JP2019537430A - 親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよびその使用 - Google Patents

親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよびその使用 Download PDF

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Abstract

親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを使用して単一の細胞を特徴付けるための方法および組成物が、本明細書で提供される。四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを使用して単一の細胞を特徴付けるための方法および組成物が、本明細書で提供される。本明細書に記載される方法は、個々の細胞のタンパク質を分析するために配列読み出しを使用し、同じ実験で同時に使用できるフルオロフォアの数によってもそれらのスペクトルの重複によっても制限されない。

Description

相互参照
本出願は、２０１６年９月２４日に出願された国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５３５９８号に基づく優先権を主張しており、この国際出願は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
背景
内因的に発現されて細胞膜上に位置するタンパク質の特定のセットの存在量によって、多くの細胞型を識別および分類することができる。この現象は、イムノフェノタイピングとして公知のプロセスを使用する細胞の研究を可能にし、このプロセスにおいて、細胞は、細胞の既知の表面タンパク質に特異的な蛍光標識された抗体と共にインキュベートされ、そしてこのような抗体と結合する。フローサイトメトリーは、各細胞に対して表面結合した抗体のレベルを測定するために一般に使用されている。しかし、フローサイトメトリーベースのアプローチは、同じ実験で同時に使用できるフルオロフォアの数によって制限される。さらに、フローサイトメトリーベースのアプローチを使用して同じ実験で同時に使用できるフルオロフォアの数は、スペクトルの重複によって制限される。さらに、フローサイトメトリーは、多くの生物学的に適切なアッセイおよび引き続くＤＮＡ配列決定になじまない。
要旨
したがって、これらの制限なしに単一の細胞を特徴付ける、例えばイムノフェノタイピングする方法が必要とされている。フローサイトメトリーベースのアプローチとは異なり、本明細書に記載される方法は、個々の細胞のタンパク質を分析するために配列読み出しを使用し、同じ実験で同時に使用できるフルオロフォアの数によってもそれらのスペクトルの重複によっても制限されない。さらに、本明細書に記載される方法は、多くの生物学的に適切なアッセイおよび引き続くＤＮＡ配列決定になじむ。本明細書に記載される方法は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート（例えば、抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート）を利用する。このコンジュゲートのオリゴヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分が特異的に結合する表面抗原にバーコード化された抗原ＩＤ（ＡＩＤ）配列を含む。したがって、本明細書に記載される方法を使用すると、単一の細胞の抗原（例えば、表面タンパク質）が、フルオロフォアを必要とせずに分析できる。例えば、提示される単一の細胞の表面タンパク質は、抗原ＩＤ配列から同定できる。別の例として、提示される単一の細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）は、抗原ＩＤ配列から同定できる。一部の態様では、細胞の表面で提示されるＴＣＲまたはＢＣＲの結合親和性は、本明細書に記載される親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを使用して判定できる。単一の細胞の表面タンパク質のうちの１種または複数は、単一の細胞の正体、特徴または関連性を規定するために使用され得る。
本明細書に記載される方法の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、緩徐なセルソーティング、セルソーティングに関連する低減された標的収量、限定数の出力ストリーム、および親和性などの親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの定量された特性に対応しない選択されたビンの問題を克服するために使用され得る。示された例示的な親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ベッセル中の四量体結合の単一細胞測定を用いて、ソーティングを置き換えまたは増強し得る。示された例示的な親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＴＣＲ対配列、クローン存在量および相対的四量体親和性を同時に獲得するために、本明細書に記載される方法において使用され得る。例えば、四量体のペプチドに結合するＴＣＲ対配列を同時に獲得するために、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）−ペプチド複合体へのＴＣＲの結合の親和性を判定するために、および四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのＭＨＣ−ペプチド複合体への高い結合親和性を有するＴＣＲと比較して低い結合親和性を有するＴＣＲを区別するために、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートである親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを、本明細書に記載される方法において使用できる。別の例として、四量体のＢ細胞受容体抗原に結合するＢＣＲ対配列を同時に獲得するために、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのＢ細胞受容体抗原へのＢＣＲの結合の親和性を判定するために、および四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのＢ細胞受容体抗原への高い結合親和性を有するＢＣＲと比較して低い結合親和性を有するＢＣＲを区別するために、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートである親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを、本明細書に記載される方法において使用できる。
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを用いて、ベッセル（例えば、エマルジョン）中の細胞を特徴付ける、例えばイムノフェノタイピングする方法が、本明細書に記載される。一部の実施形態では、この方法は、エマルジョンベースの単一の細胞の分析に適合する様式で、細胞サブセットを同定するために使用される。一部の実施形態では、この方法は、エマルジョンベースの単一の細胞の分析に適合する様式で、抗原に特異的な免疫細胞を同定するために使用される。一部の実施形態では、細胞分析の前に、表面タンパク質特異的抗体は、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、コンジュゲート抗体の標的特異性に固有の配列モチーフを含有するように設計される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、コンジュゲート四量体の標的特異性に固有の配列モチーフを含有するように設計される。このオリゴヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分（例えば、抗体または四量体）に、共有結合的または非共有結合的にコンジュゲートされ得る（例えば、ビオチン−オリゴヌクレオチドをストレプトアビジン−抗体に）。
方法は、混合物または溶液中で、１つまたは複数の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと共に細胞をインキュベートすることを含み得る。細胞は、未結合の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを除去するために洗浄され得る。次いで、細胞は、ベッセル、例えば、エマルジョン中にカプセル化される。細胞は、ベッセル１つ当たり単一の細胞の密度でベッセル中に存在し得る。したがって、ベッセル、例えば液滴内の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、例えば、特異的抗体−表面タンパク質相互作用を介して、細胞表面に結合される。この方法は、ベッセル特異的ＤＮＡ配列（例えば、固有のベッセルバーコード）を親和性−コンジュゲートオリゴヌクレオチドに付着させることを含み得る。さらなる細胞ＤＮＡまたはｍＲＮＡ分析、表現型測定、機能的試験、細胞ソーティングまたは他の反応が、親和性−コンジュゲートオリゴヌクレオチドを（例えば、ＤＮＡバーコードで）バーコード化する前に、それと同時にまたはその後で、実施され得る。
方法は、混合物または溶液中で、１つまたは複数の四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと共に細胞をインキュベートするステップを含み得る。細胞は、未結合の四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを除去するために洗浄され得る。次いで、細胞は、ベッセル、例えば、エマルジョン中にカプセル化される。細胞は、ベッセル１つ当たり単一の細胞の密度でベッセル中に存在し得る。したがって、ベッセル、例えば液滴内の四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、例えば、特異的ＴＣＲ−ＭＨＣ−ペプチド複合体相互作用を介して、または四量体相互作用の特異的ＢＣＲ−Ｂ細胞受容体抗原を介して、細胞表面に結合される。この方法は、ベッセル特異的ＤＮＡ配列（例えば、固有のベッセルバーコード）を四量体−コンジュゲートオリゴヌクレオチドに付着させるステップを含み得る。さらなる細胞ＤＮＡもしくはｍＲＮＡ分析、表現型測定、機能的試験、セルソーティングまたは他の反応が、四量体−コンジュゲートオリゴヌクレオチドを（例えば、ＤＮＡバーコードで）バーコード化する前、それと同時にまたはその後で、実施され得る。
方法は、例えば、エマルジョン実験の後に、核酸をエマルジョンから抽出するステップを含み得る。抽出された核酸は配列決定のために調製され得、（例えば、次世代配列決定技術を使用して）配列決定され得る。方法は、抗原ＩＤ配列および液滴特異的バーコード配列の両方を含有するベッセル由来のポリヌクレオチド分子を配列決定するステップを含み得る。抗原ＩＤ配列は、オリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体によって結合された特異的細胞表面タンパク質を規定できる。抗原ＩＤ配列は、特定の細胞表面タンパク質に結合するオリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体の特異抗体を規定できる。抗原ＩＤ配列は、特定の細胞ＴＣＲに結合するオリゴヌクレオチドコンジュゲート四量体の特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体を規定できる。抗原ＩＤ配列は、特定の細胞ＢＣＲに結合するオリゴヌクレオチドコンジュゲート四量体の特異的Ｂ細胞受容体抗原を規定できる。したがって、抗原ＩＤ配列は、分析された細胞上のどの表面タンパク質が発現されるかについて示すことができる。単一の細胞を有するベッセルでは、共有された液滴特異的バーコード配列を含有する全ての配列が、単一の細胞と関連する。したがって、単一の細胞は、その正体、特徴または関連性を規定するために使用され得る表面タンパク質のセットを提示すると分析できる。例えば、単一の細胞は、そのＴＣＲの配列を同定することもできるＭＨＣ−ペプチド複合体へのある特定の親和性を有するＴＣＲを提示すると分析できるか、または、単一の細胞は、そのＢＣＲの配列を同定することもできる四量体のＢ細胞受容体抗原へのある特定の親和性を有するＢＣＲを提示すると分析できる。
一態様では、複数のベッセル中で反応を実行するステップを含む方法が提供され、この反応は、ベッセルバーコード配列を含むベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを、複数のベッセルのうちの１つのベッセル中の、単離された単一の細胞の標的抗原に結合した親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドに付着させることを含む。一態様では、複数のベッセル中で反応を実行するステップを含む方法が提供され、この反応は、ベッセルバーコード配列を含むベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを、複数のベッセルのうちの１つのベッセル中の、単離された単一の細胞のＴＣＲに結合した四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドに付着させることを含む。一態様では、複数のベッセル中で反応を実行するステップを含む方法が提供され、この反応は、ベッセルバーコード配列を含むベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを、複数のベッセルのうちの１つのベッセル中の、単離された単一の細胞のＢＣＲに結合した四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドに付着させることを含む。
一態様では、複数のベッセルのうちの１つのベッセル中で反応を実行するステップを含む方法が本明細書で提供され、この反応は、ベッセルバーコード配列を含むベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分に付着させることを含み、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、複数のベッセルのうちのそのベッセル中の細胞によって発現される標的抗原に結合する。一態様では、複数のベッセルのうちの１つのベッセル中で反応を実行するステップを含む方法が本明細書で提供され、この反応は、ベッセルバーコード配列を含むベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分に付着させることを含み、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、複数のベッセルのうちのそのベッセル中の細胞によって発現されるＴＣＲに結合する。一態様では、複数のベッセルのうちの１つのベッセル中で反応を実行するステップを含む方法が本明細書で提供され、この反応は、ベッセルバーコード配列を含むベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分に付着させることを含み、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、複数のベッセルのうちのそのベッセル中の細胞によって発現されるＢＣＲに結合する。
一部の実施形態では、細胞は、ベッセル内に含有される単一の細胞である。一部の実施形態では、ベッセルは、複数のベッセルのうちの２またはそれよりも多くのベッセルを含む。一部の実施形態では、ベッセルは、複数のベッセルの各ベッセルを含む。一部の実施形態では、反応は、複数のベッセルのうちの２またはそれよりも多くのベッセル中で起こる。一部の実施形態では、各ベッセル中の細胞は、同じ試料に由来する。一部の実施形態では、２またはそれよりも多くの複数のベッセルのうちの第１の複数のベッセルのうちの１つのベッセル中の細胞は、２またはそれよりも多くの複数のベッセルのうちの第２の複数のベッセルのうちの１つのベッセル中の細胞と同じ試料に由来する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド部分は、抗原同定配列（ＡＩＤ）を含む。一部の実施形態では、ＡＩＤは、標的抗原、または親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にバーコード化される。一部の実施形態では、ＡＩＤは、公知の特異性を有するＴＣＲ、または四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのＭＨＣ−ペプチド複合体にバーコード化される。一部の実施形態では、ＡＩＤは、公知の特異性を有するＢＣＲ、または四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのＢ細胞受容体抗原にバーコード化される。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的抗原、または親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にバーコード化された抗原同定配列（ＡＩＤ）をさらに含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、公知の特異性を有するＴＣＲ、または四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのＭＨＣ−ペプチド複合体にバーコード化された抗原同定配列（ＡＩＤ）をさらに含む。一部の実施形態では、抗原同定配列（ＡＩＤ）は、公知の配列である。
一部の実施形態では、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドは、ベッセル中の鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチド由来である。
一部の実施形態では、この方法は、配列情報を取得するために、オリゴヌクレオチドまたはそのアンプリコンを配列決定することをさらに含む。
一部の実施形態では、この方法は、配列情報に基づいて、単一の細胞の特徴を決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、配列情報は、抗原同定（ＡＩＤ）配列を含む。一部の実施形態では、この方法は、配列情報に基づいて、単一の細胞の特徴を決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、特徴は、表現型である。一部の実施形態では、表現型は、免疫表現型である。一部の実施形態では、特徴は、親和性である。一部の実施態様では、親和性は、ＭＨＣ−ペプチド複合体である。一部の実施形態では、親和性は、ＭＨＣ−ペプチド複合体の相対的親和性（例えば、より低い結合親和性を有するＴＣＲと比較してより高い結合親和性を有するＴＣＲ）である。一部の実施形態では、親和性は、ＢＣＲのものである。一部の実施形態では、親和性は、ＢＣＲの相対的親和性（例えば、より低い結合親和性を有するＢＣＲと比較してより高い結合親和性を有するＢＣＲ）である。
一部の実施形態では、この方法は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを、単一の細胞を含む複数の細胞と接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを、単一の細胞を含む複数の細胞と接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、接触させるステップは、ベッセル中の単一の細胞が単離される前である。一部の実施形態では、この方法は、接触させるステップの後に、複数の細胞を洗浄するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、ベッセルは、標的抗原に結合していない親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを含まない。一部の実施形態では、ベッセルは、ＴＣＲに結合していない四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを含まない。一部の実施形態では、ベッセルは、ＢＣＲに結合していない四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを含まない。
一部の実施形態では、この方法は、ベッセル中の単一の細胞を単離することをさらに含む。一部の実施形態では、単一の細胞は、単離することの前に親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに結合される。
一部の実施形態では、この方法は、単一の細胞を溶解させることをさらに含む。一部の実施形態では、溶解させることは、ベッセル中で単一の細胞が単離された後である。
一部の実施形態では、複数の細胞は、複数のソーティングされていない細胞である。一部の実施形態では、複数の細胞は、複数のソーティングされた細胞である。一部の実施形態では、複数の細胞は、複数の富化された細胞である。
一部の実施形態では、複数のベッセルのうちの第１のベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンのベッセルバーコード配列は、複数のベッセルのうちの第２のベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンのベッセルバーコード配列とは異なる。一部の実施形態では、複数のベッセルのうちの単一のベッセル中の各ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンのベッセルバーコード配列は、同じベッセルバーコード配列を含む。一部の実施形態では、複数のベッセルのうちの任意の単一のベッセル中の各ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドおよびそのアンプリコンのベッセルバーコード配列は、複数のベッセルのうちの任意の他の単一のベッセル中の各ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドおよびそのアンプリコンのベッセルバーコード配列に対して固有である。
一部の実施形態では、この方法は、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを、単一の細胞由来の細胞ポリヌクレオチドに付着させることをさらに含む。一部の実施形態では、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドに付着させることと、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを、単一の細胞由来の細胞ポリヌクレオチドに付着させることとは、同時に実行される。
一部の実施形態では、この方法は、オリゴヌクレオチドまたはその相補体を増幅することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、細胞ポリヌクレオチドまたはその相補体を増幅することをさらに含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはその相補体を増幅することと、細胞ポリヌクレオチドまたはその相補体を増幅することとは、同時に実行される。
一部の実施形態では、細胞ポリヌクレオチドのベッセルバーコード配列とオリゴヌクレオチドのベッセルバーコード配列とは同じである。
一部の実施形態では、この方法は、複数のベッセルのうちの２またはそれよりも多くのベッセルから、オリゴヌクレオチドまたはそのアンプリコンをプールすることをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、複数のベッセルのうちの２またはそれよりも多くのベッセルから、オリゴヌクレオチドまたはそのアンプリコンおよび細胞ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンをプールすることをさらに含む。一部の実施形態では、プールすることは、配列決定することの前である。
一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、複数の異なる親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む。一部の実施形態では、複数の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの各親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、固有の抗原識別（ＡＩＤ）配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、複数の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のうちの単一の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子にバーコード化される親和性分子バーコード（ＡＭＢ）配列を含む。一部の実施形態では、複数の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の各親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子は、固有の親和性分子バーコード（ＡＭＢ）配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法およびコンジュゲートは、複数の異なる四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む。一部の実施形態では、複数の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの各四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、固有の抗原同定（ＡＩＤ）配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、複数の四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のうちの１つの単一の四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子にバーコード化された親和性分子バーコード（ＡＭＢ）配列を含む。一部の実施形態では、複数の四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の各四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子は、固有の親和性分子バーコード（ＡＭＢ）配列を含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、融合配列を含み、そして付着させることは、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを融合配列に付着させることを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、プライマー結合配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは定常配列（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。
一部の実施形態では、この方法は、オリゴヌクレオチド、その相補体、その増幅された産物、またはそれらの組合せを配列決定することであって、それによって、オリゴヌクレオチド配列読み取りを生成することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、１つまたは複数の第１のオリゴヌクレオチド配列読み取りを、１つまたは複数の第２のオリゴヌクレオチド配列読み取りと比較することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、オリゴヌクレオチド配列読み取りを分析することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、オリゴヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列を分析することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、オリゴヌクレオチド配列読み取りの抗原識別（ＡＩＤ）配列を分析することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、オリゴヌクレオチド配列読み取りの親和性分子バーコード（ＡＭＢ）配列を分析することをさらに含む。一部の実施形態では、分析することは、１もしくは複数のベッセルバーコード配列、１もしくは複数のＡＩＤ配列、１もしくは複数の親和性分子バーコード（ＡＭＢ）配列、またはそれらの組合せの頻度を決定することを含む。一部の実施形態では、分析することは、比較することを含む。一部の実施形態では、この方法は、オリゴヌクレオチド配列読み取りの抗原識別（ＡＩＤ）配列を、オリゴヌクレオチド配列読み取りの親和性分子バーコード（ＡＭＢ）配列と比較することをさらに含む。
一部の実施形態では、この方法は、細胞ポリヌクレオチド、その相補体、その増幅された産物、またはそれらの組合せを配列決定することであって、それによって、細胞ポリヌクレオチド配列読み取りを生成することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、オリゴヌクレオチド配列読み取りを、細胞ポリヌクレオチド配列読み取りと比較することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、オリゴヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列を、細胞ポリヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列と比較することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、細胞ポリヌクレオチド配列読み取りを比較することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、細胞ポリヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列を分析することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、細胞ポリヌクレオチド配列読み取りの分子バーコード配列を分析することをさらに含む。
一部の実施形態では、この方法は、分析するステップまたは比較するステップに基づいて、細胞の特徴を決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、オリゴヌクレオチド配列読み取りに基づいて、抗体、ＢＣＲまたはＴＣＲを選択するステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、細胞のポリヌクレオチド配列読み取りに基づいて、抗体、ＢＣＲまたはＴＣＲを選択するステップを含む。
一部の実施形態では、この方法は、分析するステップまたは比較するステップに基づいて、ＴＣＲもしくはＢＣＲへの四量体の親和性および／または四量体へのＴＣＲもしくはＢＣＲの親和性を決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、配列決定読み取りの数は、ＴＣＲまたはＢＣＲへの四量体の親和性を示す。一部の実施形態では、１つの単一の細胞の配列読み取りのより多い数は、配列読み取りのより少ない数を有する１つの単一の細胞と比較して、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよび／またはＴＣＲもしくはＢＣＲのより高い結合親和性を示す。四量体の結合親和性は、四量体のＭＨＣ−ペプチド複合体または四量体のＢ細胞受容体抗原の結合を示すことができる。
一部の実施形態では、四量体オリゴヌクレオチドコンジュゲートへのＴＣＲまたはＢＣＲの親和性を決定する方法は、１つまたは複数の四量体オリゴヌクレオチドコンジュゲートの存在下で１つまたは複数のＴ細胞をインキュベートするステップを含み、ここで、複数の四量体オリゴヌクレオチドコンジュゲートの各々は、固有の識別子バーコードを含むことができる。一部の実施形態では、この方法は、各細胞−四量体複合体を単離するステップと、本明細書に記載される四量体複合体にコンジュゲートされているオリゴヌクレオチドまたはその相補性配列の少なくとも一部を配列決定するステップとをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、各固有バーコード配列の配列決定するステップの間に得られる配列決定読み取りの数を数えるステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、配列決定情報を分析するかまたは標準曲線と比較するステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、四量体へのＴＣＲもしくはＢＣＲの親和性、またはＴＣＲもしくはＢＣＲへの四量体の親和性を、配列決定するステップ、または配列決定情報を分析もしくは比較するステップに基づいて、決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドに付させたベッセルバーコード化ポリヌクレオチド、および細胞ポリヌクレオチドに付着させたベッセルバーコード化ポリヌクレオチドは、ベッセル中の同じ鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドに由来する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドに付着させたベッセルバーコード化ポリヌクレオチドは、鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの増幅産物である。
一部の実施形態では、細胞ポリヌクレオチドに付着させたベッセルバーコード化ポリヌクレオチドは、鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの増幅産物である。
一部の実施形態では、ベッセルは、固体支持体を含む。一部の実施形態では、ベッセルは、固体支持体を含まない。一部の実施形態では、複数のベッセルの各ベッセルは、単一の細胞を含む。一部の実施形態では、ベッセルは、ウェル、エマルジョンまたは液滴である。一部の実施形態では、鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドは、固体支持体に結合していない。一部の実施形態では、鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドは、固体支持体に結合している。
一部の実施形態では、この方法は、複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドのうちの１つの分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコード配列を、細胞ポリヌクレオチドに付着させることをさらに含み、分子バーコード配列は、単一の細胞ポリヌクレオチド分子およびそのアンプリコンにバーコード化される。
一部の実施形態では、付着させることは、ベッセルポリヌクレオチドをオリゴヌクレオチドにライゲーションすることを含む。一部の実施形態では、付着させることは、酵素を用いてベッセルポリヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに付着させることを含む。一部の実施形態では、付着させることは、ベッセルポリヌクレオチドをオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることを含む。一部の実施形態では、付着させることは、オリゴヌクレオチドを伸長させることをさらに含む。一部の実施形態では、付着させることは、鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを増幅することを含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは二本鎖である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは一本鎖である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドはＤＮＡである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドはＲＮＡである。
一部の実施形態では、細胞ポリヌクレオチドは、可変領域配列を含む。一部の実施形態では、この方法は、可変領域配列を含むネイティブ鎖配列を対合させることをさらに含む。一部の実施形態では、細胞ポリヌクレオチドはＤＮＡである。一部の実施形態では、細胞ポリヌクレオチドはＲＮＡである。一部の実施形態では、ＲＮＡはｍＲＮＡである。
一部の実施形態では、単一の細胞はＢ細胞である。一部の実施形態では、単一の細胞はＴ細胞である。
一部の実施形態では、親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、単一の細胞の細胞外抗原に結合する。一部の実施形態では、単一の細胞の細胞外抗原は、免疫細胞に特異的な抗原である。一部の実施形態では、単一の細胞の細胞外抗原は、Ｔ細胞に特異的な抗原である。一部の実施形態では、この細胞外抗原はＣＤ４である。一部の実施形態では、この細胞外抗原はＣＤ８である。一部の実施形態では、単一の細胞の細胞外抗原は、Ｂ細胞に特異的な抗原である。一部の実施形態では、この細胞外抗原は免疫グロブリンである。
一部の実施形態では、親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、抗体またはその断片である。一部の実施形態では、親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、ペプチドである。一部の実施形態では、親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、タンパク質である。一部の実施形態では、親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、アプタマーである。一部の実施形態では、親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、小分子である。一部の実施形態では、親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、薬物である。一部の実施形態では、親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、細胞である。一部の実施形態では、この細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。一部の実施形態では、親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、ＭＨＣ−ペプチド複合体を含む。一部の実施形態では、親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣは、可溶性および／または多量体（例えば、四量体）形態である。一部の実施形態では、ＭＨＣはペプチドに結合している。一部の実施形態では、ペプチドは合成ペプチドである。一部の実施形態では、ＭＨＣは、例えば単一の細胞の、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはＴＣＲ様結合分子、例えばＴＣＲ様抗体または免疫グロブリンまたはキメラ抗原受容体に結合する。
一部の実施形態では、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、ＭＨＣ−ペプチド複合体を含む。一部の実施形態では、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）を可溶性および／または多量体（例えば、四量体）形態で含む。一部の実施形態では、ＭＨＣはストレプトアビジンタンパク質に結合しており、それは中心のビオチンタンパク質と複合体化し、最高４つのＭＨＣ−ストレプトアビジン複合体が多量体複合体に連結されるのを可能にする（例えば、図１０Ａに示すように）。一部の実施形態では、ＭＨＣは、ペプチドと関連する。一部の実施形態では、ＭＨＣは、共有結合性または非共有結合性の連結を経てペプチドと関連する。一部の実施形態では、ペプチドは合成ペプチドである。一部の実施形態では、ペプチドは合成ペプチドである。一部の実施形態では、ＭＨＣは、例えば単一の細胞の、ＴＣＲおよび／またはＴＣＲ様結合分子、例えばＴＣＲ様抗体または免疫グロブリンまたはキメラ抗原受容体に結合する。一部の実施形態では、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、Ｂ細胞受容体抗原を可溶性および／または多量体（例えば、四量体）形態で含む。一部の実施形態では、Ｂ細胞受容体抗原は、細胞または対象に以前に投与された。一部の実施形態では、Ｂ細胞受容体抗原は、例えば単一の細胞の、ＢＣＲおよび／またはＢＣＲ様結合分子、例えばキメラ抗原受容体に結合する。
一部の実施形態では、親和性部分は、抗原認識分子および／あるいは免疫受容体、例えば、抗体もしくは免疫グロブリンまたはそれらの部分もしくは融合物、操作された免疫受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、あるいはＴＣＲに特異的に結合する。一部のかかる実施形態では、親和性部分は、抗体もしくは受容体、例えばＣＡＲによって認識される抗原もしくはエピトープまたはそれらの部分を含む。一部の実施形態では、親和性部分は、免疫受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む。一部の態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、受容体の可変性部分および／または抗原結合性部分、例えば、イディオトープに特異的に結合する。一部の態様では、親和性分子は、抗イディオタイプ抗体またはその断片である。
一部の実施形態では、親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）またはその機能的部分もしくは結合性部分を含む。一部の実施形態では、親和性部分は、ＭＨＣの多量体、任意選択で、ＭＨＣの四量体を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣは、可溶性形態である。一部の実施形態では、ＭＨＣは、ＭＨＣの溝内で、ペプチドに結合しているかおよび／またはペプチドを含む。一部の実施形態では、ペプチドは合成ペプチドである。一部の実施形態では、ＭＨＣは、単一の細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合する。一部の実施形態では、親和性部分は、抗体もしくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に結合するペプチドを含み、および／または標的は、抗体もしくはＣＡＲである。一部の実施形態では、親和性部分は、抗体もしくはキメラ抗原受容体によって特異的に認識される抗原もしくはエピトープであるかまたはそれを含み、および／あるいはそれに特異的に結合する抗体、任意選択で、その抗原結合性部分に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を含む。
一態様では、複数の細胞を含む試料由来の単一の細胞、単一の細胞の標的抗原に結合した親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、およびベッセルバーコード配列を含むベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを各々が含む複数のベッセルを含む組成物が提供される。一部の実施形態では、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドに付着される。
一態様では、複数の細胞を含む試料に由来する単一の細胞、単一の細胞のＴＣＲまたはＢＣＲに結合した四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、およびベッセルバーコード配列を含むベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを各々が含む複数のベッセルを含む組成物が提供される。一部の実施形態では、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体は、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドに付着される。一態様では、複数の細胞を含む試料に由来する単一の溶解細胞、および単一の溶解細胞の標的抗原に結合した親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを各々が含む複数のベッセルを含む組成物が提供され；親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドは、ベッセルバーコード配列を含み、単一の溶解細胞に由来する細胞ポリヌクレオチドは、同じベッセルバーコード配列を含む。
一態様では、複数の細胞を含む試料に由来する単一の溶解細胞、および単一の溶解細胞のＴＣＲまたはＢＣＲに結合した四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを各々が含む複数のベッセルを含む組成物が提供され；四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドは、ベッセルバーコード配列を含み、単一の溶解細胞に由来する細胞ポリヌクレオチドは、同じベッセルバーコード配列を含む。一態様では、複数のベッセルを含む組成物が本明細書で提供され、複数のベッセルのうちの１つのベッセルは、複数の細胞を含む試料に由来する単一の細胞、およびベッセルバーコード配列を含むベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを含み、ベッセルは、単一の細胞の標的抗原に結合する親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはそれに由来するオリゴヌクレオチド部分をさらに含む。
一態様では、複数のベッセルを含む組成物が本明細書で提供され、複数のベッセルの１ベッセルは、複数の細胞を含む試料に由来する単一の細胞、およびベッセルバーコード配列を含むベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを含み、ベッセルは、単一の細胞のＴＣＲまたはＢＣＲに結合する四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはそれに由来するオリゴヌクレオチド部分をさらに含む。
一部の実施形態では、反応は、複数のベッセルのうちの２またはそれよりも多くのベッセル中で起こる。一部の実施形態では、ベッセルは、複数のベッセルの各ベッセルを構成する。一部の実施形態では、複数のベッセルは、２またはそれよりも多くの複数のベッセルを構成する。一部の実施形態では、各ベッセル中の細胞は、同じ試料に由来する。一部の実施形態では、２またはそれよりも多くの複数のベッセルのうちの第１の複数のベッセルのうちの１つのベッセル中の細胞は、２またはそれよりも多くの複数のベッセルのうちの第２の複数のベッセルのうちの１つのベッセル中の細胞と同じ試料に由来する。一部の実施形態では、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドに付着される。一部の実施形態では、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体は、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドに付着される。一部の実施形態では、単一の細胞は、溶解される。
一態様では、複数のベッセルを含む組成物が本明細書で提供され、複数のベッセルのうちの１つのベッセルは、複数の細胞を含む試料由来の単一の溶解細胞、および単一の溶解細胞の標的抗原に結合する親和性部分を含む親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはこの親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分を含み；親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分は、ベッセルバーコード配列を含み、単一の溶解細胞由来の細胞ポリヌクレオチドは、同じベッセルバーコード配列を含む。
一態様では、複数のベッセルを含む組成物が本明細書で提供され、複数のベッセルのうちの１つのベッセルは、複数の細胞を含む試料に由来する単一の溶解細胞、および単一の溶解細胞のＴＣＲもしくはＢＣＲに結合する親和性部分を含む四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはこの四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分を含み；四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分は、ベッセルバーコード配列を含み、単一の溶解細胞に由来する細胞ポリヌクレオチドは、同じベッセルバーコード配列を含む。
一態様では、第１の抗原識別（ＡＩＤ）配列を含む第１のオリゴヌクレオチドを含む第１の容器であって、第１のＡＩＤ配列が既知の配列である、第１の容器；第２の抗原識別（ＡＩＤ）配列を含む第２のオリゴヌクレオチドを含む第２の容器であって、第２のＡＩＤ配列が既知の配列であり、第１のＡＩＤ配列とは異なる、第２の容器；第１のオリゴヌクレオチドを第１の親和性分子にコンジュゲートすることが可能な試薬と、第２のオリゴヌクレオチドを第２の親和性分子にコンジュゲートすることが可能な試薬とを含む、１つまたは複数の第３の容器；第１のオリゴヌクレオチドを第１の親和性分子にどのようにコンジュゲートするか、および第２のオリゴヌクレオチドを第２の親和性分子にどのようにコンジュゲートするかを記載する、指示書のセットを含むキットが提供される。
一態様では、第１の抗原同定（ＡＩＤ）配列を含む第１のオリゴヌクレオチドを含む第１の容器であって、第１のＡＩＤ配列が公知の配列である、第１の容器；第２の抗原同定（ＡＩＤ）配列を含む第２のオリゴヌクレオチドを含む第２の容器であって、第２のＡＩＤ配列が公知の配列であり、第１のＡＩＤ配列とは異なる、第２の容器；第１のオリゴヌクレオチドを第１の四量体にコンジュゲートすることが可能な試薬および第２のオリゴヌクレオチドを第２の四量体にコンジュゲートすることが可能な試薬を含む、１つまたは複数の第３の容器；第１のオリゴヌクレオチドを第１の四量体に、および第２のオリゴヌクレオチドを第２の四量体分子にコンジュゲートする方法を記載する、指示書のセットを含むキットが提供される。
一態様では、抗原識別（ＡＩＤ）配列を含むオリゴヌクレオチドを含む第１の容器であって、ＡＩＤ配列が既知の配列である、第１の容器；オリゴヌクレオチドを親和性分子にコンジュゲートすることが可能な試薬を含む第２の容器；複数のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを含む第３の容器；および親和性分子にコンジュゲートされたときに、複数のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドのうちの１つのベッセルバーコード化ポリヌクレオチドをオリゴヌクレオチドにどのように付着させるかを記載する、指示書のセットを含むキットが提供される。
一態様では、抗原同定（ＡＩＤ）配列を含むオリゴヌクレオチドを含む第１の容器であって、ＡＩＤ配列が公知の配列である、第１の容器；オリゴヌクレオチドを四量体にコンジュゲートすることが可能な試薬を含む第２の容器；複数のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを含む第３の容器；および四量体にコンジュゲートされたときに、複数のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドのうちの１つのベッセルバーコード化ポリヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに付着させる方法を記載する、指示書のセットを含むキットが提供される。
本明細書に開示される方法および組成物は、腫瘍プロファイリングに使用され得る。例えば、これらの方法は、細胞表現型を患者試料中の免疫レパートリーとリンクさせて、腫瘍反応性ＴＣＲを識別することを含み得る。本明細書に開示される方法および組成物は、養子細胞療法に使用され得る。例えば、これらの方法は、ソーティングなしのＴ細胞の遺伝子分析を含み得る。例えば、これらの方法は、産物の製造および処理の間に、Ｔ細胞クローン情報（ＴＣＲを使用する）を遺伝子発現パターンと組み合わせることを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、養子細胞療法の前、その過程の間、またはその後に、患者から取得された養子移入された細胞を追跡、特徴付け、モニタリングおよび／または評価するために使用され得る。本明細書に開示される方法および組成物は、既知の標的に対するＴＣＲを識別するために使用され得る。例えば、これらの方法は、抗原に対して高度に応答してもよいがあまり増殖しない高親和性クローンを識別することを含み得る。本明細書に開示される方法および組成物は、細胞試料の多重化に使用され得る。例えば、１つまたは複数の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと接触させたプールされた細胞試料を含むエマルジョンは、同時に複数の試料を処理しながら、オリジナルの細胞試料を識別するために使用され得る。
本明細書に開示される方法および組成物は、配列決定による多重化されたＴＣＲまたはＢＣＲ親和性の測定のために使用され得る。本明細書に開示される方法および組成物は、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの四量体への単一の細胞のＴＣＲまたはＢＣＲの結合親和性を定量化するために使用され得る。さらに、この定量化は、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート濃度に感受性であってよく、ここで、結合親和性シグナルは、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート濃度に依存性であってよい（例えば、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート濃度の低下は結合親和性シグナルの対応する低下をもたらす）。さらに、本明細書に開示される方法および組成物は、非特異的細胞から抗原特異的細胞を区別するために使用され得る。例えば、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの四量体に結合するＴＣＲまたはＢＣＲを有する細胞と、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの四量体に結合しないＴＣＲまたはＢＣＲを有する細胞とを区別すること。さらに、本明細書に開示される方法および組成物の１つの利点は、それらの２つの集団を分離するためのフローサイトメトリーゲーティングを使用せずに、非特異的細胞（すなわち、四量体−細胞）から抗原特異的細胞（すなわち、四量体＋細胞）の集団を区別する能力である。しばしば、フローサイトメトリーゲーティングは、フローサイトメトリープロットの上での四量体−集団からの四量体＋集団の分離に基づく集団分離の「最良の推測」であるかもしれないが、それは不正確である可能性があり、したがって、各集団からの細胞の喪失または細胞の誤った特徴付けをもたらす可能性がある。対照的に、本明細書に記載される方法および組成物は、細胞の集団を区別するためにゲーティング技術に頼らず、代わりに、試料中の各細胞の結合親和性を個々に定量化するハイスループット方法であってよい。さらに、本明細書に開示される方法および組成物は、ＭＨＣ−ペプチドへの高い結合親和性を有するＴＣＲを有する細胞（すなわち、高結合剤）とＭＨＣ−ペプチドへの低い結合親和性を有するＴＣＲを有する細胞（すなわち、低結合剤）とを区別するために、ならびに本明細書に記載されるハイスループット方法を使用して、試料中の高結合親和性細胞と低結合親和性細胞とを区別するために使用され得る。
参照による組込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個々に示されるのと同じ程度まで、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載されている新規特徴は、特に添付の特許請求の範囲に示されている。本明細書に記載されている特徴および特徴の利点に関するより良好な理解は、本明細書に記載されている特徴の原理が利用されている説明例が示されている以下の詳細な記載および添付の図面を参照することにより得られ得る。
図１は、本明細書に記載されている方法のベッセルの例示の模式図を示す。
図２は、抗体にコンジュゲートされているオリゴヌクレオチドタグの例示の設計を示す。各有色ブロックは、完全なオリゴヌクレオチド配列の部分を表わす。融合配列は、エマルジョン反応内での液滴特異的ＤＮＡバーコードの酵素的付着に使用される。配列の１つの考え得る配置のみが示されているが、他の配置も本記載の方法と適合する。
図３Ａは、追加のｍＲＮＡおよびタンパク質標的を有する免疫受容体配列の例示の同時捕捉を示す。表面タンパク質標的は、エマルジョン配列決定の前に、細胞をＤＮＡ標識染色抗体と共に事前にインキュベートすることにより定量化される。
図３Ｂは、健常ヒトＴ細胞から生成された３，６８２個の液滴バーコードＴＣＲ ＶαＶβペアの、例示のＣＤ４およびＣＤ８ ｍＲＮＡならびにタンパク質測定を示す。
図３Ｃは、ｍＲＮＡとタンパク質測定との例示の合致を示す（各点は、ＴＣＲ ＶαＶβペアにリンクする液滴バーコードである）。
図３Ｄは、エマルジョン内でのソーティングされていないＴ細胞に由来するＣＤ４およびＣＤ８のｍＲＮＡおよびタンパク質の同時検出の例示の表を示す。３０，０００個のインプットＴ細胞から、３，６８２個のＴＣＲペアが回収された。ｍＲＮＡ対タンパク質（分子計数、多数決原理に基づく）によりＣＤ４＋またはＣＤ８＋とみなされたＴＣＲペアの頻度が、マトリックスで示されている。
図３Ｅは、ＣＤ４を標的とする親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよびＣＤ８を標的とする親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを使用した、４５，８７０個の単一細胞ＴＣＲペアの例示の結果を示す。
図４は、ＣＤ４を標的とする親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよびＣＤ８を標的とする親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが使用される例示の方法の模式図を示す。
図５は、エマルジョン内での単一免疫細胞バーコード付与方法の結果を例示する。図５Ａは、細胞および溶解／反応（ＬＲ）混合物を含有する２つの水性流動を油内に通して、毎時８００万液滴を超えて単分散エマルジョンを生成する例示の図である。
図５Ｂは、ベッセル内の細胞が溶解され、単一反応で分子特異的および液滴特異的バーコード付与に供されることを示す例示の図である。
図５Ｃは、標的ｍＲＮＡが逆転写され、ユニバーサルアダプター配列で鋳型スイッチタグ化されることを示す例示の図である。その後、初めに１液滴当たり約１分子に希釈された液滴バーコード鋳型のＰＣＲ増幅が起こる。増幅されたバーコードを、相補的オーバーラップ伸長法により、鋳型スイッチしたｃＤＮＡに追加する。エマルジョンから産物を回収し、追加のライブラリー処理ステップおよびハイスループット配列決定の前に、ＲＴプライマーのビオチンを使用して精製する。
図５Ｄは、二重バーコード付与により、配列決定読み取りをそれらの由来分子および由来液滴にクラスター化することが可能になり、配列決定エラーおよび増幅バイアスを最小限に抑えつつ、ネイティブ受容体鎖対合が再構築されることを示す例示の図である。
図６は、単離された健常Ｂ細胞からＢＣＲを回収するための方法の結果を例示する。図６Ａは、３００万個のＢ細胞が０．２細胞／液滴でエマルジョン内を通過し、占領細胞の約９０％が単一細胞を含有する結果となった液滴の例示の図である。
図６Ｂは、ＶＨＶＬ対合精度の例示の図である。エマルジョンバーコード付与および配列決定後、データを、単一細胞液滴に由来するデータについて濃縮し、ＶＨＶＬ対合精度を、拡大クローン中のペア一貫性を使用して評価した。
図６Ｃは、液滴バーコードパーセント対Ｉｇアイソタイプの例示のグラフである。２５９，３６８個のフィルタリングされたＶＨＶＬペアの重鎖アイソタイプ（各液滴内の最も多量なアイソタイプ）および軽鎖遺伝子座使用率が示されている。
図６Ｄは、６つの独立エマルジョン画分の各々の、１００個の最高頻度重鎖のクローンのランク存在量の例示のグラフである。０．０５％の全体頻度に印が付けられている。
図６Ｅは、各液滴バーコード内の捕捉ｍＲＮＡの数により評価した、細胞内でのＶＨ対ＶＬ発現の例示のグラフである。アイソタイプ毎に、５，０００個の点が示されている。
図６Ｆは、ＢＣＲペアのＶＨ対ＶＬ突然変異相関性および各アイソタイプ内の密度分布の例示のグラフである。
図７は、ＨＩＶ広域中和抗体（ｂＮＡｂ）を発見するための方法の結果を例示する。図７Ａは、エマルジョンに入れられたＨＩＶ長期非進行者のＢ細胞に由来する３８，６２０個の回収したＶＨＶＬペアの重鎖アイソタイプ分布の例示のグラフである。先に知られたｂＮＡｂ（「ＰＧＴ様」）と良好にアラインするＩｇＧ鎖の割合はわずかである。
図７Ｂは、既知のｂＮＡｂ（黒色）＋新たに回収されたもの（赤色、液滴バーコードで標識されている）の完全なＶＤＪアミノ酸配列の系統樹の例示の図である。重鎖（左）および軽鎖（右）は別々にプロットされている。ミスマッチの可能性のある抗体ＰＧＴ１２２およびＰＧＴ１２３は青色である。
図７Ｃは、ＰＧＴ１２１の対照ストックと比較した、１０株のＨＩＶに対する、８つの新たに発見されたＰＧＴ様バリアントの中和活性（ＩＣ５０、μｇ／ｍＬ）の例示の図である。
図８は、卵巣腫瘍に由来するＴＩＬを特徴付けるための方法の結果を例示する。図８Ａは、卵巣腫瘍に由来する４００，０００個のソーティングされていない分離された細胞がエマルジョンに入れられ、ＢＣＲペアおよびＴＣＲペアが、エマルジョンバーコード付与により同時に回収された液滴の例示の図である。
図８Ｂは、フィルタリング後に液滴バーコード内で観察された全てのＶＨ／ＶＬおよびＶα／Ｖβ組合せの数を示す、液滴バーコード対受容体鎖組合せの例示のグラフである。
図８Ｃは、回収したＢＣＲペアの液滴バーコードパーセント対重鎖アイソタイプ分布の例示のグラフである。
図８Ｄは、ＢＣＲペアについてのＶＨ対ＶＬ突然変異相関性および各アイソタイプ内の密度分布の例示のグラフである。
図８Ｅは、全体の（上段）ＴＣＲペアおよびＢＣＲペアの、および異なるアイソタイプ（下段）の捕捉ｍＲＮＡの数の例示のグラフを示す。
図８Ｆは、６つの独立エマルジョン画分の各々における、３０個の最高頻度のＢＣＲ重鎖クローン（上段）および３０個の最高頻度のＴＣＲベータ鎖クローンのランク存在量を示すクローン分析の例示のグラフを示す。１％および１０％の全体頻度レベルが示されている。
図９は、抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを使用してイムノフェノタイピングするための方法を例示する。図９Ａは、抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに結合されている単一細胞を各々が含有する２つのベッセルを示す例示の模式図を示す。（ＤＢ１−液滴バーコード１；ＤＢ２−液滴バーコード２；ＭＢ１−分子バーコード１；ＭＢ２−分子バーコード２；ＡＩＤ−抗原ＩＤバーコード；ＡＭＢ１−抗体分子バーコード１；ＡＭＢ２−抗体分子バーコード２）。
図９Ｂは、図９Ａのベッセルの溶解細胞に由来するＲＮＡ分子を各々が含有する２つのベッセルを示す例示の模式図を示す。ＲＮＡ分子が逆転写され、逆転写により創出されたｃＤＮＡ分子の末端に非鋳型ヌクレオチドが付加されている。逆転写により創出されたｃＤＮＡ分子の末端に付加された非鋳型ヌクレオチドに、分子バーコードがハイブリダイズされている。
図９Ｃは、増幅され、図９ＢのベッセルのｃＤＮＡにハイブリダイゼーションにより付着されている、各々が鋳型バーコード化ポリヌクレオチドを含有する２つのベッセルを示す例示の模式図を示す。ｃＤＮＡは、伸長されている（上段）。その後、伸長されたｃＤＮＡが増幅される（下段）。
図９Ｄは、同じ同一ＲＮＡ配列に付着されている同じ分子バーコード（ＭＢ）を有するＲＮＡ−ＭＢ−ＤＢ種が、ＰＣＲ複製の結果である可能性が高いことを示す例示の模式図を示す。同じ同一ＲＮＡ配列に付着されている２つの異なるＭＢを有するＲＮＡ−ＭＢ−ＤＢ種（ＲＮＡ１−ＭＢ１−ＤＢおよびＲＮＡ１−ＭＢ２−ＤＢ）は、２つの当初の独立ＲＮＡ分子であり、ＰＣＲ複製由来ではない。
図９Ｅは、同じ液滴バーコード（ＤＢ）および抗原ＩＤバーコード（ＡＩＤ）を有する配列に付着されている、同じ抗体分子バーコード（ＡＭＢ）を有するＤＢ−ＡＭＢ−ＡＩＤ種が、ＰＣＲ複製の結果である可能性が高いことを示す例示の模式図を示す。同じ液滴バーコード（ＤＢ）および抗原ＩＤバーコード（ＡＩＤ）を有する配列に付着されている、２つの異なるＡＭＢを有するＤＢ１−ＡＭＢ１−ＡＩＤ１およびＤＢ１−ＡＭＢ２−ＡＩＤ１種は、ベッセル内の同じ単一細胞に付着された同じ標的抗原に特異的に結合する抗体を各々が有する２つの独立抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に由来し、ＰＣＲ複製由来ではない２つの独立オリゴヌクレオチド分子である。同じ液滴バーコード（ＤＢ）および同じまたは異なる抗体分子バーコード（ＡＭＢ）を有する配列に付着されている、２つの異なるＡＩＤを有するＤＢ１−ＡＭＢｎ−ＡＩＤ１およびＤＢ１−ＡＭＢｎ−ＡＩＤ２種は、ベッセル内の同じ単一細胞に付着されている２つの独立抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に由来する２つの独立オリゴヌクレオチド分子であり、抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の一方は、第１の標的抗原と特異的に結合する抗体を有し、他方の抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子は、第２の標的抗原と特異的に結合する抗体を有する。
図１０Ａは、本明細書に記載されている方法の例示的な親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの模式図を示す。示すように、例示的な親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＭＨＣ−ペプチド親和性部分を含むことができる。一部の態様では、そのようなコンジュゲートは、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと呼ぶことができる。
