JP2023530930A - リガンドおよび受容体の同族ペアを同定する方法 - Google Patents

リガンドおよび受容体の同族ペアを同定する方法 Download PDF

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Abstract

リガンド種および受容体種の同族ペアを同定するための方法が本明細書において提供される。本方法は、（ａ）リガンド種のセットを提供するステップ（ここで、各リガンド種は少なくとも１回提示される）；（ｂ）受容体種のセットを提供するステップ（ここで、各受容体種は少なくとも１回提示される）；（ｃ）リガンド種のセットを受容体種のセットとマイクロリアクター内で接触させるステップ（ここで、受容体種とリガンド種の選択的結合の際に増強シグナルが産生される）；（ｄ）リガンド種と受容体種の同族ペアを増強シグナルの産生によって検出するステップ；および（ａ）リガンド種と受容体種の同族ペアを同定するステップを含む。【選択図】 図１

Description

［出願の相互参照］
本出願は、２０２０年６月２４日に出願された米国仮出願番号６２／７０５，３８３の優先権を主張するものであり、その開示はその全体で参照により本明細書中に援用される。
［本発明の分野］
本発明は、リガンドと受容体の同族（ｃｏｇｎａｔｅ）ペア、特にＴ細胞受容体とＴ細胞抗原の同族ペアまたはＢ細胞受容体とＢ細胞受容体抗原の同族ペアを同定する方法に関する。
免疫療法は、がんの画期的かつ魅力的な治療的モダリティとなっており、従来の治療法と比べてより少ない副作用で潜在的な標的化療法を提供する。免疫療法の１つのタイプは、ＣＴＬ抗原４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）、またはそのリガンドＰＤ－Ｌ１に特異的なヒト化ｍＡｂを用いるチェックポイント阻害療法である。この治療法は、黒色腫、肺がん、腎臓がん、および膀胱がんを有する患者において顕著かつ恒久性の臨床応答を誘導した。しかしながら、そのような免疫チェックポイント療法に応答するのは患者のほんのサブセットのみであり（２０～３０％）、特定のタイプのがんに罹患している患者のみである。
したがって、ワクチン手法を用いるがんの免疫療法は、そのような治療法に反応しない患者において関連があり得る。
しかしながら、がん患者において効果的かつ安全なＴ細胞介在型抗腫瘍免疫を誘発することができる腫瘍抗原は非常に少ししか知られていない。実際に、そのような効果的な腫瘍抗原は、正常組織では発現されずにがん組織において過剰発現される必要があり、腫瘍抗原特異的なＴ細胞応答を誘導することが可能である必要がある。
したがって、Ｔ細胞抗原の信頼性のある同定は、がん免疫学の分野における未だ対処されていない必要性を対処する。
さらに、免疫療法手法は、自己免疫疾患、炎症性および自己免疫性疾患、感染性疾患および代謝疾患を処置するために適用する可能性もあり得、この場合も同様に、効率的かつ信頼性のあるＴ細胞抗原の同定が非常に重要である。
自己免疫疾患は、細胞に基づく治療法または寛容化アプローチによっても処置され得、これもまた、目的抗原の信頼性のある同定を必要とする。
残念なことに、この潜在的な有用性にもかかわらず、Ｔ細胞抗原の知見および特性化は非常にゆっくり前進しており、これは特に、Ｔ細胞レパートリーの多さおよび大量の潜在的Ｔ細胞抗原の両方が原因である。
Ｔ細胞エピトープを同定するための現在の方法は一般に、Ｔ細胞を単離し、個々のＴ細胞クローンを作製し、自家腫瘍細胞由来の腫瘍細胞株または発現ライブラリー（新鮮または確立された細胞株由来）のパネルをスクリーニングするステップを含む（Ｂｏｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：３３７－６５）。このプロセスは、Ｔ細胞クローンおよび腫瘍細胞株の両方を確立しなければならず、それは時間がかかり全ての腫瘍タイプについて可能なものではないため、労働集約的かつ非効率である。
最近では、ＲＮＡ分析とともに腫瘍ＤＮＡのディープシーケンシングによって、腫瘍細胞株を確立する必要なく、特定のＭＨＣ対立遺伝子に対するペプチド結合予測アルゴリズムを用いた候補エピトープの定義およびランク付けが可能になった（Ｇｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２５：３４１３－３４２１）。しかしながら、ＣＤ４ Ｔ細胞によって認識されるＭＨＣクラスＩＩ制限エピトープについては、予測アルゴリズムの信頼性はあまり高くはない。エピトープは、腫瘍細胞から得られたＭＨＣクラスＩ分子の免疫沈殿物由来の酸溶出液のプロテオミクス分析によっても同定することができ、プロセスの予測能力をさらに洗練することができる。両方の場合において、最も可能性の高い抗原候補を負荷したＭＨＣ四量体が合成され、潜在的な反応性Ｔ細胞を蛍光標識および単離するために用いられる（Ｙａｄａｖ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ５１５：５７２－５７６およびＡｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．７：８９１－９０２）。
しかしながら、ＭＨＣクラスＩＩ四量体の作製は、多くのエピトープについて未だチャレンジングである。
あるいは、Ｔ細胞クローンまたはクローン化されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞株が、合成ペプチドを負荷した抗原提示細胞（ＡＰＣ）（発現ライブラリー）（Ｇａｕｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：９２１－９３０）または候補エピトープをコードするｍＲＮＡが形質導入された抗原提示細胞（ＡＰＣ）（Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０８：４００９－４０１７）に対して機能的に試験される。ＤＮＡタグ化ＭＨＣオリゴマー技術（Ｂｅｎｔｚｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４：１０３７－１０４５）は、候補抗原に関する事前の知識を要し、現在のところＭＨＣ－Ｉ制限エピトープにのみ適用可能である。
しかしながら、それぞれの方法は以下の不利な点がある：Ｔ細胞クローンの作製は、生じるクローンを抗原特異性についてスクリーニングするので非常に労働集約的であり；デコンボリューション法による混合集団からの細胞増殖を用いずに反復性（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ）のＴＣＲおよび／または腫瘍応答性ＴＣＲを同定することは、目的ＴＣＲのうちのいくつかの頻度が増大し、かつ十分な細胞が利用可能である場合にのみ適用可能であり；腫瘍ＭＨＣ分子からのペプチドの溶出は、多くの腫瘍細胞を必要とし；ゲノムデータによるＭＨＣエピトープの生物情報学分析は、エピトープの性質について強力な仮説を必要とする。
合わせると、これらの方法は低スループットであり、特定の試薬（クローン、腫瘍細胞株、ＭＨＣ四量体、ｍＲＮＡ、ペプチド）の作製をしばしば要する多重ステップのプロセスに基づいており、したがって、突然変異または過剰発現（例えば、翻訳後修飾［とりわけリン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化］、スプライシング、挿入／欠失による）以外のメカニズムによって生産され得るＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩエピトープの偏見のない発見に適用されない。
したがって、特に、がん、炎症性および自己免疫疾患、感染性疾患、または代謝疾患に罹患している対象由来の、Ｔ細胞およびＴ細胞抗原の同族ペアを同定する効率的な方法に対する重要な必要性が存在する。
さらに、Ｂ細胞レパートリー（ＢＣＲおよび抗体）は、治療的産物の由来であり得、免疫応答モニタリングとして使用され得る。そのような治療的産物は、抗体（および二重特異性抗体およびナノボディを含む全てのその変異体）および操作された細胞（とりわけＣＡＲ－ＴおよびＮＫ細胞を含む）であり得、天然フォーマットにおいて特異的な抗原に優先的に結合する抗体の能力を用いる。そのような抗原は、がん細胞において潜在的に過剰発現される天然抗原、がん細胞または正常細胞において発現される外来抗原であり得る。抗原ライブラリーおよび／またはＢ細胞レパートリーは通常、抗原／Ｂ細胞レパートリーのペアを同定するためにスクリーニングされる。抗原の同定は、潜在的なワクチン、バイオマーカー、および標的の同定を導き得る。特異的な抗原に対応するＢ細胞レパートリーの同定は、ハイスループットな方法からの利益を受け、強力かつ特異的な治療学を急速に同定する。
Ｔ細胞表現型応答の理解は、処置前および／または処置後の患者からの免疫応答をモニタリングするために使用され得る。したがって、外来抗原（例えば、Ｔ細胞抗原、Ｂ細胞抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原など）に応答するＴ細胞および／またはＢ細胞を定義することは、外来抗原に起因する疾患の処置を導くことができ、同族ワクチンエピトープの同定をもたらす。さらに、外来抗原応答性Ｔ細胞受容体（抗腫瘍Ｔ細胞受容体に匹敵し得る）の同定は、高親和性および特異性を有するＴ細胞受容体の選択を導くことができる。
Ｔ細胞レパートリー、抗原、および経時的表現型を関連付けることは、経時的に表現型およびトランスクリプトームレベルの両方で免疫原性抗原の多様性および異種性ならびにレスポンダーＴ細胞を理解するために必要である。これは、患者を異なる段階での免疫原性応答に基づいて階層化し、予防および処置ワクチンを開発するのを効果的に助ける。
細胞療法（例えば、Ｔ細胞、ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、幹細胞）は、治癒および有益な臨床転帰を示す別の有望な治療法であり、特異的なリガンドに応答する受容体配列の同定ならびにこの相互作用およびそれらの下流効果の特性化を必要とする。実際に、表現型－遺伝子型およびリガンド－受容体を関連付けることは、これらの未だ対処されていない必要性を対処し、適切な表現型およびトランスクリプトームプロファイルを示す最適な反応細胞の選択を改善することができる。この関連付け（ｌｉｎｋａｇｅ）およびマッチング（ｍａｔｃｈｉｎｇ）は、選択を微調整し、最も高い特異的活性を示す最適な細胞を（ＴＣＲのような正しい受容体とともに）選択するのに有用である。
本発明は、いかなる先験的選択もなく、無制限の抗原のセットを含む数千もの腫瘍抗原のＴ細胞に結合および活性化する能力を急速かつ簡単にスクリーニングすること、および、Ｔ細胞抗原とＴ細胞受容体のそのような同族ペアを低いエラー率で、同定のさらなる確認なしに、信頼性高く同定することが可能であるという予期されない知見によるものである。さらに、設計された同定方法は、リガンドと受容体の任意のタイプの結合ペア、例えば、ウイルス抗原とＴ細胞受容体、細菌抗原とＴ細胞受容体、寄生虫抗原とＴ細胞受容体、およびＢ細胞抗原とＢ細胞受容体に適用することができる。
したがって、リガンド種と受容体種の同族ペアを同定する方法が本明細書において提供される。本方法は、（ａ）リガンド種のセットを提供するステップ（ここで、各リガンド種は少なくとも１回提示される）；（ｂ）受容体種のセットを提供するステップ（ここで、各受容体種は少なくとも１回提示される）；（ｃ）リガンド種のセットを受容体種のセットとマイクロリアクター内で接触させるステップ（ここで、受容体種とリガンド種の選択的結合の際に増強シグナルが産生される）；（ｄ）リガンド種と受容体種の同族ペアを増強シグナルの産生によって検出するステップ；および（ａ）リガンド種と受容体種の同族ペアを同定するステップを含む。
ある特定の実施形態では、各リガンド種はバーコード配列を含む。ある特定の実施形態では、各受容体種はバーコード配列を含む。ある特定の実施形態では、各リガンド種および／または各受容体種はバーコード配列を含む。
ある特定の実施形態では、各リガンド種は、細胞またはビーズの表面に発現されるか表面上に提示され、または無細胞抽出物内または溶液内に発現されるか存在する。リガンド種は、例えば、抗原提示細胞の表面に発現されるか表面上に提示され得る。抗原提示細胞は、例えば、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、Ｂ細胞、単球由来樹状細胞、またはＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子を発現する別の細胞から選択することができる。
ある特定の実施形態では、各受容体種は、細胞またはビーズの表面に発現されるか表面上に提示され、または無細胞抽出物内または溶液内に発現されるか存在する。
ある特定の実施形態では、マイクロリアクターは、水性液滴、マイクロカプセル、マイクロビーズ、マイクロ流体チップの区画、またはウェル（例えば、組織培養プレートのウェル）から選択される。
ある特定の実施形態では、シグナルは、細胞、リガンド、または受容体のいずれか１つの形態学的変化；蛍光シグナル増強；ケージド化合物を用いる、またはクエンチング反応による蛍光シグナルの改変；光吸収；可視構造の改変／生成；またはそれらのシグナルの組み合わせから選択される。シグナルは、動的（オン／オフ；対オン；対オフ）および空間－時間変化であり得る。クエンチング反応による蛍光シグナルの改変は、例えば、ＦＲＥＴ、ＦＬＩＰ、ＦＲＡＰ、ＦＬＡＰ、ＢＲＥＴ、またはＦＬＩＭクエンチング反応を含み得る。形態学的変化は、細胞間相互作用（例えば免疫学的シナプス様）、細胞サイズの変化、細胞粒度の変化、ペプチド／タンパク質局在の極性化、または細胞間からの物質移動（例えば、タンパク質、核酸、脂質、および／または炭水化物）であり得る。
ある特定の実施形態では、リガンド種と受容体種の同族ペアを同定するステップは、リガンド種と受容体種を増幅するステップを含み、増幅されたリガンド種および受容体種の少なくとも１つは、同定のためにシーケンシングされる。
ある特定の実施形態では、リガンド種のセットは、例えば、Ｔ細胞抗原、Ｂ細胞抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、新生抗原、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異的抗原、免疫チェックポイント分子、サイトカイン、炭水化物、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、セレクチン、ケモカイン、ホルモン、増殖因子、Ｇタンパク質共役型受容体リガンド、または酵素基質から選択され得る。
ある特定の実施形態では、受容体種のセットは、例えば、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、免疫チェックポイント受容体、サイトカイン受容体、セレクチン、インテグリン、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、カドヘリン、ケモカイン受容体、ホルモン受容体、増殖因子受容体、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、または酵素から選択され得る。
ある特定の実施形態では、リガンド種はＴ細胞抗原であって受容体種はＴ細胞受容体であり、Ｔ細胞受容体とＴ細胞抗原の選択的結合の際に、増強シグナルが産生され、ここで、産生された増強シグナルはＴ細胞活性化の結果である。
ある特定の実施形態では、リガンド種はウイルス抗原であって受容体種はＴ細胞受容体であり、Ｔ細胞受容体とウイルス抗原の選択的結合の際に、増強シグナルが産生され、ここで、産生された増強シグナルはＴ細胞活性化の結果である。
ある特定の実施形態では、リガンド種のセットを受容体種のセットとマイクロリアクター内で接触させるステップは、約０．００１時間～約８時間生じる。ある特定の実施形態では、リガンド種のセットを受容体種のセットとマイクロリアクター内で接触させるステップは、少なくとも約８時間、例えば、約８時間～約４８時間生じる。
ある特定の実施形態では、接触させるステップが約０．１時間～約８時間生じ、リガンド種と受容体種が高親和性で結合する場合、産生される増強シグナルはＴ細胞活性化の早期マーカーである。ある特定の実施形態では、接触させるステップが約０．１時間～約８時間生じ、リガンド種と受容体種が高親和性で結合する場合、産生される増強シグナルはＴ細胞活性化の後期マーカーである。
ある特定の実施形態では、接触させるステップが少なくとも約８時間生じ、リガンド種と受容体種が高親和性で結合する場合、産生される増強シグナルは、Ｔ細胞活性化の早期マーカーまたは後期マーカーであり得る。
ある特定の実施形態では、接触させるステップが少なくとも約８時間生じ、リガンド種と受容体種が低親和性で結合する場合、産生される増強シグナルはＴ細胞活性化の早期マーカーである。低親和性で結合するリガンド種と受容体種に関する接触させるステップを延長することは、Ｔ細胞活性化の後期マーカーにより産生される増強シグナルを最終的にもたらし得る。
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞活性化の早期マーカーは、制限されないが、ＣＤ６９、ＣＤ１０７ａ、またはトランスフェリン受容体であり得る。
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞活性化の後期マーカーは、制限されないが、ＣＤ１３７、ＨＬＡ－ＤＲ、ＶＬＡ１、ＰＴＡ１、ＣＤ７１、ＣＤ２７、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４であり得る。
ある特定の実施形態では、シグナルは、抗ＣＤ６９抗体、抗ＣＤ１０７ａ抗体、抗トランスフェリン受容体抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体、抗ＶＬＡ１抗体、抗ＰＴＡ１抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、または抗ＣＴＬＡ４抗体によって検出される。
ある特定の実施形態では、リガンド種はＢ細胞抗原であって受容体種はＢ細胞受容体であり、Ｂ細胞受容体とＢ細胞抗原の選択的結合の際に増強シグナルが産生される。産生される増強シグナルは、例えば、Ｂ細胞活性化、Ｂ細胞（受容体）特異的な抗原検出、または標的細胞活性化の結果であり得る。
ある特定の実施形態では、シグナルは、抗ＣＤ１３８抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ４５Ｒ抗体、抗ＣＤ４５抗体、蛍光レポーター発現の活性化、または蛍光レポーター発現の阻害によって検出される。
前述の要約、ならびに以下の本発明の詳細な説明は、添付の図面とともに読むと、よりよく理解されるであろう。本発明は図面に示される明確な実施形態に制限されないことが理解されるべきである。
液滴中の抗ＣＤ１３７抗体の滴定を示す。異なる濃度の抗体を並行流させ（ｃｏ－ｆｌｏｗｅｄ）、液滴中でポリクローナル事前活性化Ｔ細胞とともに一晩インキュベートした。 液滴ワークフローにおける抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＴ細胞活性化の概略を示す。ペプチドをパルスした（ｐｕｌｓｅｄ ｗｉｔｈ）Ｋ５６２抗原提示細胞を、抗ＣＤ１３７抗体を含む並行流（ｃｏ－ｆｌｏｗ）中に再懸濁し、次いで、ＥＢＶペプチドに特異的なＴ細胞クローンを含む第２の入口とは異なる入口に並行流させた。 液滴中のＴ細胞活性化を示す。ペプチドをパルスしたＫ５６２を、抗ＣＤ１３７抗体を含む並行流中に再懸濁し、次いで、ＥＢＶペプチドに特異的なＴ細胞クローンと別々に並行流させた。 液滴における抗原提示細胞（ＡＰＣ、Ｋ５６２）とＴ細胞の相互作用の画像を示す。上の列は、Ｔ細胞およびペプチドを負荷したＫ５６２を共封入する液滴の３７℃での一晩のインキュベーション後の顕微鏡写真を示す。他のものは、示されたとおりの関連する蛍光シグナルである。これらの結合イベントは、赤色蛍光シグナルをもたらし；抗ＣＤ１３７抗体は、液滴の体積または抗原提示細胞（紫色）の全体にわたって均一に分布するのではなく、Ｔ細胞（黄色）に濃縮された（矢印で示す）。 液滴中のＩＦＮ－γ分泌物の代表的な蛍光プロットを示す。Ｔ細胞を、液滴中でｍＲＮＡをトランスフェクトした抗原提示細胞（ＡＰＣ；Ｋ５６２細胞）とともに抗ＩＦＮ－γコンジュゲート抗体（例示されるように、ＰＥ蛍光色素が抗体に連結される）の存在下で一晩共培養した。ＩＦＮ－γ放出を、液滴において、Ｔ細胞に予め負荷した抗ＣＤ４５二重特異性抗体および並行流させたＰＥ連結抗ＩＦＮ－γ二次抗体を用いた間接ＥＬＩＳＡアッセイで検出した。 Ｃｅｌｌ－Ｃａｐシステムを用いたＡＰＣによる活性化されたＴ細胞の配列回収のための代表的なワークフローを示す。濃縮液滴（目的の表現型を有する細胞を含むソーティングされた液滴由来）を個々のマイクロウェル内に収集し（顕微鏡下で確認してもよい）、次いで、細胞バーコードおよび遺伝子特異的プライマーとコンジュゲートさせたヒドロゲルビーズを含む液滴と融合した。遺伝子特異的プライマーは、ＴＣＲ、抗原情報、および任意に追加の遺伝子セットを捕捉するように設計した。次いで、同一の細胞バーコードを有する回収配列を適切なペアＴ細胞－ＡＰＣに対応する同一の液滴から得て、したがって、ＴＣＲおよび同族抗原について配列が回収された。 ＴＣＲ配列と抗原の関連付け（ｌｉｎｋｉｎｇ）：同一の細胞バーコードおよびＴＣＲと抗原の両方を示す同一液滴から回収された配列（ＴＭＧと呼ばれる）を示す。一例として、細胞バーコードは、４マーのリンカーによって分離された１１マーのインデックスの一連の４つの特定のセットで構成される）。これらの配列は、公共または私的データベースに対してブラストされており、ＴＣＲα（配列番号１）およびβ（配列番号２）配列およびＴＭＧの配列（配列番号３）と適合する（タンデムのミニ遺伝子は、ＡＰＣ内にトランスフェクトされた抗原に対応する）。細胞あたり産生される転写産物を定量化するためにＵＭＩ（固有の分子識別子）を用い、それは任意である（ａｎｄ ｉｓ ｏｐｔｉｏｎａｌ）。
様々な刊行物、記事および特許が背景技術および本明細書全体に引用または記載されており；これらの参考文献は各々がその全体で参照により本明細書中に援用される。本明細書中に含められている文献、行為、材料、デバイス、記事などの開示は、本発明のコンテキストを提供する目的のためである。そのような議論は、これらのいずれかまたは全てが、開示されるまたは特許請求の範囲に記載される任意の発明に関する従来技術の部分を形成することを認めるものではない。
別段の定義がない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が関連する当業者が一般に理解するのと同一の意味を有する。それ以外では、本明細書において用いられる特定の用語は、明細書において定められる意味を有する。本明細書において引用される全ての特許、公開された特許出願、および刊行物は、本明細書においてあたかも全体が示されたかのように参照によって援用される。
一般に、本明細書に記載される、細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴ－またはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションとの関連で使用される命名法およびそれらの技術は周知のものであり、当該分野において一般に用いられるものである。
標準的な技術が、組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成および組織培養に用いられる。酵素反応および精製技術は、製造元の仕様書に従って、または当該分野において一般に達成されるように、または本明細書において記載されるように、行われる。
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、複数形の言及を含むことに留意しなければならない。
特に記載のない限り、本明細書において記載される濃度または濃度範囲などの任意の数値は、全ての場合において用語「約」によって修飾されることが理解されるべきである。したがって、数値は典型的に、列挙された値の±１０％を含む。例えば、濃度１ｍｇ／ｍＬは、０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、濃度範囲１％～１０％（ｗ／ｖ）は、０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書において用いられる数値範囲の使用は、文脈が明確のその他のものを示さない限り、全てのあり得るサブ範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含み、そのような範囲内の整数およびその値の分数を含む。
本明細書において用いられる用語「核酸」は一般に、ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも１つの分子または鎖を指し、少なくとも１つの核酸塩基、例えば、ＤＮＡに見られる天然起源のプリンまたはピリミジン塩基（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」、およびシトシン「Ｃ」）またはＲＮＡ（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」、およびＣ）を含む。
「ＲＮＡ」は、本明細書において、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、テロメラーゼＲＮＡ構成要素、ＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、環状ＲＮＡ、エンハンサーＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよびｒＲＮＡなどの機能性ＲＮＡを指す。
