CN115997125A - 鉴定配体和受体的同源对的方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于鉴定配体种类和受体种类的同源对的方法。所述方法包括(a)提供配体种类组，其中每种配体种类被呈现至少一次；(b)提供受体种类组，其中每种受体种类被呈现至少一次；(c)使所述配体种类组与所述受体种类组在微反应器中接触，其中在配体种类与受体种类选择性结合后产生增强信号；(d)通过所述增强信号的产生检测配体种类和受体种类的同源对；和(a)鉴定配体种类和受体种类的所述同源对。

Description

鉴定配体和受体的同源对的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年6月24日提交的美国临时申请No.62/705,383的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及用于鉴定配体和受体的同源对，特别是T细胞受体和T细胞抗原的同源对或B细胞受体和B细胞受体抗原的同源对的方法。

背景技术

免疫疗法已成为癌症的划时代且有吸引力的治疗方式，其提供与常规疗法相比具有较少副作用的潜在靶向疗法。一种类型的免疫疗法是使用特异于CTL抗原4(CTLA-4)、程序性细胞死亡-1(PD-1)或其配体PD-L1的人源化mAb的检查点阻断疗法。这种疗法在患有黑素瘤、肺癌、肾癌和膀胱癌的患者中诱导显著且持久的临床反应。然而，只有一部分患者(20-30％)对这种免疫检查点疗法有反应，并且只有患有某些类型的癌症的患者对此有反应。

因此，使用疫苗方法的癌症免疫疗法可能与对这种疗法没有反应的患者有关。

然而，已知很少有肿瘤抗原可在癌症患者中引发有效且安全的T细胞介导的抗肿瘤免疫。实际上，这种有效的肿瘤抗原需要在癌组织中过表达，在正常组织中不表达，并且能够诱导肿瘤抗原特异性T细胞反应。

因此，T细胞抗原的可靠鉴定将解决癌症免疫学领域的未满足的需要。

此外，免疫治疗方法还可以潜在地用于治疗自身免疫性疾病、炎症和自身免疫性疾病、感染性疾病和代谢疾病，其中T细胞抗原的有效且可靠的鉴定同样是非常重要的。

自身免疫性疾病也可以通过基于细胞的疗法或通过耐受化方法进行治疗，这也需要可靠地鉴定感兴趣的抗原。

不幸的是，尽管有这种潜在的效用，但T细胞抗原的发现和表征进展非常缓慢，特别是由于T细胞库的广泛性和大量潜在的T细胞抗原两者。

目前鉴定T细胞表位的方法通常包括分离T细胞、制备单个T细胞克隆和从自体肿瘤细胞(新鲜的或从已建立的细胞系)筛选一组肿瘤细胞系或表达文库(Boon等，(1994)Annu Rev Immunol.12:337-65)。该方法是劳动密集型的并且效率低，因为T细胞克隆和肿瘤细胞系都应当建立，这个过程很长，并且不可能适用于所有肿瘤类型。

最近，肿瘤DNA的深度测序连同RNA分析已经允许使用肽结合预测算法对特定MHC等位基因的候选表位进行定义和排序，从而避免了建立肿瘤细胞系的需要(Gubin等，(2015)J.Clin.Invest.125:3413-3421)。然而，对于由CD4 T细胞识别的MHC II类限制性表位，预测算法不是非常可靠。表位也可以通过对从肿瘤细胞获得的MHC I类分子的免疫沉淀酸性洗脱物进行蛋白质组学分析来鉴定，进一步改进该方法的预测能力。在这两种情况下，然后合成负载有最可能的候选抗原的MHC四聚体，并用于荧光标记和分离潜在的反应性T细胞(Yadav等，(2014)Nature 515:572-576以及Andersen等，(2012)Nat.Protoc.7:891-902).

然而，制备MHC II类四聚体对于许多表位仍然具有挑战性。

或者，表达克隆的T细胞受体(TCR)的T细胞克隆或细胞系针对抗原呈递细胞(APC)进行功能测试，所述抗原呈递细胞(APC)负载有合成肽、表达文库(Gaugler等，(1994)J.Exp.Med.179:921-930)或用编码候选表位的mRNA转导(Holtkamp等，(2006)Blood 108:4009-4017)。DNA标记的MHC寡聚体技术(Bentzen等，(2016)Nat.Biotechnol.34:1037-1045)需要候选抗原的现有知识，并且目前仅适用于MHC-I限制性表位。

然而，每种方法具有缺点：制备T细胞克隆是极其劳动密集型的，对所得克隆进行抗原特异性筛选也是如此；只有当少数感兴趣的TCR的频率增加且有足够的细胞可利用时，才可通过去卷积方法在没有细胞扩增的情况下，从大量细胞群中鉴定复发性TCR和/或肿瘤反应性TCR；从肿瘤MHC分子洗脱肽需要许多肿瘤细胞；并且基因组数据中MHC表位的生物信息学分析需要对表位性质作出强烈假设。

总之，这些方法是低通量的，是基于通常需要产生特定试剂(克隆、肿瘤细胞系、MHC四聚体、mRNA、肽)的多步骤方法，并且因此不适用于可能通过除突变或过表达之外的其他机制(例如通过翻译后修饰[值得注意地磷酸化、泛素化、磺酰化]、剪接、插入/缺失)产生的MHC I类和II类表位的无偏发现。

因此，非常需要有效的方法来鉴定T细胞和T细胞抗原的同源对，特别是来自患有癌症、炎症和自身免疫性疾病、感染性疾病或代谢疾病的受试者。

另外，B细胞库(BCR和抗体)可以是治疗产品的来源并用作免疫反应监测。这样的治疗产品可以是抗体(及其所有变体，包括双特异性抗体和纳米抗体)和工程化的细胞(包括CAR-T和NK细胞等)，其利用抗体优先以天然形式连接特定抗原的能力。这种抗原可以是在癌细胞中潜在过表达的天然抗原，在癌细胞或正常细胞中表达的外源抗原。通常筛选抗原文库和/或B细胞库以鉴定抗原/B细胞库的对。抗原的鉴定可导致潜在疫苗、生物标志物和靶标的鉴定。鉴定对应于特异性抗原的B细胞库将受益于高通量方法，以快速鉴定有效且特异性的治疗剂。

发明内容

了解T细胞表型反应可用于监测治疗前和/或治疗后患者的免疫反应。因此，确定应答T细胞和/或B细胞的外源抗原(例如T细胞抗原、B细胞抗原、病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原等)可导致由外源抗原引起的疾病的治疗，从而导致同源疫苗表位的鉴定。此外，鉴定可与抗肿瘤T细胞受体匹配的外源抗原反应T细胞受体，可导致具有高亲和力和特异性的T细胞受体的选择。

随着时间的推移，连接T细胞库、抗原和表型是理解免疫原性抗原以及反应T细胞在表型和转录组水平上随着时间的推移的多样性和异质性所必需的。这将有效地帮助根据患者在不同阶段的免疫原性反应对患者进行分级，并开发预防和治疗疫苗。

细胞疗法(例如T细胞、CAR T细胞、Treg、干细胞)是另一种显示治愈和有益临床结果的有希望的疗法，其需要鉴定对特定配体反应的受体序列，并表征这种相互作用及其下游效应。实际上，连接表型-基因型和配体-受体可以解决这些未满足的需要，并改善显示适当表型和转录组图谱的最佳反应细胞的选择。这种连接和匹配可用于微调选择和选择显示最高比活性的最佳细胞(具有正确的受体如TCR)。

本发明源于意外的发现，即可以快速和容易地筛选多达数千种肿瘤抗原(包括无限组抗原)，而不需要任何先验选择，以获得它们结合和活化T细胞的能力，并以低错误率可靠地鉴定这种T细胞抗原和T细胞受体的同源对，而不需要进一步确认鉴定。此外，所设计的鉴定方法可应用于任何类型的配体和受体的结合对，如病毒抗原和T细胞受体、细菌抗原和T细胞受体、寄生虫抗原和T细胞受体、以及B细胞抗原和B细胞受体。

因此，本文提供了鉴定配体种类和受体种类的同源对的方法。方法包括(a)提供配体种类组，其中每种配体种类被呈现至少一次；(b)提供受体种类组，其中每种受体种类被呈现至少一次；(c)使所述配体种类组与所述受体种类组在微反应器中接触，其中在配体种类与受体种类选择性结合后产生增强信号；(d)通过增强信号的产生检测配体种类和受体种类的同源对；和(a)鉴定配体种类和受体种类的同源对。

在某些实施方案中，每种配体种类包含条形码序列。在某些实施方案中，每种受体种类包含条形码序列。在某些实施方案中，每种配体种类和/或每种受体种类包含条形码序列。

在某些实施方案中，每种配体种类由细胞表达或在珠表面上展示，或在无细胞提取物或溶液中表达或存在。配体种类可以例如由抗原呈递细胞表达或展示在其表面上。抗原呈递细胞可以例如选自巨噬细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞、B细胞、单核细胞衍生的树突细胞或表达MHC I类或II类分子的另一种细胞。

在某些实施方案中，每种受体种类由细胞表达或在珠表面上展示，或在无细胞提取物或溶液中表达或存在。

在某些实施方案中，微反应器选自水性液滴、微胶囊、微珠、微流体芯片的隔室或孔(例如组织培养板的孔)。

在某些实施方案中，信号选自细胞、配体或受体中任何一个的形态学变化；荧光信号增强；通过使用笼形化合物或通过猝灭反应修饰荧光信号；光吸收；可见的结构修饰/创建；或其信号的组合。信号可以是动态的(开/关；对比开启(versus on)；对比关闭(versusoff))和时空变化。通过猝灭反应对荧光信号的修饰可以例如包括FRET、FLIP、FRAP、FLAP、BRET或FLIM猝灭反应。形态学变化可以是细胞-细胞相互作用(例如像免疫突触)、细胞尺寸的变化、细胞粒度的变化、肽/蛋白质定位的极化、或材料从细胞到细胞的转移(例如蛋白质、核酸、脂质和/或碳水化合物)。

在某些实施方案中，鉴定配体种类和受体种类的同源对包括扩增配体种类和受体种类，其中对所扩增的配体种类和受体种类中的至少一种进行测序以用于鉴定。

在某些实施方案中，配体种类组可以例如选自T细胞抗原、B细胞抗原、病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原、新抗原、肿瘤相关抗原(TAA)、肿瘤特异性抗原、免疫检查点分子、细胞因子、碳水化合物、免疫球蛋白超家族成员、选择素、趋化因子、激素、生长因子、G蛋白偶联受体配体或酶底物。

在某些实施方案中，受体种类组可以例如选自T细胞受体、B细胞受体、免疫检查点受体、细胞因子受体、选择素、整联蛋白、免疫球蛋白超家族成员、钙粘蛋白、趋化因子受体、激素受体、生长因子受体、G蛋白偶联受体(GPCR)或酶。

在某些实施方案中，配体种类是T细胞抗原且受体种类是T细胞受体，并且在T细胞抗原与T细胞受体选择性结合后，产生增强信号，其中产生的增强信号是T细胞活化的结果。

在某些实施方案中，配体种类是病毒抗原且受体种类是T细胞受体，并且在病毒抗原与T细胞受体选择性结合后，产生增强信号，其中产生的增强信号是T细胞活化的结果。

在某些实施方案中，使所述配体种类组与所述受体种类组在微反应器中接触约0.001小时至约8小时。在某些实施方案中，使所述配体种类组与所述受体种类组在微反应器中接触至少约8小时，例如约8小时至约48小时。

在某些实施方案中，当接触步骤发生约0.1小时至约8小时，并且配体种类和受体种类以高亲和力结合时，产生的增强信号是T细胞活化的早期标志物。在某些实施方案中，当接触步骤发生约0.1小时至约8小时，并且配体种类和受体种类以高亲和力结合时，产生的增强信号是T细胞活化的晚期标志物。

在某些实施方案中，当接触步骤发生至少约8小时，并且配体种类和受体种类以高亲和力结合时，产生的增强信号可以是T细胞活化的早期标志物或晚期标志物。

在某些实施方案中，当接触步骤发生至少约8小时，并且配体种类和受体种类以低亲和力结合时，产生的增强信号是T细胞活化的早期标志物。延长配体种类和受体种类以低亲和力结合的接触步骤可最终导致由T细胞活化的晚期标志物产生的增强信号。

在某些实施方案中，T细胞活化的早期标志物可以是但不限于CD69、CD107a或转铁蛋白受体。

在某些实施方案中，T细胞活化的晚期标志物可以是但不限于CD137、HLA-DR、VLA1、PTA1、CD71、CD27、PD-1、TIM3、LAG3或CTLA4。

在某些实施方案中，信号用抗CD69抗体、抗CD107a抗体、抗转铁蛋白受体抗体、抗CD137抗体、抗HLA-DR抗体、抗VLA1抗体、抗PTA1抗体、抗CD71抗体、抗CD27抗体、抗PD1抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体或抗CTLA4抗体进行检测。

在某些实施方案中，配体种类是B细胞抗原且受体种类是B细胞受体，并且在B细胞抗原与B细胞受体选择性结合后，产生增强信号。产生的增强信号可以是例如B细胞活化、B细胞(受体)特异性抗原检测或靶细胞活化的结果。

在某些实施方案中，信号用抗CD138抗体、抗CD19抗体、抗CD45R抗体、抗CD45抗体、荧光报告基因表达的活化或荧光报告基因表达的抑制进行检测。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的以上概述以及以下详细描述。应当理解，本发明不限于附图中所示的精确实施方案。

图1显示了液滴中的抗CD137抗体的滴定。将不同浓度的抗体共流，并与液滴中的多克隆预活化T细胞一起孵育过夜。

图2显示了液滴工作流程中抗原呈递细胞(APC)活化T细胞的示意图。将用肽脉冲的K562抗原呈递细胞重新悬浮于含有抗CD137抗体的共流中，然后在与含有EBV肽特异性T细胞克隆的第二个入口不同的入口中共流。

图3显示液滴中的T细胞活化。将用肽脉冲的K562重新悬浮于含有抗CD137抗体的共流中，然后与EBV肽特异性T细胞克隆分别共流。

图4显示了液滴中的抗原呈递细胞(APC，K562)-T细胞相互作用的图像。上排显示了在37℃下孵育过夜后共包封T细胞和负载有肽的K562的液滴的显微照片。其它是如所示相关的荧光信号。这些结合事件导致红色荧光信号；抗CD137抗体集中在T细胞(黄色)上，而不是均匀分布在整个液滴体积中或抗原呈递细胞(紫色)上(用箭头表示)。

图5显示了液滴中IFN-γ分泌的代表性荧光图。在抗IFN-γ偶联抗体存在下，将T细胞与mRNA转染的抗原呈递细胞(APC；K562细胞)在液滴中共培养过夜(此处以PE荧光染料偶联抗体为例)。在间接ELISA试验中，使用预负载至T细胞的抗CD45双特异性抗体和PE-偶联的共流的抗IFN-γ二抗检测液滴中的IFN-γ释放。

图6显示了使用Cell-Cap系统通过APC对活化T细胞的序列回收的代表性工作流程。将富集的液滴(来自含有具有感兴趣表型的细胞的分选液滴)收集在单个微孔中(任选地在显微镜下检查)，然后与含有与细胞条形码和基因特异性引物缀合的水凝胶珠的液滴融合。已经设计了基因特异性引物来捕获TCR、抗原信息和任选的其它基因组。然后回收的具有相同细胞条形码的序列将来源于对应于合适的T细胞-APC对的相同液滴，因此回收了TCR和同源抗原的序列。

图7显示连接抗原与TCR序列：从相同液滴回收的序列显示相同的细胞条形码以及TCR和抗原(称为TMG)。例如，细胞条形码由一系列4个特定组的11-mers索引组成，所述11-mers索引由4-mers接头分开。针对公共或私人数据库，这些序列与TCRα(SEQ ID NO:1)和β(SEQ ID NO:2)序列匹配，并与TMG(SEQ ID NO:3)序列(对应于转染到APC中的抗原的串联小基因)匹配。UMI(独特的分子标识符)用于定量每个细胞产生的转录本并且是任选的。

