JP2015519911A - 複数転写産物のハイスループットシークエンシング - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、一般的には分子生物学及び免疫学の分野に関する。より具体的には、発明は、免疫細胞受容体及び抗体をコードするcDNAハイスループット単離方法に関する。
マイクロピラーの格子(直径56μm、高さ50μm)を、SU−8フォトレジスト(Fisher Scientific)を用いてフォトリソグラフィーでシリカウェーハ上に型押しし、シリカウェーハを、標準的な顕微鏡スライドの寸法であってチップ毎におよそ170,000ウェルを含有する、ポリジメチルシロキサン(PDMS)チップ(Sylgard 184、Dow Corning)を印刷する型として使用する。マイクロピラーの寸法は、幅約5μm〜約300μm及び高さ約5μm〜約300μmの範囲であり得る。成型したPDMSチップを、酸素プラズマ容器内で5分間シラン処理して、親水性表面を生成した。その後PDMSチップを、1%ウシ血清アルブミン(BSA)中で30分間遮断し、脱イオン水及びリン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄して、細胞播種の準備をした。
ハイスループット法において単一細胞由来の2つ以上の転写物を物理的に結合する工程は、実施例1の密閉したPDMSマイクロウェル装置を使用して、単一細胞を別々のウェル中に閉じ込める。細胞溶解もまた発生し、mRNA捕捉のためのポリ(T)磁性ミクロンサイズビーズもまた、マイクロウェル中に導入する。一度細胞及びビーズを装填すると、装置を透析膜で密封し、溶菌液を導入する。続いて、ビーズを回収し、重複伸長(overlap extension)(OE)RT−PCRのための試薬、プライマー及びポリメラーゼ酵素を有する溶液中に再懸濁し、各ビーズが単一エマルジョン滴中に被包されるように、その後溶液を乳化する。エマルジョン熱循環に供して、2つの転写物(例えば、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖cDNA)を物理的に結合し、そして結合した生成物を循環後のエマルジョンから回収する。ネステッドPCR増幅を実施し、その後Illumina又は適切な長さのリードを産生して転写物対合情報(図6)を明確に解釈することができる他のNextGen配列決定技術を用いて得られたDNAを、配列決定する。
5つの不死化B細胞株を異なる比率で混合し、OE−PCRにより生成された結合生成物の対合効果を試験するのに使用した。この実験で使用した5つのB細胞株は以下の通りである:MOPC−21、MOPC−315、IM−9、ARH−77、及びDB(表5を参照)。DBは非常に低レベルのVH及びVL転写物を発現し、負の対照として使用された。
B細胞の集合を、実施例1に記載の通りに作製したPDMSマイクロウェルプレート中に重力によって定着させる。この実施例において、各PDMSスライドは、少なくとも95%の確立でポアソン統計に基づきウェル毎に細胞が1つだけ存在している、同時に加工された4つのスライドが68,000個のリンパ球に≧1:10の細胞/ウェル占有率で適応するように、1.7×105ウェルを含有する。直径2.8μmのポリ(dT)磁性ビーズを平均55個のビーズ/ウェルでマイクロウェル中に沈着し、スライドを透析膜で覆う。続いて、<1分以内の完全細胞溶解の結果として生じる1%ドデシル硫酸リチウムを含有する膜で覆われたスライドを、最適化細胞溶解溶液でインキュベートする。mRNAは、重複伸長(OE)RT−PCRに対して、試薬、プライマー、逆転写酵素、及びポリメラーゼ酵素により溶液中で集められ、洗浄され、最懸濁されたポリ(dT)磁性ビーズにアニールする。この方法において、ビーズは油エマルジョン中に水を含む液滴中に単離される。エマルジョンを熱循環に供して、2つの転写物(例えば、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖cDNA)を物理的に結合し、結合生成物を循環の後のエマルジョンから回収する。ネステッドPCR増幅を実施し、その後得られたDNAを、Illumina又は適切な長さのリードを産生して転写物対合情報を明確に解釈することができるあらゆる他のNextGen配列決定技術を用いて配列決定する。工程の概要を図6に示す。