当業者によって理解されるように、一本鎖の表示は、相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸はまた、表示された一本鎖の相補鎖も包含する。したがって、用語「核酸」は、相補ＤＮＡを包含する。また、当業者によって認識されるように、核酸の多くの変異体が、所与の核酸と同一の目的のために用いられ得る。したがって、核酸はまた、実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。また、当業者によって理解されるように、プライマーなどの一本鎖核酸は、ハイブリダイゼーション条件、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズし得る。したがって、核酸は、ハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズするプライマーも包含する。
用語「バーコード化プライマー」は、核酸合成をプライミングする機能を発揮することのできる約２０～約２００核酸塩基の長さの少なくとも１つの分子を指す。具体的には、バーコード化プライマーは、約３０～約１５０核酸塩基の長さ、約４０～約１００核酸塩基の長さ、約５０～約９０核酸塩基の長さ、約６０～約８０または７０核酸塩基の長さであり得る。より具体的には、本発明の文脈において、バーコード化プライマーは、バーコード配列またはバーコード配列のセットおよびプライマー配列を含むオリゴヌクレオチドであり、ここで、それぞれの異なるプライマー配列は、バーコード化プライマーの異なる特異性を規定する。１つの実施形態では、バーコード化プライマーは、５’から３’に、ユニバーサルプライマー配列、バーコード配列またはバーコード配列のセットおよびプライマー配列を含む。
これらの定義は、少なくとも１つの一本鎖分子を指すが、一部の実施形態では、少なくとも１つの一本鎖分子に対して部分的に、実質的に、または完全に相補である少なくとも１つの追加の鎖も包含する。したがって、一部の実施形態では前記定義は、二本鎖分子を指す。
したがって、１つの実施形態では、核酸は、分子の鎖を含む特定の配列の１つまたは複数の相補鎖または「相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」を含む少なくとも１つの二本鎖分子を指す。
本明細書において「バーコード配列」は、その配列によって別の核酸配列から区別することができ、したがって、別のバーコード配列を保有する別の核酸から区別することができるように核酸配列を固有に標識することを可能にする、固有の核酸配列を指す。
１つの実施形態では、バーコード配列は、特定のマイクロリアクター内に含まれる核酸を、他のマイクロリアクター内に含まれる核酸から、例えば核酸が一緒にプールされた後でさえも固有に同定する。
一部の実施形態では、バーコード配列を用いて、例えば、異なるマイクロリアクター内に含まれる細胞に起因する数十、数百、または数千の核酸でさえも区別し得る。
１つの実施形態では、バーコード配列は、任意の適切な長さであり得る。バーコード配列は、好ましくは、そのバーコード配列を他のバーコード配列から区別するのに十分な長さである。１つの実施形態では、バーコード配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８５、９０またはそれよりも多くのヌクレオチド、例えば５０～８５、６０～８０、７０～８０ヌクレオチドの長さを有する。
１つの実施形態では、バーコード配列は１つよりも多いバーコード配列からなり、ここで、バーコード配列は異なる。そのようなバーコード配列は、本明細書において「バーコード配列のセット」と呼ばれる。
関連する一実施形態において、異なるバーコード配列は、潜在的バーコード配列の「プール」から取得され得る。バーコード配列が１つよりも多いバーコード配列からなる場合、バーコード配列は、潜在的バーコード配列の同一プールまたは異なるプールから取得され得る。配列のプールは、任意の適切な技術を用いて、例えばランダムに、または例えば、特定の距離（例えばハミング距離）によって離れていることによって配列がエラー検出および／または補正するのを可能にするように選択されてもよく、それにより、バーコード配列のリーディング内のエラーが検出され得、場合によっては補正され得る。プールは、任意の数の潜在的バーコード配列、例えば、少なくとも１００、少なくとも３００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも３，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも３００，０００、少なくとも５００，０００、少なくとも１，０００，０００、少なくとも１０，０００，０００、または少なくとも１００，０００，０００のバーコード配列を有し得る。
１つの「プール」または１つよりも多い「プール」から取得した異なるバーコード配列を結合させる方法は当業者に知られており、限定されないが、リガーゼの使用および／またはアニーリングもしくはプライマー伸長方法の使用を含む。
１つの実施形態では、バーコード配列は、二本鎖もしくは一本鎖核酸であるか、または部分的に一本鎖および二本鎖核酸である。
「プライマー配列」は典型的に、１０～５０ヌクレオチド長の短い一本鎖核酸であり、捕捉される目的の核酸と完全またはほぼ完全に合うように設計され、次いで増幅され（例えばＰＣＲによって）、または逆転写される（例えばＲＴによって）。プライマー配列は、それらがハイブリダイズする核酸に対して「特異的」であり、すなわち、プライマー配列は、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、より好ましくは非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ、それらがハイブリダイズする核酸（標的配列とも呼ばれる）に対して相補、または、ほぼ相補である。
典型的に、プライマー配列は、核酸合成のための開始点としての役割を果たし、核酸ポリメラーゼなどのポリメラーゼ酵素がプライマー配列を伸長させて相補鎖を複製するのを可能にする。プライマー配列は、標的核酸と相補であり得、それにハイブリダイズし得る。一部の実施形態では、プライマー配列は、合成プライマー配列である。一部の実施形態では、プライマー配列は、非天然起源プライマー配列である。プライマー配列は典型的に、１０～５０ヌクレオチドの長さを有する。例えば、プライマー配列は、１０～４０、１０～３０、１０～２０、２５～５０、１５～４０、１５～３０、２０～５０、２０～４０、または２０～３０ヌクレオチドの長さを有し得る。一部の実施形態では、プライマー配列は、１８～２４ヌクレオチドの長さを有する。
１つの実施形態では、プライマー配列は、本発明のコンテキストにおいて用いられるバーコード化プライマーの３’側に位置する（すなわち、プライマーは、バーコード配列に対して３’位にある）。
本明細書において用いられる「遺伝子」は、転写および／または転写調節配列および／またはコード領域および／または非翻訳配列（例えば、イントロン、５’－および３’－非翻訳配列）を含むゲノム遺伝子を指すことができる。遺伝子のコード領域は、アミノ酸配列または機能性ＲＮＡ、例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡおよびｐｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列であることができる。遺伝子はまた、コード領域（例えば、エクソンおよびｍｉＲＮＡ）に対応するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであることもでき、それに連結された５’－または３’－非翻訳配列を含んでもよい。遺伝子はまた、コード領域の全部もしくは一部および／またはそれに連結された５’－または３’－非翻訳配列を含むインビトロで生産された増幅核酸分子であってもよい。
本明細書において用いられる用語「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、決定されたレベルの相補性を有する核酸間で結合ペアを生じるのに適切であり、一方で、前記決定されたレベルに劣る相補性を示す核酸間の結合ペアの形成には適さない条件に対応する。ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の両方の組合せであり、配列依存性である。これらの条件は、当業者に知られている方法に従って改変することができる（Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９９３，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。一般に、高ストリンジェンシー条件は、融点（Ｔｍ）よりも約５°Ｃ低くなるように選択され、好ましくは、完全に塩基対合した二重鎖のＴｍに近い温度である（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｌ．Ｍ．（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ ｐ．５４）。ハイブリダイゼーション手順は当技術分野でよく知られており、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．、Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．，Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．ｅｄｓ．（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖ．Ｂ．Ｃｈａｎｄａ，ｓｅｒｉｅｓ ｅｄ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓに記載されている。
高ストリンジェンシー条件は典型的に、約４０°Ｃ～約６８°Ｃでのハイブリダイズを含み、ここで、前記温度は典型的に、例えば、５×ＳＳＣ／５×デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳ中、および０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で約６０°Ｃ～約６８°Ｃの洗浄において、標的配列とハイブリダイズされる核酸の最も高い融解温度ＴＭに相当する。
本明細書において用いられる用語「組織」は、細胞の集団を指し、一般に、同一または同様の機能を発揮する同種細胞からなる。組織は、臓器または骨の一部であってよく、または、細胞、例えば免疫系の細胞の緩やかな会合であり得る。組織は健常組織または病変組織であり得る。特に、組織は、がん性組織または腫瘍周辺組織であり得る。
本明細書において用いられる「対象」は、ヒトなどの哺乳類であるが、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなどの別の動物であってもよい。好ましくは、対象はヒトである。
特定の一実施形態では、対象は、疾患、特に、がん、炎症性および自己免疫疾患、感染性疾患または代謝疾患に罹患している。
「がん」とは、本明細書において、固形腫瘍を伴うがん、および固形腫瘍を伴わないがん（例えば、白血病）の両方を含む、異常増殖を伴う疾患のクラスを意味する。
「自己免疫疾患」とは、本明細書において、自己の細胞を攻撃する免疫系によって引き起こされる広範な変性疾患を意味する。
「炎症性および自己免疫性疾患」とは、本明細書において、炎症過程によって最初に誘導される疾患を意味し、抗原提示細胞によるＴ細胞の活性化によって始まり、その後、他の炎症性細胞の活性化を導き、その結果、炎症促進性サイトカイン、走化性作用物質およびマトリックス分解酵素が放出されるものである。炎症性および自己免疫性疾患の例は当業者によく知られており、関節リウマチ、変形性関節症、骨粗鬆症、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、歯周炎、歯肉炎、移植片対宿主反応、乾癬、強皮症、円形脱毛症（ａｌｌｏｐｅｉｃｉａ）、シェーグレン症候群、多発性筋炎（ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｔｉｓ）、天疱瘡（ｐｅｍｐｌｉｇｕｓ）、ぶどう膜炎（ｕｖｅｉｔｉｔｉｓ）、アジソン疾患、アトピー性皮膚炎、喘息、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、腎障害および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、糖尿病性網膜症、および加齢黄斑変性を含む。
「感染性疾患」とは、本明細書において、微生物の感染によって引き起こされる疾患を意味する。本発明の文脈において、用語「微生物」は同等にウイルスを指し、具体的には、脂質エンベロープを有するウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、細菌、寄生虫、および菌類を指す。
「代謝疾患」とは、本明細書において、代謝のエラーおよび不均衡が生じ、代謝プロセスが最適以下の様式で起こる任意のタイプの障害を意味する。好ましい実施形態では、代謝疾患は、高血糖症、糖尿病、特に２型糖尿病、肥満、脂質異常症および高コレステロール血症からなる群から選択される。特定の一実施形態では、前記代謝疾患は糖尿病であり、より具体的には２型糖尿病である。
本発明の文脈において、リガンドおよび受容体の「同族ペア」という用語は、リガンド種と、それが選択的に結合する受容体種とのペアを指す。
「選択的に結合する」とは、本明細書において、ペアの一方のメンバーが、ペアの他方のメンバーを認識して、別のペアのメンバーよりも高い親和性で結合することを意味する。
「特異的に結合する」とは、本明細書において、ペアの一方のメンバーが、ペアの他方のメンバーを認識して結合し、かつ、別のペアのメンバーに対して検出可能な結合活性を有さないことを意味する。
本明細書において用いられる用語「高親和性」とは、結合が３μＭ以下のレベルである受容体種へのリガンド種の選択的または特異的な結合を指す。
本明細書において用いられる用語「低親和性」とは、結合が３μＭ以上のレベルである受容体種へのリガンド種の選択的または特異的な結合を指す。
本明細書において用いられる用語「リガンド種」とは、特定の認識ペアのメンバーであって、前記特定の認識ペア（または同族ペア）の第２のメンバーに選択的に結合する、好ましくは特異的に結合するメンバーを指す。
本明細書において用いられる用語「受容体種」とは、特定の認識ペアのメンバーであって、前記特定の認識ペア（または同族ペア）の第２のメンバーによって選択的に結合される、好ましくは特異的に結合されるメンバーを指す。
したがって、リガンドおよび受容体は結合パートナーとして定義されるので、リガンドである分子は受容体であってもよく、反対に、受容体である分子はリガンドであってもよい。
本明細書において用いられる用語「リガンドのセット」は、少なくとも１つのリガンド種、好ましくは複数のリガンド種、特に複数のリガンド種を指し、ここで、複数のリガンド種の少なくとも２つは、別個の認識ペアの一部である。好ましくは、本発明の文脈において用いられるリガンドのセットは、余分のリガンド種、すなわち、複数コピーでセット内に存在するリガンド種を含む。
本明細書において用いられる用語「受容体のセット」は、少なくとも１つの受容体種、好ましくは複数の受容体種、特に複数の受容体種を指し、ここで、複数の受容体種の少なくとも２つは、別個の認識ペアの一部である。好ましくは、本発明の文脈において用いられる受容体のセットは、余分の受容体種、すなわち、複数コピーでセット内に存在する受容体種を含む。
ある特定の実施形態では、受容体のセットは、細胞（または複数の細胞）、ビーズ、特に、Ｎｅａｌ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．２：６８－７９に開示されるように改変されたＡＰＣ様のビーズの表面に発現されるか、もしくは表面上に提示され、または、Ｇｒｕｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｖａｃｃｉｎｅ ３１：３８０５－３８１０に開示されるようにインビトロでコードされる（すなわち、無細胞抽出物または溶液中に発現または存在する）。好ましくは、受容体のセットは、受容体のセット由来の固有の受容体種を発現または提示する細胞（または複数の細胞）、１つの細胞またはビーズの表面に発現されるか、または表面上に提示される。
別の特定の実施形態では、リガンドのセットは、細胞（または複数の細胞）、ビーズ、特に、Ｎｅａｌ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．２：６８－７９に開示されるように改変されたＡＰＣ様のビーズの表面に発現されるか、もしくは表面上に提示され、または、Ｇｒｕｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｖａｃｃｉｎｅ ３１：３８０５－３８１０に開示されるようにインビトロでコードされる（すなわち、無細胞抽出物または溶液中に発現または存在する）。好ましくは、リガンドのセットは、リガンドのセット由来の１つのリガンド種またはリガンドのセット由来の複数の別個のリガンド種、好ましくは、リガンドのセット由来の２～１０００、５～９００、１０～８００、２０～７００、３０～６００、４０～５００、５０～４００の別個のリガンド種、特に、リガンドのセット由来の１００～３５０、１５０～３００、または２００～２５０の別個のリガンド種を発現または提示する細胞（または複数の細胞）、１つの細胞の表面に発現されるか、または表面上に提示される。
特に好ましい一実施形態では、受容体のセットは、細胞（または複数の細胞）の表面に発現されるか、または表面上に提示され、リガンドのセットは、別の細胞（または別の複数の細胞）の表面に発現されるか、または表面上に提示される。さらに好ましくは、受容体のセットは、細胞（または複数の細胞）の表面に発現されるか、または表面上に提示され、それぞれの細胞は、受容体のセット由来の固有の受容体種を発現または提示し、リガンドのセットは、別の細胞（または別の複数の細胞）の表面に発現されるか、または表面上に提示され、それぞれの細胞は、リガンドのセット由来の複数の別個のリガンド種を発現または提示する。
ある特定の実施形態では、受容体は、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ／ウイルス抗原認識ペア由来のＴＣＲを含む、ＴＣＲ／Ｔ細胞抗原認識ペア由来のＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（Ｂ細胞受容体／Ｂ細胞抗原認識ペア由来）、刺激性免疫チェックポイント分子のための受容体（例えばＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０ペア由来のＯＸ４０Ｌ）、阻害性免疫チェックポイント分子のための受容体（例えばＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１ペア由来のＰＤ－Ｌ１）、サイトカイン受容体（サイトカイン／サイトカイン受容体ペア由来）、セレクチン（セレクチン／炭水化物ペア由来）、インテグリン（インテグリン／免疫グロブリンスーパーファミリーペアのメンバー由来）、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー（免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー／セレクチンペア由来、または免疫グロブリンスーパーファミリーの２つのメンバーを含むペア由来）、カドヘリン（２つのカドヘリンを含むペア由来）、ケモカイン受容体（ケモカイン／ケモカイン受容体ペア由来）、ホルモン受容体（ホルモン／ホルモン受容体ペア由来）、増殖因子受容体（増殖因子／増殖因子受容体ペア由来）、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ、ＧＰＣＲ／対応するリガンドペア由来）または酵素（酵素／対応する基質ペア由来）であり得る。
好ましい一実施形態では、受容体のペアは、Ｔ細胞受容体のセットである。
ある特定の実施形態では、リガンドは、例えば、Ｔ細胞抗原（ＴＣＲ／Ｔ細胞抗原認識ペア由来）、Ｂ細胞抗原（Ｂ細胞受容体／Ｂ細胞抗原認識ペア由来）、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、新生抗原（すなわち、遺伝子突然変異または腫瘍細胞における異常な発現であって腫瘍細胞において固有に見られる発現に起因する抗原）、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異的抗原、刺激性免疫チェックポイント分子（例えばＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０ペア由来のＯＸ４０）、阻害性免疫チェックポイント分子（例えばＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１ペア由来のＰＤ－１）、サイトカイン（サイトカイン／サイトカイン受容体ペア由来）、炭水化物（セレクチン／炭水化物ペア由来）、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー（免疫グロブリンスーパーファミリーの２つのメンバーを含むペア由来）、セレクチン（免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー／セレクチンペア由来）、ケモカイン（ケモカイン／ケモカイン受容体ペア由来）、ホルモン（ホルモン／ホルモン受容体ペア由来）、増殖因子（増殖因子／増殖因子受容体ペア由来）、ＧＰＣＲのリガンド（ＧＰＣＲ／対応するリガンドペア由来）または基質（酵素／対応する基質ペア由来）であり得る。好ましい一実施形態では、リガンドのセットは、Ｔ細胞抗原（ペプチド、糖脂質または小さな代謝物、例えば５－Ａ－ＲＵ誘導体）のセットであり、好ましくは主要組織適合複合体（クラスＩ、クラスＩＩまたはＭＲ１であり得るＭＨＣ分子）またはＣＤ１ａ、ｂ、ｃ、またはｄ分子に結合している。
外来抗原、例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、または寄生虫抗原は、例えば、限定されないが、以下の生物の少なくとも１つから選択されるウイルス抗原、細菌抗原、または寄生虫抗原を含むことができる：ボレリア細菌（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）、クラミジア細菌（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮＶ）、エボラウイルス（ＥＶＤ）、大腸菌（例えば、志賀様毒素）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ネコ白血病ウイルス、ハンタウイルス、肝炎ウイルス（例えば、肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、および／またはＥウイルス）、ヘルペスウイルス、ヘリコバクターピロリ、ヒト内因性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ－Ｋ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、インフルエンザウイルス、ラッサウイルス、プラスモディウム寄生虫（例えば、マラリアを引き起こすもの）、ムンプスウイルス（例えば、Ｍｕｍｐｓ ｏｒｔｈｏｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）、マイコプラズマ細菌、ノロウイルス、乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、パルボウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サルモネラ細菌（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、トキソプラズマ寄生虫（例えば、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、トレポネーマ細菌（例えば、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｃａｒａｔｅｕｍ）、トリパノソーマ寄生虫（例えば、シャーガス病を引き起こすＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、痘瘡ウイルス、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、および／またはジカウイルス（ＺＩＫＶ）。ウイルス抗原は、より強いＴＣＲ親和性を有することが知られており（例えば、Ａｌｅｋｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２（１２）：３１７４－９（２０１２）を参照）、本明細書に開示される方法において、より高い増強シグナルの検出をもたらすことができる。外来抗原は当業者に知られており、例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ６：Ｎｏｒｍａｌ Ｆｌｏｒａ；Ｂａｒｏｎ Ｓ．，ｅｄｉｔｏｒ；Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ，ＴＸ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｒａｎｃｈ ａｔ Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ（１９９６）；Ｌａｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｕｐｐｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ａｎｄ ｏｔｉｔｉｓ ｍｅｄｉａ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ」，ｍＢｉｏ ２（１）：ｅ００２４５－１０（２０１１）を参照されたい。
Ｔ細胞抗原／Ｔ細胞受容体
特定の一実施形態では、受容体のセットはＴ細胞受容体のセットであり、好ましくはＴ細胞の表面上に提示されており、それぞれのＴ細胞は、好ましくは固有のＴ細胞受容体を有しており、リガンドのセットは、Ｔ細胞抗原のセットであり、好ましくは、典型的に抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に提示された主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に結合しており、それぞれのＡＰＣは、好ましくは複数の抗原種を提示する。