具体实施方式

背景和说明书通篇引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一篇通过引用整体并入本文。包括在本说明书中的文献、法令、材料、装置、制品等的讨论是为了提供本发明的背景。这样的讨论并不是承认任何或所有这些内容都构成与所公开或要求保护的任何发明的现有技术的一部分。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。另外，本文所用的某些术语具有说明书中所设定的含义。本文引用的所有专利、公开的专利申请和出版物通过引用并入，如同在本文中完全阐述一样。

通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交相关使用的命名法和技术是本领域熟知和常用的那些。

标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养。酶反应和纯化技术根据制造商的说明书或本领域通常实现的或如本文所述进行。

必须注意的是，如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一(a)”，“一个(an)”和“所述(the)”包括复数指代，除非上下文另外清楚地指明。

除非另有说明，否则任何数值(例如本文所述的浓度或浓度范围)应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样地，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。如本文所用，除非上下文另外清楚地指明，否则数值范围的使用明确包括所有可能的子范围、该范围内的所有单个数值，其包括这些范围内的整数和所述值的分数。

如本文所用，术语“核酸”通常是指DNA或RNA的至少一个分子或链，其包含至少一个碱基，例如在DNA(例如腺嘌呤“A”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”和胞嘧啶“C”)或RNA(例如A、G、尿嘧啶“U”和C)中发现的天然存在的嘌呤或嘧啶碱基。

“RNA”在本文中是指功能性RNA，例如mRNA、tRNA、ncRNA、lncRNA、miRNA、siRNA、piRNA、gRNA、端粒酶RNA组分、RNAi、CRISPR RNA、环状RNA、增强子RNA、snoRNA、snRNA和rRNA。

如本领域技术人员所理解的，单链的描述也限定了互补链的序列。因此，核酸也包括所述单链的互补链。因此，术语核酸包括互补DNA。本领域技术人员还将理解，核酸的许多变体可用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸也包括基本上相同的核酸及其互补物。如本领域技术人员所理解的，单链核酸(例如引物)可以在杂交条件，优选严格杂交条件下与靶序列杂交。因此，核酸也包括在杂交条件下与靶序列杂交的引物。

术语“条形码引物”是指至少一个长度为约20至约200个碱基的分子，其可用于引发核酸合成。特别地，条形码引物的长度可以是约30至约150个碱基、约40至约100个碱基、约50至约90个碱基、约60至约80或70个碱基。更具体地，在本发明的背景下，条形码引物是包含条形码序列或条形码序列组和引物序列的寡核苷酸，其中每种不同的引物序列定义了条形码引物的不同特异性。在一个实施方案中，条形码引物包含5’至3’的通用引物序列、条形码序列或条形码序列组和引物序列。

这些定义是指至少一种单链分子，但在一些实施方案中还包括至少一种与所述至少一种单链分子部分、基本上或完全互补的另外的链。因此，在一些实施方案中，所述定义是指双链分子。

因此，在一个实施方案中，核酸是指至少一种双链分子，其包含含有分子链的特定序列的一条或多条互补链或“互补物”。

本文的“条形码序列”是指可通过其序列与另一种核酸序列区分开的独特核酸序列，因此允许独特地标记核酸序列以使其可与携带另一种条形码序列的另一种核酸区分开。

在一个实施方案中，条形码序列将独特鉴定包含在特定微反应器中的核酸与包含在其它微反应器中的核酸，例如，甚至在核酸汇集在一起之后。

在一些实施方案中，条形码序列可用于区分数十、数百或甚至数千种核酸，例如由包含在不同微反应器中的细胞产生的核酸。

在一个实施方案中，条形码序列可以是任何合适的长度。条形码序列优选地具有足以将所述条形码序列与其他条形码序列区分开的长度。在一个实施方案中，条形码序列具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、72、74、76、78、80、85、90或更多个核苷酸的长度，例如50至85、60至80、70至80个核苷酸。

在一个实施方案中，条形码序列由一个以上的条形码序列组成，其中所述条形码序列是不同的。这种条形码序列在本文中称为“条形码序列组”。

在相关的实施方案中，不同的条形码序列可以取自潜在的条形码序列的“库”。如果条形码序列由一个以上的条形码序列组成，则所述条形码序列可以取自相同或不同的潜在条形码序列库。可以使用任何合适的技术来选择序列库，例如随机地、或使得序列允许错误检测和/或校正，例如，通过以特定距离(例如汉明距离)分开，使得可以检测条形码序列的读取中的错误，并且在一些情况下，进行校正。库可以具有任何数目的潜在条形码序列，例如至少100、至少300、至少500、至少1,000、至少3,000、至少5,000、至少10,000、至少30,000、至少50,000、至少100,000、至少300,000、至少500,000、至少1,000,000、至少10,000,000或至少100,000,000个条形码序列。

连接取自一个“库”或多于一个“库”的不同条形码序列的方法是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于使用连接酶和/或使用退火或引物延伸方法。

在一个实施方案中，条形码序列是双链或单链核酸、或部分单链和双链核酸。

“引物序列”通常是长度在10至50个核苷酸之间的短单链核酸，其被设计成完美地或几乎完美地匹配感兴趣的核酸，以被捕获然后被扩增(例如通过PCR)或逆转录(例如通过RT)。引物序列对其杂交的核酸是“特异性的”，即引物序列优选地在严格杂交条件下，更优选在高度严格杂交条件下杂交，并且与其杂交的核酸(也称为靶序列)互补或几乎互补。

通常，引物序列用作核酸合成的起始点，这允许聚合酶(如核酸聚合酶)延伸引物序列并复制互补链。引物序列可以与靶核酸互补并与之杂交。在一些实施方案中，引物序列是合成引物序列。在一些实施方案中，引物序列是非天然存在的引物序列。引物序列通常具有10至50个核苷酸的长度。例如，引物序列可以具有10至40、10至30、10至20、25至50、15至40、15至30、20至50、20至40或20至30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，引物序列具有18至24个核苷酸的长度。

在一个实施方案中，引物序列位于本发明背景下使用的条形码引物的3’侧(即，与条形码序列相比，引物在3’位置)。

如本文所用，“基因”可指包含转录和/或翻译调节序列和/或编码区和/或非翻译序列(例如内含子、5’-和3’-非翻译序列)的基因组基因。基因的编码区可以是编码氨基酸序列或功能性RNA(如tRNA、rRNA、催化RNA、siRNA、miRNA、反义RNA、lncRNA和piRNA)的核苷酸序列。基因还可以是mRNA或cDNA，其对应于任选地包含与其连接的5’-或3’-非翻译序列的编码区(例如外显子和miRNA)。基因也可以是体外产生的扩增的核酸分子，其包含编码区和/或与其连接的5’-或3’-非翻译序列的全部或部分。

如本文所用，术语“严格条件”或“高度严格条件”对应于适于在具有确定水平的互补性的核酸之间产生结合对，而不适于在显示低于所述确定水平的互补性的核酸之间形成结合对的条件。严格条件是杂交和洗涤条件的组合，并且是序列依赖性的。这些条件可以根据本领域技术人员已知的方法进行修改(Tijssen，1993，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes,第一部分,第2章“Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic acid probe assays,”Elsevier,New York)。通常，高度严格条件被选择为比热熔点(Tm)低约5℃，优选地在接近完全碱基配对双链体的Tm的温度下(Anderson,M.L.M.(1999)Nucleic acid hybridization.New York:Bios Scientific Publisher第54页)。杂交方法是本领域熟知的，并且描述于例如Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Seidman,J.G.,Smith,J.A.,Struhl,K.eds.(1998)Current protocols inmolecular biology.V.B.Chanda,series ed.New York:John Wiley&Sons。

高度严格条件通常涉及在约40℃至约68℃杂交，其中所述温度通常对应于待与靶序列杂交的核酸的最高解链温度T_M，例如在5x SSC/5x Denhardt’s溶液/1.0％SDS中，并在约60℃至约68℃在0.2x SSC/0.1％SDS中洗涤。

如本文所用，术语“组织”是指细胞群，通常由执行相同或相似功能的相同种类的细胞组成。组织可以是器官或骨的一部分，或者它可以是细胞的松散结合，例如免疫系统的细胞。组织可以是健康组织或患病组织。特别地，组织可以是癌组织或肿瘤周围的组织。

如本文所用，“受试者”是哺乳动物，例如人，但也可以是另一种动物，例如狗、猫、牛、绵羊、猪、马、猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等。优选地，受试者是人。

在一个实施方案中，受试者患有疾病，特别是癌症、炎症和自身免疫性疾病、感染性疾病或代谢疾病。

“癌症”在本文中是指涉及瘤形成的一类疾病，其包括涉及实体肿瘤的癌症和不涉及实体肿瘤的癌症(例如白血病)。

“自身免疫性疾病”在本文中是指由免疫系统攻击人自身细胞引起的广泛范围的退行性疾病。

“炎症和自身免疫性疾病”在本文中是指首先由炎症过程诱导的疾病，所述炎症过程由抗原呈递细胞对T细胞的活化引发，其随后导致其它炎症细胞的活化，并进而导致促炎细胞因子、趋化试剂和基质降解酶的释放。炎症和自身免疫性疾病的实例是本领域技术人员熟知的，并且包括类风湿性关节炎、骨关节炎、骨质疏松症、克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性硬化、牙周炎、牙龈炎、移植物抗宿主反应、银屑病、硬皮病、allopeicia、干燥综合征(sjogren’s syndrome)、多肌炎、天疱疮、葡萄膜炎、阿狄森氏病、特应性皮炎、哮喘、系统性红斑狼疮(SLE)、肾病和慢性阻塞性肺病(COPD)、糖尿病性视网膜病和年龄相关性黄斑变性。

“感染性疾病”在本文中是指由微生物传播引起的疾病。在本发明的背景下，术语“微生物”同样是指病毒，特别是具有脂质包膜的病毒(例如流感病毒)、细菌、寄生虫和真菌。

“代谢疾病”在本文中是指其中发生代谢错误和失衡并且其中代谢过程以次优方式发生的任何类型的病症。在一个优选的实施方案中，代谢疾病选自下组：高血糖症、糖尿病，特别是2型糖尿病、肥胖、血脂异常和高胆固醇血症。在特定的实施方案中，所述代谢疾病是糖尿病，更具体地是2型糖尿病。

在本发明的背景下，术语配体和受体的“同源对”是指其选择性结合的配体种类和受体种类的对。

“选择性结合”在本文中是指所述对的一个成员以比另一对的一个成员更大的亲和力识别并结合所述对的另一个成员。

“特异性结合”在本文中是指所述对的一个成员识别并结合所述对的另一个成员，并且对另一对的一个成员没有可检测的结合活性。

如本文所用，术语“高亲和力”是指配体种类对受体种类的选择性或特异性结合，其中结合处于等于或小于3μM的水平。

如本文所用，术语“低亲和力”是指配体种类对受体种类的选择性或特异性结合，其中结合处于等于或大于3μM的水平。

如本文所用，术语“配体种类”是指特定识别对的成员，其选择性结合，优选特异性结合所述特定识别对(或同源对)的第二成员。

如本文所用，术语“受体种类”是指特定识别对的成员，其被所述特定识别对(或同源对)的第二成员选择性结合，优选特异性结合。

因此，作为配体的分子也可以是受体，相反，作为受体的分子也可以是配体，因为配体和受体被定义为结合配偶体。

如本文所用，术语“配体组”是指至少一种配体种类，优选多种配体种类，特别是多种配体种类，其中所述多种配体种类中的至少两种是不同识别对的部分。优选地，在本发明的背景下使用的配体组包含冗余配体种类，即以多拷贝存在于所述组中的配体种类。

本文所用的术语“受体组”是指至少一种受体种类，优选多种受体种类，特别是多种受体种类，其中多种受体种类中的至少两种是不同识别对的部分。优选地，在本发明的背景下使用的受体组包含冗余受体种类，即以多拷贝存在于所述组中的受体种类。

在某些实施方案中，受体组由细胞(或多个细胞)表达、或在珠(特别是工程化的APC样珠)表面上展示，如Neal等(2017)J.Immunol.Res.Ther.2:68-79所公开的，或体外编码(即表达或存在于无细胞提取物或溶液中)，如Grubaugh等(2013)Vaccine 31:3805-3810所公开的。优选地，受体组由细胞(或多个细胞)、一个细胞表达或在珠表面上展示，所述一个细胞或珠表达或展示来自所述受体组的独特受体种类。

在另一特定实施方案中，配体组由细胞(或多个细胞)表达、或在珠(特别是工程化的APC样珠)表面上展示，如Neal等(2017)J.Immunol.Res.Ther.2:68-79所公开的，或体外编码(即表达或存在于无细胞提取物或溶液中)，如Grubaugh等(2013)Vaccine 31:3805-3810所公开的。优选地，配体组由细胞(或多个细胞)、一个细胞表达或在其表面上展示，所述一个细胞表达或展示来自所述配体组的一种配体种类或来自所述配体组的多种不同配体种类，优选来自所述配体组的2至1000、5至900、10至800、20至700、30至600、40至500、50至400种不同配体种类，特别是来自所述配体组的100至350、150至300或200至250种不同配体种类。

在一个特别优选的实施方案中，受体组由细胞(或多种细胞)表达或在其表面上展示，且配体组由另一细胞(或其它细胞)表达或在其表面上展示。更优选地，受体组由细胞(或多个细胞)表达或在其表面上展示，每个细胞表达或展示来自所述受体组的独特受体种类，且配体组由另一细胞(或其它细胞)表达或在其表面上展示，每个细胞表达或展示来自所述配体组的多种不同配体种类。

在某些实施方案中，受体可以是例如T细胞受体(TCR，来自TCR/T细胞抗原识别对，其包括来自TCR/病毒抗原识别对的TCR)、B细胞受体(来自B细胞受体/B细胞抗原识别对)、刺激性免疫检查点分子的受体(例如来自OX40L/OX40对的OX40L)、抑制性免疫检查点分子的受体(例如来自PD-L1/PD-1对的PD-L1)、细胞因子受体(来自细胞因子/细胞因子受体对)、选择素(来自选择素/碳水化合物对)、整联蛋白(来自整联蛋白/免疫球蛋白超家族的成员对)、免疫球蛋白超家族的成员(来自免疫球蛋白超家族的成员/选择素对，或来自包含免疫球蛋白超家族的两个成员的对)、钙粘蛋白(来自包含两个钙粘蛋白的对)、趋化因子受体(来自趋化因子/趋化因子受体对)、激素受体(来自激素/激素受体对)、生长因子受体(来自生长因子/生长因子受体对)、G蛋白偶联受体(GPCR，来自GPCR/相应配体对)或酶(来自酶/相应底物对)。

在优选的实施方案中，受体组是T细胞受体组。

在某些实施方案中，配体可以例如是T细胞抗原(来自TCR/T细胞抗原识别对)、B细胞抗原(来自B细胞受体/B细胞抗原识别对)、病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原、新抗原(即，由肿瘤细胞中的基因突变或异常表达产生的抗原，并且其表达独特地发现于肿瘤细胞中)、肿瘤相关抗原(TAA)、肿瘤特异性抗原、刺激性免疫检查点分子(例如来自OX40L/OX40对的OX40)、抑制性免疫检查点分子(例如来自PD-L1/PD-1对的PD-1)、细胞因子(来自细胞因子/细胞因子受体对)、碳水化合物(来自选择素/碳水化合物对)、免疫球蛋白超家族的成员(来自包含免疫球蛋白超家族的两个成员的对)、选择素(来自免疫球蛋白超家族成员/选择素对)、趋化因子(来自趋化因子/趋化因子受体对)、激素(来自激素/激素受体对)、生长因子(来自生长因子/生长因子受体对)、GPCR的配体(来自GPCR/相应的配体对)或底物(来自酶/相应的底物对)。在一个优选的实施方案中，配体组是T细胞抗原组(肽、糖脂或小代谢物，例如5-A-RU衍生物)，优选与主要组织相容性复合体(可以是I类、II类的MHC分子或MR1)或CD1a、b、c或d分子结合。