この実施例は、追加抗原免疫に続く、ヒト末梢性B細胞からの高親和性抗破傷風抗体の単離について記載する。1人の女性ドナーを、Charite Universitaetsmedizin Berlinによるインフォームド・コンセントが得られた後に、TT/ジフテリアトキソイド(TD、20 I.E.TT及び2 I.E.ジフテリアトキソイド、Sanofi Pasteur Merck Sharpe&Dohme GmbH、ライメン、ドイツ)に対して追加抗原免疫化(booster immunized)した(試料は匿名でコード化され、病院の倫理承認委員会により認められた研究の番号第EA1/178/11、及びUniversity of Texas at Austin Institutional Review BoardのIRB番号第2011−11−0095号)。TT免疫化の7日後に、EDTA血液を採取し、PBMCを記載の通り(Mei et al., 2009)に密度勾配分離によって単離した。PBMCをPBS/BSA中において、抗ヒトCD3/CD14−PacB(それぞれクローンUCHT1及びM5E2、Becton Dickinson、BD)、CD19−PECy7(クローンSJ25C1、BD)、CD27−Cy5(クローン2E4、Rene van Lierによる高品質な種、Academic Medical Centre、University of Amsterdam、The Netherlands、Deutsches Rheumaforschungszentrum(DRFZ)で標識、Berlin)、CD20−PacO(クローンHI47、Invitrogen)、IgD−PerCpCy5.5(クローンL27、BD)、CD38−PE(クローンHIT2、BD)及びTT−Digoxigenin(DRFZで標識)により4℃で15分間染色した。細胞を洗浄し、第2の染色を抗Digoxigenin−FITC(Roche、DRFZで標識)により実施し、選別の前にDAPIを加えた。CD19+CD3−CD14―CD38++CD27++CD20−TT+形質芽細胞を、FACSAria II選別システム(BD Biosciences)を用いて選別した。選別した細胞の一部を洗浄し、DMSO/10%FCS中でハイスループットVH:VL対合のために凍結保存した。
実施例4及び実施例5は、ハイスループット配列決定からの正確なVH:VL配列対の同定を開示し、それにより所与のVH配列に対する最高リード数VL配列は、個々のB細胞によりコード化された天然の同属VH:VL対を明らかにした。代わりに、この実施例は、VH及びVL配列の両方のコンセンサス対合を介する、ハイスループットVH:VL単位複製配列データにおける正確なVH:VL対を同定する方法について記載する。
記憶B細胞を単離し、インビトロで増殖し、増殖細胞の2つのアリコットをハイスループット対合のために加工した。インビトロクローン増殖は同じVH:VL対を含有する細胞の複数の複製に結果としてなり、したがって同じB細胞試料由来の別々のアリコット中の同じVH:VL対を配列決定する確率を上昇させる。
この実施例において、抗体cDNAのリーダーペプチド領域とアニールするプライマー(VH及びVL領域のフレームワーク1に特異的なプライマーとは対照的、実施例4に記載)を使用して、抗体VH:VL対を配列決定した。記憶B細胞を提供ヒトPBMCから単離し、細胞を2つの群に分割した:群1は29,000個の細胞からなり、これを直ちに分析し(合計510,000個のウェルを使用、1:16細胞:ウェル比率)、一方で群2を実施例7に記載の通りに伸長し、28,000個の細胞をインビトロ増殖の後に分析した(合計680,000個のウェルを使用、1:24細胞:ウェル比率)。どちらの実験も、表15に示されるリーダーペプチド重複伸長プライマー、及び下記の条件下におけるエマルジョン結合RT−PCR循環を用いる実施例7の通りに実施した:55℃で30分間、続いて94℃で2分間;94℃で30秒間の変性、54℃で30秒間のアニール、72℃で2分間の伸長を4回;94℃で30秒間の変性、60℃で30秒間のアニール、72℃で2分間の伸長を29回;その後、72℃で7分間の最終伸長ステップ。さらなるバーコード領域もまた、個々の結合イベントの多配列リードを同定するのに使用したVL結合プライマー(16N領域)に含まれる(表15)。ネステッドPCRを、各群につき25のPCR周期を伴う実施例5の通りに実施した。
この実施例において、不死化B細胞株MOPC−21を、PBS中の細胞の混合物及び細胞生存率可視化のためのトリパンブルー染色からなる調節された大きさのエマルジョン滴中で生存可能にカプセル化した。この実施例は、調整された大きさ分布のエマルジョン滴中、さらに、液滴形成に先んじて直ちに混合する2つの異なる水流からなっている液滴中への単一細胞の単離を示す(図7)。