「Ｔ細胞抗原」とは、本明細書において、ＣＤ４＋Ｔ細胞抗原またはＣＤ８＋Ｔ細胞抗原を意味する。「ＣＤ４＋Ｔ細胞抗原」は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識されて免疫応答をトリガーする任意の抗原、例えば、クラスＩＩ主要組織適合複合体分子（ＭＨＣ）に結合した抗原またはその一部の提示を介してＣＤ４＋Ｔ細胞上のＴ細胞受容体によって特異的に認識される抗原を指す。「ＣＤ８＋Ｔ細胞抗原」は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されて免疫応答をトリガーする任意の抗原、例えば、クラスＩ主要組織適合複合体分子（ＭＨＣ）に結合した抗原またはその一部の提示を介してＣＤ８＋Ｔ細胞上のＴ細胞受容体によって特異的に認識される抗原を指す。Ｔ細胞抗原は一般に、タンパク質またはペプチドであるが、脂質および糖脂質のような他の分子ならびに任意のそれらの誘導体であってもよい。
抗原特異性がバーコードによって、または遺伝子によって保有される四量体、多量体、およびその誘導体も想定される。四量体、または任意の誘導体は、抗原および対応するベクターを含むインビトロ転写翻訳（ＩＶＴＴ）によって液滴内で合成することができる。そのようなベクターは、可溶性ＴＣＲの発現をコードする遺伝子を含むことができる。
好ましくは、リガンドのセットは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に提示された主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に結合したＴ細胞抗原のセットである。
本発明の文脈において、用語「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」は、抗原をプロセッシングしてＴ細胞に提示することによって細胞の免疫応答を媒介する免疫担当細胞の異種グループを包含する。抗原提示細胞は、限定されないがマクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、Ｂ細胞、単球由来樹状細胞、人工ＡＰＣ、改変されたＡＰＣ、またはＭＨＣクラスＩ分子もしくはＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する他の細胞を含む。
ＡＰＣは、Ｂ細胞であることができ、具体的には不死化Ｂ細胞、例えばエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）－不死化Ｂ細胞であることができる。
特定の一実施形態では、ＡＰＣは、上記に定義されるような、目的対象由来の自己由来不死化Ｂ細胞、または上記に定義されるような、目的対象と同一のＭＨＣを保有する異種不死化Ｂ細胞である。
「目的対象と同一のＭＨＣを保有する異種Ｂ細胞」とは、本明細書において、目的対象に由来しないが、目的対象と同一のＭＨＣを保有するＢ細胞を意味する。
「ＭＨＣ」または「主要組織適合複合体」とは、本明細書において、Ｔ細胞に対する抗原提示および迅速な移植片拒絶に必要な細胞表面分子をコードする遺伝子の複合体（およびそれによってコードされる分子）を意味する。ヒトでは、ＭＨＣ複合体は、ＨＬＡ複合体としても知られている。ＭＨＣ複合体によってコードされるタンパク質は「ＭＨＣ分子」として知られており、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子に分類される。クラスＩ ＭＨＣ分子は、β２ミクログロブリンと非共有結合した、ＭＨＣにおいてコードされるα鎖からなる膜ヘテロ二量体タンパク質を含む。クラスＩ ＭＨＣ分子は、ほぼ全ての有核細胞によって発現され、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する抗原提示における機能が示されている。ヒトにおいてクラスＩ分子は、ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、および－Ｃを含む。クラスＩＩ ＭＨＣ分子もまた、非共有結合したα鎖およびβ鎖からなる膜ヘテロ二量体タンパク質を含む。クラスＩＩ ＭＨＣは、ＣＤ４＋Ｔ細胞と相互作用することが知られており、ヒトにおいて、ＨＬＡ－ＤＰ、－ＤＱ、およびＤＲを含む。用語「ＭＨＣ制限」は、プロセッシングされて生じた抗原性ペプチドがクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子のいずれかと関連して提示された後にのみ抗原を認識することが可能になるＴ細胞の特徴を指す。ＭＨＣを同定および比較する方法は当技術分野でよく知られており、Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍ．４０：２５－３２；またはＳａｎｔａｍａｒｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍ．３７：３９－５０に記載されている。
特定の一実施形態では、それぞれのＡＰＣは、Ｔ細胞抗原のセット由来の少なくとも１つのＴ細胞抗原、好ましくは複数の別個のＴ細胞抗原、好ましくは、Ｔ細胞抗原のセット由来の２～１０００、５～９００、１０～８００、２０～７００、３０～６００、４０～５００、５０～４００の別個のＴ細胞抗原、具体的には、Ｔ細胞抗原のセット由来の６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、または５００の別個のＴ細胞抗原を発現または提示する。特定の一実施形態では、それぞれのＡＰＣは、１０～１０００、より好ましくは、３００の別個のＴ細胞抗原種を発現または提示する。
特定の一実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞抗原、特に複数の別個のＴ細胞抗原を提示するＡＰＣのセットは、上記に定義されるように目的対象の組織から得られたＴ細胞抗原をコードする核酸のライブラリーを、上記に定義されるように目的対象由来の自己由来ＡＰＣ内または目的対象と同一のＭＨＣを保有する異種ＡＰＣ内に導入することによって得られる。
別の特定の一実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞抗原、特に複数の別個のＴ細胞抗原を提示するＡＰＣのセットは、ＡＰＣ内に、抗原をコードする合成ｍＲＮＡのライブラリーを（タンデム遺伝子または単一遺伝子のいずれかとして）導入することによって得られ、前記ｍＲＮＡは、腫瘍のゲノム、エクソーム、またはトランスクリプトームをシーケンシングすることによって同定され、インビトロ転写によって生産される。
別の特定の一実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞抗原、特に複数の別個のＴ細胞抗原を提示するＡＰＣのセットは、ＡＰＣ内に、抗原をコードする合成ｍＲＮＡのライブラリーを（タンデム遺伝子または単一遺伝子のいずれかとして）導入することによって得られ、前記ｍＲＮＡは、腫瘍のゲノム、エクソーム、またはトランスクリプトームをシーケンシングすることによって同定され、個々のｍＲＮＡで分割およびプールすることによって生産される。
別の特定の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞抗原、特に複数の別個のＴ細胞抗原を提示するＡＰＣのセットは、ＡＰＣ内に、抗原をコードする合成ｍＲＮＡのライブラリーを（タンデム遺伝子または単一遺伝子のいずれかとして）導入することによって得られ、前記ｍＲＮＡは、腫瘍のゲノム、エクソーム、またはトランスクリプトームをシーケンシングすることによって同定され、ｍＲＮＡ翻訳を可能にする透過性に基づくＤＮＡ送達を用いて生産される。
別の特定の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞抗原、特に複数の別個のＴ細胞抗原を提示するＡＰＣのセットは、ＡＰＣ内に、ビーズ上に作製されてｍＲＮＡに転写された個々のＤＮＡを導入し、液滴においてトランスフェクトすることによって得られる（抗原をコードするタンデム遺伝子または単一遺伝子のいずれかとして、前記抗原は、腫瘍のゲノム、エクソーム、またはトランスクリプトームをシーケンシングすることによって同定される）。
別の特定の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞抗原、特に複数の別個のＴ細胞抗原を提示するＡＰＣのセットは、ＡＰＣ内に、ビーズ上に作製されてｍＲＮＡに転写された個々のＤＮＡを導入し、ＡＰＣ内にトランスフェクトまたは形質導入することによって得られる（抗原をコードするタンデム遺伝子または単一遺伝子のいずれかとして、前記抗原は、腫瘍のゲノム、エクソーム、またはトランスクリプトームをシーケンシングすることによって同定される）。
別の特定の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞抗原、特に複数の別個のＴ細胞抗原を提示するＡＰＣのセットは、既知のタグ化Ｔ細胞抗原および／またはＴ細胞抗原をコードする既知のタグ化核酸をＡＰＣ内に導入することによって得られる。
「タグ化」とは、本明細書において、既知配列の核酸、蛍光色素またはラベルなどのタグを保有することを意味する。典型的に、タグは、上記に定義されるようなバーコード配列であり得る。
特定の一実施形態では、Ｔ細胞抗原をコードする核酸のライブラリーは、患者または病原体ＲＮＡまたはＤＮＡのシーケンシングに基づいて化学的に合成される。
別の特定の実施形態では、Ｔ細胞抗原をコードする核酸のライブラリーは、上記に定義されるように目的対象の組織由来の核酸の増幅（例えばＰＣＲによる）によって得られる。
特定の一実施形態では、Ｔ細胞抗原をコードする核酸のライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリーである。別の実施形態では、Ｔ細胞抗原をコードする核酸のライブラリーは、ｍＲＮＡライブラリーである。
目的対象の組織から得られたＴ細胞抗原をコードする核酸のライブラリーは、当業者によく知られた方法によって取得され得る。特に、細胞、例えば、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩ発現細胞または腫瘍細胞は、ＤＮａｓｅ、プロテアーゼ（例えばコラゲナーゼ）および機械的消化などの公知技術によって目的対象の組織から抽出することができる。ＲＮＡは、シリカカラムまたは酸フェノール技術などの当業者によく知られた技術によって前記細胞から単離することができる。これらのＲＮＡを次いで、よく知られた技術を用いて逆転写してｃＤＮＡライブラリーを得ることができる。好ましくは、ｃＤＮＡライブラリーは、ＲＮＡとハイブリダイズするプライマーを用いて逆転写によって得られる。プライマーは、ポリ（Ａ）テールに対するハイブリダイズによって全てのｍＲＮＡに対してプライムすることができ（アンカーオリゴｄＴプライマー）、または、ＲＮＡの特定のサブセットに対してのみプライムするように設計されるか、もしくは、任意のＲＮＡに対してランダムにプライムするように設計される。
特定の一実施形態では、前記ライブラリーは、ｍＲＮＡ濃度の違いに起因するライブラリー内のバイアスを減少させるように正規化される。
正規化技術の範囲は当業者によく知られており、例えば、二重鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）に基づくｃＤＮＡライブラリーの正規化（Ｂｏｇｄａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈａｐｔｅｒ ５：Ｕｎｉｔ ５．１２．１－２７）、およびｍＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリダイゼーションおよびサブトラクションによるｃＤＮＡライブラリーの正規化（Ｃｈｅｎ（２００３）Ｉｎ Ｓ．－Ｙ．Ｙｉｎｇ（Ｅｄ．），Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ｐｐ．３３－４０）Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）がある。
特定の一実施形態では、Ｔ細胞抗原をコードする核酸のライブラリーは、以下に定義されるように、特異的な増幅および本発明の同定方法の後続するステップにおけるシーケンシングを可能にするユニバーサル配列を含む。
本明細書において用いられる用語「ユニバーサル配列」は、例えばライゲーションまたは任意の他の適切な方法（オーバーラップ伸長ＰＣＲ、ＰＣＲ、プライマー伸長またはダイレクトＤＮＡ合成など）によって、特に核酸分子のライブラリー内の核酸配列に付着させることができる配列を指し、それにより、同一配列が複数の異なる核酸分子に付着される。そのようなユニバーサル配列は、複数のサンプルを同時に分析するのに特に有用である。ユニバーサル配列の例は、ユニバーサルプライマーおよびユニバーサルプライミング部位である。ユニバーサルプライミング部位は、適切なプライマーが結合することができ、ユニバーサルプライマーに付着した核酸配列に対して相補の核酸配列の合成のためのプライミング部位として使用することのできる「共通プライミング部位」を含む。
Ｔ細胞抗原をコードする核酸のライブラリーのＡＰＣ内への導入は、当業者によく知られている任意の方法によって、例えば、ウイルスベクターを用いた形質導入によって、エレクトロポレーションによって、またはトランスフェクションによって（例えば、リポ－、ヌクレオ－フェクション、ナノ粒子に基づく、または細胞透過性ペプチドを用いる）、行なうことができる。
特定の一実施形態では、Ｔ細胞抗原をコードする核酸のライブラリーの、特に、Ｔ細胞抗原をコードする核酸のｃＤＮＡライブラリーの、前記ＡＰＣ内への導入は、前記ライブラリーを保有するウイルスベクターを用いた前記ＡＰＣの形質導入によって行なわれる。
「ウイルスベクター」とは、本明細書において、望ましい遺伝物質を封入することができ、望ましい遺伝物質を標的細胞内にトランスフェクトおよび組み込むことができ、したがって、効果的かつ標的化された遺伝物質の送達をエクスビボでおよびインビボの両方で可能にすることができるウイルス、またはその組み換え体を意味する。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、鶏痘ウイルスベクター、バキュロウイルスベクターおよびセンダイウイルスベクターを含む。好ましくは、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
当業者によって理解されるように、Ｔ細胞抗原をコードする核酸のＡＰＣ内への導入がウイルスベクターを用いた形質導入によって行なわれる場合、前記ＡＰＣによって発現または提示される別個のＴ細胞抗原の数は、前記ＡＰＣを形質導入するために用いた前記ウイルスベクターの感染多重度（ＭＯＩ）に依存する。
したがって、特定の一実施形態では、Ｔ細胞抗原をコードする核酸のライブラリーの前記ＡＰＣ内への導入は、０．０１～１０００、０．０５～９００、０．１～８００、０．５～７００、１～６００、２～５００、３～４５０、４～４００、５～３５０、６～３００、７～２５０、８～２００、９～１５０、または１０～１００の感染多重度、具体的には、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、または５００の感染多重度で、前記ライブラリーを保有するウイルスベクターを用いて前記ＡＰＣを形質導入することによって行なわれ、それにより、少なくとも１つの抗原から複数の抗原までを発現するＡＰＣが生成される。
別の実施形態では、Ｔ細胞抗原をコードする核酸のライブラリー、特に、Ｔ細胞抗原をコードする核酸のＲＮＡライブラリーの、前記ＡＰＣ内への導入は、前記ｍＲＮＡまたは対応するＤＮＡを用いたＡＰＣのトランスフェクションによって行なわれる。そのようなトランスフェクションは、典型的に、リポフェクション、ヌクレオ－フェクション、ナノ粒子に基づくトランスフェクションによって、または、ＲＮＡに共有結合した細胞透過性ペプチド（Ｒａｄｉｓ－Ｂａｐｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５２：１５－２６）、例えば、ペネトラチンを用いて行なわれ得る。同じ原理が、抗原／ＭＨＣ複合体に対するＴＣＲ特異性および／または親和性／結合性をスクリーニングするための自己由来または異種Ｔ細胞、またはＴ細胞株によるＴＣＲの発現に適用される。
用語「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」は、本明細書において、Ｔ細胞（すなわち、Ｔリンパ球）の表面上に存在する抗原認識分子を指す。この定義は、当技術分野で知られている用語の理解を明示的に含み、例えば、不変ＣＤ３鎖との複合体として細胞膜において発現される非常に可変のαまたはβ鎖のジスルフィド結合ヘテロ二量体を含むもしくはそれからなる受容体、または、Ｔ細胞のサブセット上のＣＤ３との複合体として細胞膜において発現される可変のγおよびδ鎖を含むもしくはそれからなる受容体を含む。ＴＣＲの抗原認識ドメインは典型的に、別個の遺伝子によってコードされるα鎖とβ鎖、またはγ鎖およびδ鎖からなる。
Ｔ細胞受容体遺伝子は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えと呼ばれる遺伝子組換えの固有のメカニズムを受け、それはＴ細胞成熟の初期の間に発生するリンパ球においてのみ生じる。それは、Ｔ細胞上に見られる非常に様々なレパートリーのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をもたらす。
好ましくは、受容体のセットは、Ｔ細胞の表面上に提示されるＴＣＲのセットである。
本明細書において一般的に用いられる用語「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、例えば、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えば、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ９およびＴＨ１７細胞）、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、抗原経験Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、セントラルＴ細胞、エフェクターＴ細胞、ＣＤ４＋制御性／抑制性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、および／または自己侵襲的Ｔ細胞（例えば、ＴＨ４０細胞）、粘膜関連不変Ｔ細胞（ＭＡＩＴ）、疲弊Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、組織常在性Ｔ細胞を指し得る。
好ましくは、ＴＣＲを提示するＴ細胞のセットにおいて、それぞれのＴ細胞は、固有のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現または提示する。
特定の一実施形態では、ＴＣＲを提示するＴ細胞のセットのＴ細胞は、Ｔ細胞抗原を提示するＡＰＣのセットを得るために用いた上記に定義されるようなＴ細胞抗原をコードする核酸のライブラリーと同一の目的対象に由来する。特に、この実施形態は、私的Ｔ細胞抗原の検出を容易にする。
「私的抗原（ｐｒｉｖａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）」とは、本明細書において、１つまたは数個の個体に制限された抗原性の特異性を意味する。
別の特定の実施形態では、ＴＣＲを提示するＴ細胞のセットのＴ細胞は、Ｔ細胞抗原を提示するＡＰＣのセットを得るために用いた上記に定義されるようなＴ細胞抗原をコードする核酸のライブラリーと同一の目的対象に由来しない。特に、この実施形態は、公衆Ｔ細胞抗原の検出を容易にする。
「公衆抗原（ｐｕｂｌｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）」とは、本明細書において、集団の５％超、より具体的には１０％超において存在する抗原を意味する。
特定の一実施形態では、ＴＣＲを提示するＴ細胞のセットのＴ細胞は、対象から収集された後の増殖を可能にするために活性化される。
Ｂ細胞受容体／Ｂ細胞抗原
別の特定の実施形態では、受容体のセットはＢ細胞受容体（ＢＣＲまたは抗体）のセットであり、およびリガンドのセットはＢ細胞抗原のセットである。
本明細書において用いられる用語「ＢＣＲ」は、Ｂ細胞の外面に位置する膜貫通受容体タンパク質を指す。受容体の結合部分は、ほとんどの抗体のように、固有かつランダムに決定された抗原結合部位を有する膜結合型抗体からなる（Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えを参照）。Ｂ細胞が、その受容体に結合する抗原（その「同族抗原」）と最初に遭遇することによって活性化されると、細胞が増殖および分化して、抗体分泌血漿Ｂ細胞およびメモリーＢ細胞の集団が産生される。
用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の部分、すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。したがって、用語「抗体」は、抗体分子全体だけでなく、抗体フラグメントならびにヒト化抗体などの誘導体を含む抗体の変異体も包含する。特定の従来の抗体では、２つの重鎖は、ジスルフィド結合によって互いに連結され、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖に連結される。２つのタイプの軽鎖、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）が存在する。抗体分子の機能性活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＹが存在する。それぞれの鎖は、別個の定常領域配列を含む。軽鎖は、２つのドメイン：可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン：可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、ＣＨと総称される）を含む。軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域は、抗原に対する結合認識および特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、抗体鎖の関連、分泌、胎盤通過性、補体結合、およびＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合などの重要な生物学的特性を与える。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末部分であり、１つの軽鎖および１つの重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原性決定因子との間の構造相補性にある。抗体結合部位は、主に高頻度可変性または相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基で構成される。時折、非高頻度可変性またはフレームワーク領域（ＦＲ）由来の残基は、ドメイン構造全体に影響を及ぼし、したがって結合部位に影響を及ぼす。相補性決定領域（ＣＤＲ）はともにネイティブ免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を規定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれ３つのＣＤＲを有しており、それぞれＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、およびＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３とそれぞれ指定される。したがって、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域のそれぞれ由来のＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に置かれたアミノ酸配列、すなわち、Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）によって定義されるように、単一種における異なる免疫グロブリンの間で相対的に保存されている免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域の部分を指す。
用語「抗体」はさらに、単鎖抗体、例えば、ラクダ科抗体、またはナノボディもしくはＶＨＨを表わす。
抗体遺伝子は一般に、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えと呼ばれる遺伝子組換えの固有のメカニズムを受け、それはＢ細胞成熟の初期の間に発生するリンパ球においてのみ生じる。抗体遺伝子は、さらに体細胞高頻度突然変異を受けることがあり、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えと体細胞高頻度突然変異の組み合わせは、Ｂ細胞上に見られる非常に様々なレパートリーの抗体／免疫グロブリン（Ｉｇ）をもたらす。
特定の一実施形態では、受容体のセットがＢ細胞受容体のセットである場合、前記Ｂ細胞受容体はＢ細胞によって提示される。
マイクロリアクターおよび共区画化
リガンド種および受容体種を「共区画化する（ｃｏ－ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚｉｎｇ）」とは、本明細書において、複数のマイクロリアクターを形成し、各マイクロリアクターが、リガンド種および／または受容体種のグループ、好ましくは少なくとも１つのリガンド種および任意に少なくとも１つの受容体種のグループを、リガンドおよび受容体のセットによって提供される残りのリガンド種および受容体種から分離することを意味する。