図１０Ｂは、本明細書に記載されている方法の例示的な親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの模式図を示す。一部の態様では、そのようなコンジュゲートは、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと呼ぶことができる。
図１１Ａは、ＴＣＲに結合する親和性部分を含む、本明細書に記載されている方法の２つの例示の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの結合シグナルの例示のグラフを示す。
図１２Ａは、本明細書に記載されている方法の例示の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに結合されているＴ細胞の例示の模式図を示す。
図１２Ｂは、本明細書に記載されている方法の例示の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに結合されている液滴内Ｔ細胞の例示の模式図を示す。液滴中の核酸は、液滴識別用配列で印が付けられ、次世代シークエンシングライブラリーに組み込まれる。
図１３は、例示の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート四量体にコンジュゲートされているオリゴヌクレオチドタグの例示の模式図を示す。四量体ＩＤは、四量体バッチに対応する短鎖の定常ＤＮＡ配列であり、単一の実験にて、ペプチド−ＭＨＣ標的等の異なる標的の多重化を可能にする。分子バーコードは、結合された四量体を定量化するための分子計数を可能にする縮重配列である。
図１４は、ＤＮＡ標識ＭＨＣ四量体試薬から生成された例示的な親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの模式図を示す（四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート）。一実施形態では、Ｃｙ５連結ＤＮＡオリゴヌクレオチドが合成され、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンにコンジュゲートされる。一実施形態では、非蛍光性ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、ＡＰＣ−ストレプトアビジンにコンジュゲートされる。一実施形態では、非蛍光性ＤＮＡオリゴヌクレオチドとストレプトアビジンまたはニュートラアビジンの混合物が、活性化ＡＰＣにコンジュゲートされる。
図１５は、クリック化学を使用して、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にオリゴヌクレオチドをコンジュゲートするための例示の方法を示す。
図１６は、例示の親和性−オリゴヌクレオチドを調製および特徴付けるための例示のワークフローの模式図を示す。
図１７は、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＴＬＡ−４を標的とする６つの異なる親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが使用する、本明細書に記載されている例示の方法の結果を示す。各点は、液滴バーコード／単一細胞である。細胞同一性は、回収した受容体ペアのタイプにより明らかにされた（ＴＣＲ＝Ｔ細胞；Ｉｇ＝Ｂ細胞）。
図１８は、例示的な四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのさらなる像を示す。一部の実施形態では、四量体−オリゴヌクレオチドは、フルオロフォア（Ｆｌｕｏｒ）を含む。一部の実施形態では、四量体−オリゴヌクレオチドは、フルオロフォアを含まない。
図１９は、ＴＣＲに結合するＭＨＣ−ペプチド親和性部分を含有する、本明細書に記載されている方法の２つの例示的な四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの例示的な結合曲線を示す。
図２０は、標的特異的一次ＣＤ８＋Ｔ細胞または非標的特異的一次ＣＤ８＋Ｔ細胞を標準のｐＭＨＣ四量体試薬またはＤＮＡ標識ｐＭＨＣ四量体（四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート）のいずれかと共にインキュベートした、フローサイトメトリープロットを示す。右の３つのパネル欄の直ぐ上の三角形で示すように、ＤＮＡ標識ｐＭＨＣ四量体は漸減濃度で使用した。
図２１は、非結合性ＴＣＲ（例えば、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート試薬によって特異的に認識されないＴＣＲ）および結合性ＴＣＲ（例えば、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート試薬によって特異的に認識されるＴＣＲ）を提示する細胞の間の、細胞当たりの四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート数の比較を示す。Ｘ軸に沿って示されるように、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの漸増濃度を使用した。
詳細な説明
いくつかの態様が、例示のために、例となる適用に関連して、以下に記載される。多くの具体的な詳細、関連性および方法が、本明細書に記載される特色の完全な理解を提供するために示されていることを理解すべきである。しかし、当業者は、本明細書に記載される特色が、具体的な詳細のうち１つもしくは複数を伴わずに、または他の方法を伴って実施され得ることを容易に認識する。一部の行為は、他の行為もしくは事象とは異なる順序でおよび／またはそれらと同時に生じ得るので、本明細書に記載される特色は、行為または事象の例示された順序付けによっては限定されない。さらに、全ての例示された行為または事象が、本明細書に記載される特色に従って方法論を実行するために必要とされるわけではない。
本明細書で使用される用語法は、特定の場合のみを記載することを目的としているのであって、限定を意図するものではない。本明細書で使用する場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「この（the）」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数形も同様に含むことが意図される。さらに、用語「含む（including）」、「含む（includes）」、「有する（having）」、「有する（has）」、「有する（with）」、またはそれらの異形は、詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかで使用される限りにおいて、かかる用語は、用語「含む（comprising）」と類似の様式で包括的である意図である。
用語「約」または「およそ」は、値がどのように測定または決定されるか、即ち、測定系の限界に一部依存する、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し得る。例えば、「約」は、当技術分野の実務に従って、１または１よりも大きい標準偏差以内であることを意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大で２０％、最大で１０％、最大で５％または最大で１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に、生物学的系またはプロセスに関して、この用語は、ある値の５倍以内、より好ましくは２倍以内のオーダーの大きさ以内であることを意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載される場合、特記しない限り、その特定の値についての許容される誤差範囲内であることを意味する用語「約」を前提とすべきである。
（例えば、エマルジョン中の）単一の細胞（免疫細胞）を親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート（例えば、抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート）を使用してフェノタイピングするための方法および組成物を提供することが、本発明の目的である。
定義
したがって、本明細書の用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、これには、断片抗原結合性（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む単鎖抗体断片、および単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）断片を含む、インタクトな抗体およびその機能的（抗原結合性）抗体断片を含む、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。この用語は、免疫グロブリンの遺伝子操作された形態および／または他の方法で改変された形態、例えば、イントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体、多特異性、例えば二特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディおよびテトラボディ、タンデムジ−ｓｃＦｖ、タンデムトリ−ｓｃＦｖを包含する。特記しない限り、用語「抗体」は、その機能的抗体断片を包含すると理解すべきである。この用語は、ＩｇＧならびにそのサブクラス、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＤを含む、任意のクラスまたはサブクラスの抗体を含む、インタクトな抗体または全長抗体もまた包含する。
「超可変領域」または「ＨＶＲ」と同義の用語「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」は、抗原特異性および／または結合親和性を付与する、抗体可変領域内のアミノ酸の非隣接配列を指すことが、当技術分野で公知である。一般に、各重鎖可変領域中の３つのＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３）および各軽鎖可変領域中の３つのＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３）が存在する。「フレームワーク領域」および「ＦＲ」は、重鎖および軽鎖の可変領域の非ＣＤＲ部分を指すことが、当技術分野で公知である。一般に、各全長重鎖可変領域中の４つのＦＲ（ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３およびＦＲ−Ｈ４）、および各全長軽鎖可変領域中の４つのＦＲ（ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３およびＦＲ−Ｌ４）が存在する。
所与のＣＤＲまたはＦＲの正確なアミノ酸配列境界は、Kabatら（１９９１年）、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、第５版 Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Al-Lazikaniら、（１９９７年）JMB ２７３巻、９２７〜９４８頁（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）、MacCallumら、J. Mol. Biol. ２６２巻：７３２〜７４５頁（１９９６年）、「Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography」、J. Mol. Biol. ２６２巻、７３２〜７４５頁（「Ｃｏｎｔａｃｔ」番号付けスキーム）、Lefranc MPら、「IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains」、Dev Comp Immunol、２００３年１月；２７巻（１号）：５５〜７７頁（「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）、ならびにHonegger AおよびPluckthun A、「Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool」、J Mol Biol、２００１年６月８日；３０９巻（３号）：６５７〜７０頁、（「Ａｈｏ」番号付けスキーム）によって記載されるものを含む、いくつかの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定され得る。
所与のＣＤＲまたはＦＲの境界は、識別に使用されるスキームに依存して変動し得る。例えば、Ｋａｂａｔスキームは、構造アラインメントに基づくが、Ｃｈｏｔｈｉａスキームは、構造情報に基づく。ＫａｂａｔスキームおよびＣｈｏｔｈｉａスキームの両方についての番号付けは、一部の抗体において現れる、挿入文字によって提供される挿入、例えば「３０ａ」および欠失を伴う、最も一般的な抗体領域配列長に基づく。２つのスキームは、異なる位置においてある特定の挿入および欠失（「インデル」）を配置して、示差的な番号付けを生じる。Ｃｏｎｔａｃｔスキームは、複合体の結晶構造の分析に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに多くの点で類似している。
以下の表Ａは、それぞれＫａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａおよびＣｏｎｔａｃｔのスキームによって識別された場合の、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３およびＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３の境界の例示の位置を列挙する。ＣＤＲ−Ｈ１については、残基番号付けは、Ｋａｂａｔ番号付けスキームおよびＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームの両方を使用して列挙されている。ＦＲは、ＣＤＲ間に位置する、例えば、ＦＲ−Ｌ１は、ＣＤＲ−Ｌ１とＣＤＲ−Ｌ２との間に位置する、など。示されたＫａｂａｔ番号付けスキームは、Ｈ３５ＡおよびＨ３５Ｂに挿入を配置するので、示されたＫａｂａｔ番号付け慣習を使用して番号付けした場合のＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ−Ｈ１ループの末端は、ループの長さに依存して、Ｈ３２とＨ３４との間で変動することに留意されたい。
したがって、特記しない限り、所与の抗体またはその領域、例えば、その可変領域の「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」、または個々の特定されたＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２）は、上述のスキームのいずれかによって規定される、ある（または特定の）相補性決定領域を包含すると理解すべきである。例えば、特定のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ−Ｈ３）が、所与のＶＨまたはＶＬアミノ酸配列中の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を含むと述べられる場合、かかるＣＤＲは、上述のスキームのいずれかによって規定される、可変領域内の対応するＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ−Ｈ３）の配列を有すると理解される。一部の実施形態では、特定されたＣＤＲ配列が特定される。
同様に、特記しない限り、所与の抗体またはその領域、例えば、その可変領域のＦＲまたは個々の識別されたＦＲ（単数または複数）（例えば、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２）は、公知のスキームのいずれかによって規定される、ある（または特定の）フレームワーク領域を包含すると理解すべきである。一部の例では、特定のＣＤＲ、ＦＲ、またはＦＲ（複数）もしくはＣＤＲ（複数）の識別のためのスキームは、Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＣｏｎｔａｃｔの方法によって規定されるＣＤＲのように、特定される。他の場合には、ＣＤＲまたはＦＲの特定のアミノ酸配列が与えられる。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の抗原への結合に関与する、抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。ネイティブ抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）は一般に、類似の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つのＣＤＲを含む（例えば、Kindtら Kuby Immunology、第６版、W.H. Freeman and Co.、９１頁（２００７年）を参照のこと）。単一のＶＨまたはＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原と結合する抗体は、それぞれ相補的ＶＬまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングするために、その抗原と結合する抗体由来のＶＨまたはＶＬドメインを使用して単離され得る。例えば、Portolanoら、J. Immunol. １５０巻：８８０〜８８７頁（１９９３年）；Clarksonら、Nature ３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）を参照のこと。
提供される抗体の中でも特に、抗体断片が挙げられる。「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原と結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、これらの抗体は、可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域を含む単鎖抗体断片、例えば、ｓｃＦｖである。
特記しない限り、用語「ＴＣＲ」は、完全ＴＣＲならびにその抗原結合性部分または抗原結合性断片（ＭＨＣ−ペプチド結合性断片とも呼ばれる）を包含すると理解すべきである。一部の実施形態では、ＴＣＲは、インタクトなまたは全長ＴＣＲである。一部の実施形態では、ＴＣＲは、全長ＴＣＲ未満であるが、ＭＨＣ分子に結合した（即ち、ＭＨＣ分子との関連での）特異的抗原性ペプチド、即ち、ＭＨＣ−ペプチド複合体に結合する、抗原結合性部分である。一部の場合には、ＴＣＲの抗原結合性部分または断片は、全長またはインタクトなＴＣＲの構造ドメインの一部分だけを含み得るが、それでもなお完全ＴＣＲが結合するエピトープ（例えば、ＭＨＣ−ペプチド複合体）と結合することが可能である。一部の場合には、ＴＣＲの抗原結合性部分または断片は、特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体への結合のための結合部位を形成するのに十分なＴＣＲの可変ドメイン、例えば、ＴＣＲの可変α鎖および可変β鎖を含み、ここで、例えば一般に、各鎖は３つの相補性決定領域を含む。抗原結合性ドメインであるまたは抗原結合性ドメインと相同である結合性ドメインを有するポリペプチドまたはタンパク質が含まれる。相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体およびＴＣＲならびに他のヒト化抗体およびＴＣＲ（ＣＤＲ改変およびフレームワーク領域改変を含む）もまた、これらの用語によって企図される。免疫グロブリン鎖（例えば、重鎖および軽鎖）のみに対して言及がなされ得るが、開示された発明は、複数の他の異なる型の対合した配列、例えば、Ｔ細胞受容体鎖ペア（ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖ならびにＴＣＲγ鎖およびＴＣＲδ鎖）に適用され得、免疫グロブリンに限定されないことに留意すべきである。
種々のがんまたは感染性生物と関連する抗原を認識するＴ細胞の能力は、アルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖の両方またはガンマ（γ）およびデルタ（δ）鎖の両方から構成されるそのＴＣＲによって付与される。これらの鎖を構成するタンパク質は、ＴＣＲの極めて大きい多様性を生成するために固有の機構を使用するＤＮＡによってコードされる。この多サブユニット免疫認識受容体は、ＣＤ３複合体と会合し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣクラスＩおよびＩＩタンパク質によって提示されるペプチドと結合する。ＡＰＣ上の抗原性ペプチドへのＴＣＲの結合は、Ｔ細胞活性化における中心的な事象であり、これは、Ｔ細胞とＡＰＣとの間の接触点の免疫シナプスにおいて生じる。
各ＴＣＲは、可変相補性決定領域（ＣＤＲ）ならびにフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。αおよびβ鎖可変ドメインの第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）ループのアミノ酸配列は、それぞれ、β鎖遺伝子座における可変（Ｖβ）遺伝子セグメント、多様性（Ｄβ）遺伝子セグメントおよび連結（Ｊβ）遺伝子セグメントの間での組換え、ならびにα鎖遺伝子座における類似のＶα遺伝子セグメントとＪα遺伝子セグメントとの間での組換えから生じる、αβＴ細胞の配列多様性を主に決定する。ＴＣＲのαおよびβ鎖遺伝子座における複数のかかる遺伝子セグメントの存在は、多数の別個のＣＤＲ３配列がコードされることを可能にする。ＴＣＲ遺伝子再配置のプロセスの間のＶβ−Ｄβ、Ｄβ−ＪβおよびＶα−Ｊα接合部におけるヌクレオチドの独立した付加および欠失は、ＣＤＲ３配列の多様性をさらに増加させる。これに関して、免疫適格性は、ＴＣＲの多様性に反映される。
Ｂ細胞によって発現される免疫グロブリン（Ｉｇ）は、一部の態様では、Ｈ２Ｌ２構造を形成する４つのポリペプチド鎖、２つの重鎖（ＩｇＨ）および２つの軽鎖（ＩｇＬ）からなるタンパク質である。ＩｇＨ鎖およびＩｇＬ鎖の各ペアは、ＶＬおよびＶＨ領域からなる超可変ドメイン、ならびに定常ドメインを含む。ＩｇのＩｇＨ鎖は、いくつかの型、μ、δ、γ、αおよびβのものである。個体内のＩｇの多様性は、超可変ドメインによって主に決定される。ＴＣＲと同様に、ＩｇＨ鎖のＶドメインは、ＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントのコンビナトリアル連結によって創出される。Ｉｇ遺伝子再配置のプロセスの間のＶＨ−ＤＨ、ＤＨ−ＪＨおよびＶＨ−ＪＨ接合部におけるヌクレオチドの独立した付加および欠失は、超可変ドメイン配列の多様性をさらに増加させる。ここで、免疫適格性は、Ｉｇの多様性に反映される。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗原への抗体の結合に関与する、抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。ネイティブ抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）は一般に、類似の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つのＣＤＲを含む（例えば、Kindtら Kuby Immunology、第６版、W.H. Freeman and Co.、９１頁（２００７年）を参照のこと）。単一のＶＨまたはＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原と結合する抗体は、それぞれ、相補的なＶＬまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングするために、抗原と結合する抗体由来のＶＨまたはＶＬドメインを使用して単離され得る。例えば、Portolanoら、J. Immunol. １５０巻：８８０〜８８７頁（１９９３年）；Clarksonら、Nature ３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）を参照のこと。
「親和性部分」とは、標的抗原と相互作用する親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの部分を指す。例示の親和性部分には、抗体、ペプチド、タンパク質、アプタマー、小分子、薬物、細胞、ＭＨＣなどが含まれる。
「超可変領域」とは、抗原結合を担う、抗体またはＴＣＲのアミノ酸残基を指す。この超可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲ由来のアミノ酸残基を含む。フレームワークまたはＦＲ残基は、本明細書で定義されるように、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
提供される抗体のなかでも特に、抗体断片が挙げられる。「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原と結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、抗体は、可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域を含む単鎖抗体断片、例えば、ｓｃＦｖである。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部分、または抗体の軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部分を含む抗体断片である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である。
抗体断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化、ならびに組換え宿主細胞による産生が含まれるがこれらに限定されない種々の技術によって作製され得る。一部の実施形態では、これらの抗体は、組換え産生された断片、例えば、天然に存在しない配置を含む断片、例えば、合成リンカー、例えばペプチドリンカーによって連結された２もしくはそれよりも多くの抗体領域もしくは鎖を有する断片、および／または天然に存在するインタクトな抗体の酵素消化によっては産生されない可能性がある断片である。一部の態様では、これらの抗体断片は、ｓｃＦｖである。
抗原結合性断片を含むＴＣＲ断片もまた提供される。一部の実施形態では、ＴＣＲは、その抗原結合性部分、例えば、完全可溶性ＴＣＲと呼ばれ得る、その膜貫通および／または細胞質領域（単数または複数）を含まない全長ＴＣＲのバリアントである。一部の実施形態では、ＴＣＲは、二量体ＴＣＲ（ｄＴＣＲ）である。一部の実施形態では、ＴＣＲは、単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）、例えば、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ０３／０２０７６３、ＷＯ０４／０３３６８５またはＷＯ２０１１／０４４１８６に記載されるような構造を有するｓｃＴＣＲである。ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、ベータ鎖可変領域に連結されたアルファ鎖可変領域を含む単鎖ＴＣＲ断片、例えば、ｓｃＴｖである。一部の実施形態では、ｓｃＴｖは、ｓｃＦｖとも呼ばれる。
単鎖ＦｖまたはｓｃＦｖとは、一部の態様では、抗体の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン、またはＴＣＲの可変アルファもしくはガンマ鎖（ＶαもしくはＶγ）および可変ベータもしくはデルタ鎖（ＶβもしくはＶδ）ドメインを含む抗体またはＴＣＲ断片を指し、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、抗原結合のための所望の構造をｓＦｖが形成するのを可能にするポリペプチドリンカーを、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間、またはＶαドメインとＶβドメインとの間、またはＶγドメインとＶδドメインとの間にさらに含む。
ダイアボディとは、一部の態様では、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体および／またはＴＣＲ断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中のＶＬに接続されたＶＨ、または同じポリペプチド鎖（Ｖα−Ｖβ）中のＶβに接続されたＶα、または同じポリペプチド鎖（Ｖγ−Ｖδ）中のＶδに接続されたＶγを含む。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、それらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合し、２つの抗原結合部位を創出するように強いられる。例示のダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４０９７およびＷＯ９３１１１１６１中により完全に記載されている。
二特異性抗体または二特異性ＴＣＲとは、一部の態様では、２つの異なる型の抗原に対する特異性を示す抗体またはＴＣＲを指す。これらの用語には、本明細書で使用する場合、標的抗原に対する、および特定の組織への送達を促進する別の標的に対する結合特異性を示す抗体およびＴＣＲが具体的に含まれるがこれらに限定されない。同様に、多特異性抗体およびＴＣＲは、２またはそれよりも多くの結合特異性を有する。
直鎖抗体または直鎖ＴＣとは、一部の態様では、抗原結合性領域の対を形成するタンデムＦｄセグメント（例えば、ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１またはＶα−Ｃα１−Ｖα−Ｃα１）の対を指す。直鎖抗体およびＴＣＲは、例えば、Zapataら、Protein Eng. ８巻（１０号）：１０５７〜１０６２頁（１９９５年）に記載されるように、二特異性または単一特異性であり得る。
抗原結合性ドメインとは、一部の態様では、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体またはＴＣＲの１つまたは複数の断片を指す。かかる用語内に含まれる抗体断片の非限定的な例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）ｓｃＦｖを含む、抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインを含むＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインを含むｄＡｂ断片（Wardら、（１９８９年）Nature ３４１巻：５４４ ５４６頁）；ならびに（ｖｉ）単離されたＣＤＲが含まれるがこれらに限定されない。さらに、単一の重鎖および単一の軽鎖を含む抗体、または単一のアルファ鎖もしくは単一のベータ鎖を有するＴＣＲが、この定義に含まれる。
「Ｆ（ａｂ’）２」および「Ｆａｂ’」部分は、ペプシンおよびパパインなどのプロテアーゼでＩｇを処理することによって産生され得、これらには、２つの重鎖の各々中のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の近傍で免疫グロブリンを消化することによって生成される抗体断片が含まれる。例えば、パパインは、２つの重鎖の各々中のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の上流でＩｇＧを切断して、ＶＬおよびＣＬから構成される軽鎖ならびにＶＨおよびＣＨγ１（重鎖の定常領域中のγ１領域）から構成される重鎖断片が、それらのＣ末端領域においてジスルフィド結合を介して接続される、２つの相同な抗体断片を生成する。これら２つの相同な抗体断片の各々は、’Ｆａｂ’と呼ばれる。ペプシンもまた、２つの重鎖の各々中のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の下流でＩｇＧを切断して、２つの上述の’Ｆａｂ’がヒンジ領域において接続される断片よりも、わずかに大きい抗体断片を生成する。この抗体断片は、Ｆ（’ａｂ’）２と呼ばれる。Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。’Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステイン（単数または複数）を含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における数個の残基の付加により、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（単数または複数）が遊離チオール基を有するＦａｂ’についての本明細書での命名である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元々、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生される。
Ｆｖとは、一部の態様では、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む抗体またはＴＣＲ断片を指す。この領域は、緊密に非共有結合的に会合した、１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインまたは１つのＴＣＲα鎖および１つのＴＣＲβ鎖または１つのＴＣＲγ鎖および１つのＴＣＲδ鎖の二量体からなる。この構成では、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体またはＶα−Ｖβ二量体またはＶγ−Ｖδ二量体の表面上の抗原結合部位を規定する。集合的に、ＶＨおよびＶＬ鎖またはＶα−Ｖβ鎖またはＶγ−Ｖδ鎖の各々由来のＣＤＲのうち１つまたは複数の組合せは、抗体またはＴＣＲに抗原結合特異性を付与する。例えば、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３は、レシピエントの選択された抗体、ＴＣＲまたはそれらの抗原結合性断片のＶＨおよびＶＬ鎖またはＶαおよびＶβ鎖またはＶγ−Ｖδ鎖に移入された場合に、抗体またはＴＣＲに抗原結合特異性を付与するのに十分であり得、ＣＤＲのこの組合せは、結合、親和性などについて試験され得ることが理解される。単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、抗原を認識し抗原と結合する能力を有するが、第２の可変ドメインと組み合わせた場合よりも低い親和性である可能性が高い。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ）は、別々の遺伝子によってコードされるが、これらは、ＶＬおよびＶＨまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ鎖領域が対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；Birdら（１９８８年）Science ２４２巻：４２３〜４２６頁；Hustonら（１９８８年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５巻：５８７９〜５８８３頁；およびOsbournら（１９９８年）Nat. Biotechnol. １６巻：７７８頁）としてそれらが作製されることを可能にする合成リンカーによって、組換え方法を使用して連結され得る。かかるｓｃＦｖもまた、抗体の用語「抗原結合性部分」内に包含される意図である。特異的ｓｃＦｖの任意のＶＨおよびＶＬ配列は、完全なＩｇ（例えば、ＩｇＧ）分子または他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成するために、Ｆｃ領域のｃＤＮＡまたはゲノム配列に連結され得る。ＶＨおよびＶＬは、タンパク質化学または組換えＤＮＡ技術のいずれかを使用する、Ｆａｂ、ＦｖまたはＩｇの他の断片の生成においても使用され得る。
抗原結合性ポリペプチドには、例えば、ラクダ科動物およびサメ由来の抗体などの、重鎖二量体もまた含まれ得る。ラクダ科動物抗体およびサメ抗体は、Ｖ様およびＣ様ドメインの２つの鎖のホモ二量体対を含む（どちらも軽鎖を有さない）。ラクダ科動物における重鎖二量体ＩｇＧのＶＨ領域は、軽鎖と疎水性相互作用しないので、軽鎖と通常接触する重鎖中の領域は、ラクダ科動物では親水性アミノ酸残基に変化される。重鎖二量体ＩｇＧのＶＨドメインは、ＶＨＨドメインと呼ばれる。サメＩｇ−ＮＡＲは、１つの可変ドメイン（Ｖ−ＮＡＲドメインと呼ばれる）および５つのＣ様定常ドメイン（Ｃ−ＮＡＲドメイン）のホモ二量体を含む。ラクダ科動物では、抗体レパートリーの多様性は、ＶＨまたはＶＨＨ領域中のＣＤＲ１、２および３によって決定される。ラクダＶＨＨ領域中のＣＤＲ３は、平均１６アミノ酸の、その比較的長い長さを特徴とする（Muyldermansら、１９９４年、Protein Engineering ７巻（９号）：１１２９頁）。
「ヒト化」抗体は、全てまたは実質的に全てのＣＤＲアミノ酸残基が非ヒトＣＤＲに由来し、全てまたは実質的に全てのＦＲアミノ酸残基がヒトＦＲに由来する抗体である。ヒト化抗体は、任意選択で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含み得る。非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、親非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しつつ、ヒトに対する免疫原性を典型的には低減させるためにヒト化を受けた非ヒト抗体のバリアントを指す。一部の実施形態では、ヒト化抗体中の一部のＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
提供される抗体のなかでも特に、ヒト抗体が挙げられる。「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞、またはヒト抗体レパートリーもしくはヒト抗体ライブラリーなどの他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト供給源によって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。この用語は、非ヒト抗原結合性領域を含む非ヒト抗体のヒト化形態、例えば、全てまたは実質的に全てのＣＤＲが非ヒトであるものを排除する。
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体、またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る。かかる動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換える、または染色体外に存在するもしくは動物の染色体中にランダムに組み込まれる、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部分を含む。かかるトランスジェニック動物では、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般に、不活化されている。ヒト抗体はまた、ヒトレパートリーに由来する抗体コード配列を含む、ファージディスプレイライブラリーおよび無細胞ライブラリーを含むヒト抗体ライブラリーに由来し得る。
提供される抗体のなかでも特に、モノクローナル抗体断片を含むモノクローナル抗体が挙げられる。用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用する場合、実質的に均一な抗体の集団に由来する抗体またはかかる集団内の抗体を指す、即ち、集団を構成する個々の抗体は、天然に存在する変異を含むまたはモノクローナル抗体調製物の産生の間に生じる可能なバリアントを除いて同一であり、かかるバリアントは一般に、微量で存在する。異なるエピトープに対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、ある抗原上の単一のエピトープに対するものである。この用語は、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈すべきではない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマからの生成、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイおよび他の抗体ディスプレイ法が含まれるがこれらに限定されない種々の技術によって作製され得る。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために相互交換可能に使用され、最小の長さに制限されない。提供される抗体および抗体鎖ならびに他のペプチド、例えばリンカーおよび結合性ペプチドを含むポリペプチドは、天然および／または非天然のアミノ酸残基を含むアミノ酸残基を含み得る。これらの用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアル酸付加、アセチル化、リン酸化などもまた含む。一部の態様では、ポリペプチドは、タンパク質が所望の活性を維持する限り、ネイティブまたは天然の配列に対する改変を含んでもよい。これらの改変は、部位特異的変異誘発などを介して計画的であり得、またはタンパク質を産生する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅に起因したエラーなどを介して偶発的であり得る。
「生殖系列配列」とは、生殖系列（一倍体配偶子およびそれらが形成される二倍体細胞）由来の遺伝子配列を指す。生殖系列ＤＮＡは、単一のＩｇ重鎖もしくは軽鎖、または単一のＴＣＲαもしくはＴＣＲβ鎖、または単一のＴＣＲγもしくはＴＣＲδ鎖をコードする複数の遺伝子セグメントを含む。これらの遺伝子セグメントは、生殖細胞中に保有されるが、機能的遺伝子へと配置されるまで、転写および翻訳することができない。骨髄におけるＢ細胞およびＴ細胞の分化の間に、これらの遺伝子セグメントは、１０８よりも大きい特異性を生じることが可能なダイナミックな遺伝子系によってランダムにシャッフルされる。これらの遺伝子セグメントのほとんどは、生殖系列データベースによって公開および収集されている。
親和性とは、２つの薬剤の可逆的結合についての平衡定数を指し、ＫＤとして表される。リガンドに対する結合性タンパク質の親和性、例えば、エピトープに対する抗体の親和性、または例えば、ＭＣＨ−ペプチド複合体に対するＴＣＲの親和性は、例えば、約１００ナノモル濃度（ｎＭ）〜約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ〜約１ピコモル濃度（ｐＭ）、または約１００ｎＭ〜約１フェムトモル濃度（ｆＭ）であり得る。用語「アビディティー」とは、希釈後の解離に対する、２またはそれよりも多くの薬剤の複合体の抵抗性を指す。
エピトープとは、一部の態様では、抗体またはＴＣＲの可変領域結合ポケットとの結合相互作用を形成することが可能な、抗原または他の高分子の一部分を指す。かかる結合相互作用は、１つまたは複数のＣＤＲの１つまたは複数のアミノ酸残基との分子間接触として顕在化され得る。抗原結合には、例えば、ＣＤＲ３、ＣＤＲ３対、または一部の例では、ＶＨおよびＶＬ鎖の最大で６つ全てのＣＤＲの相互作用が関与し得る。エピトープは、直鎖ペプチド配列であり得る（即ち、「連続的」）、または非隣接アミノ酸配列から構成され得る（即ち、「コンフォメーション」または「不連続的」）。抗体またはＴＣＲは、１つまたは複数のアミノ酸配列を認識できる；したがって、エピトープは、１つよりも多くの別個のアミノ酸配列を規定できる。一部の態様では、ＴＣＲは、ＭＨＣとの関連で１つまたは複数のアミノ酸配列またはエピトープを認識できる。抗体およびＴＣＲによって認識されるエピトープは、当業者に周知のペプチドマッピングおよび配列分析技術によって決定され得る。結合相互作用は、ＣＤＲの１つまたは複数のアミノ酸残基との分子間接触として顕在化される。
一部の実施形態では、特異的結合を有する抗体またはＴＣＲに対する言及は、ある抗体またはＴＣＲが、抗体またはＴＣＲによって認識されるエピトープを含む抗原以外の分子に対するいずれの顕著な結合も示さない状況を指す。この用語は、例えば、抗原結合性ドメインが、いくつかの抗原によって保有される特定のエピトープに特異的である場合にも適用可能であり、この場合、選択された抗体、ＴＣＲ、または抗原結合性ドメインを保有するそれらの抗原結合性断片は、エピトープを保有する種々の抗原に結合できる。用語「優先的に結合する」または「特異的に結合する」とは、抗体、ＴＣＲまたはそれらの断片が、無関係のアミノ酸配列に結合する場合よりも高い親和性でエピトープに結合し、このエピトープを含む他のポリペプチドと交差反応性である場合には、ヒト使用への投与のために製剤化されるレベルにおいてそれらが毒性でないことを意味する。一態様では、かかる親和性は、無関係のアミノ酸配列に対する抗体、ＴＣＲまたはそれらの断片の親和性よりも、少なくとも１倍大きい、少なくとも２倍大きい、少なくとも３倍大きい、少なくとも４倍大きい、少なくとも５倍大きい、少なくとも６倍大きい、少なくとも７倍大きい、少なくとも８倍大きい、少なくとも９倍大きい、１０倍大きい、少なくとも２０倍大きい、少なくとも３０倍大きい、少なくとも４０倍大きい、少なくとも５０倍大きい、少なくとも６０倍大きい、少なくとも７０倍大きい、少なくとも８０倍大きい、少なくとも９０倍大きい、少なくとも１００倍大きい、または少なくとも１０００倍大きい。用語「結合」とは、例えば、生理的条件下での共有結合、静電、疎水性、ならびにイオン性および／または水素結合相互作用に起因する２つの分子間の直接的会合を指し、これには、相互作用、例えば、塩架橋および水架橋、ならびに結合の任意の他の従来の手段が含まれる。
用語「結合」とは、例えば、生理的条件下での共有結合、静電、疎水性、ならびにイオン性および／または水素結合相互作用に起因する２つの分子間の直接的会合を指し、これには、相互作用、例えば、塩架橋および水架橋、ならびに結合の任意の他の従来の手段が含まれる。
一部の態様では、用語「四量体」は、ストレプトアビジンの単一の分子に結合している４つのサブユニットを含む複合体を指すことができ、それは細胞の集団に結合することができ、したがってそれを識別できる。サブユニットは、ＭＨＣ−ペプチド複合体であってよい。サブユニットは、関連しているペプチドのないＭＨＣであってもよい。サブユニットは、Ｂ細胞受容体抗原であってもよい。四量体によって識別される細胞の集団は、四量体のサブユニットに結合する、ＴＣＲまたはＢＣＲなどの受容体を発現する集団であってよい。細胞の集団は、抗原特異的Ｔ細胞であってもよい。細胞の集団は、抗原特異的Ｂ細胞であってもよい。四量体は、蛍光標識されてもよい。本明細書で使用する場合、ＭＨＣ−ペプチド四量体は、ｐＭＨＣと互換的に使用することができる。
「薬学的に許容される」とは、生理的に容認可能であり、ヒトに投与した場合にアレルギー反応または類似の有害な反応、例えば、胃の異常亢進、眩暈などを典型的には生じない、分子実体および組成物を指す。
「予防（prevention）」とは、予防（prophylaxis）、症状の発症の予防（prevention）、過剰なレベルのタンパク質と関連するまたはタンパク質活性と相関する疾患または障害の進行の予防（prevention）を指す。
「阻害」、「処置」および「処置すること」は、相互交換可能に使用され、例えば、症状の停滞、生存の延長、症状の部分的または完全な寛解、および過剰なレベルのタンパク質と関連するまたはタンパク質活性と相関する状態、疾患または障害の部分的または完全な根絶を指す。例えば、がんの処置には、がん性成長または腫瘍の停滞、部分的または完全な排除が含まれるがこれらに限定されない。処置または部分的排除には、例えば、成長または腫瘍のサイズおよび／もしくは体積における所定倍率の低減、例えば、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、またはそれらの間の任意の倍率の低減が含まれる。同様に、処置または部分的排除には、成長または腫瘍のサイズおよび／もしくは体積における、約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれらの間の任意の百分率の低減の、パーセント低減が含まれ得る。
中和抗体または中和ＴＣＲとは、一部の態様では、中和が達成される機構に関わりなく、ウイルスまたは細菌などの病原体の複製を阻害する任意の抗体またはＴＣＲを指す。
抗体レパートリーまたはＴＣＲレパートリーとは、抗体、ＴＣＲまたはそれらの断片の収集を指す。抗体レパートリーは、例えば、特定の抗体を選択するため、または特定の特性、例えば、結合能、結合特異性、胃腸輸送の能力、安定性、親和性などについてスクリーニングするために使用され得る。この用語は、例えば、ナイーブ、合成および半合成ライブラリーを含む、任意の供給源由来の単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）およびＦａｂ抗体ファージディスプレイライブラリーが限定なしに含まれる抗体ファージディスプレイライブラリーなどのコンビナトリアルライブラリーの全ての形態を含む、抗体およびＴＣＲライブラリーを具体的に含む。
「標的核酸分子」、「標的ポリヌクレオチド」、「標的ポリヌクレオチド分子」とは、目的の任意の核酸を指す。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とは、二本鎖ポリヌクレオチドの相補鎖の同時プライマー伸長によるポリヌクレオチド配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅反応を指す。ＰＣＲ反応は、プライマー結合部位が隣接する鋳型ポリヌクレオチドのコピーを生成する。２つのプライマーを用いた結果は、各サイクルによって両方の鎖が複製されることによる、各サイクルによる両方の鎖の鋳型ポリヌクレオチドコピー数における指数関数的増加である。ポリヌクレオチド二重鎖は、使用されるプライマーの末端に対応する末端を有する。ＰＣＲは、鋳型ポリヌクレオチドを変性させること、プライマーをプライマー結合部位にアニーリングさせること、およびヌクレオチドの存在下でＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによってプライマーを伸長させることの、１または複数回の反復を含み得る。特定の温度、各ステップにおける持続時間、およびステップ間の変化の速度は、当業者に周知の多くの因子に依存する（McPhersonら、IRL Press、Oxford（１９９１年および１９９５年））。例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用する従来のＰＣＲでは、二本鎖鋳型ポリヌクレオチドは、＞９０℃の温度で変性され得、プライマーは、５０〜７５℃の範囲の温度でアニーリングされ得、プライマーは、７２〜７８℃の範囲の温度で伸長され得る。一部の実施形態では、ＰＣＲは、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、多重ＰＣＲなどを含む。一部の実施形態では、ＰＣＲは、ＲＴ−ＰＣＲを含まない（米国特許第５，１６８，０３８号、同第５，２１０，０１５号、同第６，１７４，６７０号、同第６，５６９，６２７号および同第５，９２５，５１７号；Mackayら、Nucleic Acids Research、３０巻：１２９２〜１３０５頁（２００２年））。ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写反応が先行するＰＣＲ反応を含み、得られたｃＤＮＡが増幅され、ネステッドＰＣＲは、第１のセットのプライマーを使用する第１のＰＣＲ反応のアンプリコンが、それらのうち少なくとも一方が第１のＰＣＲ反応のアンプリコンの内部位置に結合する第２のプライマーセットを使用する第２のＰＣＲ反応のための試料になる、二段階ＰＣＲを含む。多重ＰＣＲは、複数のポリヌクレオチド配列が同じ反応混合物中で同時にＰＣＲに供されるＰＣＲ反応を含む。ＰＣＲ反応体積は、０．２ｐＬ〜１０００μＬの間のいずれかであり得る。定量的ＰＣＲは、試料中の１つまたは複数の配列の絶対量もしくは相対量、存在量、または濃度を測定するために設計されたＰＣＲ反応を含む。定量的測定は、１つまたは複数の参照配列または標準を目的のポリヌクレオチド配列と比較することを含み得る（Freemanら、Biotechniques、２６巻：１１２〜１２６頁（１９９９年）；Becker-Andreら、Nucleic Acids Research、１７巻：９４３７〜９４４７頁（１９８９年）；Zimmermanら、Biotechniques、２１巻：２６８〜２７９頁（１９９６年）；Diviaccoら、Gene、１２２巻：３０１３〜３０２０頁（１９９２年）；Becker-Andreら、Nucleic Acids Research、１７巻：９４３７〜９４４６頁（１９８９年））。
「ヌクレオチド」、「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド残基」および「ヌクレオシド残基」とは、本明細書で使用する場合、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド残基、または増幅反応（例えば、ＰＣＲ反応）における使用に適切なプライマーの成分として機能することが可能な他の類似のヌクレオシドアナログを意味し得る。かかるヌクレオシドおよびその誘導体は、特記した場合を除き、本明細書に記載されるプライマーの構成要素として使用され得る。化学的改変が、必要に応じて、ポリメラーゼによる、デオキシグアニン、デオキシシトシン、デオキシチミジンまたはデオキシアデニンとしてのそれらの認識を妨害しないことを条件として、増幅反応におけるそれらの安定性または有用性を増強するために化学改変されたヌクレオシド誘導体または塩基の利用を妨げることを意味するものは、本出願中には存在しない。一部の実施形態では、ヌクレオチドアナログは、ハイブリッド形成を安定化し得る。一部の実施形態では、ヌクレオチドアナログは、ハイブリッド形成を不安定化し得る。一部の実施形態では、ヌクレオチドアナログは、ハイブリダイゼーションの特異性を増強し得る。一部の実施形態では、ヌクレオチドアナログは、ハイブリダイゼーションの特異性を低減させ得る。
「核酸」または文法的等価物とは、単一のヌクレオチド、または共有結合によって一緒に連結された少なくとも２つのヌクレオチドのいずれかを指す。
「ポリヌクレオチド」または文法的等価物とは、共有結合によって一緒に連結された少なくとも２つのヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、２またはそれよりも多くのヌクレオチドを含む分子を含む。ポリヌクレオチドは、プリンおよびピリミジン塩基、または他の天然のヌクレオチド塩基、化学的に改変されたもしくは生化学的に改変された非天然のヌクレオチド塩基、またはヌクレオチド塩基の誘導体を含む、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含む。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基、または改変もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含み得る。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、他の分子、例えば、別のハイブリダイズしたポリヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、またはその両方の配列を含む。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、遺伝子間ＤＮＡ（ヘテロクロマチンＤＮＡが限定なしに含まれる）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、ある配列の単離されたＤＮＡ、ある配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーが含まれる。ポリヌクレオチドは、天然の供給源から単離された、組換えの、または人工的に合成されたものであり得る。
ポリヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド、例えば、ヌクレオチドアナログまたは改変ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、非標準ヌクレオチドは、ハイブリッド形成を安定化し得る。一部の実施形態では、非標準ヌクレオチドは、ハイブリッド形成を不安定化し得る。一部の実施形態では、非標準ヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションの特異性を増強し得る。一部の実施形態では、非標準ヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションの特異性を低減させ得る。非標準ヌクレオチド改変の例には、２’Ｏ−Ｍｅ、２’Ｏ−アリル、２’Ｏ−プロパルギル、２’Ｏ−アルキル、２’フルオロ、２’アラビノ、２’キシロ、２’フルオロアラビノ、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデート（phosphoroamidate）、２’アミノ、５−アルキル置換ピリミジン、３’デオキシグアノシン、５−ハロ置換ピリミジン、アルキル置換プリン、ハロ置換プリン、二環式ヌクレオチド、２’ＭＯＥ、ＰＮＡ分子、ＬＮＡ−分子、ＬＮＡ様分子、ジアミノプリン、Ｓ２Ｔ、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン（xantine）、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（beta-D-galactosylqueosine）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン（beta-D-mannosylqueosine）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｄ４６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウブトキソシン（wybutoxosine）、シュードウラシル、キューオシン（queosine）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６−ジアミノプリン、およびそれらの誘導体が含まれる。
「対象」、「個体」、「宿主」または「患者」とは、哺乳動物などの生きた生物を指す。対象および宿主の例には、ウマ、雌ウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス（例えば、ヒト化マウス）、スナネズミ、非ヒト霊長類（例えば、マカク）、ヒトなど、例えば、非哺乳動物脊椎動物、例えば、鳥類（例えば、ニワトリまたはアヒル）、魚類（例えば、サメ）またはカエル（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ）、および非哺乳動物無脊椎動物を含む非哺乳動物、ならびにそれらのトランスジェニック種が含まれるがこれらに限定されない。ある特定の態様では、対象とは、単一の生物（例えば、ヒト）を指す。ある特定の態様では、あるいは、研究のための共通の免疫因子および／もしくは疾患を有する小さいコホート、ならびに／または疾患を有さない個体のコホート（例えば、陰性／正常対照）を構成する個体の群が提供される。試料が取得される対象は、疾患および／または障害（例えば、１つまたは複数のアレルギー、感染、がんまたは自己免疫障害など）に苦しみ得、疾患に罹患していない陰性対照対象に対して比較され得る。
「キット」とは、本明細書に開示される方法を実行するために材料または試薬を送達するための送達系を指す。一部の実施形態では、キットには、反応試薬（例えば、適切な容器中のプローブ、酵素など）および／または支持材料（例えば、アッセイを実行するための緩衝液、書面の指示書など）の貯蔵、１つの位置から別の位置へのそれらの輸送または送達を可能にする系が含まれる。例えば、キットは、適切な反応試薬および／または支持材料を含む１つまたは複数のエンクロージャー（例えば、箱）を含む。かかる内容物は、意図したレシピエントに一緒にまたは別々に送達され得る。例えば、第１の容器は、アッセイにおける使用のための酵素を含み得るが、第２の容器は、複数のプライマーを含む。
ポリペプチドとは、一部の態様では、少なくとも２つのアミノ酸を含む分子を指す。一部の実施形態では、ポリペプチドは、単一のペプチドからなる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、２またはそれよりも多くのペプチドを含む。例えば、ポリペプチドは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００のペプチドまたはアミノ酸を含み得る。ポリペプチドの例には、アミノ酸鎖、タンパク質、ペプチド、ホルモン、ポリペプチド、サッカライド、脂質、糖脂質、リン脂質、抗体、酵素、キナーゼ、受容体、転写因子およびリガンドが含まれるがこれらに限定されない。
試料とは、一部の態様では、生物学的、環境的、医学的な、対象の、もしくは患者の試料、または標的ポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドを含む試料を指す。
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、親和性分子部分（例えば、抗体またはＭＨＣ−ペプチド複合体）およびオリゴヌクレオチド部分を含む。親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドの抗原同定配列は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが特異的に相互作用する１種または複数の抗原を同定するために使用され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、コンジュゲートの親和性部分に共有結合的に付着される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、コンジュゲートの親和性部分に非共有結合的に付着される。親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであってよい。四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、四量体（例えば、Ｂ細胞受容体抗原四量体またはＭＨＣ−ペプチド複合体四量体）およびオリゴヌクレオチド部分を含むことができる。四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドの抗原同定配列は、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが特異的に相互作用する１種または複数の抗原を同定するために使用され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、コンジュゲートの親和性部分または四量体に共有結合的に付着される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、コンジュゲートの親和性部分または四量体に非共有結合的に付着される。
一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、単一の親和性部分を含む。一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、多価親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートである。例えば、多価親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド（単数または複数）にコンジュゲートされた少なくとも２つの親和性分子の抗原結合性ドメインを含み得る。例えば、多価親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされた少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、２００、５００または１，０００の親和性分子の抗原結合性ドメインを含み得る。一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、単一のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、２またはそれよりも多くのオリゴヌクレオチドを含む。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、１つまたは複数の親和性分子（例えば、抗体またはＭＨＣ−ペプチド複合体）にコンジュゲートされた少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、２００、５００または１，０００のオリゴヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、同じ抗原ＩＤ（ＡＩＤ）配列を含む２またはそれよりも多くのオリゴヌクレオチドを含む。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、同じＡＩＤ配列を含む少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、２００、５００または１，０００のオリゴヌクレオチドを含み得る。
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分（またはドメイン）は、標的抗原に結合する親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの領域、分子、ドメイン、部分（portion）、断片または部分（moiety）を含む。したがって、親和性部分は、所与の標的抗原、例えば、細胞表面タンパク質の細胞外ドメインに結合するまたは特異的に結合する能力を付与する。一部の実施形態では、親和性部分は、異なる抗原ＩＤ配列を含む別の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの抗原とは実質的に相互作用しない。一部の実施形態では、親和性部分は、核酸を含み得る分子、または標的抗原への親和性部分の結合を実質的に消失させることなくオリゴヌクレオチドが付着され得る分子である。