外源抗原，例如病毒抗原、细菌抗原或寄生虫抗原可以例如包括但不限于选自以下生物体中的至少一种的病毒抗原、细菌抗原或寄生虫抗原：疏螺旋体属细菌(例如伯氏疏螺旋体)、基孔肯雅病毒(CHIKV)、衣原体属细菌(例如沙眼衣原体)、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DENV)、埃博拉病毒(EVD)、大肠杆菌(例如志贺样毒素)、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、猫白血病病毒、汉坦病毒、肝炎病毒(例如甲型、乙型、丙型、丁型和/或戊型肝炎病毒)、疱疹病毒、幽门螺杆菌、人内源性逆转录病毒K(HERV-K)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人T细胞白血病病毒(HTLV)、流感病毒、拉沙病毒、疟原虫寄生虫(例如引起疟疾的)、腮腺炎病毒(例如流行性腮腺炎病毒)、支原体细菌、诺如病毒(Norovims)、乳头瘤病毒(HPV)、细小病毒、鼻病毒、轮状病毒、风疹病毒、沙门氏菌(例如伤寒沙门氏菌)、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、弓形体寄生虫(例如刚地弓形体)、密螺旋体属细菌(例如梅毒螺旋体、克拉泰密螺旋体)、锥虫属寄生虫(例如引起南美锥虫病的克氏锥虫)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、天花病毒、西尼罗河病毒(WNV)和/或寨卡病毒(ZIKV)。已知病毒抗原具有较强的TCR亲和力(参见例如Aleksic等，Eur.J.Immunol.42(12):3174-9(2012))，其可导致本文公开的方法中较高的增强信号检测。外源抗原是本领域技术人员已知的，参见例如Medical Microbiology,第四版,第6章:Normal Flora；Baron S.,编辑；Galveston,TX；University of Texas Medical Branch atGalveston(1996)；Laufer等,“Microbial communities of the upper respiratorytract and otitis media in children,”mBio 2(1):e00245-10(2011)。

T细胞抗原/T细胞受体

在特定的实施方案中，受体组是T细胞受体组，优选在T细胞的表面上展示，每个T细胞优选具有独特的T细胞受体，且配体组是T细胞抗原组，优选结合常在抗原呈递细胞(APC)的表面上展示的主要组织相容性复合体(MHC)，每个APC优选地展示多种抗原种类。

“T细胞抗原”在本文中是指CD4⁺T细胞抗原或CD8⁺T细胞抗原。“CD4⁺T细胞抗原”是指被CD4⁺T细胞识别并引发免疫反应的任何抗原，例如，通过与II类主要组织相容性复合体分子(MHC)结合的抗原或其部分的呈递而被CD4⁺T细胞上的T细胞受体特异性识别的抗原。“CD8⁺T细胞抗原”是指被CD8⁺T细胞识别并引发免疫反应的任何抗原，例如，通过与I类主要组织相容性复合体分子(MHC)结合的抗原或其部分的呈递而被CD8⁺T细胞上的T细胞受体特异性识别的抗原。T细胞抗原通常是蛋白质或肽，但也可以是其它分子如脂质和糖脂及其任何衍生物。

还包括四聚体、多聚体及其衍生物，其中抗原特异性由条形码或基因携带。四聚体或任何衍生物可通过体外转录翻译(IVTT)在液滴中合成，其中包括抗原和相应的载体。这类载体可包括编码可溶性TCR表达的基因。

优选地，配体组是与抗原呈递细胞(APC)表面上展示的主要组织相容性复合体(MHC)结合的T细胞抗原组。

在本发明的背景下，术语“抗原呈递细胞”或“APC”包括通过加工抗原并将抗原呈递至T细胞而介导细胞免疫反应的免疫活性细胞的异质群体。抗原呈递细胞包括但不限于巨噬细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞、B细胞、单核细胞衍生的树突细胞、人工APC、工程化APC或表达MHC I类分子或MHC II类分子的其它细胞。

APC可以是B细胞，特别是永生化B细胞，例如爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)永生化的B细胞。

在特定的实施方案中，APC是如上定义的来自感兴趣的受试者的自体永生化B细胞，或如上定义的携带与感兴趣的受试者相同的MHC的异质永生化B细胞。

“携带与感兴趣的受试者相同的MHC的异质B细胞”在本文中是指不来源于感兴趣的受试者但携带与感兴趣的受试者相同的MHC的B细胞。

“MHC”或“主要组织相容性复合体”在本文中是指编码抗原呈递至T细胞和快速移植排斥所需的细胞表面分子的基因(和由其编码的分子)的复合体。在人类中，MHC复合体也称为HLA复合体。MHC复合体编码的蛋白质被称为“MHC分子”，并被分为I类和II类MHC分子。I类MHC分子包括由与β2微球蛋白非共价结合的MHC中编码的α链组成的膜异质二聚体蛋白。I类MHC分子由几乎所有有核细胞表达，并且已经显示出在抗原呈递至CD8⁺T细胞中起作用。I类分子包括人类中的HLA-A、HLA-B和HLA-C。II类MHC分子还包括由非共价结合的α和β链组成的膜异质二聚体蛋白。已知II类MHC与CD4⁺T细胞相互作用，并且在人类中包括HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。术语“MHC限制”是指T细胞的特征，其允许它们仅在抗原被加工后识别抗原，并且所产生的抗原肽与I类或II类MHC分子结合展示。鉴别和比较MHC的方法是本领域熟知的，并描述于Allen等，(1994)Human Imm.40:25-32；或Santamaria等(1993)HumanImm.37:39-50。

在特定的实施方案中，每种APC表达或展示至少一种T细胞抗原，优选来自T细胞抗原组的多种不同的T细胞抗原，优选来自T细胞抗原组的2至1000、5至900、10至800、20至700、30至600、40至500、50至400种不同的T细胞抗原，特别是来自T细胞抗原组的60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、或500种不同的T细胞抗原。在特定的实施方案中，每种APC表达或展示10至1000，更优选300种不同的T细胞抗原种类。

在特定的实施方案中，展示至少一种T细胞抗原，特别是多种不同的T细胞抗原的APC组是通过将编码从感兴趣的受试者的组织获得的T细胞抗原(如上定义)的核酸文库引入来自感兴趣的受试者的自体APC或携带与感兴趣的受试者相同的MHC的异质APC(如上定义)而获得的。

在另一个特定的实施方案中，展示至少一种T细胞抗原，特别是多种不同的T细胞抗原的APC组是通过将编码抗原的合成mRNA(作为串联基因或作为单基因)的文库引入APC而获得的，所述mRNA是通过对肿瘤的基因组、外显子组或转录组进行测序来鉴定，并通过体外转录产生。

在另一个特定的实施方案中，展示至少一种T细胞抗原，特别是多种不同的T细胞抗原的APC组是通过将编码抗原的合成mRNA(作为串联基因或作为单基因)的文库引入APC而获得的，所述mRNA是通过对肿瘤的基因组、外显子组或转录组进行测序来鉴定，并通过与单个mRNA分裂和合并而产生。

在另一个特定的实施方案中，展示至少一种T细胞抗原，特别是多种不同的T细胞抗原的APC组是通过将编码抗原的合成mRNA(作为串联基因或作为单基因)的文库引入APC而获得的，所述mRNA通过对肿瘤的基因组、外显子组或转录组进行测序来鉴定，并通过使用允许mRNA翻译的基于DNA递送的穿透而产生。

在另一个特定的实施方案中，展示至少一种T细胞抗原，特别是多种不同的T细胞抗原的APC组是通过将在珠上制备的单个DNA(作为编码抗原的串联基因或作为编码抗原的单基因，所述抗原通过对肿瘤的基因组、外显子组或转录组进行测序来鉴定)引入APC中且转录为mRNA并在液滴转染而获得的。

在另一个特定的实施方案中，展示至少一种T细胞抗原，特别是多种不同的T细胞抗原的APC组是通过将在珠上制备的单个DNA(作为编码抗原的串联基因或作为编码抗原的单基因，所述抗原通过对肿瘤的基因组、外基因组或转录组进行测序来鉴定)引入APC中且转录为mRNA并在APC中转染或转导而获得的。

在另一个特定的实施方案中，展示至少一种T细胞抗原，特别是多种不同的T细胞抗原的APC组是通过将已知的标记的T细胞抗原和/或编码T细胞抗原的已知的标记的核酸引入APC中而获得的。

“标记的”在本文中表示带有标记，例如已知序列的核酸、荧光染料或标签。通常，标记可以是如上定义的条形码序列。

在特定的实施方案中，编码T细胞抗原的核酸文库是基于患者或病原体RNA或DNA的测序而化学合成。

在另一个特定的实施方案中，编码T细胞抗原的核酸文库是通过来自感兴趣的受试者的组织的核酸的扩增(例如，通过PCR)而获得的，如上文所定义。

在特定的实施方案中，编码T细胞抗原的核酸文库是cDNA文库。在另一个实施方案中，编码T细胞抗原的核酸文库是mRNA文库。

编码从感兴趣的受试者的组织获得的T细胞抗原的核酸文库可通过本领域技术人员熟知的方法获得。特别地，细胞(例如表达MHC-I或MHC-II的细胞或肿瘤细胞)可以通过已知技术如DNase、蛋白酶(如胶原酶)和机械消化从感兴趣的受试者的组织中提取。可以通过本领域技术人员熟知的技术如硅胶柱或酸苯酚技术从所述细胞中分离RNA。然后可以使用熟知的技术逆转录这些RNA以获得cDNA文库。优选地，使用与RNA杂交的引物通过逆转录获得cDNA文库。引物可以通过与poly(A)尾(锚定的寡聚dT引物)杂交而在所有mRNA上引发，或者被设计为仅在RNA的特定亚组上引发或随机引发任何RNA。

在特定的实施方案中，所述文库被标准化以减少文库中由于mRNA浓度差异引起的偏差。

标准化技术的范围是本领域技术人员熟知的，例如基于双链特异性核酸酶(DSN)的cDNA文库的标准化(Bogdanov等，Curr.Protoc.Mol.Biol.Chapter 5:Unit 5.12.1-27)，以及通过mRNA-cDNA杂交和减法的cDNA文库标准化(Chen(2003)In S.-Y.Ying(Ed.),Generation of cDNA Libraries:Methods and Protocols(pp.33–40)Totowa,NJ:HumanaPress)。

在特定的实施方案中，编码T细胞抗原的核酸文库包含通用序列，其允许在本发明的鉴定方法的后续步骤中进行特异性扩增和测序，如下文所定义。

如本文所用，术语“通用序列”是指可以例如通过连接或任何其它合适的方法(如重叠延伸PCR、PCR、引物延伸或直接DNA合成)连接至核酸序列(特别是核酸分子文库中的核酸序列)的序列，使得相同序列连接至多个不同核酸分子。这种通用序列对于同时分析多个样品特别有用。通用序列的实例是通用引物和通用引发位点。通用引发位点包含“共同引发位点”，适当的引物可以结合至所述“共同引发位点”，并且所述“共同引发位点”可以用作合成与连接至通用引物的核酸序列互补的核酸序列的引发位点。

将编码T细胞抗原的核酸文库引入APC可以通过本领域技术人员熟知的任何方法进行，例如通过用病毒载体转导、通过电穿孔、或通过转染(例如脂质转染、核转染、基于纳米颗粒，或使用细胞穿透肽)。

在特定的实施方案中，将编码T细胞抗原的核酸文库(特别是编码T细胞抗原的核酸的cDNA文库)引入所述APC是通过用携带所述文库的病毒载体转导所述APC进行的。

“病毒载体”在本文中是指病毒或其重组体，其能够包封所需的遗传材料，并将所需的遗传材料转移和整合到靶细胞中，从而能够离体和在体内都有效且靶向地递送遗传材料。病毒载体的实例包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)载体、辛德比斯病毒载体、牛痘病毒载体、鸡痘病毒载体、杆状病毒载体和仙台病毒载体。优选地，所述病毒载体是慢病毒载体。

如本领域技术人员所理解的，当通过用病毒载体转导将编码T细胞抗原的核酸引入APC时，所述APC表达或展示的不同T细胞抗原的数目取决于所述病毒载体用于转导所述APC的感染复数(MOI)。

因此，在特定的实施方案中，通过用携带所述文库的病毒载体转导所述APC将编码T细胞抗原的核酸文库引入所述APC，其感染复数为0.01至1000、0.05至900、0.1至800、0.5至700、1至600、2至500、3至450、4至400、5至350、6至300、7至250、8至200、9至150或10至100，特别是感染复数为20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、或500，从而产生表达至少一种抗原至多种抗原的APC。

在另一个实施方案中，通过用所述mRNA或相应的DNA转染APC将编码T细胞抗原的核酸文库(特别是编码T细胞抗原的核酸的RNA文库)引入所述APC。这种转染通常可以通过与RNA共价偶联的脂质转染、核转染、基于纳米颗粒的转染或使用细胞穿透肽((Rádis-Baptista等，(2017)Journal of Biotechnology 252:15-26)如渗透素)进行。相同的原理适用于通过自体或异质T细胞或T细胞系表达TCR，以筛选针对抗原/MHC复合体的TCR特异性和/或亲和力/亲合力。

术语“T细胞受体”或“TCR”在本文中是指存在于T细胞(即T淋巴细胞)表面上的抗原识别分子。该定义明确地包括本领域已知的术语的理解，并且包括例如，包含在细胞膜上作为具有不变CD3链的复合体表达的高度可变的α或β链的二硫化物连接的异质二聚体或由其组成的受体，或包含在细胞膜上作为具有T细胞亚群上的CD3的复合体表达的可变的γ和δ链或由其组成的受体。TCR的抗原识别结构域通常由由独立的基因编码的α链和β链构成，或由由独立的基因编码的γ链和δ链构成。

T细胞受体基因经历独特的遗传重组机制(称为V(D)J重组)，其仅发生在T细胞成熟早期阶段的发育中的淋巴细胞中。它导致在T细胞上发现的T细胞受体(TCR)的高度多样性文库。

优选地，受体组是展示在T细胞表面上的TCR组。

本文一般使用的术语“T细胞”或“T淋巴细胞”可以指例如CD4⁺辅助T细胞(例如TH1、TH2、TH9和TH17细胞)、CD8⁺细胞毒性T细胞、抗原经历型T细胞、天然T细胞、中央T细胞、效应T细胞、CD4⁺调节/抑制T细胞(Treg细胞)、天然杀伤T细胞、γδT细胞和/或自身攻击性T细胞(例如TH40细胞)、粘膜相关不变T细胞(MAIT)、耗竭性T细胞、记忆T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞、组织驻留T细胞。

优选地，在展示TCR的T细胞组中，每种T细胞表达或展示独特的T细胞受体(TCR)。

在特定的实施方案中，展示TCR的T细胞组的T细胞来源于与编码T细胞抗原的核酸文库相同的感兴趣的受试者，如上定义，其用于获得展示T细胞抗原的APC组。特别地，该实施方案有助于专用T细胞抗原的检测。

“专用抗原”在本文中是指限于一个或几个个体的抗原特异性。

在另一个特定的实施方案中，展示TCR的T细胞组的T细胞不是来源于与编码T细胞抗原的核酸文库相同的感兴趣的受试者，如上定义，其用于获得展示T细胞抗原的APC组。特别地，该实施方案有助于公共T细胞抗原的检测。

“公共抗原”在本文中是指存在于超过5％，更具体地超过10％的群体中的抗原。

在特定的实施方案中，展示TCR的T细胞组的T细胞在从受试者收集后被活化以允许其扩增。

B细胞受体/B细胞抗原

在另一个特定的实施方案中，受体组是B细胞受体(BCR或抗体)组且配体组是B细胞抗原组。

如本文所用，术语“BCR”是指位于B细胞外表面上的跨膜受体蛋白。受体的结合部分由膜结合抗体构成，与大多数抗体一样，该膜结合抗体具有独特且随机确定的抗原结合位点(参见V(D)J重组)。当B细胞通过与其受体结合的抗原(其“同源抗原”)的第一次遭遇而被活化时，细胞增殖并分化以产生分泌抗体的血浆B细胞和记忆B细胞群。