本発明の文脈において、共区画化／マイクロリアクターステップは、任意の適切な方法によって、例えば、マイクロ流体、フローサイトメトリー細胞に基づくソーティング、および／または限界希釈によって行なわれ得る。
特定の一実施形態では、マイクロリアクターは、ウェルまたは微細加工ウェルである。
別の特定の実施形態では、マイクロリアクターは、水性液滴であり、特に、連続的な非混和相中である。
「液滴」は通常、体積の尺度を指し、さらに、本発明の文脈において、第二の流体によって取り囲まれた第一の流体の分離された部分を指す。液滴は必ずしも球状ではないが、例えば外的環境に応じて他の形状も想定され得ることに留意しなければならない。
好ましくは、それぞれの液滴は、２つの哺乳類細胞の体積と少なくとも等しい体積を有する。
別の特定の実施形態では、マイクロリアクターはマイクロカプセルである。マイクロカプセルは、体積の尺度を指すことができ、さらに、本発明の文脈において、第二の材料によって取り囲まれた第一のコーティング材料の分離された部分を指す。マイクロカプセルは必ずしも球状ではないが、例えば外的環境に応じて他の形状も想定され得ることに留意しなければならない。「マイクロカプセル」は一般に、永久的または一時的に封入された物質を利用できるコアを形成する空間を取り囲む固形シェルからなる中空の微粒子を指す。物質は、薬物、農薬、色素、細胞、それらの組み合わせおよび同様の材料であり得る。固形シェルは、例えば、硬質または軟質の可溶性フィルムで作られたマイクロメートルの壁の内側に固体、液体、または気体を封入することができる。コーティングのために一般的に用いられるコーティング材料は、エチルセルロース、ポリビニルアルコール、ゼラチン、アルギン酸ナトリウムである。
好ましくは、各マイクロカプセルは、２つの哺乳類細胞の体積と少なくとも等しい体積を有する。
別の特定の実施形態では、マイクロリアクターはマイクロビーズである。マイクロビーズは、体積の尺度を指すことができ、さらに、半固体ビーズに対して浸透性またはそうでない流体によって取り囲まれた第一の半固体材料の分離された部分を指す。マイクロビーズは必ずしも球状ではないが、例えば外的環境に応じて他の形状も想定され得ることに留意しなければならない。「マイクロビーズ」は一般に、永久的または一時的に封入された物質を利用できる全体積を占める半固体の多孔質性またはそうでない構造を指す。物質は、薬物、農薬、色素、細胞、それらの組み合わせおよび同様の材料であることができる。半固体多孔質性構造は、例えば、硬質または軟質の可溶性フィルムで作られたマイクロメートルの壁の内側に固体、液体、または気体を封入することができる。マイクロビーズを形成するために一般的に用いられる材料は、アガロース、アクリルアミド、アルギン酸ナトリウムのようなポリマーを含む。
好ましくは、各マイクロビーズは、２つの哺乳類細胞の体積と少なくとも等しい体積を有する。
細胞をマイクロカプセルまたはマイクロビーズ内に封入した後に、細胞は、マイクロカプセルまたはマイクロビーズ内への液滴の形質転換を達成することができることが理解される。
哺乳類細胞の平均体積は当業者によく知られており、典型的に約０．００２ｎＬである。
特定の一実施形態では、各液滴またはマイクロカプセルまたはマイクロビーズは、２０ｎＬ未満の体積を有する。１つの実施形態では、各液滴は、１５ｎＬ未満、１０ｎＬ未満、９ｎＬ未満、８ｎＬ未満、７ｎＬ未満、６ｎＬ未満、５ｎＬ未満、３ｎＬ未満、２．５ｎＬ未満、２ｎＬ未満、１．５ｎＬ未満、１ｎＬ未満、０．５ｎＬ未満、０．２ｎＬ未満、０．１ｎＬ未満、０．０５ｎＬ未満、例えば２０ｐＬ～３ｎＬ、３０ｐＬ～１ｎＬ、４０ｐＬ～５００ｐＬ、５０ｐＬ、～２５０ｐＬ、６０ｐＬ～１００ｐＬ、または０．１ｎＬ～３ｎＬ、０．５ｎＬ～３ｎＬ、１ｎＬ～３ｎＬ、典型的に、０．１ｎＬ、０．５ｎＬ、１ｎＬ、１．２ｎＬ、１．４ｎＬ、１．６ｎＬ、１．８ｎＬ、２．０ｎＬ、２．２ｎＬ、２．４ｎＬ、２．６ｎＬ、２．８ｎＬ、３ｎＬの体積を有する。
そのような液滴またはマイクロカプセルまたはマイクロビーズは、当業者によく知られた任意の技術によって、具体的にはマイクロ流体技術によって調製され得る。
当業者によって理解されるように、および、以下にさらに説明するように、１つのマイクロリアクター、例えば液滴内に共区画化されるリガンドおよび受容体の数、具体的にはＴ細胞抗原を提示するＡＰＣおよびＴＣＲを提示するＴ細胞の数は、確率分布、例えばポアソン分布に従い、例えば、第一の流体中の第一のタイプの細胞の濃度、第二の流体中の第二のタイプの細胞の濃度、主チャネルと副チャネルの形状、用いられる第一の流体、第二の流体および担体流体の注入パラメーターに依存する。
リガンドおよび／または受容体が細胞または粒子上に提示される場合、細胞または粒子の分布は、したがってリガンドおよび／または受容体の分布もまた、典型的にポアソン分布に従う。しかしながら、マイクロリアクターが液滴である場合、当業者に馴染みのある様々なマイクロ流体技術は、ポアソン分布以外の分布、特に、液滴のより多くの画分が単一細胞／粒子を含む分布を可能にする。これらの技術は、液滴内への区画化の前に慣性力を用いて粒子／細胞を整えることからなる方法であってディーンフローのような二次的フローによって媒介される方法（Ｅｄｄ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ８：１２６２－１２６４；Ｋｅｍｎａ ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｃｈｉｐ（２０１２）１２：２８８１－２８８７，Ｌａｇｕｓ ａｎｄ Ｅｄｄ（２０１３）ＲＳＣ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３：２０５１２－２０５２２，Ｓｃｈｏｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ３５：３８５－３９２，Ｓｃｈｏｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８：３７１４、ＵＳ２０１３／０１１２１０、ＵＳ２０１０／０２１９８４およびＵＳ２０１１／０２２３３１４を参照）、分析／測定する液滴の数を減少させるための単一細胞／粒子または細胞／粒子のペアを含む液滴の単離／ソーティングからなる方法（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １５：３９８９－３９９３；Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １７：３６６４－３６７１およびＳｈｅｍｂｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２２：２２０６－２２１５を参照）、細胞／粒子を狭いボトルネック内に流して同一サンプルの複数の細胞／粒子を封入する可能性を減少させることからなる方法（Ｒａｍｊｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ８：０３４１０４を参照）、細胞／粒子がノズルの前を通過するときの要求に応じた液滴の生産からなる方法（Ｓｃｈｏｅｎｄｕｂｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ９：０１４１１７；Ｌｅｉｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ９：０２４１０９およびＹｕｓｏｆ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｌａｂ．Ｃｈｉｐ１１：２４４７－２４５４を参照）を含む。
したがって、特定の一実施形態では、複数の受容体種、具体的には水性組成物内に含まれるＴＣＲ提示Ｔ細胞の複数の受容体種は、複数のリガンド、具体的には抗原提示ＡＰＣの複数のリガンドとともに、複数のマイクロリアクター内に、具体的には複数のマイクロ流体液滴内に共区画化され、１つのマイクロリアクター内に共区画化される、具体的には１つの液滴内に共区画化される受容体種の数、具体的にはＴＣＲ提示Ｔ細胞の数は、用いられるパラメーターに応じて、確率分布、具体的にはポアソン分布に従う。パラメーターは、例えば、ほとんどのマイクロリアクターが１または０個の受容体、具体的にはＴＣＲ提示Ｔ細胞を有するように適合させることができ、したがって、数個の受容体を含む区画の数を最小限にさせる。
受容体種、具体的にはＴＣＲ提示Ｔ細胞を、リガンド種、具体的には抗原提示ＡＰＣとともに共区画化するために用いられるパラメーターは、少なくともいくつかのマイクロリアクターが、単一の受容体種、具体的には単一のＴＣＲ提示Ｔ細胞を含むように適合させることができる。
同様に、受容体種、具体的にはＴＣＲ提示Ｔ細胞を、リガンド種、具体的には抗原提示ＡＰＣとともに共区画化するために用いられるパラメーターは、少なくともいくつかのマイクロリアクターが、単一のリガンド種、具体的には単一の抗原提示ＡＰＣを含むように適合させることができる。
特定の好ましい一実施形態では、少なくとも１つのリガンド種、具体的には少なくとも１つのＴ細胞抗原、より具体的には少なくとも１つのＴ細胞抗原提示ＡＰＣと、少なくとも１つの受容体種、具体的には少なくとも１つのＴＣＲ、より具体的には少なくとも１つのＴＣＲ提示Ｔ細胞とをそれぞれが含むマイクロリアクターのセットが作製される。
しかしながら、当業者によって理解されるように、任意の受容体種を含まないいくつかのマイクロリアクターを作製してもよい。
好ましくは、、少なくとも１つのリガンド種、具体的には少なくとも１つのＴ細胞抗原、より具体的には少なくとも１つのＴ細胞抗原提示ＡＰＣと、１つまたは少数の受容体種、具体的には１つまたは少数のＴＣＲ、より具体的には１つのまたは少数のＴＣＲ提示Ｔ細胞とをそれぞれが含むマイクロリアクターのセットが作製される。
「少数」とは、本明細書において、１０未満、例えば１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１を意味する。
別の好ましい実施形態では、１つまたは少数のリガンド種、具体的には１つまたは少数のＴ細胞抗原、より具体的には１つまたは少数のＴ細胞抗原提示ＡＰＣと、少なくとも１つの受容体種、特に少なくとも１つのＴＣＲ、より具体的には少なくとも１つのＴＣＲ提示Ｔ細胞とをそれぞれが含むマイクロリアクターのセットが作製される。
さらに好ましい一実施形態では、１つまたは少数のリガンド種、具体的には１つまたは少数のＴ細胞抗原、より具体的には１つまたは少数のＴ細胞抗原提示ＡＰＣと、１つまたは少数の受容体種、具体的には１つまたは少数のＴＣＲ、より具体的には１つまたは少数のＴＣＲ提示Ｔ細胞とをそれぞれが含むマイクロリアクターのセットが作製される。
好ましい一実施形態では、１つのリガンド種、具体的には１つのＴ細胞抗原、より具体的には１つのＴ細胞抗原提示ＡＰＣと、１つの受容体種、具体的には１つのＴＣＲ、より具体的には１つのＴＣＲ提示Ｔ細胞とをそれぞれが含むマイクロリアクターのセットが作製される。
特に好ましい一実施形態では、複数のリガンド種、具体的には複数のＴ細胞抗原、より具体的には複数のＴ細胞抗原を提示する１つのＡＰＣまたは単一（または複数）のＴ細胞抗原を提示する複数のＡＰＣと、１つの受容体種、具体的には１つのＴＣＲ、より具体的には１つのＴＣＲ提示Ｔ細胞とをそれぞれが含むマイクロリアクターのセットが作製される。
したがって１つの実施形態では、マイクロリアクターのセットは、１～２０，０００マイクロリアクター／秒、例えば、１～１５，０００マイクロリアクター／秒、１～１０，０００マイクロリアクター／秒、１～９０００マイクロリアクター／秒、１～８０００マイクロリアクター／秒、１～７０００マイクロリアクター／秒、１～６０００マイクロリアクター／秒、１～５０００マイクロリアクター／秒、１～４０００マイクロリアクター／秒、１～３０００マイクロリアクター／秒、１～２０００マイクロリアクター／秒、１～１０００マイクロリアクター／秒、１～８００マイクロリアクター／秒、１～７００マイクロリアクター／秒、１～６００マイクロリアクター／秒、１～５００マイクロリアクター／秒、１～４００マイクロリアクター／秒、１～３００マイクロリアクター／秒、１～２００マイクロリアクター／秒、１～１００マイクロリアクター／秒、１～８０マイクロリアクター／秒、１～７０マイクロリアクター／秒、１～５０マイクロリアクター／秒、例えば１０～３００マイクロリアクター／秒、５０～３００マイクロリアクター／秒、１００～３００マイクロリアクター／秒、１５０～３００マイクロリアクター／秒、１５０～２５０マイクロリアクター／秒、１７５～２５０マイクロリアクター／秒、典型的に、１～１０００マイクロリアクター／秒、好ましくは１７５～２５０マイクロリアクター／秒の頻度でのリガンド種、具体的には抗原提示ＡＰＣと、受容体種、具体的にはＴＣＲ提示Ｔ細胞との共区画化によって形成される。
マイクロリアクターのセット、具体的にはマイクロ流体液滴のセットは、任意の適切な技術によって得ることができる。具体的には、マイクロリアクターのセットは、（ａ）第一の流体源を提供するステップ（ここで第一の流体は、上記に定義される受容体のセットの懸濁液を含む）、（ｂ）第二の流体源を提供するステップ（ここで第二の流体は、上記に定義されるリガンドのセットの懸濁液を含む）；（ｃ）担体流体を提供するステップ（ここで担体流体は、第一の流体および第二の流体と非混和性である）、（ｄ）担体流体をチップの主チャネル内に注入するステップ、（ｅ）チップの少なくとも副チャネルにおいて第二の流体および第一の流体を注入することによって、担体流体において、マイクロリアクター、具体的には液滴の流れを生成するステップによって形成することができ、副チャネルは主チャネルにおいて開口しており、それぞれの生産されたマイクロリアクター、具体的には液滴は、第一の流体および第二の流体の混合物を含んでおり、ここで第一の流体内の受容体の濃度、第二の流体内のリガンドの濃度、主チャネルおよび副チャネルの形状、第一の流体、第二の流体および担体流体の注入パラメーターは、それぞれのマイクロリアクター、具体的には液滴が、少なくとも１つの受容体種（好ましくは単一の受容体種のみ）と、少なくとも１つのリガンド種とを含み、好ましくは２０ｎＬ未満の体積を提供するように適合される。
あるいは、マイクロリアクターのセットは、（ａ）第一の流体源を提供するステップ（ここで第一の流体は上記に定義されるような予め形成された受容体およびリガンドのセットの懸濁液を含む）、（ｂ）任意に、第二の流体源を提供するステップ（ここで第二の流体は、上記に定義されるような検出のための試薬を含む）、（ｃ）担体流体を提供するステップ（ここで担体流体は、第一の流体および第二の流体と非混和性である）によって形成され得る。
１つの実施形態では、第一の流体源および第二の流体源は、接合部（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）の形態で編成される。
接合部は、例えば、Ｔ接合部、Ｙ接合部、チャネル内チャネル接合部（例えば同軸配置、または内側チャネルと内側チャネルの少なくとも一部を取り囲む外側チャネルとを含む）、クロス（または「Ｘ」）接合部、フローフォーカシング接合部、または液滴を作製するための任意の他の適切な接合部であり得る。例えば、２００４年４月９日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１０９０３、表題「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ」（Ｌｉｎｋ，ｅｔ ａｈ，２００４年１０月２８日にＷＯ２００４／０９１７６３として公開）、または２００３年６月３０日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２０５４２、表題「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｆｌｕｉｄ Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ」（Ｓｔｏｎｅ，ｅｔ ａｈ，２００４年１月８日にＷＯ２００４／００２６２７として公開）を参照。
一部の実施形態では、接合部は、実質的に単分散の液滴を生産するように構成および配置され得る。
受容体種／液滴の量は、負荷率（ｌｏａｄｉｎｇ ｒａｔｅ）とも呼ばれ得る。例えば、平均負荷率は、約１未満の受容体種／液滴、約０．９未満の受容体種／液滴、約０．８未満の受容体種／液滴、約０．７未満の受容体種／液滴、約０．６未満の受容体種／液滴、約０．５未満の受容体種／液滴、約０．４未満の受容体種／液滴、約０．３未満の受容体種／液滴、約０．２未満の受容体種／液滴、約０．１未満の受容体種／液滴、約０．０５未満の受容体種／液滴、約０．０３未満の受容体種／液滴、約０．０２未満の受容体種／液滴、または約０．０１未満の受容体種／液滴であり得る。場合によっては、２以上の受容体種を中に有する液滴が生産される可能性を最小限にするために、より少ない受容体種の負荷率が選択され得る。したがって、例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の液滴は、受容体種を含まないか、または１つの受容体種のみを含んでよい。
少なくともいくつかのマイクロリアクターは、本発明の文脈において、本明細書において以下にさらに定義されるような逆転写酵素およびバーコード化プライマーをさらに含んでよい。
認識アッセイおよび分類
「認識」とは、本明細書において、好ましくはリガンド種および／または受容体種による特定の反応を誘導する、リガンド種と受容体種との間の結合を意味する。
当業者によって理解されるように、リガンド種と受容体種との間の認識によって誘導される反応は、考慮される特定のリガンドおよび受容体に依存する。例えば、Ｔ細胞抗原とＴ細胞によって提示されるその対応するＴＣＲとの間の認識は、前記Ｔ細胞の活性化を誘導する。同様に、Ｂ細胞抗原とＢ細胞によって提示されるその対応するＢ細胞受容体との間の認識は、前記Ｂ細胞の活性化を誘導する。
したがって、リガンド種と受容体種との間の認識を決定するために用いられるアッセイは、考慮される特定のリガンドおよび受容体に依存する。
特定の一実施形態では、受容体のセットの受容体種が細胞によって提示される場合、それぞれのマイクロリアクターにおけるリガンドと受容体との間の認識は、細胞の応答が前記マイクロリアクターにおいて誘導されるかどうか決定することによってアッセイされ、誘導された細胞の応答が前記マイクロリアクターにおいて決定される場合に、マイクロリアクターは陽性（マイクロリアクターにおけるリガンド種と受容体種との間の認識）として分類され、誘導された細胞の応答が前記マイクロリアクターにおいて決定されない場合に、マイクロリアクターは陰性（マイクロリアクターにおけるリガンド種と受容体種との間の認識なし）として分類される。
より具体的には、受容体のセットがＴＣＲ提示Ｔ細胞であり、リガンドのセットがＴ細胞抗原提示ＡＰＣである場合、リガンドと受容体との間の認識は、Ｔ細胞活性化が前記マイクロリアクターにおいて誘導されるかどうか決定することによってアッセイされ、誘導されたＴ細胞活性化が前記マイクロリアクターにおいて決定される場合に、マイクロリアクターは陽性（マイクロリアクターにおけるリガンド種と受容体種との間の認識）として分類され、誘導されたＴ細胞活性化が前記マイクロリアクターにおいて決定されない場合に、マイクロリアクターは陰性（マイクロリアクターにおけるリガンド種と受容体種との間の認識なし）として分類される。
「Ｔ細胞活性化」とは、本明細書において、その化学的性質が何であれＴＣＲによる抗原の認識によって誘導される調節された一連のイベントであって、それにより、ＴＣＲ提示Ｔ細胞による、活性化、分化、増殖およびＴ細胞の免疫性の機能の獲得がもたらされるものを意味する。当業者によく知られているように、ＴＣＲ活性化によって開始されるシグナル伝達カスケードは、イノシトール三リン酸／Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール／タンパク質キナーゼＣ、Ｒａｓ／分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ、およびＰＩ ３－Ｋ経路を含む。これらの経路の構成要素は、情報を核に伝達し、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、およびインターフェロン－γなどの様々な分泌因子をコードする遺伝子を活性化し、ＣＤ１３７、ＣＤ４０ＬおよびＣＤ６９などの様々な細胞表面発現活性化マーカーをコードする遺伝子を活性化し、免疫系の細胞構成要素の増殖、成熟、および機能と関連するカスパーゼ３／７経路を誘導する。
ある特定の実施形態では、マイクロリアクターにおいてリガンド種のセットを受容体種のセットと接触させるステップは、短いインキュベーション時間、例えば、約０．００１時間～約８時間生じる。ある特定の実施形態では、接触させるステップは、約０．００１時間～約８時間、約０．００１時間～約７時間、約０．００１時間～約６時間、約０．００１時間～約５時間、約０．００１時間～約４時間、約０．００１時間～約３時間、約０．００１時間～約２時間、約０．００１時間～約１時間、約０．０１時間～約８時間、約０．０１時間～約７時間、約０．０１時間～約６時間、約０．０１時間～約５時間、約０．０１時間～約４時間、約０．０１時間～約３時間、約０．０１時間～約２時間、約０．０１時間～約１時間、約０．１時間～約８時間、約０．１時間～約７時間、約０．１時間～約６時間、約０．１時間～約５時間、約０．１時間～約４時間、約０．１時間～約３時間、約０．１時間～約２時間、約０．１時間～約１時間、約１時間～約８時間、約１時間～約７時間、約１時間～約６時間、約１時間～約５時間、約１時間～約４時間、約１時間～約３時間、または約１時間～約２時間生じる。
ある特定の実施形態では、マイクロリアクターにおいてリガンド種のセットを受容体種のセットと接触させるステップは、長いインキュベーション時間、例えば、少なくとも約８時間、好ましくは約８時間～約４８時間生じる。ある特定の実施形態では、接触させるステップは、約８時間～約４８時間、約８時間～約４０時間、約８時間～約３２時間、約８時間～約２４時間、約８時間～約１６時間、約１６時間～約４８時間、約１６時間～約４０時間、約１６時間～約３２時間、約１６時間～約２４時間、約２４時間～約４８時間、約２４時間～約４０時間、約２４時間～約３２時間、約３２時間～約４８時間、約３２時間～約４０時間、または約４０時間～約４８時間生じる。
ある特定の実施形態では、接触させるステップが、より短いインキュベーション時間（例えば、約０．００１時間～約８時間）であり、リガンド種と受容体種が高親和性で結合する場合、産生される増強シグナルは、Ｔ細胞活性化の早期マーカーまたは後期マーカーである。リガンド種および受容体種が互いに高親和性を有する場合、選択的または特異的な結合は直ちに生じることができ、それにより、Ｔ細胞の即時の活性化をもたらすことができる（例えば、リガンド種がＴ細胞抗原であり受容体種がＴ細胞受容体である場合）。Ｔ細胞の即時の活性化は、早期マーカーの即時の発現をもたらすことができ、これには、限定されないが、ＣＤ６９、ＣＤ１０７ａ、およびトランスフェリン受容体が含まれ得る。Ｔ細胞の即時の活性化はまた、継続的に発現されるマーカーの即時の発現をもたらすこともでき、これには、限定されないが、ＩＦＮγ、ＣＤ２５、ＣＤ１５４、ＴＮＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２、およびＩＬ－１ｂが含まれ得る。Ｔ細胞の即時の活性化はまた、より短いインキュベーション時間中に後期マーカーの発現をもたらすこともでき、これには、限定されないがＣＤ１３７、ＨＬＡ－ＤＲ、ＶＬＡ１、ＰＴＡ１、ＣＤ７１、ＣＤ２７、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４が含まれ得る。
ある特定の実施形態では、接触させるステップがより長いインキュベーション時間（例えば、少なくとも約８時間、好ましくは約８～約４８時間）であり、リガンド種と受容体種が高親和性で結合する場合、産生される増強シグナルは、Ｔ細胞活性化の早期マーカーまたは後期マーカーであり得る。インキュベーション時間がより長いので、Ｔ細胞の即時の活性化は、前述の早期または後期マーカーのいずれかの産生をもたらすことができる。さらに、インキュベーション時間がより長いので、継続的に発現されるマーカーも産生され得る。
ある特定の実施形態では、接触させるステップがより長いインキュベーション時間（例えば、少なくとも約８時間、好ましくは約８～約４８時間）であり、リガンド種と受容体種が低親和性で結合する場合、産生される増強シグナルは、Ｔ細胞活性化の早期マーカーである。より低い親和性を有するので、Ｔ細胞を活性化するためにより長いインキュベーション時間がかかる可能性があり、したがって、インキュベーション時間に応じてＴ細胞活性化の早期マーカーまたは後期マーカーのいずれかが観察され得る。低親和性を有するリガンド種および受容体種のための接触させるステップを延長することにより、産生される増強シグナルは最終的にＴ細胞活性化の後期マーカーとなり得る。
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞活性化の早期マーカーは、制限されないが、ＣＤ６９、ＣＤ１０７ａ、またはトランスフェリン受容体であり得る。
ある特定の実施形態では、継続的に発現されるＴ細胞活性化のマーカーは、制限されないが、ＩＦＮγ、ＣＤ２５、ＣＤ１５４、ＴＮＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２、およびＩＬ－１ｂであり得る。
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞活性化の後期マーカーは、制限されないが、ＣＤ１３７、ＨＬＡ－ＤＲ、ＶＬＡ１、ＰＴＡ１、ＣＤ７１、ＣＤ２７、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４であり得る。
ある特定の実施形態では、シグナルは、抗ＣＤ６９抗体、抗ＣＤ１０７ａ抗体、抗トランスフェリン受容体抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体、抗ＶＬＡ１抗体、抗ＰＴＡ１抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、または抗ＣＴＬＡ４抗体によって検出される。