この実施例において、細胞溶解及びポリ(T)ビーズへのmRNAアニールは、実施例9に概説した方法を用いて、生成したエマルジョン中で達成した。記憶B細胞の集合を単離し、細胞を実施例7に記載の通りに増殖した。記憶B細胞をPBS中で100k/mLの濃度で再懸濁し、実施例8のエマルジョン発生装置の26ゲージの針の最内側を、500μL/分の速度で通過させた。450μLのポリ(dT)磁性ビーズ(直径1.0μm、New England Biosciences、マサチューセッツ州イプスウィッチ、米国)を磁石でペレット化し、5mLの細胞溶解/結合緩衝液(pH7.5の100mM tris、500mM LiCl、10mM EDTA、0.5%ドデシル硫酸リチウム、5mM DTT)中で再懸濁し、得られた混合物を500μL/分の速度で19ゲージ皮下管留置中を通過させ、一方で油相(4.5%Span−80、0.4%Tween 80、0.05%Triton X−100を有する分子生物学グレードミネラルオイル、v/v%、Sigma Aldrich Corp.)を、3mL/分の速度でガラス管の最外側を通過させて、単一細胞を含有する直径およそ85μmの水滴からなるエマルジョンを生成した。エマルジョン流を2mLのEppendorf管中に集めて、液滴が、エマルジョン滴内でカプセル化されたポリ(dT)磁性ビーズ上でmRNAを捕捉させるために生成された際に、洗浄剤によって細胞を溶解した。
先の実施例は、mRNAを捕捉するための磁性ビーズの使用及び単一単位複製配列を作成するための、単一細胞(例えば、VH及びVL cDNA)由来の所望のcDNAsの共有結合を示す。したがって作成した単一VH−VL単位複製配列をハイスループットDNA配列決定によって配列決定して、天然に対合したVH及びVL配列のレパートリーを明らかにした。
先の実施例は、様々な細胞集団からの配列決定多重転写物に関する種々の技術の使用について詳述した。本実施例は、抗原依存ポリ(dT)捕捉及び後のVH:VL配列決定を用いる目的の特定の抗原に特異的な高親和性抗体をコード化する細胞のみに由来する、天然に対合したVH:VL抗体配列ハイスループット配列決定の方法について記載する。
実施例6の通り、エマルジョンを、ノズルの外から高速で動く環状の油相中に水流を注入することで形成した。キャリア流によって発生した剪断力は、厳重に調節された大きさ分布で液滴形成を引き起こし、ノズル/キャリア流法は、液滴の大きさの幅によって引き起こされるエマルジョン滴毎の多細胞の発生率を減少させる、単分散液滴の大きさのエマルジョンを形成した。この実施例において、2つの不死化細胞株(MOPC−21及びMOPC−315)混合物を使用して、中間細胞溶解又はmRNA捕捉ステップなしにおよそ容積4nLのエマルジョン滴中で直接、細胞のカプセル化及び結合RT−PCRを示す。
***
Claims (64)
- 以下:
a)単一細胞及びmRNA捕捉剤を個々のコンパートメントに隔離するステップ;
b)細胞を溶解し、mRNA捕捉剤でmRNA転写物を収集するステップ;
c)mRNA捕捉剤を用いてmRNAをコンパートメントから単離するステップ;
d)逆転写を行い、次いで捕捉されたmRNAにPCR増幅を行うステップ;そして、
e)単一細胞から増幅された、少なくとも2つの異なったcDNA産物を配列決定するステップ、
を含む、方法。 - 前記細胞がB細胞である、複数の対抗体VH配列及びVL配列を取得するための方法として更に定義された、請求項1に記載の方法。
- 前記mRNA捕捉剤がビーズである、請求項1に記載の方法。
- 前記ビーズが磁性である、請求項3に記載の方法。
- 前記ビーズがmRNAとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが対象の転写産物に特異的なポリ(T)及びプライマーの少なくとも1つを含む、請求項5に記載の方法。
- 対象の抗原に結合する抗体について対抗体VH配列及びVL配列を取得するための方法として更に定義された、請求項2に記載の方法。
- 前記ビーズが対象の抗原に複合化され、前記オリゴヌクレオチドが対象の抗原に結合する抗体の存在下でビーズに専ら複合化される、請求項3に記載の方法。
- 前記個々のコンパートメントがゲル又はマイクロタイタープレート中のウェルである、請求項1に記載の方法。
- 前記個々のコンパートメントが5nL未満の体積を有する、請求項1に記載の方法。
- ステップ(c)の前に、前記ウェルが透析膜で覆われる、請求項10に記載の方法。
- 前記個々のコンパートメントがエマルジョン中の微小胞である、請求項1に記載の方法。
- ステップ(a)及び(b)が同時に行われる、請求項1に記載の方法。
- ステップ(a)及び(b)が、単一細胞及びオリゴヌクレオチドを単離して、エマルジョン中の個々の微小胞に細胞溶解液の存在下で加えることを含む、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも10,000の各々の細胞から配列を取得することを含む、請求項2に記載の方法。
- 少なくとも5,000の各々の対抗体VH配列及びVL配列を取得することを含む、請求項2に記載の方法。