术语“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。因此，术语抗体不仅包括完整的抗体分子，而且包括抗体片段以及抗体变体，其包括衍生物如人源化抗体。在某些常规抗体中，两条重链通过二硫键彼此连接，并且每条重链通过二硫键与轻链连接。存在两种类型的轻链，lambda(λ)和kappa(κ)。有五种决定抗体分子的功能活性的主要的重链类型(或同种型)：IgM、IgD、IgG、IgA、IgE和IgY。每条链含有不同的恒定区序列。轻链包括两个结构域，可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。重链包括四个结构域，可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区决定了对抗原的结合识别和特异性。轻链(CL)和重链(CH)的恒定区结构域赋予重要的生物学特性，例如抗体链缔合、分泌、跨胎盘迁移、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N-末端部分，且由一个轻链和一个重链的可变部分组成。抗体的特异性在于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自高变区或互补决定区(CDR)的残基组成。有时，来自非高变区或构架区(FR)的残基影响整个结构域结构并因此影响结合位点。互补决定区(CDR)是指共同定义天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个CDR，分别命名为LCDR1、LCDR2、LCDR3和HCDR1、HCDR2、HCDR3。因此，抗原结合位点包括六个CDR，其包含来自每个重链和轻链V区的CDR组。构架区(FR)是指插在CDR之间的氨基酸序列，即，在单一种类的不同免疫球蛋白中相对保守的免疫球蛋白轻链和重链可变区的那些部分，如Kabat等所定义(Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。

术语抗体还表示单链抗体，例如骆驼科抗体(Camelidae antibody)，或纳米抗体或V_HH。

抗体基因通常经历独特的遗传重组机制(称为V(D)J重组)，其仅发生在B细胞成熟早期阶段的发育中的淋巴细胞中。抗体基因可以进一步进行体细胞超变，并且V(D)J重组和体细胞超变的组合导致在B细胞上发现的抗体/免疫球蛋白(Ig)的高度多样性文库。

在特定的实施方案中，当受体组是B细胞受体组时，所述B细胞受体由B细胞展示。

微反应器和共区室化

“共区室化”配体种类和受体种类在本文中是指形成多个微反应器，每个微反应器将一组配体种类和/或受体种类(优选一组至少一种配体种类和任选的至少一种受体种类)与由配体和受体组提供的其余配体种类和受体种类分开。

在本发明的背景下，共区室化/微反应器步骤可以通过任何合适的方法进行，例如通过微流体、流式细胞术、基于细胞的分选和/或有限稀释。

在特定的实施方案中，微反应器是孔或微加工的孔(microfabricated well)。

在另一个特定实施方案中，微反应器是水性液滴，特别是在连续不混溶相中。

“液滴”通常是指体积的量度，并且在本发明的背景下进一步指的是被第二流体包围的第一流体的隔离部分。应当注意，液滴不一定是球形的，而是也可以呈现其它形状，例如，取决于外部环境。

优选地，每个液滴的体积至少等于两个哺乳动物细胞的体积。

在另一个特定的实施方案中，微反应器是微胶囊。微胶囊可以指体积的量度，并且在本发明的背景下进一步指的是包围第二材料的第一涂层材料的隔离部分。应当注意，微胶囊不一定是球形的，而是也可以呈现其它形状，例如，取决于外部环境。“微胶囊”通常是指由包围可用于永久或临时包埋物质的核形成空间的固体壳构成的中空微粒。所述物质可以是药物、农药、染料、细胞、其组合和类似材料。固体壳可例如将固体、液体或气体封闭在由硬或软的可溶性膜制成的测微壁内。通常用于包衣的包衣材料是乙基纤维素、聚乙烯醇、明胶、海藻酸钠。

优选地，每个微胶囊的体积至少等于两个哺乳动物细胞的体积。

在另一个特定的实施方案中，微反应器是微珠。微珠可以指体积的量度，并且进一步指的是被流体包围的第一半固体材料的隔离部分，所述流体渗透或不渗透半固体珠。应当注意，微珠不一定是球形的，而是也可以呈现其它形状，例如，取决于外部环境。“微珠”通常是指半固体多孔或非结构，其占据可用于永久或临时包埋物质的整个体积。所述物质可以是药物、农药、染料、细胞、其组合和类似材料。半固体多孔结构可以例如将固体、液体或气体封闭在由硬或软的可溶性膜制成的测微壁内。通常用于形成微珠的材料包括聚合物如琼脂糖、丙烯酰胺、海藻酸钠。

优选地，每个微珠的体积至少等于两个哺乳动物细胞的体积。

应当理解，在细胞实现它们的液滴向微胶囊或微珠的转化之前，细胞可以被包封在微胶囊或微珠中。

哺乳动物细胞的平均体积是本领域技术人员公知的，其通常为约0.002nL。

在特定的实施方案中，每个液滴或微胶囊或微珠具有小于20nL的体积。在一个实施方案中，每个液滴具有小于15nL、小于10nL、小于9nL、小于8nL、小于7nL、小于6nL、小于5nL、小于3nL、小于2.5nL、小于2nL、小于1.5nL、小于1nL、小于0.5nL、小于0.2nL、小于0.1nL、小于0.05nL的体积，例如20pL至3nL、30pL至1nL、40pL至500pL、50pL至250pL、60pL至100pL、或0.1nL至3nL、0.5nL至3nL、1nL至3nL，典型地，0.1nL、0.5nL、1nL、1.2nL、1.4nL、1.6nL、1.8nL、2.0nL、2.2nL、2.4nL、2.6nL、2.8nL、3nL。

这类液滴或微胶囊或微珠可以通过本领域技术人员熟知的任何技术制备，特别是通过微流体技术制备。

如本领域技术人员所理解的以及如下进一步解释的，在一个微反应器(例如液滴)中共区室化的配体和受体(特别是展示T细胞抗原的APC和展示TCR的T细胞)的数目遵循概率分布，例如泊松分布，并且取决于例如第一流体中第一类型细胞的浓度，第二流体中第二类型细胞的浓度，主要通道和次要次要通道的几何形状，第一流体、第二流体和所用载体流体的注射参数。

如果配体和/或受体展示在细胞或颗粒上，则细胞或颗粒的分布以及因此配体和/或受体的分布通常遵循泊松分布。然而，如果微反应器是液滴，则本领域技术人员熟悉的各种微流体技术允许不同于泊松分布的分布，特别是其中较高比例的液滴包含单个细胞/颗粒的分布。这些技术包括在使用惯性力并通过第二流(例如Dean流)介导将颗粒/细胞区室化成液滴之前对颗粒/细胞进行排序的方法(参见Edd等，(2008)Lab Chip 8:1262-1264；Kemna等，Lab Chip(2012)12:2881-2887，Lagus和Edd(2013)RSC Advances 3:20512-20522，Schoeman等，(2014)Electrophoresis 35:385-392，Schoeman等，(2018)ScientificReports 8:3714，US 2013/011210、US 2010/021984以及US 2011/0223314)，包括分离/分选含有单个细胞/颗粒或细胞/颗粒对的液滴以减少分析/测量的液滴数量的方法(参见Hu等，(2015)Lab Chip 15:3989-3993；Chung等，(2017)Lab Chip 17:3664-3671以及Shembekar等，(2018)Cell Reports 22:2206-2215)，包括迫使细胞/颗粒在狭窄的瓶颈中流动以减少包封相同样品的多个细胞/颗粒的机会的方法(参见Ramji等，(2014)Biomicrofluidics 8:034104)，包括当细胞/颗粒在喷嘴前通过时根据需要产生液滴的方法(参见Schoendube等，(2015)Biomicrofluidics 9:014117；Leibacher等，(2015)Biomicrofluidics 9:024109以及Yusof等，(2011)Lab.Chip 11:2447-2454)。

因此，在特定的实施方案中，将包含在水性组合物中的多种受体种类(特别是展示TCR的T细胞)与多种配体(特别是展示抗原的APC)共区室化到多个微反应器中(特别是多个微流体液滴中)，并且根据所使用的参数，共区室化到一个微反应器中(特别是共区室化到一个液滴中)的受体种类(特别是展示TCR的T细胞)的数目遵循概率分布，特别是泊松分布。这些参数可适于获得例如其中具有1或0受体(特别是展示T细胞的TCR)的大多数微反应器，从而使含有几种受体的区室的数目最小化。

用于共区室化受体种类(特别是展示TCR的T细胞)与配体种类(特别是展示抗原的APC)的参数可适于获得至少一些包含单一受体种类(特别是展示单一TCR的T细胞)的微反应器。

类似地，用于共区室化受体种类(特别是展示TCR的T细胞)与配体种类(特别是展示抗原的APC)的参数可适于获得至少一些包含单一配体种类(特别是展示单一抗原的APC)的微反应器。

在特别优选的实施方案中，产生微反应器组，每个包含至少一种配体种类，特别是至少一种T细胞抗原，更特别是展示至少一种T细胞抗原的APC，和至少一种受体种类，特别是至少一种TCR，更特别是展示至少一种TCR的T细胞。

然而，如技术人员所理解的，可以产生不包括任何受体种类的一些微反应器。

优选地，产生微反应器组，每个包含至少一种配体种类，特别是至少一种T细胞抗原，更特别是展示至少一种T细胞抗原的APC，和一种或少量受体种类，特别是一种或少量TCR，更特别是展示一种或少量TCR的T细胞。

“少量”在本文中表示小于10，例如10、9、8、7、6、5、4、3、2或1。

在另一个优选的实施方案中，产生微反应器组，每个包含一种或少量配体种类，特别是一种或少量T细胞抗原，更特别是展示一种或少量T细胞抗原的APC，和至少一种受体种类，特别是至少一种TCR，更特别是展示至少一种TCR的T细胞。

在另一个优选的实施方案中，产生微反应器组，每个包含一种或少量配体种类，特别是一种或少量T细胞抗原，更特别是展示一种或少量T细胞抗原的APC，和一种或少量受体种类，特别是一种或少量TCR，更特别是展示一种或少量TCR的T细胞。

在优选的实施方案中，产生微反应器组，每个包含一种配体种类，特别是一种T细胞抗原，更特别是展示一种T细胞抗原的APC，和一种受体种类，特别是一种TCR，更特别是展示一种TCR的T细胞。

在特别优选的实施方案中，产生微反应器组，每个包含多种配体种类，特别是多种T细胞抗原，更特别是一种展示多种T细胞抗原的APC或多种展示单一(或多种)T细胞抗原的APC，和一种受体种类，特别是一种TCR，更特别是展示一种TCR的T细胞。

因此，在一个实施方案中，通过以每秒1至20,000个微反应器的频率，例如每秒1至15,000个微反应器，每秒1至10,000个微反应器，每秒1至9000个微反应器，每秒1至8000个微反应器，每秒1至7000个微反应器，每秒1至6000个微反应器，每秒1至5000个微反应器，每秒1至4000个微反应器，每秒1至3000个微反应器，每秒1至2000个微反应器，每秒1至1000个微反应器，每秒1至800个微反应器，每秒1至700个微反应器，每秒1至600个微反应器，每秒1至500个微反应器，每秒1至400个微反应器，每秒1至300个微反应器，每秒1至200个微反应器，每秒1至100个微反应器，每秒1至80个微反应器，每秒1至70个微反应器，每秒1至50个微反应器，例如每秒10至300个微反应器，每秒50至300个微反应器，每秒100至300个微反应器，每秒150至300个微反应器，每秒150至250个微反应器，每秒175至250个微反应器，典型地，每秒1至1000个微反应器，优选地每秒175至250个微反应器，共区室化配体种类(特别是展示抗原的APC)和受体种类(特别是展示TCR的T细胞)形成微反应器组。

微反应器组，特别是微流体液滴组，可以通过任何合适的技术获得。特别地，所述微反应器组可以通过以下步骤形成：(a)提供第一流体源，所述第一流体包含如上定义的受体组的悬浮液，(b)提供第二流体源，所述第二流体包含如上定义的配体组的悬浮液；(c)提供载体流体，所述载体流体与所述第一流体和所述第二流体互不相溶，(d)将所述载体流体注射到芯片的主通道中，(e)通过将所述第二流体和所述第一流体注射到所述芯片的至少次要通道中在所述载体流体中产生微反应器(特别是液滴)流，所述次要通道在所述主通道中开口，每个产生的微反应器(特别是液滴)包含所述第一流体和所述第二流体的混合物，其中调整所述第一流体中的所述受体的浓度，所述第二流体中的所述配体的浓度，所述主通道和所述次要通道的几何形状，所述第一流体、所述第二流体和载体流体的注射参数，使得每个微反应器(特别是液滴)包含至少一种受体种类，优选仅单一受体种类，和至少一种配体种类，并且优选地呈现小于20nL的体积。

或者，微反应器组可通过以下步骤形成：(a)提供第一流体源，所述第一流体包含如上定义的预形成的受体和配体组的悬浮液，(b)任选地提供第二流体源，所述第二流体包含如上定义的用于检测的试剂，(c)提供载体流体，所述载体流体与第一流体和第二流体互不相溶。

在一个实施方案中，第一和第二流体源以接头的形式组织。

接头可以是例如T形接头、Y形接头、通道接头内通道(例如同轴布置，或包括内部通道和围绕所述内部通道的至少一部分的外部通道)、交叉(或“X”)接头、流动聚焦接头或用于产生液滴的任何其它合适的接头。例如，参见Link等于2004年4月9日提交的标题为“Formation and Control of Fluidic Species”、于2004年10月28日公开为WO2004/091763的国际专利申请No.PCT/US2004/010903，或Stone等于2003年6月30日提交的标题为“Method and Apparatus for Fluid Dispersion”、于2004年1月8日公开为WO2004/002627的国际专利申请No.PCT/US2003/020542，。

在一些实施方案中，可以配置和排列接头以产生基本上单分散的液滴。

受体种类/液滴的量也可称为负载率。例如，平均负载率可以小于约1个受体种类/液滴，小于约0.9个受体种类/液滴，小于约0.8个受体种类/液滴，小于约0.7个受体种类/液滴，小于约0.6个受体种类/液滴，小于约0.5个受体种类/液滴，小于约0.4个受体种类/液滴，小于约0.3个受体种类/液滴，小于约0.2个受体种类/液滴，小于约0.1个受体种类/液滴，小于约0.05个受体种类/液滴，小于约0.03个受体种类/液滴，小于约0.02个受体种类/液滴，或小于约0.01个受体种类/液滴。在一些情况下，可以选择较低的受体种类负载率，以最小化产生其中具有两种或更多种受体种类的液滴的可能性。因此，例如，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约97％，至少约98％或至少约99％的液滴可以不包含受体种类或仅包含一种受体种类。

在本发明的背景下，至少一些微反应器可以进一步包含逆转录酶和条形码引物，如下文进一步定义。

识别试验和分类

“识别”在本文中是指配体种类和受体种类之间的结合，优选诱导配体种类和/或受体种类的特定反应。

如本领域技术人员所理解的，配体种类和受体种类之间的识别所诱导的反应将取决于所考虑的特定配体和受体。例如，T细胞抗原与由T细胞展示的其相应的TCR之间的识别将诱导所述T细胞的活化。类似地，B细胞抗原与由B细胞展示的其相应的B细胞受体之间的识别将诱导所述B细胞的活化。

因此，用于测定配体种类和受体种类之间的识别的试验将取决于所考虑的特定配体和受体。

在特定的实施方案中，当受体组的受体种类被细胞展示时，通过测定所述微反应器中是否诱导细胞反应来分析每个微反应器中配体和受体之间的识别，当在所述微反应器中测定到诱导的细胞反应时，微反应器被分类为阳性(微反应器中配体种类和受体种类之间的识别)，并且当在所述微反应器中没有测定到诱导的细胞反应时，微反应器被分类为阴性(微反应器中配体种类和受体种类之间没有识别)。

更具体地，当受体组是展示TCR的T细胞且配体组是展示T细胞抗原的APC时，通过测定在所述微反应器中是否诱导T细胞活化来分析配体和受体之间的识别，当在所述微反应器中测定到诱导的T细胞活化时，微反应器被分类为阳性(微反应器中配体种类和受体种类之间的识别)，并且当在所述微反应器中没有测定到诱导的T细胞活化时，微反应器被分类为阴性(微反应器中配体种类和受体种类之间没有识别)。