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、核酸分子であり得る、またはタンパク質性であり得る。親和性部分には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、小分子（例えば、薬物）、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、抗体およびその断片、ＴＣＲおよびその断片、ウイルス、ウイルス粒子、細胞、それらの断片、ならびにそれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない（例えば、Fredrikssonら、（２００２年）Nat Biotech ２０巻：４７３〜７７頁；Gullbergら、（２００４年）PNAS、１０１巻：８４２０〜２４頁を参照のこと）。例えば、親和性部分は、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、１もしくは複数の二本鎖領域および１もしくは複数の一本鎖領域を含むＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、小分子、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片、ＴＣＲ、ＴＣＲ断片、ＭＨＣ、ＭＨＣ−ペプチド複合体、ウイルス粒子、細胞、またはそれらの任意の組合せであり得る。
一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、細胞を標的化する。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、Ｔ細胞またはＢ細胞を標的化し得る。一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、特定の細胞型または細胞サブセットを標的化する。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、ＣＤ４−Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞を標的化し得る。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、特定の抗原を特異的に認識するＴＣＲを含むＴ細胞を標的化し得る。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、特定のＭＨＣ−ペプチド複合体を特異的に認識するＴＣＲを含むＴ細胞を標的化し得る。
一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、細胞の標的の細胞外ドメインを標的化する。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、細胞の受容体、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞外ドメインを標的化し得る。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、細胞の受容体の細胞外ドメインのグリコシル化された領域を標的化し得る。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、細胞の受容体の細胞外ドメインのリガンド結合性領域を標的化し得る。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、リガンドに結合しない細胞の受容体の細胞外ドメインの領域を標的化し得る。
一部の実施形態では、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、ＭＨＣ−ペプチド複合体を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣ−ペプチド複合体はＴＣＲを標的化する。一部の実施形態では、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、Ｂ細胞受容体抗原を含む。一部の実施形態では、Ｂ細胞受容体抗原は、ＢＣＲを標的化する。
タンパク質
一部の実施形態では、親和性部分は、ポリペプチド、タンパク質、またはそれらの任意の断片である。一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、タンパク質である。一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、ペプチドである。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、抗体、例えば、抗体の結合性ドメインであり得る。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、ＭＨＣ−ペプチド複合体であり得る。例えば、親和性部分は、精製されたポリペプチド、単離されたポリペプチド、融合タグ化ポリペプチド、細胞またはウイルスもしくはビリオンの膜に付着させたポリペプチド、あるいはそれらにまたがるポリペプチド、細胞質タンパク質、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、キナーゼ、ホスファターゼ、アロマターゼ、ヘリカーゼ、プロテアーゼ、オキシドレダクターゼ、レダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、グリコシラーゼ、細胞外マトリックスタンパク質、リガーゼ、イオントランスポーター、チャネル、ポア、アポトーシスタンパク質、細胞接着タンパク質、病原性タンパク質、異常に発現されるタンパク質、転写因子、転写調節因子、翻訳タンパク質、シャペロン、分泌型タンパク質、リガンド、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、核タンパク質、受容体、膜貫通受容体、シグナル伝達因子、抗体、膜タンパク質、膜内在性タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞壁タンパク質、球状タンパク質、線維状タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、染色体タンパク質、それらの任意の断片、またはそれらの任意の組合せであり得る。一部の実施形態では、親和性部分は、異種ポリペプチドである。一部の実施形態では、親和性部分は、トランスフェクションなどの分子技術を使用して細胞において過剰発現されるタンパク質である。一部の実施形態では、親和性部分は、組換えポリペプチドである。例えば、親和性部分は、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、哺乳動物または昆虫細胞において産生される試料（例えば、生物によって過剰発現されるタンパク質）を含み得る。一部の実施形態では、親和性部分は、変異、挿入、欠失または多型を含むポリペプチドである。一部の実施形態では、親和性部分は、抗原、例えば、生物を免疫化するため、または生物において免疫応答を生成するため、例えば、抗体産生のために使用されるポリペプチドである。
一部の実施形態では、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、四量体である。一部の実施形態では、四量体のサブユニットは、タンパク質である。一部の実施形態では、四量体のサブユニットは、ペプチドである。一部の実施形態では、四量体のサブユニットは、タンパク質および／またはペプチドの複合体である。一部の実施形態では、タンパク質および／またはペプチドの複合体は、共有結合的または非共有結合的に連結および／または関連してもよい。例えば、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、ＭＨＣ−ペプチド複合体であってよい。ＭＨＣ−ペプチド複合体中のペプチドの一部の非限定的な例は、精製されたポリペプチド、単離されたポリペプチド、融合タグ化ポリペプチド、細胞またはウイルスもしくはビリオンの膜に付着させたポリペプチド、あるいはそれらにまたがるポリペプチド、細胞質タンパク質、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、キナーゼ、ホスファターゼ、アロマターゼ、ヘリカーゼ、プロテアーゼ、オキシドレダクターゼ、レダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、グリコシラーゼ、細胞外マトリックスタンパク質、リガーゼ、イオントランスポーター、チャネル、ポア、アポトーシスタンパク質、細胞接着タンパク質、病原性タンパク質、異常に発現されるタンパク質、転写因子、転写調節因子、翻訳タンパク質、シャペロン、分泌型タンパク質、リガンド、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、核タンパク質、受容体、膜貫通受容体、シグナル伝達因子、抗体、膜タンパク質、膜内在性タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞壁タンパク質、球状タンパク質、線維状タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、染色体タンパク質、それらの任意の断片、またはそれらの任意の組合せに由来するペプチドであってよい。一部の実施形態では、ペプチドは、疾患関連抗原に由来する。例えば、一部の態様では、ペプチドは、腫瘍関連抗原、例えば普遍的腫瘍抗原、ウイルス関連抗原、自己免疫関連抗原、炎症関連抗原、細菌関連抗原またはそれらの任意の組合せに由来するかまたは由来することができる。一部の実施形態では、親和性部分は、トランスフェクションなどの分子技術を使用して細胞中で過剰発現されるタンパク質である。一部の実施形態では、親和性部分は、組換えポリペプチドである。例えば、親和性部分は、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、哺乳動物または昆虫細胞において産生される試料（例えば、生物体によって過剰発現されるタンパク質）を含み得る。一部の実施形態では、親和性部分は、変異、挿入、欠失または多型を含有するポリペプチドである。一部の実施形態では、親和性部分は、抗原、例えば、生物を免疫化するため、または生物において免疫応答を生成するため、例えば、抗体産生のために使用されるポリペプチドである。別の例として、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、Ｂ細胞受容体抗原であってよい。Ｂ細胞受容体抗原は、四量体のサブユニットであってよい。
抗体
一部の実施形態では、親和性部分は、抗体、例えば、抗体の結合性断片である。抗体は、別の分子の特定の空間的および極性機構に特異的に結合し得る。例えば、抗体は、精製された抗体、単離された抗体、抗体の断片、または融合タグ化抗体であり得る。一部の実施形態では、抗体は、トランスフェクションなどの分子技術を使用して細胞において過剰発現される。一部の実施形態では、抗体は、組換え抗体である。抗体は、細胞表面分子などの別の分子の特定の空間的および極性機構に特異的に結合し得る。抗体は、モノクローナル、ポリクローナルまたは組換え抗体であり得、当技術分野で周知の技術、例えば、宿主の免疫化および血清（ポリクローナル）の収集によって、または連続的ハイブリッド細胞株を調製し、分泌されたタンパク質（モノクローナル）を収集することによって、または天然の抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列を少なくともコードするヌクレオチド配列もしくはその変異誘発バージョンをクローニングし発現させることによって、調製され得る。さらに、凝集物、ポリマー、および免疫グロブリンまたはそれらの断片のコンジュゲートは、特定の分子に対する結合親和性が維持される限り、必要に応じて使用され得る。抗体断片の例には、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）２断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Wardら、（１９８９年）Nature ３４１巻：５４４〜４６頁）；ならびに単離されたＣＤＲ、ならびにＶＬ領域およびＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単鎖断片（ｓｃＦｖ）（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Birdら、（１９８８年）Science ２４２巻：４２３〜２６頁；およびHustonら、（１９８８年）PNAS ８５巻：５８７９〜８３頁を参照のこと）が含まれる。したがって、抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂなどが含まれる。２つのドメインＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、これらは、単一のタンパク質鎖としてそれらが作製されることを可能にする人工ペプチドリンカーによって、組換え方法を使用して連結され得る。かかる単鎖抗体は、１つまたは複数の抗原結合性部分を含む。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を使用して取得され得、断片は、インタクトな抗体と同じ様式で、有用性についてスクリーニングされ得る。抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、単離された、イヌ、ネコ、ロバ、ヒツジ、任意の植物、動物または哺乳動物であり得る。
ＭＨＣ
一部の場合における細胞性免疫系による抗原構造の認識は、表面発現される主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によって媒介される。細胞、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、一部の態様では、ＭＨＣ分子の特異的ペプチド結合フォールド中に存在し得る、したがって、一部の態様ではＴ細胞によって認識され得る短いペプチドへと、抗原などのタンパク質をプロセシングする。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によるエピトープ（ペプチド断片）の特異的認識は一般に、ＭＨＣ分子との同時相互作用を必要とする。安定した多量体複合体は、結合したペプチドを含有するＭＨＣタンパク質サブユニットを用いて調製され得る。ＭＨＣ−抗原複合体は、それらの抗原受容体を介して複合体を認識するＴ細胞と共に安定した構造体を形成し得、それによって、抗原を特異的に認識するＴ細胞への結合を可能にする。親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの、または四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、Ｔ細胞を標的化し得る。親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、Ｔ細胞を特異的に標的化し得る。親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの、または四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、Ｔ細胞受容体またはＴＣＲ様分子、例えば、ＴＣＲ様ＣＡＲを標的化し得る。親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、Ｔ細胞受容体を特異的に標的化し得る。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの、または四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、ＭＨＣ分子を含み得る。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの、または四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、ＭＨＣ−ペプチド複合体（ＭＨＣ−ｐ）を含み得る。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの、または四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、式（Ａ−Ｂ−Ｐ）ｎを有することができ、式中、ＡはＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩタンパク質のα鎖であり、ＢはクラスＩＩ ＭＨＣタンパク質のβ鎖またはＭＨＣクラスＩタンパク質についてはβ２ミクログロブリンであり、Ｐはペプチドである。一部の実施形態では、ｎは１である。一部の実施形態では、ｎは２より大きいか２と等しい。ＭＨＣタンパク質サブユニットは、可溶性形態であってよい。例えば、可溶性ＭＨＣタンパク質サブユニットは、膜貫通ドメインまたはその部分の欠失によって、ネイティブＭＨＣタンパク質サブユニットから誘導され得る。一部の実施形態では、ＭＨＣタンパク質サブユニットは、細胞質ドメインを含まない。一部の実施形態では、ＭＨＣタンパク質サブユニットは、膜貫通ドメインを含まない。
ペプチド（Ｐ）は、クラスＩ ＭＨＣタンパク質との複合体については約６〜１２アミノ酸長、例えば、約８〜１０アミノ酸であり得る。ペプチドは、クラスＩＩ ＭＨＣタンパク質との複合体については約６〜２０アミノ酸長、例えば、約１０〜１８アミノ酸であり得る。ペプチドは、広範な種々のタンパク質に由来する配列を有し得る。ペプチドは、Ｔ細胞エピトープであり得る。いくつかの抗原由来のエピトープ配列が、当技術分野で公知である。あるいは、エピトープ配列は、ネイティブＭＨＣタンパク質に結合したペプチドを単離し、配列決定することによって、標的配列からの一連のペプチドの合成、次いで、異なるペプチドに対して反応性のＴ細胞についてアッセイすることによって、または異なるペプチドを用いて一連の結合性複合体を生成し、Ｔ細胞結合を定量することによって、実験的に決定され得る。断片の調製、配列を識別すること、および最小配列を識別することは、米国特許第５，０１９，３８４号およびそこで引用される参考文献に記載されている。ペプチドは、種々の方法で調製され得る。簡便には、これらは、自動合成器を使用する従来技術によって合成され得、または手動で合成され得る。あるいは、特定のペプチドをコードするＤＮＡ配列が調製され得、所望のペプチドを提供するためにクローニングおよび発現され得る。この場合、メチオニンが最初のアミノ酸であり得る。さらに、ペプチドは、親和性試薬による融合タンパク質の精製を可能にする、特異的結合対のうちの１つであるタンパク質への融合などの組換え方法と、その後の、通常は操作された部位におけるタンパク質分解性切断とによって生成されて、所望のペプチドを生じ得る（例えば、Driscollら（１９９３年）J. Mol. Bio. ２３２巻：３４２〜３５０頁を参照のこと）。ペプチドはまた、天然の供給源から単離され得、例えば、イオン交換材料上でのクロマトグラフィー、サイズによる分離、免疫親和性クロマトグラフィーおよび電気泳動が含まれる公知の技術によって精製され得る。
一部の実施形態では、α−サブユニットおよびβ−サブユニットは、別々に産生され、安定なヘテロ二重鎖複合体を形成するようにｉｎ ｖｉｔｒｏで会合される（例えば、Altmanら（１９９３年）またはGarbocziら（１９９２年）を参照のこと）。一部の実施形態では、α−サブユニットおよびβ−サブユニットは、単一の細胞において一緒に発現される。一部の実施形態では、α−サブユニットおよびβ−サブユニットを有する単一の分子が使用される。例えば、単鎖ヘテロ二量体は、短いペプチドリンカー、例えば、１５〜２５アミノ酸のペプチドまたはリンカーを使用して、２つのサブユニットを一緒に融合させることによって創出され得る（例えば、Bedzykら（１９９０年）J. Biol. Chem. ２６５巻：１８６１５頁を参照のこと）。可溶性ヘテロ二量体は、可溶性産物を産生するために、ネイティブヘテロ二量体の単離、およびプロテアーゼ、例えばパパインによる切断によっても産生され得る。
可溶性サブユニットは、トランケート型タンパク質をコードするＤＮＡ構築物から独立して発現され得る。発現のために、ＤＮＡ配列は、適切な発現ベクター中に挿入され得、このとき、ネイティブ転写開始領域が使用され得、または外因性転写開始領域、例えば、通常存在する染色体中の遺伝子と関連するプロモーター以外のプロモーターが使用され得る。プロモーターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで組換え方法によって、または染色体中への配列の相同組込みの結果として、導入され得る。転写開始領域は、広範な種々の発現宿主について公知である。発現宿主は、原核生物または真核生物、特に、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、サル腎臓細胞、リンパ系細胞、ヒト細胞株などを含み得る。
サブユニットは、適切な宿主細胞において発現され得、必要に応じて可溶化され得る。２つのサブユニットは、ペプチドと組み合わされ得、鎖内ジスルフィド結合したドメインを有する安定なヘテロ二量体複合体を形成するためにｉｎ ｖｉｔｒｏでフォールドすることが可能であり得る。ペプチドは、最初のフォールディング反応に含まれ得、または後のステップで空のヘテロ二量体に付加され得る。ＭＨＣ結合部位は、このペプチドの付加の前には、ペプチドなしであり得る。例外は、天然のペプチド−ＭＨＣ複合体、例えば、自己免疫攻撃の標的である細胞の表面上に存在し得るものなどによってＴ細胞を標識することが所望される場合である。ＭＨＣヘテロ二量体は、クラスＩについてはα２およびα１、またはクラスＩＩについてはα１およびβ１のいずれかの２つの膜遠位ドメインによって形成される溝中でペプチドに結合する。サブユニットおよびペプチドのフォールディングおよび会合を許容する条件は、当技術分野で公知である（例えば、Altmanら（１９９３年）およびGarbocziら（１９９２年）を参照のこと）。許容的条件の一例として、大まかに等モル量の可溶化されたαサブユニットおよびβサブユニットが、尿素の溶液中で混合される。再フォールディングは、尿素なしの緩衝溶液中への希釈または透析によって開始される。ペプチドは、約１〜３日間にわたって約ｐＨ５〜５．５で空のクラスＩＩヘテロ二量体中に負荷され、その後、中和、濃縮および緩衝液交換される。しかし、具体的なフォールディング条件は本発明の実施にとって重要でないことは、当業者によって容易に理解される。
一部の実施形態では、単量体複合体（α−β−Ｐ）は、多量体化され得る。例えば、多量体は、αサブユニットまたはβサブユニット上の特定の付着部位を介して、単量体を多価の実体に結合させることによって形成され得る。一部の実施形態では、多量体は、単量体の化学的架橋結合によって形成される。タンパク質を架橋結合させることが可能ないくつかの試薬が、当技術分野で公知であり、これには、アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’−［２’−ピリジルジチオ］プロピオンアミド）、ビス−スルホスクシンイミジルスベレート、アジプイミド酸ジメチル、酒石酸ジスクシンイミジル、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル［４−アジドフェニル］−１，３’−ジチオプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒドおよびスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレートが含まれるがこれらに限定されない。多価実体への結合のための付着部位は、天然に存在してもよく、または遺伝子操作を介して導入されてもよい。部位は、特異的結合対のメンバー、または特異的結合対のメンバーを提供するように改変されたものであり得、ここで、相補的対は、多様な特異的結合部位を有する。相補的結合メンバーへの結合は、化学反応、エピトープ−受容体結合またはハプテン−受容体結合であり得、ここで、ハプテンは、サブユニット鎖に連結される。好ましい実施形態では、これらのサブユニットのうち１つは、改変酵素のための認識部位を提供するアミノ酸配列に融合される。この認識配列は通常、抗原性ペプチド結合部位における潜在的な妨害を回避するために、これらのサブユニットのうち１つのカルボキシ末端の近位に融合される。簡便には、発現カセットは、認識部位をコードする配列を含む。
目的の改変酵素には、ＢｉｒＡ、種々のグリコシラーゼ、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ、タンパク質キナーゼなどが含まれる。サブユニットは、任意の都合のよい時、通常は単量体の形成後に、改変酵素と反応され得る。改変酵素によって導入される基、例えば、ビオチン、糖、リン酸、ファルネシルなどは、相補的結合対のメンバー、または相補的結合対のメンバーを提供するさらなる改変、例えば、化学的架橋結合、ビオチン化などに固有の部位を提供する。代替的戦略は、対合していないシステイン残基をサブユニットに導入し、それによって、結合に固有の化学的に反応性の部位を導入することである。付着部位はまた、天然に存在するまたは導入されたエピトープであり得、多価結合パートナーは、抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭなどである。任意の改変は、結合を干渉しない部位、例えば、Ｃ末端近位においてである。多量体形成の例示は、タンパク質基質のビオチン化を触媒する酵素ＢｉｒＡのための認識配列の導入である。次いで、ビオチン化サブユニットを有する単量体が、多価結合パートナー、例えば、極端に高い親和性でビオチンが結合するストレプトアビジンまたはアビジンに結合される。ストレプトアビジンは、４の価数を有して、（α−β−Ｐ）４の多量体を提供する。多価結合パートナーは、溶液中で遊離であり得る、または不溶性支持体に付着され得る。適切な不溶性支持体の例には、ビーズ、例えば、磁性ビーズ、メンブレンおよびマイクロタイタープレートが含まれる。これらは、典型的には、ガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、ポリサッカライド、ナイロンまたはニトロセルロース製である。不溶性支持体への付着は、結合性複合体がＴ細胞の分離に使用される場合に有用である。
Ｂ細胞受容体抗原
Ｂ細胞、例えばＢ細胞の小集団またはＢ細胞サブセットは、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）を介して抗原を認識することができる。Ｂ細胞受容体抗原のサブユニットによる四量体は、これらのＢ細胞またはＢ細胞サブセットを同定し、研究するために使用され得る。Ｂ細胞受容体抗原には、ＢＣＲを介して免疫応答を誘導することが可能なエピトープを有する任意の抗原が含まれる。例えば、Ｂ細胞受容体抗原は、対象を免疫化するために使用されている抗原であってよい。Ｂ細胞受容体抗原は、Ｂ細胞受容体抗原の小さい線状ペプチド部分を使用して四量体に作製することができ、ペプチド部分はＢＣＲエピトープを含有する。小さい線状化ペプチド部分は、次いで、発現ベクター中のビオチン化部位で発現させることができ、四量体において使用される単量体として精製させ得る。次いで、ビオチン化サブユニットを有する単量体が、多価結合パートナー、例えば、極端に高い親和性でビオチンが結合するストレプトアビジンまたはアビジンに結合させることができる。ストレプトアビジンは、４の価数を有し、Ｂ細胞受容体抗原の四量体を提供する。生じる四量体は、サイズ排除カラムを使用して精製できる。
細胞
一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、細胞である。例えば、親和性部分は、インタクトな細胞、化合物（例えば、薬物）で処理された細胞、固定された細胞、溶解細胞、またはそれらの任意の組合せであり得る。一部の実施形態では、親和性部分は、単一の細胞である。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、Ｔ細胞またはＢ細胞であり得る。一部の実施形態では、親和性部分は、複数の細胞である。一部の実施形態では、親和性部分は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、親和性部分は、Ｂ細胞である。一部の実施形態では、親和性部分は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、特定の細胞型または細胞サブセットである。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、特定の抗原を特異的に認識するＴＣＲを含むＴ細胞であり得る。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、特定のＭＨＣ−ペプチド複合体を特異的に認識するＴＣＲを含むＴ細胞であり得る。一部の実施形態では、親和性部分は、細胞である。
小分子
一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、薬物などの小分子である。例えば、小分子は、大環状分子、阻害剤、薬物または化学化合物であり得る。一部の実施形態では、小分子は、５つ以下の水素結合ドナーを含む。一部の実施形態では、小分子は、１０個以下の水素結合アクセプターを含む。一部の実施形態では、小分子は、５００ダルトンまたはそれ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、小分子は、約１８０〜５００ダルトンの分子量を有する。一部の実施形態では、小分子は、５以下のオクタノール−水分配係数ｌｏｇ Ｐを含む。一部の実施形態では、小分子は、−０．４〜５．６の分配係数ｌｏｇ Ｐを有する。一部の実施形態では、小分子は、４０〜１３０のモル屈折率を有する。一部の実施形態では、小分子は、約２０〜約７０個の原子を含む。一部の実施形態では、小分子は、１４０オングストローム２またはそれ未満の極性表面積を有する。
核酸
一部の実施形態では、親和性部分は、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）のポリマー形態、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。ＤＮＡには、直鎖ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、ウイルス、プラスミドおよび染色体において見出される二本鎖ＤＮＡが含まれる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド親和性部分は、一本鎖、二本鎖、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、染色体、遺伝子、非コードゲノム配列、ゲノムＤＮＡ（例えば、断片化されたゲノムＤＮＡ）、精製されたポリヌクレオチド、単離されたポリヌクレオチド、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド、転写因子結合部位、ミトコンドリアＤＮＡ、リボソームＲＮＡ、真核生物ポリヌクレオチド、原核生物ポリヌクレオチド、合成されたポリヌクレオチド、ライゲーションされたポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド、核酸アナログを含むポリヌクレオチド、メチル化ポリヌクレオチド、脱メチル化ポリヌクレオチド、それらの任意の断片、またはそれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、親和性部分は、二本鎖領域と二本鎖ではない末端（例えば、５’または３’オーバーハング領域）とを含むポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、親和性部分は、組換えポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、親和性部分は、異種ポリヌクレオチドである。例えば、親和性部分は、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、哺乳動物または昆虫細胞において産生されるポリヌクレオチド（例えば、生物にとって異種のポリヌクレオチド）を含み得る。一部の実施形態では、親和性部分は、変異、挿入、欠失または多型を含むポリヌクレオチドである。
一部の実施形態では、親和性部分は、アプタマーである。アプタマーは、タンパク質などの標的分析物に高い特異性および親和性で結合する単離された核酸分子である。アプタマーは、その所与の標的を特異的に結合するための化学的接触を提供するある特定のコンフォメーション（単数または複数）で維持された三次元構造である。アプタマーは、核酸ベースの分子であるが、アプタマーと遺伝子およびｍＲＮＡなどの他の核酸分子との間には根本的な差異が存在する。後者では、核酸構造は、その直鎖塩基配列を介して情報をコードし、したがって、この配列は、情報記憶の機能にとって重要なものである。完全に対照的に、標的分子の特異的結合に基づくアプタマー機能は、保存された直鎖塩基配列（非コード配列）に完全に依存するわけではなく、むしろ特定の二次／三次／四次構造に依存する。アプタマーが有し得る任意のコード潜在力は、完全に偶然であり、その同族標的へのアプタマーの結合においていかなる役割も果たさない。アプタマーはまた、ある特定のタンパク質に結合する天然に存在する核酸配列から鑑別されなくてはならない。これら後者の配列は、天然に存在する核酸の転写、翻訳および運搬に関与するタンパク質の特殊化した下位群（例えば、核酸結合性タンパク質）に結合する、生物のゲノム内に埋め込まれた天然に存在する配列である。他方で、アプタマーは、短い単離された天然に存在しない核酸分子である。核酸結合性タンパク質と結合するアプタマーが識別され得るが、ほとんどの場合、かかるアプタマーは、核酸結合性タンパク質によって実際に認識される配列に対する配列同一性をほとんどまたは全く有さない。より重要なことに、アプタマーは、事実上任意のタンパク質（核酸結合性タンパク質にとどまらない）ならびに、小分子、炭水化物、ペプチドなどを含む目的のほぼ任意の標的と結合し得る。ほとんどの標的について、タンパク質であっても、それが結合する天然に存在する核酸配列は存在しない。かかる配列を有する標的、例えば、核酸結合性タンパク質について、かかる配列は、緊密に結合するアプタマーと比較して、実際に使用される比較的低い結合親和性の結果として、アプタマーとは異なる。アプタマーは、選択された標的に特異的に結合し、標的活性または結合相互作用をモジュレートすることが可能であり、例えば、結合を介して、アプタマーは、それらの標的が機能する能力を遮断し得る。標的への特異的結合の機能的特性は、アプタマーの固有の特性である。典型的なアプタマーは、サイズが６〜３５ｋＤａ（２０〜１００ヌクレオチド）であり、マイクロモル濃度からナノモル濃度未満の親和性でその標的と結合し、密接に関連する標的を判別し得る（例えば、アプタマーは、同じ遺伝子ファミリー由来の関連タンパク質を選択的に結合し得る）。アプタマーは、特異的標的と結合するために、一般に見られる分子間相互作用、例えば、水素結合、静電相補性、疎水性接触および立体排除を使用することが可能である。アプタマーは、高い特異性および親和性、低い免疫原性、生物学的効力ならびに優れた薬物動態学的特性を含む、治療剤および診断剤としての使用のためのいくつかの所望の特徴を有する。アプタマーは、共有結合的に連結された相補的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションから形成される分子ステムおよびループ構造（例えば、ヘアピンループ構造）を含み得る。ステムは、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドを含み、ループは、２つの相補的ポリヌクレオチドを共有結合的に連結する領域である。
一部の実施形態では、親和性部分は、複数の親和性部分、例えば、親和性部分の混合物またはライブラリーである。一部の実施形態では、親和性部分は、複数の異なる親和性部分である。例えば、親和性部分は、複数の少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００または３０，０００の親和性部分を含み得る。
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分は、その親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にカップリングされた核酸である。一部の実施形態では、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分は、その四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にカップリングされた核酸である。一部の実施形態では、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分は、四量体複合体の１つまたは複数のコアエレメントにカップリングされた核酸である。例えば、核酸は、単量体または四量体のストレプトアビジンコアにコンジュゲートされてもよい。四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの例示的な模式図を、図１０Ａ、１０Ｂ、１３、１４および１８に示す。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、親和性部分に直接的にカップリングされる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、親和性部分に間接的にカップリングされる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、親和性部分に非共有結合的にカップリングされる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、親和性部分に共有結合的にカップリングされる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドである。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、親和性部分の標的分析物と直接的には、実質的に相互作用しない。
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にカップリングされたオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のバーコード配列を含み得る。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にカップリングされたオリゴヌクレオチドは、抗原ＩＤ（ＡＩＤ）配列および抗原分子バーコード（ＡＭＢ）配列を含み得る。オリゴヌクレオチドは、抗原ＩＤ（ＡＩＤ）配列、融合配列、プライマー部位、分子バーコード配列、定常配列、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
オリゴヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分（例えば、アミン、チオールまたはビオチン）へのコンジュゲーションを可能にする、化学的改変を含有することができる。
オリゴヌクレオチドは、複数のオリゴヌクレオチドを構成し得る。複数のオリゴヌクレオチドは、複数の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは複数の四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートによって構成され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、複数の少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００または３０，０００のオリゴヌクレオチドを構成し得る。例えば、複数の少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００または３０，０００のオリゴヌクレオチドが、複数の少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００または３０，０００の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートによって構成され得る。
オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドバーコード配列、オリゴヌクレオチド融合配列、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列、オリゴヌクレオチド定常配列、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
オリゴヌクレオチド抗原ＩＤ（ＡＩＤ）配列
オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド抗原バーコード配列またはその相補体を含み得る。オリゴヌクレオチド抗原バーコードは、このオリゴヌクレオチド抗原バーコードを含む親和性−オリゴヌクレオチド複合体または四量体オリゴヌクレオチド複合体の同定を可能にし得る。オリゴヌクレオチド抗原バーコードは、このオリゴヌクレオチド抗原バーコードが付着される親和性部分の同定を可能にし得る。オリゴヌクレオチド抗原バーコードは、異なる標的分析物に結合する複数の異なる親和性部分由来の親和性部分を同定するために使用され得る。オリゴヌクレオチド抗原バーコードは、親和性−オリゴヌクレオチド複合体に排他的に、または四量体−オリゴヌクレオチド複合体に排他的にバーコード化され得る。オリゴヌクレオチド抗原バーコードは、親和性部分に排他的にバーコード化され得る。したがって、オリゴヌクレオチド抗原バーコード配列は、特異的親和性部分にバーコード化され得る。
オリゴヌクレオチド抗原バーコードは、固有のバーコード配列であり得る。例えば、複数のオリゴヌクレオチド抗原バーコードのうちの任意の１つのオリゴヌクレオチド抗原バーコードは、固有のバーコード配列であり得る。理論的に可能な異なる抗原バーコード配列の数は、バーコード配列の長さに直接的に依存し得る。例えば、ランダムにアセンブルされたアデニン、チミジン、グアノシンおよびシチジンヌクレオチドを有するＤＮＡバーコードが使用できる場合、可能なバーコード配列の理論的最大数は、１０ヌクレオチドの長さについては１，０４８，５７６であり得、１５ヌクレオチドの長さについては１，０７３，７４１，８２４であり得る。オリゴヌクレオチド抗原バーコード配列は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、４５、または５０もしくはそれよりも多く連続するヌクレオチドの配列を含み得る。オリゴヌクレオチドは、２もしくはそれよりも多くのオリゴヌクレオチド抗原バーコード配列またはそれらの相補体を含み得る。オリゴヌクレオチド抗原バーコード配列は、ヌクレオチドのランダムにアセンブルされた配列を含み得る。オリゴヌクレオチド抗原バーコード配列は、ディジェネレート配列であり得る。オリゴヌクレオチド抗原バーコード配列は、既知の配列であり得る。オリゴヌクレオチド抗原バーコード配列は、予め規定された配列であり得る。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチド抗原バーコード配列は、異なる標的分析物と相互作用する複数の異なる親和性部分のうちの１つの親和性部分を識別するためにオリゴヌクレオチド抗原バーコードまたはその相補体を含むシグナル（例えば、配列読み取り）が使用できるようにそれがカップリングされる親和性部分にバーコード化される既知の固有の配列である。
例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にカップリングされたオリゴヌクレオチドは、抗原ＩＤ（ＡＩＤ）配列であるバーコードを含み得る。ＡＩＤ配列は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にバーコード化され得る。ＡＩＤ配列は、親和性部分が標的化する抗原にバーコード化され得る。ＡＩＤ配列は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分および／または親和性部分が標的化する抗原を識別するために使用され得る。例えば、ＡＩＤ配列は、抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの抗体にバーコード化され得る。例えば、ＡＩＤ配列は、抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの抗体が標的化する抗原にバーコード化され得る。例えば、ＡＩＤ配列は、細胞をイムノフェノタイピングするために使用され得る。例えば、ＡＩＤ配列は、ＭＨＣ−ペプチド複合体のペプチドにバーコード化され得る。
ＡＩＤ配列は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分によって標的化される各抗原に固有であり得る。ＡＩＤ配列は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分に固有であり得る。例えば、ＡＩＤ配列は、細胞の異なる標的抗原に特異的に結合する各抗体に固有であり得る。一部の実施形態では、ＡＩＤ配列は、規定された配列である。一部の実施形態では、ＡＩＤ配列は、既知の配列である。各オリゴヌクレオチドについてのＡＩＤ配列は、例えば、次世代シークエンシングによって、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの増幅産物を配列決定することによって決定され得る。
オリゴヌクレオチド分子バーコード配列
オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド分子バーコード配列またはその相補体を含み得る。オリゴヌクレオチドバーコードは、このオリゴヌクレオチドバーコードを含む親和性−オリゴヌクレオチド複合体の分子の識別を可能にし得る。オリゴヌクレオチド分子バーコードは、親和性−オリゴヌクレオチド複合体の分子に排他的にバーコード化され得る。オリゴヌクレオチド分子バーコードは、親和性部分の分子に排他的にバーコード化され得る。したがって、オリゴヌクレオチド分子バーコード配列は、親和性部分の特異的分子にバーコード化され得る。
オリゴヌクレオチド分子バーコードは、固有のバーコード配列であり得る。例えば、複数のオリゴヌクレオチド分子バーコードのうちの任意の１つのオリゴヌクレオチド分子バーコードは、固有のバーコード配列であり得る。理論的に可能な異なる分子バーコード配列の数は、バーコード配列の長さに直接的に依存し得る。例えば、ランダムにアセンブルされたアデニン、チミジン、グアノシンおよびシチジンヌクレオチドを有するＤＮＡバーコードが使用できる場合、可能なバーコード配列の理論的最大数は、１０ヌクレオチドの長さについては１，０４８，５７６であり得、１５ヌクレオチドの長さについては１，０７３，７４１，８２４であり得る。オリゴヌクレオチド分子バーコード配列は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、４５、または５０もしくはそれよりも多く連続するヌクレオチドの配列を含み得る。オリゴヌクレオチドは、２もしくはそれよりも多くのオリゴヌクレオチド分子バーコード配列またはそれらの相補体を含み得る。オリゴヌクレオチド分子バーコード配列は、ヌクレオチドのランダムにアセンブルされた配列を含み得る。オリゴヌクレオチド分子バーコード配列は、ディジェネレート配列であり得る。オリゴヌクレオチド分子バーコード配列は、既知の配列であり得る。オリゴヌクレオチド分子バーコード配列は、予め規定された配列であり得る。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチド分子バーコード配列は、固有の配列であり、標的分析物と相互作用する複数の親和性部分分子のうちの１つの親和性部分分子を識別するために使用され得る。
例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にカップリングされたオリゴヌクレオチドは、抗原分子バーコード（ＡＭＢ）配列であるバーコードを含み得る。抗原分子バーコード（ＡＭＢ）配列は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの各オリゴヌクレオチド分子に固有であり得る。ＡＭＢ配列は、ベッセル、例えば、エマルジョン液滴中の個々の細胞の抗原などの抗原に結合した親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド分子の数の計数を可能にし得る。各オリゴヌクレオチドについてのＡＭＢ配列は、例えば、次世代シークエンシングによって、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの増幅産物を配列決定することによって決定され得る。
オリゴヌクレオチド融合配列
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にカップリングされたオリゴヌクレオチドは、融合配列を含み得る。融合配列は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、例えば、細胞表面結合した親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、例えばＴＣＲもしくはＢＣＲ結合した四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド上への、液滴特異的バーコード配列のＰＣＲ伸長を可能にし得る。複数のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドの融合配列は、同一であってよい。融合配列は、液滴バーコードの配列に対して相補的な配列を含むことができる。一部の実施形態では、融合配列は、オリゴヌクレオチドの末端に位置する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの末端の融合配列は、抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分に直接的にはコンジュゲートされない。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの末端の融合配列は、遊離末端を含む。
融合配列は、３’タギングポリヌクレオチド、例えば、ベッセルバーコードを含むポリヌクレオチドの領域に対して相補的な領域を含み得る。融合配列は、ポリヌクレオチド、例えば、ベッセルバーコードを含むポリヌクレオチドの領域の相補体に対して相補的な領域を含み得る。例えば、融合配列は、ベッセルバーコードなどのバーコードを含む３’タギングポリヌクレオチドまたはその相補体に対して相補的な３’領域、例えば、３’末端領域を含み得る。
３’タギングポリヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドなどの標的ポリヌクレオチドの３’末端に核酸を付加するために使用されるポリヌクレオチドであってよい。３’タギングポリヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドなどの標的ポリヌクレオチドの３’末端に核酸を付加するために鋳型として使用されるポリヌクレオチドであってよい。３’タギングポリヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドなどの標的ポリヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズするポリヌクレオチドであってよい。３’タギングポリヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドなどの標的ポリヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズする、３’領域、例えば３’末端領域を含有するポリヌクレオチドであってよい。
一部の実施形態では、３’タギングポリヌクレオチドは、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドである。ベッセルバーコードは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドに加えることができる。例えば、ベッセルバーコードは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることができる。ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズする、３’末端領域などの３’領域を含むことができる。
一部の実施形態では、３’タギングポリヌクレオチドは、増幅産物である。一部の実施形態では、３’タギングポリヌクレオチドは、単一の分子から生じる増幅産物である。一部の実施形態では、３’タギングポリヌクレオチドは、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの増幅産物である。一部の実施形態では、３’タギングポリヌクレオチドは、単一のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドから生じる増幅産物である。親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズする３’領域に対して５’側の領域は、プライマーまたはその相補体に対して相補的な領域を含むことができる。親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズする３’領域に対して５’側の領域は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドを増幅するために使用され得るプライマーに対して相補的な領域を含むことができる。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドまたはその相補体の３’末端にハイブリダイズする３’領域に対する５’側の領域に対して相補的な第１のプライマーと、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドのプライマー部位に対して相補的な第２のプライマーとを含むプライマーセットが、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドを増幅するために使用され得る。
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズする３’領域に対して５’側の領域は、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを増幅するために使用したプライマーまたはその相補体に対して相補的な領域を含み得る。
オリゴヌクレオチド融合配列は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれよりも多く連続するヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチド融合配列は、既知の長さの配列であり得る。オリゴヌクレオチド融合配列は、既知の配列であり得る。オリゴヌクレオチド融合配列は、予め規定された配列であり得る。オリゴヌクレオチド融合配列は、既知の長さの未知の配列であり得る。オリゴヌクレオチド融合配列は、既知の長さの既知の配列であり得る。
オリゴヌクレオチド定常配列
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にカップリングされたオリゴヌクレオチドは、定常配列を含むことができる。この定常配列は、任意選択である。複数の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの各オリゴヌクレオチドの定常配列は、同一であってよい。
オリゴヌクレオチド定常配列は、オリゴヌクレオチドの長さを増加させるために、または、オリゴヌクレオチドバーコード、オリゴヌクレオチド融合およびオリゴヌクレオチドプライマー結合部位のうちの１つまたは複数を互いから分離するために使用できる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド定常配列を含まない。例えば、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチドの末端で、親和性部分にカップリングされ得る。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド定常配列は、親和性−オリゴヌクレオチド複合体または四量体−オリゴヌクレオチド複合体の親和性部分に付着される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド定常は、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列の上流に位置する。例えば、オリゴヌクレオチド定常配列は、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列に対して５’側に位置することができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド定常は、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列の下流に位置する。例えば、オリゴヌクレオチド定常配列は、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列に対して３’側に位置することができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド定常は、オリゴヌクレオチドバーコードの上流に位置する。例えば、オリゴヌクレオチド定常配列は、オリゴヌクレオチドバーコードに対して５’側に位置することができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド定常は、オリゴヌクレオチドバーコードの下流に位置する。例えば、オリゴヌクレオチド定常配列は、オリゴヌクレオチドバーコードに対して３’側に位置することができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド定常は、オリゴヌクレオチド融合配列の上流に位置する。例えば、オリゴヌクレオチド定常配列は、オリゴヌクレオチド融合配列に対して５’側に位置することができる。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド定常配列は、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列と親和性−オリゴヌクレオチド複合体または四量体−オリゴヌクレオチド複合体の親和性部分との間に挟まれる。例えば、オリゴヌクレオチド定常配列は、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列に対して５’側に位置することができ、オリゴヌクレオチドの親和性部分に付着され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド定常配列は、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列とオリゴヌクレオチドバーコードとの間に挟まれる。例えば、オリゴヌクレオチド定常配列は、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列に対して３’側およびオリゴヌクレオチドバーコードに対して５’側に位置することができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド定常は、オリゴヌクレオチド融合配列とオリゴヌクレオチドバーコードとの間に挟まれる。例えば、オリゴヌクレオチド定常配列は、オリゴヌクレオチドバーコードに対して３’側およびオリゴヌクレオチド融合配列に対して５’側に位置することができる。
オリゴヌクレオチド定常配列は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、２５０、３００、４００、５００またはそれより多く連続するヌクレオチドであってよい。オリゴヌクレオチド定常配列は、ヌクレオチドの非ランダム配列を含むことができる。オリゴヌクレオチド定常配列は、既知の長さの配列であってよい。オリゴヌクレオチド定常配列は、既知の配列であってよい。オリゴヌクレオチド定常配列は、予め規定された配列であってよい。オリゴヌクレオチド定常配列は、既知の長さの未知の配列であってよい。オリゴヌクレオチド定常配列は、既知の長さの公知の配列であってよい。
オリゴヌクレオチドプライマー結合部位
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にカップリングされたオリゴヌクレオチドは、プライマー部位を含むことができる。プライマー部位は、増幅プライマーなどのプライマーに対して相補的な配列を含むことができる。オリゴヌクレオチドプライマー結合配列は、増幅または配列決定などの反応のためのプライマー結合部位として使用され得る。オリゴヌクレオチドプライマー結合配列は、増幅または配列決定などの反応のために使用されるプライマーの対のための第１のプライマー結合配列であってよい。例えば、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列は、フォワードプライマー結合部位であってよい。例えば、オリゴヌクレオチドプライマー結合部位は、リバースプライマー結合部位であってよい。例えば、オリゴヌクレオチドプライマー結合部位は、フォワードプライマー結合部位であってよく、オリゴヌクレオチドに付着させたベッセルバーコード化ポリヌクレオチドのプライマー結合配列は、リバースプライマー結合配列であってよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列は、ユニバーサルプライマー結合配列である。
オリゴヌクレオチドプライマー結合配列と、オリゴヌクレオチドに付着させたポリヌクレオチドの（例えば、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの）プライマー結合配列とは、６、５、４、３、２または１セルシウス度以下異なる融解温度を含み得る。オリゴヌクレオチドプライマー結合配列のヌクレオチド配列と、オリゴヌクレオチドに付着させたポリヌクレオチドのプライマー結合配列のヌクレオチド配列とは、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドに付着させたポリヌクレオチドのプライマー結合配列にハイブリダイズしないように、異なり得る。オリゴヌクレオチドプライマー結合配列のヌクレオチド配列と、オリゴヌクレオチドに付着させたポリヌクレオチドのプライマー結合配列のヌクレオチド配列とは、オリゴヌクレオチドに付着させたポリヌクレオチドのプライマー結合配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列にハイブリダイズしないように、異なり得る。
オリゴヌクレオチドエレメントの配置
オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド融合配列が、オリゴヌクレオチドの一方の末端に位置するような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド融合配列の上流にオリゴヌクレオチドバーコードを含むような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドバーコードの上流にオリゴヌクレオチドプライマー結合配列を含むような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド定常配列が、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列の上流または下流に位置するような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド定常配列がオリゴヌクレオチドバーコード配列の上流に位置するような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド定常配列が、オリゴヌクレオチドの一方の末端、例えば、オリゴヌクレオチド融合配列を含まないオリゴヌクレオチドの末端に位置するような順序で配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド融合配列、オリゴヌクレオチドバーコード配列、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列、およびオリゴヌクレオチド定常配列の順序で配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、親和性部分からに向かってまたは親和性部分から進んで、オリゴヌクレオチド融合配列、オリゴヌクレオチドバーコード配列、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列、およびオリゴヌクレオチド定常配列の順序で配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、５’末端から３’末端へまたは３’末端から５’末端へ、オリゴヌクレオチド融合配列、オリゴヌクレオチドバーコード配列、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列、およびオリゴヌクレオチド定常配列の順序で配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、５’末端オリゴヌクレオチド融合配列、固有のオリゴヌクレオチドバーコード配列、リバースオリゴヌクレオチドプライマー結合配列、および親和性部分に（例えば、３’末端に付着させた一級アミン基を介して）付着させた３’オリゴヌクレオチド定常配列を、その順序で含み得る。例えば、親和性部分に付着させたオリゴヌクレオチドは、親和性部分に向かって伝わる、オリゴヌクレオチド融合配列、オリゴヌクレオチドバーコード配列、オリゴヌクレオチド定常配列、およびオリゴヌクレオチドプライマー結合部位配列の順序で配置され得る。
オリゴヌクレオチドは、融合配列がオリゴヌクレオチドの一方の末端に位置するような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、融合配列がＡＩＤ配列の下流に位置するような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、融合配列がＡＭＢ配列の下流に位置するような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、融合配列が定常配列の下流に位置するような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、融合配列がプライマー部位の下流に位置するような順序で配置され得る。
オリゴヌクレオチドは、プライマー部位がオリゴヌクレオチドの一方の末端に位置するような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、プライマー部位がＡＩＤ配列の上流に位置するような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、プライマー部位がＡＭＢ配列の上流に位置するような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、プライマー部位が定常配列の上流に位置するような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、プライマー部位が融合配列の上流に位置するような順序で配置され得る。