- ステップ(e)が、少なくとも2の転写産物を単一のDNA分子に連結するために、重複伸長逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を行うことによってcDNAを連結することを含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(e)が重複伸長逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応の使用を含まない、請求項1に記載の方法。
- ステップ(e)が、VH及びVL cDNAを単一分子中で連結するために、重複伸長逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を行うことによってVH及びVL cDNAを連結することを含む、請求項2に記載の方法。
- ステップ(e)が、重複延長逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応の使用を含まず、VH及びVL cDNAが別箇の分子である、請求項2に記載の方法。
- 前記VH及びVL配列が異なった分子の配列決定によって得られる、請求項2に記載の方法。
- 前記対抗体VH配列及びVL配列を同定することが、配列の確率解析を行うことを更に含む、請求項2に記載の方法。
- 前記確率解析がCDR−H3又はCDR−L3配列に基づく、請求項22に記載の方法。
- 前記対抗体VH配列及びVL配列を同定することが、生の配列決定の読み数(raw sequencing read counts)を比較することを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記確率解析が図9のステップを行うことを含む、請求項22に記載の方法。
- ステップ(e)が組み換えを行うことによってcDNAを連結することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、B細胞、T細胞、NKT細胞及び癌細胞からなる群より選ばれる、請求項1に記載の方法。
- 単一細胞を隔離することが、細胞の大多数が単一細胞として捕捉されるように多数のマイクロウェルを含む装置に細胞を導入することを含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(e)が同一ビーズに共有結合的に連結された2又はそれ以上の転写産物の配列決定を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項1に記載の方法。
- 確率解析を用いて天然に対になった転写産物を決定することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対転写産物を同定することが、生の配列決定の読み数(raw sequencing read counts)を比較することを含む、請求項31に記載の方法。
- 前記確率解析が図9のステップを行うことを含む、請求項31に記載の方法。
- a)環状流動油相内に配置された水性流体相出口;及び
b)水性流体相であって、水性相流体が細胞懸濁液を含み、油相内に分散され、細胞の水性懸濁液を含む低サイズ分散度を有する乳化液滴をもたらす、水性流体相
を含む、装置。 - 前記水性流体相出口がニードルである、請求項34に記載の装置。
- 前記水性流体相出口がガラス管である、請求項34に記載の装置。
- 前記油相がガラス管を流れる、請求項34に記載の装置。
- 前記油相がポリマーチューブを流れる、請求項34に記載の装置。
- 前記水性相がポリマーチューブを流れる、請求項34に記載の装置。
- 細胞濃度、水性流体相流速、及び油相流速が液滴形成を可能にし、各々の液滴が単一細胞を含む、請求項34に記載の装置。
- 前記細胞がB細胞、T細胞、NKT細胞、及び癌細胞からなる群より選ばれる、請求項34に記載の装置。
- 前記水性流体相が核酸捕捉のためのビーズを含む、請求項34に記載の装置。
- 前記水性流体相が、逆転写酵素試薬、ポリメラーゼ連鎖反応試薬、及びそれらの組み合わせを含む、請求項34に記載の装置。
- 多数の個々の微小胞を有するエマルジョンを含む組成物であって、微小胞が、逆転写を刺激するための固定されたオリゴヌクレオチドを有するビーズ、及び個々のB細胞を含み、個々のB細胞からmRNA転写産物を放出するために崩壊されている、組成物。
- a)遺伝子標的のセットに特異的である2又はそれ以上のオリゴヌクレオチドの5’領域に共通配列を加えるステップ;
b)共通配列を刺激することによって遺伝子標的のセットの核酸増幅を行うステップ;そして、
c)固定されたオリゴヌクレオチドが核酸増幅を刺激するように、表面上に固定された共通配列を含むオリゴヌクレオチドを核酸増幅に含み、増幅された配列の表面捕捉をもたらすステップ、