“T细胞活化”在本文中是指由抗原(无论其化学性质如何)和TCR的识别诱导的一系列调节事件，其导致展示TCR的T细胞的T细胞免疫功能的活化、分化、增殖和获得。如本领域技术人员所熟知的，由TCR活化引发的信号级联包括肌醇三磷酸/Ca²⁺、二酰基甘油/蛋白激酶C、Ras/丝裂原活化蛋白激酶和PI 3-K途径。这些途径的组分将信息传递到细胞核中以活化编码多种分泌因子(例如IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-10、TNF-α和干扰素-γ)的基因，以活化编码多种细胞表面表达的活化标志物(例如CD137、CD40L和CD69)的基因，以及诱导与免疫系统的细胞组分的增殖、成熟和功能相关的胱天蛋白酶3/7途径。

在某些实施方案中，使配体种类组与受体种类组在微反应器中的接触发生短的孵育期，例如约0.001小时至约8小时。在某些实施方案中，接触步骤发生约0.001小时至约8小时、约0.001小时至约7小时、约0.001小时至约6小时、约0.001小时至约5小时、约0.001小时至约4小时、约0.001小时至约3小时、约0.001小时至约2小时、约0.001小时至约1小时、约0.01小时至约8小时、约0.01小时至约7小时、约0.01小时至约6小时、约0.01小时至约5小时、约0.01小时至约4小时、约0.01小时至约3小时、约0.01小时至约2小时、约0.01小时至约1小时、约0.1小时至约8小时、约0.1小时至约7小时、约0.1小时至约6小时、约0.1小时至约5小时、约0.1小时至约4小时、约0.1小时至约3小时、约0.1小时至约2小时、约0.1小时至约1小时、约1小时至约8小时、约1小时至约7小时、约1小时至约6小时、约1小时至约5小时、约1小时至约4小时、约1小时至约3小时、或约1小时至约2小时。

在某些实施方案中，使配体种类组与受体种类组在微反应器中的接触发生长的孵育期，例如至少约8小时、优选约8小时至约48小时。在某些实施方案中，接触步骤发生约8小时至约48小时、约8小时至约40小时、约8小时至约32小时、约8小时至约24小时、约8小时至约16小时、约16小时至约48小时、约16小时至约40小时、约16小时至约32小时、约16小时至约24小时、约24小时至约48小时、约24小时至约40小时、约24小时至约32小时、约32小时至约48小时、约32小时至约40小时、或约40小时至约48小时。

在某些实施方案中，当接触步骤是较短的孵育期(例如，约0.001小时至约8小时)，并且配体种类和受体种类以高亲和力结合时，产生的增强信号是T细胞活化的早期标志物或晚期标志物。如果配体种类和受体种类彼此具有高亲和力，则选择性或特异性结合可立即发生，这可导致T细胞的立即活化(例如，当配体种类是T细胞抗原且受体种类是T细胞受体时)。T细胞的立即活化可导致早期标志物的立即表达，其可包括但不限于CD69、CD107a和转铁蛋白受体。T细胞的立即活化也可导致持续表达的标志物的立即表达，其可包括但不限于IFNγ、CD25、CD154、TNF、IL-10、IL-2和IL-1b。T细胞的立即活化也可导致在较短的孵育时间内的晚期标志物的表达，其可包括但不限于CD137、HLA-DR、VLA1、PTA1、CD71、CD27、PD-1、TIM3、LAG3或CTLA4。

在某些实施方案中，当接触步骤是较长的孵育时间(例如，至少约8小时，优选约8至约48小时)，并且配体种类和受体种类以高亲和力结合时，产生的增强信号可以是T细胞活化的早期标志物或晚期标志物。由于孵育时间较长，T细胞的立即活化可导致早期或晚期标志物的产生，如上所述。此外，由于孵育时间较长，也可以产生持续表达的标志物。

在某些实施方案中，当接触步骤是较长的孵育时间(例如，至少约8小时，优选约8至约48小时)，并且配体种类和受体种类以低亲和力结合时，产生的增强信号是T细胞活化的早期标志物。具有较低的亲和力，可能需要较长的孵育时间来活化T细胞，并且因此可以观察到T细胞活化的早期或晚期标志物，这取决于孵育时间。通过延长具有低亲和力的配体种类和受体种类的接触步骤，产生的增强信号最终可以是T细胞活化的晚期标志物。

在某些实施方案中，T细胞活化的早期标志物可以是但不限于CD69、CD107a或转铁蛋白受体。

在某些实施方案中，持续表达的T细胞标志物可以是但不限于IFNγ、CD25、CD154、TNF、IL-10、IL-2和IL-1b。

在某些实施方案中，T细胞活化的晚期标志物可以是但不限于CD137、HLA-DR、VLA1、PTA1、CD71、CD27、PD-1、TIM3、LAG3或CTLA4。

在某些实施方案中，信号用抗CD69抗体、抗CD107a抗体、抗转铁蛋白受体抗体、抗CD137抗体、抗HLA-DR抗体、抗VLA1抗体、抗PTA1抗体、抗CD71抗体、抗CD27抗体、抗PD1抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体或抗CTLA4抗体进行检测。

测定T细胞活化的试验是本领域技术人员熟知的，并且其中包括CD69、CD137、CD134(OX40)或CD40L的上调的检测，细胞因子分泌的检测，胱天蛋白酶3/7途径的诱导的检测，以及检测穿孔素或颗粒酶，或TNF-α和干扰素-γ的分泌。

配体种类与受体种类的选择性和/或特异性结合可在使用荧光抗体的荧光测定中检测，其范围为约1nM至约100nM、约1nM至约75nM、约1nM至约50nM、约1nM至约25nM、约10nM至约100nM、约10nM至约75nM、约10nM至约50nM、约10nM至约25nM、约20nM至约100nM、约20nM至约75nM、约20nM至约50nM、约30nM至约100nM、约30nM至约75nM、约30nM至约50nM、约40nM至约100nM、约40nM至约75nM、约40nM至约50nM、约50nM至约100nM、约50nM至约75nM、约60nM至约100nM、约60nM至约75nM、约70nM至约100nM、约80nM至约100nM、或约90nM至约100nM。配体种类与受体种类的选择性结合可为约1nM、约5nM、约10nM、约15nM、约20nM、约25nM、约30nM、约35nM、约40nM、约45nM、约50nM、约55nM、约60nM、约65nM、约70nM、约75nM、约80nM、约85nM、约90nM、约95nM、或约100nM。

T细胞活化也可通过使用条形码化cDNA引物对T细胞mRNA进行测序来检测，以检测活化的T细胞特征性特有的mRNA表达模式。这些cDNA引物通常包含与同一微反应器中的配体特异性和受体特异性cDNA条形码引物相同的条形码序列，并且因此cDNA包含与配体和受体cDNA中包含的条形码序列相同的条形码序列，这允许通过测序鉴定阳性液滴(其包含活化的T细胞)中的配体和受体。cDNA引物还可以任选地包含独特的分子标识符(UMI)(Kivioja等，(2012).Nat.Methods,9,72-74；Islam等，(2014).Nat.Methods,11,163-166)，以促进mRNA表达的定量和标准化。读数的数目或任选地UMI的数目被用于定量和标准化mRNA表达。

类似地，当受体组是展示B细胞受体的B细胞且配体组是B细胞抗原时，通过测定在所述微反应器中是否诱导B细胞活化来分析配体和受体之间的识别，当在所述微反应器中测定到诱导的B细胞活化时，微反应器被分类为阳性(微反应器中配体种类和受体种类之间的识别)，并且当在所述微反应器中没有测定到诱导的B细胞活化时，微反应器被分类为阴性(微反应器中配体种类和受体种类之间没有识别)。

“B细胞活化”在本文中是指引起B细胞表现出活化的B细胞的表型的过程或活性，并且“活化的B细胞”描述了可以表现出以下表型中的一些的B细胞：B细胞活化可通过本领域已知的任何方法测量以鉴定抗体产生(>50倍，高达300倍的表达增加的诱导)和表面表达对分泌、抗原特异性、CD138/CD38的表达、高网状组织内质网或丰度、抗原介导的活化、T细胞依赖性活化、T细胞非依赖性活化(参见Blood.2003；102:592-600、Blood.2002；99:2905-2912和Blood.2010；116(18):3445-3455)等。

测定B细胞活化的试验是本领域技术人员熟知的。

B细胞活化也可通过使用条形码化cDNA引物对B细胞mRNA进行测序来检测，以检测活化的B细胞的特征性特有的mRNA表达模式。这些cDNA引物通常包含与同一微反应器中的配体特异性和受体特异性条形码化cDNA引物相同的条形码序列，并且因此cDNA包含与配体和受体cDNA中包含的条形码序列相同的条形码序列，这允许通过测序鉴定阳性液滴(其包含活化的B细胞)中的配体和受体。cDNA引物还可以任选地包含独特的分子标识符(UMI)，以促进mRNA表达的定量。读数的数目或任选地UMI的数目被用于定量mRNA表达。

在一个特定的实施方案中，将试验试剂加入到微反应器中。优选地，在共区室化步骤中所述试验试剂与所述配体种类和所述受体种类共区室化。

例如，当微反应器是微流体液滴时，所述试验试剂可以包含在用于形成所述液滴的第一流体和/或第二流体中。或者，所述试验试剂可以通过第三流体提供。

还可以通过本领域技术人员已知的多种方法将试剂添加至预形成的液滴中，包括被动液滴聚结(参见Mazutis等，(2009).Lab Chip,9(18),2665-2672；Mazutis&Griffiths(2012)Lab Chip,12:1800-1806)，由聚焦激光的局部加热驱动的液滴聚结(Baroud等(2007).Lab Chip 7:1029-1033)或使用电力(Chaber等，(2005)Electrophoresis,26:3706-3715；Ahn等，(2006)Appl.Phys.Lett.,88:264105；Link等，(2006)Angew.Chem.,Int.Ed.,45:2556-2560；Priest等，(2006)Appl.Phys.Lett.,89:134101)，或通过例如使用电力(皮注射(picoinjection))将液体注射至预形成的液滴中(Abate等，(2010)Proc.Nat.Acad.Sci.USA,107:19163-19166)。

如本领域技术人员所理解的，所述试验试剂将取决于所进行的特定识别试验。

在特定的实施方案中，所述试验试剂包括报告试剂，其能够通过如下定义的检测技术直接分选阳性微反应器。

基于在每个微反应器中进行的试验的结果，每个微反应器可被分类为阳性或阴性。

在特定的实施方案中，阳性微反应器可以与阴性微反应器分开，从而形成一组阳性微反应器。

所述分离可以通过本领域技术人员熟知的任何技术进行，这将取决于所使用的微反应器的类型。特别地，所述分离可以通过例如经由检测报告试剂分选微反应器，特别是分选微流体液滴来进行。所述分离也可以通过经由流式细胞术分选微反应器来进行。

在优选的实施方案中，当微反应器是液滴时，所述液滴将通过介电电泳(Ahn等，(2006)Appl.Phys.Lett.88:024104)或使用表面声波(Franke等，(2009)Lab Chip 9:2625-2627)在微流体装置中被分选，例如通过检测液滴中的荧光信号(Baret等，(2009)LabChip,9:1850-1858)或使用磁泳力或使用气动调节器器(参见，Xi等，(2017)Lab Chip 17:751-771)被触发。

或者，基于将微反应器分类为阳性或阴性，可以仅智能地建立阳性微反应器的子集，而不用物理地形成一组阳性微反应器。

任选的另外的试剂和微反应器的处理

在特定的实施方案中，所述微反应器，特别是所述阳性微反应器，包括另外的试剂。

另外的试剂通常包括逆转录酶(RT)、细胞裂解缓冲液，脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)和多种对编码配体或配体候选物的核酸序列具有特异性的条形码引物和对编码受体的核酸序列具有特异性的条形码引物，如下文定义。

当配体是如上定义的标记的配体时，对编码配体的核酸序列具有特异性的条形码引物可以是对编码所述配体的标签的核酸序列具有特异性的条形码引物。类似地，当受体是如上定义的标记受体时，对编码受体的核酸序列具有特异性的条形码引物可以是对编码所述受体的标签的核酸序列具有特异性的条形码引物。

因此，在特定的实施方案中，将另外的试剂加入到微反应器中，特别是加入到阳性微反应器中，所述另外的试剂至少包括逆转录酶(RT)、脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)和多种对编码配体(或配体的标签)的核酸序列具有特异性的条形码引物和对编码受体(或受体的标签)的核酸序列具有特异性的条形码引物、和任选的细胞裂解缓冲液，其中对编码配体(或配体的标签)的核酸序列具有特异性的条形码引物包含对编码配体(或配体的标签)的核酸序列具有特异性的引物序列和条形码序列或条形码序列组，其中对编码受体(或受体的标签)的核酸序列具有特异性的条形码引物包含对编码受体(或受体的标签)的核酸序列具有特异性的引物序列和条形码序列或条形码序列组，并且其中包含在微反应器中的条形码序列或条形码序列组可区分于包含在其它微反应器中的条形码序列或条形码序列组，但是包含在给定微反应器中的对编码配体(或配体的标签)的核酸序列和对编码受体(或受体的标签)的核酸序列具有特异性的条形码引物携带共同条形码序列或条形码序列组。

因此，在特定的实施方案中，将另外的试剂加入到微反应器中，特别是加入到阳性微反应器中，所述另外的试剂至少包括逆转录酶(RT)、脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)和多种引物，所述引物任选被条形码化，其将被用作模板转换反应的模板(如US5,962,272中所述)，其中编码配体(或配体的标签)的核酸序列的自由浮动特异性引物和对编码受体(或受体的标签)的核酸序列具有特异性的条形码引物将被加入，和/或任选地加入聚dT引物和/或随机引物，和任选地细胞裂解缓冲液，其中对模板转换反应具有特异性的引物(任选地被条形码化)包含本领域技术人员已知的引物序列，以与在通过cDNA的3’端的逆转录酶的RT过程中产生的非模板核苷酸(通常为三胞嘧啶)结合(参见，Zajac等(2013)PLoS ONE 8:e85270)，其中对非模板核苷酸(通常为三个胞嘧啶)具有特异性的引物(任选地被条形码化)包含对非模板核苷酸具有特异性的引物序列和条形码序列或条形码序列组，并且其中包含在微反应器中的条形码序列或条形码序列组可区分于包含在其它微反应器中的条形码序列或条形码序列组区，但是包含在给定微反应器中的对非模板核苷酸具有特异性的条形码引物携带共同条形码序列或条形码序列组。

当受体为TCR时，编码受体的核酸序列优选地为编码αT细胞受体、βT细胞受体、γT细胞受体或δT细胞受体的核酸序列。

当受体是展示抗体的B细胞时，编码受体的核酸优选地为编码抗体重链可变区或抗体轻链可变区的核酸序列。

当受体由几种多肽构成时，每种多肽由独立的基因编码，优选地加入几种不同的条形码引物，每种对编码所述多肽之一的核酸序列具有特异性。换句话说，当受体由n种多肽构成时，每种多肽由独立的基因编码，加入包含对编码所述受体的第一多肽的核酸序列具有特异性的引物序列的第一条形码引物，加入包含对编码所述受体的第二多肽的核酸序列具有特异性的引物序列的第二条形码引物，和加入包含对编码所述受体的第n多肽的核酸具有特异性的引物序列的第n条形码引物。

类似地，当配体由几种多肽构成时，每种多肽由独立的基因编码，优选地加入几种不同的条形码引物，每种对编码所述多肽之一的核酸序列具有特异性。换句话说，当配体由n种多肽构成时，每种多肽由独立的基因编码，加入包含对编码所述配体的第一多肽的核酸序列具有特异性的引物序列的第一条形码引物，加入包含对编码所述配体的第二多肽的核酸序列具有特异性的引物序列的第二条形码引物，和加入包含对编码所述配体的第n多肽的核酸具有特异性的引物序列的第n条形码引物。

在特定的实施方案中，通常当受体由两个独立的基因编码的两种多肽(特别是两条链)构成时，对编码受体的核酸序列具有特异性的条形码引物是两种不同的条形码引物，每种对编码构成受体的两种多肽(特别是链)之一的核酸序列具有特异性。