Ｔ細胞活性化を決定するアッセイは、当業者によく知られており、とりわけ、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）またはＣＤ４０Ｌの上方制御の検出、サイトカイン分泌の検出、カスパーゼ３／７経路の誘導、ならびにパーフォリンもしくはグランザイムの分泌、またはＴＮＦ－α、およびインターフェロン－γの検出が含まれる。
受容体種に対するリガンド種の選択的および／または特異的な結合は、約１ｎＭ～約１００ｎＭ、約１ｎＭ～約７５ｎＭ、約１ｎＭ～約５０ｎＭ、約１ｎＭ～約２５ｎＭ、約１０ｎＭ～約１００ｎＭ、約１０ｎＭ～約７５ｎＭ、約１０ｎＭ～約５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２５ｎＭ、約２０ｎＭ～約１００ｎＭ、約２０ｎＭ～約７５ｎＭ、約２０ｎＭ～約５０ｎＭ、約３０ｎＭ～約１００ｎＭ、約３０ｎＭ～約７５ｎＭ、約３０ｎＭ～約５０ｎＭ、約４０ｎＭ～約１００ｎＭ、約４０ｎＭ～約７５ｎＭ、約４０ｎＭ～約５０ｎＭ、約５０ｎＭ～約１００ｎＭ、約５０ｎＭ～約７５ｎＭ、約６０ｎＭ～約１００ｎＭ、約６０ｎＭ～約７５ｎＭ、約７０ｎＭ～約１００ｎＭ、約８０ｎＭ～約１００ｎＭ、または約９０ｎＭ～約１００ｎＭの範囲内で、蛍光抗体を用いた蛍光アッセイにおいて検出され得る。受容体種に対するリガンド種の選択的な結合は、約１ｎＭ、約５ｎＭ、約１０ｎＭ、約１５ｎＭ、約２０ｎＭ、約２５ｎＭ、約３０ｎＭ、約３５ｎＭ、約４０ｎＭ、約４５ｎＭ、約５０ｎＭ、約５５ｎＭ、約６０ｎＭ、約６５ｎＭ、約７０ｎＭ、約７５ｎＭ、約８０ｎＭ、約８５ｎＭ、約９０ｎＭ、約９５ｎＭ、または約１００ｎＭであり得る。
Ｔ細胞活性化はまた、活性化されたＴ細胞の特徴的な特異的ｍＲＮＡ発現パターンを検出するためのバーコード化ｃＤＮＡプライマーを用いたＴ細胞ｍＲＮＡのシーケンシングによっても検出され得る。これらのｃＤＮＡプライマーは典型的に、同一マイクロリアクター内のリガンド特異的および受容体特異的ｃＤＮＡバーコード化プライマーと同一のバーコード配列を含んでおり、したがって、ｃＤＮＡは、リガンドおよび受容体ｃＤＮＡに含まれるものと同一のバーコード配列を含んでおり、陽性液滴（活性化されたＴ細胞を含む）中のリガンドおよび受容体がシーケンシングにより同定されるのを可能にする。ｃＤＮＡプライマーは、ｍＲＮＡ発現の定量化および正規化を容易にするために、固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含んでもよい（Ｋｉｖｉｏｊａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，９，７２－７４；Ｉｓｌａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１、１６３－１６６）。ビーズの数、または任意にＵＭＩの数は、ｍＲＮＡ発現を定量化および正規化するために用いられる。
同様に、受容体のセットがＢ細胞受容体提示Ｂ細胞であり、リガンドのセットがＢ細胞抗原である場合、リガンドと受容体との間の認識は、Ｂ細胞活性化が前記マイクロリアクターにおいて誘導されるかどうか決定することによってアッセイされ、誘導されたＢ細胞活性化が前記マイクロリアクターにおいて決定される場合に、マイクロリアクターは陽性（マイクロリアクターにおけるリガンド種と受容体種との間の認識）として分類され、前記マイクロリアクターにおいて誘導されたＢ細胞活性化が決定されない場合に、マイクロリアクターは陰性（マイクロリアクターにおけるリガンド種と受容体種との間の認識なし）として分類される。
「Ｂ細胞活性化」とは、本明細書において、Ｂ細胞に、活性化されたＢ細胞の表現型を示させるプロセスまたは活性を意味し、「活性化されたＢ細胞」は、以下の表現型のいくつかを示すことのできるＢ細胞を指す：Ｂ細胞活性化は、抗体産生（＞５０倍の発現増加の誘導、３００倍まで）、表面発現対分泌、抗原特異性、ＣＤ１３８／ＣＤ３８の発現、高い小胞体の網状組織または存在量、抗原介在性活性化、Ｔ細胞依存性活性化、Ｔ細胞非依存性活性化（Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０２：５９２－６００，Ｂｌｏｏｄ．２００２；９９：２９０５－２９１２、およびＢｌｏｏｄ．２０１０；１１６（１８）：３４４５－３４５５を参照）などを同定するために当該分野で知られている任意の方法によって測定され得る。
Ｂ細胞活性化を決定するためのアッセイは当業者によく知られている。
Ｂ細胞活性化はまた、活性化されたＢ細胞の特徴的な特異的ｍＲＮＡ発現パターンを検出するためのバーコード化ｃＤＮＡプライマーを用いたＢ細胞ｍＲＮＡのシーケンシングによっても同定され得る。これらのｃＤＮＡプライマーは典型的に、同一マイクロリアクター内のリガンド特異的および受容体特異的バーコード化ｃＤＮＡプライマーと同一のバーコード配列を含んでおり、したがって、ｃＤＮＡは、リガンドおよび受容体ｃＤＮＡ内に含まれるものと同一のバーコード配列を含んでおり、陽性液滴（活性化されたＢ細胞を含む）中のリガンドおよび受容体がシーケンシングによって同定されるのを可能にする。ｃＤＮＡプライマーは、ｍＲＮＡ発現の定量化を容易にするために固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含んでもよい。ビーズの数、または任意にＵＭＩの数は、ｍＲＮＡ発現を定量化するために用いられる。
特定の一実施形態では、アッセイ試薬がマイクロリアクターに添加される。好ましくは、前記アッセイ試薬は、共区画化ステップ中に前記リガンド種および前記受容体種と共区画化される。
例えば、マイクロリアクターがマイクロ流体液滴である場合、前記アッセイ試薬は、前記液滴の形成に用いられる第一の流体および／または第二の流体中に含まれ得る。あるいは、前記アッセイ試薬は、第三の流体を通して提供され得る。
試薬はまた、受動性の液滴合体（Ｍａｚｕｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００９）．Ｌａｂ Ｃｈｉｐ，９（１８），２６６５－２６７２；Ｍａｚｕｔｉｓ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ（２０１２）Ｌａｂ Ｃｈｉｐ，１２：１８００－１８０６を参照）、集束レーザーによる局所加熱によって駆動される液滴合体（Ｂａｒｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）．Ｌａｂ Ｃｈｉｐ７：１０２９－１０３３）を含む当業者に知られている様々な方法によって、または電気力を用いて（Ｃｈａｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２６：３７０６－３７１５；Ａｈｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，８８：２６４１０５；Ｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．、４５：２５５６－２５６０；Ｐｒｉｅｓｔ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，８９：１３４１０１）、または、例えば電気による力を用いた予め形成された液滴内への液体の注入によって（ピコ注入（ｐｉｃｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ））（Ａｂａｔｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０７：１９１６３－１９１６６）、予め形成された液滴に添加することもできる。
当業者によって理解されるように、前記アッセイ試薬は、行なわれる特定の認識アッセイに依存する。
特定の一実施形態では、前記アッセイ試薬は、以下に定義されるような検出技術による陽性マイクロリアクターの直接ソーティングを可能にするレポーター試薬を含む。
各マイクロリアクター内で行なわれるアッセイの結果に基づき、各マイクロリアクターを陽性または陰性として分類することができる。
特定の一実施形態では、陽性マイクロリアクターを陰性マイクロリアクターから分離することができ、それにより陽性マイクロリアクターのグループが形成される。
前記分離は、当業者によく知られた任意の技術によって行なうことができ、用いられるマイクロリアクターのタイプに依存する。特に、前記分離は、マイクロリアクター、具体的にはマイクロ流体液滴を、例えばレポーター試薬の検出によってソーティングすることによって行なわれ得る。前記分離はまた、フローサイトメトリーによるマイクロリアクターのソーティングによっても行なわれ得る。
好ましい一実施形態では、マイクロリアクターが液滴である場合、液滴は、マイクロ流体デバイスにおいて、誘電泳動によって（Ａｈｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．８８：０２４１０４）またはトリガーされる表面弾性波を用いて（Ｆｒａｎｋｅ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ９：２６２５－２６２７）、例えば、液滴内の蛍光シグナルを検出することによって（Ｂａｒｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｌａｂ Ｃｈｉｐ，９：１８５０－１８５８）または磁気泳動力を用いて、もしくは空気制御器を用いて（Ｘｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １７：７５１－７７１を参照）ソーティングされる。
あるいは、陽性または陰性としてのマイクロリアクターの分類に基づいて、陽性マイクロリアクターのサブセットを、陽性マイクロリアクターのグループを物理的に形成せずに知的にのみ実証することができる。
任意の追加の試薬およびマイクロリアクターの処理
特定の一実施形態では、前記マイクロリアクター、具体的には前記陽性マイクロリアクターは、追加の試薬を含む。
追加の試薬は典型的に、以下に定義されるように、逆転写酵素（ＲＴ）、細胞溶解バッファー、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ならびに、リガンドまたはリガンド候補をコードする核酸配列に特異的な複数のバーコード化プライマーおよび受容体をコードする核酸配列に特異的な複数のバーコード化プライマーを含む。
リガンドが上記に定義されるようなタグ化リガンドである場合、リガンドをコードする核酸配列に特異的なバーコード化プライマーは、前記リガンドのタグをコードする核酸配列に特異的なバーコード化プライマーであり得る。同様に、受容体が上記に定義されるようなタグ化受容体である場合、受容体をコードする核酸配列に特異的なバーコード化プライマーは、前記受容体のタグをコードする核酸配列に特異的なバーコード化プライマーであり得る。
したがって、特定の一実施形態では、追加の試薬が、マイクロリアクターに、具体的には陽性マイクロリアクターに添加され、前記追加の試薬は、少なくとも、逆転写酵素（ＲＴ）、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、およびリガンド（またはリガンドのタグ）をコードする核酸配列に特異的な複数のバーコード化プライマーおよび受容体（または受容体のタグ）をコードする核酸配列に特異的な複数のバーコード化プライマーを含み、細胞溶解バッファーを含んでもよく、ここで、リガンド（またはリガンドのタグ）をコードする核酸配列に特異的なバーコード化プライマーは、リガンド（またはリガンドのタグ）をコードする核酸配列に特異的なプライマー配列およびバーコード配列またはバーコード配列のセットを含み、ここで、受容体（または受容体のタグ）をコードする核酸配列に特異的なバーコード化プライマーは、受容体（または受容体のタグ）をコードする核酸配列に特異的なプライマー配列およびバーコード配列またはバーコード配列のセットを含み、ここで、マイクロリアクター内に含まれるバーコード配列またはバーコード配列のセットは、他のマイクロリアクター内に含まれるバーコード配列またはバーコード配列のセットから区別可能であるが、所与のマイクロリアクター内に含まれるリガンド（またはリガンドのタグ）をコードする核酸配列および受容体（または受容体のタグ）をコードする核酸配列に特異的なバーコード化プライマーは、共通のバーコード配列またはバーコード配列のセットを保有する。
したがって、特定の一実施形態では、追加の試薬が、マイクロリアクターに、具体的には陽性マイクロリアクターに添加され、前記追加の試薬は、少なくとも、逆転写酵素（ＲＴ）、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、および複数のプライマー（バーコード化であってもよく、テンプレートスイッチ反応（ＵＳ５，９６２，２７２に記載）のためのテンプレートとしての役割を果たす）を含み、ここで、リガンド（またはリガンドのタグ）をコードする核酸配列のための自由に動く（ｆｒｅｅ ｆｌｏａｔｉｎｇ）特異的プライマーおよび受容体（または受容体のタグ）をコードする核酸配列に特異的なバーコード化プライマーのいずれかが添加され、および／または、ポリｄＴプライマーおよび／またはランダムプライマーが添加されてもよく、細胞溶解バッファーが添加されてもよく、ここで、テンプレートスイッチ反応に特異的なプライマー（バーコード化されていてもよい）は、ｃＤＮＡの３’末端において逆転写酵素によってＲＴ中に生じる非テンプレートのヌクレオチド、典型的にトリプルシトシンと会合することが当業者に知られているプライマー配列を含み（Ｚａｊａｃ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８：ｅ８５２７０を参照）、ここで、非テンプレートのヌクレオチド（典型的に３つのシトシン）に特異的なプライマー（バーコード化されていてもよい）は、非テンプレートのヌクレオチドに特異的なプライマー配列およびバーコード配列またはバーコード配列のセットを含み、ここで、マイクロリアクター内に含まれるバーコード配列またはバーコード配列のセットは、他のマイクロリアクター内に含まれるバーコード配列またはバーコード配列のセットから区別可能であるが、所与のマイクロリアクター内に含まれる非テンプレートのヌクレオチドに特異的なバーコード化プライマーは、共通のバーコード配列またはバーコード配列のセットを保有する。
受容体がＴＣＲである場合、受容体をコードする核酸配列は、好ましくは、αＴ細胞受容体、βＴ細胞受容体、γＴ細胞受容体またはδＴ細胞受容体をコードする核酸配列である。
受容体がＢ細胞を提示する抗体である場合、受容体をコードする核酸は、好ましくは、抗体重鎖可変ドメインまたは抗体軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列である。
受容体が、別個の遺伝子によってそれぞれコードされるいくつかのポリペプチドで構成される場合、前記ポリペプチドの１つをコードする核酸配列にそれぞれ特異的ないくつかの別個のバーコード化プライマーが好ましくは加えられる。換言すれば、受容体が、別個の遺伝子によってそれぞれコードされる数ｎのポリペプチドで構成される場合、前記受容体の第一のポリペプチドをコードする核酸配列に特異的なプライマー配列を含む第一のバーコード化プライマーが加えられ、前記受容体の第二のポリペプチドをコードする核酸配列に特異的なプライマー配列を含む第二のバーコード化プライマーが加えられ、・・・そして、前記受容体の第ｎのポリペプチドをコードする核酸に特異的なプライマー配列を含む第ｎのバーコード化プライマーが加えられる。
同様に、リガンドが、別個の遺伝子によってそれぞれコードされるいくつかのポリペプチドで構成される場合、前記ポリペプチドの１つをコードする核酸配列にそれぞれ特異的ないくつかの別個のバーコード化プライマーが好ましくは加えられる。換言すれば、リガンドが、別個の遺伝子によってそれぞれコードされる数ｎのポリペプチドで構成される場合、前記リガンドの第一のポリペプチドをコードする核酸配列に特異的なプライマー配列を含む第一のバーコード化プライマーが加えられ、前記リガンドの第二のポリペプチドをコードする核酸配列に特異的なプライマー配列を含む第二のバーコード化プライマーが加えられ、・・・そして前記リガンドの第ｎのポリペプチドをコードする核酸配列に特異的なプライマー配列を含む第ｎのバーコード化プライマーが加えられる。
特定の一実施形態では、典型的に、受容体が２つのポリペプチド、具体的には２つの別個の遺伝子によってコードされる２つの鎖で構成される場合、受容体をコードする核酸配列に特異的なバーコード化プライマーは、２つのポリペプチド、具体的には受容体を構成する鎖の一方をコードする核酸配列にそれぞれ特異的な、２つの異なるバーコード化プライマーである。
典型的に、受容体がＴＣＲである場合、ＴＣＲをコードする核酸配列に特異的なバーコード化プライマーは、２つの異なるバーコード化プライマーであり、ここで、一方のバーコード化プライマーは、αＴ細胞受容体をコードする核酸配列に特異的であり、第二のバーコード化プライマーは、βＴ細胞受容体をコードする核酸配列に特異的である。
あるいは、受容体がＴＣＲである場合、ＴＣＲをコードする核酸配列に特異的なバーコード化プライマーは、２つの異なるバーコード化プライマーであり、ここで、一方のバーコード化プライマーは、γＴ細胞受容体をコードする核酸配列に特異的であり、第二のバーコード化プライマーは、δＴ細胞受容体をコードする核酸配列に特異的である。
典型的に、受容体がＢＣＲおよび／または抗体（上記に定義）である場合、ＢＣＲおよび／または抗体（上記に定義）をコードする核酸配列に特異的なバーコード化プライマーは、２つの異なるバーコード化プライマーであり、ここで、一方のバーコード化プライマーは、ＢＣＲおよび／または抗体のλまたはκ鎖をコードする核酸配列に特異的であり、第二のバーコード化プライマーは、ＢＣＲおよび／または抗体のγ、δ、ε、α、またはμ鎖をコードする核酸配列に特異的である。
本発明の文脈において、リガンド（またはリガンドのタグ）または受容体（または受容体のタグ）「をコードする核酸配列」は、上記のセクション「定義」に定義される任意のタイプの核酸であり得る。特に、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であることができる。特定の一実施形態では、リガンド（またはリガンドのタグ）または受容体（または受容体のタグ）をコードする前記核酸配列は、前記リガンド（または前記リガンドのタグ）または前記受容体（または前記受容体のタグ）をコードするｍＲＮＡ配列、そのフラグメントまたはその相補配列からなるか、またはそれを含む。別の特定の実施形態では、リガンド（またはリガンドのタグ）または受容体（または受容体のタグ）をコードする前記核酸配列は、前記リガンド（または前記リガンドのタグ）または前記受容体（または前記受容体のタグ）をコードするｃＤＮＡ配列、またはそのフラグメントからなるか、またはそれを含む。さらに別の実施形態では、リガンド（またはリガンドのタグ）または受容体（または受容体のタグ）をコードする前記核酸配列は、前記リガンド（または前記リガンドのタグ）または前記受容体（または前記受容体のタグ）をコードする遺伝子、またはそのフラグメントからなるか、またはそれを含む。
上記に定義されるように、マイクロリアクター内に含まれるバーコード配列またはバーコード配列のセットは、他のマイクロリアクター内に含まれるバーコード配列またはバーコード配列のセットから区別可能であるが、所与のマイクロリアクター内に含まれるリガンド（またはリガンドのタグ）をコードする核酸配列および受容体（または受容体のタグ）をコードする核酸配列に特異的なバーコード化プライマーは、共通のバーコード配列またはバーコード配列のセットを保有する。換言すれば、各マイクロリアクターは、固有のタイプのバーコード配列またはバーコード配列のセットを含み、好ましくは異なるプライマー配列と関連したいくつかのバーコード化プライマーを含んでもよいが、特定のバーコード配列またはバーコード配列のセットは、好ましくは、２つの異なるマイクロリアクター内には決して含まれない。
一部の実施形態では、前記バーコード化プライマーは粒子上で送達される。特に、好ましい一実施形態では、前記バーコード化プライマーは、はじめに粒子に結合される。実際に、前記バーコード化プライマーがはじめに粒子に結合することは、１つのタイプのバーコード化プライマーのみを各マイクロリアクター内に送達するのを容易にさせる。
本明細書において用いられる用語「粒子」および「ビーズ」は相互交換可能に用いられる。
「粒子」は、本発明の文脈において微粒子を指す。
１つの実施形態では、粒子は、ヒドロゲル粒子、ポリマー粒子または磁気粒子である。
粒子は、不規則または規則的な形状を有してよい。例えば、粒子は球状、楕円体、または立方体であり得る。
「ヒドロゲル粒子」は、例えば、国際特許出願番号ＷＯ２００８／１０９１７６、表題「Ａｓｓａｙ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｄｒｏｐｌｅｔｓ」に記載されている。ヒドロゲルの例は、限定されないがアガロース、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、またはアクリルアミド系ゲル、例えば、ビス－アクリルアミド、ポリアクリルアミド、ストレプトアビジンアクリルアミド、ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、またはポリＮ－イソプロピルポリアクリルアミドまたはそれらの混合物を含む。１つの例において、ヒドロゲル粒子は、アクリルアミド、ビス－アクリルアミドおよびストレプトアビジンアクリルアミドを含む。
例えば、モノマーの水溶液が、マイクロリアクター、例えば液滴中に分散されてよく、次いで、重合されて、例えばゲルが形成される。別の例は、ヒドロゲル、例えばカルシウムイオンの添加によってゲル化され得るアルギン酸である。場合によっては、ゲル化イニシエーター（アクリルアミドについては過硫酸アンモニウムおよびＴＥＭＥＤ、またはアルギン酸についてはＣａ２＋）を、例えば、２００６年２月２３日に出願された米国特許出願番号１１／３６０，８４５、表題「Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ」（Ｌｉｎｋ，ｅｔ ａｈ、米国特許出願公開番号２００７／０００３４２として２００７年１月４日に公表；または２００７年１月２４日に出願された米国特許出願番号１１／６９８，２９８、表題「Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｃｏａｌｅｓｃｅｎｃｅ」（Ａｈｎら）に開示されるように、例えば、水相との並行流、油相を通した拡散および／または並行流、または２つの異なる液滴の合体によって、マイクロリアクター、例えば液滴に添加することができる。
実施形態の別のセットでは、粒子は、１つまたは複数のポリマーを含んでよく、したがって、本明細書において、「ポリマー粒子」と呼ばれる。例示的なポリマーは、限定されないが、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリイソプレン（ＰＩＰ）、ポリ（乳酸）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリロニトリル、ポリイミド、ポリアミド、および／またはこれらおよび／または他のポリマーの混合物および／またはコポリマーを含む。
さらに、一部の実施形態では、粒子は磁気であってよく、したがって「磁気粒子」と呼ばれ、粒子の磁気操作を可能にし得る。例えば、粒子は、鉄または他の磁気材料を含んでよい。粒子はまた、タンパク質、核酸または小分子などの他の分子が付着され得るように官能化され得る。
一部の実施形態では、粒子は蛍光であり得る。
一部の実施形態では、粒子は、特に、例えばヒスチジン、Ｆｌａｇ、ＨＡ、ストレプトアビジン、アクリダイトＤＮＡまたはビオチンを用いたその同定および／またはそのソーティングを容易にするように官能化され得る。
１つの実施形態では、粒子はストレプトアビジンを含む。ストレプトアビジンは、上記に定義される粒子の表面に連結されてもよく、または前記粒子の内側であってもよい。
１つの実施形態では、ヒドロゲル粒子は、１ｐＬ～１０００ｐＬ、例えば１ｐＬ～５００ｐＬ、１ｐＬ～４００ｐＬ、１ｐＬ～４００ｐＬ、１ｐＬ～３００ｐＬ、例えば５ｐＬ～３００ｐＬ、５ｐＬ～２５０ｐＬ、５ｐＬ～２００ｐＬ、１０ｐＬ～２５０ｐＬ、１０ｐＬ～２００ｐＬ、２０ｐＬ～１５０ｐＬ、３０ｐＬ～１００ｐＬ、４０ｐＬ～９０ｐＬ、５０ｐＬ～６０ｐＬ、好ましくは６０ｐＬ～１００ｐＬのサイズを有する。
バーコード化プライマーを一時的に粒子に結合させることは、大量のバーコード化プライマーを有する粒子を提供するのを可能にすることが当業者によって理解されよう。さらに、バーコード化プライマーをはじめに粒子に結合させることは、各マイクロリアクター、具体的には各液滴内へのバーコード化プライマーの導入を容易にし、ここで、バーコード化プライマーは同一のバーコード配列を有する。
したがって、１つの実施形態では、バーコード化プライマーは、粒子に共有結合または非共有結合される。
本明細書において「非共有結合」は、例えば、ストレプトアビジン－ビオチン結合を指す。アビジンビオチン結合またはヒスタグとニッケルの結合などの他の非共有結合が当業者に知られている。
本明細書において「共有結合」は、例えば、アミノ結合またはアクリダイト・ホスホラミダイト結合を指す。
「ストレプトアビジン」は一般に、細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉから精製された５２．８ｋＤａのタンパク質を指す。ストレプトアビジンホモ－四量体は、ビオチンに対して非常に高親和性（解離定数（Ｋｄ）約１０－１４ｍｏｌ／Ｌ）を有しており、ストレプトアビジンに対するビオチンの結合は、天然に知られている最も強い非共有相互作用の１つである。
好ましい一実施形態では、非共有結合は、ストレプトアビジン・ビオチン結合である。
ストレプトアビジン・ビオチン結合は当業者に知られている。したがって、１つの実施形態では、本明細書において定義される粒子はストレプトアビジンを含む。したがって、同じ実施形態において、本明細書において定義されるバーコード化プライマーはビオチンを含む。換言すれば、バーコード化プライマーはビオチンによって官能化される。
バーコード化プライマーを粒子に連結するために用いられる結合のタイプとは独立に、バーコード化プライマーは、少なくとも１つのリンカー配列をさらに含んでよい。