オリゴヌクレオチドは、融合配列の上流にＡＩＤ配列を含むような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、プライマー部位の下流にＡＩＤ配列を含むような順序で配置され得る。ＡＩＤ配列は、ＡＭＢ配列の上流または下流に位置し得る。ＡＩＤ配列は、定常配列の上流または下流に位置し得る。オリゴヌクレオチドは、融合配列とプライマー部位との間にＡＩＤ配列を含むような順序で配置され得る。
オリゴヌクレオチドは、融合配列の上流にＡＭＢ配列を含むような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、プライマー部位の下流にＡＭＢ配列を含むような順序で配置され得る。ＡＭＢ配列は、ＡＩＤ配列の上流または下流に位置し得る。ＡＭＢ配列は、定常配列の上流または下流に位置し得る。オリゴヌクレオチドは、融合配列とプライマー部位との間にＡＭＢ配列を含むような順序で配置され得る。
オリゴヌクレオチドは、融合配列の上流に定常配列を含むような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、プライマー部位の下流に定常配列を含むような順序で配置され得る。定常配列は、ＡＩＤ配列の上流または下流に位置し得る。定常配列は、ＡＭＢ配列の上流または下流に位置し得る。オリゴヌクレオチドは、融合配列とプライマー部位との間に定常配列を含むような順序で配置され得る。
オリゴヌクレオチドは、ＡＭＢ配列および／またはＡＩＤ配列が、オリゴヌクレオチドの一方の末端、例えば、融合配列またはプライマー部位を含むオリゴヌクレオチドの末端に位置しないような順序で配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、融合配列、ＡＩＤ配列、ＡＭＢ配列およびプライマー部位の順序で配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、融合配列、ＡＭＢ配列、ＡＩＤ配列およびプライマー部位の順序で配置され得る。
例えば、オリゴヌクレオチドは、融合配列、ＡＩＤ配列、ＡＭＢ配列、定常配列およびプライマー部位の順序で配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、融合配列、ＡＭＢ配列、ＡＩＤ配列、定常配列およびプライマー部位の順序で配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、融合配列、定常配列、ＡＩＤ配列、ＡＭＢ配列およびプライマー部位の順序で配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、融合配列、定常配列、ＡＭＢ配列、ＡＩＤ配列およびプライマー部位の順序で配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、融合配列、ＡＩＤ配列、定常配列、ＡＭＢ配列およびプライマー部位の順序で配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、融合配列、ＡＭＢ配列、定常配列、ＡＩＤ配列およびプライマー部位の順序で配置され得る。
例えば、オリゴヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分に向かって伝わる、融合配列、ＡＩＤ配列、ＡＭＢ配列、定常配列およびプライマー部位の順序で配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’末端から３’末端へと、融合配列、ＡＩＤ配列、ＡＭＢ配列、定常配列およびプライマー部位の順序で配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、５’末端融合配列、ＡＩＤ配列、ＡＭＢ配列、定常配列、および親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分に（例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端に付着させた抗体の一級アミン基を介して）付着させた３’プライマー部位を、その順序で含み得る。
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート調製
本明細書に記載される方法および組成物において用いられる親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、任意の便利な方法を使用して調製され得る。親和性部分は、オリゴヌクレオチドに直接的または間接的に（例えば、リンカーを介して）カップリングされ得る。親和性部分は、オリゴヌクレオチドに共有結合的に（例えば、化学架橋を介して）または非共有結合的に（例えば、ストレプトアビジン−ビオチンを介して）カップリングされ得る。使用され得る様々な異なる親和性部分、近接ライゲーションアッセイのためのオリゴヌクレオチドの設計、および親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを形成するための親和性部分へのかかるオリゴヌクレオチドのカップリングを含む、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの設計および調製は、当技術分野で広く記載されている。当技術分野で記載される詳細および原理は、本発明の方法で使用するための親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの設計に適用され得る（例えば、ＷＯ２００７１０７７４３、ならびに米国特許第７，３０６，９０４号および同第６，８７８，５１５号を参照のこと）。
オリゴヌクレオチドと親和性部分との間での直接的カップリング反応は、例えば、各々が、他方上の官能基と反応することが可能な官能基（例えば、置換基または化学的ハンドル（chemical handle））を有する場合に、利用され得る。官能基は、オリゴヌクレオチドもしくは親和性部分上に存在し得る、またはこれらの成分上に（例えば、酸化反応、還元反応、切断反応などを介して）導入され得る。核酸／ポリペプチドコンジュゲートを産生するための方法は、記載されている（例えば、米国特許第５，７３３，５２３号を参照のこと）。
オリゴヌクレオチドへのカップリングに使用され得る抗体またはポリペプチドの官能基には、炭水化物、アミノ酸のチオール基（ＨＳ−）、アミノ酸のアミン基（Ｈ２Ｎ−）、およびアミノ酸のカルボキシ基が含まれるがこれらに限定されない。例えば、炭水化物構造は、アルデヒドへと酸化され、Ｈ２ＮＮＨ基含有化合物と反応させられて、官能基−Ｃ＝ＮＨ−ＮＨ−を形成し得る。例えば、チオール基は、チオール反応性基と反応させられて、チオエーテルまたはジスルフィドを形成し得る。例えば、タンパク質の遊離チオール基は、ネイティブシステイン残基中のジスルフィドのチオール化または開裂によって、タンパク質中に導入され得る。例えば、アミノ基（例えば、アミノ末端、またはリシン残基のオメガアミノ基の）は、求電子基（例えば、活性化カルボキシ基）と反応させられて、アミド基を形成し得る。例えば、カルボキシ基（例えば、カルボキシ末端、または二酸性（diacidic）アルファアミノ酸のカルボキシ基）は、活性化され、アミノ基と接触させれられて、アミド基を形成し得る。他の例示の官能基には、例えば、ＳＰＤＰ、カルボジイミド、グルタルアルデヒドなどが含まれる。
例示の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、市販のキット（「Ａｌｌ−ｉｎ−Ｏｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」；Ｓｏｌｕｌｉｎｋ，Ｉｎｃ．）を使用して、親和性部分に共有結合的にカップリングされる。例えば、第１に、３’−アミノ−オリゴヌクレオチドが、スルホ−Ｓ−４ＦＢを用いて誘導体化され得る。第２に、親和性部分が、Ｓ−ＨｙＮｉｃ基を用いて改変され得る。第３に、ＨｙＮｉｃ改変された親和性部分は、４ＦＢ改変されたオリゴヌクレオチドと反応させられて、ビス−アリールヒドラゾン媒介された親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを得ることができる。過剰な４ＦＢ改変されたオリゴヌクレオチドは、磁性親和性マトリックスを介してさらに除去され得る。全体的な親和性部分の回収は、ＨｙＮｉｃ改変された親和性部分および４ＦＢ改変されたオリゴヌクレオチドを、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％含まない。ビス−アリールヒドラゾン結合は、熱（例えば、９４℃）およびｐＨ（例えば、３〜１０）の両方に対して安定であり得る。
連結基が使用される場合、かかるリンカーは、この連結基を介した親和性部分とオリゴヌクレオチドとの共有結合付着または非共有結合付着を提供するために選択され得る。種々の適切なリンカーは、当技術分野で公知である。一部の実施形態では、このリンカーは、少なくとも約５０または１００ダルトン１００ダルトンである。一部の実施形態では、このリンカーは、多くて約３００；５００；１，０００；１０，０００または１００，０００ダルトンである。リンカーは、いずれかの末端において、オリゴヌクレオチドに結合することが可能な反応性官能性を有する官能基を含み得る。リンカーは、いずれかの末端において、親和性部分に結合することが可能な反応性官能性を有する官能基を含み得る。官能基は、オリゴヌクレオチド、親和性部分および／もしくはリンカー上に存在し得、またはこれらの成分上に（例えば、酸化反応、還元反応、切断反応などを介して）導入され得る。
例示のリンカーには、ポリマー、脂肪族炭化水素鎖、不飽和炭化水素鎖、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、環式リンカー、非環式リンカー、炭水化物、エーテル、ポリアミン、および当技術分野で公知の他のものが含まれる。リンカーの例示の官能基には、求核性官能基（例えば、アミン、アミノ基、ヒドロキシ基、スルフヒドリル基、アミノ基、アルコール、チオールおよびヒドラジド）、求電子官能基（例えば、アルデヒド、エステル、ビニルケトン、エポキシド、イソシアネートおよびマレイミド）、および環化付加反応が可能な、ジスルフィド結合を形成することが可能な、または金属に結合することが可能な官能基が含まれる。例えば、リンカーの官能基は、一級アミン、二級アミン、ヒドロキサム酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート、オキシカルボニルイミダゾール、ニトロフェニルエステル、トリフルオロエチルエステル、グリシジルエーテル、ビニルスルホン、マレイミド、アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’−［２’−ピリジルジチオ］プロピオンアミド（N-[4-(p-azidosalicylamino)butyl]-3'-[2'-pyridyldithio]propionamid)）、ビス−スルホスクシンイミジルスベレート、アジプイミド酸ジメチル、酒石酸ジスクシンイミジル、Ｎ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル［４−アジドフェニル］−１，３’−ジチオプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、グルタルアルデヒド、およびスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）などであり得る。
他の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、親和性部分をコードするベクターからｉｎ ｖｉｔｒｏで親和性部分を産生するなどの、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを生じるｉｎ ｖｉｔｒｏプロトコールを使用して産生され得る。目的のかかるｉｎ ｖｉｔｒｏプロトコールの例には、以下が含まれる：ＲｅｐＡベースのプロトコール（例えば、Fitzgeraldら、Drug Discov Today（２０００年）５巻：２５３〜５８頁、およびＷＯ９８３７１８６を参照のこと）、リボソームディスプレイベースのプロトコール（例えば、Hanesら、PNAS（１９９７年）９４巻：４９３７〜４２頁；Robertsら、Curr Opin Chem Biol（１９９９年）６月；３巻：２６８〜７３頁；Schaffitzelら、J Immunol Methods（１９９９年）１２月１０日；２３１巻：１１９〜３５頁；およびＷＯ９８５４３１２を参照のこと）など。
核酸分子を抗体にコンジュゲートするための技術は、当技術分野で周知である（例えば、Arnonら、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy（Reisfeldら編、Alan R. Liss, Inc.、１９８５年）；Hellstromら、「Antibodies For Drug Delivery」、Controlled Drug Delivery （Robinsonら編、Marcel Deiker, Inc.、第２版 １９８７年）；Thorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」、Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications（Pincheraら編、１９８５年）；「Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy（Baldwinら編、Academic Press、１９８５年）；およびThorpeら、１９８２年、Immunol. Rev. ６２巻：１１９〜５８頁を参照のこと。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８９／１２６２４もまた参照のこと）。例えば、核酸分子は、例えば、それぞれＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはマレイミド官能性を介して、抗体上のリシンまたはシステインに共有結合的に付着され得る。
標的抗原
親和性部分の標的抗原は、核酸分子であり得る、またはタンパク質性、例えば、標的タンパク質もしくはペプチドであり得る。標的抗原は、試料中の細胞上に存在する化合物または組成物であり得る。一部の実施形態では、標的抗原は、特に、ヒトなどの哺乳動物において、細胞媒介性免疫応答（即ち、適応免疫応答）を惹起することが可能な化合物または組成物であり得る。一部の実施形態では、標的抗原は、ＭＨＣ分子との関連でＴ細胞によって認識され得る。標的抗原には、細胞、組織抽出物、組織または細胞溶解物、タンパク質、個々にまたは混合物としての、複数のタンパク質、ペプチド、ペプチドの混合物、脂質、炭水化物、糖などが含まれるがこれらに限定されない。標的抗原は、感染性疾患、自己免疫疾患またはがんなどの疾患の特徴であり得る。標的抗原は、例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、がん抗原などであり得る。
一部の実施形態では、標的抗原は、ウイルス抗原である。ウイルス抗原には、例えば、ウイルスコートタンパク質、インフルエンザウイルス抗原、ＨＩＶ抗原、Ｂ型肝炎抗原またはＣ型肝炎抗原が含まれる。
一部の実施形態では、標的抗原は、抗原が腫瘍またはがんと関連するように、腫瘍細胞またはがん細胞によって専らまたは優勢に発現または過剰発現されるがん抗原（例えば、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物など）である。がん抗原は、がん抗原が、１つだけの型のがんまたは腫瘍と関連するまたはその特徴であるように、１つだけの型のがんまたは腫瘍のがん抗原であり得る。あるいは、がん抗原は、１つよりも多くの型のがんまたは腫瘍のがん抗原であり得る（例えば、その特徴であり得る）。例えば、がん抗原は、乳房がん細胞および前立腺がん細胞の両方によって発現され得、正常、非腫瘍もしくは非がん細胞によっては全く発現されない、または最小限にのみ発現される。がん抗原は、黒色腫がん抗原または乳房がん抗原であり得る。例示のがん抗原には、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥファミリーのタンパク質のメンバー、例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＰＭＳＡ、Ｈｅｒ−２およびｐ５３からなる群のものが含まれる。
標的抗原は、天然に、人工的に、合成によりまたは組換えにより産生され得る。したがって、標的抗原は、合成、組換え、単離されたおよび／または精製されたタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドであり得る。かかる抗原を作製または取得する方法は、当技術分野で公知である。例えば、ポリペプチドおよびタンパク質（例えば、抗原性ポリペプチドおよびタンパク質）をｄｅ ｎｏｖｏ合成する適切な方法は、Chanら、Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis、Oxford University Press、Oxford、United Kingdom、２００５年；Peptide and Protein Drug Analysis、Reid, R.編、Marcel Dekker, Inc.、２０００年；Epitope Mapping、Westwoodら編、Oxford University Press、Oxford、United Kingdom、２０００年；および米国特許第５，４４９，７５２号に記載されている。また、ポリペプチドおよびタンパク質（例えば、抗原性ポリペプチドおよびタンパク質）は、標準的な組換え方法を使用して、そのポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸を使用して組換え産生され得る。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第３版 Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、N.Y. ２００１年；およびAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons、NY、１９９４年を参照のこと。多くの抗原のヌクレオチド配列は、当技術分野で公知であり、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ウェブサイトのＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手可能である。さらに、抗原は、供給源、例えば、植物、細菌、昆虫、哺乳動物、例えば、ラット、ヒトなどから単離および／または精製され得る。単離および精製の方法は、当技術分野で周知である。
抗原は、遊離抗原、例えば、未結合の抗原性ペプチド（例えば、遊離ペプチド）であり得る、または結合した抗原、例えば、ペプチドでパルスした担体細胞によって提示されるＭＨＣ−ペプチド四量体または抗原性ペプチドであり得る。
一部の実施形態では、標的分析物は、膜結合型タンパク質である。一実施形態では、この膜結合型タンパク質は、単一の膜貫通（ＴＭ）ドメインを有する古典的Ｉ型膜タンパク質ＣＤ４である（Carrら、（１９８９年）J. Biol. Chem. ２６４巻：２１２８６〜９５頁）。別の実施形態では、この膜結合型タンパク質は、複数回膜貫通Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）膜タンパク質ＧＰＲ７７である（CainおよびMonk、（２００２年）J. Biol. Chem. ２７７巻：７１６５〜６９頁）。
さらなる例示の膜結合型タンパク質には、ＧＰＣＲ（例えば、アドレナリン受容体、アンジオテンシン受容体、コレシストキニン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、ニューロテンシン受容体、ガラニン受容体、ドパミン受容体、オピオイド受容体、セロトニン（erotonin）受容体、ソマトスタチン受容体など）、イオンチャネル（例えば、ニコチン性アセチルコリン受容体、ナトリウムチャネル、カリウムチャネルなど）、受容体チロシンキナーゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニル酸シクラーゼ、増殖因子およびホルモン受容体（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体）などが含まれるがこれらに限定されない。膜結合型タンパク質の変異体または改変されたバリアントもまた使用され得る。例えば、ＧＰＣＲの一部の単一または複数の点変異は、機能を保持し、疾患に関与する（例えば、Stadelら、（１９９７年）Trends in Pharmacological Review １８巻：４３０〜３７頁を参照のこと）。
単一の細胞の特徴付け、細胞ポリヌクレオチドバーコード化、および鎖の対合
本明細書に記載される方法は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを利用して細胞を特徴付けるステップを含み得る。１つまたは複数の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは１つまたは複数の四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに、複数の細胞を接触させることができる。未結合のコンジュゲートを除去するために、細胞を洗浄することができる。細胞は、ベッセル中で単一の細胞として単離することができる。単離された細胞に結合した親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、例えば、コンジュゲートのオリゴヌクレオチドにベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを付着させることによって、ベッセルバーコード配列を含有するように改変することができる。単離された細胞に結合した四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、例えば、コンジュゲートのオリゴヌクレオチドにベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを付着させることによって、ベッセルバーコード配列を含有するように改変することができる。
ベッセルバーコードを有するポリヌクレオチドは、ベッセルの形成の間にも導入することができる。これらのベッセルバーコード化ポリヌクレオチドは、ベッセルバーコードを含有する各オリゴヌクレオチドが、それらが存在するベッセルに対応する固有の正体コードを含有するように、ディジェネレートバーコードを有することができる。
オリゴヌクレオチドは、増幅することができ、反応の増幅産物は、ベッセルから回収することができる。増幅産物は、次世代配列決定（ＮＧＳ）タグを付加するためにＰＣＲ富化することができる。ライブラリーは、ハイスループット配列決定プラットホームを使用して配列決定され得、続いて、ベッセルバーコード配列および／またはＡＩＤ配列および／またはＡＭＢ配列が分析され得る。各単一の細胞は、そのそれぞれのベッセル中で単離されるので、２回観察された各ベッセルバーコードについて、配列決定された増幅されたオリゴヌクレオチド産物は、同じベッセルに起源し、したがって固有の単一の細胞に起源した。オリゴヌクレオチドの各ＡＩＤは、それが付着される親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にバーコード化され、各単一の細胞は、そのそれぞれのベッセル中で単離されるので、同じベッセルバーコードを含有する配列について観察された各ＡＩＤについて、配列決定された増幅されたオリゴヌクレオチド産物は、同じベッセル中の単一の細胞に結合した特定の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに起源した。全て同じベッセルバーコードを含有する配列のセットの中で個々に観察された各異なるＡＭＢについて、配列決定されたセット中のＡＭＢを有する増幅されたオリゴヌクレオチド産物は、同じベッセル中の細胞に結合した、例えば、単一細胞ベッセルが使用される場合、ベッセル中の単一の細胞に結合した、単一の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の（他の個々のＡＭＢと比較して）異なる単一のオリゴヌクレオチド部分に起源した。観察された各単一のＡＭＢについて、その同じベッセルバーコードを含有する配列を有する全ての増幅されたオリゴヌクレオチド産物は、単一の（同じ）親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子または四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のオリゴヌクレオチド部分に起源した（例えば、ＰＣＲ重複またはアンプリコンを示す）。したがって、特定のＡＭＢおよび特定のベッセルバーコードの所与の組合せを用いて観察された各オリゴヌクレオチドは、単一の細胞に結合した親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは単一の細胞に結合した四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの単一の分子を示す；したがって、かかるＡＭＢ／ベッセルバーコード組合せを有する配列決定された複数のオリゴヌクレオチドの所与の数（例えば、２、３、４またはそれよりも多い）の検出は、例えば、アッセイした細胞集団または試料内の、単一の細胞に結合した親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは単一の細胞に結合した四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの数（例えば、２、３、４またはそれよりも多い）を示す。したがって、かかる数は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの所与の親和性部分が結合するように設計される、細胞上の分子の数、例えば、単一の細胞上または単一の細胞中で発現されたコピーの数を示すことができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートとは別個であり、その部分またはコピーとは異なる、細胞に由来するポリヌクレオチドおよび／またはベッセル中のポリヌクレオチドをバーコード化するステップをさらに含む。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに結合するまたは結合した、ベッセル中にカプセル化された単一の細胞を溶解することができ、単一の細胞に由来するまたは単一の細胞内のポリヌクレオチドなどのさらなるポリヌクレオチドをバーコード化することができる。一部の実施形態では、ベッセル中の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分、例えば、ベッセル中の単一の細胞に結合するもしくは結合されたオリゴヌクレオチド部分、および／またはそのコピーもしくは増幅産物は、ベッセルバーコード配列を用いてバーコード化することができる。一部の実施形態では、単一の細胞に由来する１つまたは複数の細胞ポリヌクレオチドは、同じベッセルバーコード化配列を用いてバーコード化することができる；かかるさらなる１つまたは複数の細胞ポリヌクレオチドは、一部の実施形態では、分子バーコードを用いてさらにバーコード化される。
Ｔ細胞受容体鎖ペアおよび抗体免疫グロブリン鎖ペアは、免疫受容体の両方の型である。一部の実施形態では、細胞ポリヌクレオチドは、抗体免疫グロブリン鎖（または部分）コードポリヌクレオチドであり；一部の実施形態では、これは、ＴＣＲ（または部分）コードポリヌクレオチドである、またはそれを含む。一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートによって結合される抗原は、ＴＣＲもしくは抗体またはその鎖もしくは部分である。一態様では、本明細書に記載される方法は、ハイスループット配列決定および診断学のためのポリヌクレオチドライブラリーを生成することをさらに含む。一態様では、本明細書に記載される方法は、特定の共通の性状を有する患者またはコホートからの抗体および／またはＴＣＲ発見のためのヒト由来のライブラリーパネルを開発することをさらに含む。開示された発明は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを使用する単一の細胞の特徴付けと一緒に、複数の異なる型の対合した可変配列、例えば、Ｔ細胞受容体鎖ペアおよび抗体免疫グロブリン鎖ペアに適用され得る。例えば、細胞ポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチド、例えば、重鎖および／もしくは軽鎖、例えば、ＶＨおよび／もしくはＶＬ抗体鎖ならびに／またはアルファおよび／もしくはベータおよび／もしくはガンマおよび／もしくはデルタ鎖、例えば、Ｖα／ＶβおよびＶγ／ＶδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖（例えば、そのフレームワーク部分に由来するもの）は、ベッセルの形成の間に導入され得る（または、ベッセル内に含まれ得る）。ベッセルバーコードを有するポリヌクレオチドもまた、ベッセルの形成の間に導入され得る（または、ベッセル内に含まれ得る）。これらのベッセルバーコード化ポリヌクレオチドは、ベッセルバーコードを含む各細胞ポリヌクレオチドが、反応（単数または複数）の間に、それが存在するベッセルに対応する固有の正体コードを含むように、ディジェネレートバーコードを保有し得る。したがって、一部のかかる実施形態では、同じ固有の正体コードを有する複数のポリヌクレオチドは、同じベッセルに起源していると考えられ、したがって、一部の態様では、単一の細胞に起源していると考えられる。分子バーコードを有する複数のポリヌクレオチドもまた、ベッセルの形成の間に導入され得る、または、ベッセル中に含まれ得る。これらの分子バーコード化ポリヌクレオチドは、分子バーコードを含む各細胞ポリヌクレオチド分子が、それらが由来する単一の細胞ポリヌクレオチド分子に対応する固有の正体コードを含むように、ディジェネレートバーコードを保有し得る。数百万の単一の免疫細胞が、エマルジョンの内側で溶解され得、細胞転写物、例えば、ＶＨおよびＶＬならびに／またはＶα／Ｖβおよび／もしくはＶγ／Ｖδ鎖転写物は、プライマーを使用して逆転写またはコピーされ得、その後、ベッセルバーコードおよび分子バーコードでタグ化され得、バーコード化ポリヌクレオチドがＰＣＲ増幅され得る。単一の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞）から生じる各ＶＨおよびＶＬならびに／またはＶα／Ｖβおよび／もしくはＶγ／Ｖδ鎖は事実上、同じベッセルバーコード正体を有して、互いに連結され得る。
次いで、ＶＨおよびＶＬならびに／またはＶα／Ｖβおよび／もしくはＶγ／Ｖδ鎖は、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）タグを付加するために、ベッセルから回収され得、ＰＣＲ富化され得る。ライブラリーは、ハイスループット配列決定プラットフォームを使用して配列決定され得、その後、レパートリー多様性の分析、抗体頻度、ＣＤＲ３特徴付け、体細胞超変異系統発生分析などがなされ得る。正確にマッチさせたＶＨおよびＶＬならびに／またはＶα／Ｖβおよび／もしくはＶγ／Ｖδペアのデータベースは、ベッセルおよび分子バーコード配列をデコンボリューションすることによって生成され得る。各単一の免疫細胞は、そのそれぞれのベッセル中で単離されるので、２回観察された各ベッセルバーコードについて、配列決定された転写物は、同じエマルジョン液滴に起源し、したがって、固有の単一の細胞に起源した。同じベッセルバーコードを含む配列について、観察された各異なる分子バーコードについて、配列決定された転写物は、単一の細胞由来の異なる転写物分子に起源した。同じベッセルバーコードを含む配列について、観察された各同じ分子バーコードについて、配列決定された転写物は、単一の細胞由来の同じ転写物分子（例えば、ＰＣＲ重複）に起源した。
配列決定と並行して、ベッセルから回収されたＶＨおよびＶＬならびに／またはＶα／Ｖβおよび／もしくはＶγ／Ｖδ鎖のライブラリーは、抗体発現ベクター中にクローニングされ得、酵母ディスプレイスクリーニングのために共トランスフェクトされ得る。この同一のライブラリープールをクローニングすることは、開始時に生物学的試料を分割することと比較して好ましい方法であるが、それは、一部の稀な免疫細胞が、一方のアッセイまたは他方のアッセイのみにおいて捕捉されるからである。ヒト由来のＶＨおよびＶＬならびに／またはＶαおよびＶβならびに／またはＶγおよびＶδ鎖のライブラリーは、古典的なディスプレイアッセイと同様、対のマッチングが正確か不正確かに関わらず発現され得る。次いで、酵母ディスプレイが、潜在的抗体候補について富化するために、１つまたは複数の抗原標的に対して実行され得る。
酵母ディスプレイなどのディスプレイ技術から出現する陽性候補抗体は、配列決定され得、マッチさせた対のバーコードデータベースに対して問い合わせされ得る。各酵母ディスプレイされたＶＨおよび／またはＶαおよび／またはＶγ鎖は、それぞれ、そのそれぞれのＶＬまたはＶβまたはＶδ鎖に再びマッチされ得、各酵母が提示したＶＬおよび／またはＶβおよび／またはＶδ鎖は、それぞれ、そのそれぞれのＶＨまたはＶαまたはＶγ鎖に再びマッチされ得る。これらの正確に対合した候補は、哺乳動物細胞株において合成および発現され、目的の標的に対して機能的に検証される遺伝子であり得る。これらの候補は、完全ヒト抗体および／またはＴＣＲであり得る。
試料
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを含有する任意の試料を、本明細書に記載の方法で使用することができる。一般的に、細胞を含有する任意の試料を、本明細書に記載の方法で使用することができる。例えば、試料は、対象に由来する生物学的試料であってもよく、または対象に由来し、ＲＮＡもしくはＤＮＡを含有する試料であってもよい。ポリヌクレオチドは、生物学的試料から抽出してもよく、または試料は、ポリヌクレオチドを抽出または精製せずに、本方法に直接供してもよい。試料は、抽出または単離されたＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。また、試料は、生物学的検体から抽出された全ＲＮＡもしくはＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー、ウイルス、またはゲノムＤＮＡであってもよい。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、タンパク質、脂質、および非鋳型核酸等の様々な他の成分を含有する生物学的試料から単離される。核酸鋳型分子は、動物、植物、細菌、真菌、または任意の他の細胞性生物から得られる任意の細胞性物質から得ることができる。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、単一細胞から得られる。ポリヌクレオチドは、直接的に生物から、または生物から得られる生物学的試料から得ることができる。任意の組織または体液検体を、本発明で使用される核酸の供給源として使用することができる。また、ポリヌクレオチドは、初代細胞培養または細胞株等の培養細胞から単離してもよい。鋳型核酸がそこから得られる細胞または組織は、ウイルスまたは他の細胞内病原体に感染していてもよい。
ある特定の実施形態では、抗体またはＴＣＲ産出免疫細胞を、免疫されているか、または感染症、がん、自己免疫状態、もしくは任意の他の疾患を罹患しているヒトまたは他の動物等の、ヒトまたは他の動物等の対象または宿主の血液または他の生物学的試料から単離して、臨床的に重要である可能性がある、病原体特異的、腫瘍特異的、および／または疾患特異的な抗体またはＴＣＲを識別することができる。例えば、ヒトは、疾患を有すると診察されていてもよく、疾患の症状を示しているが、疾患を有すると診察されていなくてもよく、または疾患の症状を示していなくてもよい。例えば、ヒトは、感染因子（例えば、ウイルス、細菌、寄生動物、プリオン等）、抗原、もしくは疾患に曝されたヒト、および／または感染因子（例えば、ウイルス、細菌、寄生動物、プリオン等）、抗原、もしくは疾患に対する有用な抗体またはＴＣＲを作ることができるヒトであってもよい。例えば、動物は、感染因子（例えば、ウイルス、細菌、寄生動物、プリオン等）、抗原、もしくは疾患に曝された動物、および／または感染因子（例えば、ウイルス、細菌、寄生動物、プリオン等）、抗原、もしくは疾患に対する有用な抗体またはＴＣＲを作ることができる動物であってもよい。免疫された宿主に由来するある特定の免疫細胞は、問題となっている１つもしくは複数の標的抗原および／または１つもしくは複数の未知抗原に対する抗体またはＴＣＲを作る。本発明では、リンパ球プールは、抗体鎖が配列決定されるか、抗体が作られるか、または発現ライブラリーが作られる前に、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）を使用した細胞のスクリーニングおよびソーティング、パニング法、または免疫細胞ライブラリー等の、試料に由来する複数の免疫細胞を生成するための他のスクリーニング方法等の、任意の好適な方法により所望の免疫細胞を濃縮することができる。異なる抗体を発現する免疫細胞のほんの少数のサブセット、したがって可変ドメインのほんの少数の天然由来の組合せを提供するに過ぎない従来技術の濃縮方法とは対照的に、本発明の免疫細胞ライブラリーは、異なる抗体またはＴＣＲを発現する個々の免疫細胞の少なくとも２つのサブセットを含有する。例えば、本発明の免疫細胞ライブラリーは、異なる抗体またはＴＣＲを発現する個々の免疫細胞の、少なくとも５、１０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２５００、５０００、１００００、２５０００、５００００、７５０００、１００００、２５００００、５０００００、７５００００、１００００００、２５０００００、５００００００、７５０００００、または１０００００００個のサブセットを含有していてもよい。本発明の方法は、免疫細胞回収を最大化し、非常に高度な多様性をもたらす。
Ｔ細胞は、末梢血液単核細胞、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、リンパ節組織、腸管関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓組織、または任意の他のリンパ組織、および腫瘍を含む、いくつかの供給源から得ることができる。Ｔ細胞は、Ｔ細胞株から、および自己由来または同種異系の供給源から得ることができる。Ｔ細胞は、単一の個体または個体の集団、例えば、全てが、がんまたは感染症等の同じ疾患を罹患している個体の集団から得てもよい。一部の実施形態では、個体の循環血液に由来する細胞が、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスにより得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球細胞、赤血球細胞、および血小板を含む、リンパ球を含有する。一実施形態では、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスにより収集した細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、細胞を、その後の処理ことに適切な緩衝液または培地に配置してもよい。本発明の一実施形態では、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄する。代替的な実施形態では、洗浄溶液は、カルシウムを欠如しており、マグネシウムを欠如していてもよく、または全てではないが、多くの２価カチオンを欠如していてもよい。当業者であれば直ちに理解するように、洗浄ステップは、半自動「フロースルー」遠心分離機を使用すること等の、当業者に公知の方法により達成することができる。洗浄後、細胞を、例えば、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋を含まないＰＢＳ等の、様々な生体適合性緩衝液に再懸濁してもよい。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁してもよい。他の実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球細胞を溶解し、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配で遠心分離することにより、末梢血リンパ球から単離される。ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞等のＴ細胞の特定の部分集団を、ポジティブまたはネガティブ選択技法により、さらに単離してもよい。例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８コンジュゲート磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｄｅｒ）を使用して、ポジティブ選択することができる。一部の実施形態では、ネガティブ選択によるＴ細胞集団の濃縮は、ネガティブ選択された細胞に固有な表面マーカーに対する抗体を組み合わせて達成することができる。１つのそのような方法は、ネガティブ選択された細胞に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルが使用されるネガティブ磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞ソーティングおよび／またはセル選択法である。例えば、ネガティブ選択によりＣＤ４＋細胞を濃縮するため、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。刺激用のＴ細胞を調製するための別の方法は、洗浄ステップ後に細胞を凍結することであり、これには、単球除去ステップが必要とされない。理論に束縛されることは望まないが、凍結およびその後の解凍ステップは、細胞集団中の顆粒球およびある程度までは単球を除去することにより、より均一な産物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄ステップの後、細胞を、凍結用溶液に懸濁してもよい。多くの凍結用溶液およびパラメータが当技術分野で公知であり、それらは、本状況で有用となるだろうが、１つの方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有するＰＢＳまたは他の好適な細胞凍結用培地を使用することを含む。その後、これを、ＤＭＳＯおよびＨＳＡの終濃度がそれぞれ１０％および４％となるように培地で１：１に希釈する。その後、細胞を、毎分１℃で−８０℃に凍結し、液体窒素貯蔵タンクの気相に保管する。
一部の実施形態では、非免疫ヒトドナーまたは非ヒトドナーに由来する免疫細胞が利用される。動物のナイーブレパートリー（抗原負荷前のレパートリー）は、中程度の親和性（約１×１０−６〜１×１０−７ＭのＫＡ）で本質的にあらゆる非自己分子に結合することができる抗体またはＴＣＲを動物に提供する。抗体またはＴＣＲ結合部位の配列多様性は、生殖系列に直接にはコードされていないが、Ｖ遺伝子セグメントからコンビナトリアル様式でアセンブルされる。免疫処置は、上述のような、免疫原に結合して増殖し（クローン拡大）、対応する抗体を分泌するＶＨ−ＶＬまたはＶα−ＶβまたはＶγ−Ｖδ組合せを作る任意の免疫細胞を誘発する。しかしながら、免疫されていない対象に由来する脾臓細胞および／または免疫細胞もしくは他の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を使用することにより、考え得る抗体またはＴＣＲレパートリーのより良好な提示を提供することができ、また、その後、任意の動物種を使用してＢ細胞またはＴ細胞抗体またはＴＣＲライブラリーを構築することを可能にする。
一部の場合では、試験に十分な核酸を得るため、少なくとも０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍＬの血液容積を採取する。
一部の場合では、出発物質は末梢血である。末梢血細胞は、特定の細胞タイプ（例えば、単核細胞、赤血球細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞等）を濃縮することができる。また、末梢血細胞は、特定の細胞タイプ（例えば、単核細胞、赤血球細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞等）を選択的に枯渇させることができる。
一部の場合では、出発物質は、固形組織を含む組織試料であってもよく、非限定的な例としては、脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ節（扁桃腺を含む）、甲状腺、膵臓、心臓、骨格筋、腸、喉頭、食道、および胃が挙げられる。他の場合では、出発物質は、核酸を含有する細胞、免疫細胞、および特にＢ細胞またはＴ細胞であってもよい。一部の場合では、出発物質は、遺伝物質を得ることができる、任意の生物に由来する、核酸を含有する試料であってもよい。一部の場合では、試料は、流体、例えば、血液、唾液、リンパ液、または尿である。
試料は、ある状態を有する対象から採取することができる。一部の場合では、試料が採取される対象は、患者、例えば、がん患者、またはがんを有する疑いのある患者であってもよい。対象は、哺乳動物、例えばヒトであってもよく、雄または雌であってもよい。一部の場合では、雌は妊娠している。試料は、腫瘍生検であってもよい。生検は、例えば、医師、医師助手、看護師、獣医、歯科医、脊椎指圧師、医療補助員、皮膚科医、がん専門医、胃腸科専門医、または外科医を含む医療従事者により実施されてもよい。
一部の場合では、非核酸物質を、酵素処理（プロテアーゼ消化等）を使用して出発物質から除去してもよい。
一部の場合では、ＥＤＴＡを含むがそれに限定されないマグネシウムキレート剤を含有する装置内に血液を収集し、４℃で保管する。任意選択で、ＥＧＴＡを含むがそれに限定されないカルシウムキレート剤を添加してもよい。別の場合では、これらに限定されないが、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒド、グルタルアルデヒド誘導体、タンパク質架橋剤、核酸架橋剤、タンパク質および核酸架橋剤、第一級アミン反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル付加またはジスルフィド還元、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、または切断可能架橋剤を含む、細胞溶解阻害剤を血液に添加する。
一部の場合では、抽出された物質が、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む場合、これら分子は、本分野で公知の技法を使用して二本鎖ＤＮＡに変換することができる。例えば、逆転写酵素を用いて、ＲＮＡ分子からＤＮＡを合成してもよい。一部の場合では、ＲＮＡのＤＮＡへの変換は、リンカー断片をＲＮＡにライゲーションさせる事前ライゲーションステップを必要とする場合があり、ユニバーサルプライマーを使用することにより、逆転写の開始が可能になる。他の場合では、例えば、ｍＲＮＡ分子のポリＡテールを使用して、逆転写を開始させることができる。ＤＮＡへの変換後、一部の場合では、本明細書に詳述されている方法を使用して、所望の配列をさらに捕捉、選択、タグ化、または単離することができる。
核酸分子としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。核酸分子は、合成であってもよく、または天然由来の供給源に由来していてもよい。一実施形態では、核酸分子は、タンパク質、脂質、および非鋳型核酸等の様々な他の成分を含有する生物学的試料から単離される。核酸鋳型分子は、動物、植物、細菌、真菌、または任意の他の細胞性生物から得される任意の細胞性物質から得ることができる。ある特定の実施形態では、核酸分子は、単一細胞から得られる。本発明で使用される生物学的試料としては、ウイルス粒子または調製物が挙げられる。核酸分子は、直接的に生物から、または生物から得られる生物学的試料、例えば、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、糞便、および組織から得ることができる。任意の組織または体液検体を、本発明で使用される核酸の供給源として使用することができる。また、核酸分子は、初代細胞培養または細胞株等の培養細胞から単離してもよい。鋳型核酸がそこから得られる細胞または組織は、ウイルスまたは他の細胞内病原体に感染していてもよい。
また、試料は、生物学的検体から抽出される全ＲＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー、ウイルス、またはゲノムＤＮＡであってもよい。ある特定の実施形態では、核酸分子は、タンパク質、酵素、基質、抗体、結合材、ビーズ、小分子、ペプチド、または任意の他の分子等の他の標的分子に結合されている。一般的に、核酸は、SambrookおよびRussell、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第３版、Cold Spring Harbor、N.Y.（２００１年）に記載されているもの等の様々な技法により生物学的試料から抽出することができる。核酸分子は、一本鎖、二本鎖、または一本鎖領域を有する二本鎖（例えば、ステムおよびループ構造）であってもよい。
ＤＮＡ抽出法は、当技術分野で周知である。古典的なＤＮＡ単離プロトコールは、フェノールおよびクロロホルムの混合物等の有機溶媒を使用して抽出し、その後エタノールで析出させることに基づく（J. Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、１９８９年、第２版、Cold Spring Harbour Laboratory Press: New York、N.Y.）。他の方法としては、以下のものが挙げられる：塩析ＤＮＡ抽出法（P. Sunnucksら、Genetics、１９９６年、１４４巻：７４７〜７５６頁；S. M. Aljanabiら、Nucl. Acids Res.、１９９７年、２５巻：４６９２〜４６９３頁）、トリメチルアンモニウム臭化物塩ＤＮＡ抽出法（S. Gustincichら、BioTechniques、１９９１年、１１巻：２９８〜３０２頁）、およびグアニジウムチオシアネートＤＮＡ抽出法（J. B. W. Hammondら、Biochemistry、１９９６年、２４０巻：２９８〜３００頁）。生物学的試料からＤＮＡを抽出するための様々なキットが、商業的に入手可能である（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（パロアルト、カリフォルニア州）：Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（マディソン、ウィスコンシン州）；Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ミネアポリス、ミネソタ州）；ＭｉｃｒｏＰｒｏｂｅ Ｃｏｒｐ．（ボセル、ワシントン州）；Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ（ダーラム、ノースカロライナ州）；およびＱｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（バレンシア、カリフォルニア州））。
また、ＲＮＡ抽出法は、当技術分野で周知であり（例えば、J. Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、１９８９年、第２１１版、Cold Spring Harbour Laboratory Press: New York）、および体液からＲＮＡを抽出するためのキットは、商業的に入手可能である（例えば、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（オースティン、テキサス州）；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ピスカタウエイ、ニュージャージー州）；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（パロアルト、カリフォルニア州）；ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）；Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．（レークサクセス、ニューヨーク州）；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（マディソン、ウィスコンシン州）；Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ミネアポリス、ミネソタ州）；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ（ゲイサーズバーグ、メリーランド州）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カールズバッド、カリフォルニア州）；ＭｉｃｒｏＰｒｏｂｅ Ｃｏｒｐ．（ボセル、ワシントン州）；Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ（ダーラム、ノースカロライナ州）；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．（マディソン、ウィスコンシン州）；およびＱｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（バレンシア、カリフォルニア州））。
１つまたは複数の試料は、１つまたは複数の供給源に由来していてもよい。１つまたは複数の試料は、２つまたはそれよりも多くの供給源に由来していてもよい。１つまたは複数の試料は、１つまたは複数の対象に由来していてもよい。１つまたは複数の試料は、２つまたはそれよりも多くの対象に由来していてもよい。１つまたは複数の試料は、同じ対象に由来していてもよい。１つまたは複数の対象は、同じ種に由来していてもよい。１つまたは複数の対象は、異なる種に由来していてもよい。１つまたは複数の対象は、健常であってもよい。１つまたは複数の対象は、疾患、障害、または状態により影響を受けていてもよい。
一部の実施形態では、試料は、血液、唾液、リンパ液、尿、脳脊髄液、精液、痰、糞便、または組織ホモジネート等の流体である。
試料は、ある状態を有する対象から採取されてもよい。一部の実施形態では、試料が採取される対象は、患者、例えば、がん患者、またはがんを有する疑いのある患者であってもよい。対象は、哺乳動物、例えばヒトであってもよく、雄または雌であってもよい。一部の実施形態では、雌は妊娠している。試料は、腫瘍生検であってもよい。生検は、例えば、医師、医師助手、看護師、獣医、歯科医、脊椎指圧師、医療補助員、皮膚科医、がん専門医、胃腸科専門医、または外科医を含む医療従事者により実施されてもよい。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、タンパク質、酵素、基質、抗体、結合材、ビーズ、小分子、ペプチド、または任意の他の分子等の他の標的分子に結合されている。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、固体支持体に結合されていない。核酸は、様々な技法により生物学的試料から抽出することができる（Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第３版、Cold Spring Harbor、N.Y.（２００１年））。
一部の実施形態では、試料は唾液である。一部の実施形態では、試料は全血である。一部の場合では、試験に十分な量のポリヌクレオチドを得るため、少なくとも約０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍＬの血液容積を採取する。一部の実施形態では、血液は、ＥＤＴＡを含むがそれに限定されないマグネシウムキレート剤を含有する装置内に収集することができ、４℃で保管される。任意選択で、ＥＧＴＡを含むがそれに限定されないカルシウムキレート剤を添加してもよい。
一部の実施形態では、これらに限定されないが、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒド、グルタルアルデヒド誘導体、タンパク質架橋剤、核酸架橋剤、タンパク質および核酸架橋剤、第一級アミン反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル付加またはジスルフィド還元、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、または切断可能架橋剤を含む、細胞溶解阻害剤を血液に添加する。一部の実施形態では、非核酸物質を、酵素処理（プロテアーゼ消化等）を使用して出発物質から除去してもよい。
複数の試料は、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個、またはそれよりも多くの試料を含んでいてもよい。複数の試料は、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個、またはそれよりも多くの試料を含んでいてもよい。複数の試料は、少なくとも約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００個の試料、９０００、または１０，０００個の試料、または１００，０００個の試料、または１，０００，０００個、またはそれよりも多くの試料を含んでいてもよい。複数の試料は、少なくとも約１０，０００個の試料を含んでいてもよい。
第１の試料中の１つまたは複数のポリヌクレオチドは、第２の試料中の１つまたは複数のポリヌクレオチドと異なっていてもよい。第１の試料中の１つまたは複数のポリヌクレオチドは、複数の試料中の１つまたは複数のポリヌクレオチドと異なっていてもよい。試料中の１つまたは複数のポリヌクレオチドは、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性を含んでいてもよい。一部の実施形態では、試料中の１つまたは複数のポリヌクレオチドは、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１つ未満のヌクレオチドまたは塩基対が異なっていてもよい。複数の試料の１つまたは複数の試料中の複数のポリヌクレオチドは、２つまたはそれよりも多くの同一配列を含んでいてもよい。複数の試料の１つまたは複数中の総ポリヌクレオチドの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、同じ配列を含んでいてもよい。複数の試料の１つまたは複数の試料中の複数のポリヌクレオチドは、少なくとも２つの異なる配列を含んでいてもよい。複数の試料の１つまたは複数中の総ポリヌクレオチドの少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、少なくとも２つの異なる配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、互いのバリアントである。例えば、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、遺伝子多型または他のタイプの突然変異を含有していてもよい。別の例では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、スプライスバリアントである。
第１の試料は、１つまたは複数の細胞を含んでいてもよく、第２の試料は、１つまたは複数の細胞を含んでいてもよい。第１の試料の１つまたは複数の細胞は、第２の試料の１つまたは複数の細胞と同じ細胞タイプであってもよい。第１の試料の１つまたは複数の細胞は、複数の試料の１つまたは複数の異なる細胞と異なる細胞タイプであってもよい。
複数の試料は、同時的に得てもよい。複数の試料は、同時に得ることができる。複数の試料は、順次得ることができる。複数の試料は、１つまたは複数の異なる試料を得てから年単位の経過にわたって、例えば、１００年、１０年、５年、４年、３年、２年、または１年にわたって得ることができる。１つまたは複数の試料は、１つまたは複数の異なる試料を得てから約１年以内に得ることができる。１つまたは複数の試料は、１つまたは複数の異なる試料を得てから１２か月、１１か月、１０か月、９か月、８か月、７か月、６か月、４か月、３か月、２か月、または１か月以内に得ることができる。１つまたは複数の試料は、１つまたは複数の異なる試料を得てから３０日、２８日、２６日、２４日、２１日、２０日、１８日、１７日、１６日、１５日、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日、または１日以内に得ることができる。１つまたは複数の試料は、１つまたは複数の異なる試料を得てから約２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、２時間、または１時間以内に得ることができる。１つまたは複数の試料は、１つまたは複数の異なる試料を得てから約６０秒、４５秒、３０秒、２０秒、１０秒、５秒、２秒、または１秒以内に得ることができる。１つまたは複数の試料は、１つまたは複数の異なる試料を得てから１秒未満以内に得ることができる。
試料の異なるポリヌクレオチドは、異なる濃度または量（例えば、異なる数の分子）で試料中に存在していてもよい。例えば、１つのポリヌクレオチドの濃度または量は、試料中の別のポリヌクレオチドの濃度または量よりも多くてもよい。一部の実施形態では、試料中の少なくとも１つのポリヌクレオチドの濃度または量は、試料中の少なくとも１つの他のポリヌクレオチドの濃度または量よりも、少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００倍、またはそれよりも大きな倍率で多くてもよい。別の例では、１つのポリヌクレオチドの濃度または量は、試料中の別のポリヌクレオチドの濃度または量よりも少なくてもよい。試料中の少なくとも１つのポリヌクレオチドの濃度または量は、試料中の少なくとも１つの他のポリヌクレオチドの濃度または量よりも、少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００分の１、またはそれよりも大きな倍率で少なくてもよい。
一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くの試料は、異なる量または濃度のポリヌクレオチドを含有していてもよい。一部の実施形態では、１つの試料中の１つのポリヌクレオチドの濃度または量は、異なる試料中の同じポリヌクレオチドの濃度または量よりも多くてもよい。例えば、血液試料は、尿試料よりも多くの量の特定のポリヌクレオチドを含有する場合がある。あるいは、単一の試料は、２つまたはそれよりも多くのサブ試料に分けることができる。サブ試料は、異なる量または濃度の同じポリヌクレオチドを含有していてもよい。１つの試料中の少なくとも１つのポリヌクレオチドの濃度または量は、別の試料中の同じポリヌクレオチドの濃度または量よりも、少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００倍、またはそれよりも大きな倍率で多くてもよい。あるいは、１つの試料中の１つのポリヌクレオチドの濃度または量は、異なる試料中の同じポリヌクレオチドの濃度または量よりも少なくてもよい。例えば、１つの試料中の少なくとも１つのポリヌクレオチドの濃度または量は、別の試料中の同じポリヌクレオチドの濃度または量よりも、少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００分の１、またはそれよりも大きな倍率で少なくてもよい。
標的ポリヌクレオチド
一部の場合では、本明細書で提供されている方法は、細胞に由来するポリヌクレオチド分子、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド、またはそれらのアンプリコン等の標的ポリヌクレオチド分子を増幅および配列決定することに関する。一部の場合では、本明細書で提供されている方法は、標的ポリヌクレオチド分子の少なくとも１つの領域を増幅および配列決定することに関する。一部の場合では、本明細書で提供されている方法は、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド分子を増幅および配列決定することに関する。一態様では、標的ポリヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドである。一態様では、標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。一部の実施形態では、標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、ポリアデニル化されている。一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、ポリアデニル化されていない。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡポリヌクレオチドである。例えば、標的ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡを含む。ＤＮＡポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡであってもよい。ＤＮＡポリヌクレオチドは、エクソン、イントロン、非翻訳領域、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。
一態様では、標的ポリヌクレオチドは、ゲノム核酸である。特定の生物の染色体中の遺伝物質に由来するＤＮＡは、ゲノムＤＮＡであってもよい。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞により産生された抗体またはＴＣＲの可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞により産生された抗体の重鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞により産生された抗体の軽鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞により産生されたＴＣＲのアルファ鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞により産生されたＴＣＲのベータ鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞により産生されたＴＣＲのガンマ鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞により産生されたＴＣＲのデルタ鎖の可変領域を含む配列を含む。例えば、標的ポリヌクレオチドは、逆転写反応またはプライマー伸長反応の産物を生成するために使用されるポリヌクレオチド鋳型を含んでいてもよく、また、逆転写反応またはプライマー伸長反応産物自体を含んでいてもよい。例えば、標的ポリヌクレオチドは、逆転写反応またはプライマー伸長反応に供することができる目的のポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドのＡＩＤを含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドのＡＭＤを含む配列を含む。例えば、標的ポリヌクレオチドには、ＲＮＡまたはＤＮＡが含まれる。例えば、標的ポリヌクレオチドには、合成オリゴヌクレオチドが含まれる。例えば、標的ポリヌクレオチドには、ＡＩＤおよび／またはＡＭＢを含有するオリゴヌクレオチドが含まれる。