通常，当受体是TCR时，对编码TCR的核酸序列具有特异性的条形码引物是两种不同的条形码引物，其中一种条形码引物对编码αT细胞受体的核酸序列具有特异性，并且第二种条形码引物对编码βT细胞受体的核酸序列具有特异性。

或者，当受体是TCR时，对编码TCR的核酸序列具有特异性的条形码引物是两种不同的条形码引物，其中一种条形码引物对编码γT细胞受体的核酸序列具有特异性，并且第二种条形码引物对编码δT细胞受体的核酸序列具有特异性。

通常，当受体是BCR和/或抗体(如上文所定义)时，对编码BCR和/或抗体(如上文所定义)的核酸序列具有特异性的条形码引物是两种不同的条形码引物，其中一种条形码引物对编码BCR和/或抗体的λ链或κ链的核酸序列具有特异性，并且第二种条形码引物对编码BCR和/或抗体的γ链、δ链、ε链、α链或μ链的核酸序列具有特异性。

在本发明的背景下，“编码配体(或配体的标签)或受体(或受体的标签)的核酸序列”可以是如上文“定义”部分中所定义的任何类型的核酸。它尤其可以是DNA分子或RNA分子。在特定的实施方案中，编码配体(或配体的标签)或受体(或受体的标签)的所述核酸序列由编码所述配体(或配体的标签)或所述受体(或受体的标签)的mRNA序列、其片段或其互补序列构成或包含编码所述配体(或配体的标签)或所述受体(或受体的标签)的mRNA序列、其片段或其互补序列，或包含编码配体(或配体的标签)或受体(或受体的标签)的mRNA序列、其片段或其互补序列。在另一个特定的实施方案中，编码配体(或配体的标签)或受体(或受体的标签)的所述核酸序列由编码所述配体(或配体的标签)或所述受体(或受体的标签)的cDNA序列或其片段构成或包含编码所述配体(或配体的标签)或所述受体(或受体的标签)的cDNA序列或其片段。在另一个实施方案中，编码配体(或配体的标签)或受体(或受体的标签)的所述核酸序列由编码所述配体(或配体的标签)或所述受体(或受体的标签)的基因或其片段构成，或包含编码所述配体(或配体的标签)或所述受体(或受体的标签)的基因或其片段。

如上所定义，包含在微反应器中的条形码序列或条形码序列组可区分于包含在其它微反应器中的条形码序列或条形码序列组区的，但包含在给定微反应器中的对编码配体(或配体的标签)的核酸序列和对编码受体(或受体的标签)的核酸序列具有特异性的条形码引物携带共同条形码序列或条形码序列组。换句话说，每个微反应器包含独特类型的条形码序列或条形码序列组，任选地包含在几个条形码引物中，优选地与不同的引物序列结合，而特定的条形码序列或条形码序列组优选地从不包含在两个不同的微反应器中。

在一些实施方案中，所述条形码引物在颗粒上递送。特别地，在优选的实施方案中，所述条形码引物最初与颗粒结合。实际上，最初将所述条形码引物结合至颗粒上有利于仅将一种类型的条形码引物递送到每个微反应器中。

如本文所用，术语“颗粒”和“珠”可互换使用。

本发明上下文中的“颗粒”是指微粒。

在一个实施方案中，颗粒为水凝胶颗粒、聚合物颗粒或磁性颗粒。

颗粒可以具有不规则或规则的形状。例如，颗粒可以是球形、椭圆形或立方体。

“水凝胶颗粒”例如描述于标题为“Assay and other reactions involvingdroplets”的国际专利申请No.WO2008/109176中。水凝胶的实例包括但不限于琼脂糖、聚(乙二醇)二丙烯酸酯或丙烯酰胺基凝胶，例如双丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、链霉亲和素丙烯酰胺、聚-N-异丙基丙烯酰胺或聚N-异丙基聚丙烯酰胺或其混合物。在一个实例中，水凝胶颗粒包括丙烯酰胺、双丙烯酰胺和链霉亲和素丙烯酰胺。

例如，可以将单体的水溶液分散在微反应器(例如液滴)中，然后聚合例如以形成凝胶。另一个实例是水凝胶，例如可通过加入钙离子而凝胶化海藻酸。在一些情况下，可以例如通过与水相共流，通过扩散和/或通过油相共流，或通过两种不同液滴的聚结，将凝胶化引发剂(用于丙烯酰胺的过硫酸铵和TEMED，或用于海藻酸的Ca²⁺)加入到微反应器(例如液滴)中，例如如由link等于2006年2月23日提交的标题为“Electronic Control ofFluidic Species”、于2007年1月4日公开为美国专利申请公开第2007/000342号的美国专利申请系列第11/360,845号中所讨论的；或如由Ahn等于2007年1月24日提交的标题为“Fluidic Droplet Coalescence”的美国专利申请系列第11/698,298号中所讨论的。

在另一组实施方案中，颗粒可包含一种或多种聚合物，因此在本文中称为“聚合物颗粒”。示例性聚合物包括但不限于聚苯乙烯(PS)、聚己内酯(PCL)、聚异戊二烯(PIP)、聚(乳酸)、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯腈、聚酰亚胺、聚酰胺和/或这些和/或其它聚合物的混合物和/或共聚物。

此外，在一些实施方案中，颗粒可以是磁性的，因此被称为“磁性颗粒”，其可以允许颗粒的磁性操作。例如，颗粒可以包括铁或其它磁性材料。颗粒也可以被功能化，使得它们可以附着有其它分子，例如蛋白质、核酸或小分子。

在一些实施方案中，颗粒可以是荧光的。

在一些实施方案中，颗粒可以是功能化的，特别是有助于其鉴定和/或其分选，例如使用组氨酸、Flag、HA、链霉亲和素，acrydite DNA或生物素。

在一个实施方案中，颗粒包含链霉亲和素。链霉亲和素可以偶联至上文定义的颗粒表面或所述颗粒内部。

在一个实施方案中，水凝胶颗粒具有1pL至1000pLpL的尺寸，例如1pL至500pL、1pL至400pL、1pL至400pL、1pL至300pL、例如5pL至300pL、5pL至250pL、5pL至200pL、10pL至250pL、10pL至200pL、20pL至150pL、30pL至100pL、40pL至90pL、50pL至60pL、优选60pL至100pL。

本领域技术人员将理解，将条形码引物暂时结合至颗粒上允许提供具有大量条形码引物的颗粒。此外，最初将条形码引物结合至颗粒有利于将条形码引物引入每个微反应器中，特别是引入每个液滴中，其中条形码引物具有相同的条形码序列。

因此，在一个实施方案中，条形码引物与颗粒共价键合或非共价键合。

本文中“非共价键合”是指例如链霉亲和素-生物素键合。其它非共价键是本领域技术人员已知的，例如亲和素生物素键或his标签和镍键。

本文中的“共价键合”是指例如氨基键或acrydite亚磷酰胺键。

“链霉亲和素”通常指从细菌Streptomyces avidinii纯化的52.8kDa蛋白质。链霉亲和素同型四聚体对生物素具有非常高的亲和力，其解离常数(Kd)为≈10^-14mol/L，生物素与链霉亲和素的结合是自然界中已知的最强的非共价相互作用之一。

在优选的实施方案中，非共价键是链霉亲和素-生物素键。

链霉亲和素-生物素键是本领域技术人员已知的。因此，在一个实施方案中，如本文所定义的颗粒包含链霉亲和素。因此，在相同的实施方案中，如本文所定义的条形码引物包含生物素。换句话说，条形码引物被生物素功能化。

独立于用于连接条形码引物和颗粒的键的类型，条形码引物可进一步包含至少一个接头序列。

因此，在另一个实施方案中，条形码引物还包含至少一个接头序列，所述接头序列优选地包含在5’端。因此，在一个实施方案中，条形码引物从5’至3’包含接头序列、条形码序列和引物序列。

在一个实施方案中，“接头序列”是任选地将条形码引物键合至颗粒的序列。

本文中“任选地键合”是指一旦键合至颗粒的条形码引物被负载到微反应器或多个微反应器中，条形码引物就可能从颗粒释放，使得微反应器包含颗粒和条形码引物，所述条形码引物与所述颗粒分离的可能性。

优选地，接头序列是可切割接头序列，例如，其可以在施加合适的刺激如酶促和/或光切割时被切割。

“可切割接头”是本领域技术人员熟知的，并且被进一步描述于Leriche等，(2012)Bioorg.Med.Chem.20:571-582。它们可以包括但不限于TEV、胰蛋白酶、凝血酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶K、半胱天冬酶基质金属蛋白酶序列、磷酸二酯、磷脂、酯、半乳糖、二烷基二烷氧基硅烷、氰乙基、砜、乙二醇二琥珀酸酯、2-N-酰基硝基苯磺酰胺、a-硫代苯酯(a-thiophenylester)、不饱和二乙烯硫醚、活化后的磺酰胺、丙二醛(MDA)-吲哚衍生物、乙酰丙酰基酯、腙、酰基腙，烷基硫酯、二硫桥、偶氮化合物、2-硝基苄基衍生物、苯甲酰甲基酯、8-喹啉基苯磺酸、香豆素、磷酸三酯、双芳基腙、双马来酸二硫代丙酸衍生物、对甲氧基苄基衍生物、氨基甲酸叔丁酯类似物、二烷基或二芳基二烷氧基硅烷、原酸酯、缩酸、乌头基、腙、b-硫代丙酸酯、氨基磷酸酯、亚胺、三苯甲基、乙烯基醚、聚缩酮、2-(二苯基膦基)苯甲酸烷基酯衍生物、烯丙基酯、8-羟基喹啉酯、吡啶甲酸酯、邻位二醇和硒化合物。切割条件和试剂包括但不限于酶、亲核/碱性试剂、还原剂、光辐射、亲电/酸性试剂、有机金属和金属试剂，以及氧化剂。

在一个优选的实施方案中，可切割接头是可光切割的部分，例如光不稳定的化学基团，其具有1至30个碳原子的链，通常具有6至10个碳原子的链。

在进一步优选的实施方案中，可切割接头是含有特定限制性内切核酸酶的靶位点的双链DNA分子。

在特定的实施方案中，结合至颗粒的条形码引物在微反应器中从颗粒被释放，特别是在裂解细胞之前或之后，如下所述。

至少一些条形码引物的释放可以进一步发生在裂解细胞之后和逆转录与所述条形码引物杂交的释放的核酸之前，或裂解细胞之后和逆转录与所述条形码引物杂交的释放的核酸之后。

本领域技术人员将理解，根据为释放条形码引物所选择的时间点，术语“至少一些条形码引物”可以指例如由细胞或DNA/RNA双链体释放的杂交至核酸的至少一些条形码引物。

在一个实施方案中，至少一些条形码引物可以使用任何方式释放，例如酶、亲核/碱性试剂、还原剂、光致辐照、亲电/酸性试剂、有机金属和金属试剂和氧化剂。

在一个实施方案中，至少一些条形码引物使用酶促和/或光切割释放。例如，内切核酸酶可用于切割接头序列或任何其它序列以从颗粒释放至少一些条形码引物。

在另一个实施方案中，释放条形码引物是指破坏所述键，如链霉亲和素生物素。破坏链霉亲和素生物素键的方法是本领域技术人员已知的，且包括链霉亲和素的酶消化和/或链霉亲和素的变性。

在一个实施方案中，通过链霉亲和素的酶消化释放条形码引物。

优选地，每个颗粒携带可区分于其他珠携带的条形码序列或条形码序列组的条形码序列或条形码序列组。换句话说，每个颗粒携带独特的多数类型的条形码序列或条形码序列组，任选地包含在几个条形码引物中，优选地至少一些与不同的引物序列结合，而两个不同的颗粒优选地不携带相同的多数条形码序列或条形码序列组。

在优选的实施方案中，每个微反应器包含携带条形码引物的单个颗粒或携带条形码引物的少于10个颗粒，特别是少于9、8、7、6、5、4、3或2个颗粒。在特别优选的实施方案中，每个微反应器携带携带条形码引物的单个颗粒。

本发明的背景下，“逆转录酶(RT)”是在称为逆转录的过程中用于从RNA模板产生互补DNA(cDNA)的酶。

在一个实施方案中，逆转录酶选自下组：Superscriptase I、Superscriptase II、Superscriptase III、Superscriptase IV、Murine Leukemia RT、SmartScribe RT、MaximaH RT或MultiScribe RT。

在一个实施方案中，逆转录酶的浓度为1至50U/μL，优选5至25U/μL，例如12.5U/μL。

在本发明的背景下，“细胞裂解缓冲液”是能够裂解细胞的组合物，优选地不破坏微反应器，特别是液滴。

优选地，细胞裂解缓冲液与RT活性和/或与用于识别试验的试剂相容。

在一个实施方案中，裂解缓冲液包含选自下组的酶：溶菌酶、溶葡萄球菌素、消解酶、变溶菌素、聚糖酶(glycanases)、蛋白酶和甘露糖。

在一个优选的实施方案中，裂解缓冲液包含氯化镁、洗涤剂、缓冲溶液和RNase抑制剂。

在一个实施方案中，氯化镁以1mM至20mM的浓度使用。

在一个实施方案中，洗涤剂选自下组：Triton-X-100、NP-40、Nonidet P40和吐温-20和IGEPAL CA 630。

在一个实施方案中，洗涤剂的浓度为0.1％至10％。

缓冲液的非限制性实例包括Tris-HCl、Hepes-KOH、Pipes-NaOH、马来酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、甲酸、乳酸、丁二酸、乙酸、新戊酸(三甲基乙酸)、吡啶、哌嗪、吡啶甲酸、L-组氨酸、MES、Bis-tris、双三丙烷、ADA、ACES、MOPSO、PIPES、咪唑、MOPS、BES、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、TEA(三乙醇胺)、N-乙基吗啉、POPSO、EPPS、HEPPS、HEPPSO、Tris、tricine、甘氨酰甘氨酸、N-二甘氨酸、TAPS、吗啉、N-甲基二乙醇胺、AMPD(2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇)、二乙醇胺、AMPSO、硼酸、CHES、甘氨酸、CAPSO、乙醇胺、AMP(2-氨基-2-甲基-1-丙醇)、哌嗪、CAPS、1,3-二氨基丙烷、CABS、或哌啶(还参见www.reachdevices.com/Protein/Biological Buffers.html)。

RNase抑制剂的非限制性实例可以包括RNase OUT、IN、SuperIN Rnase、以及靶向广泛的RNase(例如A、B、C、1和T1)的那些抑制剂。

在一个实例中，裂解缓冲液通常是0.36％Igepal CA 630、50mM Tris-HCl pH8。

在特定的实施方案中，通过从贮液器中注射，例如使用电力皮(皮注射(picoinjection))，将所述另外的试剂加入到微反应器中，特别是加入到微流体液滴中(Abate等，(2010)Proc.Nat.Acad.Sci.USA107:19163-19166)。

在另一个特定的实施方案中，通过与包含所述另外的试剂但不包含任何配体或受体的第二微反应器(特别是第二微流体液体)聚结，将所述另外的试剂加入到微反应器中，特别是加入到微流体液滴中。液滴可通过本领域技术人员已知的各种方法聚结，包括被动液滴聚结(参见Mazutis等，(2009)Lab on a Chip,9(18):2665-2672；Mazutis等，(2012)Lab Chip,12:1800-1806)，通过由聚焦激光的局部加热驱动的液滴聚结(Baroud等，(2007)Lab Chip 7:1029-1033)或使用电力(Chaber等，(2005)Electrophoresis 26:3706-3715；Ahn等，(2006)Appl.Phys.Lett.,88:264105；Link等，(2006)Angew.Chem.,Int.Ed.,45:2556-2560；Priest等，(2006)Appl.Phys.Lett.89:134101)或使用磁泳力或使用气动调节器(参见Xi等，(2017)Lab Chip 17:751-771)。