したがって、さらなる一実施形態では、バーコード化プライマーは、少なくとも１つのリンカー配列をさらに含み、前記リンカー配列は好ましくは５’末端に含まれる。したがって、１つの実施形態では、バーコード化プライマーは、５’から３’に、リンカー配列、バーコード配列、およびプライマー配列を含む。
１つの実施形態では、「リンカー配列」は、それによってバーコード化プライマーが粒子に任意に結合される配列である。
本明細書において「任意に結合される」とは、粒子に結合されたバーコード化プライマーがマイクロリアクターまたは複数のマイクロリアクター内にロードされた時点で、バーコード化プライマーが粒子から放出される可能性があり、それにより、マイクロリアクターが粒子およびバーコード化プライマーを含み前記バーコード化プライマーが前記粒子から分離される可能性を指す。
好ましくは、リンカー配列は、例えば酵素および／または光切断のような適切な刺激の適用の際に切断され得る切断可能なリンカー配列である。
「切断可能なリンカー」は当業者によく知られており、Ｌｅｒｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０：５７１－５８２においてさらに記載されている。それらには、限定されないが、ＴＥＶ、トリプシン、トロンビン、カテプシンＢ、カテプシン（ｃａｔｈｅｓｐｉｎ）Ｄ、カテプシンＫ、カスパーゼ・ルマトリクス（ｌｕｍａｔｒｉｘ）メタロプロテイナーゼ配列、ホスホジエステル、リン脂質、エステル、ガラクトース、ジアルキルジアルコキシシラン、シアノエチル基、スルホン、エチレングリコリルジスクシネート、２－Ｎ－アシルニトロベンゼンスルホンアミド、ａ－チオフェニルエステル、不飽和ビニルスルフィド、活性化後スルホンアミド、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）インドール誘導体、レブリノイルエステル、ヒドラゾン、アシルヒドラゾン、アルキルチオエステル、ジスルフィド架橋、アゾ化合物、２－ニトロベンジル誘導体、フェナシルエステル、８－キノリニルベンゼンスルホン酸、クマリン、ホスホトリエステル、ビス－アリールヒドラゾン、ビマン・ビチオプロピオン酸（ｂｉｍａｎｅ ｂｉ－ｔｈｉｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）誘導体、パラメトキシベンジル誘導体、ｔｅｒｔ－ブチルカルバメート類似体、ジアルキルまたはジアリールジアルコキシシラン、オルトエステル、アセタール、アコニチル（ａｃｏｎｉｔｙｌ）、ヒドラゾン、ｂ－チオプロピオン酸、ホスホロアミデート、イミン、トリチル、ビニルエーテル、ポリケタル、アルキル２－（ジフェニルホスフィノ）安息香酸誘導体、アリルエステル、８－ヒドロキシキノリンエステル、ピコリン酸エステル、ビシナルジオール、およびセレニウム化合物が含まれ得る。切断条件および試薬は、限定されないが、酵素、求核／塩基性試薬、還元剤、光照射、求電子／酸性試薬、有機金属および金属試薬、および酸化試薬を含む。
好ましい一実施形態では、切断可能なリンカーは、光切断可能な部分であり、例えば感光性化学基の後に１～３０個の炭素原子の鎖、典型的には６～１０個の炭素原子の鎖が続く。
さらに好ましい一実施形態では、切断可能なリンカーは、特異的な制限エンドヌクレアーゼのための標的部位を含む二本鎖ＤＮＡ分子である。
特定の一実施形態では、粒子に結合したバーコード化プライマーは、特に、以下に開示するように細胞を溶解させる前または後に、マイクロリアクターにおいて粒子から放出される。
少なくともいくつかのバーコード化プライマーの放出は、細胞を溶解した後かつ前記バーコード化プライマーにハイブリダイズした放出された核酸を逆転写する前、または、細胞を溶解した後かつ前記バーコード化プライマーにハイブリダイズした放出された核酸を逆転写した後にさらに生じ得る。
当業者は、バーコード化プライマーの放出について選択される時点に応じて、用語「少なくともいくつかのバーコード化プライマー」は、例えば、細胞によって放出された核酸またはＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖にハイブリダイズしたバーコード化プライマーの少なくとも一部を指すことがあると理解している。
１つの実施形態では、バーコード化プライマーの少なくとも一部は、任意の手段、例えば、酵素、求核／塩基性試薬、還元剤、光照射、求電子／酸性試薬、有機金属および金属試薬、および酸化試薬を用いて放出され得る。
１つの実施形態では、バーコード化プライマーの少なくとも一部は、酵素および／または光切断を用いて放出され得る。例えば、エンドヌクレアーゼを用いて、リンカー配列または任意の他の配列を切断し、バーコード化プライマーの少なくとも一部を粒子から放出することができる。
さらなる一実施形態では、バーコード化プライマーの放出は、ストレプトアビジン・ビオチンなどの結合の破壊を指す。ストレプトアビジン・ビオチン結合を破壊する方法は当業者に知られており、ストレプトアビジンの酵素消化および／またはストレプトアビジンの変性を含む。
１つの実施形態では、バーコード化プライマーは、ストレプトアビジンの酵素消化によって放出される。
好ましくは、各粒子は、他のビーズが保有するバーコード配列またはバーコード配列のセットから区別可能なバーコード配列またはバーコード配列のセットを保有する。換言すれば、各粒子は、固有の大多数のタイプのバーコード配列またはバーコード配列のセットを保有し、好ましくは少なくとも一部が異なるプライマー配列と関連しているいくつかのバーコード化プライマーを含んでもよいが、２つの異なる粒子は、好ましくは、同一の大多数のバーコード配列またはバーコード配列のセットを保有しない。
好ましい一実施形態では、各マイクロリアクターは、バーコード化プライマーを保有する単一粒子、または、バーコード化プライマーを保有する１０個未満の粒子、具体的には、９、８、７、６、５、４、３、または２個未満の粒子を含む。特に好ましい一実施形態では、各マイクロリアクターは、バーコード化プライマーを保有する単一粒子を保有する。
「逆転写酵素（ＲＴ）」は、本発明の文脈において、逆転写と呼ばれるプロセスにおいて、ＲＮＡテンプレートから相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を産生するために用いられる酵素である。
１つの実施形態では、逆転写酵素は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｉ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＩＩ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＩＩＩ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＩＶ、マウス白血病ＲＴ、ＳｍａｒｔＳｃｒｉｂｅ ＲＴ、Ｍａｘｉｍａ Ｈ ＲＴ、またはＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ ＲＴからなる群から選択される。
１つの実施形態では、逆転写酵素は、１～５０Ｕ／μＬ、好ましくは５～２５Ｕ／μＬ、例えば１２．５Ｕ／μＬの濃度である。
本発明の文脈において、「細胞溶解バッファー」は、好ましくはマイクロリアクター（具体的には液滴）を破壊せずに細胞溶解を可能にする組成物である。
好ましくは、細胞溶解バッファーは、ＲＴ活性および／または認識アッセイに用いられる試薬と適合する。
１つの実施形態では、溶解バッファーは、リゾチーム、リゾスタフィン、ザイモラーゼ（ｚｙｍｏｌａｓｅ）、ムタノリシン、グリカナーゼ、プロテアーゼ、およびマンノースからなる群から選択される酵素を含む。
１つの好ましい実施形態では、溶解バッファーは、塩化マグネシウム、洗浄剤、緩衝化溶液およびＲＮａｓｅ阻害剤を含む。
１つの実施形態では、塩化マグネシウムは、１ｍＭ～２０ｍＭの濃度で用いられる。
１つの実施形態では、洗浄剤は、トリトン－Ｘ－１００、ＮＰ－４０、ノニデットＰ４０、およびＴｗｅｅｎ－２０およびＩＧＥＰＡＬ ＣＡ ６３０からなる群から選択される。
１つの実施形態では、洗浄剤は、０．１％～１０％の濃度である。
緩衝化溶液の非限定的な例は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、Ｈｅｐｅｓ－ＫＯＨ、Ｐｉｐｅｓ－ＮａＯＨ、マレイン酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、ギ酸、乳酸、コハク酸、酢酸、ピバル酸（トリメチル酢酸）、ピリジン、ピペラジン、ピコリン酸、Ｌ－ヒスチジン、ＭＥＳ、ビス－トリス、ビス－トリスプロパン、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、イミダゾール、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ（トリエタノールアミン）、Ｎ－エチルモルホリニウム、ＰＯＰＳＯ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、トリス、トリシン、グリシルグリシン、ビシン、ＴＡＰＳ、モルホリン、Ｎ－メチルジエタノールアミン、ＡＭＰＤ（２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール）、ジエタノールアミン、ＡＭＰＳＯ、ホウ酸、ＣＨＥＳ、グリシン、ＣＡＰＳＯ、エタノールアミン、ＡＭＰ（２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール）、ピペラジン、ＣＡＰＳ、１，３－ジアミノプロパン、ＣＡＢＳ、またはピペリジンを含む（ｗｗｗ．ｒｅａｃｈｄｅｖｉｃｅｓ．ｃｏｍ／Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｆｆｅｒｓ．ｈｔｍｌも参照のこと）。
ＲＮａｓｅ阻害剤の非限定的な例は、ＲＮａｓｅ ＯＵＴ、ＩＮ、ＳｕｐｅｒＩＮ Ｒｎａｓｅ、および広範なＲＮＡｓｅ（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、１およびＴ１）を標的化する阻害剤を含む。
１つの例において、溶解バッファーは、典型的に０．３６％ Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ ６３０，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）である。
特定の一実施形態では、前記追加の試薬は、マイクロリアクター内に、具体的にはマイクロ流体液滴内に、リザーバーからの注入により、例えば電気による力を用いて添加される（ピコ注入）（Ａｂａｔｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０７：１９１６３－１９１６６）。
別の特定の実施形態では、前記追加の試薬は、マイクロリアクター内に、具体的にはマイクロ流体液滴内に、前記追加の試薬を含むがいかなるリガンドまたは受容体も含まない第二のマイクロリアクター、具体的には第二のマイクロ流体液滴との合体によって添加される。液滴は、受動性の液滴合体液滴合体（Ｍａｚｕｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ，９（１８）：２６６５－２６７２；Ｍａｚｕｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｌａｂ Ｃｈｉｐ，１２：１８００－１８０６を参照）、集束レーザーによる局所加熱によって駆動される液滴合体（Ｂａｒｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ７：１０２９－１０３３）を含む当業者に知られている様々な方法によって、または電気力を用いて（Ｃｈａｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２６：３７０６－３７１５；Ａｈｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，８８：２６４１０５；Ｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４５：２５５６－２５６０；Ｐｒｉｅｓｔ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．８９：１３４１０１）または磁気泳動力を用いて、または空気制御器を用いて（Ｘｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １７：７５１－７７１を参照）、合体され得る。
前記第二のマイクロリアクター、具体的には前記第二のマイクロ流体液滴は、リガンドおよび受容体を含むマイクロリアクターについて上記に開示したものと同一の技術によって調製され得る。
「合体」とは、本明細書において、２つ以上の液滴または粒子が接触中にマージして単一の娘液滴または娘粒子を形成するプロセスを意味する。
好ましくは、前記追加の試薬は、陽性マイクロリアクターに、具体的には、陰性マイクロリアクターからの陽性マイクロリアクターの分離ステップ後に、選択的に添加される。
特定の一実施形態では、それぞれのマイクロリアクターにおいて、具体的には上記の追加の試薬が添加されるそれぞれの陽性マイクロリアクターにおいて、バーコード化ｃＤＮＡは、（ａ）受容体を発現または提示している細胞およびリガンドを発現または提示している細胞を溶解させて、細胞からｍＲＮＡを放出させ、（ｂ）少なくともいくつかのマイクロリアクターにおいて、受容体（または受容体のタグ）をコードする少なくとも一部の放出されたｍＲＮＡを、受容体（または受容体のタグ）をコードする核酸配列特異的プライマー（バーコード化されていてもよい）にハイブリダイズさせ、リガンド（またはリガンドのタグ）をコードする少なくとも一部の放出されたｍＲＮＡを、リガンド（またはリガンドのタグ）をコードする核酸配列特異的バーコード化プライマーにハイブリダイズさせ、および（ｃ）バーコード化されていてもよいプライマーにハイブリダイズした放出されたｍＲＮＡを逆転写して、それによりバーコード化ｃＤＮＡを得ることによって調製される。
当業者によって理解されるように、リガンドのタグまたは受容体のタグがバーコード配列である場合、リガンドまたは受容体のｎｔ配列はそれら自体の同定を可能にするので、上記に詳述したようにバーコード化ｃＤＮＡを調製する必要はない。
本明細書における「バーコード化」は、遺伝子配列（本明細書において上記にさらに定義される、いわゆるバーコード配列）を核酸に付加し、それにより、前記バーコード化核酸を、別の加えられた遺伝子配列、すなわち、別の固有のバーコード配列を有する核酸から区別するのを可能にすることを指す。
本発明の文脈における用語「細胞溶解」は、酵素的、物理的、および／または化学的手段、または、それら（具体的には酵素的、物理的、および／または化学的手段）の任意の組み合わせによって達成され得る。他の細胞破壊方法を用いてもよい。
したがって、１つの実施形態では、細胞は、酵素的、物理的、および／または化学的な細胞溶解を用いて溶解される。
細胞壁を除去するための「酵素的方法」は、当該分野において十分に実証されている。酵素は一般に市販され、ほとんどの場合において、元来、生物学的由来から単離されたものである。一般に用いられる酵素は、リゾチーム、リゾスタフィン、ザイモラーゼ、ムタノリシン、グリカナーゼ、プロテアーゼ、およびマンノースを含む。
当業者によって知られているように、「化学的細胞溶解」は、脂質－脂質間、脂質－タンパク質間、およびタンパク質－タンパク質間相互作用を破壊することによって細胞を取り囲んでいる脂質バリアを破壊する洗浄剤などの化学物質を用いて達成される。細胞溶解のための理想的な洗浄剤は、細胞のタイプおよび由来に依存する。非イオン性および双性イオン性の洗浄剤は、より穏やかな洗浄剤である。非イオン洗剤のトリトンＸシリーズ、ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ ６３０非イオン洗剤、および３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、双性イオン性洗浄剤が、これらの目的のために一般に用いられる。対照的に、イオン性洗浄剤は強力な可溶化剤であり、タンパク質を変性させる傾向があり、それによりタンパク質の活性および機能を壊す。タンパク質に結合して変性させるイオン性洗浄剤であるＳＤＳが、細胞を破壊するために当該分野において広く用いられる。
「物理的細胞溶解」は、超音波処理、温度ショック（４０°Ｃより上、１０°Ｃより下）、エレクトロポレーション、またはレーザー誘導性キャビテーションの使用を指す。
１つの例において、細胞は氷上で溶解される。
１つの好ましい実施形態では、細胞溶解は、マイクロリアクター、具体的には本発明の文脈において液滴を、破壊せず、または壊さない。
本明細書において記載される用語「ハイブリダイゼーション」は、バーコード化プライマー内に存在するプライマー配列が、放出された核酸の相補核酸配列にアニーリングする現象を指す。したがって、当業者によって知られるように、用いる温度は、用いられるプライマー配列および／またはポリメラーゼ酵素に依存する。
上記に定義される逆転写のステップは、少なくともいくつかのマイクロリアクターにおいて、プライマー配列を用いて、前記バーコード化プライマーにハイブリダイズした放出された核酸を逆転写することを指す。逆転写は、少なくともいくつかのマイクロリアクター内に含められた逆転写酵素（ＲＴ）を用いて行なわれる。
「逆転写」または「ＲＴ反応」は、全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）ＲＮＡ、逆転写酵素酵素、プライマー、ｄＮＴＰおよびＲＮａｓｅ阻害剤を用いることにより、一本鎖ＲＮＡが一本鎖相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写されるプロセスである。逆転写の産物は、そのテンプレートＲＮＡにハイブリダイズした一本鎖ｃＤＮＡを含むＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖であることが当業者によって理解されよう。さらに理解されるように、前記ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、逆転写に用いたプライマー配列を含むバーコード化プライマーにさらに連結されている。
「テンプレートスイッチ」は、元は２００１年に説明された技術を指し、「ＳＭＡＲＴ」（ＲＮＡ転写産物の５’におけるスイッチメカニズム）技術と呼ばれることが多い（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ）。この技術は、単細胞由来ＲＮＡサンプルからでさえも全長ｃＤＮＡライブラリーを生成する見込みが示されている（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３０：８９２－８９７）。この戦略は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素の内在性の特性および固有のテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳオリゴ、すなわちＴＳＯ）の使用に依拠する。第１の鎖の合成中に、ＲＮＡテンプレートの５’末端に到達した際、ＭＭＬＶ逆転写酵素のターミナルトランスフェラーゼ活性が、数個の追加のヌクレオチド（たいていはデオキシシチジン）を新たに合成されたｃＤＮＡ鎖の３’末端に付加する。これらの塩基は、ＴＳオリゴ－アンカー部位として作用する。ＴＳオリゴと付加されたデオキシシチジンのストレッチとの間の塩基対合の際に、逆転写酵素は、テンプレート鎖を、細胞ＲＮＡからＴＳオリゴに「スイッチ」し、ＴＳオリゴの５’まで複製を続ける。そうすることによって、生じるｃＤＮＡは、転写産物の完全な５’末端を含み、選択のユニバーサル配列が逆転写産物に付加される。オリゴｄＴプライマーによるｃＤＮＡの３’末端のタグ化と合わせて、このアプローチは、完全に配列非依存性の様式で全長転写産物プール全体を効率的に増幅することを可能にさせる（Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１４：６１８－６３０）。
したがって、核酸を逆転写した後、マイクロリアクターはｃＤＮＡをさらに含むことが当業者によって理解されよう。
したがって、１つの実施形態では、少なくとも一部のマイクロリアクターは、前記マイクロリアクター内に含まれる細胞由来の核酸の逆転写によって産生されたｃＤＮＡをさらに含む。
１つの実施形態では、前記ｃＤＮＡは、一本鎖相補ＤＮＡを指す。
さらなる一実施形態では、前記ｃＤＮＡは、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖内に含まれる。
１つの実施形態では、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、逆転写されたＲＮＡであってマイクロリアクター内に含まれるバーコード化されていてもよい少なくとも１つのプライマーのプライマー配列にハイブリダイズしたＲＮＡを指す。
当業者によって理解されるように、１つの実施形態では、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、核酸（好ましくはｍＲＮＡ）がハイブリダイズしたプライマー配列であって逆転写に用いられたプライマー配列を含むバーコード化されていてもよいプライマーに対して結合されている。
１つの例において、ハイブリダイゼーションおよび逆転写は、マイクロリアクターを例えば１時間または２時間、５５°Ｃまたは５０°Ｃで、典型的にはマイクロリアクターを例えば５５０ｒｐｍで混合させながらインキュベートすることによって行なわれる。
リガンド種および受容体種の同定
それぞれのマイクロリアクター、具体的にはそれぞれの陽性マイクロリアクター内に含まれるリガンド種および受容体種の同定は、当業者によく知られている任意の技術によって行なうことができる。具体的には、それぞれのマイクロリアクター、具体的にはそれぞれの陽性マイクロリアクター内に含まれるリガンド種および受容体種の同定は、シーケンシングすることによって、具体的には、ＤＮＡ、上記に詳述したように得られたバーコード化ｃＤＮＡ、またはタグをシーケンシングすることによって行なうことができる。
１つの実施形態では、上記に定義したように逆転写によって産生されたバーコード化ｃＤＮＡを回収して、典型的に、後の増幅およびライブラリー調製物のシーケンシングによる同定のためにさらに用いられる。
したがって、１つの実施形態では、本発明の方法は、少なくともいくつかのマイクロリアクターにおいて、好ましくは陽性マイクロリアクターにおいて、逆転写によって産生された細胞ｃＤＮＡを回収するステップをさらに含む。
本明細書において「回収するステップ」は、前記複数のマイクロリアクターからの少なくともいくつかのマイクロリアクターにおいて逆転写によって産生されたバーコード化ｃＤＮＡを単離することを指す。
１つの実施形態では、本明細書において「回収するステップ」は、逆転写によって産生されたバーコード化ｃＤＮＡを含むマイクロリアクターを収集するステップ、または、前記バーコード化ｃＤＮＡを含む前記マイクロリアクター内に含まれる水性組成物を収集して、水性組成物内に含まれるバーコード化ｃＤＮＡを分離するステップを指す。
１つの特定の実施形態では、本明細書において「回収するステップ」は、逆転写によって産生されたバーコード化ｃＤＮＡを含むマイクロ流体液滴を収集し、マイクロ流体液滴を破壊し、水性組成物内に含まれるバーコード化ｃＤＮＡを前記マイクロ流体液滴の油相から分離するステップを指す。
核酸を、具体的にはｃＤＮＡを、マイクロ流体液滴から単離する方法は当業者に知られており、例えば、マイクロ流体液滴を収集するステップ、および、例えば電場を適用することにより（エレクトロコアレッセンス）、または化学的エマルション破壊剤（例えば、フッ素化担体油中の液滴の場合はペルフルオロ－オクタノール）を添加することにより、エマルションを破壊するステップを含む。１つの例において、破壊されたエマルションは典型的に、例えば１０分間１０，０００ｇで４°Ｃにて遠心分離され、水相中のバーコード化ｃＤＮＡを含む上清が回収される。
１つの実施形態では、本方法は、取り込まれなかったバーコード化プライマーをマイクロリアクターの水性組成物から除去するステップをさらに含む。１つの好ましい実施形態では、取り込まれなかったバーコード化プライマーを少なくともいくつかのマイクロリアクターの水性組成物から除去するステップは、本明細書において上記に定義される逆転写によって産生されたバーコード化ｃＤＮＡを回収するステップの後に行なわれる。
好ましくは、取り込まれなかったバーコード化プライマーを除去するステップは、本明細書において以下に定義される増幅ステップおよび／またはシーケンシングステップに先行する。
１つの実施形態では、取り込まれなかったバーコード化プライマーを除去するステップは、少なくともいくつかのマイクロリアクターの水性組成物を精製基質と接触させるステップを含み、ここで、精製基質は、取り込まれなかったバーコード化プライマーを除去する。１つの実施形態では、精製基質はビーズまたは粒子を含み、カラムを形成してもよい。さらなる一例において、取り込まれなかったバーコード化プライマーは、例えばアクリルアミドまたはアガロースゲルを用いたサイズ選択によって除去される。
１つの実施形態では、取り込まれなかったバーコード化プライマーを除去するステップは、少なくともいくつかのマイクロリアクターの水性組成物をエキソヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼＥｘｏ１と接触させて、少なくともいくつかのマイクロリアクターの水性組成物内の取り込まれなかったバーコード化プライマーを分解するステップを含む。
このステップのある特定の実施形態では、エキソヌクレアーゼは、ｃＤＮＡを含む水性組成物から一本鎖核酸配列を分解する。
逆転写後に得られるバーコード化ｃＤＮＡは、典型的にＲＮＡ／ＤＮＡ複合体の形態で存在し、したがって、前記エキソヌクレアーゼから保護されることが当業者によって理解されよう。
１つの実施形態では、バーコード化ｃＤＮＡは、例えばバーコード化ｃＤＮＡ配列または分子の精製を容易にするために、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含む。