を含む、方法。 - 多数の対抗原受容体配列を取得する方法であって、以下:
a)逆転写の刺激のための固定されたオリゴヌクレオチドを有する個々のコンパートメント中の単一哺乳動物細胞を単離するステップ;
b)細胞を溶解させ、mRNA転写産物を固定されたオリゴヌクレオチドと会合させるステップ;
c)単一細胞由来のmRNA転写産物に相当するcDNAを取得するために、逆転写を行い、次いでPCR増幅を行うステップ;
d)cDNAを配列決定するステップ;そして
e)配列決定に基づいて、多数の単一細胞について、複数のmRNA転写産物を同定するステップ、
を含む、方法。 - 複数の、対抗体VH配列及びVL配列を取得する方法として更に定義された、請求項46に記載の方法であって、以下:
a)逆転写の刺激のための固定されたオリゴヌクレオチドを有する個々のコンパートメント中の単一B細胞を単離するステップ;
b)B細胞を溶解させ、mRNA転写産物を固定されたオリゴヌクレオチドと会合させるステップ;
c)単一B細胞由来のmRNA転写産物に相当するcDNAを取得するために、逆転写を行い、次いでPCR増幅を行うステップ;
d)cDNAを配列決定するステップ;そして
e)配列決定に基づいて、複数の単一B細胞について、対抗体VH配列及びVL配列を同定するステップ、
を含む、方法。 - 複数の、対T細胞受容体配列を取得する方法として更に定義された、請求項46に記載の方法であって、以下のステップ:
a)逆転写の刺激のための固定されたオリゴヌクレオチドを有する個々のコンパートメント中の単一T細胞を単離するステップ;
b)T細胞を溶解させ、mRNA転写産物を固定されたオリゴヌクレオチドと会合させるステップ;
c)単一T細胞由来のmRNA転写産物に相当するcDNAを取得するために、逆転写を行い、次いでPCR増幅を行うステップ;
d)cDNAを配列決定するステップ;そして
e)配列決定に基づいて、複数の単一T細胞について、対T細胞受容体配列を同定するステップ、
を含む、方法。 - 対象の抗原に結合する抗体について、対抗体VH配列及びVL配列を取得する方法として更に定義された、請求項47に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、対象の抗原に結合する抗体の存在下でのみ、固定されたオリゴヌクレオチドである、請求項49に記載の方法。
- 前記個々のコンパートメントがゲル又はマイクロタイタープレート中のウェルである、請求項46に記載の方法。
- ステップ(b)の前に、前記ウェルが透析膜で覆われている、請求項46に記載の方法。
- 前記ウェルがエマルジョン中の微小胞である、請求項46に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドがビーズ上に固定されている、請求項46に記載の方法。
- ステップ(a)及び(b)が同時に行われる、請求項46に記載の方法。
- ステップ(a)及び(b)が、単一細胞及びビーズ上に固定されたオリゴヌクレオチドを単離して、エマルジョン中の個々の微小胞に細胞溶解液の存在下で加えることを含む、請求項55に記載の方法。
- ステップ(c)が、単一分子中で対抗原受容体cDNAと連結するために、重複伸長逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を行うことによって対抗原受容体cDNAを連結することを含む、請求項46に記載の方法。
- ステップ(c)が、重複伸長逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の使用を含まず、対抗原受容体配列cDNAが別個の分子である、請求項46に記載の方法。
- 対抗原受容体配列を同定するステップ(e)が、配列の確率解析を行うことを含む、請求項46に記載の方法。
- 対抗原受容体配列が対VH配列及びVL配列であり、確率解析がCDR−H3又はCDR−L3配列に基づく、請求項59に記載の方法。
- 前記対抗原受容体配列を同定することが、生の配列決定の読み数(raw sequencing read counts)を比較することを含む、請求項59に記載の方法。
- 前記確率解析が図9のステップを行うことを含む、請求項59に記載の方法。
- 少なくとも10,000の個々の細胞から配列を取得することを含む、請求項46に記載の方法。
- ステップ(c)の前に、固定されたmRNA転写物を単離することを更に含む、請求項46に記載の方法。
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---|---|---|---|
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