所述第二微反应器，特别是所述第二微流体液滴，可以通过与上述公开的用于包含配体和受体的微反应器相同的技术制备。

“聚结”在本文中是指两个或更多个液滴或颗粒在接触期间合并以形成单个子液滴或颗粒的过程。

优选地，将所述另外的试剂选择性地加入到阳性微反应器中，特别是在阳性微反应器与阴性微反应器的分离步骤之后。

在特定的实施方案中，在每个微反应器中，特别是在每个阳性微反应器中，其中加入了上述另外的试剂，条形码化cDNA通过以下方法制备，(a)裂解表达或展示受体的细胞和表达或展示配体的细胞，以从细胞中释放mRNA，(b)在至少一些微反应器中，将至少一些编码受体(或受体的标签)的释放的mRNA与编码受体(或受体的标签)的核酸序列特异性引物杂交，任选地进行条形码化，和将至少一些编码配体(或配体的标签)的释放的mRNA与编码配体(或配体的标签)的核酸序列特异性条形码引物杂交，和(c)逆转录与引物杂交的释放的mRNA，任选地进行条形码化，由此获得条形码化cDNA。

如本领域技术人员所理解的，当配体的标签或受体的标签是条形码序列时，不需要制备如上详述的条形码化cDNA，因为配体或受体的nt序列允许其自身的识别。

本文中的“条形码化”是指将遗传序列(如上文进一步定义的所谓的条形码序列)添加到允许将所述条形码化核酸与具有另一添加的遗传序列(即另一独特条形码序列)的核酸区分开的核酸中。

在本发明的背景下，术语“细胞裂解”可以通过酶促、物理和/或化学手段或其任何组合，特别是酶促、物理和/或化学手段来实现。也可以使用其它细胞破碎方法。

因此，在一个实施方案中，使用酶促、物理和/或化学细胞裂解来裂解细胞。

去除细胞壁的“酶促方法”在本领域中是公认的。酶通常是可商购的，并且在大多数情况下最初分离自生物来源。常用的酶包括溶菌酶、溶葡萄球菌素、消解酶、变溶菌素、聚糖酶、蛋白酶和甘露糖。

如本领域技术人员已知的，“化学细胞裂解”是使用例如洗涤剂的化学品实现的，其通过破坏脂质-脂质、脂质-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用来破坏细胞周围的脂质屏障。用于细胞裂解的理想洗涤剂取决于细胞类型和来源。非离子和两性离子洗涤剂是更温和的洗涤剂。Triton X系列非离子洗涤剂、IGEPAL CA 630非离子洗涤剂和3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基胺基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、两性离子洗涤剂通常用于这些目的。相反，离子型洗涤剂是强增溶剂，并且倾向于使蛋白质变性，从而破坏蛋白质活性和功能。SDS，一种与蛋白质结合并使其变性的离子型洗涤剂，在本领域中广泛用于破坏细胞。

“物理细胞裂解”是指使用超声处理、热冲击(高于40℃，低于10℃)、电穿孔或激光诱导空化。

在一个实例中，细胞在冰上裂解。

在一个优选的实施方案中，在本发明的背景下，细胞裂解不破坏或毁坏微反应器，特别是液滴。

如本文所述，术语“杂交”是指条形码引物中存在的引物序列与释放的核酸的互补核酸序列退火的现象。因此，如本领域技术人员已知的，使用的温度取决于所用的引物序列和/或聚合酶。

上述定义的逆转录步骤是指在至少一些微反应器中使用引物序列逆转录与所述条形码引物杂交的释放的核酸。使用包含在至少一些微反应器中的逆转录酶(RT)进行逆转录。

“逆转录”或“RT反应”是通过使用总细胞RNA或poly(A)RNA、逆转录酶、引物、dNTP和RNase抑制剂将单链RNA逆转录为单链互补DNA(cDNA)的过程。本领域技术人员应当理解，逆转录产物是包含与其模板RNA杂交的单链cDNA的RNA/DNA双链体。如将进一步理解的，所述RNA/DNA双链体进一步连接至包含用于逆转录的引物序列的条形码引物。

“模板转换”是指最初在2001年描述的技术，通常称为“SMART”(在RNA转录物的5’端的转换机制)技术(Takara Bio USA,Inc)。该技术已经显示出产生全长cDNA文库的前景，甚至从单细胞来源的RNA样品产生(Zhu等，(2001)Biotechniques 30:892-897)。该策略依赖于莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶的固有性质和独特的模板转换寡核苷酸(TSoligo或TS0)的使用。在第一链合成期间，当到达RNA模板的5’端时，MMLV逆转录酶的末端转移酶活性将一些另外的核苷酸(大部分是脱氧胞苷)添加到新合成的cDNA链的3’端。这些碱基起TS寡核苷酸锚定位点的作用。在TS oligo和附加的脱氧胞苷片段之间碱基配对后，逆转录酶将模板链从细胞RNA“转换”至TS oligo，并继续复制至TS oligo的5’端。通过这样做，所产生的cDNA含有转录物的完整5’端，并且将选择的通用序列添加到逆转录产物中。与用寡dT引物标记的cDNA 3’端一起，该方法使得以完全不依赖于序列的方式有效扩增整个全长转录物库成为可能(Shapiro等，(2013)Nat.Rev.Genet.14:618-630).

因此，本领域技术人员应理解，在逆转录核酸后，微反应器还包含cDNA。

因此，在一个实施方案中，至少一些微反应器进一步包含通过逆转录来自所述微反应器中包含的细胞的核酸产生的cDNA。

在一个实施方案中，所述cDNA指单链互补DNA。

在另一个实施方案中，所述cDNA包含在RNA/DNA双链体中。

在一个实施方案中，RNA/DNA双链体是指已被逆转录并与微反应器中所含的至少一种引物的引物序列(其任选地被条形码化)杂交的RNA。

如本领域技术人员所理解的，在一个实施方案中，RNA/DNA双链体与引物连接，所述引物任选地被条形码化，其包含与核酸(优选mRNA)杂交并用于逆转录的引物序列。

在一个实例中，杂交和逆转录通过在通常以例如550rpm混合微反应器期间，在55℃或50℃下孵育微反应器例如1小时或2小时来进行。

配体种类和受体种类的鉴定

每个微反应器，特别是每个阳性微反应器中所包含的配体种类和受体种类的鉴定可通过本领域技术人员熟知的任何技术进行。特别地，每个微反应器，特别是每个阳性微反应器中所包含的配体种类和受体种类的鉴定可以通过测序，特别是通过测序DNA、如上详述获得的条形码化cDNA或标签来进行。

在一个实施方案中，回收通过如上定义的逆转录产生的条形码化cDNA并进一步用于鉴定，通常通过随后的扩增和测序文库制备。

因此，在一个实施方案中，本发明的方法还包括回收在至少一些微反应器中，优选在阳性微反应器中通过逆转录产生的细胞cDNA。

本文的“回收”是指从所述多个微反应器中分离在至少一些微反应器中通过逆转录产生的条形码化cDNA。

在一个实施方案中，本文的回收是指收集包含由逆转录产生的条形码化cDNA的微反应器，或收集包含在含有所述条形码化cDNA所述微反应器中的的水性组合物，以及分离包含在水性组合物中的条形码化cDNA。

在特定的实施方案中，本文的回收是指收集包含由逆转录产生的条形码化cDNA的微流体液滴，破碎微流体液滴和将包含在水性组合物中的条形码化cDNA与所述微流体液滴的油相分离。

从微流体液滴中分离核酸(特别是cDNA)的方法是本领域技术人员已知的，并且包括例如，收集微流体液滴并通过例如施加电场(电聚结)或通过添加化学破乳剂(例如在氟化载体油中的液滴的情况下为全氟辛醇)来破碎乳状液。在一个实例中，通常将破碎的乳状液例如在4℃下以10,000g离心10分钟，并且回收水相中包含条形码化cDNA的上清液。

在一个实施方案中，方法还包括从微反应器的水性组合物中去除未掺入的条形码引物的步骤。在一个优选的实施方案中，从至少一些微反应器的水性组合物中去除未掺入的条形码引物的步骤发生在回收如上定义的通过逆转录产生的条形码化cDNA的步骤之后。

优选地，去除未掺入的条形码引物的步骤在扩增步骤和/或下文定义的测序步骤之前。

在一个实施方案中，去除未掺入的条形码引物包括使至少一些微反应器的水性组合物与纯化底物接触，其中纯化底物去除未掺入的条形码引物。在一个实施方案中，纯化底物包含珠或颗粒，其任选地形成柱。在另一个实例中，使用例如丙烯酰胺或琼脂糖凝胶通过尺寸选择去除未掺入的条形码引物。

在一个实施方案中，去除未掺入的条形码引物的步骤包括使至少一些微反应器的水性组合物与核酸外切酶如核酸外切酶Exo1接触，以降解至少一些微反应器的水性组合物中的未掺入的条形码引物。

在该步骤的某些实施方案中，核酸外切酶从包含cDNA的水性组合物中降解单链核酸序列。

本领域技术人员将理解，逆转录后获得的条形码化cDNA通常以RNA/DNA复合体的形式存在，因此被保护免受所述核酸外切酶的影响。

在一个实施方案中，条形码化cDNA包含一个或多个修饰的核苷酸或核苷酸类似物，例如用于促进条形码化cDNA序列或分子的纯化。

例如，核苷酸可用作硫代磷酸酯衍生物(用硫原子取代非桥磷酰基氧原子)，其增加了对核酸酶消化的抗性。2’-甲氧乙基(MOE)修饰(例如由ISIS Pharmaceuticals商业化的修饰主链)也是有效的。

修饰的核苷酸的其他实例包括在糖的2’位具有取代的核苷酸衍生物，特别是具有以下化学修饰的核苷酸衍生物：O-甲基基团(2’-O-Me)取代、2-甲氧基乙基基团(2’-O-MOE)取代、氟基基团(2’-氟代)取代、氯基基团(2’-Cl)取代、溴基基团(2’-Br)取代、氰基基团(2’-CN)取代、三氟甲基基团(2’-CF₃)取代、OCF₃基团(2’-OCF₃)取代、OCN基团(2’-OCN)取代、O-烷基基团(2’-O-烷基)取代、S-烷基基团(2’-S-烷基)取代、N-烷基基团(2’-N-烷基)取代、O-烯基基团(2’-O-烯基)取代、S-烯基基团(2’-S-烯基)取代、N-烯基基团(2’-N-烯基)取代、SOCH₃基团(2’-SOCH₃)取代、SO₂CH₃基团(2’-SO₂CH₃)取代、ONO₂基团(2’-ONO₂)取代、NO₂基团(2’-NO₂)取代、N₃基团(2’-N3)取代和/或NH₂基团(2’-NH₂)取代。修饰的核苷酸的其它实例包括生物素标记的核苷酸。

修饰的核苷酸的其它实例包括其中核糖部分用于产生锁核酸(LNA)的核苷酸，其中在核糖的2’氧和4’碳之间形成共价桥，将其固定在3’-endo构型中。

核苷酸类似物的其它实例包括脱氧肌苷。

核苷酸类似物的其它实例包括生物素化的、荧光标记的核苷酸。例如，生物素-11-dCTP可用作逆转录酶的底物以在聚合期间将生物素掺入cDNA，从而允许使用链霉亲和素或亲和素进行亲和纯化。

在一个实施方案中，进一步用RNase A和/或RNase H处理条形码化cDNA。

“RNase A”是在C和U残基处特异性降解单链RNA的内切核糖核酸酶。在一个实施方案中，RNase A的浓度为10至1000μg/μL，优选50至200μg/μL，例如100μg/μL。

“RNase H”是通过水解机制催化RNA切割的非特异性内切酶家族。RNase H核糖核酸酶活性可切割DNA/RNA双链体底物中RNA的3’-O-P键以产生3’-羟基和5’-磷酸封端的产物。在一个实施方案中，RNase H的浓度为10至1000μg/μL，优选50至200μg/μL，例如100μg/μL。

在一个实施方案中，进一步用蛋白酶K处理条形码化cDNA。“蛋白酶K”是广谱丝氨酸蛋白酶并且消化蛋白质，优先在疏水氨基酸之后。在一个实施方案中，蛋白酶K的浓度为0.1至5mg/mL，优选0.1至1mg/mL，例如0.8mg/mL。

在一个实施方案中，对逆转录后获得的条形码化cDNA进行测序以允许鉴定包含在同一微反应器中的受体和配体。

在一个实施方案中，对条形码化cDNA测序的步骤可以包括对测序文库进行下一代测序(NGS)方案。可以使用任何类型的NGS方案，例如MiSeq Systems

HiSeqSystems

NextSeq System

NovaSeq Systems

IonTorrent system(ThermoFisher)、IonProton system(ThermoFisher)或PacificBiosciences或Nanopore生产的测序系统。

在某些实施方案中，NGS方案包括在试剂盒的每个流动池负载1pM至20pM，特别是1.5pM至20pM的量的测序文库。

在一个实施方案中，NGS测序方案进一步包括向测序文库的量或向试剂盒的流动池添加5-60％PhiX的步骤。

在一个实施方案中，在测序之前，进一步扩增条形码化cDNA。

在一个实施方案中，扩增步骤通过聚合酶链式反应(PCR)和/或线性扩增进行。

在一个实施方案中，线性扩增在PCR反应之前进行。

在一个实施方案中，线性扩增是体外转录。

在一个实施方案中，线性扩增是恒温扩增。

在一个实施方案中，所述扩增步骤在去除未掺入的条形码引物后进行。在一个实施方案中，所述扩增步骤在本文上述定义的测序步骤之前进行。

在一个实施方案中，使用qPCR对逆转录后产生的条形码化cDNA进行定量。

在一个实施方案中，在扩增期间或通过衔接子的连接添加测序所需的特异性序列，从而产生测序文库。

本领域技术人员可以理解，由于来自特定微反应器的条形码化cDNA携带相同的特定多数条形码序列或条形码序列组，其与其它微反应器中包含的多数条形码序列或条形码序列组不同，可以确定哪些已鉴定的配体种类包含在同一微反应器中，特别是在阳性微反应器中，作为特定的鉴定的配体受体。

实施方案

将本发明还提供以下非限制性实施方案。

实施方案1是一种鉴定配体种类和受体种类的同源对的方法，所述方法包括：

a.提供配体种类组，其中每种配体种类被呈现至少一次；

b.提供受体种类组，其中每种受体种类被呈现至少一次；

c.使所述配体种类组与所述受体种类组在微反应器中接触，其中在配体种类与受体种类选择性结合后产生增强信号；

d.通过所述信号的产生检测配体种类和受体种类的同源对；以及

e.鉴定配体种类和受体种类的所述同源对。

实施方案2是实施方案1的方法，其中每种配体种类包含条形码序列。

实施方案3是实施方案1或2的方法，其中每种受体种类包含条形码序列。

实施方案4是实施方案1-3中任一项的方法，其中每种配体种类由细胞表达或在珠表面上展示，或者在无细胞提取物或溶液中表达或存在。

实施方案5是实施方案4的方法，其中所述配体种类由抗原呈递细胞表达或展示在抗原呈递细胞的表面上。

实施方案6是实施方案5的方法，其中所述抗原呈递细胞选自巨噬细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞、B细胞、单核细胞衍生的树突细胞或表达MHC I类或II类分子的另一种细胞。

实施方案7是实施方案1-6中任一项的方法，其中每种受体种类由细胞表达或在珠表面上展示，或者在无细胞提取物或溶液中表达或存在。

实施方案8是实施方案1-7中任一项的方法，其中所述微反应器选自水性液滴、微胶囊、微珠、微流体芯片的隔室、或孔。

实施方案9是实施方案1-8中任一项的方法，其中所述信号选自细胞、配体或受体中任何一个的形态学变化；荧光信号增强；使用笼形化合物或通过猝灭反应修饰的荧光信号；光吸收；可见的结构修饰/创建；或其信号的组合。

实施方案10是实施方案2-9中任一项的方法，其中鉴定配体种类和受体种类的同源对包括扩增配体种类和/或受体种类，其中对所扩增的配体种类和受体种类中的至少一种进行测序以用于鉴定。

实施方案11是实施方案1-10中任一项的方法，其中所述配体种类组选自T细胞抗原、B细胞抗原、病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原、新抗原、肿瘤相关抗原(TAA)、肿瘤特异性抗原、免疫检查点分子、细胞因子、碳水化合物、免疫球蛋白超家族成员、选择素、趋化因子、激素、生长因子、G蛋白偶联受体配体或酶底物。