例えば、ヌクレオチドは、ヌクレアーゼ消化に対する耐性が高められたホスホロチオエート誘導体（硫黄原子による非架橋ホスホリル酸素原子の置換）として用いられ得る。２’－メトキシエチル（ＭＯＥ）修飾（例えば、ＩＳＩＳ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって市販される修飾主鎖）も効果的である。
修飾ヌクレオチドの他の例は、糖の２’位における置換、具体的には以下の化学修飾によるヌクレオチドの誘導体を含む：Ｏ－メチル基（２’－Ｏ－Ｍｅ）置換、２－メトキシエチル基（２’－Ｏ－ＭＯＥ）置換、フルオロ基（２’－フルオロ）置換、クロロ基（２’－Ｃｌ）置換、ブロモ基（２’－Ｂｒ）置換、シアン化基（２’－ＣＮ）置換、トリフルオロメチル基（２’－ＣＦ３）置換、ＯＣＦ３基（２’－ＯＣＦ３）置換、ＯＣＮ基（２’－ＯＣＮ）置換、Ｏ－アルキル基（２’－Ｏ－アルキル）置換、Ｓ－アルキル基（２’－Ｓ－アルキル）置換、Ｎ－アルキル基（２’－Ｎ－ａｋｙｌ）置換、Ｏ－アルケニル基（２’－Ｏ－アルケニル）置換、Ｓ－アルケニル基（２’－Ｓ－アルケニル）置換、Ｎ－アルケニル基（２’－Ｎ－アルケニル）置換、ＳＯＣＨ３基（２’－ＳＯＣＨ３）置換、ＳＯ２ＣＨ３基（２’－ＳＯ２ＣＨ３）置換、ＯＮＯ２基（２’－ＯＮＯ２）置換、ＮＯ２基（２’－ＮＯ２）置換、Ｎ３基（２’－Ｎ３）置換および／またはＮＨ２基（２’－ＮＨ２）置換。修飾ヌクレオチドの他の例は、ビオチン標識ヌクレオチドを含む。
修飾ヌクレオチドの他の例は、リボースの２’酸素と４’炭素との間に共有架橋が形成されて３’エンド構成に固定されたロックド核酸（ＬＮＡ）を産生するためにリボース部分が用いられるヌクレオチドを含む。
ヌクレオチド類似体の他の例は、デオキシイノシンを含む。
ヌクレオチド類似体の他の例は、ビオチン化、蛍光標識ヌクレオチドを含む。例えば、ビオチン－１１－ｄＣＴＰは、重合中にビオチンをｃＤＮＡ内に取り込んで、ストレプトアビジンまたはアビジンを用いた親和性精製を可能にするために、逆転写酵素のための基質として用いられ得る。
１つの実施形態では、バーコード化ｃＤＮＡは、ＲＮＡｓｅ Ａおよび／またはＲＮＡｓｅ Ｈでさらに処理される。
「ＲＮＡｓｅ Ａ」は、一本鎖ＲＮＡをＣおよびＵ残基において特異的に分解するエンドリボヌクレアーゼである。１つの実施形態では、ＲＮＡｓｅ Ａは、１０～１０００μｇ／μＬ、好ましくは５０～２００μｇ／μＬ、例えば１００μｇ／μＬの濃度である。
「ＲＮＡｓｅ Ｈ」は、加水分解性のメカニズムを介してＲＮＡの切断を触媒する非特異的エンドヌクレアーゼのファミリーである。ＲＮａｓｅ Ｈリボヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖基質におけるＲＮＡの３’－Ｏ－Ｐ結合を切断して、３’－ヒドロキシルおよび５’－リン酸末端の産物を産生する。１つの実施形態では、ＲＮＡｓｅ Ｈは、１０～１０００μｇ／μＬ、好ましくは５０～２００μｇ／μＬ、例えば１００μｇ／μＬの濃度である。
１つの実施形態では、バーコード化ｃＤＮＡは、プロテイナーゼＫでさらに処理される。「プロテイナーゼＫ」は、広範囲に使用されるセリンプロテアーゼであり、タンパク質を、優先的に疎水性アミノ酸の後ろで消化する。１つの実施形態では、プロテイナーゼＫは、０．１～５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．１～１ｍｇ／ｍＬ、例えば０．８ｍｇ／ｍＬの濃度である。
１つの実施形態では、逆転写後に得られるバーコード化ｃＤＮＡがシーケンシングされて、同じマイクロリアクター内に含まれる受容体およびリガンドの同定を可能にする。
１つの実施形態では、バーコード化ｃＤＮＡをシーケンシングするステップは、シーケンシングライブラリーに対して次世代シーケンシング（ＮＧＳ）プロトコルを行なうステップを含んでよい。ＭｉＳｅｑ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標））、ＨｉＳｅｑ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標））、ＮｅｘｔＳｅｑ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標））、ＮｏｖａＳｅｑ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標））、ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ＩｏｎＰｒｏｔｏｎシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、またはＰａｃｉｆｉｃ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓもしくはＮａｎｏｐｏｒｅによって生産されるシーケンシングシステムのような任意のタイプのＮＧＳプロトコルを用いることができる。
ある特定の実施形態では、ＮＧＳプロトコルは、試薬キットのフローセルあたり、１ｐＭ～２０ｐＭ、具体的には１．５ｐＭ～２０ｐＭのシーケンスライブラリーの量を負荷するステップを含む。
１つの実施形態では、ＮＧＳシーケンシングプロトコルは、５～６０％ＰｈｉＸを、シーケンスライブラリーの量または試薬キットのフローセルに添加するステップをさらに含む。
１つの実施形態では、シーケンシングの前に、バーコード化ｃＤＮＡはさらに増幅される。
１つの実施形態では、増幅ステップは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および／または線形増幅によって行なわれる。
１つの実施形態では、線形増幅はＰＣＲ反応に先行する。
１つの実施形態では、線形増幅はインビトロ転写である。
１つの実施形態では、線形増幅は等温増幅である。
１つの実施形態では、前記増幅ステップは、取り込まれなかったバーコード化プライマーを除去した後に行なわれる。１つの実施形態では、前記増幅ステップは、本明細書において上記に定義されるシーケンシングステップの前に行なわれる。
１つの実施形態では、逆転写後に産生されるバーコード化ｃＤＮＡは、ｑＰＣＲを用いて定量化される。
１つの実施形態では、シーケンシングのために必要な特定の配列が、増幅中に、またはアダプターのライゲーションによって付加され、それにより、シーケンシングライブラリーが生成される。
当業者によって理解されように、特定のマイクロリアクター由来のバーコード化ｃＤＮＡは、他のマイクロリアクター内に含まれる大多数のバーコード配列またはバーコード配列のセットとは異なる同一の特異的な大多数のバーコード配列またはバーコード配列のセットを保有するので、どの同定リガンド種が、特定の同定リガンド受容体と同一マイクロリアクター内に、具体的には陽性マイクロリアクター内に含まれていたか決定することが可能である。
［実施形態］
本発明はまた、以下の非限定的な実施形態も提供する。
実施形態１は、リガンド種と受容体種の同族ペアを同定する方法であって、該方法は、
ａ．リガンド種のセットを提供するステップ（ここで、各リガンド種は少なくとも１回提示される）；
ｂ．受容体種のセットを提供するステップ（ここで、各受容体種は少なくとも１回提示される）；
ｃ．リガンド種のセットを受容体種のセットとマイクロリアクター内で接触させるステップ（ここで、受容体種とリガンド種の選択的結合の際に増強シグナルが産生される）；
ｄ．リガンド種および受容体種の同族ペアをシグナルの産生によって検出するステップ；および
ｅ．リガンド種と受容体種の同族ペアを同定するステップを含む。
実施形態２は、実施形態１の方法であって、各リガンド種は、バーコード配列を含む。
実施形態３は、実施形態１または２の方法であって、各受容体種は、バーコード配列を含む。
実施形態４は、実施形態１～３のいずれか一つの方法であって、各リガンド種は、細胞またはビーズの表面に発現されるか表面上に提示され、または無細胞抽出物内または溶液内に発現されるか存在する。
実施形態５は、実施形態４の方法であって、リガンド種は、抗原提示細胞の表面に発現されるか、または表面上に提示される。
実施形態６は、実施形態５の方法であって、抗原提示細胞は、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、Ｂ細胞、単球由来樹状細胞、またはＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子を発現する別の細胞から選択される。
実施形態７は、実施形態１～６のいずれか一つの方法であって、各受容体種は、細胞またはビーズの表面に発現されるか表面上に提示され、または無細胞抽出物内または溶液内に発現されるか存在する。
実施形態８は、実施形態１～７のいずれか一つの方法であって、マイクロリアクターは、水性液滴、マイクロカプセル、マイクロビーズ、マイクロ流体チップの区画、またはウェルから選択される。
実施形態９は、実施形態１～８のいずれか一つの方法であって、シグナルは、細胞、リガンド、または受容体のいずれか１つの形態学的変化；蛍光シグナル増強；ケージド化合物を用いる、またはクエンチング反応による蛍光シグナルの改変；光吸収；可視構造の改変／生成；またはそれらのシグナルの組み合わせから選択される。
実施形態１０は、実施形態２～９のいずれか一つの方法であって、リガンド種と受容体種の同族ペアを同定するステップは、リガンド種および／または受容体種を増幅するステップを含み、増幅されたリガンド種および受容体種の少なくとも１つが、同定のためにシーケンシングされる。
実施形態１１は、実施形態１～１０のいずれか一つの方法であって、リガンド種のセットは、Ｔ細胞抗原、Ｂ細胞抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、新生抗原、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異的抗原、免疫チェックポイント分子、サイトカイン、炭水化物、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、セレクチン、ケモカイン、ホルモン、増殖因子、Ｇタンパク質共役型受容体リガンド、または酵素基質から選択される。
実施形態１２は、実施形態１～１１のいずれか一つの方法であって、受容体種のセットは、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、免疫チェックポイント受容体、サイトカイン受容体、セレクチン、インテグリン、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、カドヘリン、ケモカイン受容体、ホルモン受容体、増殖因子受容体、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、または酵素から選択される。
実施形態１３は、実施形態１～１２のいずれか一つの方法であって、リガンド種はＴ細胞抗原であり、受容体種はＴ細胞受容体であり、Ｔ細胞受容体とＴ細胞抗原の選択的結合の際に増強シグナルが産生され、産生された増強シグナルは、Ｔ細胞活性化の結果である。
実施形態１４は、実施形態１～１２のいずれか一つの方法であって、リガンド種はウイルス抗原であり、受容体種はＴ細胞受容体であり、Ｔ細胞受容体とウイルス抗原の選択的結合の際に増強シグナルが産生され、産生された増強シグナルは、Ｔ細胞活性化の結果である。
実施形態１５は、実施形態１３または１４の方法であって、マイクロリアクターにおいてリガンド種のセットを受容体種のセットと接触させるステップは、約０．００１時間～約８時間生じる。
実施形態１６は、実施形態１３または１４の方法であって、マイクロリアクターにおいてリガンド種のセットを受容体種のセットと接触させるステップは、少なくとも約８時間生じる。
実施形態１７は、実施形態１５または１６の方法であって、リガンド種および受容体種は高親和性で結合し、産生された増強シグナルは、Ｔ細胞活性化の早期マーカーまたは後期マーカーである。
実施形態１８は、実施形態１６の方法であって、リガンド種および受容体種は、低親和性で結合し、産生された増強シグナルは、Ｔ細胞活性化の早期マーカーまたは後期マーカーである。
実施形態１９は、実施形態１７または１８の方法であって、Ｔ細胞活性化の早期マーカーは、ＣＤ６９、ＣＤ１０７ａ、またはトランスフェリン受容体から選択される。
実施形態２０は、実施形態１７または１８の方法であって、Ｔ細胞活性化の後期マーカーは、ＣＤ１３７、ＨＬＡ－ＤＲ、ＶＬＡ１、ＰＴＡ１、ＣＤ７１、ＣＤ２７、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４から選択される。
実施形態２１は、実施形態１９または２０の方法であって、増強シグナルは、抗ＣＤ６９抗体、抗ＣＤ１０７ａ抗体、抗トランスフェリン受容体抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体、抗ＶＬＡ１抗体、抗ＰＴＡ１抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、または抗ＣＴＬＡ４抗体によって検出される。
実施形態２２は、実施形態１～１２のいずれか一つの方法であって、リガンド種はＢ細胞抗原であり、受容体種はＢ細胞受容体であり、Ｂ細胞受容体とＢ細胞抗原の選択的結合の際に増強シグナルが産生される。
実施形態２３は、実施形態２２の方法であって、シグナルは、抗ＣＤ１３８抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ４５Ｒ抗体、抗ＣＤ４５抗体、蛍光レポーター発現の活性化、または蛍光レポーター発現の阻害によって検出される。
本発明の以下の実施例は、本発明の性質をさらに説明するためのものである。以下の実施例は本発明を限定しないこと、および、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって決定されるべきであることが理解されるべきである。
［材料および方法］
細胞調製：Ｔ細胞を、１％ペニシリン、ストレプトマイシン、１％ピルビン酸ナトリウムおよび非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ）で補充された５％ヒト血清とともにＸ ｖｉｖｏ中で培養した。細胞をカウントし、ＰＢＳで洗浄し、４５０ｇで５分間、４℃でスピンダウンした。細胞ペレットをＰＢＳ中に２Ｍ／ｍｌで再懸濁し、ＤＭＳＯ中に５μＭで既に溶解された細胞トレース（細胞トレース（赤色）は例外で１μＭ）を用いて、３７℃にて２０分間染色した。タンパク質を含むバッファー（完全培地）を少なくともさらに５回添加し、室温で５分間インキュベートして、反応を止めた。細胞を４５０ｇで３分間４℃にてスピンダウンし、ＭＡＣＳバッファー中に再懸濁した（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および２ｍＭ ＥＤＴＡ（ＭＡＣＳ（登録商標）ＢＳＡストック溶液（＃１３０－０９１－３７６）１：２０をａｕｔｏ ＭＡＣＳＲリンス溶液（＃１３０－０９１－２２２）で希釈することによる）。
Ｔ細胞精製：Ｔ細胞を、製造元（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ；Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって推奨されるとおりに、陰性選択を用いて精製した。ＰＢＭＣをＭＡＣｓバッファー中に２５０Ｍ／ｍｌで再懸濁した。別のサブセットを標的化する抗体カクテルを１／５希釈で添加し、４℃で５分間インキュベートした。細胞濃度をＭＡＣｓバッファーで１２５Ｍ／ｍｌに調節し、マイクロビーズカクテルを１／５希釈で添加した。Ｔ細胞を、ＭＡＣＳセパレーターの磁場においてＬＳカラムを用いて抽出した。
Ｋ５６２のペプチド負荷：Ｋ５６２細胞をカウントし、ＰＢＳで洗浄し、４５０ｇで５分間スピンダウンした。細胞ペレットをＰＢＳ中に２Ｍ／ｍｌで再懸濁し、推奨される濃度で細胞トレースを用いて染色した。Ｘ ｖｉｖｏ５％ヒト血清を用いて５分間室温で染色反応を止めた。次いで、細胞を洗浄し、５％ヒト血清を含むｘ ｖｉｖｏ中に１Ｍ／ｍｌで再懸濁した。次いで、ペプチドを細胞懸濁液に１０μｇ／ｍｌで添加し、３７℃、５％ＣＯ２で９０分間インキュベートして、ＨＬＡ０２０１によるペプチド提示を可能にした。
ｍＲＮＡトランスフェクション：Ｋ５６２細胞のための培地を２～３日ごとに交換した。Ｋ５６２細胞は、ｍＲＮＡトランスフェクションのためには、増殖期かつ継代培養１０未満（１Ｍ：ｍｌに到達後の継代培養細胞）でなければならない。Ｋ５６２細胞を１×１０５細胞／ｍｌで播種し、細胞を、ヌクレオフェクション（商標）の前に２日間、３×１０５細胞／ｍｌの密度で培養した。実験的パラメーターファイルのアップロード後、適切なＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｐｒｏｇｒａｍ（ＦＦ－１２０）を選択した。細胞培養プレートを、適切な数のウェルに所望の容量の推奨される培養培地を満たすことにより調製し、湿潤３７℃５％ＣＯ２インキュベーター中で事前インキュベート／平衡化した。Ｋ５６２細胞をカウントし、必要な細胞数を９０ｇで１０分間室温にて遠心分離した。上清を完全に除去し、細胞を４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液中に適切な濃度（１０Ｍ／ｍｌ）で再懸濁した。１Ｍの細胞を必要な量のｍＲＮＡ基質（１０μｇ）と混合し、４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｘユニットのリテーナー内に蓋を閉じて置かれているＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）容器に移した。パルスによるトランスフェクション後、Ｎｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）容器をリテーナーから注意深く取り出し、室温で１０分間インキュベートした。次いで、細胞を、事前に温めた培地（１Ｍの細胞あたり５００μｌ）中に再懸濁し、２～３回ピペットで上下させることによって細胞を穏やかに混合させてプレーティングした。次いで、プレーティングした細胞を、湿潤３７℃５％ＣＯ２インキュベーター内で分析までインキュベートした。
液滴におけるＩＦＮ－γのための細胞調製：エフェクター細胞のために、Ｔ細胞を細胞トレース（黄色）で標識し、次いで、ＣＤ４５およびＩＦＮγを標的化する二重特異性抗体（冷却培地中１／１０希釈、５分間４℃、１０Ｍ／ｍｌの細胞濃度）で標識した。次いで、Ｔ細胞を洗浄し、プルロニックＦ６８（０．１％）、２３．６％のＮｙｃｏｄｅｎｚ、６％のＤＮＡマーカー（Ｎｕｃｇｒｅｅｎ）で補充された５％ヒト血清を含有するＸ ｖｉｖｏ培地を含む並行流中に再懸濁した。
ペプチド負荷のために、Ｋ５６２細胞を、示された細胞トレースを用いて５μＭで標識し、次いで、ペプチドを１０μＭで負荷し、または負荷しなかった。次いで、冷却バッファーを添加することによって細胞を洗浄し、細胞を１０分間４℃でスピンダウンし、次いで、上述のとおりに並行流中に再懸濁した。ｍＲＮＡがトランスフェクトされたＫ５６２細胞については、トランスフェクトされたｍＲＮＡが蛍光レポーターをコードするので、細胞を標識しなかった。
検出抗体を細胞懸濁液に添加した。最後に、これらの細胞をマイクロ流体デバイス中に別々に並行流させ、したがって、１００ピコリットルの液滴が産生され、次いで、３７℃５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
液滴産生
水相Ｉ：液滴における区画化のための細胞の調製。細胞懸濁液を、液滴における区画化のために記載されるとおりに４℃で調製し、液滴におけるＴ細胞活性化アッセイにおいて、Ｋ５６２およびＴ細胞についてそれぞれ約０．９および０．４５のλ（液滴当たりの細胞の平均数）を達成すべく、０．１％プルロニックＦ６８（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、２３．６％のＮｙｃｏｄｅｎｚ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ）および６％ＤＮＡマーカー（Ｎｕｃｇｒｅｅｎ－Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で補充されたＸ ｖｉｖｏ中に細胞を再懸濁した。
水相ＩＩ：液滴における区画化のためのバイオアッセイ試薬およびレポーター細胞の調製。同族抗原のために、細胞トレースで染色してペプチドを負荷したＫ５６２細胞を、Ｆｃブロック（１／５に希釈）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）および示された濃度の２倍の抗ＣＤ１３７抗体（それぞれ示されたとおりの最終液滴濃度をもたらす）または１／２５希釈のＩＦＮ－γのいずれかを含む作業バッファー中に再懸濁した。細胞表面にペプチドを提示しているＫ５６２細胞を図に示される細胞トレースで事前標識して、細胞に基づくアッセイにおいて、レポーター細胞について約０．９のλ（液滴あたりの細胞の平均数）を達成すべく、５％ヒト血清を含み２３．６％（ｖｏｌ／ｖｏｌ））Ｎｙｃｏｄｅｎｚで補充されたＸ ｖｉｖｏを含む培地中に上記に定義されるように再懸濁した。示された細胞トレースで事前標識されたＴ細胞を、上述した同一培地中にλ約０．４５で、必要な濃度のドロップコードＤＹ７５４とともに再懸濁する。
マイクロ流体チップ：別個のマイクロ流体チップを用いた。デバイス１は、バイオアッセイ試薬と単一細胞を液滴中に区画化するために、または、抗原を提示しているＫ５６２細胞とＴ細胞およびバイオアッセイ試薬を液滴中に区画化するために用いた；デバイス２は、蛍光活性化誘電泳動によって液滴をソーティングするために用いた；デバイス３はヒドロゲルビーズを産生し、デバイス４（ＣｅｌｌＣａｐ）は、単一のヒドロゲルビーズと単一のソーティングされた細胞を区画化した。全てのチップは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）中のソフトリソグラフィによって製造した（Ｓｙｌｇａｒｄ）。マスターは、設計に応じて１層または２層のＳＵ－８フォトレジストを用いて作製した（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ；Ｂｅａｒ，ＤＥ）。デバイス１および２のフォトレジスト層のリスト深さ（ｌｉｓｔ ｄｅｐｔｈ）は４０μｍ±１μｍであり、デバイス３については５５μｍ±１μｍであった。デバイス４については、第１の層（７０～７５μｍの深さ）をヒドロゲルビーズの入口に用い、第２の層（１３０～１４５μｍの深さ）を細胞の入口、逆転写酵素の入口および出口に用いた。電極は、５１Ｉｎ ３２．５Ｂｉ １６．５Ｓｎ合金（Ｉｎｄｉｕｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を電極チャネル内に溶融することによって調製した。
液滴の産生、収集、およびインキュベーション：水相ＩおよびＩＩを並行流させ、１５μｍの幅、４０μｍの深さ、および１０μｍの長さのノズルを備えるマイクロ流体チップ上で、ドリッピングモードで流体力学フローフォーカシングを用いて液滴中に区画した。連続相は、Ｎｏｖｅｃ ＨＦＥ７５００フッ素化油（３Ｍ；Ｓａｉｎｔ Ｐａｕｌ，ＭＮ）中、２～３％（ｗｔ／ｗｔ）の００８－ＦｌｕｏｒｏＳｕｒｆａｃｔａｎｔ（ＲＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で構成されていた。流速を、８０ｐｌ±８ｐｌの単分散液滴を産生するように調節した（膜結合型抗原を用いた細胞に基づくアッセイについて）。産生直後に、０．１％（ｗｔ／ｗｔ）００８－ＦｌｕｏｒｏＳｕｒｆａｃｔａｎｔを含む５ｍｌのＮｏｖｅｃ ＨＦＥ７５００フッ素化油で満たされた５ｍｌ溶血チューブ中に液滴を収集した。
液滴アッセイにおいて用いたリードアウトに応じて、示された濃度（２０ｎＭ）の抗ＣＤ１３７抗体または液滴中１／５０の抗ＩＦＮγ検出試薬のいずれかを含む少なくとも２つのエマルションを産生した。これらのエマルションを、Ｄｙ７５４（Ｄｙｏｍｉｃｓ）を用いて、陽性および陰性コントロールのエマルションにおいて液滴を光学的にコードするように区別し、条件をスクリーニングした。ペプチドを提示しているＫ５６２（パルスまたはトランスフェクトした）とともにＴ細胞を液滴内に共区画化した。特定の状況において、陽性エマルション内に封入されたＴ細胞は、陰性エマルション内のＴ細胞標識とは異なる色で標識され得る。これは主に、特定の細胞の濃縮のフローサイトメトリーｐｏｓｔ－ＱＣ中に、細胞を含む陰性エマルションから陽性エマルションを区別するために用いられる。
マイクロ流体プラットフォーム：液滴蛍光分析およびソーティングは、蛍光分析のためにビードラインに対して平行に配向された固定焦点レーザーライン（波長４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍまたは６３５ｎｍの固体レーザー、Ｏｍｉｃｒｏｎ）を備える専用の液滴マイクロ流体ステーション上で、４４０／４０－２５ｎｍ、５２５／４０－２５ｎｍ、５９３／４６－２５ｎｍおよび７０８／７５－２５ｎｍの光電子増倍管バンドパスフィルター（Ｈａｍａｍａｔｓｕ；Ｓｈｉｚｕｏｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて行なった。
液滴ソーティングのためのゲーティング戦略：液滴を最初に、合体した液滴を除去するためにゲーティングし、所望のサイズの液滴のみを保持した。光学的な液滴のバーコード化を用いて、陰性コントロール液滴、陽性コントロール液滴、および試験対象細胞を含む液滴を検出した。Ｔ細胞への蛍光再局在化を、液滴からの積算蛍光シグナル（Ｆｉ）に対して液滴内の最大ピーク蛍光シグナル（Ｆｐ）をプロットすることによって測定した。Ｔ細胞への蛍光再局在化は、比Ｆｐ／Ｆｉの増加をもたらす。Ｔ細胞およびＫ５６２細胞を含む合体していない液滴を、以下の基準の全てを満たす場合にソーティングした：１）液滴がＫ５６２細胞を含む、２）Ｔ細胞を含む、３）液滴内の細胞上のリードアウトマーカー（ＩＦＮ－γおよびＣＤ１３７）の再局在化、および４）Ｔ細胞上のマーカー蛍光ピークの共局在。したがって、共局在値（ｃ）は０～１を境界とし、１は、２つのピークの完全な共局在である。液滴を、ｃ＞０．９５の場合にソーティングした。全ての抗原について、共局在パラメーター（ｃ）を、活性化マーカーの蛍光におけるピークとＴ細胞の蛍光との間の時間間隔（ｔｐ）、および、液滴の始まりから終わりまでの時間間隔（ｔｄ）から計算した：ｃ＝１－（ｔｐ／ｔｄ）。したがって、ｃの値は０～１を境界とし、１は、２つのピークの完全な共局在である。