標的ポリヌクレオチドは、事実上任意の供給源から得ることができ、当技術分野で公知の方法を使用して調製することができる。例えば、標的ポリヌクレオチドは、生物または細胞（例えば、免疫細胞）からゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡの断片を抽出して、標的ポリヌクレオチドを得ることを含むがこれに限定されない、当技術分野で公知の方法を使用して、増幅せずに直接単離することができる。また、標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）から逆転写ＰＣＲにより生成されるｃＤＮＡを包含することもできる。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ分子またはそのｍＲＮＡ分子から産生されるｃＤＮＡである。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞に由来するｍＲＮＡ分子またはそのｍＲＮＡ分子から産生されるｃＤＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞に由来するｍＲＮＡ分子またはそれらｍＲＮＡ分子から産生されるｃＤＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞に由来する、抗体配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞に由来する、重鎖抗体配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞に由来する、重鎖抗体配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞に由来する、軽鎖抗体配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞に由来する、軽鎖抗体配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞に由来する、抗体可変配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞に由来する、可変抗体配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞に由来する、可変軽鎖抗体配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞に由来する、可変軽鎖抗体配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞に由来する、可変重鎖抗体配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞に由来する、可変重鎖抗体配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の場合には、標的ポリヌクレオチドは、無細胞性の核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞に由来する、可変アルファ、ベータ、ガンマおよび／またはデルタ鎖ＴＣＲ配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞に由来する、ＶＨおよび／またはＶＬのＢＣＲ配列をコードするｍＲＮＡ分子である。
本明細書に記載されている方法を使用して、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドから、配列決定用のポリヌクレオチドのライブラリーを生成することができる。一部の実施形態では、ライブラリーは、標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれよりも多くの領域から生成されてもよい。一部の実施形態では、方法ライブラリーは、２つまたはそれよりも多くの標的ポリヌクレオチドから生成されてもよい。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、染色体に由来するゲノム核酸またはＤＮＡである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、遺伝子多型または突然変異等のバリアントを含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡを含むが、ＲＮＡを含まない。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡを含むが、ＤＮＡを含まない。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、二本鎖ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖である。
標的ポリヌクレオチドは、任意の生物学的試料から合成または得ることができ、当技術分野で公知の方法を使用して調製することができる。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、増幅せずに直接単離される。直接単離するための方法は、当技術分野で公知である。非限定的な例としては、生物学的試料、生物、または細胞からゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することが挙げられる。一部の実施形態では、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドは、生物学的試料から精製される。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、それが含有されている生物学的試料から精製されていない。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、生物学的試料から単離される。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、それが含有されている生物学的試料から単離されていない。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、無細胞性の核酸であってもよい。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、断片化核酸であってもよい。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、転写された核酸であってもよい。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、修飾ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、非修飾ポリヌクレオチドである。
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに由来するオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、複数の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは複数の四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに由来する複数のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、複数の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに由来する、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、または１０００個、またはそれよりも多くのオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、または１０００個、またはそれよりも多くの親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに由来する、複数のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、または１０００個、またはそれよりも多くの親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに由来する、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、または１０００個、またはそれよりも多くのオリゴヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＡＩＤ配列を含む。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、または１０００個、またはそれよりも多くのＡＩＤ配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＡＭＢ配列を含む。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２個、またはそれよりも多くのＡＭＢ配列を含む。
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、単一細胞に由来するポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、個々の細胞に由来する。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、複数の細胞を含有する試料に由来するポリヌクレオチドである。
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、バイオマーカー配列をコードする。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、２つまたはそれよりも多くのバイオマーカー配列をコードする。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、バイオマーカー配列をコードする。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、２つまたはそれよりも多くのバイオマーカー配列をコードする。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個、またはそれよりも多くのバイオマーカー配列をコードする。
一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド配列のパネルを含む。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、免疫グロブリン配列のパネルを含む。例えば、免疫グロブリン配列のパネルは、ＶＨおよび／またはＶＬ配列であってよい。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、ＴＣＲ配列のパネルを含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンまたはＴＣＲ配列のパネルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の免疫グロブリンまたはＴＣＲ配列を含有する。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、ＢＣＲ配列のパネルを含む。例えば、ＢＣＲ配列のパネルは、ＶＨおよび／またはＶＬ配列であってよい。一部の実施形態では、免疫グロブリン、ＢＣＲまたはＴＣＲ配列のパネルは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２個の免疫グロブリン、ＢＣＲまたはＴＣＲ配列を含有する。一部の実施形態では、免疫グロブリン、ＢＣＲまたはＴＣＲ配列のパネルは、多くとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２個の免疫グロブリン、ＢＣＲまたはＴＣＲ配列を含有する。一部の実施形態では、免疫グロブリン、ＢＣＲまたはＴＣＲ配列のパネルは、約１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、１０〜７０、１０〜８０、１０〜９０、１０〜１００、５０〜６０、５０〜７０、５０〜８０、５０〜９０、５０〜１００、１００〜２００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜５００、１００〜６００、１００〜７００、１００〜８００、１００〜９００、１００〜１０００、５００〜６００、５００〜７００、５００〜８００、５００〜９００、５００〜１０００、１０００〜２０００、１０００〜３０００、１０００〜４０００、１０００〜３０００、１０００〜４０００、１０００〜５０００、１０００〜６０００、１０００〜７０００、１０００〜８０００、１０００〜９０００、１０００〜１００００、５０００〜６０００、５０００〜７０００、５０００〜８０００、５０００〜９０００、５０００〜１００００、１〜１×１０５、１〜２×１０５、１〜３×１０５、１〜４×１０５、１〜５×１０５、１〜６×１０５、１〜７×１０５、１〜８×１０５、９×１０５、１〜１×１０６、１〜２×１０６、１〜３×１０６、１〜４×１０６、１〜５×１０６、１〜６×１０６、１〜７×１０６、１〜８×１０６、９×１０６、１×１０７、１〜２×１０７、１〜３×１０７、１〜４×１０７、１〜５×１０７、１〜６×１０７、１〜７×１０７、１〜８×１０７、１〜９×１０７、１〜１×１０８、１〜２×１０８、１〜３×１０８、１〜４×１０８、１〜５×１０８、１〜６×１０８、１〜７×１０８、１〜８×１０８、１〜９×１０８、１〜１×１０９、１〜２×１０９、１〜３×１０９、１〜４×１０９、１〜５×１０９、１〜６×１０９、１〜７×１０９、１〜８×１０９、１〜９×１０９、１〜１×１０１０、１〜２×１０１０、１〜３×１０１０、１〜４×１０１０、１〜５×１０１０、１〜６×１０１０、１〜７×１０１０、１〜８×１０１０、１〜９×１０１０、１〜１×１０１１、１〜２×１０１１、１〜３×１０１１、１〜４×１０１１、１〜５×１０１１、１〜６×１０１１、１〜７×１０１１、１〜８×１０１１、１〜９×１０１１、１〜１×１０１２、１〜２×１０１２、１〜３×１０１２、１〜４×１０１２、１〜５×１０１２、１〜６×１０１２、１〜７×１０１２、１〜８×１０１２、または１〜９×１０１２個の免疫グロブリン、ＢＣＲまたはＴＣＲ配列を含有する。
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、長さが、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、または２０，０００塩基または塩基対である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、長さが、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、または２０，０００塩基または塩基対である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、長さが、多くとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、または２０，０００塩基または塩基対である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、長さが、約１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、１０〜７０、１０〜８０、１０〜９０、１０〜１００、５０〜６０、５０〜７０、５０〜８０、５０〜９０、５０〜１００、１００〜２００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜５００、１００〜６００、１００〜７００、１００〜８００、１００〜９００、１００〜１０００、５００〜６００、５００〜７００、５００〜８００、５００〜９００、５００〜１０００、１０００〜２０００、１０００〜３０００、１０００〜４０００、１０００〜３０００、１０００〜４０００、１０００〜５０００、１０００〜６０００、１０００〜７０００、１０００〜８０００、１０００〜９０００、１０００〜１００００、５０００〜６０００、５０００〜７０００、５０００〜８０００、５０００〜９０００、または５０００〜１００００塩基または塩基対である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドまたはそれらの断片の平均の長さは、約１００、２００、３００、４００、５００、もしくは８００塩基対未満であってもよく、または約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００ヌクレオチド未満であってもよく、または約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００キロベース未満であってもよい。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドを含有する試料等の、相対的に短い鋳型に由来する標的配列は、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００塩基である。ある特定の実施形態では、配列決定データは、疾患または状態に関連する配列または免疫グロブリンもしくはＴＣＲ配列を含有するデータベースを使用して、既知のまたは予想される配列に対してアラインされる。
一部の実施形態では、方法は、第１の細胞ポリヌクレオチド、第２の細胞ポリヌクレオチド、または両方の生殖系列配列を決定することをさらに含み、第１の細胞ポリヌクレオチドは、ＩｇＨまたはＶＨ配列を含み、第２の細胞ポリヌクレオチドは、ＩｇＬまたはＶＬ配列、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、方法は、生殖系列のＩｇＬ ＩｇＨ、ＶＨ、ＶＬ、またはそれらの任意の組合せの配列からの、ＩｇＬ ＩｇＨ、ＶＨ、ＶＬ、またはそれらの任意の組合せの配列の相違を決定することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、固有のＩｇＨ配列の総数、固有のＩｇＬ配列の総数；固有のＩｇＨおよびＩｇＬ配列の総数；固有の対合したＩｇＬおよびＩｇＨ配列の総数；１つまたは複数の他の配列に対する、ＩｇＨ配列もしくはＩｇＬ配列の頻度、またはＩｇＨ配列およびＩｇＬ配列の組合せの頻度の少なくとも１つを決定することをさらに含む。
一部の実施形態では、方法は、第１の細胞ポリヌクレオチド、第２の細胞ポリヌクレオチド、または両方の生殖系列配列を決定することをさらに含み、第１の細胞ポリヌクレオチドは、ＴＣＲαまたはＶα配列を含み、第２の細胞ポリヌクレオチドは、ＴＣＲβまたはＶβ配列、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、方法は、生殖系列のＴＣＲα、ＴＣＲβ、Ｖα、Ｖβ、またはそれらの任意の組合せの配列からの、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、Ｖα、Ｖβ、またはそれらの任意の組合せの配列の相違を決定することをさらに含む。
一部の実施形態では、方法は、固有のＴＣＲα配列の総数、固有のＴＣＲβ配列の総数；固有のＴＣＲαおよびＴＣＲβ配列の総数；固有の対合したＴＣＲβおよびＴＣＲα配列の総数；１つまたは複数の他の配列に対する、ＴＣＲα配列もしくはＴＣＲβ配列の頻度、またはＴＣＲα配列およびＴＣＲβ配列の組合せの頻度の少なくとも１つを決定することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、第１の細胞ポリヌクレオチド、第２の細胞ポリヌクレオチド、または両方の生殖系列配列を決定することをさらに含み、第１の細胞ポリヌクレオチドは、ＴＣＲγまたはＶγ配列を含み、第２の細胞ポリヌクレオチドは、ＴＣＲδまたはＶδ配列、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、方法は、生殖系列のＴＣＲγ、ＴＣＲδ、Ｖγ、Ｖδ、またはそれらの任意の組合せの配列からの、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、Ｖγ、Ｖδ、またはそれらの任意の組合せの配列の相違を決定することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、固有のＴＣＲγ配列の総数、固有のＴＣＲδ配列の総数；固有のＴＣＲγおよびＴＣＲδ配列の総数；固有の対合したＴＣＲδおよびＴＣＲγ配列の総数；１つまたは複数の他の配列に対する、ＴＣＲγ配列もしくはＴＣＲδ配列の頻度、またはＴＣＲγ配列およびＴＣＲδ配列の組合せの頻度の少なくとも１つを決定することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、第１の遺伝子に由来する配列の総数；第２の遺伝子に由来する配列の総数；第１の遺伝子に由来する固有の配列の総数；第２の遺伝子に由来する固有の配列の総数；または第１の遺伝子に由来する配列もしくは第２の遺伝子に由来する配列の頻度の少なくとも１つを決定することをさらに含む。
一部の実施形態では、方法は、個々の対合したＩｇＬおよびＩｇＨ配列、またはＴＣＲαおよびＴＣＲβ配列、またはＴＣＲγおよびＴＣＲδ配列の１つまたは複数の対、ならびに生殖系列からの相違の合計量に基づき、抗体またはＴＣＲを選択することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、１つもしくは複数のＩｇＬもしくはＩｇＨ配列、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ配列、またはＴＣＲγおよびＴＣＲδ配列、ならびに生殖系列からの相違に基づき、抗体またはＴＣＲを選択することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、配列パターン、相違の分析、動力学、または頻度の１つまたは複数に基づき抗体またはＴＣＲを選択することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、頻度に基づき抗体またはＴＣＲを選択することをさらに含む。
抗体、ＢＣＲおよびＴＣＲのクローニングおよび発現
「抗体発現ライブラリー」または「ＢＣＲ発現ライブラリー」または「ＴＣＲ発現ライブラリー」または「発現ライブラリー」は、本明細書で使用される場合、核酸またはタンパク質レベルのいずれかでの分子のコレクション（つまり、２つまたはそれよりも多くの分子）を指す場合がある。したがって、この用語は、複数の抗体、ＢＣＲもしくはＴＣＲ分子をコードする（つまり、核酸レベルの）発現ベクターのコレクションを指していてもよく、またはそれらが適切な発現系で発現された後の（つまり、タンパク質レベルの）抗体、ＢＣＲもしくはＴＣＲ分子のコレクションを指していてもよい。あるいは、発現ベクター／発現ライブラリーは、それらを発現され得る好適な宿主細胞に含有されてもよい。本発明の発現ライブラリー中のコードまたは発現されている抗体分子は、任意の適切な形式であってよく、例えば、抗体、ＢＣＲもしくはＴＣＲ分子全体であってもよく、または抗体、ＢＣＲ断片もしくはＴＣＲ断片、例えば、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ抗体）、Ｆｖ抗体、Ｆａｂ’抗体、（Ｆａｂ’）２断片、ダイアボディ等であってもよい。用語「コードする（encoding）」および「コードする（coding for）」、例えば、特定の酵素を「コードする」／「コードする」核酸配列、または特定の酵素のＤＮＡコート配列、または特定の酵素を「コードする」／「コードする」ヌクレオチド配列など、ならびに他の同義的な用語は、適切な調節配列の制御下に置かれると酵素に転写および翻訳されるＤＮＡ配列を指す。「プロモーター配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼに結合可能であり、下流（３’方向）コード配列の転写を開始可能であるＤＮＡ調節領域である。プロモーターは、ＤＮＡ配列の一部である。この配列領域は、その３’末端に開始コドンを有する。プロモーター配列は、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始させるために必要なエレメントを有する最小数の塩基を含む。しかしながら、ＲＮＡポリメラーゼがこの配列に結合し、転写が開始コドン（プロモーターを有する３’末端）から開始されると、転写は、３’方向の下流に進行する。プロモーター配列内には、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１でマッピングすることによって都合良く規定される）ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合をもたらすタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。
本発明の抗体、ＢＣＲまたはＴＣＲ発現ライブラリーによって同定される、それに由来する、それから選択される、またはそれから得ることができる、抗体、ＢＣＲまたはＴＣＲ分子は、本発明のさらなる態様を形成する。この場合も、これら抗体、ＢＣＲまたはＴＣＲ分子は、抗体、ＢＣＲもしくはＴＣＲ分子をコードするタンパク質または核酸であってよく、次いで、この核酸は、適切な発現ベクターに組み込むことができ、および／または好適な宿主細胞に含有されてもよい。
ｃＤＮＡプールは、抗体またはＢＣＲ遺伝子の重鎖の定常領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド、および抗体、ＢＣＲまたはＴＣＲ遺伝子のＶＨまたはＶαまたはＶγ鎖領域の５’末端にハイブリダイズするポリヌクレオチドと共にＰＣＲ反応に供してもよい。ｃＤＮＡプールは、抗体、ＢＣＲまたはＴＣＲ遺伝子の重鎖またはアルファもしくはガンマ鎖の定常領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド、および抗体、ＢＣＲまたはＴＣＲ配列を含むバーコード化ポリヌクレオチドのＶＨまたはＶαまたはＶγ鎖領域の領域５’〜５’末端にハイブリダイズするポリヌクレオチドと共にＰＣＲ反応に供してもよい。ＰＣＲ反応は、例えば、カッパおよびラムダクラスのＶＬまたはＶβまたはＶδ鎖プールを増幅するように設定することもできる。ｃＤＮＡプールは、抗体遺伝子の軽鎖の定常領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド、および抗体、ＢＣＲまたはＴＣＲ遺伝子のＶＬまたはＶβまたはＶδ鎖領域の５’末端にハイブリダイズするポリヌクレオチドと共にＰＣＲ反応に供してもよい。ｃＤＮＡプールは、抗体遺伝子の軽鎖の定常領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド、および抗体、ＢＣＲまたはＴＣＲ配列を含むバーコード化ポリヌクレオチドのＶＬまたはＶβまたはＶδ鎖領域の領域５’〜５’末端にハイブリダイズするポリヌクレオチドと共にＰＣＲ反応に供してもよい。そのようなオリゴヌクレオチドまたはプライマーは、公知であり公的に入手可能な免疫グロブリン、ＢＣＲまたはＴＣＲ遺伝子配列データベース情報に基づいて設計することができる。
一部の実施形態では、ＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ配列は、重鎖または軽鎖遺伝子に、特にＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδポリヌクレオチドの末端領域の一方または両方に特異的ではない１つまたは複数のプライマーを使用したＰＣＲ増幅により産生されるＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ配列のライブラリーから便利に得ることができる。一部の実施形態では、ＶＨおよびＶＬ配列は、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの領域に特異的なプライマーを使用したＰＣＲ増幅により産生されるＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ配列のライブラリーから便利に得ることができる。一部の実施形態では、ＶＨおよびＶＬ配列は、Ｃ遺伝子ファミリー特異的プライマーまたはＣ遺伝子特異的プライマーを使用したＰＣＲ増幅により産生されるＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ配列のライブラリーから便利に得ることができる。一部の実施形態では、ＶＨおよびＶＬ配列は、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの領域に特異的な第１のプライマー、およびＣ遺伝子ファミリー特異的プライマーまたはＣ遺伝子特異的プライマーである第２のプライマーまたは複数の第２のプライマーを有するプライマーセットを使用したＰＣＲ増幅により産生されるＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ配列のライブラリーから便利に得ることができる。一部の実施形態では、ＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ配列は、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの領域に特異的な第１のプライマーおよびユニバーサル配列に特異的な第２のプライマーを有するプライマーセットを使用したＰＣＲ増幅により産生されるＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ配列のライブラリーから便利に得ることができる。
一部の実施形態では、逆転写時に、得られたｃＤＮＡ配列を、免疫グロブリン遺伝子またはＢＣＲ遺伝子に特異的な、特にＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδポリヌクレオチドの末端領域の一方または両方に特異的な１つまたは複数のプライマーを使用して、ＰＣＲにより増幅してもよい。一部の実施形態では、ＶＨおよびＶＬ配列は、Ｖ遺伝子ファミリー特異的プライマーまたはＶ遺伝子特異的プライマーを使用したＰＣＲ増幅により産生されるＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ配列のライブラリーから得ることができ（Nichollsら、J. Immunol. Meth.、１９９３年、１６５巻：８１頁；ＷＯ９３／１２２２７）、または入手可能な情報に基づき、標準的な当技術分野で公知の方法に従って設計される。（ＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ配列を、通常は介在スペーサー配列（例えば、インフレーム可撓性ペプチドスペーサーをコードする）とライゲーションさせて、単鎖抗体をコードするカセットを形成することができる）。Ｖ領域配列は、免疫グロブリン発現細胞のｃＤＮＡまたはＰＣＲ増幅産物として便利にクローニングすることができる。ＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ領域は、任意選択で、本明細書に記載されている方法で、特に、言及されているある特定のステップ後（例えば、単一細胞ＰＣＲ後、哺乳動物または他の細胞表面ディスプレイ後、およびＦＡＣＳスクリーニング後等）に配列決定される。他の理由の中でも、多様性のレベルが許容可能なレベルにあることを確認するために、配列決定を使用してもよい。配列決定は、ハイスループット配列決定、ディープシーケンシング（複数の個々の試料に由来する同じ遺伝子を配列決定して、配列の差異を識別する）、またはこの２つの組合せを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載されている方法を使用して、天然のＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ組合せを、物理的に連結することは必要とされない。一部の実施形態では、ｃＤＮＡ、バーコード化ポリヌクレオチド、またはＰＣＲ増幅バーコード化ｃＤＮＡは、物理的に連結されていない。一部の実施形態では、ｃＤＮＡ、バーコード化ポリヌクレオチド、またはＰＣＲ増幅バーコード化ｃＤＮＡは、同じ反応またはベッセルでは、物理的に連結されていない。
一部の実施形態では、天然のＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ組合せは、ｃＤＮＡプライマーに加えて、ＶＨまたはＶαまたはＶγ遺伝子の５’末端に対する１つのプライマーまたは複数のプライマー、およびＶＬまたはＶβまたはＶδ遺伝子の５’末端に対する別のプライマーまたは複数のプライマーを使用して、物理的に連結される。また、これらプライマーは、ＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ遺伝子の自己集合を可能にするための追加的な配列である相補的尾部を含有する。増幅および連結反応は各細胞内で実施されたため、ＰＣＲ増幅および連結後に、混合産物、言い換えれば混合可変領域を得る可能性は最小限である。混合のリスクは、Ｖ領域ｃＤＮＡ対が細胞区画の外に出て相互混合せず、ＰＣＲ増幅および連結のために細胞内に残留することを更に保証するために、ジゴキシゲニン標識ヌクレオチド等の嵩高い試薬を利用することによりさらに低減させることができる。増幅された配列は、相補的末端配列のハイブリダイゼーションにより連結される。連結後、配列は、本明細書に記載のさらなる方法ステップで使用される細胞から回収することができる。例えば、回収されたＤＮＡは、必要に応じて末端プライマーを使用してＰＣＲ増幅し、下記に詳述されているような、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、ウイルスベクター、またはそれらの組合せであってもよいベクターにクローニングすることができる。ハイブリダイズされた配列に便利な制限酵素部位を組み込んで、クローニングを容易にしてもよい。また、こうしたベクターは、後に使用するための、連結された可変領域のライブラリーとして保存してもよい。
追加のＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδの組合せを提供するために、発現系を選択することができる。例えば、バクテリオファージ発現系では、重鎖および軽鎖配列のランダム組換えが可能である。他の好適な発現系が当業者に公知である。
非ヒトに由来するＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ配列の場合、一部の実施形態では、これらの配列を完全ヒトＦｃとキメラ化することが好ましい可能性があることに注意すべきである。本明細書で使用される場合、「キメラ化」は、重鎖および軽鎖可変領域またはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ領域がヒト由来ではなく、重鎖および軽鎖またはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ鎖の定常領域がヒト由来である免疫グロブリン、ＢＣＲまたはＴＣＲを指す。これは、可変ドメインをヒトＦｃに増幅およびクローニングすることによって達成される。ヒトＦｃは、ベクターの一部であってもよく、または別個の分子の中にあってもよく、Ｆｃのライブラリーを使用することもできる。好ましい実施形態では、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞において増殖させたキメラ化分子を、ＦＡＣＳで２回スクリーニングして、細胞集団を、目的の抗体を発現する細胞について濃縮する。キメラ化抗体、ＢＣＲまたはＴＣＲは、配列決定してから機能的に特徴付けるか、または直接的な機能特徴付けもしくは動力学のいずれかによって特徴付けられる。成長、スクリーニング、および特徴付けは、下記に詳細に記載される。
上述のＰＣＲ反応は、ＩｇＧ形態の抗体をクローニングするために記載されていることに留意することが重要である。ＩｇＧ形態の抗体は、一般的により成熟した免疫応答と関連しており、一般的にＩｇＭ抗体よりも高い親和性を示し、ある特定の治療または診断応用により望ましいため、好ましい。しかしながら、明らかに、所望であるかまたは適切である場合、免疫グロブリン分子の他の形態、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤの１つまたは複数のクローニングを可能にすることになるポリヌクレオチドを設計することができる。
細胞に含有されている遺伝物質の完全性を維持することができ、それによってライブラリーを後日に作ることが可能である場合、抗体、ＢＣＲまたはＴＣＲを同定し、細胞の適切な集団を、適切な時点で単離し、任意選択で上述のように濃縮した後に、抗体、ＢＣＲまたはＴＣＲ発現ライブラリーを直ちに生成する必要はない。したがって、例えば、細胞、細胞溶解物、または核酸、例えばＲＮＡまたはそれに由来するＤＮＡは、適切な方法、例えば凍結によって後日まで保存することができ、後日に所望となった時点で、発現ライブラリーを生成することができる。
発現ベクターのライブラリーが生成されたら、コードされた抗体分子を、適切な発現系で発現し、周知であり当技術分野で記録されている適切な技法を使用してスクリーニングすることができる。したがって、上記で規定されている本発明の方法は、適切な発現系で発現ベクターのライブラリーを発現すること、および発現されたライブラリーを所望の特性を有する抗体についてスクリーニングすることをさらに含んでいてもよい。
本明細書に示されるように、抗体、ＢＣＲまたはＴＣＲ配列をコードするポリヌクレオチドを含む、本開示の方法によって調製されるポリヌクレオチドとしては、これらに限定されないが、それ自体が抗体、ＢＣＲまたはＴＣＲ断片のアミノ酸配列をコードするもの、抗体、ＢＣＲまたはＴＣＲ全体、またはその部分の非コード配列、抗体、ＢＣＲまたはＴＣＲ、断片または部分のコード配列、ならびに上述の追加のコード配列を有するまたは有していない、少なくとも１つのシグナルリーダーまたは融合ペプチドのコード配列などの、非コード５’および３’配列を含むがこれらに限定されない追加の非コード配列を共に有する、少なくとも１つのイントロンなどの、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル（例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合および安定性）を含む、転写、ｍＲＮＡプロセシングに役割を果たす転写された未翻訳配列などの、追加の配列；追加の機能を提供するものなどの、追加のアミノ酸をコードする追加のコード配列が挙げられる。したがって、抗体をコードする配列は、抗体またはＴＣＲ断片または部分を含む融合抗体またはＴＣＲの精製を容易にするペプチドをコードする配列などの、マーカー配列に融合させることができる。
次に任意選択で、一次ＰＣＲ産物は、抗体、ＢＣＲまたはＴＣＲ可変ドメインＶＨ、ＶＬカッパおよびＶＬラムダまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδの５’および３’末端にハイブリダイズする新しいポリヌクレオチドセットによる二次ＰＣＲ反応に供してもよい（適宜、新しいポリヌクレオチドセットが使用される一次ＰＣＲ反応が、重鎖もしくは軽鎖抗体遺伝子またはＶαもしくはＶβのＴＣＲ遺伝子またはＶγもしくはＶδのＴＣＲ遺伝子の部分を増幅するように設計されていたか否かに応じて）。これらポリヌクレオチドは、以降のクローニングのための規定セットの制限酵素に特異的なＤＮＡ配列（つまり、制限酵素部位）を含むことが有利である。選択された制限酵素は、ヒト抗体、ＢＣＲまたはＴＣＲ Ｖ遺伝子セグメント内で切断が起こらないように選択しなければならない。そのようなポリヌクレオチドは、公知であり公的に入手可能な免疫グロブリンまたはＴＣＲ遺伝子配列および制限酵素データベース情報に基づいて設計することができる。しかし、含まれる好ましい制限酵素部位は、ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｌｕＩ、およびＮｏｔＩである。そのような二次ＰＣＲ反応の産物は、様々なＶ−重鎖、Ｖ−軽鎖カッパおよびＶ−軽鎖ラムダ抗体断片／ドメインのレパートリーである。したがって、目的の発現ライブラリー形式が、ｓｃＦｖまたはＦｖ形式であり、抗体またはＴＣＲのＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδドメインのみが存在する場合、一般的に、このタイプの二次ＰＣＲ反応が実施される。
ＰＣＲ産物はまた、バーコード化ポリヌクレオチドの５’および３’末端にハイブリダイズする新しいプライマーセットによるＰＣＲ反応に供してもよい。有利には、これらのポリヌクレオチドは、以降のクローニングのための規定セットの制限酵素に特異的なＤＮＡ配列（つまり、制限酵素部位）を含むことができる。選択された制限酵素は、ヒト抗体またはＴＣＲ Ｖ遺伝子セグメント内で切断が起こらないように選択しなければならない。そのようなポリヌクレオチドは、公知であり公的に入手可能な免疫グロブリン、ＢＣＲまたはＴＣＲ遺伝子配列および制限酵素データベース情報に基づいて設計することができる。しかし、含まれる好ましい制限酵素部位は、ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｌｕＩ、およびＮｏｔＩである。そのような二次ＰＣＲ反応の産物は、様々なＶＨ、ＶＬカッパ、およびＶＬラムダ抗体断片／ドメイン、またはＶαおよびＶβもしくはＶγおよびＶδ ＴＣＲ断片／ドメインのレパートリーである。
重鎖もしくは軽鎖またはＶαもしくはＶβ鎖またはＶγもしくはＶδ鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片、または単鎖抗体、ＢＣＲもしくはＴＣＲを、この系と共に使用することもできる。重鎖もしくは軽鎖またはＶαもしくはＶβ鎖またはＶγもしくはＶδ鎖を突然変異させた後、溶液に相補鎖を添加することができる。その後、２つの鎖を組み合わせ、機能性抗体断片を形成させることが可能である。ランダムで非特異的な軽鎖もしくは重鎖またはＶαもしくはＶβ鎖またはＶγもしくはＶδ鎖配列を添加することにより、多様なメンバーのライブラリーを生成するための、コンビナトリアル系の産生を可能にする。
本明細書で規定される免疫負荷宿主のＢまたはＴリンパ球に由来する抗体、ＢＣＲまたはＴＣＲ遺伝子の可変重鎖もしくはＶα鎖もしくはＶγ鎖領域またはその断片、および／あるいは可変軽鎖もしくはＶβ鎖もしくはＶδ鎖領域またはその断片を含む、クローニングされた断片のそのようなレパートリーのライブラリーは、本発明のさらなる態様を形成する。クローニングされた可変領域を含むこれらのライブラリーを、発現ベクターに任意選択で挿入して、発現ライブラリーを形成することができる。
一部の実施形態では、ＰＣＲ反応は、単離された免疫細胞集団に含有されている様々な抗体、ＢＣＲまたはＴＣＲ鎖の定常領域の全部または一部を保持するように設定することができる。これは、発現ライブラリー形式がＦａｂ形式であり、重鎖またはアルファ鎖またはガンマ鎖成分が、ＶＨまたはＶαまたはＶγおよびＣＨまたはＣαまたはＣγドメインを含み、軽鎖またはＶβ鎖またはＶδ鎖成分が、ＶＬまたはＶβまたはＶδ鎖およびＣＬまたはＣβまたはＣδドメインを含む場合に望ましい。この場合も、抗体、ＢＣＲまたはＴＣＲ鎖の定常領域の全部または一部を含むそのようなクローニングされた断片のライブラリーは、本発明のさらなる態様を形成する。
こうした核酸は、本発明のポリヌクレオチドの他の配列を含むことができるため便利である。例えば、１つまたは複数のエンドヌクレアーゼ制限部位を含む多重クローニング部位を核酸に挿入して、ポリヌクレオチドの単離を支援することができる。また、翻訳可能な配列を挿入して、翻訳された本発明のポリヌクレオチドの単離を支援することができる。例えば、ヘキサヒスチジンマーカー配列は、本発明のタンパク質を精製するための便利な手段を提供する。任意選択で、コード配列を除く本発明の核酸は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングおよび／または発現するためのベクター、アダプター、またはリンカーである。
追加の配列を、そのようなクローニングおよび／または発現配列に付加して、クローニングおよび／または発現時のそれらの機能を最適化し、ポリヌクレオチドの単離を支援し、またはポリヌクレオチドの細胞への導入を向上させることができる。クローニングベクター、発現ベクター、アダプター、およびリンカーの使用は、当技術分野で周知である。（例えば、Ausubel、上記；またはSambrook、上記を参照）。
本明細書で開示されているライブラリーは、様々な用途で使用することができる。本明細書で使用される場合、ライブラリーは、複数の分子を含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、複数のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、複数のプライマーを含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、１つまたは複数のポリヌクレオチド、アンプリコン、またはアンプリコンセットに由来する複数の配列読み取りを含む。ライブラリーは、保管し、分析用の試料を生成するために複数回使用することができる。一部の用途としては、例えば、遺伝子多型を遺伝子型決定すること、ＲＮＡプロセシングを研究すること、および本明細書で提供されている方法により配列決定するための代表的クローンを選択することが挙げられる。配列決定または増幅のためのプライマーまたはライブラリー等の複数のポリヌクレオチドを含むライブラリーを生成することができ、複数のポリヌクレオチドは、少なくとも、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００個、またはそれよりも多くの分子バーコードまたはベッセルバーコードを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのライブラリーは、複数の少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００個、またはそれよりも多くの固有のポリヌクレオチドを含み、各固有のポリヌクレオチドは、１つまたは複数の分子バーコードおよびベッセルバーコードを含む。
バーコード
抗原分子バーコードなどの分子バーコードは、単一の分子、例えば親和性−オリゴヌクレオチド複合体もしくは四量体−オリゴヌクレオチド複合体の単一のオリゴヌクレオチド、または単一の細胞もしくは単一のベッセルに由来するポリヌクレオチド分子に固有の情報を含む。ベッセルバーコードは、異なる単一の細胞に由来するまたは異なる単一のベッセル中に存在するポリヌクレオチドと比較して、単一の細胞に由来するまたは単一のベッセル中に存在するポリヌクレオチドに固有の情報を含む。一部の実施形態では、固有の情報は、ヌクレオチドの固有の配列を含む。例えば、分子バーコードまたはベッセルバーコードの配列は、分子バーコードまたはベッセルバーコードを含むヌクレオチドの固有のまたはランダムな配列の同一性および順序を決定することによって決定することができる。一部の実施形態では、固有の情報を使用して、標的ポリヌクレオチドの配列を同定することはできない。例えば、分子バーコードは、１つの標的ポリヌクレオチドに付着されていてもよいが、分子バーコードを使用して、付着されている標的ポリヌクレオチドを決定することはできない。一部の実施形態では、固有の情報は、標的ポリヌクレオチドの配列の同定に連結されている公知の配列ではない。例えば、ベッセルバーコードは、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドに付着されていてもよいが、ベッセルバーコードを使用して、付着されている１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドのいずれかを決定することはできない。一部の実施形態では、固有の情報は、ヌクレオチドのランダムな配列を含む。一部の実施形態では、固有の情報は、ポリヌクレオチド上のヌクレオチドの１つまたは複数の固有の配列を含む。一部の実施形態では、固有の情報は、ディジェネレートヌクレオチド配列またはディジェネレートバーコードを含む。ディジェネレートバーコードは、可変ヌクレオチド塩基組成または配列を含むことができる。例えば、ディジェネレートバーコードは、ランダム配列であってよい。一部の実施形態では、分子バーコードまたはベッセルバーコードの相補体配列も、分子バーコードまたはベッセルバーコード配列である。
バーコードは、任意の長さのヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、本明細書に記載のバーコードはいずれも、２から３６個までのヌクレオチドの、４から３６個までのヌクレオチドの、または６から３０個までのヌクレオチドの、または８から２０個までのヌクレオチドの、２から２０個までのヌクレオチドの、４から２０個までのヌクレオチドの、または６から２０個までのヌクレオチドの範囲内の長さを有していてもよい。ある特定の態様では、セット内のバーコードの融解温度は、互いに１０℃以内、互いに５℃以内、または互いに２℃以内である。ある特定の態様では、セット内のバーコードの融解温度は、互いに１０℃以内、互いに５℃以内、または互いに２℃以内ではない。一部の態様では、バーコードは、クロスハイブリダイゼーションが最小限であるセットのメンバーである。例えば、そのようなセットの各メンバーのヌクレオチド配列は、メンバーがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で任意の他のメンバーの相補体と安定二本鎖を形成することができないように、そのセットの全ての他のメンバーのヌクレオチド配列と十分に異なっていてもよい。一部の実施形態では、クロスハイブリダイゼーションが最小限であるセットの各メンバーのヌクレオチド配列は、少なくとも２つのヌクレオチドが全ての他の配列と異なる。バーコード技術は、Winzelerら（１９９９年）Science、２８５巻：９０１頁；Brenner（２０００年）Genome Biol.、１巻：１頁 Kumarら（２００１年）Nature Rev.、２巻：３０２頁；Giaeverら（２００４年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、１０１巻：７９３頁；Easonら（２００４年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、１０１巻：１１０４６頁；およびBrenner（２００４年）Genome Biol.、５巻：２４０頁に記載されている。
例えば、バーコードは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、または１０００個のヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、バーコードは、多くとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、または１０００個のヌクレオチドを含んでいてもよい。一部の実施形態では、バーコードは、特定の長さのヌクレオチドを有する。例えば、バーコードは、長さが、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、または１０００個のヌクレオチドであってもよい。
一部の実施形態では、複数のバーコード中の各バーコードは、少なくとも約２つのヌクレオチドを有する。例えば、複数のバーコード中の各バーコードは、長さが、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、または１０００個のヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態では、複数のバーコード中の各バーコードは、多くとも約１０００個のヌクレオチドを有する。例えば、複数のバーコード中の各バーコードは、長さが、多くとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、または１０００個のヌクレオチドであってもよい。
分子バーコードの数は、複数のベッセル中の標識しようとする分子の総数に対して過剰であってもよい。ベッセルバーコードの数は、複数のベッセル中の標識しようとする分子の総数に対して過剰であってもよい。例えば、分子バーコードまたはベッセルバーコードの数は、複数のベッセル中の標識しようとする分子の総数の、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍であってもよい。
異なる分子バーコードの数は、複数のベッセル中の標識しようとする分子の総数に対して過剰であってもよい。一部の実施形態では、異なる分子バーコードの数は、複数のベッセル中の標識しようとする分子の総数の、少なくとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍である。
単一ベッセル中の異なる分子バーコードの数は、単一ベッセル中の標識しようとする異なる分子の数に対して過剰であってもよい。一部の実施形態では、単一ベッセル中の異なる分子バーコードの数は、単一ベッセル中の標識しようとする異なる分子の数の、少なくとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍である。
異なるベッセルバーコードの数は、複数のベッセル中の標識しようとする分子の総数よりも少なくてもよい。一部の実施形態では、異なるベッセルバーコードの数は、複数のベッセル中の標識しようとする分子の総数の、多くとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００分の１である。
単一ベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチド分子に由来する増幅産物分子の数は、単一ベッセル中の標識しようとする異なる分子の数に対して過剰であってもよい。一部の実施形態では、単一ベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチド分子に由来する増幅産物分子の数は、単一ベッセル中の標識しようとする異なる分子の数の、少なくとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍である。
単一ベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチド分子の数は、単一ベッセル中の標識しようとする異なる分子の数よりも少なくてもよい。一部の実施形態では、単一ベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチド分子の数は、単一ベッセル中の標識しようとする異なる分子の数の、多くとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００分の１である。
単一ベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチド分子の数は、１つの分子であってもよい。単一ベッセル中の増幅されていないベッセルバーコード化ポリヌクレオチド分子の数は、１つの分子であってもよい。
一部の実施形態では、異なる分子バーコードの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％は、同じ濃度を有する。一部の実施形態では、異なるベッセルバーコードの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％は、同じ濃度を有する。
一部の実施形態では、異なる分子バーコードの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％は、異なる濃度を有する。一部の実施形態では、異なるベッセルバーコードの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％は、異なる濃度を有する。
分子バーコードまたはベッセルバーコードの集団中の分子バーコードまたはベッセルバーコードは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個、またはそれよりも多くの異なる配列を有していてもよい。例えば、集団中の分子バーコードまたはベッセルバーコードは、少なくとも２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００個、またはそれよりも多くの異なる配列を有していてもよい。したがって、複数の分子バーコードまたはベッセルバーコードを使用して、標的ポリヌクレオチド等の１つまたは複数のポリヌクレオチドから、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個、またはそれよりも多くの異なる配列を生成することができる。例えば、複数の分子バーコードまたはベッセルバーコードを使用して、標的ポリヌクレオチド等の１つまたは複数のポリヌクレオチドから、少なくとも２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２個、またはそれよりも多くの異なる配列を生成することができる。例えば、複数の分子バーコードまたはベッセルバーコードを使用して、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２個、またはそれよりも多くの標的ポリヌクレオチドから、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２個、またはそれよりも多くの異なる配列を生成することができる。
一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分ける。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、同じ分子バーコードを含有する。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードまたはベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、アンプリコンセットを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は複数の配列を含み、上記複数の配列が生成されたポリヌクレオチドは、増幅反応中の同じポリヌクレオチド分子に由来していた。
一部の実施形態では、１つまたは複数のベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分ける。一部の実施形態では、１つまたは複数のベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、同じベッセルバーコードを含有する。一部の実施形態では、１つまたは複数のベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、１つまたは複数のアンプリコンセットを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は複数の配列を含み、上記複数の配列が生成されたポリヌクレオチドは、単一ベッセルまたは単一細胞に由来するポリヌクレオチド分子に由来していた。
一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＩＤ配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分ける。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＩＤ配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、同じＡＩＤ配列を含有する。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＩＤ配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、１つまたは複数のアンプリコンセットを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＩＤ配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は複数の配列を含み、上記複数の配列が生成されたポリヌクレオチドは、単一ベッセルまたは単一細胞に由来するポリヌクレオチド分子に由来していた。
一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＭＢ配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分ける。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＭＢ配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、同じＡＭＢ配列を含有する。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＭＢ配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、１つまたは複数のアンプリコンセットを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＭＢ配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は複数の配列を含み、上記複数の配列が生成されたポリヌクレオチドは、単一ベッセルまたは単一細胞に由来するポリヌクレオチド分子に由来していた。
一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＩＤ配列およびＡＭＢ配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分ける。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＩＤ配列およびＡＭＢ配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、同じＡＩＤ配列を含有する。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＩＤ配列およびＡＭＢ配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、同じＡＩＤ配列および異なるＡＭＢ配列を含有する。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＩＤ配列およびＡＭＢ配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、同じＡＩＤ配列および同じＡＭＢ配列を含有する。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＩＤ配列およびＡＭＢ配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、１つまたは複数のアンプリコンセットを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＩＤ配列およびＡＭＢ配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は複数の配列を含み、上記複数の配列が生成されたポリヌクレオチドは、増幅反応中の同じポリヌクレオチドに由来し、単一細胞またはベッセルに由来していた。
一部の実施形態では、１つまたは複数のベッセルバーコードおよびＡＭＢ配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分ける。一部の実施形態では、１つまたは複数のベッセルバーコードおよびＡＭＢ配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、同じベッセルバーコードを含有する。一部の実施形態では、１つまたは複数のベッセルバーコードおよびＡＭＢ配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、同じベッセルバーコードおよび異なるＡＭＢ配列を含有する。一部の実施形態では、１つまたは複数のベッセルバーコードおよびＡＭＢ配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、同じベッセルバーコードおよび同じＡＭＢ配列を含有する。一部の実施形態では、１つまたは複数のベッセルバーコードおよびＡＭＢ配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、１つまたは複数のアンプリコンセットを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のベッセルバーコードおよびＡＭＢ配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は複数の配列を含み、上記複数の配列が生成されたポリヌクレオチドは、増幅反応中の同じポリヌクレオチドに由来し、単一細胞またはベッセルに由来していた。
一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＩＤ配列およびベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分ける。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＩＤ配列およびベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、同じＡＩＤ配列を含有する。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＩＤ配列およびベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、同じＡＩＤ配列および同じベッセルバーコードを含有する。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＩＤ配列およびベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、１つまたは複数のアンプリコンセットを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＩＤ配列およびベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は複数の配列を含み、上記複数の配列が生成されたポリヌクレオチドは、増幅反応中の同じポリヌクレオチドに由来し、単一細胞またはベッセルに由来していた。
