感染からＡＩＤＳへの緩慢な進行の素因があると決定する工程（ｇ）を更に含む、請求項７に記載の方法。
10. 対立遺伝子ＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３が工程（ｅ）で発見され、且つ、工程（ｆ）で対立遺伝子ＨＬＡ−Ｃ２が発見された場合に、個体にクローン病の素因があると決定する工程（ｇ）を更に含む、請求項７に記載の方法。
11. １又は２以上の個体の全てのＫＩＲ遺伝子の少なくとも１つのエキソンを分析することにより、前記１又は２以上の個体のＫＩＲ遺伝子型を並行して決定するためのＫＩＲアンプリコンを得るためのキットであって、
    アダプター領域と、個体識別タグと、ＫＩＲハイブリダイズ領域とを含むフォワードプライマー、及び、
    アダプター領域と、個体識別タグと、ＫＩＲハイブリダイズ領域とを含むリバースプライマー
    からなるプライマー対を少なくとも１対含み、
    前記プライマー対のうち少なくとも１対が、全てのＫＩＲ遺伝子又はそのサブセットに汎用であると共に、前記ＫＩＲ遺伝子の各々の前記少なくとも１つのエキソンの各々が、前記アンプリコンから遺伝子型を一義的に決定するのに十分な特異性を以って増幅されるように、前記フォワードプライマー及びリバースプライマーが選択されると共に、
    少なくとも１つのプライマー対が、下記Ａ群から選択されるＫＩＲ結合領域の配列の対を含み、且つ、少なくとも１つのプライマー対が、下記Ｂ群から選択される個体識別タグの対を含む、キット。
    

    

    
12. １又は２以上の個体の全てのＫＩＲ遺伝子の少なくとも１つのエキソンを分析することにより、前記１又は２以上の個体のＫＩＲ遺伝子型を並行して決定するためのＫＩＲアンプリコンを得るための反応混合物であって、
    アダプター領域と、個体識別タグと、ＫＩＲハイブリダイズ領域とを含むフォワードプライマー、及び、
    アダプター領域と、個体識別タグと、ＫＩＲハイブリダイズ領域とを含むリバースプライマー
    からなるプライマー対を少なくとも１対含み、
    前記プライマー対のうち少なくとも１対が、全てのＫＩＲ遺伝子又はそのサブセットに汎用であると共に、前記ＫＩＲ遺伝子の各々の前記少なくとも１つのエキソンの各々が、前記アンプリコンから遺伝子型を一義的に決定するのに十分な特異性を以って増幅されるように、前記フォワードプライマー及びリバースプライマーが選択されると共に、
    少なくとも１つのプライマー対が、下記Ａ群から選択されるＫＩＲ結合領域の配列の対を含み、且つ、少なくとも１つのプライマー対が、下記Ｂ群から選択される個体識別タグの対を含む、反応混合物。
    

    

    

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