液滴ソーティングおよび細胞回収：液滴を、ＳＡＷソーターによって、または誘電泳動によってソーティングした。この機器は、チャネルの上または下の電極の活性化によって、液滴を最大２つのビンまでソーティングすることができるが、一方のビンのみをこの試験で用いた。入口フロー（エマルションについてＱｅｍおよび油についてＱｏｉｌ）を、６００ｓ－１で液滴をソーティングするように調節した；ソーティングのための典型的なパラメーターは、Ｑｅｍ＝５０μｌｈ－１（１８０ｍｂａｒ）、Ｑｏｉｌ＝５０μｌｈ－１（１８０ｍｂａｒ）、Ｆ（ソーティングパルスの周波数）＝１．５ｋＨｚ、τｓｏｒｔ（ソーティングパルスの持続時間）＝２，０００μｓおよびＵｓｏｒｔ（電極にわたって適用されるピーク間電圧）＝４００ｋＶｐ－ｐであった。ソーティングされた液滴を、４℃に冷却した１．５ｍｌチューブ内に収集した。５％ヒト血清で補充された１００μｌのＸ ｖｉｖｏの添加の後に、１００μｌの１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロ－１－オクタノール（Ｓｉｇｍａ，３７０５３３；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加することによって細胞を回収し；次いで、細胞を穏やかに混合して、３００ｇで１０分間４℃にて遠心分離して完全な相分離を行なった。次いで、４００μｌの０．１％プルロニックＦ－６８非イオン性界面活性剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，２４０４００３２）、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ヒト血清（Ｘ ｖｉｖｏ中）において細胞を洗浄し、５分間４００ｇで４℃にて遠心分離し、次いで、２１．８２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｏｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配溶液（Ｓｉｇｍａ）および０．０１ｍｇｍｌ－１ＢＳＡを含む５０μｌの１×ＰＢＳ中に再懸濁した。
バーコード化ヒドロゲルビーズの生産：６０μｍ直径のポリアクリルアミドヒドロゲルビーズを、マイクロ流体デバイスによって作製した液滴中で重合により生産した。しかしながら、次いで、プライマー伸長ではなくライゲーションを用いて、バーコード化プライマーを分割およびプールの合成によってビーズに付加した。１００万ビーズ－それぞれ、５’オーバーハング（第一のインデックス５’オーバーハング配列に対して相補）、光切断可能部位およびＴ７－ＳＢＳ１２配列を有する約１０９コピーの二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド保有する－を、マイクロタイタープレートの９６ウェル中に分配した。各ウェルは、異なる第一のインデックス（インデックスＡ）、一方の末端の第一のＤＮＡに対する相補５’オーバーハング、および他方の末端の異なる５’オーバーハングを有する１０μｌの５μＭ二本鎖ＤＮＡを含んでおり、これらを、製造元の説明書に従ってＴ７ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて２３℃で１５分間ライゲーションさせた。次いで、ヒドロゲルビーズをプールし、記載されるとおりに洗浄し、第二のマイクロタイタープレートのウェルに上記のとおりに再分配した。第二のマイクロタイタープレートのウェルはそれぞれ、異なる第二のインデックス（インデックスＢ）、一方の末端のインデックスＡに対する相補５’オーバーハング、および他方の末端の異なる５’オーバーハングを有する二本鎖ＤＮＡを含んでおり、これをインデックスＡにライゲーションした。この分割およびプールの工程を合計３～４回繰り返すと（３つのインデックスを付加する）、９６３の組み合わせを生じ、約１０６の異なるバーコードを生じる。最後のインデックスの付加後、ビーズをプールし、インデックスＣに対する相補５’オーバーハングを有しておりミニ遺伝子ＴＣＲαおよびβならびに選択された２０個の遺伝子をコードする領域に相補の遺伝子特異的プライマー領域を含む二本鎖ＤＮＡ分子の混合物を、ビーズ上のバーコードにライゲーションした。次いで、プライマーの第二の鎖を、２分間２２℃で３００ｍＭ ＮａＯＨとともにインキュベートすることによって除去した。プロセスの完了後、各ヒドロゲルビーズは、同一のビーズ特異的バーコードを保有する合計約１０９のプライマーを有する。
単一細胞のバーコード化相補ＤＮＡ合成：個々のソーティングした細胞を、マイクロ流体デバイスを用いて、個々のバーコード化ヒドロゲルビーズおよび溶解および逆転写試薬とともに液滴内に共区画化した。約１ｎｌの体積の液滴を２５０ｓ－１で形成した。溶媒ＨＦＥ－７５００（Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍ；Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）および０．１％界面活性剤を含む１．５ｍｌチューブ内に液滴を収集し、９０秒間、紫外線光によって光切断し（ＯｍｎｉＣｕｒｅ，ＡＣ４７５；３６５ｎｍ）、次いで、細胞溶解およびｃＤＮＡ合成のために５０℃でインキュベートした。
シーケンシングライブラリーの調製：バーコード化ｃＤＮＡを含むエマルションを、１体積の１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロ－１－オクタノールを添加することによって破壊した。プールしたバーコード化ｃＤＮＡを、ＲＮＡ ＣｌｅａｎＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ａ６３９８７；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ；Ｂｒｅａ，ＣＡ）を１：１比（ｖｏｌ／ｖｏｌ）でさらに精製し、４０μｌのＤＮａｓｅ－およびＲＮａｓｅ－フリーＨ２Ｏ中に溶出させた。シーケンシングライブラリーを、ＧｏＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、外側（ＰＣＲ１）および内側（ＰＣＲ２）リバースプライマー（ＳＢＳ１２プライマーの後にＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑインデックス化プライマー－Ｐ７）および外側（ＰＣＲ１）および内側（ＰＣＲ２）フォワードプライマー（ＴＣＲαおよびβ、ＴＭＧおよび選択遺伝子に特異的）を用いて二段階のネステッドＰＣＲによって生産した。
シーケンシング：最終産物を、αおよびβＴＣＲのＣＤＲ３ドメイン全体、ＴＭＧおよび２０遺伝子の抗原、ならびにバーコード配列のシーケンシングを可能にするＩｌｌｕｍｉｎａ（ＭｉＳｅｑ／Ｎｅｘｔｓｅｑ）上でシーケンシングした。
実施例１：液滴中の抗ＣＤ１３７抗体の滴定
液滴におけるＣＤ１３７活性化マーカー発現に基づく免疫応答のシグナル検出感度およびダイナミックレンジを評価するために、液滴における抗ＣＤ１３７抗体滴定を行なった。Ｔ細胞を、Ｔｒａｎｓａｃｔ（１／１００）を用いて４８時間、３７℃、５％ＣＯ２で活性化し、次いで、ＰＢＳ中５μＭの細胞トレース（黄色）で染色した。次いで、細胞を４５０ｇで５分間スピンダウンし、プルロニックＦ６８（０．１％）、２３．６％のＮｙｃｏｄｅｎｚおよび６％のＤＮＡマーカー（Ｎｕｃｇｒｅｅｎ）で補充された５％ヒト血清を有する完全Ｘ ｖｉｖｏ培地を含む並行流中に再懸濁した。
第二の並行流は、異なるドロップコード濃度ＤＹ７５４に割り当てられたいくつかのエマルションにおいて試験された異なる抗体濃度のそれぞれを含んでいた（Ｇｅｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．，「Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ－ｂａｓｅｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｄｒｏｐｌｅｔ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ」，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３８：７１５－２１（２０２０）を参照）。抗ＣＤ１３７ ＢＶ４２１抗体を並行流の２倍の濃度で添加して、産生された液滴において、示された濃度（例えば、５ｎＭ、１０ｎＭ、および２０ｎＭ）に到達させた。細胞および抗ＣＤ１３７抗体を、２つの異なる入口からの２つの異なる並行流とは別に注入した。実験の結果を図１に示す。
ＵｓｅｒＩｎｔシグナルにわたる最大ピーク検出の変化によって例示されるように、１００ｐＬ液滴中に最低２０ｎＭの抗ＣＤ１３７抗体濃度が、Ｔ細胞の表面における抗体の再局在を効率的に検出するのに必要であった。したがって、アッセイの感度は、Ｔ細胞の表面に発現されて十分な抗体再局在化および蛍光シグナルの検出を導く分子の最小数として計算した。このアッセイにおける計算された分子の数は、活性化されたＴ細胞あたり１２０，４６０分子のＣＤ１３７であり、８０％の活性化Ｔ細胞の検出を導いた。そのようなアッセイフォーマットにおいて、より低いＣＤ１３７発現は、活性化Ｔ細胞の検出を妨げるであろう。
実施例２：液滴におけるＴ細胞活性化
液滴におけるＴ細胞活性化の効率およびシグナル検出感度を液滴におけるＣＤ１３７活性化マーカー発現に基づき評価するために、抗原提示細胞によるＴ細胞刺激を行ない、抗ＣＤ１３７抗体を用いた活性化を、効率的なＣＤ１３７検出を導く条件でモニターした（上記に定義）。
Ｋ５６２細胞を、１μＭの細胞トレース（赤色）で染色して、次いで、１０μＭのウイルスペプチド（エプスタイン・バーウイルス抗原ＢＭＬＦ１）を負荷した。（他の実験では、ペプチドは、任意のＴ細胞抗原であることができ、ウイルス抗原、細菌抗原、または寄生虫抗原を含むことができる）。これらの細胞を、プルロニックＦ６８（０．１％）、２３．６％のＮｙｃｏｄｅｎｚおよび６％のＤＮＡマーカー（Ｎｕｃｇｒｅｅｎ）で補充された５％ヒト血清を有する完全Ｘ ｖｉｖｏ培地を含む並行流中に再懸濁した。他方で、ＢＭＬＦ１抗原に特異的なＴ細胞クローンを５μＭの細胞トレース（黄色）で標識して、上述したものと同様の並行流組成物中に懸濁した。抗ＣＤ１３７ ＢＶ４２１抗体を４０ｎＭでＫ５６２細胞懸濁液に添加し、２つの細胞懸濁液を別々に２つの異なる入口において並行流させた後に２０ｎＭの液滴濃度をもたらし、したがって、ＨＦＥ２％界面活性剤を用いて１００ピコリットル（ｐｌ）の液滴を産生した。これらの液滴を、３７℃および５％ＣＯ２でのインキュベーション後に目的のマーカーの発現および目的のマーカーのＴ細胞内／上の局在に基づきソーティングした。図２は、液滴におけるＴ細胞活性化の概要を示す。
図３は、図２に記載した概略アプローチによって集めたデータを示す。簡単に説明すると、１００ピコリットル（ｐｌ）の液滴を、２つの細胞型（すなわち、Ｋ５６２細胞およびＴ細胞）を同時に封入するために生産した。これらの液滴を、ＨＦＥ０．１％の界面活性剤を含む５ｍｌチューブ内に収集した。このチューブを３７℃で一晩インキュベートした。次いで、これらの液滴をマイクロ流体デバイス内に注入し、異なる色で標識された生存可能Ｋ５６２およびＴ細胞を同時に含む液滴におけるＣＤ１３７発現について液滴を調べた。ユーザー・インテグレーション（ｕｓｅｒ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）、マイクロ流体デバイスにおける特徴により、ピーク下面積の推定が可能になり、これを用いて、任意の潜在的なバックグラウンドおよび非特異シグナルを除去した（図３）。
最小限の非特異検出（０％～０．１％）で、効率的な（約９４％）Ｔ細胞活性化が、高親和性抗原およびＴ細胞クローンを用いた液滴における２０ｎＭのＣＤ１３７抗体により検出されることが確認された。
実施例３：異なるリードアウトを用いた抗原提示細胞（ＡＰＣ）－Ｔ細胞相互作用
アッセイが、単一細胞レベルでの液滴フォーマットにおけるＴ細胞とＡＰＣ細胞の会合／相互作用に特異的であることを確証するために、Ｔ細胞刺激を液滴において抗原提示細胞によって行ない、明視野において細胞間相互作用をモニターした。抗ＣＤ１３７抗体を用いた活性化、Ｔ細胞の死滅化活性（ＮｕｃＧｒｅｅｎリードアウトを用いる）、および制御された特異的局在を、各リードアウトについてモニターした。
この実験のために、細胞を、蛍光顕微鏡下でチェックされる特異的な蛍光定量的構成で染色した。ＰＢＳ中５μＭの細胞トレース（紫色）を用いてＫ５６２細胞を標識し、次いで、１０μＭペプチドを負荷し、一方で、Ｔ細胞をＰＢＳ中５μＭの細胞トレース（黄色）で標識した。両方の細胞を、プルロニックＦ６８（０．１％）、２３．６％のＮｙｃｏｄｅｎｚおよび６％のＤＮＡマーカー（Ｎｕｃｇｒｅｅｎ）で補充された５％ヒト血清を有するＸ ｖｉｖｏ培地を含む並行流中に再懸濁させた。液滴産生を開始する前に、４０ｎＭの抗体ＣＤ１３７ ＡＰＣをＫ５６２細胞の並行流に添加し、一方で、ドロップコードをＴ細胞の並行流に所望の濃度で添加した。３７℃、５％ＣＯ２での一晩のインキュベーション後、液滴を蛍光顕微鏡下でチェックした。これらの画像は、生存可能Ｔ細胞（黄色）上の赤色シグナル（ＣＤ１３７）の明らかな局在を示し、紫色（Ｔ細胞）は示さなかった（図４）。Ｎｕｃｇｒｅｅｎは、活性化マーカー共発現によりＴ細胞死滅化活性（または無し：ｏｒ ｎｏｔ）の同時発生（ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ）（およびカイネティクス）を制御するために用いることができる生存可能マーカーである。
Ｔ－ＡＰＣ細胞が会合して液滴内で相互作用すること、Ｔ細胞の表面におけるＣＤ１３７抗体の再局在化によって可視化されるように活性化されたＴ細胞が検出可能なＣＤ１３７タンパク質を産生／発現すること、および、死滅化活性が実験の過程で検出されず、ＣＤ１３７抗体の再局在化は死滅した／死滅しているＴ細胞に起因するものではないことが確認された。
実施例４：活性化された細胞の検出のための抗ＩＦＮ－γ抗体の使用
ＴおよびＡＰＣによる関連のある生理学的条件において（ＡＰＣはＣＭＶ ｐｐ６５ウイルス抗原を提示する）、液滴におけるＴ細胞活性化の効率、およびサイトカイン分泌物に基づくシグナル検出感度を評価するために、ＩＦＮγ活性化マーカー発現をリードアウトとして用いた。Ｔ細胞刺激を抗原提示細胞によって行ない、効率的なＩＦＮγ検出をもたらす条件下で抗ＩＦＮγ抗体を用いて活性化をモニターした（図示せず）。
Ｋ５６２細胞を５μＭの細胞トレース（紫色）で標識し、次いで、１０μＭのペプチドを負荷した（または負荷しなかった）。次いで、冷却バッファーを添加することによってＫ５６２細胞を洗浄し、４℃で１０分間スピンダウンし、次いで、細胞を、プルロニックＦ６８（０．１％）、２３．６％のＮｙｃｏｄｅｎｚ、６％のＤＮＡマーカー（Ｎｕｃｇｒｅｅｎ）で補充された５％ヒト血清を有するＸ ｖｉｖｏ培地からなる並行流中に再懸濁した。抗ＩＦＮ－γ検出抗体をこの細胞懸濁液に１／２５希釈で添加した。エフェクター細胞については、Ｔ細胞を細胞トレース（黄色）で標識し、次いで、ＣＤ４５およびＩＦＮγを標的化する二重特異性抗体（冷却培地中１／１０希釈、５分間４℃、１０Ｍ／ｍｌの細胞濃度）で標識した。次いで、Ｔ細胞を洗浄し、プルロニックＦ６８（０．１％）、２３．６％のＮｙｃｏｄｅｎｚ、６％のＤＮＡマーカー（Ｎｕｃｇｒｅｅｎ）で補充された５％ヒト血清を有するＸ ｖｉｖｏ培地および適切な濃度のドロップコードを含む並行流中に再懸濁した。最後に、これらの細胞を別々にマイクロ流体デバイス中に並行流させ、したがって、１００ｐｌの液滴が産生され、次いで、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。蛍光レポーターとウイルスペプチドＣＭＶ ｐｐ６５をコードする１０μｇのｍＲＮＡをトランスフェクトしたＫ５６２細胞を用いて同様の実験を行なった。実験の結果を図５に示す。
高親和性抗原およびＴ細胞クローンを用いた液滴におけるリードアウトとしてサイトカイン分泌物（例えば、ＩＦＮｇ）を用いて、特異的なＴ細胞活性化が、最小限の非特異検出で検出された。
実施例５：ＣｅｌｌＣａｐデバイスを使用した、濃縮細胞からのＴＣＲおよび抗原リンケージ配列の回収
抗原および／またはＴＣＲ配列の両方またはいずれかを回収するために、目的の表現型を有する細胞を、ＣｅｌｌＣａｐと呼ばれるマイクロ流体チップ内にソーティングした。表現型の目視検査後、ＴＣＲおよび抗原のペアの情報を、抗原を発現しているＡＰＣおよびＴ細胞を有する濃縮液滴を含む液滴においてバーコード化ビーズを用いて単一細胞のバーコード化を行なうことによって回収した。代替の液滴回収および配列回収が可能であった。
細胞キャップ内への細胞ソーティング中、調製されたバーコード化ビーズのライブラリーを、５ｍｌの１×ＢＷバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（Ｐｈ８．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）中で５回洗浄し、次いで、ヒドロゲルビーズを３２００ｇで２分間４℃にてスピンダウンした後に、１ｍｌの変性溶液（９７０μｌ Ｈ２Ｏ＋３０μｌ １０Ｍ ＮａＯＨ、３００ｍＭ最終）を用いて２分間室温（ＲＴ）で変性させた。次いで、バーコード化ビーズを５ｍｌのＢＷバッファーで３回洗浄してから、バーコード化ビーズを室温で１０分間、ビオチン化ＦＩＴＣ（５μＭ最終濃度）で標識した。１回洗浄し、バーコード化ビーズを１ｍｌのライブラリーバッファー（Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、１０ｍＭ、ＥＤＴＡ ０，１ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０ ０．１％）中に再懸濁し、７０℃で２分間加熱し、３２００ｇで２分間４℃にてスピンダウンした。ペレットを、第１の鎖バッファー、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ＿６３０、スルホローダミンＢおよびヌクレアーゼフリー水）を含むバッファー中に再懸濁し、異なる入口において逆転写（ＲＴ）ミックスと別々に並行流させた。
ＣｅｌｌＣａｐを、細胞を含む１００ｐｌの液滴で満たした時点で、ＣｅｌｌＣａｐリザーバーを逆さにしながら、入口に接続したシリンジ（チャンバーなし）を用いて空気をチップの外に除去した。ＨＦＥを２０００μｌ／ｈｒでフラッシュして、システム内の気泡を完全に取り除いた。次いで、フローを１５０μｌ／ｈｒまで低減させ、バーコード化ビーズエマルションを含むチューブを各ウェルが１ｎｌの液滴で満たされるまで元に戻し、残存液滴および浮遊液滴のすべてをチップの外に流した。次いで、液滴を５＊５ｓと融合し、両側（入口および出口）をクランプして、サーモミキサーを用いて逆転写（ＲＴ）を開始して、液滴を５０℃で２時間インキュベートし、次いで４℃に維持した後にＲＴを不活性化し、ライブラリー調製物を処理してシーケンシングした。図６は、代表的なワークフローである概要を示す。
図７は、受容体およびリガンドの同族ペアを同定するために、ＴＣＲαおよびβならびに抗原を回収した予測シーケンシングデータの代表的な図を示す。
本発明を詳細に、その特定の実施形態に関して説明したが、本発明の主旨および範囲を逸脱せずに様々な変更および改変が本明細書においてなされ得ることが当業者に明らかであろう。

Claims (14)

  1. リガンド種と受容体種の同族ペアを同定する方法であって、
    ａ．リガンド種のセットを提供するステップ、
    ここで、各リガンド種は少なくとも１回提示される；
    ｂ．受容体種のセットを提供するステップ、
    ここで、各受容体種は少なくとも１回提示される；
    ｃ．前記リガンド種のセットを前記受容体種のセットとマイクロリアクター内で接触させるステップ、
    ここで、受容体種とリガンド種の選択的結合の際に増強シグナルが産生される；
    ｄ．リガンド種および受容体種の同族ペアを前記シグナルの産生によって検出するステップ；および
    ｅ．リガンド種と受容体種の前記同族ペアを同定するステップ
    を含む、
    方法。
  2. 請求項１に記載の方法であって、
    各リガンド種および／または各受容体種がバーコード配列を含む、
    方法。
  3. 請求項１または２に記載の方法であって、
    各リガンド種および／または各受容体種は、細胞またはビーズの表面に発現されるか表面上に提示され、または無細胞抽出物内または溶液内に発現されるか存在する、
    方法。
  4. 請求項３に記載の方法であって、
    前記抗原提示細胞が、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、Ｂ細胞、単球由来樹状細胞、またはＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子を発現する別の細胞から選択される、
    方法。
  5. 請求項１または２に記載の方法であって、
    前記マイクロリアクターが、水性液滴、マイクロカプセル、マイクロビーズ、マイクロ流体チップの区画、またはウェルから選択され；および／または、前記シグナルが、細胞、リガンド、または受容体のいずれか１つの形態学的変化；蛍光シグナル増強；ケージド化合物を用いる、またはクエンチング反応による蛍光シグナルの改変；光吸収；可視構造の改変／生成；またはそれらのシグナルの組み合わせから選択される、
    方法。
  6. 請求項２に記載の方法であって、
    リガンド種と受容体種の同族ペアを同定するステップが、前記リガンド種および／または前記受容体種を増幅するステップを含み、増幅されたリガンド種および受容体種の少なくとも１つが、同定のためにシーケンシングされる、
    方法。
  7. 請求項１または２に記載の方法であって、
    （ａ）前記リガンド種のセットが、Ｔ細胞抗原、Ｂ細胞抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、新生抗原、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異的抗原、免疫チェックポイント分子、サイトカイン、炭水化物、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、セレクチン、ケモカイン、ホルモン、増殖因子、Ｇタンパク質共役型受容体リガンド、または酵素基質から選択され；および／または（ｂ）前記受容体種のセットが、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、免疫チェックポイント受容体、サイトカイン受容体、セレクチン、インテグリン、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、カドヘリン、ケモカイン受容体、ホルモン受容体、増殖因子受容体、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、または酵素から選択される、
    方法。
  8. 請求項１または２のいずれかの方法であって、
    ａ）前記リガンド種がＴ細胞抗原であって前記受容体種がＴ細胞受容体であり、前記Ｔ細胞受容体と前記Ｔ細胞抗原の選択的結合の際に前記増強シグナルが産生され、前記産生された増強シグナルはＴ細胞活性化の結果である；
    ｂ）前記リガンド種がウイルス抗原であって前記受容体種がＴ細胞受容体であり、前記Ｔ細胞受容体と前記ウイルス抗原の選択的結合の際に前記増強シグナルが産生され、前記産生された増強シグナルはＴ細胞活性化の結果である；または
    ｃ）前記リガンド種がＢ細胞抗原であって前記受容体種がＢ細胞受容体であり、前記Ｂ細胞受容体とＢ細胞抗原の選択的結合の際に前記増強シグナルが産生される、
    方法。
  9. 請求項８に記載の方法であって、
    前記リガンド種のセットを前記受容体種のセットとマイクロリアクター内で接触させるステップは、
    ａ）約０．００１時間～約８時間；または
    ｂ）少なくとも約８時間生じる、
    方法。
  10. 請求項９に記載の方法であって、
    前記リガンド種および前記受容体種が、高親和性で結合し、
    前記産生された増強シグナルが、Ｔ細胞活性化の早期マーカーまたは後期マーカーである、
    方法。
  11. 請求項９に記載の方法であって、
    前記リガンド種および前記受容体種が、低親和性で結合し、
    前記産生された増強シグナルが、Ｔ細胞活性化の早期マーカーまたは後期マーカーである、
    方法。
  12. 請求項１０または１１に記載の方法であって、
    （ａ）Ｔ細胞活性化の前記早期マーカーが、ＣＤ６９、ＣＤ１０７ａ、またはトランスフェリン受容体から選択され；および／または（ｂ）Ｔ細胞活性化の前記後期マーカーが、ＣＤ１３７、ＨＬＡ－ＤＲ、ＶＬＡ１、ＰＴＡ１、ＣＤ７１、ＣＤ２７、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４から選択される、
    方法。
  13. 請求項１２に記載の方法であって、
    前記増強シグナルが、抗ＣＤ６９抗体、抗ＣＤ１０７ａ抗体、抗トランスフェリン受容体抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体、抗ＶＬＡ１抗体、抗ＰＴＡ１抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、または抗ＣＴＬＡ４抗体によって検出される、
    方法。
  14. 請求項１３に記載の方法であって、
    前記シグナルが、抗ＣＤ１３８抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ４５Ｒ抗体、抗ＣＤ４５抗体、蛍光レポーター発現の活性化、または蛍光レポーター発現の阻害によって検出される、
    方法。
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