一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードおよびベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分ける。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードおよびベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、同じ分子バーコードおよび同じベッセルバーコードを含有する。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードおよびベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、１つまたは複数のアンプリコンセットを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードおよびベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は複数の配列を含み、上記複数の配列が生成されたポリヌクレオチドは、増幅反応中の同じポリヌクレオチドに由来し、単一細胞またはベッセルに由来していた。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードおよびベッセルバーコードを使用せずに、配列をアラインする。
一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードを使用せずに、配列をアラインする。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードを使用して、配列をアラインする。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、標的特異的領域を使用して配列をアラインする。一部の実施形態では、１つまたは複数のベッセルバーコードを使用せずに、配列をアラインする。一部の実施形態では、１つまたは複数のベッセルバーコードを使用して、配列をアラインする。一部の実施形態では、１つまたは複数のベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、標的特異的領域を使用して配列をアラインする。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードおよびベッセルバーコードを使用して、配列をアラインする。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードおよびベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、標的特異的領域を使用して配列をアラインする。
一部の実施形態では、アラインされた配列は、同じＡＩＤを含有する。一部の実施形態では、アラインされた配列は、同じＡＭＢを含有する。一部の実施形態では、アラインされた配列は、同じＡＩＤおよびＡＭＢを含有する。一部の実施形態では、アラインされた配列は、同じＡＩＤおよびベッセルバーコードを含有する。一部の実施形態では、アラインされた配列は、同じＡＭＢおよびベッセルバーコードを含有する。一部の実施形態では、アラインされた配列は、同じ分子バーコードを含有する。一部の実施形態では、アラインされた配列は、同じベッセルバーコードを含有する。一部の実施形態では、アラインされた配列は、同じ分子バーコードおよびベッセルバーコードを含有する。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードまたはベッセルバーコードを使用して、配列をアラインし、アラインされた配列は、アンプリコンセットに由来する２つまたはそれよりも多くの配列を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードまたはベッセルバーコードを使用して、配列をアラインし、アラインされた配列は複数の配列を含み、上記複数の配列が生成されたポリヌクレオチドは、増幅反応中の同じポリヌクレオチド分子に由来していた。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードまたはベッセルバーコードを使用して、配列をアラインし、アラインされた配列は複数の配列を含み、上記複数の配列が生成されたポリヌクレオチドは、単一細胞または単一ベッセルに由来していた。
液滴生成
複数の細胞の試料を小さな反応容積に分割し、複数の細胞の個々の細胞からの、または個々の細胞に由来するポリヌクレオチドの分子およびベッセルバーコード付与と併用することにより、バイオマーカー配列等の配列のレパートリーのハイスループット配列決定が可能になり得る。
複数の細胞の試料を小さな反応容積に分割し、複数の細胞の個々の細胞からの、または個々の細胞に由来するポリヌクレオチドの分子およびベッセルバーコード付与と併用することにより、生物のトランスクリプトームのパーセントを表す配列等の配列のレパートリーのハイスループット配列決定が可能になり得る。例えば、配列のレパートリーは、生物のトランスクリプトームの少なくとも約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１０％、０．０００５０％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％である複数の配列を含んでいてもよい。
免疫細胞の試料を小さな反応容積に分割し、複数の免疫細胞の個々の免疫細胞からの、または個々の細胞に由来するポリヌクレオチドの分子およびベッセルバーコード付与と併用することにより、重鎖および軽鎖配列のレパートリーのハイスループット配列決定が可能になり得る。また、こうした方法は、バーコード化配列に基づいて配列決定した後、重鎖および軽鎖の対合を可能にし得る。また、本明細書に記載のように試料を小さな反応容積に分割することは、試薬使用量を低減し、それにより分析の材料費の削減を可能にし得る。
一部の場合では、逆転写反応および／または増幅反応（例えば、ＰＣＲ）は、液滴デジタルＰＣＲ等のように、液滴中で実施される。ある特定の態様では、本発明は、標的物質の全体または部分を含有する流体区画を提供する。一部の実施形態では、区画は、液滴である。明細書の全体にわたって「液滴」が参照されているが、この用語は、別様の指定がない限り、流体区画および流体分配と同義的に使用される。別様の指定がある場合を除き、便宜的に「液滴」を使用し、任意の流体分配または区画を使用することができる。本明細書で使用される液滴は、米国特許第７，６２２，２８０号に記載のもの等の、エマルジョン組成物（または、２つまたはそれよりも多くの不混和性流体の混合物）を含んでいてもよい。液滴は、ＷＯ２０１０／０３６３５２に記載のデバイスにより生成することができる。用語「エマルジョン」は、本明細書で使用される場合、不混和性液体（油および水等の）の混合物を指す場合がある。油相および／または油中水型エマルジョンは、水性液滴内での反応混合物の区画化を可能にする。エマルジョンは、連続油相内に水性液滴を含むことができる。本明細書で提供されるエマルジョンは、液滴が連続水相内の油液滴である水中油型エマルジョンであってもよい。本明細書で提供される液滴は、区画間の混合を防止し、各区画が、その内容物を、蒸発および他の区画の内容物との凝集から保護するように設計される。
本明細書に記載されている混合物またはエマルジョンは、安定であってもよく、または不安定であってもよい。エマルジョンは、比較的安定しており、凝集は最小限である。小液滴が組み合わさって次第により大きな液滴を形成する場合、凝集が生じたという。一部の場合では、液滴生成装置から生成された液滴の０．００００１％、０．００００５％、０．０００１０％、０．０００５０％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％未満が、他の液滴と凝集する。また、エマルジョンは、フロキュレーションが限定的であってもよく、フロキュレーションとは、分散相が懸濁液からフレーク状に沈殿するプロセスである。
約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００、もしくは５００ミクロンの、または約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００、もしくは５００ミクロン未満の、または約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００、もしくは５００ミクロンよりも大きな、または少なくとも約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００、もしくは５００ミクロンの平均直径を有する液滴を生成することができる。液滴は、約０．００１〜約５００、約０．０１〜約５００、約０．１〜約５００、約０．１〜約１００、約０．０１〜約１００、または約１〜約１００ミクロンの平均直径を有していてもよい。マイクロチャネルクロスフローフォーカシング（microchannel cross-flow focusing）または物理的な撹拌を使用して、単分散または多分散エマルジョンのいずれかが生成される、エマルジョン液滴を生成するためのマイクロ流体法が既知である。液滴は、単分散液滴であってもよい。液滴は、液滴のサイズが、液滴の平均サイズのプラスまたはマイナス５％を超えて変動しないように生成することができる。一部の場合では、液滴は、液滴のサイズが、液滴の平均サイズのプラスまたはマイナス２％を超えて変動しないように生成される。液滴生成装置は、単一試料から液滴の集団を生成することができ、液滴はいずれも、液滴の全集団の平均サイズのプラスまたはマイナス約０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、または１０％を超えてサイズが変動しない。
より高い機械的安定性は、マイクロ流体の操作、およびより高剪断での流体処理（例えば、マイクロ流体毛細管での、または流体経路中のバルブ等の９０度屈曲による）に有用であり得る。熱処理前または熱処理後の液滴またはカプセルは、標準的ピペット操作および遠心分離に対して機械的に安定であり得る。
液滴は、油相を水性試料に通して流動させることにより形成することができる。水相は、細胞、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、分子バーコード化ポリヌクレオチド、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチド、プライマー、鋳型核酸、ならびにＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および／または逆転写酵素等の酵素を含む、増幅反応を実施するための緩衝溶液および試薬を含んでいてもよい。
水相は、ビーズ等の固体表面を用いてまたは用いずに増幅反応を実施するための緩衝溶液および試薬を含んでいてもよい。緩衝溶液は、約１、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、もしくは２００ｍＭの、約１、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、もしくは２００ｍＭよりも多くの、または約１、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、もしくは２００ｍＭ未満のＴｒｉｓを含んでいてもよい。一部の場合では、塩化カリウムの濃度は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００ｍＭであるか、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００ｍＭよりも高いか、または約１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００ｍＭ未満であってもよい。緩衝溶液は、約１５ｍＭ Ｔｒｉｓおよび５０ｍＭ ＫＣｌを含んでいてもよい。ヌクレオチドは、濃度が、各々、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、もしくは７００μｍの、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、もしくは７００μｍよりも高い、または約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、もしくは７００μｍ未満のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰを含むデオキシリボヌクレオチド三リン酸分子を含んでいてもよい。一部の場合では、ｄＵＴＰは、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、もしくは７００、８００、９００、もしくは１０００μｍの、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、もしくは７００、８００、９００、もしくは１０００μｍよりも高い、または約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、もしくは７００、８００、９００、もしくは１０００μｍ未満の濃度になるように水相内に添加される。一部の場合では、塩化マグネシウムまたは酢酸マグネシウム（ＭｇＣｌ２）は、約１．０、２．０、３．０、４．０、もしくは５．０ｍＭの、約１．０、２．０、３．０、４．０、もしくは５．０ｍＭよりも高い、または約１．０、２．０、３．０、４．０、もしくは５．０ｍＭ未満の濃度で水相に添加される。ＭｇＣｌ２の濃度は、約３．２ｍＭであってもよい。一部の場合では、酢酸マグネシウムまたはマグネシウムが使用される。一部の場合では、硫酸マグネシウムが使用される。
ＢＳＡまたはウシ皮膚に由来するゼラチン等の非特異的ブロッキング剤を使用することができ、ゼラチンまたはＢＳＡは、およそ０．１〜０．９％ｗ／ｖの濃度範囲で存在する。他の考え得るブロッキング剤としては、ベータラクトグロブリン、カゼイン、粉乳、または他の一般的のブロッキング剤を挙げることができる。一部の場合では、ＢＳＡおよびゼラチンの好ましい濃度は、約０．１％ｗ／ｖである。
水相内の増幅用プライマーは、約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．５、１．７、もしくは２．０μｍの、約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．５、１．７、もしくは２．０μｍよりも高い、または約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．５、１．７、もしくは２．０μｍ未満の濃度を有していてもよい。水相内のプライマー濃度は、約０．０５〜約２、約０．１〜約１．０、約０．２〜約１．０、約０．３〜約１．０、約０．４〜約１．０、または約０．５〜約１．０μｍであってもよい。プライマーの濃度は、約０．５μｍであってもよい。ＰＣＲにおける標的核酸濃度の許容範囲は、限定されないが、約１ｐｇ〜約５００ｎｇの間が挙げられる。
また、一部の場合では、水相は、添加剤を含んでいてもよく、添加剤としては、これらに限定されないが、非特異的バックグラウンド／ブロッキング核酸（例えば、サケ精子ＤＮＡ）、バイオプリザバティブ（biopreservative）（例えば、アジ化ナトリウム）、ＰＣＲエンハンサー（例えば、ベタイン、トレハロース等）、および阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｅ阻害剤）が挙げられる。他の添加剤としては、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ベタイン（一）水和物（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン＝［カルボキシ（caroxy）−メチル］トリメチルアンモニウム、トレハロース、７−デアザ−２’−デオキシグアノシン三リン酸（ｄＣ７ＧＴＰまたは７−デアザ−２’−ｄＧＴＰ）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ホルムアミド（メタンアミド）、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、他のテトラアルキルアンモニウム誘導体（例えば、テトラエチルアンモニウムクロリド（tetraethyammonium chloride）（ＴＥＡ−Ｃｌ）およびテトラプロピルアンモニウムクロリド（ＴＰｒＡ−Ｃｌ））、非イオン性洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ−４０））、またはＰＲＥＸＣＥＬ−Ｑを挙げることができる。一部の場合では、水相は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０種の異なる添加剤を含んでいてもよい。他の場合では、水相は、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０種の異なる添加剤を含んでいてもよい。
一部の場合では、非イオン性エチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックコポリマーを、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、または１．０％の濃度で水相に添加してもよい。一般的なバイオサーファクタント（biosurfactant）としては、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、Ｔｅｔｒｏｎｉｃｓ、およびＺｏｎｙｌ ＦＳＮ等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８は、約０．５％ｗ／ｖの濃度で存在していてもよい。
一部の場合では、塩化マグネシウムの代わりに、硫酸マグネシウムを同様の濃度で用いることができる。種々の供給業者から市販されている広範な一般的ＰＣＲ緩衝液を、緩衝溶液の代わりに用いることができる。
エマルジョンは、加熱することにより固体様界面フィルムを有するマイクロカプセルへと変換することができる液体様界面フィルムを有する高度に単分散性の液滴を生成するように調合することができる。そのようなマイクロカプセルは、ＰＣＲ増幅等の反応プロセス中にわたって内容物を保持することが可能なバイオリアクターとして働くことができる。マイクロカプセル形態への変換は、加熱時に生じてもよい。例えば、そのような変換は、約５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃、または９５℃よりも高い温度で生じてもよい。一部の場合では、この加熱は、サーモサイクラーを使用して生じる。加熱プロセス中、流体または鉱油オーバーレイを使用して、蒸発を防止してもよい。過剰な連続相油は、加熱前に除去してもよく、または除去しなくてもよい。生体適合性カプセルは、幅広い熱的および機械的処理で凝集および／またはフロキュレーションに耐性であってもよい。変換後、カプセルは、約３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、もしくは４０℃で、約３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、もしくは４０℃よりも高い温度で、または約３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、もしくは４０℃未満で保管することができる。こうしたカプセルは、巨大分子、特に、核酸またはタンパク質または両方一緒の混合物を含有する水性生物学的流体の安定デジタル化封入；薬物およびワクチン送達；生体分子ライブラリー；および臨床イメージング用途等の、生物医学的用途に有用であり得る。
マイクロカプセルは、１つまたは複数のポリヌクレオチドを含有していてもよく、特に高温で凝集に耐性であってもよい。したがって、ＰＣＲ増幅反応は、非常に高い密度（例えば、１単位容積当たりの反応数）で生じてもよい。一部の場合では、１ｍｌ当たり１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、１，５００，０００、２，０００，０００、２，５００，０００、５，０００，０００、または１０，０００，０００よりも多くの別個の反応が生じてもよい。一部の場合では、反応は、単一のウェルにて、例えば、マイクロタイタープレートのウェルにて、反応容積間で相互混合を生じさせずに生じる。また、マイクロカプセルは、逆転写、プライマー伸長、および／またはＰＣＲ反応が生じることを可能にするために必要な他の成分、例えばプライマー、プローブ、ｄＮＴＰ、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ等を含有していてもよい。こうしたカプセルは、幅広い熱的および機械的処理で凝集およびフロキュレーションに耐性を示す。
一部の場合では、増幅ステップは、マイクロ流体に基づくデジタルＰＣＲまたは液滴デジタルＰＣＲ等のデジタルＰＣＲを実施することにより行われる。
液滴は、マイクロ流体システムまたはデバイスを使用して生成することができる。本明細書で使用される場合、「マイクロ」という接頭辞（例えば、「マイクロチャネル」または「マイクロ流体」の）は、一般的に、約１ｍｍ未満の、一部の場合では、約１００ミクロン（マイクロメートル）未満の幅または直径を有する要素または物品を指す。一部の場合では、要素または物品は、流体が流動し得るチャネルを含む。加えて、「マイクロ流体」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つのマイクロスケールチャネルを含むデバイス、装置、またはシステムを指す。
マイクロ流体システムおよびデバイスは、様々な状況で、典型的には小型実験室（例えば、臨床）分析の状況で記載されている。他の使用も同様に記載されている。例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ０１／８９７８８、ＷＯ２００６／０４０５５１、ＷＯ２００６／０４０５５４、ＷＯ２００４／００２６２７、ＷＯ２００８／０６３２２７、ＷＯ２００４／０９１７６３、ＷＯ２００５／０２１１５１、ＷＯ２００６／０９６５７１、ＷＯ２００７／０８９５４１、ＷＯ２００７／０８１３８５、およびＷＯ２００８／０６３２２７。
液滴は、一般的に、第２のキャリア流体内に、ある量の第１の試料流体を含む。当技術分野で既知の、液滴を形成するための任意の技法を、本発明の方法と共に使用することができる。例示の方法は、標的物質（例えば、免疫細胞）を含有する試料流体の流動を、流動中のキャリア流体の２つの対向流動と交差するように流動させることを含む。キャリア流体は、試料流体と不混和性である。試料流体を、流動中のキャリア流体の２つの対向流動と交差させることにより、標的物質を含有する個々の試料液滴内への試料流体の分配がもたらされる。
キャリア流体は、試料流体と不混和性である任意の流体であってもよい。例示のキャリア流体は、油である。ある特定の実施形態では、キャリア流体は界面活性剤を含む。
同じ方法を適用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、多重鎖置換増幅等の非ＰＣＲ系増幅反応、または当業者に既知の他の方法等の増幅反応用の試薬等の他の試薬を含有する個々の液滴を創出することができる。ＰＣＲに基づく増幅反応の実施に好適な試薬は当業者に既知であり、これらに限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼ、フォワードおよびリバースプライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ならびに１つまたは複数の緩衝液が挙げられる。
ある特定の実施形態では、流体区画は、標的物質（例えば、免疫細胞および／またはビーズ等の固体支持体）を含む第１の流体分配（例えば、液滴）および第２の流体（例えば、流体流動として、または液滴内）を提供することにより形成される。第１および第２の流体を合流させて、液滴を形成する。合流は、２つの流体に電場をかけることにより達成してもよい。ある特定の実施形態では、第２の流体は、ポリメラーゼ連鎖反応または増幅反応等の増幅反応を実施するための試薬を含有する。
ある特定の態様では、本発明は、固有にバーコード化された重鎖および軽鎖抗体配列ならびに／またはアルファおよびベータ鎖ＴＣＲ配列ならびに／またはガンマおよびデルタ鎖ＴＣＲ配列のライブラリーを作製するための方法であって、各構築物が固有のＮ量体および機能性Ｎ量体を含む複数の核酸構築物を得ることを含む方法を提供する。機能性Ｎ量体は、ランダムＮ量体、ＰＣＲプライマー、ユニバーサルプライマー、抗体、粘着末端、または任意の他の配列であってもよい。上記方法は、各々が固有の構築物の１つまたは複数のコピーを含有するＮ数の流体区画のＭ個のセットを作製することを含んでいてもよい。上記方法は、追加の構築物をセット内の各区画に添加し、これを各セットについて繰り返して、各々が固有な１対の構築物を含有するＮ×Ｍ個の区画を生成することにより、より高度な複雑さを有するバーコードライブラリーを創出することができる。これらの対をハイブリダイズまたはライゲーションして、新しい構築物を生成してもよい。バーコードライブラリー内の各構築物では、各固有Ｎ量体は、配列決定、プローブハイブリダイゼーション、他の方法、または方法の組合せにより識別するのに適していてもよい。
液滴ライブラリー
一般的に、液滴ライブラリーは、単一コレクション内に共にプールされているいくつかのライブラリー要素で構成される。ライブラリーは、複雑さが、単一のライブラリー要素から１×１０１５個またはそれよりも多くのライブラリー要素まで、様々であってもよい。各ライブラリー要素は、一定濃度の１つまたは複数の所与の成分である。要素は、これらに限定されないが、細胞、ビーズ、アミノ酸、タンパク質、ポリペプチド、核酸、ポリヌクレオチド、または小分子化合物であってもよい。要素は、分子バーコード、ベッセルバーコード、または両方等の識別子を含有していてもよい。
細胞ライブラリー要素としては、これらに限定されないが、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、初代細胞、培養細胞株、がん細胞、幹細胞、または任意の他の細胞タイプを挙げることができる。細胞ライブラリー要素は、１個から数万個までの数の細胞を個々の液滴に封入することにより調製される。封入細胞の数は、通常、細胞の数密度および液滴の容積からポアソン統計により求められる。しかしながら、一部の場合では、個数は、Eddら、Lab Chip、８巻（８号）：１２６２〜１２６４頁、２００８年に記載されているようにポアソン統計から逸脱する。細胞は性質が分散性であるため、ライブラリーを、全てが単一の開始培地に存在する、各々が１つの抗体またはＴＣＲを産生する免疫細胞等の複数の細胞バリアントを有する集団に調製することが可能であり、その後、その培地を、多くとも１つの細胞を含有する個々の液滴カプセルに分ける。その後、個々の液滴カプセル内の細胞を溶解し、溶解細胞に由来する重鎖および軽鎖ポリヌクレオチドならびに／またはアルファおよびベータ鎖ポリヌクレオチドならびに／またはガンマおよびデルタ鎖ポリヌクレオチドを、分子バーコードおよびベッセルでバーコード化し、増幅し、その後組み合わせ、またはプールして、重鎖および軽鎖ならびに／またはアルファおよびベータ鎖ならびに／またはガンマおよびデルタ鎖ライブラリー要素で構成されるライブラリーを形成する。
ビーズに基づくライブラリー要素は、１つまたは複数のビーズを含有し、また、抗体、酵素、または他のタンパク質等の他の試薬を含んでいてもよい。全てのライブラリー要素が異なるタイプのビーズを含有するが、周囲媒体が同じである場合、ライブラリー要素は全て、単一の開始流体から調製されていてもよく、または様々な開始流体を有していてもよい。バリアントのコレクションから集団に調製する細胞のライブラリーの場合、ライブラリー要素は、様々な開始流体から調製されることになる。複数の細胞から開始する場合、１液滴当たり正確に１つの細胞を有しており、１つよりも多くの細胞を含有する液滴が極少数であることが望ましい。一部の場合では、１液滴当たり正確に１つの細胞を含有する液滴がより多くなり、空の液滴または１つよりも多くの細胞を含有する液滴が少数の例外になるように、ポアソン統計からの変動を実現して、液滴の積み込み強化を提供することができる。
一部の実施形態では、複数のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドから開始する場合、１液滴当たり正確に１つのベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを有しており、１つよりも多くのベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを含有する液滴が極少数であることが望ましい。一部の場合では、１液滴当たり正確に１つのベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを有する液滴がより多くなり、空の液滴または１つよりも多くのベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを含む液滴が少数の例外になるように、ポアソン統計からの変動を実現して、液滴の積み込み強化を提供することができる。
液滴ライブラリーの例は、ビーズ、細胞、小分子、ＤＮＡ、プライマー、抗体、およびバーコード化ポリヌクレオチド等の様々な異なる内容物を有する液滴のコレクションである。液滴のサイズは、直径が、およそ０．５ミクロンから５００ミクロンまでの範囲であり、これは、約１ピコリットル〜１ナノリットルに対応する。しかしながら、液滴は、５ミクロンと小さくてもよく、５００ミクロンと大きくてもよい。好ましくは、液滴は、直径が、１００ミクロン未満、約１ミクロン〜約１００ミクロンである。最も好ましいサイズは、直径が、約２０〜４０ミクロン（１０〜１００ピコリットル）である。液滴ライブラリーの検討される好ましい特性としては、浸透圧バランス、均一なサイズ、およびサイズ範囲が挙げられる。
本発明により提供される液滴ライブラリー内に含まれる液滴は、サイズが、好ましくは均一である。すなわち、ライブラリー内の任意の液滴の直径は、同じライブラリー内の他の液滴の直径と比較して、５％、４％、３％、２％、１％、または０．５％未満しか変動しないだろう。ライブラリーの液滴のサイズが均一であることは、液滴の安定性および完全性を保つために重要である場合があり、また、後に、本明細書に記載されている種々の生物学的および化学的アッセイのために、ライブラリー内の液滴を使用するために不可欠である場合がある。
本発明は、不混和性流体内に複数の水性液滴を含み、各液滴が、好ましくはサイズが実質的に均一であり、異なるライブラリー要素を含む液滴ライブラリーを提供する。本発明は、液滴ライブラリーを形成するための方法であって、異なるライブラリー要素を含む単一の水性流体を準備すること、各ライブラリー要素を不混和性流体内の水性液滴内に封入することを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、異なるタイプの要素（例えば、細胞またはビーズ）を、同じ培地に含有される単一供給源にプールする。初期プールを行った後、要素を液滴に封入して、液滴のライブラリーを生成し、異なるタイプのビーズまたは細胞を有する各液滴は、異なるライブラリー要素である。初期溶液を希釈することにより、封入プロセスが可能になる。一部の実施形態では、形成される液滴は、単一の要素を含有することになるか、または何も含有しないことになる、つまり空になるかのいずれかである。他の実施形態では、形成される液滴は、ライブラリー要素の複数コピーを含有することになる。封入されている要素は、一般的に、あるタイプのバリアントである。一例では、要素は、血液試料の免疫細胞であり、各免疫細胞は、免疫細胞内の抗体のヌクレオチド配列を増幅およびバーコード化するために封入される。
例えば、１つのタイプのエマルジョンライブラリーには、異なる粒子、つまり異なる培地内の細胞またはバーコード化ポリヌクレオチドを有し、プールする前に封入されているライブラリー要素が存在する。一例では、指定数のライブラリー要素、つまりｎ数の異なる細胞またはバーコード化ポリヌクレオチドが、異なる培地内に含有されている。ライブラリー要素の各々は、別々に乳化およびプールされ、その地点で、ｎ数のプールされた異なるライブラリー要素の各々が組み合わされ、単一プールにプールされる。その結果として得られるプールは、各々が異なるタイプの粒子を含有する複数の油中水型エマルジョン液滴を含有する。
一部の実施形態では、形成される液滴は、単一のライブラリー要素を含有することになるか、または何も含有しないことになる、つまり空になるかのいずれかである。他の実施形態では、形成される液滴は、ライブラリー要素の複数コピーを含有することになる。ビーズの内容物は、ポアソン分布に従い、事象が既知の平均率で生じ、その直前の事象と時間的に独立している場合、ある一定期間にいくつかの事象が生じる確率を表す離散確率分布が存在する。ライブラリーを創出するために使用される油および界面活性剤は、ライブラリーの内容物が液滴間で交換されることを防止する。
プライマー
一般的に、１対または複数対のプライマーを増幅反応に使用することができる。プライマー対の１つのプライマーは、フォワードプライマーであってもよく、プライマー対の１つのプライマーは、リバースプライマーであってもよい。
一部の場合では、第１の対のプライマーを増幅反応に使用することができる。第１の対の１つのプライマーは、第１の標的ポリヌクレオチド分子の配列に相補的なフォワードプライマーであってもよく、第１の対の１つのプライマーは、リバースプライマーであってもよく、第１の標的ポリヌクレオチド分子の第２の配列と相補的であってもよく、第１の標的遺伝子座は、第１の配列と第２の配列との間に存在していてもよい。一部の実施形態では、第１の標的遺伝子座は、ＶＨまたはＶαまたはＶγ配列を含む。一部の実施形態では、第１の標的遺伝子座は、ＡＩＤ配列および／またはＡＭＢ配列を含む。
一部の場合では、第２の対のプライマーを増幅反応に使用することができる。第２の対の１つのプライマーは、第２の標的ポリヌクレオチド分子の第１の配列に相補的なフォワードプライマーであってもよく、第２の対の１つのプライマーは、第２の標的ポリヌクレオチド分子の第２の配列と相補的なリバースプライマーであってもよく、第２の標的遺伝子座は、第１の配列と第２の配列との間に存在していてもよい。一部の実施形態では、第２の標的遺伝子座は、ＶＬまたはＶβまたはＶδ配列を含む。
一部の場合では、第３の対のプライマーを増幅反応に使用することができる。第３の対の１つのプライマーは、第３の標的ポリヌクレオチド分子の第１の配列に相補的なフォワードプライマーであってもよく、第３の対の１つのプライマーは、第３の標的ポリヌクレオチド分子の第２の配列と相補的なリバースプライマーであってもよく、第３の標的遺伝子座は、第１の配列と第２の配列との間に存在していてもよい。一部の実施形態では、第３の標的遺伝子座は、分子バーコードまたはベッセルバーコード等のバーコードを含む。
フォワードプライマーおよびリバースプライマーの長さは、標的ポリヌクレオチドおよび標的遺伝子座の配列に依存していてもよい。例えば、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの長さおよび／またはＴＭは、最適化することができる。一部の場合では、プライマーは、長さが、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０個の、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０個よりも多くの、または約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０個未満のヌクレオチドであってもよい。一部の場合では、プライマーは、長さが、約１５〜約２０、約１５〜約２５、約１５〜約３０、約１５〜約４０、約１５〜約４５、約１５〜約５０、約１５〜約５５、約１５〜約６０、約２０〜約２５、約２０〜約３０、約２０〜約３５、約２０〜約４０、約２０〜約４５、約２０〜約５０、約２０〜約５５、約２０〜約６０個のヌクレオチドである。
プライマーは、鋳型ポリヌクレオチドと結合する前は、一本鎖ＤＮＡであってもよい。一部の場合では、プライマーは、初期には二本鎖配列を含む。プライマーの適切な長さは、プライマーの使用目的に依存していてもよいが、約６から約５０個までのヌクレオチド、または約１５から約３５個までのヌクレオチドの範囲であってもよい。短いプライマー分子の場合、一般的には、鋳型との十分に安定したハイブリッド複合体を形成するためには、より低い温度が必要とされる場合ある。一部の実施形態では、プライマーは、鋳型核酸の正確な配列を反映する必要はなく、鋳型とのハイブリダイズに十分な程度に相補的であればよい。一部の場合では、プライマーは、鋳型ポリヌクレオチドと結合する前は、部分的に二本鎖であってもよい。二本鎖配列を有するプライマーは、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個の、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個よりも多くの、または約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個未満の塩基のヘアピンループを有していてもよい。プライマーの二本鎖部分は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０個の、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０個よりも多くの、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０個未満の、または少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０個の塩基対であってもよい。所与の標的配列を増幅するための好適なプライマーの設計は、当技術分野で周知である。
プライマーには、プライマーの検出または固定化を可能にするが、プライマーの基本的な特性（例えば、ＤＮＡ合成開始地点として作用すること）を変更しない追加の特徴を組み込むことができる。例えば、プライマーは、標的核酸にハイブリダイズしないが、クローニングまたはさらなる増幅または増幅産物の配列決定を容易にする追加の核酸配列を５’末端に含有していてもよい。例えば、追加の配列は、ユニバーサルプライマー結合部位等のプライマー結合部位を含んでいてもよい。鋳型とハイブリダイズするのに十分な相補性を有するプライマーの領域は、本明細書では、ハイブリダイズ領域と呼ばれる場合がある。
別の場合では、本明細書に記載されている方法および組成物に利用されるプライマーは、１つまたは複数のユニバーサルヌクレオシドを含んでいてもよい。ユニバーサルヌクレオシドの非限定的な例は、米国特許出願公開第２００９／０３２５１６９号および第２０１０／０１６７３５３号に記載されている５−ニトロインドールおよびイノシンである。
プライマーは、二次構造および自己ハイブリダイゼーションを回避するための既知のパラメータに従って設計することができる。異なるプライマー対は、ほぼ同じ温度で、例えば、別のプライマー対の１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、または１０℃以内でアニーリングおよび融解してもよい。一部の場合では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、５００、１０００、５０００、１０，０００個、またはそれよりも多くのプライマーが、初期に使用される。そのようなプライマーは、本明細書に記載の標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる。
プライマーは、これらに限定されないが、適切な配列のクローニング、および当技術分野で周知の方法を使用した直接的化学合成を含む様々な方法により調製することができる（Narangら、Methods Enzymol.、６８巻：９０頁（１９７９年）；Brownら、Methods Enzymol.、６８巻：１０９頁（１９７９年））。また、プライマーは、商業的供給源から得ることができる。プライマーは、同一の融解温度を有していてもよい。プライマーは、非同一の融解温度を有していてもよい。プライマーの長さを、５’末端または３’末端で伸長または短縮して、所望の融解温度を有するプライマーを生成することができる。プライマー対のプライマーの一方は、他方のプライマーよりも長くてもよい。プライマー対内の、プライマーの３’アニーリング長は、異なっていてもよい。また、各プライマー対のアニーリング位置は、プライマー対の配列および長さが、所望の融解温度をもたらすように設計することができる。２５塩基対よりも短いプライマーの融解温度を決定するための式は、ウォーレスのルール（ＴＭ＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ））である。また、コンピュータプログラムを使用して、プライマーを設計してもよい。各プライマーのＴＭ（融解温度またはアニーリング温度）は、ソフトウェアプログラムを使用して算出することができる。プライマーのアニーリング温度は、これらに限定されないが、１、２、３、４、５サイクル目、６〜１０サイクル目、１０〜１５サイクル目、１５〜２０サイクル目、２０〜２５サイクル目、２５〜３０サイクル目、３０〜３５サイクル目、または３５〜４０サイクル目を含む、任意の増幅サイクル後に再計算し、増加させてもよい。最初の増幅サイクル後、プライマーの５’側半分を、各目的遺伝子座に由来する産物に組み込んでもよく、したがって、ＴＭは、各プライマーの５’側半分および３’側半分の両配列に基づいて再計算してもよい。
プライマー部位は、プライマーがハイブリダイズする鋳型の領域を含む。一部の実施形態では、プライマーは、鋳型指向核酸合成の開始点として作用することが可能である。例えば、プライマーは、４つの異なるヌクレオチド、およびＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素等の重合剤または酵素が存在する場合、鋳型指向核酸合成を開始させることができる。プライマー対は２つのプライマー：鋳型配列の５’末端とハイブリダイズする５’上流領域を有する第１のプライマー、および鋳型配列の３’末端の相補体とハイブリダイズする３’下流領域を有する第２のプライマーを含む。プライマーセットは、２つまたはそれよりも多くのプライマー：鋳型配列または複数の鋳型配列の５’末端とハイブリダイズする５’上流領域を有する第１のプライマーまたは第１の複数のプライマー、および鋳型配列または複数の鋳型配列の３’末端の相補体とハイブリダイズする３’下流領域を有する第２のプライマーまたは第２の複数のプライマーを含む。一部の実施形態では、プライマーは、標的特異的配列を含む。一部の実施形態では、プライマーは、試料バーコード配列を含む。一部の実施形態では、プライマーは、ユニバーサルプライミング配列を含む。一部の実施形態では、プライマーは、ＰＣＲプライミング配列を含む。一部の実施形態では、プライマーは、ポリヌクレオチドの増幅を開始させるために使用されるＰＣＲプライミング配列を含む。（Dieffenbach, PCR Primer: A Laboratory Manual、第２版（Cold Spring Harbor Press、New York（２００３年））。ユニバーサルプライマー結合部位または配列は、ポリヌクレオチドおよび／またはアンプリコンへのユニバーサルプライマーの付着を可能にする。ユニバーサルプライマーは当技術分野で周知であり、これらに限定されないが、−４７Ｆ（Ｍ１３Ｆ）、アルファＭＦ、ＡＯＸ３’、ＡＯＸ５’、ＢＧＨｒ、ＣＭＶ−３０、ＣＭＶ−５０、ＣＶＭｆ、ＬＡＣｒｍｔ、ラムダｇｔ１０Ｆ、ラムダｇｔ１０Ｒ、ラムダｇｔ１１Ｆ、ラムダｇｔ１１Ｒ、Ｍ１３リバース、Ｍ１３フォワード（−２０）、Ｍ１３リバース、メール（male）、ｐ１０ＳＥＱＰｐＱＥ、ｐＡ−１２０、ｐｅｔ４、ｐＧＡＰフォワード、ｐＧＬＲＶｐｒ３、ｐＧＬｐｒ２Ｒ、ｐＫＬＡＣ１４、ｐＱＥＦＳ、ｐＱＥＲＳ、ｐｕｃＵ１、ｐｕｃＵ２、リバースＡ、ｓｅｑＩＲＥＳｔａｍ、ｓｅｑＩＲＥＳｚｐｅｔ、ｓｅｑｏｒｉ、ｓｅｑＰＣＲ、ｓｅｑｐＩＲＥＳ−、ｓｅｑｐＩＲＥＳ＋、ｓｅｑｐＳｅｃＴａｇ、ｓｅｑｐＳｅｃＴａｇ＋、ｓｅｑｒｅｔｒｏ＋ＰＳＩ、ＳＰ６、Ｔ３−ｐｒｏｍ、Ｔ７−ｐｒｏｍ、およびＴ７−ｔｅｒｍＩｎｖが挙げられる。本明細書で使用される場合、付着は、共有結合による相互作用および非共有結合による相互作用の両方またはいずれかを指すことができる。ユニバーサルプライマー結合部位へのユニバーサルプライマーの付着を、ポリヌクレオチドおよび／またはアンプリコンの増幅、検出、および／または配列決定に使用してもよい。ユニバーサルプライマー結合部位は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個のヌクレオチドまたは塩基対を含んでいてもよい。別の例では、ユニバーサルプライマー結合部位は、少なくとも約１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、または１００００個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。一部の実施形態では、ユニバーサルプライマー結合部位は、１〜１０、１０〜２０、１０〜３０、または１０〜１００個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。一部の実施形態では、ユニバーサルプライマー結合部位は、約１〜９０、１〜８０、１〜７０、１〜６０、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１０、２〜９０、２〜８０、２〜７０、２〜６０、２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１０、１〜９００、１〜８００、１〜７００、１〜６００、１〜５００、１〜４００、１〜３００、１〜２００、１〜１００、２〜９００、２〜８００、２〜７００、２〜６００、２〜５００、２〜４００、２〜３００、２〜２００、２〜１００、５〜９０、５〜８０、５〜７０、５〜６０、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１０、１０〜９０、１０〜８０、１０〜７０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、１０〜１０、５〜９００、５〜８００、５〜７００、５〜６００、５〜５００、５〜４００、５〜３００、５〜２００、５〜１００、１０〜９００、１０〜８００、１０〜７００、１０〜６００、１０〜５００、１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００、１０〜１００、２５〜９００、２５〜８００、２５〜７００、２５〜６００、２５〜５００、２５〜４００、２５〜３００、２５〜２００、２５〜１００、１００〜１０００、１００〜９００、１００〜８００、１００〜７００、１００〜６００、１００〜５００、１００〜４００、１００〜３００、１００〜２００、２００〜１０００、２００〜９００、２００〜８００、２００〜７００、２００〜６００、２００〜５００、２００〜４００、２００〜３００、３００〜１０００、３００〜９００、３００〜８００、３００〜７００、３００〜６００、３００〜５００、３００〜４００、４００〜１０００、４００〜９００、４００〜８００、４００〜７００、４００〜６００、４００〜５００、５００〜１０００、５００〜９００、５００〜８００、５００〜７００、５００〜６００、６００〜１０００、６００〜９００、６００〜８００、６００〜７００、７００〜１０００、７００〜９００、７００〜８００、８００〜１０００、８００〜９００、または９００〜１０００個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。
プライマーは、プライマー伸長産物の合成におけるその使用と適合する長さを有していてもよい。プライマーは、長さが８〜２００個のヌクレオチドであるポリヌクレオチドであってもよい。プライマーの長さは、鋳型ポリヌクレオチドおよび鋳型遺伝子座の配列に依存していてもよい。例えば、プライマーまたはプライマーセットの長さおよび／または融解温度（ＴＭ）は最適化することができる。一部の場合では、プライマーは、長さが、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０個の、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０個よりも多くの、または約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０個未満のヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態では、プライマーは、長さが約８〜１００個のヌクレオチド、例えば、長さが１０〜７５、１５〜６０、１５〜４０、１８〜３０、２０〜４０、２１〜５０、２２〜４５、２５〜４０、７〜９、１２〜１５、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜４５、１５〜５０、１５〜５５、１５〜６０、２０〜２５、２０〜３０、２０〜３５、２０〜４５、２０〜５０、２０〜５５、または２０〜６０個の、およびそれら間の任意の長さのヌクレオチドである。一部の実施形態では、プライマーは、長さが、多くとも約１０、１２、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００個のヌクレオチドである。
一般的に、１対または複数対のプライマーを指数関数的増幅反応に使用することができる。プライマー対の１つのプライマーは、フォワードプライマーであってもよく、プライマー対の１つのプライマーは、リバースプライマーであってもよい。一部の実施形態では、第１の対のプライマーを指数関数的増幅反応に使用することができる。第１の対の１つのプライマーは、第１の鋳型ポリヌクレオチド分子の配列に相補的なフォワードプライマーであってもよく、第１の対の１つのプライマーは、第１の鋳型ポリヌクレオチド分子の第２の配列と相補的なリバースプライマーであってもよく、第１の鋳型遺伝子座は、第１の配列と第２の配列との間に存在していてもよい。一部の実施形態では、第２の対のプライマーを増幅反応に使用することができる。第２の対の１つのプライマーは、第２の標的ポリヌクレオチド分子の第１の配列に相補的なフォワードプライマーであってもよく、第２の対の１つのプライマーは、第２の標的ポリヌクレオチド分子の第２の配列と相補的なリバースプライマーであってもよく、第２の標的遺伝子座は、第１の配列と第２の配列との間に存在していてもよい。一部の実施形態では、第２の標的遺伝子座は、可変軽鎖抗体配列を含む。一部の実施形態では、第３の対のプライマーを増幅反応に使用することができる。第３の対の１つのプライマーは、第３の鋳型ポリヌクレオチド分子の第１の配列に相補的なフォワードプライマーであってもよく、第３の対の１つのプライマーは、第３の鋳型ポリヌクレオチド分子の第２の配列と相補的なリバースプライマーであってもよく、第３の鋳型遺伝子座は、第１の配列と第２の配列との間に存在していてもよい。
１つまたは複数のプライマーは、複数の鋳型ポリヌクレオチドの少なくとも部分にアニーリングすることができる。１つまたは複数のプライマーは、複数の鋳型ポリヌクレオチドの３’末端および／または５’末端にアニーリングすることができる。１つまたは複数のプライマーは、複数の鋳型ポリヌクレオチドの内部領域にアニーリングすることができる。内部領域は、複数の鋳型ポリヌクレオチドの３’末端または５’末端から、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、１００、１５０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、または１０００個のヌクレオチドであってもよい。１つまたは複数のプライマーは、一定のパネルのプライマーを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数の特注プライマーを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数の対照プライマーを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数のハウスキーピング遺伝子プライマーを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーを含んでいてもよい。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマー結合部位にアニーリングすることができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の特注プライマーは、ＳＢＣ、標的特異的領域、それらの相補体、またはそれらの任意の組合せにアニーリングする。１つまたは複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、プライマー伸長、逆転写、線形伸長、非指数関数的増幅、指数関数的増幅、ＰＣＲ、または１つもしくは複数の標的もしくは鋳型ポリヌクレオチドの任意の他の増幅法を増幅または実施するように設計することができる。
標的特異的領域は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、１００、１５０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、または１０００個のヌクレオチドまたは塩基対を含んでいてもよい。別の例では、標的特異的領域は、少なくとも約１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、または１００００個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。一部の実施形態では、標的特異的領域は、約５〜１０、１０〜１５、１０〜２０、１０〜３０、１５〜３０、１０〜７５、１５〜６０、１５〜４０、１８〜３０、２０〜４０、２１〜５０、２２〜４５、２５〜４０、７〜９、１２〜１５、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜４５、１５〜５０、１５〜５５、１５〜６０、２０〜２５、２０〜３０、２０〜３５、２０〜４５、２０〜５０、２０〜５５、２０〜６０、２〜９００、２〜８００、２〜７００、２〜６００、２〜５００、２〜４００、２〜３００、２〜２００、２〜１００、２５〜９００、２５〜８００、２５〜７００、２５〜６００、２５〜５００、２５〜４００、２５〜３００、２５〜２００、２５〜１００、１００〜１０００、１００〜９００、１００〜８００、１００〜７００、１００〜６００、１００〜５００、１００〜４００、１００〜３００、１００〜２００、２００〜１０００、２００〜９００、２００〜８００、２００〜７００、２００〜６００、２００〜５００、２００〜４００、２００〜３００、３００〜１０００、３００〜９００、３００〜８００、３００〜７００、３００〜６００、３００〜５００、３００〜４００、４００〜１０００、４００〜９００、４００〜８００、４００〜７００、４００〜６００、４００〜５００、５００〜１０００、５００〜９００、５００〜８００、５００〜７００、５００〜６００、６００〜１０００、６００〜９００、６００〜８００、６００〜７００、７００〜１０００、７００〜９００、７００〜８００、８００〜１０００、８００〜９００、または９００〜１０００個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。
プライマーは、二次構造および自己ハイブリダイゼーションを回避するための既知のパラメータに従って設計することができる。一部の実施形態では、異なるプライマー対は、ほぼ同じ温度で、例えば、別のプライマー対の１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、または１０℃以内でアニーリングおよび融解してもよい。一部の実施形態では、複数のプライマーの１つまたは複数のプライマーは、ほぼ同じ温度で、例えば、複数のプライマー中の別のプライマー対の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０℃以内でアニーリングおよび融解してもよい。一部の実施形態では、複数中の１つまたは複数のプライマーは、複数のプライマー中の別のプライマーとは異なる温度でアニーリングおよび融解してもよい。
本明細書に記載されている方法の１つまたは複数のステッブのための複数のプライマーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００個の、多くとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００個の、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００個の異なるプライマーを含む複数のプライマーを含んでいてもよい。例えば、複数のプライマーの各プライマーは、異なる標的または鋳型特異的領域または配列を含んでいてもよい。
逆転写
一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、逆転写によりＲＮＡから調製される。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ等を使用して、プライマー伸長によりＤＮＡから調製される。
本明細書に記載されている方法は、逆転写−ＰＣＲ併用法（coupled reverse transcription-PCR）（逆転写−ＰＣＲ）で使用することができる。例えば、逆転写およびＰＣＲは、２つの個別ステップで実施してもよい。最初に、ポリヌクレオチドｄＴプライマー、配列特異的プライマー、ユニバーサルプライマー、または本明細書に記載の任意のプライマーのいずれかを使用して、試料ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを合成してもよい。
逆転写およびＰＣＲは、単一の閉鎖ベッセル反応で実施してもよい。例えば、１つは逆転写用、２つはＰＣＲ用の３つのプライマーを用いてもよい。逆転写用のプライマーは、ＰＣＲアンプリコンの位置に対して３’側でｍＲＮＡと結合してもよい。必須ではないが、逆転写プライマーは、ＲＮＡ残基、またはｍＲＮＡにハイブリダイズしてもＲＮａｓｅＨの基質を形成することがない２’−ＯメチルＲＮＡ塩基等の修飾類似体を含んでいてもよい。
逆転写反応を実施する温度は、使用されている逆転写酵素に依存する。一部の場合では、熱安定性逆転写酵素が使用され、逆転写反応は、約３７℃〜約７５℃で、約３７℃〜約５０℃で、約３７℃〜約５５℃で、約３７℃〜約６０℃で、約５５℃〜約７５℃で、約５５℃〜約６０℃で、または約３７℃〜約６０℃で実施される。一部の場合では、３つまたはそれよりも多くの非鋳型末端ヌクレオチドを転写産物の末端に移動させる逆転写酵素が使用される。
本明細書に記載の逆転写反応およびＰＣＲ反応は、チューブ、マイクロタイタープレート、マイクロ流体デバイス、または好ましくは液滴内等の、当技術分野で公知の種々の形式で実施することができる。
逆転写反応は、５μＬから１００μＬまでの範囲の容積で、または１０μＬ〜２０μＬの反応容積で実施することができる。液滴の場合、反応容積は、１ｐＬから１００ｎＬまで、または１０ｐＬ〜１ｎＬの範囲であってもよい。一部の場合では、逆転写反応は、約１ｎＬまたはそれ未満の容積を有する液滴中で実施される。一部の場合では、ＰＣＲ反応は、１ｐＬから１００ｎＬまで、好ましくは１０ｐＬ〜１ｎＬの反応容積範囲を有する液滴中である。一部の場合では、ＰＣＲ反応は、約１ｎＬまたはそれ未満の容積を有する液滴中で実施される。一部の場合では、逆転写反応およびＰＣＲ反応は、１ｐＬから１００ｎＬまでの、または１０ｐＬ〜１ｎＬの反応容積範囲を有する同じ液滴内で実施される。一部の場合では、逆転写反応およびＰＣＲ反応は、約１ｎＬもしくはそれ未満の容積、または約１ｐＬもしくはそれ未満の容積を有する液滴内で実施される。一部の場合では、逆転写反応およびＰＣＲ反応は、異なる液滴内で実施される。一部の場合では、逆転写反応およびＰＣＲ反応は、各々が、１ｐＬから１００ｎＬまでの、または１０ｐＬ〜１ｎＬの反応容積範囲を有する複数の液滴内で実施される。一部の場合では、逆転写反応およびＰＣＲ反応は、各々が約１ｎＬまたはそれ未満の容積を有する複数の液滴内で実施される。
一部の場合では、第１のＰＣＲ反応は、１ｐＬから１００ｎＬまでの、好ましくは１０ｐＬ〜１ｎＬの範囲の反応容積を有する第１に液滴内であり、第２のＰＣＲ反応は、１ｐＬから１００ｎＬまでの、好ましくは１０ｐＬ〜１ｎＬの範囲の反応容積を有する第２の液滴内である。一部の場合では、第１のＰＣＲ反応は、約１ｎＬまたはそれ未満の容積を有する第１の液滴内であり、第２のＰＣＲ反応は、約１ｎＬまたはそれ未満の容積を有する第２の液滴内である。
一部の場合では、第１のＰＣＲ反応および第２のＰＣＲ反応は、各々が、１ｐＬから１００ｎＬまでの、または１０ｐＬから１ｎＬの反応容積範囲を有する複数の液滴内で実施される。一部の場合では、第１のＰＣＲ反応および第２のＰＣＲ反応は、各々が約１ｎＬまたはそれ未満の容積を有する複数の液滴内で実施される。
ＲＮＡ等の標的ポリヌクレオチドを、１つまたは複数の逆転写プライマーを使用してｃＤＮＡへと逆転写してもよい。１つまたは複数の逆転写プライマーは、定常領域等の、ＲＮＡの領域に相補的な領域（例えば、ｍＲＮＡの重鎖もしくは軽鎖定常領域またはポリＡテール）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、逆転写プライマーは、第１のＲＮＡの定常領域に相補的な領域を有する第１の逆転写プライマー、および第２のＲＮＡの定常領域に相補的な領域を有する第２の逆転写プライマーを含んでいてもよい。一部の実施形態では、逆転写プライマーは、それぞれ、第１のＲＮＡの定常領域に相補的な領域を有する第１の逆転写プライマー、および１つまたは複数のＲＮＡの定常領域に相補的な領域を有する１つまたは複数の逆転写プライマーを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、逆転写プライマーは、バーコードを含まない。
逆転写プライマーは、ＲＮＡの領域に相補的でない領域をさらに含んでいてもよい。一部の実施形態では、ＲＮＡの領域に相補的でない領域は、ＲＮＡに相補的なプライマーの領域に対して５’側である。一部の実施形態では、ＲＮＡの領域に相補的でない領域は、ＲＮＡに相補的なプライマーの領域に対して３’側である。一部の実施形態では、ＲＮＡの領域に相補的でない領域は、５’突出領域である。一部の実施形態では、ＲＮＡの領域に相補的でない領域は、増幅および／または配列決定反応用のプライミング部位を含む。本明細書に記載の１つまたは複数のプライマーを使用し、当技術分野で公知の好適な試薬を使用して、ＲＮＡ分子を逆転写する。
ＲＮＡ分子の逆転写反応を実施した後、得られたｃＤＮＡ分子を、分子バーコードおよびベッセルバーコードでバーコード化し、第１および／または第２のＰＣＲ反応等の、１つまたは複数のＰＣＲ反応により増幅してもよい。第１および／または第２のＰＣＲ反応には、１対のプライマーまたは複数のプライマー対を利用してもよい。第１および／または第２のＰＣＲ反応には、複数のフォワード／リバースプライマーおよびリバースプライマーを利用してもよい。第１および／または第２のＰＣＲ反応には、複数のフォワード／リバースプライマーおよびフォワードプライマーを利用してもよい。複数のフォワード／リバースプライマーの第１および／または第２のプライマーは、ｃＤＮＡ分子またはバーコード化ｃＤＮＡ分子に相補的な領域を含有するフォワード／リバースプライマーであってもよい。複数のフォワード／リバースプライマーの第１および／または第２のプライマーは、バーコード化ｃＤＮＡ分子に相補的な領域を含有するフォワード／リバースプライマーであってもよい。
一部の実施形態では、複数のフォワード／リバースプライマーは、１つまたは複数のフォワード／リバースプライマーを含み、複数のフォワード／リバースプライマーのフォワード／リバースプライマーの各々は、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの１つまたは複数の上流または下流領域に相補的な領域を含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの上流または下流領域に相補的な領域を含むフォワード／リバースプライマー、およびｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの１つまたは複数の他の上流または下流領域に相補的な領域を含む１つまたは複数の他のフォワード／リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマー、およびｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマー、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマー、およびｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの第３の上流または下流領域に相補的な領域を含む第３のフォワード／リバースプライマー等を含む。複数のフォワード／リバースプライマー中のプライマーを使用して、試料中の免疫Ｂ細胞またはＴ細胞等の細胞により発現されるあらゆるＶセグメントのあらゆる考え得る上流または下流領域にアニーリングすることができる。
一部の実施形態では、複数のフォワード／リバースプライマーは、１つまたは複数のフォワード／リバースプライマーを含み、複数のフォワード／リバースプライマー中のフォワード／リバースプライマーの各々は、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの１つまたは複数の上流または下流領域に相補的な領域を含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの上流または下流領域に相補的な領域を含むフォワード／リバースプライマー、およびｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの１つまたは複数の他の上流または下流領域に相補的な領域を含む１つまたは複数の他のフォワード／リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマー、およびｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマー、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマー、およびｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの第３の上流または下流領域に相補的な領域を含む第３のフォワード／リバースプライマー等を含む。複数のフォワード／リバースプライマー中のプライマーを使用して、試料中の免疫Ｂ細胞またはＴ細胞等の細胞により発現されるあらゆるＣセグメントのあらゆる考え得る上流または下流領域にアニーリングすることができる。
一部の実施形態では、複数のフォワード／リバースプライマーは、１つまたは複数のフォワード／リバースプライマーを含み、複数のフォワード／リバースプライマー中のフォワード／リバースプライマーの各々は、バーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの１つまたは複数の上流または下流領域に相補的な領域を含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、バーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの上流または下流領域に相補的な領域を含むフォワード／リバースプライマー、およびバーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの１つまたは複数の他の上流または下流領域に相補的な領域を含む１つまたは複数の他のフォワード／リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、バーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマー、およびバーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、バーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマー、バーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマー、およびバーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの第３の上流または下流領域に相補的な領域を含む第３のフォワード／リバースプライマー等を含む。複数のフォワード／リバースプライマーを使用して、試料中の免疫Ｂ細胞またはＴ細胞等の細胞により発現されるあらゆる分子バーコードのあらゆる考え得る上流または下流領域にアニーリングすることができる。
一部の実施形態では、複数のフォワード／リバースプライマーは、１つまたは複数のフォワード／リバースプライマーを含み、複数のフォワード／リバースプライマー中のフォワード／リバースプライマーの各々は、バーコード化ｃＤＮＡのベッセルバーコードの１つまたは複数の上流または下流領域に相補的な領域を含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、バーコード化ｃＤＮＡのベッセルバーコードの上流または下流領域に相補的な領域を含むフォワード／リバースプライマー、およびバーコード化ｃＤＮＡのベッセルバーコードの１つまたは複数の他の上流または下流領域に相補的な領域を含む１つまたは複数の他のフォワード／リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、バーコード化ｃＤＮＡのベッセルバーコードの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマー、およびバーコード化ｃＤＮＡのベッセルバーコードの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、バーコード化ｃＤＮＡのベッセルバーコードの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマー、バーコード化ｃＤＮＡのベッセルバーコードの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマー、およびバーコード化ｃＤＮＡのベッセルバーコードの第３の上流または下流領域に相補的な領域を含む第３のフォワード／リバースプライマー等を含む。複数のフォワード／リバースプライマー中のプライマーを使用して、試料中の免疫Ｂ細胞またはＴ細胞等の細胞により発現されるあらゆるベッセルバーコードのあらゆる考え得る上流または下流領域にアニーリングすることができる。
複数のフォワード／リバースプライマー中のフォワード／リバースプライマーは、ＲＮＡの領域に相補的でない領域をさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡの領域に相補的でない領域は、ＲＮＡに相補的なフォワード／リバースプライマーの領域に対して５’側である（つまり、Ｖセグメントの上流または下流領域）。一部の実施形態では、ＲＮＡの領域に相補的でない領域は、ＲＮＡに相補的なフォワード／リバースプライマーの領域に対して３’側である。一部の実施形態では、ＲＮＡの領域に相補的でない領域は、５’突出領域である。一部の実施形態では、ＲＮＡの領域に相補的でない領域は、増幅および／または第２の配列決定反応用のプライミング部位を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡの領域に相補的でない領域は、増幅および／または第３の配列決定反応用のプライミング部位を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡの領域に相補的でない領域は、第２および第３の配列決定反応用のプライミング部位を含む。一部の実施形態では、第２および第３の配列決定反応用のプライミング部位の配列は、同じである。本明細書に記載の１つまたは複数のフォワード／リバースプライマーおよびリバースプライマーを使用し、当技術分野で公知の好適な試薬を使用して、ｃＤＮＡ分子を増幅する。一部の実施形態では、領域は、ｍＲＮＡの定常領域またはポリＡテール等のＲＮＡの領域に相補的である。
一部の実施形態では、複数のフォワード／リバースプライマーは、１つまたは複数のフォワード／リバースプライマーを含み、複数のフォワード／リバースプライマー中のフォワード／リバースプライマーの各々は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのバーコード化オリゴヌクレオチドのベッセルバーコードの１つもしくは複数の上流または下流領域に相補的な領域を含む。一部の実施形態では、複数のフォワード／リバースプライマーは、１つまたは複数のフォワード／リバースプライマーを含み、複数のフォワード／リバースプライマー中のフォワード／リバースプライマーの各々は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのバーコード化オリゴヌクレオチドのＡＩＤの１つもしくは複数の上流または下流領域に相補的な領域を含む。一部の実施形態では、複数のフォワード／リバースプライマーは、１つまたは複数のフォワード／リバースプライマーを含み、複数のフォワード／リバースプライマー中のフォワード／リバースプライマーの各々は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのバーコード化オリゴヌクレオチドのＡＭＢの１つもしくは複数の上流または下流領域に相補的な領域を含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのバーコード化オリゴヌクレオチドのベッセルバーコード、ＡＩＤ、および／もしくはＡＭＢの上流または下流領域に相補的な領域を含むフォワード／リバースプライマー、ならびに、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのバーコード化オリゴヌクレオチドのベッセルバーコード、ＡＩＤ、および／もしくはＡＭＢの１つもしくは複数の他の上流または下流領域に相補的な領域を含む１つまたは複数の他のフォワード／リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのバーコード化オリゴヌクレオチドのベッセルバーコード、ＡＩＤ、および／もしくはＡＭＢの第１および／もしくは第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む、第１および／または第２のフォワード／リバースプライマー、ならびに、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのバーコード化オリゴヌクレオチドのベッセルバーコード、ＡＩＤ、および／もしくはＡＭＢの第２の上流もしくは下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのバーコード化オリゴヌクレオチドのベッセルバーコード、ＡＩＤ、および／もしくはＡＭＢの第１および／もしくは第２の上流もしくは下流領域に相補的な領域を含む、第１および／または第２のフォワード／リバースプライマー、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのバーコード化オリゴヌクレオチドのベッセルバーコード、ＡＩＤ、および／もしくはＡＭＢの第２の上流もしくは下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマー、ならびに、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのバーコード化オリゴヌクレオチドのベッセルバーコード、ＡＩＤ、および／もしくはＡＭＢの第３の上流もしくは下流領域に相補的な領域を含む第３のフォワード／リバースプライマーなどを含む。
増幅
ベッセルバーコードを標的ポリヌクレオチドに付加した後、標的ポリヌクレオチドを増幅することができる。例えば、ベッセルバーコードを親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドに付加した後、オリゴヌクレオチドを増幅することができる。例えば、ベッセルバーコードを細胞ポリヌクレオチドに付加した後、ベッセルバーコード化細胞ポリヌクレオチドを増幅することができる。
増幅反応は、１つまたは複数の添加剤を含んでいてもよい。一部の場合では、１つまたは複数の添加剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ベタイン（一）水和物（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン＝カルボキシ−メチル］トリメチルアンモニウム、トレハロース、７−デアザ−２’−デオキシグアノシン三リン酸（ｄＣ７ＧＴＰまたは７−デアザ−２’−ｄＧＴＰ）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ホルムアミド（メタンアミド）、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、他のテトラアルキルアンモニウム誘導体（例えば、テトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡ−Ｃｌ）およびテトラプロピルアンモニウムクロリド（ＴＰｒＡ−Ｃｌ））、非イオン性洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ−４０））、またはＰＲＥＸＣＥＬ−Ｑである。一部の場合では、増幅反応は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０種の異なる添加剤を含む。他の場合では、増幅反応は、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０種の異なる添加剤を含む。
反応容積（例えば、液滴）に含有されている試料に対して、熱サイクル反応を実施することができる。液滴は、多分散であってもよく、または好ましくは単分散であってもよく、当業者であれば、撹拌、超音波処理、またはマイクロ流体的にＴ型チャネル接合部を通過させること、または他の手段により生成することができる。密度は、２０，０００液滴／４０ｕｌ（１ｎＬ液滴）、２００，０００液滴／４０ｕｌ（１００ｐＬ液滴）を超えていてもよい。液滴は、熱サイクル中、完全性を保つことができる。液滴は、約１０，０００液滴／μＬ、１００，０００液滴／μＬ、２００，０００液滴／μＬ、３００，０００液滴／μＬ、４００，０００液滴／μＬ、５００，０００液滴／μＬ、６００，０００液滴／μＬ、７００，０００液滴／μＬ、８００，０００液滴／μＬ、９００，０００液滴／μＬ、または１，０００，０００液滴／μＬを超える密度で、熱サイクル中に完全性を保つことができる。他の場合では、２つまたはそれよりも多くの液滴が、熱サイクル中に凝集しない。他の場合では、１００個よりも多くのまたは１，０００個よりも多くの液滴が、熱サイクル中に凝集しない。
これらに限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ１のクレノー断片、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージ２９、ＲＥＤＴａｑ（商標）、ゲノムＤＮＡポリメラーゼ、またはシーケナーゼを含む、プライマー伸長を触媒する任意のＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。一部の場合では、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが使用される。また、ポリメラーゼを添加する前に反応を２分間９５℃に加熱するか、または１サイクル目の最初の加熱ステップまでポリメラーゼを不活性にしておくことができるホットスタートＰＣＲを実施してもよい。ホットスタートＰＣＲを使用すると、非特異的増幅を最小限に抑えることができる。任意の回数のＰＣＲサイクル、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、もしくは４５回のサイクル、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、もしくは４５回よりも多くのサイクル、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、もしくは４５回未満のサイクルを使用してＤＮＡを増幅することができる。増幅サイクルの回数は、約１〜４５、１０〜４５、２０〜４５、３０〜４５、３５〜４５、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１０〜１５、２０〜３５、２５〜３５、３０〜３５、または３５〜４０であってもよい。
標的核酸の増幅は、当技術分野で公知の任意の手段により実施することができる。標的核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または等温ＤＮＡ増幅により増幅してもよい。使用することができるＰＣＲ技法の例としては、これらに限定されないが、定量ＰＣＲ、定量蛍光ＰＣＲ（ＱＦ−ＰＣＲ）、マルチプレックス蛍光ＰＣＲ（ＭＦ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（逆転写−ＰＣＲ）、単一細胞ＰＣＲ、制限断片長多型ＰＣＲ（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ／逆転写−ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ホットスタートＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ｉｎ ｓｉｔｕポロニーＰＣＲ、ｉｎ ｓｉｔｕローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、ブリッジＰＣＲ、ピコリットルＰＣＲ、およびエマルジョンＰＣＲが挙げられる。他の好適な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ）、転写増幅法、分子反転プローブ（ＭＩＰ）ＰＣＲ法、自家持続配列複製法、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅法、コンセンサス配列プライムドポリメラーゼ連鎖反応法（ＣＰ−ＰＣＲ；consensus sequence primed polymerase chain reaction）、任意プライムドポリメラーゼ連鎖反応法（ＡＰ−ＰＣＲ；arbitrarily primed polymerase chain reaction）、ディジェネレートポリヌクレオチドプライムドＰＣＲ法（ＤＯＰ−ＰＣＲ；degenerate polynucleotide-primed PCR）、および核酸に基づく配列増幅法（ＮＡＢＳＡ；nucleic acid based sequence amplification）挙げられる。本明細書で使用することができる他の増幅方法としては、米国特許第５，２４２，７９４号、第５，４９４，８１０号、第４，９８８，６１７号、および第６，５８２，９３８号に記載されているもの、ならびにＱベータレプリカーゼ媒介性ＲＮＡ増幅法が挙げられる。増幅は、等温増幅、例えば等温線形増幅であってもよい。
一部の実施形態では、増幅は、固体支持体では生じない。一部の実施形態では、増幅は、液滴内の固体支持体では生じない。一部の実施形態では、増幅が液滴内でない場合、増幅は、固体支持体で生じる。
配列決定
本明細書に記載されている方法または方法ステップの１つまたは複数を実施した後、生成されたポリヌクレオチドのライブラリーを配列決定してもよい。
配列決定は、当技術分野で公知の任意の配列決定法により実施することができる。一部の実施形態では、配列決定は、ハイスループットで実施することができる。好適な次世代シークエンシング技術としては、４５４ライフサイエンスプラットフォーム（Ｒｏｃｈｅ、ブランフォード、コネティカット州）（Marguliesら、Nature、４３７巻、３７６〜３８０頁（２００５年））；Ｉｌｌｕｍｉｎａのゲノムアナライザー、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅメチル化アッセイ、またはＩｎｆｉｎｉｕｍメチル化アッセイ、つまりＩｎｆｉｎｉｕｍ ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ２７Ｋ ＢｅａｄＡｒｒａｙ、またはＶｅｒａＣｏｄｅ ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅメチル化アレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、サンディエゴ、カリフォルニア州、Bibkovaら、Genome Res.、１６巻、３８３〜３９３頁（２００６年）、および米国特許第６，３０６，５９７号、第７，５９８，０３５号、第７，２３２，６５６号）、またはライゲーションによるＤＮＡ配列決定、ＳＯＬｉＤシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国特許第６，７９７，４７０号、第７，０８３，９１７号、第７，１６６，４３４号、第７，３２０，８６５号、第７，３３２，２８５号、第７，３６４，８５８号、および第７，４２９，４５３号）；またはＨｅｌｉｃｏｓ Ｔｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡ配列決定技術（Harrisら、Science、３２０巻、１０６〜１０９頁（２００８年）；および米国特許第７，０３７，６８７号、第７，６４５，５９６号、第７，１６９，５６０号、および第７，７６９，４００号）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの一分子リアルタイム（ＳＭＲＴＴｍ）技術および配列決定法（Soniら、Clin. Chem.、５３巻、１９９６〜２００１頁（２００７年））が挙げられる。こうしたシステムは、試料から単離された多数のポリヌクレオチドのマルチプレックス並列配列決定を可能にする（Dear、Brief Funct. Genomic Proteomic、１巻（４号）、３９７〜４１６頁（２００３年）、およびMcCaughanら、J. Pathol.、２２０巻、２９７〜３０６頁（２０１０年））。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、色素修飾プローブのライゲーションによる配列決定法、ピロシーケンス法、または一分子配列決定法により配列決定される。ポリヌクレオチドの配列の決定は、Ｈｅｌｉｏｓｃｏｐｅ（商標）一分子配列決定法、ナノポアＤＮＡ配列決定法、Ｌｙｎｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの大規模並列シグネチャー配列決定法（ＭＰＳＳ）、４５４ピロシーケンス法、一分子リアルタイム（ＲＮＡＰ）配列決定法、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）配列決定法、ＳＯＬｉＤ配列決定法、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）、イオン半導体配列決定法、一分子ＳＭＲＴ（商標）配列決定法、ポロニー配列決定法、ＤＮＡナノボール配列決定法、およびＶｉｓｉＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ手法等の配列決定法により実施することができる。あるいは、ポリヌクレオチドの配列の決定には、これらに限定されないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａが提供するゲノムアナライザーＩＩｘ、ＨｉＳｅｑ、およびＭｉＳｅｑ；Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア）が提供するＰａｃＢｉｏ ＲＳシステムおよびＳｏｌｅｘａシーケンサー等の一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））技術；Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｉｎｃ．（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）が提供するＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）等のＴｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｔＳＭＳ（商標））技術を含む配列決定プラットフォームを使用してもよい。配列決定は、ＭｉＳｅｑ配列決定を含んでいてもよい。配列決定は、ＨｉＳｅｑ配列決定を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの配列の決定は、ペアエンド配列決定法、ナノポア配列決定法、ハイスループット配列決定法、ショットガン配列決定法、色素ターミネーター配列決定法、多重プライマーＤＮＡ配列決定法、プライマーウォーキング法、サンガー式ジデオキシ配列決定法、マクシム−ギルバート配列決定法、ピロシーケンス法、ｔｒｕｅ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ配列決定法、またはそれらの任意の組合せを含む。あるいは、ポリヌクレオチドの配列は、電子顕微鏡または化学感応性電界効果トランジスター（ｃｈｅｍＦＥＴ）アレイにより決定してもよい。
方法は、ライブラリー中の１つまたは複数のポリヌクレオチドを配列決定することをさらに含んでいてもよい。方法は、ライブラリー中の１つまたは複数のポリヌクレオチド配列、配列読み取り、アンプリコン配列、またはアンプリコンセット配列を互いにアラインすることをさらに含んでいてもよい。
アラインメントは、配列読み取り等の試験配列を、１つまたは複数の他の試験配列、参照配列、またはそれらの組合せと比較することを含んでいてもよい。一部の実施形態では、アラインメントを使用して、複数の配列またはアラインされた配列からコンセンサス配列を決定してもよい。一部の実施形態では、アラインメントは、各々が同一の分子バーコードまたはベッセルバーコードを有する複数の配列からコンセンサス配列を決定することを含む。一部の実施形態では、比較目的でアラインされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。２つまたはそれよりも多くの配列の実際の比較は、周知の方法により、例えば数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。そのような数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Karlin, S.およびAltschul, S.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９０巻−５８７３〜５８７７頁（１９９３年）に記載されている。そのようなアルゴリズムは、Altschul, S.ら、Nucleic Acids Res.、２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９９７年）に記載されているＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）の任意の関連パラメータを使用してもよい。例えば、配列比較のパラメータは、スコア＝１００、ワード長＝１２に設定してもよく、または様々であってもよい（例えば、Ｗ＝５またはＷ＝２０）。他の例としては、MyersおよびMiller、CABIOS（１９８９年）のアルゴリズム、ＡＤＶＡＮＣＥ、ＡＤＡＭ、ＢＬＡＴ、およびＦＡＳＴＡが挙げられる。一部の実施形態では、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、ケンブリッジ、英国）のＧＡＰプログラムを使用して達成することができる。
配列決定は、ポリヌクレオチドの少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個、またはそれよりも多くのヌクレオチドまたは塩基対を配列決定することを含んでいてもよい。一部の実施形態では、配列決定は、ポリヌクレオチドの少なくとも約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個、またはそれよりも多くのヌクレオチドまたは塩基対を配列決定することを含む。他の場合では、配列決定は、ポリヌクレオチドの少なくとも約１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００個、またはそれよりも多くのヌクレオチドまたは塩基対を配列決定することを含む。
配列決定は、１実行当たり、少なくとも約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個、またはそれよりも多くの配列決定読み取りを含んでいてもよい。本明細書で使用される場合、配列読み取りは、配列決定技法により生成されるデータの配列またはストリームから決定されるヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、配列決定は、１実行当たり、少なくとも約１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００個、またはそれよりも多くの配列決定読み取りを含む。配列決定は、１実行当たり、約１，０００，０００，０００個よりも多くの、約１，０００，０００，０００個未満の、または約１，０００，０００，０００個に等しい配列決定読み取りを含んでいてもよい。配列決定は、１実行当たり、約２００，０００，０００個よりも多くの、約２００，０００，０００個未満の、または約２００，０００，０００個に等しい配列決定読み取りを含んでいてもよい。
酵素
本明細書で開示されている方法およびキットは、１つまたは複数の酵素を含んでいてもよい。酵素の例としては、これらに限定されないが、リガーゼ、逆転写酵素、ポリメラーゼ、および制限ヌクレアーゼが挙げられる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに対するアダプターの付着は、１つまたは複数のリガーゼを使用することを含む。リガーゼの例としては、これらに限定されないが、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶ、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ等のＤＮＡリガーゼ；ならびにＴ４ ＲＮＡリガーゼＩおよびＴ４ ＲＮＡリガーゼＩＩ等のＲＮＡリガーゼが挙げられる。
本明細書で開示されている方法およびキットは、１つまたは複数の逆転写酵素を使用することをさらに含んでいてもよい。一部の実施形態では、逆転写酵素は、ＨＩＶ−１逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、およびテロメラーゼ逆転写酵素である。一部の実施形態では、逆転写酵素は、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素である。
一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法およびキットは、１つまたは複数のプロテアーゼを使用することを含む。
一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法およびキットは、１つまたは複数のポリメラーゼを使用することを含む。ポリメラーゼの例としては、これらに限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素、およびＤＮＡポリメラーゼＩＶである。商業的に入手可能なＤＮＡポリメラーゼとしては、これらに限定されないが、Ｂｓｔ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ２．０ＷａｒｍＳｔａｒｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、スルフォロブスＤＮＡポリメラーゼＩＶ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎ（商標）ｍＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ（商標）（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｍｏ ＫｌｅｎＴａｑ（商標）、ＬｏｎｇＡｍｐ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＯｎｅＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５（商標）高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）γＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、Ｔｉｔａｎｉｕｍ（登録商標）Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＡＰＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、およびＫＡＰＡ ＴａｑホットスタートＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
一部の実施形態では、ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ｐｈｉ６ ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ等のＲＮＡポリメラーゼである。
追加の試薬
本明細書で開示されている方法およびキットは、１つまたは複数の試薬を使用することを含んでいてもよい。試薬の例としては、これらに限定されないが、ＰＣＲ試薬、ライゲーション試薬、逆転写試薬、酵素試薬、ハイブリダイゼーション試薬、試料調製試薬、親和性捕捉試薬、ビーズ等の固体支持体、ならびに核酸精製および／または単離用の試薬が挙げられる。
他の実施形態では、本明細書で開示されている方法、キット、および組成物は、支持体を含んでいてもよい。一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法、キット、および組成物は、支持体を含まない。典型的には、固体支持体は、１つまたは複数の剛性または半剛性表面を含む１つまたは複数の材料を含む。一部の実施形態では、支持体は非固体支持体である。支持体または基材は、膜、紙、プラスチック、被覆表面、平坦表面、ガラス、スライド、チップ、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。一部の実施形態では、支持体の１つまたは複数の表面は実質的に平坦であるが、一部の実施形態では、例えば、ウェル、隆起領域、ピン、またはエッチングされた溝等を有する、様々な化合物のための合成領域が物理的に分離されていることが望ましい場合がある。一部の実施形態では、固体支持体は、ビーズ、樹脂、ゲル、ミクロスフェア、または他の幾何学的構成を含む。あるいは、固体支持体は、シリカチップ、マイクロ粒子、ナノ粒子、プレート、およびアレイを含んでいてもよい。固体支持体は、マイクロウェルでの自己集合可能なビーズの使用を含んでいてもよい。例えば、固体支持体は、ＩｌｌｕｍｉｎａのＢｅａｄＡｒｒａｙ技術を含む。あるいは、固体支持体は、Ａｂｂｏｔｔ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＢｅａｄ Ａｒｒａｙ技術、およびＡｐｐｌｉｅｄ ＭｉｃｒｏａｒｒａｙのＦｌｅｘｉＰｌｅｘ（商標）システムを含む。他の例では、固体支持体は、プレートである。プレートの例としては、これらに限定されないが、ＭＳＤマルチアレイプレート、ＭＳＤ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｐｏｔ（登録商標）プレート、マイクロプレート、ＰｒｏｔｅＯｎマイクロプレート、ＡｌｐｈａＰｌａｔｅ、ＤＥＬＦＩＡプレート、ＩｓｏＰｌａｔｅ、およびＬｕｍａＰｌａｔｅが挙げられる。一部の実施形態では、支持体は、複数のビーズを含んでいてもよい。一部の実施形態では、支持体は、アレイを含んでいてもよい。一部の実施形態では、支持体は、ガラススライドを含んでいてもよい。ポリマーに適用可能な方法、基材、および技法（米国特許第５，７４４，３０５号、５，１４３，８５４号、第５，２４２，９７４号、第５，２５２，７４３号、第５，３２４，６３３号、第５，３８４，２６１号、第５，４０５，７８３号、第５，４２４，１８６号、第５，４５１，６８３号、第５，４８２，８６７号、第５，４９１，０７４号、第５，５２７，６８１号、第５，５５０，２１５号、第５，５７１，６３９号、第５，５７８，８３２号、第５，５９３，８３９号、第５，５９９，６９５号、第５，６２４，７１１号、第５，６３１，７３４号、第５，７９５，７１６号、第５，８３１，０７０号、第５，８３７，８３２号、第５，８５６，１０１号、第５，８５８，６５９号、第５，９３６，３２４号、第５，９６８，７４０号、第５，９７４，１６４号、第５，９８１，１８５号、第５，９８１，９５６号、第６，０２５，６０１号、第６，０３３，８６０号、第６，０４０，１９３号、第６，０９０，５５５号、第６，１３６，２６９号、第６，２６９，８４６号、および第６，４２８，７５２号；米国特許出願公開第２００９０１４９３４０号、第２００８００３８５５９号、第２００５００７４７８７；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ００／５８５１６、ＷＯ９９／３６７６０、およびＷＯ０１／５８５９３）。支持体へのポリヌクレオチドの付着は、アミン−チオール架橋、マレイミド架橋、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、またはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、Ｚｅｎｏｎ、またはＳｉｔｅＣｌｉｃｋを含んでいてもよい。支持体への標識核酸の付着は、ビオチンを複数のポリヌクレオチドに付着させること、および１つまたは複数のビーズをストレプトアビジンでコーティングすることを含んでいてもよい。一部の実施形態では、支持体はビーズである。ビーズの例としては、これらに限定されないが、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、ＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズ、抗体コンジュゲートビーズ（例えば、抗免疫グロブリンマイクロビーズ）、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、ポリヌクレオチドｄＴコンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、およびＢｃＭａｇ（商標）カルボキシ末端磁気ビーズが挙げられる。ビーズの直径は、約５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、または５０μｍであってもよい。固体支持体は、アレイまたはマイクロアレイであってもよい。固体支持体は、個別の領域を含んでいてもよい。固体支持体は、アレイ、例えばアドレス可能なアレイであってもよい。
固体支持体は、事実上あらゆる不溶性または固体材料を含むことができ、水に不溶性である固体支持体組成物が選択されることが多い。例えば、固体支持体は、シリカゲル、ガラス（例えば、細孔制御ガラス（ＣＰＧ））、ナイロン、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、セルロース、金属表面（例えば、鋼、金、銀、アルミニウム、ケイ素、および銅）、磁性材料、プラスチック材料（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル、およびポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ））等を含んでいてもよく、またはこれらから本質的になっていてもよい。本実施形態により使用されるビーズの例としては、ビーズと核酸分子との相互作用を可能にする親和性部分を挙げることができる。固相（例えば、ビーズ）は、結合対のメンバー（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、またはそれらの誘導体）を含んでいてもよい。例えば、ビーズは、ストレプトアビジンがコーティングされたビーズであってもよく、ビーズに固定する核酸分子は、ビオチン部分を含んでいてもよい。一部の場合では、各ポリヌクレオチド分子は、ポリヌクレオチドをさらに安定させるために、ビオチン等の２つの親和性部分を含んでいてもよい。ビーズは、核酸の固定に使用するための、または下流でのスクリーニングまたは選択プロセスで使用することができる追加の特徴を含んでいてもよい。例えば、ビーズは、親和性部分、蛍光標識、または蛍光クエンチャーを含んでいてもよい。一部の場合では、ビーズは、磁性であってもよい。一部の例では、支持体はビーズである。ビーズの例としては、これらに限定されないが、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、ＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズ、抗体コンジュゲートビーズ（例えば、抗免疫グロブリンマイクロビーズ）、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、ポリヌクレオチドｄＴコンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、およびＢｃＭａｇ（商標）カルボキシ末端磁気ビーズが挙げられる。ビーズまたは粒子は、膨潤可能であってもよく（例えば、Ｗａｎｇ樹脂等のポリマー性ビーズ）、または膨潤不能であってもよい（例えば、ＣＰＧ）。一部の実施形態では、固相は、実質的に親水性である。一部の実施形態では、固相（例えば、ビーズ）は、実質的に疎水性である。一部の実施形態では、固相は、結合対のメンバー（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、またはそれらの誘導体）を含み、実質的に疎水性または実質的に親水性である。一部の実施形態では、固相は、結合対のメンバー（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、またはそれらの誘導体）を含み、固体支持体１ｍｇ当たり約１３５０ピコモルの遊離捕捉剤（例えば、遊離ビオチン）よりも高い結合能を有する。一部の実施形態では、結合対のメンバーを含む固相の結合能は、固体支持体１ｍｇ当たり、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１８００、２０００ピコモルの遊離捕捉剤よりも高い。本発明に好適なビーズの他の例は、金コロイド、またはポリスチレンビーズもしくはシリカビーズ等のビーズである。実質的に任意のビーズ半径を使用することができる。ビーズの例としては、１５０ナノメートルから１０ミクロンまでの範囲の半径を有するビーズを挙げることができる。他のサイズも使用することができる。
本明細書で開示されている方法およびキットは、１つまたは複数の緩衝液を使用することを含んでいてもよい。緩衝液の例としては、これらに限定されないが、洗浄緩衝液、ライゲーション緩衝液、ハイブリダイゼーション緩衝液、増幅緩衝液、および逆転写緩衝液が挙げられる。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション緩衝液は、ＴＭＡＣ Ｈｙｂ溶液、ＳＳＰＥハイブリダイゼーション溶液、およびＥＣＯＮＯ（商標）ハイブリダイゼーション緩衝液等の商業的に入手可能な緩衝液である。本明細書で開示されている緩衝液は、１つまたは複数の洗剤を含んでいてもよい。
本明細書で開示されている方法およびキットは、１つまたは複数の担体を使用することを含んでいてもよい。担体は、本明細書で開示されている１つまたは複数の反応（例えば、ライゲーション反応、逆転写、増幅、ハイブリダイゼーション）の効率を増強または向上させることができる。担体は、分子またはそれらの任意の産物（例えば、ポリヌクレオチドおよび／またはアンプリコン）の非特異性の喪失を減少または防止することができる。例えば、担体は、表面への吸収によるポリヌクレオチドの非特異性の喪失を減少させることができる。担体は、表面または基材（例えば、容器、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ、ピペットチップ）へのポリヌクレオチドの親和性を減少させることができる。あるいは、担体は、表面または基材（例えば、ビーズ、アレイ、ガラス、スライド、チップ）へのポリヌクレオチドの親和性を増加させることができる。担体は、ポリヌクレオチドの分解を防止することができる。例えば、担体は、リボヌクレアーゼからＲＮＡ分子を保護することができる。あるいは、担体は、ＤＮａｓｅからＤＮＡ分子を保護することができる。担体の例としては、これらに限定されないが、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ等のポリヌクレオチド、またはポリペプチドが挙げられる。ＤＮＡ担体の例としては、プラスミド、ベクター、ポリアデニル化ＤＮＡ、およびＤＮＡポリヌクレオチドが挙げられる。ＲＮＡ担体の例としては、ポリアデニル化ＲＮＡ、ファージＲＮＡ、ファージＭＳ２ ＲＮＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡ、酵母ＲＮＡ、酵母ｔＲＮＡ、哺乳動物ＲＮＡ、哺乳動物ｔＲＮＡ、短鎖ポリアデニル化合成リボヌクレオチド、およびＲＮＡポリヌクレオチドが挙げられる。ＲＮＡ担体は、ポリアデニル化ＲＮＡであってもよい。あるいは、ＲＮＡ担体は、非ポリアデニル化ＲＮＡであってもよい。一部の実施形態では、担体は、細菌、酵母、またはウイルスに由来する。例えば、担体は、細菌、酵母、またはウイルスに由来するポリヌクレオチドまたはポリペプチドであってもよい。例えば、担体は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓに由来するタンパク質である。別の例では、担体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに由来するポリヌクレオチドである。あるいは、担体は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ヤギ、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、またはウサギ）、トリ、両生類、または爬虫類に由来するポリヌクレオチドまたはペプチドである。
本明細書で開示されている方法およびキットは、１つまたは複数の対照物質を使用することを含んでいてもよい。対照物質としては、対照ポリヌクレオチド、不活性酵素、非特異的競合物質を挙げることができる。あるいは、対照物質は、ブライトハイブリダイゼーション（bright hybridization）、ブライトプローブ対照、核酸鋳型、スパイクイン対照、ＰＣＲ増幅対照を含む。ＰＣＲ増幅対照は、陽性対照であってもよい。他の例では、ＰＣＲ増幅対照は、陰性対照である。核酸鋳型対照は、既知の濃度であってもよい。対照物質は、１つまたは複数の標識を含んでいてもよい。
スパイクイン対照は、反応または試料に添加される鋳型であってもよい。例えば、スパイクイン鋳型を、増幅反応に添加してもよい。スパイクイン鋳型は、最初の増幅サイクル後の任意の時点で増幅反応に添加してもよい。一部の実施形態では、スパイクイン鋳型は、サイクル数が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０回に達した後で、増幅反応に添加される。スパイクイン鋳型は、最後の増幅サイクル前の任意の時点で増幅反応に添加してもよい。スパイクイン鋳型は、１つまたは複数のヌクレオチドまたは核酸塩基対を含んでいてもよい。スパイクイン鋳型は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。スパイクイン鋳型は、１つまたは複数の標識を含んでいてもよい。
本明細書で開示されているものは、本明細書で開示されている方法および組成物に使用することができる、方法および組成物と共に使用することができる、方法および組成物を調製するために使用することができる、分枝、材料、組成物および成分であり、または方法および組成物の産物である。これら物質の組合せ、サブセット、相互作用、グループ等が開示されている場合、これら分子および化合物の様々な個々のおよび集合的な組合せおよび順列に対する具体的な参照を明示的に開示することができない場合でも、各々は、本明細書にて具体的に企図および記載されていることが理解される。例えば、ヌクレオチドまたは核酸が開示および考察され、そのヌクレオチドまたは核酸を含むいくつかの分子になすことができるいくつかの修飾が考察されている場合、特に別様の指示がない限り、ヌクレオチドまたは核酸のありとあらゆる組合せおよび順列ならびに考え得る修飾が、具体的に企図されている。この概念は、本開示の方法および組成物を作製および使用するための方法のことを含むがそれらに限定されない、本出願の全ての態様に当てはまる。したがって、実施することができる様々な追加ステップが存在する場合、そうした追加ステップの各々は、本開示の方法の任意の特定の実施形態でまたは実施形態を組み合わせて実施することができ、各々のそのような組合せは、具体的に企図され、開示されているとみなされるべきであることが理解される。
本明細書に記載されている一部の実施形態が、本明細書に表示および記載されているが、そのような実施形態は、例示のために提供されているに過ぎない。今や、当業者であれば、本明細書で提供されている開示から逸脱せずに、多数の変異、変更、および置換を起想するだろう。本明細書に記載されている実施形態の種々の代替を、本明細書に記載されている方法の実行に用いることができることが理解されるべきである。
別様に説明されていない限り、本明細書で使用されている技術的および科学的用語は全て、本開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。以下の参考文献は、本明細書で使用することができる方法および組成物の実施形態を含む：The Merck Manual of Diagnosis and Therapy、第１８版、Merck Research Laboratoriesから出版、２００６年（ＩＳＢＮ０−９１１９１０２）；Benjamin Lewin、Genes IX、Jones & Bartlett Publishingから出版、２００７年（ＩＳＢＮ−１３：９７８０７６３７４０６３４）；Kendrewら（編）、The Encyclopedia of Mol. Biology、Blackwell Science Ltd.から出版、１９９４年（ＩＳＢＮ０−６３２−０２１８２−９）；およびRobert A. Meyers（編）、Mol. Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers, Inc.から出版、１９９５年（ＩＳＢＮ１−５６０８１−５６９−８）。
本開示の標準的手順は、以下に記載されている：例えば、Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、USA（１９８２年）；Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第２版）、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、USA（１９８９年）；Davisら、Basic Methods in Molecular Biology、Elsevier Science Publishing, Inc.、New York、USA（１９８６年）；またはMethods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques、１５２巻、S. L. BergerおよびA. R. Kimmerl（編）、Academic Press Inc.、San Diego、USA（１９８７年）。Current Protocols in Molecular Biology (CPMB)（Fred M. Ausubelら編、John Wiley and Sons, Inc.）、Current Protocols in Protein Science (CPPS)（John E. Coliganら編、John Wiley and Sons, Inc.）、Current Protocols in Immunology (CPI)（John E. Coliganら編、John Wiley and Sons, Inc.），Current Protocols in Cell Biology (CPCB)（Juan S. Bonifacinoら編、John Wiley and Sons, Inc.）、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique 、R. Ian Freshney著、出版社：Wiley-Liss；第５版（２００５年）、およびAnimal Cell Culture Methods（Methods in Cell Biology、５７巻、Jennie P. MatherおよびDavid Barnes編、Academic Press、第１版、１９９８年）。
（実施例１）
Ｔ細胞集団中の単一Ｔリンパ球のイムノタイピング
本明細書に記載されているイムノフェノタイピング法を、ヒトＴリンパ球におけるＣＤ４およびＣＤ８のｍＲＮＡならびに表面タンパク質発現の両方を分析することにより検証した（図１）。通常、成熟Ｔ細胞は、ＣＤ４サブタイプまたはＣＤ８サブタイプのいずれかであると予想される。ＣＤ４サブタイプは、ＣＤ４ ｍＲＮＡおよびＣＤ４タンパク質を共に発現するはずであるが、ＣＤ８ ｍＲＮＡまたはＣＤ８タンパク質のいずれかを発現するはずである。ＣＤ８サブタイプは、ＣＤ８ ｍＲＮＡおよびＣＤ８タンパク質を共に発現するはずであるが、ＣＤ４ ｍＲＮＡまたはＣＤ４タンパク質のいずれかを発現するはずである。
３０，０００個のＴ細胞を、ＣＤ４抗原ＩＤ配列を含むＣＤ４特異的抗体−オリゴヌクレオチド、およびＣＤ８抗原ＩＤ配列を含むＣＤ８特異的抗体−オリゴヌクレオチドの両方と共にインキュベートした。また、Ｔ細胞のＣＤ４、ＣＤ８、およびＴＣＲのｍＲＮＡ含有量を、単一細胞エマルジョン実験で分析した。Ｔ細胞受容体アルファ、Ｔ細胞受容体ベータ、ＣＤ４、およびＣＤ８のｍＲＮＡを、ｃＤＮＡへと逆転写し、液滴特異的バーコード配列を、ポリメラーゼ連鎖反応によりｃＤＮＡおよび抗体コンジュゲートオリゴヌクレオチドの両方に融合した。このＤＮＡを、エマルジョンから抽出し、次世代シークエンシング法で分析した。
ほとんど全ての液滴バーコード（単一細胞に関連付けられる）は、ＣＤ４特異的抗原ＩＤまたはＣＤ８特異的抗原ＩＤのいずれかに関連付けられた。ｍＲＮＡと表面タンパク質に基づく帰属との間に実質的な一致が見出された（図３）。
（実施例２）
免疫レパートリーの配列決定は、基礎免疫学、自己免疫、感染症、および腫瘍学において幅広い応用を有する。多くの研究では、循環血液中のＢＣＲおよびＴＣＲ多様性が調査されているが、ＴＩＬの免疫受容体に対する関心が高まっている。その機能は、がん成長または退縮に高度に関連しているが、その程度は様々であり、特徴付けされていないことが多い。ＴＩＬのより良好な理解に向かって重要なことは、新しい腫瘍関連抗原の識別を可能にし得るため、ＴＩＬのＢＣＲおよびＴＣＲの回収および機能的な特徴付けである。腫瘍抗原は、がんワクチンを開発するために、チェックポイント阻害剤の役割を理解するために、および固形腫瘍のキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）療法を進歩させるために、非常に必要とされている。しかしながら、免疫配列決定における数十年に及ぶ技術的進歩にも関わらず、全長のネイティブに対合したＢＣＲ（重鎖および軽鎖）およびＴＣＲ（アルファおよびベータ鎖）を、観察されるレパートリーを制限および偏向するｉｎ ｖｉｔｒｏ培養または細胞ソーティングを行わずに、腫瘍等の不均質試料から回収した研究はない。初代未培養免疫細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激細胞の１００分の１未満の受容体ＲＮＡを含み得るため、技術的な困難性が非常に高い。複雑な不均質試料に由来するネイティブに対合したＢＣＲおよびＴＣＲの包括的な分析を可能にするため、多数の単一細胞を並列単離およびＤＮＡバーコード付与するためのマイクロ流体エマルジョンに基づく方法を開発した。毎時最大１００万個の細胞が、個々の約６５ピコリットルエマルジョン液滴中で単離される。液滴内で細胞を溶解し、標的特異的プライマーを用いて標的ｍＲＮＡを逆転写し、二段階ＤＮＡバーコード付与プロセスにより、分子特異的および液滴特異的バーコードをｃＤＮＡに付着する。その後の回収および次世代シークエンシングの後、この二重バーコード付与戦略は、配列読み取りを、それらの当初の分子および細胞の両方にクラスター化することを可能にする。これより、エラーおよび増幅バイアスの広範な矯正、ｍＲＮＡおよび細胞の両レベルでのクローン計数、重鎖アイソタイプの決定、ならびに、重要なことには、ＢＣＲおよびＴＣＲの全長のネイティブに対合したＶ（Ｄ）Ｊ配列を超ハイスループットで同時に回収することが可能になる。
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、抗がん免疫応答に重要であるが、それらの存在量、表現型、および機能は予測不能であるため、研究は困難である。本発明者らは、細胞ソーティング、刺激、または培養を行う必要なく、ＴＩＬを高深度で特徴付けるための方法を開発した。エマルジョンに基づく単一細胞バーコード付与法により、数百万個のインプット細胞中のリンパ球の中から、ネイティブに対合したＢ細胞およびＴ細胞受容体（ＢＣＲおよびＴＣＲ）配列が捕捉される。以前の手法とは対照的に、回収される可変領域は全長であり、さらなるｍＲＮＡおよびタンパク質標的が付随し得る。卵巣腺癌に由来する４００，０００個のソーティングされていない細胞を処理し、１１，０００個を超えるＴＩＬから対合したＢＣＲおよびＴＣＲを回収する前に、健常ヒト血液に由来する３００万個のＢ細胞およびＨＩＶ患者に由来する３５０，０００個のＢ細胞で本方法を検証した。本発明者らの結果は、任意の対合したＢＣＲまたはＴＣＲレパートリーの最も高深度のサンプリングであると共に、エマルジョン中での単一細胞の同時ＲＮＡ配列決定およびタンパク質測定を最初に実証するものである。
（実施例３）
健常血液試料からのＢ細胞ＶＨＶＬペア対の大規模回収
最初に、本技術を開発し、対合能力およびスループットを、陰性ビーズ濃縮により健常ボランティアの末梢血から単離された３００万個のＢ細胞でアセスメントした。エマルジョンを６つの別々の画分に分割し、それらを並列で処理し、配列決定前に再混合しなかった。エマルジョンを、１液滴当たり０．２細胞になるように装填した。これは、占有液滴の約９０％が単一細胞を含有するというポアソン期待値をもたらし、エマルジョン液滴観察と一致していた（図５Ａ）。エマルジョン破壊および追加のライブラリー処理ステップを行った後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを用いて、ペアエンド３２５＋３００ｂｐ配列決定を実施した。配列決定データを処理するため、液滴および分子バーコードを共に使用して、元々の各ｍＲＮＡ分子からＰＣＲ複製読み取りを収集し、各ｍＲＮＡについてコンセンサスを決定して、少なくとも２つの読み取りから組み立てられたｍＲＮＡ配列のみを維持した。フォワードおよびリバース読み取りを繋ぎ合わせて、５’ＵＴＲ、完全Ｖ（Ｄ）Ｊ配列、およびアイソタイプ決定に十分な定常領域を含む全長産物を生成した。ＩＭＧＴ Ｈｉｇｈ−ＶＱｕｅｓｔおよび／またはＩｇＢＬＡＳＴを用いて、再配置された免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列に注釈を付けた。
得られたデータセットは、少なくとも１つの重鎖（ＶＨ）および１つの軽鎖（ＶＬ）ｍＲＮＡと関連していた３２４，９８８個の液滴バーコードを含有し、重鎖クラスター分析で評価して２２９，８６９個の異なるＶＨクローン系列が存在していた。この生セットは、複数細胞ならびに単一細胞液滴に由来するデータを含むため、非一致の重鎖または軽鎖Ｖ（Ｄ）Ｊ配列に関連した液滴バーコードをフィルタリングして取り除くことにより、単一細胞液滴に由来するデータを濃縮した（図５Ｂ）。このことを実施することが可能であるのは、典型的な免疫レパートリーの多様性が高いためであり、２つのランダム細胞に由来するＶＨまたはＶＬ ｍＲＮＡがマッチングすることは、ほとんど全くないだろう。得られた濃縮データセットは、２５９，３６８個のＶＨＶＬ液滴バーコードを含み、１８２，７４５個のＶＨのクローン系列を含有していた。これは、現在までで最も高深度の対合した免疫レパートリーのサンプリングであることをほぼ間違いなく示す。クローン的に関連する細胞は、それらのＶＨＶＬ対合が一貫しているはずであるため、クローン拡大の発生を識別することにより、ＶＨＶＬ対合の精度を直接的に評価した。１つよりも多くのエマルジョン画分で、クローン的に拡大した細胞であることが高い信頼性で観察された２，６０４個のＶＨクローンが識別された。これらＶＨクローンと対合したＶＬ配列は、画分間の一貫性が非常に高く、９６．１％の対合精度を示した。これにより、２５９，３６８個のＶＨＶＬペアのフィルタリングされたデータセット全体に高い信頼性が与えられた。交差画分ＶＨおよびＶＬ配列は、各画分にて異なる液滴および分子バーコードと関連することが常であり、したがってライブラリー交差汚染を示さなかった。一部のＢ細胞は複数の軽鎖を発現することが公知であるため、分析は、対合精度を過小評価する場合がある。２５９，３６８個のフィルタリングされたＶＨＶＬ液滴バーコードまたは「ＶＨＶＬペア」の７５．０％は、ＩｇＭおよび／またはＩｇＤを含有していた（図５Ｃ）。これは、未感作ナイーブＢ細胞は典型的にはＩｇＭ＋ＩｇＤ＋表現型であることを考慮すると、予想通り一緒に観察されることが多かった。より少ないがかなりの割合のＩｇＡ（１８．３％）およびＩｇＧ（６．６％）ＶＨＶＬペアも見出された。ＶＨアイソタイプは全て、約３：２の比率でＩｇκまたはＩｇλのいずれかと対合した。１８２，７４５個のＶＨクローン系列中のクローン拡大を２つの方法でアセスメントした：クローンに関連する液滴バーコードの数；およびエマルジョン画分にわたるそのクローンの観察。複数の液滴バーコードでクローンが見られることは、クローン拡大を反映する場合もあり、または複数バーコード液滴を反映する場合もある。初期λ＝１であったこと、つまり液滴内へのバーコードの分散がポアソン分散であったことを考慮すると、液滴の約３７％で複数バーコード液滴が予想された。しかしながら、＞８つの液滴バーコードにより表わされるクローンは全て、間違いなく拡大性である可能性が高い（単一液滴中のポアソン確率は、＜１０−６）。全体でクローンの６．０％が１つよりも多くの画分で見られたが、８つよりも多くの液滴バーコードで見られたクローン（全体で０．７％）の場合、それらの９９％は、１つよりも多くの画分で見られた。１００個の最も高頻度のクローン（各々３０〜１３７個の液滴バーコード、図５Ｄ）は全て、６つの画分の少なくとも５つで見られた。したがって、バーコード計数および独立した画分分析を組み合わせると、非増殖クローンの厖大なバックグラウンドの中から、希少な拡大系列を検出することが可能になる。しかしながら、最も多量の拡大したクローンでさえ、１０００個に１個未満の細胞にしか存在していなかったことは注目すべきことであり、ヒト末梢免疫レパートリーの多様性が非常に高いことを例示している。
発現レベルの推定としての、ペア内の各ＶＨおよびＶＬ鎖の捕捉ｍＲＮＡの数（図５Ｅ）。概して、１液滴バーコード当たり１０個未満の重鎖（平均２．０）および軽鎖（平均４．０）ｍＲＮＡが捕捉され、１細胞当たり、数ダース〜数百個の捕捉重鎖および軽鎖ｍＲＮＡを有する液滴バーコードの小集団が、ほとんど排他的にＩｇＧおよびＩｇＡ発現細胞から観察された。興味深いことには、ペア内のＶＨおよびＶＬ突然変異の程度は、各アイソタイプ（例えば、ＩｇＧの場合は、ＶＨ対ＶＬ）内、およびアイソタイプ間（例えば、ＩｇＧ対ＩｇＭ）の両方で、強い相関性を示した（図２Ｆ）。さらに、ＩｇＧおよびＩｇＡ対はほとんど全てが、ＶＨおよびＶＬ鎖の両方にかなりの突然変異を示したが、ＩｇＭおよびＩｇＤペアはほとんどが、ＶＨまたはＶＬ突然変異をほとんど示さなかった。こうした結果は、Ｂ細胞活性化の機序と一致し、ＩｇＭおよびＩｇＤからＩｇＧまたはＩｇＡへのクラススイッチ、免疫グロブリン発現の増加、ならびに細胞の重鎖および軽鎖遺伝子座の両方に影響を及ぼす体細胞超変異に至る。高度に突然変異を起こしたＶＨ鎖は、高度に突然変異を起こしたＶＬ鎖と対合する傾向があるというこの観察に加えて、本方法は、休止ヒトＢ細胞レパートリーに由来する多数の全長のネイティブに対合したＢＣＲを生成することが可能である。
（実施例４）
ＨＩＶ長期非進行者からの公既知の低頻度ＶＨＶＬ対ペアの回収。
アッセイの対合感度および正確性のさらなる検証として、いくつかの希少な（１０，０００個の細胞中、＜１個の細胞）ネイティブＶＨＶＬ対合が既に既知である試料を処理した。ＨＩＶ長期非進行患者から末梢Ｂ細胞を得た。この患者のメモリＢ細胞は、ＨＩＶ中和活性を示す抗体が近年詳細に探索されている。３５０，０００個のＢ細胞を処理して、合計３８，６２０個のフィルタリングされたＶＨＶＬペアを生成した。興味深いことには、この個体は、以前の健常試料（図３Ａ）または典型的な健常末梢Ｂ細胞レパートリーよりも高い割合のＩｇＧを示した。このデータセットに由来するＶＨ配列を、ＰＧＴ１２１を含む、この個体に由来する全ての報告されている広域中和抗体（ｂＮＡｂ）と比較し、８つの類似または同一のＶＨ配列を見出した。これは、ｂＮＡｂのこのファミリーが循環Ｂ細胞の０．０３％未満であることを示す。重要なことには、これら重鎖と対合した全ての軽鎖は、予想される同様に希少のｂＮＡｂ系列のものであり、以前に報告されているように、同じＩｇλ−Ｖ３−２１／Ｊ３再配置および特徴的な３コドン挿入を示し、本発明者らの方法の正確性および感度が高いことが支持された。さらに、この個体に由来する、全ての既知の新らたに生成されたＰＧＴ１２１様ＶＨＶＬペアの系統樹（図３Ｂ）では、ＶＨおよびＶＬツリーは、鏡像様位置を占める対合したＶＨおよびＶＬ配列と非常に類似したトポロジーを示しており、これは、系統発生史が共通していることを反映している可能性が高い。ここで発見されたバリアントペアは、このルールに良好に当てはまる。興味深いことには、２つの発表されている抗体ＰＧＴ１２２およびＰＧＴ１２３は、例外であると考えられ、これら２つの対合を支持するものは見出されなかったが、その代わりに、ＰＧＴ１２２ＶＨ：ＰＧＴ１２３ＶＬ様のおよびＰＧＴ１２３ＶＨ：ＰＧＴ１２２ＶＬ様のペアが見出された。これは、元々の報告書では確認されていない対合を示している。８つの新規なＰＧＴ様ＶＨＶＬペアの完全なＶ（Ｄ）Ｊ領域をコードするＤＮＡを合成し、抗体を完全ＩｇＧとして発現させ、複数のＨＩＶ擬似系統を中和する能力を試験した（図６Ｃ）。抗体は良好に発現され、全てがウイルスに対する強力な中和活性を示し、関連する生物学的試料からネイティブに対合した機能性抗体バリアントを迅速に生成する本発明者らの手法の有用性が実証された。
（実施例５）
腫瘍浸潤リンパ球に由来するＢ細胞およびＴ細胞受容体対ペア
対合した受容体をハイスループットで回収するためにエマルジョンバーコード付与が検証されたことを受けて、免疫受容体を、腫瘍から直接回収した。プロテアーゼで分離された切除卵巣腺癌試料を得、４００，０００個のソーティングされていない細胞をエマルジョンに入れた。別々の等量の試料をＣＤ３／ＣＤ１９染色することにより、かなりの数の浸潤性Ｂ（約５％）およびＴ細胞（約２０％）が物質中に存在することが示唆された。エマルジョン中の単一細胞分散系は、いくつかの限定的な塊が視認されたとはいえ、精製細胞と類似しており、試料の細胞タイプが不均質であったことを考慮すると予想通りに液滴内の細胞サイズおよび形状に広範なばらつきがあった（図７Ａ）。
Ｔ細胞受容体アルファおよびベータ鎖の定常領域を共に標的とするプライマーを、以前に使用されたＢＣＲプライマーと共に使用し、配列決定およびストリンジェントなフィルタリング後に、ＢＣＲまたはＴＣＲ産物にリンクする数千個の液滴バーコードを回収した。単一細胞精度をアセスメントするため、液滴バーコード内の４つの標的遺伝子座（ＶＨ、ＶＬ、Ｖα、Ｖβ）のあらゆる考え得る組合せを計数した（図７Ｂ）。１つよりも多くの標的鎖を有する液滴バーコードの大部分（９７．９％）は、生物学的に予想されるＢＣＲ ＶＨ ＋ＶＬまたはＴＣＲ Ｖα＋Ｖβの対合を含有し、混合ＢＣＲ−ＴＣＲ組合せは２．１％しか含有されていなかった。産物のバーコード付与は、標的鎖に関して偏りがないため、この結果は、得られた６，０５６個のＢＣＲ ＶＨＶＬおよび５，２１７個のＴＣＲ ＶαＶβペアの信頼性を高度化することが可能である。ＢＣＲでは、他のアイソタイプと比較して、ＩｇＧ（＞８０％）が著しく優勢であったが（図７Ｃ）、全てが存在した（ＩｇＥ＜０．０５％のみ）ことが示された。カッパおよびラムダ軽鎖は、末梢血データセットと同様の比率で存在した。
末梢血と同様に、ＢＣＲアイソタイプとＶＨおよびＶＬ鎖の両方の突然変異レベルとの間に相関性が観察され、ＩｇＧおよびＩｇＡペアは、ＩｇＤおよびＩｇＭよりも大きなＶＨおよびＶＬ突然変異、ならびに各アイソタイプ内でのＶＨおよびＶＬ間の突然変異の一般的相関性を示した（図７Ｄ）。興味深いことには、ＩｇＤ、ＩｇＭ、およびＩｇＡペアは、腫瘍と末梢血データセットとの間で非常に類似した突然変異分布を示した（図５Ｆ）。また、腫瘍ＩｇＧ画分は、末梢血では観察されなかった、ほとんど突然変異していないかまたは全く突然変異してない配列をかなりの割合で含有していた。ＴＣＲの場合、およびＩｇＤを含有するＢＣＲの場合、１液滴バーコード当たり、末梢血のＢＣＲ結果と同様の数の捕捉ｍＲＮＡが観察された（図７Ｅ、ほとんどが１液滴バーコード当たり＜１０）。極めて対照的だが、腫瘍由来のＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＧペアは、１０〜１００倍の平均発現レベル増加を示し、液滴バーコードの多くには数百または数千個の標的ｍＲＮＡが捕捉された。その後、捕捉ＴＩＬ−ＴＣＲおよびＢＣＲレパートリーの多様性をアセスメントした（図７Ｆ）。５，２１７個の合計ＴＣＲペアの中で、２，４２３個の異なるＴＣＲベータクローンが観察された。７つのクローンが、＞１％の頻度で存在し、上位クローンは、全ての液滴バーコードの１６．９％に相当した。６，０５６個の合計ＢＣＲペア中で、１，５１８個の異なる重鎖クローンが観察され、１５個のクローンが＞１％の頻度であったが、＞５％の頻度のものはなかった。これは、多様性が、健常末梢ＢＣＲレパートリーよりも実質的により制限されていることを表わしているが（０．０６％を超える頻度で存在するクローンはなかった）、クラス転換し、突然変異を起こし、高度に発現されたクローンが、腫瘍試料中に非常に多く存在することは、ＴＩＬを特徴付けるためには、高深度で高感度のサンプリング手法が必要であることを示す。本方法は、規定されたＴＩＬ集団を事前にソーティングまたは外因的活性化する必要なく、ＢおよびＴ細胞の両方から同時に、多数のＴＩＬ免疫受容体ペアを迅速に回収することを可能にする。
（実施例６）
追加の目的の表現型マーカーの捕捉
液滴バーコード付与による受容体鎖の対合は、潜在的に、免疫受容体の他に追加の標的の捕捉を可能にする。この可能性を調査するため、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団に入る健常Ｔ細胞を、磁気ビーズ濃縮により分離し、各タイプの２０，０００個の細胞を別々のエマルジョンに入れ、ＴＣＲアルファおよびベータ鎖を標的とするプライマーならびにＣＤ４およびＣＤ８のｍＲＮＡを用いて実験を行った。配列決定後、ＣＤ４＋単離細胞に由来するＴＣＲ ＶαおよびＶβ（「ＴＣＲペア」）を含有する３，８６１個の液滴バーコードの４７．０％は、ＣＤ４ ｍＲＮＡに関連していたが、ＣＤ８ ｍＲＮＡに関連したものは０．３％に過ぎなかった。反対に、ＣＤ８＋単離細胞に由来する２，２３５個のＴＣＲペアの５０．６％が、ＣＤ８ ｍＲＮＡにリンクしていたが、ＣＤ４ ｍＲＮＡにリンクしていたものは０．６％に過ぎなかった。これは、以前の報告と同様に、細胞表現型を決定するためのｍＲＮＡに基づく手法は、高特異性だが、感度に制限があることを示す。対照的に、細胞表面受容体等のタンパク質は、通常、それらのコードｍＲＮＡよりも非常に大きな数（１細胞当たり１，０００〜１００，０００個）で存在し、検出がより容易である可能性が高いだけでなく、より直接的に細胞表現型と関連する可能性が高い。各細胞での標的タンパク質レベルを測定するため、特注オリゴヌクレオチドＤＮＡ標識を、抗ヒトＣＤ４およびＣＤ８抗体にコンジュゲートし、標識抗体を、３０，０００個の細胞をエマルジョンに入力する前に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の未分離混合物と共にインキュベートした（図８Ａ）。ＤＮＡ標識は、抗体特異的配列タグだけでなく、分子バーコード、および増幅された液滴バーコードに相補的な配列を担持し、ｍＲＮＡでの実施と同様に、エマルジョン液滴バーコード付与、および分子計数を可能にする。ＤＮＡ標識、ならびにＴＣＲ、ＣＤ４、およびＣＤ８ ｍＲＮＡを、同時に標的とした。配列決定およびフィルタリング後、３，６８２個の液滴バーコードを、高い信頼性でＴＣＲ ＶαＶβペアであると識別した。以前の実験と一致して、ＴＣＲペアのおよそ半分（５２％）を、ｍＲＮＡに基づいてＣＤ４またはＣＤ８ステータスに帰属させることができた（図８Ｂ）。しかしながら、液滴バーコードの９５％超は、タンパク質ステータスに基づいてＣＤ４またはＣＤ８に帰属させることができ、１液滴当たりの平均分子計数は、ＣＤ４／８タンパク質（平均２０．５）が、ＣＤ４／８ ｍＲＮＡ（平均１．０）よりもかなり高かった。ｍＲＮＡおよびタンパク質決定が両方とも合致していたことを考慮すると、ｍＲＮＡとタンパク質シグナルとの間の合致率は高く（図８Ｃ）、液滴の９６．０％だった。一部の希少な例では、ＣＤ４およびＣＤ８タンパク質の両方が検出された。これは、液滴が、２つまたはそれよりも多くの細胞を含有していた結果であると考えられた。エマルジョンバーコード付与により、単一細胞免疫受容体を、目的のｍＲＮＡおよびタンパク質マーカーと、全てハイスループットで直接的に関連付けることが初めて可能になった。抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４等の拡大された免疫腫瘍学的関連マーカーセットを用いて、この手法をＴＩＬに応用することは、保証されている。
（実施例７）
ヒト試料
健常レパートリー検証用の血液試料を、Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔの承認に基づいて収集した。ＨＩＶ ｂＮＡｂ実験用のＰＢＭＣを、ＩＡＶＩプロトコールＧコホートのＨＩＶ−１感染ドナーであるドナー１７から得た。ヒトＨＩＶ試料は全て、ルワンダ共和国国立倫理委員会、エモリー大学内治験審査委員会、ザンビア大学研究倫理委員会、チャリングクロス研究倫理委員会、ＵＶＲＩ科学および倫理委員会、ニューサウスウェールズ大学研究倫理委員会、聖ビンセント病院および東シドニー地区ヘルスサービス、ケニヤッタ国立病院倫理調査委員会、ケープタウン大学倫理委員会、国際施設内治験審査委員会、マヒドン大学倫理委員会、ウォルターリード陸軍研究所（ＷＲＡＩＲ）施設内治験審査委員会、およびコートジボアール委員会「Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄ’Ｅｔｈｉｑｕｅ ｄｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｄｅ ｌａ Ｖｉｅ ｅｔ ｄｅ ｌａ Ｓａｎｔｅ」（ＣＮＥＳＶＳ）により承認された臨床試験プロトコールに基づいて書面によるインフォームドコンセントを得たうえで収集した。凍結保存され、解離され、切除された、単一ドナーに由来する卵巣腺癌を、ＩＲＢ承認プロトコールに基づいて、書面によるインフォームドコンセントを得たうえで、Ｃｏｎｖｅｒｓａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから得た。
（実施例８）
細胞調製
３００万個の健常Ｂ細胞に関する研究では、ヘパリンナトリウム（ＢＤ）を有するＶａｃｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴ細胞調製チューブに５０ｍＬの血液を採取し、１８００×ｇで２０分間遠心分離し、細胞調製緩衝液（２％ウシ胎仔血清および２ｍＭ ＥＤＴＡで補填された１×ＰＢＳ）で２回洗浄し、２００×ｇのスピンを使用して血小板を除去し、得られたＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋２０％ウシ胎仔血清＋１０％ＤＭＳＯに、必要になるまで−８０℃で凍結保存した。エマルジョン生成の前に、ＰＢＭＣを解凍し、細胞調製緩衝液で２回洗浄し、計数した。ネガティブ選択に基づくヒトＢ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の説明書に従って使用して、Ｂ細胞を単離した。２０μｍ細胞ストレーナーに細胞を通し、細胞調製緩衝液で６．２×１０６細胞／ｍＬ（３００万個のＢ細胞での実験）または３．１×１０６細胞／ｍＬ（ＰＧＴドナーおよび卵巣腫瘍での実験）に希釈した。
（実施例９）
エマルジョン内での免疫受容体バーコード付与
エマルジョン生成プラットフォームは、親フッ素性にコーティングされた石英Ｄｏｌｏｍｉｔｅ小型２試薬チップ内への、２つの水相および１つの親フッ素性油連続相のコンピュータ制御流動が可能になるように、単一の空気圧縮機により駆動され、各々がＭｉｔｏｓ流速センサを有する３つのＭｉｔｏｓ Ｐポンプ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を備えていた。１つの水性インプットチャネルは、所望の１液滴当たりの細胞占有レベルをもたらすように、必要とされる密度の細胞を含有し、第２の水性のチャネルは、ＡｂＰａｉｒ（商標）反応緩衝液およびオリゴヌクレオチド（ｗｗｗ．ａｂｖｉｔｒｏ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ ＡＶ２０７０−１ＳおよびＡＶ２０８０−１Ｓ）、５単位／μＬのＭｕＭＬＶに基づく逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および０．１単位／μＬのＨｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ ＰＣＲポリメラーゼを含む溶解および反応混合物を含有していた。１００μＬのＨａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒシリンジを使用して、１００μＬ内部径ＰＥＥＫチューブ試料ループに、各々約１００μＬのＬＲミックスを２回のインジェクションで負荷した。１００μＬのＨａｍｉｌｔｏｎ Ｇａｓｔｉｇｈｔシリンジを使用して、約１００μＬの０．２ｍｍ内部径ＦＥＰチューブループに、約１１０μＬの細胞懸濁液を負荷した。エマルジョンは、チップの２つの油チャネルから油を同時に流動させた２試薬チップに、水相を同一の流速で集中流噴射することにより形成した。チップ出口チャネルを出るエマルジョンを、冷却ブロックに配置した０．２ｍＬのＰＣＲストリップチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内に滴下させ、その後、過剰な油を、ピペットでチューブの底部から取り除き、４０μＬのオーバーレイ溶液（２５ｍＭ Ｎａ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を添加し、チューブを、転写タグ化反応のために標準的サーモサイクラーに移した。４５分間の逆転写（ＲＴ）ステップ中、標的特異的ＲＴプライマーを用いて、ランダム化分子バーコードを含有するユニバーサルアダプター配列の鋳型スイッチに基づく付加により、ＲＮＡを４２℃で逆転写した。ＲＴ後、エマルジョンを、４０サイクルの熱サイクル（各サイクル：８２℃で１０秒間、６５℃で２５秒間）にかけて、液滴バーコード鋳型のＰＣＲ増幅を実施し、それを、初期溶解および反応混合物中で３０，０００ｃｐ／μＬに希釈し、１５，０００ｃｐ／μＬまたは約６５ｐｌ液滴当たり約１個の最終混合物中での濃度を生成した。液滴バーコードの一方の末端は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ読み取り２（「Ｐ７」）プライマー部位を含み、他方の末端は、ユニバーサルアダプターオリゴヌクレオチドの共通配列とマッチングする。したがって、ＰＣＲ中、鋳型スイッチしたｃＤＮＡは、増幅された液滴バーコード鎖にアニーリングし、オーバーラップ伸長によりスプライスされて、標的、分子バーコード、および液滴バーコード配列を含有する全長産物を産生することができる。
（実施例１０）
エマルジョン破壊、クリーンアップ、下流ＰＣＲ、プール化、および配列決定
熱サイクル後、オーバーレイ溶液を、ピペットで取り除き、４０μＬエマルジョン破壊溶液（１：１ ＦＣ−４０：パーフルオロオクタノール）を、１５μＬ溶解物クリアリング溶液（１２．５μＬ Ｑｉａｇｅｎプロテアーゼ、２．５μＬの０．５Ｍ Ｎａ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）と共に添加した。１０回反転させてエマルジョンを破壊した後、混合物を５０℃で１５分間、および９５℃で３分間インキュベートして、プロテアーゼを不活化した。１５，０００×ｇで１分間遠心分離して水相を単離した後、回収した物質を徹底的に精製して、オリゴヌクレオチド、試薬、および過剰な液滴バーコードＰＣＲ産物を除去した。全長産物は、ＲＴプライマーの５’ビオチン化によりビオチンを含有するため、ストレプトアビジンビーズをクリーンアップすることにより、それらは、過剰な液滴バーコードＰＣＲ産物から効率的に分離することができ、したがって、オーバーラップ伸長法に共通の問題である下流ＰＣＲ組換えアーティファクトが最小限に抑えられる。まず、製造業者の説明書を使用して１：１比のＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を使用し、その後、この場合も製造業者の説明書を使用してストレプトアビジンビーズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してクリーンアップし、その後、９５℃の脱イオン水で溶出させ、その後１：１比のＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで第２のクリーンアップを行うことにより、産物を精製した。その後、産物を、標的濃縮ＰＣＲに入れ、ＢまたはＴ細胞受容体標的の定常領域に特異的なプライマーを、液滴バーコード配列のユニバーサル末端に特異的なプライマーと共に使用した。このリバースプライマーは、製造業者の説明書に従ってＭｉＳｅｑ機器でマルチプレックス配列決定するための６塩基インデックスバーコードも含んでいた。したがって、このステップでは、全長液滴バーコード化標的配列のみが増幅される。まず、反応開始時に２分間の９８℃ポリメラーゼ活性化ステップを含む製造業者の推奨条件下で、Ｑ５ホットスタートポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、全ての標的を、９８℃で１０秒間；６４℃で２０秒間；７２℃で１５秒間の７サイクルで一緒に増幅した。この後、１．５：１のビーズ：ＰＣＲ比でＡＭＰｕｒｅ ＸＰクリーンアップを行った。その後、同じ熱サイクル条件を以前と同様に使用して、各鎖（ＶＨ、ＶＬ、Ｖα、Ｖβ）を別々に標的とする第２の７サイクルを実施し、その後、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰクリーンアップを行った。その後、同じ熱サイクル条件および５〜１５サイクル（ｑＰＣＲにより判断される収量に応じて）で、全長Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定アダプターを付加し、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ Ｄ１０００（Ａｇｉｌｅｎｔ）定量化に十分な物質を生成する最終ＰＣＲを実施した。その後、ライブラリーをプールし、Ｖ３ ２×３００ｂｐ ＭｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で配列決定した。
（実施例１１）
ＭｉＳｅｑプラットフォームの改変
ＢＣＲまたはＴＣＲの完全な可変Ｖ（Ｄ）Ｊ領域の再構成には、２つのペアエンドＩｌｌｕｍｉｎａ読み取りを繋ぎ合わせることが必要である。このプロセスを向上させるため、２×３００ｂｐキットのフォワード読み取りを３２５ｂｐに延長した。免疫受容体ライブラリーは、定常領域プライマー部位の多様性を制限するため、１０％ｐｈｉＸスパイクインを使用して、ライブラリー多様性の制限という問題を軽減した。
（実施例１２）
読み取りのバイオインフォマティクス処理の概要
ｐＲＥＳＴＯパッケージ（バージョン０．４）の周辺に組み立てた特注パイプラインを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ読み取りを処理して、各液滴からｍＲＮＡ分子の全長コンセンサス配列を生成し、ＩｇＢＬＡＳＴおよび／またはＩＭＧＴ／ＨｉｇｈＶ−ＱＵＥＳＴで注釈を付け、特注スクリプトおよびＣｈａｎｇｅ−Ｏパッケージを用いて、さらにアラインし、フィルタリングし、および処理して、統計情報を生成した。
（実施例１３）
読み取り処理および注釈、アイソタイプ帰属。
生読み取り処理、Ｖ（Ｄ）Ｊ注釈、およびクローンの帰属は、ｐＲＥＳＴＯおよびＣｈａｎｇｅ−Ｏパッケージを利用して特注パイプラインで実施した。手短に言えば、生Ｉｌｌｕｍｉｎａペアエンド３２５＋３００ｂｐ読み取りを品質管理し、プライマートリミングし、液滴特異的（ＤＢ）および分子特異的バーコード（ＭＢ）を、プライマー部位のファジーマッチングにより識別した。まとめると、ＤＢおよびＭＢにより由来分子が固有に識別され、この固有な分子識別子（ＵＭＩ）を使用して、同じ分子から生じる一致ＰＣＲ複製読み取り（最小で２つ）をグループ化し、各ｍＲＮＡ配列のコンセンサスを生成する。アイソタイプ特異的プライミングは、プライマートリミングされた配列内の既知のアイソタイプ特異的定常領域のファジーマッチングにより確認した。Ｖ（Ｄ）Ｊ生殖系列セグメントおよび再配置構造を、ＩｇＢＬＡＳＴを使用して決定し、ＩＭＧＴ／ＨｉｇｈＶ−ＱＵＥＳＴで確認し、適切な場合は、Ｃｈａｎｇｅ−Ｏおよび特注スクリプトで解析した。
マッチングするＩＧＨＶ遺伝子、ＩＧＨＪ遺伝子、および接合部長を有する機能性Ｖ（Ｄ）Ｊ配列を、Ｃｈａｎｇｅ−Ｏに実装されているように、グループ内で単一連鎖クラスター化することにより、クローンを帰属させた。３００万個の循環細胞データセットでは、対称化トランジション／トランスバージョンモデルを使用して、４．０の重みが加えられたクローン内距離を、クローン内の最近傍距離カットオフとして使用した。
（実施例１４）
液滴免疫受容体含有フィルタリングおよび対合フィデリティー算出
液滴からＢ細胞配列を回収する精度は、本バーコード付与法により２つのやり方：液滴内ｍＲＮＡ配列一致および交差画分対合一致を使用してアセスメントすることができる。各液滴内では、１遺伝子座当たり複数のｍＲＮＡが捕捉され、１つの細胞に由来する発現Ｖ（Ｄ）Ｊ配列は、一致するはずである。配列一致を規定する、複数のアラインされたＶ（Ｄ）Ｊセグメントの２％配列多様性（平均のペアを成すヌクレオチド差ｐｉ５５＜０．０２）のカットオフを使用して、１液滴当たり１つよりも多くの生産的ＶＤＪおよび１つの生産的ＶＪ配列の存在を、推定免疫受容体含有または複数細胞占有として、バイオインフォマティクス的に目印を付ける。対立遺伝子排除的な液滴毎に重鎖および軽鎖コンセンサス配列を組み立て、クローン規定および交差画分対合分析に使用した。３００万個の循環Ｂ細胞データセットでは、各ＶＨ系列は、データセット中の＞２０，０００個の軽鎖クローンの１つ（理想的な場合）と関連している。ＶＨＶＬペアを有する２５９，３６８個の免疫遺伝子座排除的な液滴中、１０，８７０個のＶＤＪ重鎖遺伝子座再配置クラスターが、少なくとも６つの物理的に分離されたエマルジョン画分の２つに存在していた。これらクラスターは、増殖系列であるか、または同じＶＪエクソンの、独立しているが類似の再配置であるかのいずれかを表わす。ＶＤＪ再配置が、２つの複製で一貫したＶＪ再配置と対合している場合、両実験は、独立して真の陽性をもたらした（より希少な再配置を有する２，６０４個のクローンの３５，９２２個の考え得るペアを成す比較のうち３３，１５７個）。したがって、各複製の精度は、９６．１％（０．９２３＾０．５）である。
（実施例１５）
ＨＩＶ ｂＮＡｂ候補配列の発見
本発明者らの３８，６２０個のＶＨＶＬペアを、ｔｂｌａｓｔｘ、ＭＵＳＣＬＥ、およびＰｈｙＭＬを使用して文献から選別した既知のｂＮＡｂ ＨＣＤＲ３、ＶＤＪ配列、およびドナー１７系列との類似性について探索することにより、ＨＩＶの新しいネイティブに対合した広域中和抗体（ＢＮＡｂ）を発見し、その後、完全なＶ（Ｄ）Ｊアミノ酸配列の系統樹を手作業で検査して、既知のｂＮＡｂ配列で分散されている抗体候補を選択した。
（実施例１６）
ＨＩＶ ｂＮＡｂタンパク質発現および精製
抗体配列を合成し、以前に記載されている重鎖および軽鎖ベクターにクローニングした。重鎖および軽鎖プラスミドを、製造業者のプロトコールに従って２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ細胞に同時トランスフェクトした（１：１比）。抗体上清を、トランスフェクトの４日後に採集し、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーで精製した。精製した抗体を、さらなるアッセイで使用する前にＰＢＳで緩衝液交換した。
（実施例１７）
擬似ウイルス産生および中和アッセイ
ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ発現プラスミドおよびＥｎｖ欠損ゲノムバックボーンプラスミド（ｐＳＧ３ΔＥｎｖ）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトすることにより、擬似ウイルスを生成した。トランスフェクション７２時間後に、擬似ウイルスを、中和アッセイで使用するために採集した。単一ラウンドの複製擬似ウイルスアッセイおよびＴＺＭ−Ｂｌ標的細胞を使用して、中和活性をアセスメントした。手短に言えば、ＴＺＭ−Ｂｌ細胞を、９６ウェル平底プレートに播種した。このプレートに、擬似ウイルスを添加し、それを、抗体の系列希釈物と共に３７℃で１時間、事前にインキュベートした。感染７２時間後に溶解し、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加して、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を定量化した。ＩＣ５０値を決定するために、用量反応曲線を非線形回帰法でフィッティングした。
（実施例１８）
卵巣腫瘍標的鎖の同定識別
エマルジョン中の卵巣解離腫瘍組織からＢＣＲおよびＴＣＲを同時に捕捉した後、以前に記載されるように分子および液滴バーコードを使用して読み取りをフィルタリングしたが、その後、４つの考え得る標的鎖タイプ（ＢＣＲ ＶＨ、ＢＣＲ ＶＬ、ＴＣＲ Ｖα、ＴＣＲ Ｖβ）の各々の存在を探した。各々が少なくとも２つの配列決定読み取りを有する少なくとも２つのｍＲＮＡにより支持されていた場合、標的鎖を保持した。ＢＣＲ ＶＨＶＬまたはＴＣＲ ＶαＶβペアのみを含有する全ての液滴バーコードを、さらに分析した。ＢＣＲ重鎖およびＴＣＲベータ鎖クローンを、個別のＣＤＲ３アミノ酸配列に基づいてコールした。
（実施例１９）
ＤＮＡ標識抗体染色によるエマルジョン内のタンパク質検出
一本鎖２００ｂｐ ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、固有の５ｂｐ抗原ＩＤ配列を含有するように設計し、５’アミノ基で修飾した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３００５１６）およびＣＤ８ａ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３０１０１８）抗体を、製造業者のプロトコールに従ってＴｈｕｎｄｅｒ−Ｌｉｎｋキット（Ｉｎｎｏｖａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＤＮＡオリゴヌクレオチドタグにコンジュゲートした。エマルジョン前の細胞標識化では、末梢血に由来する２００万個のネガティブ選択されたＴ細胞を、４００μＬ細胞緩衝液＋２ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．０５％アジ化ナトリウムで希釈した。一本鎖サケ精子ＤＮＡを、２００μｇ／ｍＬの最終濃度で細胞に添加し、細胞を室温で５分間回転させた。ＣＤ４およびＣＤ８ａ ＤＮＡ標識抗体の混合物（各々、５ｎＭの最終濃度）を細胞に添加し、３０分間室温でインキュベートした。細胞を、細胞緩衝液＋２ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．０５％アジ化ナトリウム＋２００μｇ／ｍＬ一本鎖サケ精子ＤＮＡで３回洗浄した。エマルジョン分析に入る前に、細胞を、細胞緩衝液＋０．０５％アジ化ナトリウムに再懸濁した。３０，０００個の細胞を、エマルジョン配列決定に使用した。
（実施例２０）
四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート染色
各々ストレプトアビジンコアおよびフルオロフォアを有する、４つのＭＨＣ−ペプチド複合体で構成される四量体−オリゴヌクレオチドを生成した。各四量体オリゴヌクレオチドは、下記のように定量化で使用するための分子バーコードおよび／または四量体ＩＤコードをさらに含んだ。例示的な蛍光標識四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを、図１８に示す。
２つの異なるＴＣＲの親和性を決定するための例示的な方法を、本明細書に記載する。ＭＨＣ−ペプチドへの公知の異なる親和性を有するＴ細胞の２つの集団を、ＭＨＣ−ペプチド四量体（ｐＭＨＣ）を含む四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの様々な濃度と共にインキュベートする。未結合の四量体−オリゴヌクレオチドを洗い流し、細胞をエマルジョン分析に入力し、配列決定する。結合シグナルは、各Ｔ細胞について四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの各濃度での四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドの配列読み取りに基づいて計算される（図１９）。より高い濃度の四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと共にインキュベートされるＴ細胞は、より高い結合シグナルを示すことが予想される。四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのＭＨＣ−ペプチドへのより高い親和性を有するＴＣＲを有するＴ細胞は、アッセイの有効範囲内で四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの同じ濃度において四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのＭＨＣ−ペプチドへのより低い親和性を有したＴＣＲを有するＴ細胞と比較して、より高い結合シグナルを示すことが予想される。例えば、図１９において、ｌｏｇ［四量体］−８と−４との濃度の間で、ＴＣＲ１への結合シグナルはＴＣＲ２のそれを上回り、このアッセイではＴＣＲ１が使用される四量体試薬へのより高い親和性を有することが予想されるだろうことを示す。
（実施例２１）
従来のＭＨＣ−ペプチド四量体染色と比較した四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート染色
本明細書に記載される例示的な四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート試薬の結合特異性を試験するための陽性対照を提供するために、標的特異的Ｔ細胞を生成した。標的特異的Ｔ細胞を生成するための例示的な方法は、Hoら、J. Immunol. Methods、３１０巻：１〜２頁、４０〜５２頁に概説されている。簡潔には、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で２日にわたって培養した後、炎症誘発性サイトカインの存在下で３日目からインキュベートして成熟樹状細胞を産生することによって、ＨＬＡ−Ａ０２：０１を有する正常なヒトドナーから得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料の接着性画分から、樹状細胞を導く。４日目に、生じた成熟樹状細胞を収集し、洗浄して、ＭＨＣ−ペプチド四量体（ｐＭＨＣ）で使用される所望の標的由来のペプチドでパルスする。５日目に、正常なヒトドナーに由来する自己ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ペプチドでパルスされた樹状細胞と共にインキュベートする。８日目に、培養物中のＩＦＮγを、抗原特異的Ｔ細胞を含有する培養物の指標として測定する。反応性共培養物に由来する細胞を選択し、ペプチドでパルスした樹状細胞で２、３回再刺激して、抗原特異的Ｔ細胞を濃縮する。一部の実施形態では、Hoら、２００６年、によって本質的に記載されるように、これら抗原特異的Ｔ細胞は、セルソーティングおよび／または限界希釈クローニングによってそのような濃縮集団から生成される。標的特異的でないＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞対照集団として使用した。
標的特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞および非特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞対照集団を、蛍光標識標準ＭＨＣ−ペプチド四量体または様々な漸減濃度の蛍光標識四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのいずれかと共にインキュベートした。インキュベーションの後、標準のＭＨＣ−ペプチド四量体または四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに陽性染色した細胞の存在は、フローサイトメトリーによって同定した。非特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞と共にインキュベートした標準のＭＨＣ−ペプチド四量体および四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの両方は、陽性染色をほとんど示さなかったか全く示さなかった（図２１、上列フローサイトメトリープロット）。標的特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞と共にインキュベートした標準のＭＨＣ−ペプチド四量体は、強力な二重陽性ＭＨＣ−ペプチド四量体＋ＣＤ８＋細胞集団を示した（図２１、下列、左のフローサイトメトリープロット）。標的特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞と共にインキュベートした四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、強力な二重陽性四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート＋ＣＤ８＋細胞集団を示し、この二重陽性集団は、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート濃度の低下に伴って減少した（図２１、下列、右の３つのフローサイトメトリープロット）。これは、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが標準のＭＨＣ−ペプチド四量体と同様に標的特異的Ｔ細胞に結合したこと、および、標的特異的Ｔ細胞に結合している四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの濃度に依存性であったことを示した。
（実施例２２）
四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート結合シグナル
実施例２１に概説した通り、標的特異的（結合ＴＣＲ）または非特異的Ｔ細胞（非結合ＴＣＲ）も使用して、１細胞あたりの結合した四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート数を調査した。結合ＴＣＲ集団のＴＣＲによって認識されるＭＨＣ−ペプチド四量体、ならびに少なくとも１つの固有のオリゴヌクレオチド配列（例えば、分子バーコード、四量体ＩＤコード、および／または抗原ＩＤコード）を含む、様々な濃度の四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと共に、非結合ＴＣＲ細胞集団および結合ＴＣＲ細胞集団を別々にインキュベートした。未結合の四量体−オリゴヌクレオチドを洗い流し、細胞をエマルジョン分析に入力して、配列決定した。結合シグナルを、各四量体について四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの各濃度でのオリゴヌクレオチドの配列読み取りの数に基づいて計算し、それを図２１にグラフの形で表す。図２１に示す結果は、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、一次標的Ｔ細胞上のＴＣＲを、用量依存的に特異的に認識し、結合することが可能なことを示す。

Claims (97)

  1. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を選択する方法であって、
    （ａ）複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子を複数のＴ細胞と接触させるステップと；
    （ｂ）ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を、
    （ｉ）複数のベッセルのうちの１つのベッセル中の、ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のオリゴヌクレオチド部分、および
    （ｉｉ）前記ベッセル中の複数のＴ細胞のうちの１つの単一のＴ細胞に由来するＴＣＲポリヌクレオチド
    に付着させるステップと；
    （ｃ）前記オリゴヌクレオチド部分またはその相補体および前記ＴＣＲポリヌクレオチドまたはその相補体を配列決定し、それによって配列情報を生成するステップと
    を含む方法。
  2. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合親和性を決定する方法であって、
    （ａ）複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子を複数のＴ細胞と接触させるステップと；
    （ｂ）オリゴヌクレオチド部分またはその相補体を配列決定し、それによって配列情報を生成するステップと；
    （ｃ）前記配列情報に基づいて、ｐＭＨＣオリゴヌクレオチドコンジュゲートへのＴＣＲの結合親和性を決定するステップと
    を含む方法。
  3. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を選択する方法であって、
    （ａ）複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子を複数のＴ細胞と接触させるステップであって、前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子が、検出部分を含む、ステップと；
    （ｂ）前記検出部分の検出に基づいて、（ａ）の前記複数のＴ細胞から、富化させたＴ細胞集団を得るステップと；
    （ｃ）富化させた前記集団から、ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に結合した１つの単一のＴ細胞を、複数のベッセルのうちの１つの第１のベッセルに単離するステップと；
    （ｄ）ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を、
    （ｉ）前記第１のベッセル中の前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のオリゴヌクレオチド部分、および
    （ｉｉ）前記第１のベッセル中の前記単一のＴ細胞に由来するＴＣＲポリヌクレオチド
    に付着させるステップと；
    （ｅ）前記オリゴヌクレオチド部分またはその相補体および前記ＴＣＲポリヌクレオチドまたはその相補体を配列決定し、それによって配列情報を生成するステップと
    を含む方法。
  4. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を選択する方法であって、
    （ａ）複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子を複数のＴ細胞と接触させるステップであって、前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子が、検出部分を含む、ステップと；
    （ｂ）前記検出部分の検出に基づいて、（ａ）の前記複数のＴ細胞から、富化させたＴ細胞集団を得るステップと；
    （ｃ）富化させた前記集団から、ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に結合した１つの単一のＴ細胞を、複数のベッセルのうちの１つの第１のベッセルに単離するステップと；
    （ｄ）オリゴヌクレオチド部分またはその相補体およびＴＣＲポリヌクレオチドまたはその相補体を配列決定し、それによって配列情報を生成するステップと；
    （ｅ）前記配列情報に基づいて、前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートへの前記ＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされるＴＣＲの結合親和性を決定するステップと
    を含む方法。
  5. 前記富化させたＴ細胞集団が、前記接触させるステップの後の前記複数のＴ細胞中のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に結合したＴ細胞の全Ｔ細胞に対する比より高い、ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に結合したＴ細胞の全Ｔ細胞に対する比を含む、請求項３または４に記載の方法。
  6. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を選択する方法であって、
    （ａ）第１の複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子を、第１の複数のＴ細胞と、第１のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子対細胞の比で接触させるステップと；
    （ｂ）第２の複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子を、第２の複数のＴ細胞と、前記第１のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子対細胞の比より低い、第２のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子対細胞の比で接触させるステップと；
    （ｃ）第１のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を、
    （ｉ）複数のベッセルのうちの第１のベッセル中のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のオリゴヌクレオチド部分、および
    （ｉｉ）前記第１のベッセル中の第１のＴ細胞集団の単一のＴ細胞に由来する第１のＴＣＲポリヌクレオチド
    に付着させるステップと；
    （ｄ）第２のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を、
    （ｉ）前記複数のベッセルのうちの第２のベッセル中のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のオリゴヌクレオチド部分、および
    （ｉｉ）前記第２のベッセル中の第２のＴ細胞集団の単一のＴ細胞に由来する第２のＴＣＲポリヌクレオチド
    に付着させるステップと；
    （ｅ）前記第１のベッセル中の前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の前記オリゴヌクレオチド部分またはその相補体および前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドまたはその相補体を配列決定し、それによって配列情報の第１のセットを生成するステップと；
    （ｆ）前記第２のベッセル中の前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の前記オリゴヌクレオチド部分またはその相補体および前記第２のＴＣＲポリヌクレオチドまたはその相補体を配列決定し、それによって配列情報の第２のセットを生成するステップと；
    （ｇ）配列情報の前記第１のセットに基づいて、前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートへの前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされるＴＣＲの第１の結合シグナルを決定するステップ、および配列情報の前記第２のセットに基づいて、前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートへの前記第２のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされるＴＣＲの第２の結合シグナルを決定するステップと
    を含み、前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドおよび前記第２のＴＣＲポリヌクレオチドが、同じＴＣＲをコードする、方法。
  7. 前記配列情報に基づいて、前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートへの前記ＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされるＴＣＲの結合親和性を決定するステップをさらに含む、請求項１または３に記載の方法。
  8. 前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドおよび前記第２のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる同じＴＣＲの結合親和性を、前記第１の結合シグナルおよび前記第２の結合シグナルに基づいて決定するステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
  9. 前記第１および第２の複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子が、同じペプチドを含む、請求項６に記載の方法。
  10. 前記第１および第２の複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のＭＨＣが、同じサブタイプである、請求項６または９に記載の方法。
  11. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を選択する方法であって、
    （ａ）複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子を複数のＴ細胞と接触させるステップと；
    （ｂ）
    （ｉ）第１のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を、複数のベッセルのうちの第１のベッセル中のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のオリゴヌクレオチド部分に付着させ、
    （ｉｉ）前記第１のベッセル中のＴ細胞集団の第１の単一のＴ細胞に由来する第１のＴＣＲポリヌクレオチドを付着させ；
    （ｉｉｉ）第２のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を、前記複数のベッセルのうちの第２のベッセル中のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のオリゴヌクレオチド部分に付着させ、
    （ｉｖ）前記第２のベッセル中のＴ細胞集団の第２の単一のＴ細胞に由来するＴＣＲポリヌクレオチドを付着させるステップと；
    （ｃ）
    （ｉ）前記第１のベッセル中の前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の前記オリゴヌクレオチド部分またはその相補体および前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドまたはその相補体を配列決定し、それによって、ＴＣＲポリヌクレオチドベッセルバーコード配列読み取りおよびオリゴヌクレオチドベッセルバーコード配列読み取りを含む配列情報の第１のセットを生成し；
    （ｉｉ）前記第２のベッセル中の前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の前記オリゴヌクレオチド部分またはその相補体および第２のＴＣＲポリヌクレオチドまたはその相補体を配列決定し、それによって、ＴＣＲポリヌクレオチドベッセルバーコード配列読み取りおよびオリゴヌクレオチドベッセルバーコード配列読み取りを含む配列情報の第２のセットを生成するステップと；
    （ｄ）前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる前記ＴＣＲの結合親和性と前記第２のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる前記ＴＣＲの結合親和性とを比較するステップであって、前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる前記ＴＣＲの前記結合親和性が、配列情報の前記第１のセットに基づいて決定され、前記第２のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる前記ＴＣＲの前記結合親和性が、配列情報の前記第２のセットに基づいて決定される、ステップと；
    （ｅ）前記比較するステップに基づいて前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる前記ＴＣＲを選択するステップであって、前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる選択された前記ＴＣＲが、前記第２のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる前記ＴＣＲより強力な結合親和性を有する、ステップと
    を含む方法。
  12. 前記第１の単一のＴ細胞が、疾患または状態に罹患している患者に由来する、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記第２の単一のＴ細胞が、前記疾患または状態に罹患していない患者に由来する、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子が、検出部分を含む、請求項１または６から１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 富化させたＴ細胞集団を得るステップが、前記検出部分の検出に基づく、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記検出部分が、フルオロフォアを含む、請求項１４または１５に記載の方法。
  17. 前記第１のベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体のベッセルバーコード配列が、複数の前記ベッセルのうちの第２のベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンのベッセルバーコード配列と異なる、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記配列情報が、ＴＣＲポリヌクレオチドベッセルバーコード配列読み取りおよびオリゴヌクレオチドベッセルバーコード配列読み取りを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記接触させるステップの後に、前記接触させるステップの後の前記複数のＴ細胞中のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に結合したＴ細胞の百分率よりも高い百分率のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に結合したＴ細胞を含む富化させたＴ細胞集団を得るステップをさらに含む、請求項１または６から１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記単一の細胞に結合したｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の数を決定するステップをさらに含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの前記オリゴヌクレオチド部分が、前記複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の単一のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に固有な四量体分子バーコード（ＴＭＢ）配列を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記配列情報が、四量体分子バーコード配列読み取りを含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記単一のＴ細胞に結合したｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の数が、前記配列情報から決定される、請求項２１または２２に記載の方法。
  24. 前記単一のＴ細胞に結合したｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の数が、前記四量体分子バーコード配列読み取りから決定される、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の各ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子が、固有のＴＭＢ配列を含む、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのｐＭＨＣ部分が、ｐＭＨＣの多量体、任意選択でｐＭＨＣの四量体を含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記ＭＨＣが、可溶形態である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの前記ｐＭＨＣ部分のペプチドが、合成ペプチドを含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記ｐＭＨＣ部分が、前記単一のＴ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合する、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記オリゴヌクレオチド部分が、四量体同定配列（ＴＩＤ）を含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記ＴＩＤが、前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの前記ペプチドまたは前記ｐＭＨＣ部分にバーコード化される、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、前記ベッセル中の鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドに由来する、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記配列情報に基づいて、前記ベッセル中の前記単一のＴ細胞の特徴を決定するステップをさらに含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記配列情報が、前記四量体同定（ＴＩＤ）配列またはその相補体を含み、および／または前記ＴＩＤ配列を有する分子のコピー数を含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記接触させるステップの後に前記複数のＴ細胞を洗浄するステップをさらに含む、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記ベッセル中の前記単一のＴ細胞を単離するステップをさらに含む、請求項１または６から３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記単一のＴ細胞が、単離するステップの前に前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに結合している、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記単一のＴ細胞を溶解するステップをさらに含む、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記溶解するステップが、前記単一のＴ細胞が前記ベッセル中で単離された後である、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記複数のＴ細胞が、複数のソーティングされていないＴ細胞である、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記複数のベッセルのうちの第１のベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体の前記ベッセルバーコード配列が、前記複数のベッセルのうちの第２のベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体の前記ベッセルバーコード配列と異なる、請求項１から４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記複数のベッセルのうちの単一のベッセル中の各ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体の前記ベッセルバーコード配列が、同じベッセルバーコード配列を含む、請求項１から４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記複数のベッセルのうちの任意の単一のベッセル中の各ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体の前記ベッセルバーコード配列が、前記複数のベッセルのうちの任意の他の単一のベッセル中の各ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体の前記ベッセルバーコード配列に固有である、請求項１から４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドをオリゴヌクレオチド部分に付着させる前記ステップ、およびベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを前記単一のＴ細胞に由来するＴＣＲポリヌクレオチドに付着させる前記ステップが、同時に実行される、請求項１から４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記オリゴヌクレオチドまたはその相補体を増幅するステップをさらに含む、請求項１から４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記ＴＣＲ細胞ポリヌクレオチドまたはその相補体を増幅するステップをさらに含む、請求項１から４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記オリゴヌクレオチドまたはその相補体を増幅するステップおよび前記ＴＣＲポリヌクレオチドまたはその相補体を増幅するステップが、同時に実行される、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記細胞ポリヌクレオチドの前記ベッセルバーコード配列および前記オリゴヌクレオチドの前記ベッセルバーコード配列が、同じである、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記複数のベッセルのうちの２またはそれより多くのベッセルから、オリゴヌクレオチド、その増幅産物またはその相補体をプールするステップをさらに含む、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記複数のベッセルのうちの２またはそれより多くのベッセルから、オリゴヌクレオチド、その増幅産物またはその相補体、およびＴＣＲポリヌクレオチドまたはその相補体をプールするステップをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記プールするステップが、配列決定するステップの前である、請求項４９または５０に記載の方法。
  52. 前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、複数の異なるｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む、請求項１から５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの各ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、固有の四量体同定（ＴＩＤ）配列を含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記オリゴヌクレオチドが、融合配列を含み、前記付着させるステップが、前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを前記融合配列に付着させることを含む、請求項１から５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記オリゴヌクレオチドが、プライマー結合配列を含む、請求項１から５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記オリゴヌクレオチドが、定常配列を含む、請求項１から５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記オリゴヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列を分析するステップをさらに含む、請求項１から５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記オリゴヌクレオチド配列読み取りの四量体同定（ＴＩＤ）配列を分析するステップをさらに含む、請求項１から５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記オリゴヌクレオチド配列読み取りの四量体分子バーコード（ＴＭＢ）配列を分析するステップをさらに含む、請求項１から５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記分析するステップが、１つまたは複数のベッセルバーコード配列、１つまたは複数のＴＩＤ配列、１つまたは複数の四量体分子バーコード（ＴＭＢ）配列、またはその組合せの頻度を決定することを含む、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記分析するステップが、比較することを含む、請求項５９または６０に記載の方法。
  62. オリゴヌクレオチド配列読み取りの四量体同定（ＴＩＤ）配列を、オリゴヌクレオチド配列読み取りの四量体分子バーコード（ＴＭＢ）配列と比較するステップをさらに含む、請求項５７から６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記ＴＣＲポリヌクレオチド、その相補体、その増幅産物、またはその組合せを配列決定し、それによってＴＣＲポリヌクレオチド配列読み取りを産生するステップをさらに含む、請求項４４から６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. オリゴヌクレオチド配列読み取りを前記ＴＣＲポリヌクレオチド配列読み取りと比較するステップをさらに含む、請求項６３に記載の方法。
  65. オリゴヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列を、前記ＴＣＲポリヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列と比較するステップをさらに含む、請求項６３または６４に記載の方法。
  66. 前記ＴＣＲポリヌクレオチド配列読み取りを比較するステップをさらに含む、請求項６３から６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記ＴＣＲポリヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列を分析するステップをさらに含む、請求項６３から６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記ＴＣＲポリヌクレオチド配列読み取りの分子バーコード配列を分析するステップをさらに含む、請求項６３から６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記分析するステップまたは前記比較するステップに基づいて細胞の特徴を決定するステップをさらに含む、請求項６３から６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記オリゴヌクレオチド配列読み取りに基づいてＴＣＲを選択するステップをさらに含む、請求項５７から６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記ＴＣＲポリヌクレオチド配列読み取りに基づいてＴＣＲを選択するステップをさらに含む、請求項６３から７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記オリゴヌクレオチドに付着された前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチド、および前記ＴＣＲポリヌクレオチドに付着された前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、前記ベッセル中の同じ鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドに由来する、請求項１から７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記オリゴヌクレオチドに付着された前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの増幅産物である、請求項１から７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記ＴＣＲポリヌクレオチドに付着された前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、前記鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの増幅産物である、請求項７２または７３に記載の方法。
  75. 前記ベッセルが、固体支持体を含む、請求項１から７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記ベッセルが、固体支持体を含まない、請求項１から７４のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記複数のベッセルの各ベッセルが、単一の細胞を含む、請求項１から７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記ベッセルが、ウェル、エマルジョンまたは液滴である、請求項１から７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、固体支持体に結合されていない、請求項１から７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、固体支持体に結合されている、請求項１から７８のいずれか一項に記載の方法。
  81. 複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドのうちの分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコード配列を前記ＴＣＲポリヌクレオチドに付着させるステップであって、前記分子バーコード配列が、単一のＴＣＲポリヌクレオチド分子およびその増幅産物にバーコード化される、ステップをさらに含む、請求項１から８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記付着させるステップが、前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を前記オリゴヌクレオチドにライゲーションすることを含む、請求項１から８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記付着させるステップが、前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を、酵素によって前記オリゴヌクレオチドに付着させることを含む、請求項１から８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記付着させるステップが、前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を、前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることを含む、請求項１から８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記付着させるステップが、前記オリゴヌクレオチドを伸長させるステップをさらに含む、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記付着させるステップが、鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを増幅することを含む、請求項１から８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記オリゴヌクレオチドが、二本鎖である、請求項１から８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記オリゴヌクレオチドが、一本鎖である、請求項１から８６のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記細胞ポリヌクレオチドが、可変領域配列を含む、請求項１から９０のいずれか一項に記載の方法。
  92. 可変領域配列を含有するネイティブのＴＣＲ鎖配列を対合させるステップをさらに含む、請求項１から９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記ＴＣＲポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項１から９２のいずれか一項に記載の方法。
  94. 前記ＴＣＲポリヌクレオチドが、ＲＮＡである、請求項１から９３のいずれか一項に記載の方法。
  95. 前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、請求項９４に記載の方法。
  96. 複数のベッセルを含む組成物であって、前記複数のベッセルのうちの１つのベッセルが、
    （ａ）複数のＴ細胞を含む試料に由来する単一のＴ細胞、および
    （ｂ）ベッセルバーコード配列を含むベッセルバーコード化ポリヌクレオチド
    を含み、前記ベッセルが、前記単一のＴ細胞のＴＣＲに結合するｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートをさらに含む、組成物。
  97. 複数のベッセルを含む組成物であって、前記複数のベッセルのうちの１つのベッセルが、
    （ａ）複数のＴ細胞を含む試料に由来する単一の溶解Ｔ細胞、および
    （ｂ）前記単一の溶解Ｔ細胞のＴＣＲに結合するｐＭＨＣ部分を含むｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート
    を含み、前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分が、ベッセルバーコード配列を含み、前記単一の溶解Ｔ細胞に由来するＴＣＲポリヌクレオチドが、同じベッセルバーコード配列を含む、組成物。
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