实施方案12是实施方案1-11中任一项的方法，其中所述受体种类组选自T细胞受体、B细胞受体、免疫检查点受体、细胞因子受体、选择素、整联蛋白、免疫球蛋白超家族成员、钙粘蛋白、趋化因子受体、激素受体、生长因子受体、G蛋白偶联受体(GPCR)或酶。

实施方案13是实施方案1-12中任一项的方法，其中所述配体种类是T细胞抗原并且所述受体种类是T细胞受体，并且在所述T细胞抗原与所述T细胞受体选择性结合后，产生所述增强信号，其中产生的所述增强信号是T细胞活化的结果。

实施方案14是实施方案1-12中任一项的方法，其中所述配体种类是病毒抗原并且所述受体种类是T细胞受体，并且在所述病毒抗原与所述T细胞受体选择性结合后，产生所述增强信号，其中产生的所述增强信号是T细胞活化的结果。

实施方案15是实施方案13或14的方法，其中使所述配体种类组与所述受体种类组在微反应器中接触约0.001小时至约8小时。

实施方案16是实施方案13或14的方法，其中使所述配体种类组与所述受体种类组在微反应器中接触至少约8小时。

实施方案17是实施方案15或16的方法，其中所述配体和受体种类以高亲和力结合，并且产生的所述增强信号是T细胞活化的早期标志物或晚期标志物。

实施方案18是实施方案16的方法，其中所述配体种类和所述受体种类以低亲和力结合，并且产生的所述增强信号是T细胞活化的早期标志物或晚期标志物。

实施方案19是实施方案17或18的方法，其中所述T细胞活化的早期标志物选自CD69、CD107a或转铁蛋白受体。

实施方案20是实施方案17或18的方法，其中所述T细胞活化的晚期标志物选自CD137、HLA-DR、VLA1、PTA1、CD71、CD27、PD-1、TIM3、LAG3或CTLA4。

实施方案21是实施方案19或20的方法，其中所述增强信号用抗CD69抗体、抗CD107a抗体、抗转铁蛋白受体抗体、抗CD137抗体、抗HLA-DR抗体、抗VLA1抗体、抗PTA1抗体、抗CD71抗体、抗CD27抗体、抗PD1抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体或抗CTLA4抗体进行检测。

实施方案22是实施方案1-12中任一项的方法，其中所述配体种类是B细胞抗原并且所述受体种类是B细胞受体，并且在所述B细胞抗原与所述B细胞受体选择性结合后，产生所述增强信号。

实施方案23是实施方案22的方法，其中所述信号用抗CD138抗体、抗CD19抗体、抗CD45R抗体、抗CD45抗体、荧光报告基因表达的活化或荧光报告基因表达的抑制进行检测。

实施例

本发明的以下实施例用于进一步说明本发明的性质。应当理解，以下实施例不限制本发明，并且本发明的范围由所附权利要求书确定。

材料和方法

细胞制备：用补充有1％青霉素、链霉素、1％丙酮酸钠和非必需氨基酸(GIBCO)的5％人血清在X体内培养T细胞。对细胞进行计数，用PBS洗涤，并在4℃下以450g自旋向下5分钟。将细胞沉淀以2M/mL重新悬浮于PBS中，并且在37℃下用已经溶解于5μM的DMSO中的细胞追踪(除了1μM的细胞追踪红色)染色20分钟。加入含有蛋白质的缓冲液(完全培养基)至少5次以上，并在室温下孵育5分钟以终止反应。将细胞在4℃以450g自旋向下3分钟，并通过用

冲洗液(#130-091-222)以1:20稀释的

储备溶液(#130-091-376)，重新悬浮于MACS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液(PBS)、pH 7.2、0.5％牛血白蛋白(BSA)和2mM EDTA中。

T细胞纯化：按照制造商(Miltenyi；Bergisch Gladbach，德国)的建议用阴性选择纯化T细胞。将PBMC以250M/mL重新悬浮于MAC缓冲液中。以1/5稀释度加入靶向另一子集的抗体混合物并在4℃下孵育5分钟。用MAC缓冲液将细胞浓度调节至125M/ml，并以1/5稀释度加入微珠混合物(Microbead cocktail)。在MACS分离器的磁场中使用LS柱提取T细胞。

用肽负载的K562：计数K562细胞，用PBS洗涤，并且以450g自旋向下5分钟。将细胞沉淀以2M/mL重新悬浮于PBS中并用细胞追踪以推荐浓度染色。室温下用X vivo5％人血清终止染色反应5分钟。然后洗涤细胞并用5％人血清以1M/mL重新悬浮于X vivo中。然后将肽以10μg/mL加入到细胞悬浮液中，并在37℃、5％CO₂下孵育90分钟，以允许肽由HLA0201呈递。

mRNA转染：每2-3天更换用于K562细胞的培养基。K562细胞必须处于生长阶段和在第10代以下(在达到1M:ml后的传代细胞)用于mRNA转染。K562细胞以1×10⁵细胞/ml接种，并且在以密度为3×10⁵细胞/ml进行Nucleofection^TM前将细胞培养2天。上传实验参数文件后，选择适当的Nucleofector^TM程序(FF-120)。通过用所需体积的推荐培养基填充适当数目的孔并在加湿的37℃、5％CO₂培养箱中预孵育/平衡来制备细胞培养板。计数K562细胞，并且所需细胞数目在室温下以90g离心10分钟。完全去除上清液，并将细胞以适当的浓度(10M/ml)重新悬浮于4D Nucleofector溶液中。将1M的细胞与所需量的mRNA底物(10μg)混合，并转移到Nucleocuvette^TM容器中，这些容器盖上盖子并放入4D-Nucleofector^TMX Unit的保持器中。在用脉冲转染后，将Nucleocuvette^TM容器小心地从保持器中取出并在室温下孵育10分钟。然后将细胞重新悬浮于预热的培养基中(500μl/1M的细胞)，并且通过上下吸移两至三次将细胞轻轻混合并铺板。然后将铺板的细胞在加湿的37℃、5％CO₂培养箱中孵育直至分析。

用于液滴内IFN-γ的细胞制备：对于效应细胞，用细胞追踪黄色标记T细胞，然后用靶向CD45和IFNγ的双特异性抗体以1/10稀释度在冷却的培养基中在4℃和10M/mL的细胞浓度下标记5分钟。然后洗涤T细胞并重新悬浮于包含X体内培养基(其具有补充有0.1％Pluronic F68、23.6％的Nycodenz、6％DNA标志物(Nucgreen)的5％人血清)的共流中。

对于肽负载，用5μM的指定细胞追标记K562细胞，然后不负载或负载10μM的肽。然后通过加入冷的缓冲液洗涤细胞，并将细胞在4℃下自旋向下10分钟，然后重新悬浮在共流中，如上所述。对于mRNA转染的K562细胞，细胞未被标志物，因为转染的mRNA编码荧光报告基因。

将检测抗体加入到细胞悬浮液中。最后，将这些细胞分别共流入微流体装置中，并且，由此产生100皮升液滴，然后在37℃、5％CO₂下孵育过夜。

液滴产生

水相I：制备用于液滴中区室化的细胞。如所述在4℃下制备细胞悬浮液用于液滴中区室化，并将细胞重新悬浮浮于补充有0.1％Pluronic F68(LifeTechnologies；Carlsbad,CA)、25mM HEPES pH 7.4(LifeTechnologies)、1％Pen/Strep(ThermoFisher；Waltham,MA)、23.6％的Nycodenz(Fisher Scientifique)和6％的DNA标志物(Nucgreen-Thermofisher)的X体内，以便在液滴中的T细胞活化试验中，对于K562和T细胞分别实现～0.9和0.45的λ(每液滴的平均细胞数目)。

水相II：制备用于液滴中区室化的生物试验试剂和报告细胞。对于同源抗原，将用细胞追踪染色并负载肽的K562细胞重新悬浮于含有Fc块(1/5稀释)(Miltenyi)和2X指定浓度的抗CD137抗体(分别产生指定的最终液滴浓度)或1/25稀释度的IFN-γ的工作缓冲液中。用图中所示的细胞追踪预标记在细胞表面呈递肽的K562细胞，并如上定义将其重新悬浮于含有5％人血清并补充有23.6％(体积/体积)Nycodenz的X-体内的培养基中，以在基于细胞的试验中对于报告细胞实现～0.9的λ(每液滴的平均细胞数目)。将用所示的细胞追踪预标记的T细胞以λ～0.45重新悬浮于上述相同培养基中，其具有所需浓度的液滴代码DY754。

微流体芯片：使用单独的微流体芯片。装置1用于在液滴中区室化单个细胞与生物试验试剂，或在液滴中区室化T细胞与呈递抗原的K562细胞和生物试验试剂；装置2用于通过荧光活化介电电泳对液滴进行分选；装置3产生水凝胶珠，并且装置4(CellCap)用单个水凝胶珠区室化单个分类的细胞。在聚二甲基硅氧烷(PDMS)(Sylgard)中通过软刻蚀制造所有芯片。根据设计，使用一层或两层SU-8光致抗蚀剂(MicroChem；Bear,DE)制作母版。装置1和2的光致抗蚀剂层的列表深度为40μm±1μm，并且装置3的光致抗蚀剂层的列表深度为55μm±1μm。对于装置4，第一层(70-75μm深)用于水凝胶珠入口，并且第二层(130-145μm深)用于细胞入口、逆转录酶入口和出口。通过将51In 32.5Bi 16.5Sn合金(Indium Corporationof America)熔化到电极通道中来制备电极。

液滴生产、收集和孵育：在具有15μm宽、40μm深和10μm长的喷嘴的微流体芯片上使用流体动力学流动聚焦以滴落模式使水相I和II共流并分成液滴。连续相包含NovecHFE7500氟化油(3M；Saint Paul，MN)中的2-3％(wt/wt)008-含氟表面活性剂(RANBiotechnologies；Beverly,MA)。调节流速以产生80pl±8pl的单分散液滴(用于使用膜结合抗原的基于细胞的试验)。产生后不久，将液滴收集到装有5ml的含有0.1％(wt/wt)008-含氟表面活性剂的Novec HFE7500氟化油的5ml溶血管中。

根据液滴试验中使用的读数，产生至少2种乳状液，其在液滴中含有指定浓度(20nM)的抗CD137抗体或1/50的抗IFNγ检测试剂。使用Dy754(Dyomics)区分这些乳状液以光学编码阳性和阴性对照乳状液中的液滴和筛选条件。T细胞在液滴中与K562呈递肽(脉冲或转染的)共区室化。在某些情况下，包封在阳性乳状液中的T细胞可以用与在阴性乳状液中标记的T细胞不同的颜色标记。这主要用于在富集特定细胞的流式细胞术后QC期间区分含有细胞的阳性和阴性乳状液。

微流体平台：液滴荧光分析和分选在专用液滴微流体站上进行，该站包含平行于珠线定向的固定焦点激光线(波长为405nm、488nm、561nm或635nm的固态激光，Omicron)，用于使用440/40-25nm、525/40-25nm、593/46-25nm和708/75-25nm的光电倍增管带通滤波器进行荧光分析(Hamamatsu；Shizuoka，Japan)。

用于液滴分选的门控策略：首先对液滴进行门控以消除聚结的液滴并仅保留所需尺寸的液滴。使用光学液滴条形码，检测阴性对照液滴、阳性对照液滴和含有查询细胞的液滴。通过将液滴中的最大峰值荧光信号(Fp)针对来自液滴的积分荧光信号(Fi)作图来测量对T细胞的荧光再定位。对T细胞的荧光再定位导致Fp/Fi比率的增加。如果含有T和K562细胞的未聚集液滴满足所有以下标准，则对它们进行分选：1)含有K562细胞的液滴，2)含有T细胞，3)液滴内细胞上的读出标志物(IFN-γ和CD137)的再定位，和4)T细胞上标志物荧光峰的共定位。因此，共定位值c被限制在0和1之间，1是两个峰的完美共定位。如果c>0.95，则分选液滴。对于所有抗原，共定位参数c由活化标志物的荧光和T细胞的荧光中的峰之间的时间间隔tp和从液滴的开始到结束的时间间隔td计算：c＝1-(tp/td)。c的值因此被限制在0和1之间，1是两个峰的完美共定位。

液滴分选和细胞回收：通过SAW分选器或通过介电电泳分选液滴。该仪器可通过活化通道上方或下方的电极将液滴分选成最多两个仓(bin)；然而，本研究中仅使用了一个仓。调整入口流量(乳状液为Qem和油为Qoil)以在600s^-1下分选液滴；用于分选的典型参数是Qem＝50μl h^-1(180mbar)，Qoil＝50μl h^-1(180mbar)，F(分选脉冲的频率)＝1.5kHz，τ分选(分选脉冲的持续时间)＝2,000μs和Usort(施加在电极两端的峰-峰电压)＝400kVp-p。将分选的液滴收集在冷却至4℃的1.5mL管中。通过加入100μl的补充有5％人血清的X-vivo，随后加入100μl 1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇(Sigma,370533；Sigma,St.Louis,MO)回收细胞；然后将细胞轻轻混合并在4℃下以300g离心10分钟以有利于完全相分离。然后细胞在400μl的含有0.1％Pluronic F-68非离子表面活性剂(Thermo Fisher Scientific,24040032)、25mM Hepes、5％(vol/vol)人血清的X体内中洗涤，在4℃下以400g离心5分钟，然后重新悬浮于50μl的含有21.82％(vol/vol)Optiprep密度梯度溶液(Sigma)和0.01mgml^-1BSA的1x PBS中。

条形码化水凝胶珠的生产：通过在用微流体装置制成的液滴中聚合产生60-μm直径的聚丙烯酰胺水凝胶珠。然而，然后通过使用连接而不是引物延伸的分裂和合并合成将条形码引物加入到珠中。将一百万颗珠(每个珠携带～10⁹个拷贝的具有5’-突出端(与第一索引5’-突出端序列互补)、光可切割位点和T7-SBS12序列的双链DNA寡核苷酸)分配到微量滴定板的96个孔中。每个孔含有10μl的5μM双链DNA，所述双链DNA具有不同的第一索引(索引A)，在一端与第一DNA互补的5’-突出端和在另一端不同的5’-突出端，并且根据制造商的说明书使用T7 DNA连接酶(New England Biolabs)将它们在23℃下连接15分钟。然后将水凝胶珠合并，如上所述洗涤并如上重新分布到第二微量滴定板的孔中，每个孔含有双链DNA，所述双链DNA具有不同的第二索引(索引B)，在一端与索引A互补的5’-突出端和在另一端与索引A连接的不同的5’-突出端。这种分裂和合并过程总共重复3-4次(加上3个索引)产生96³个组合，其产生～10⁶个不同的条形码。加入最后一个索引后，合并所述珠，具有与索引C互补的5’-突出端的双链DNA分子的混合物与珠上的条形码连接，并且所述混合物包含与编码小基因、TCRα和β以及选定的20个基因的区域互补的基因特异性引物区域。然后通过在22℃下用300mM NaOH孵育2分钟去除引物的第二条链。在过程完成后，每个水凝胶珠总共具有～10⁹个引物，其携带相同的珠特异性条形码。

单个细胞条形码化互补DNA合成：使用微流体装置将单个分选的细胞与单个条形码化水凝胶珠以及裂解和逆转录试剂一起在液滴中共区室化。～1nl体积的液滴在250s^-1下形成。将液滴收集在含有溶剂HFE-7500(Fluorochem；Derbyshire,United Kingdom)和0.1％表面活性剂的1.5ml管，并通过紫外光光切割90秒(OmniCure,AC475；365nm)，然后在50℃下孵育用于细胞裂解和cDNA合成

测序文库制备：通过加入1体积的1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇破坏含有条形码化cDNA的乳状液。用RNA CleanXP珠(Beckman,A63987；Beckman Coulter；Brea,CA)以1:1比率(体积/体积)进一步纯化合并的条形码化cDNA，并在40μl的无DNase和无RNase的H₂O中洗脱。使用GoTaq聚合酶(Promega)、外部(PCR1)和内部(PCR2)反向引物(SBS12引物，随后是Illumina TruSeq索引引物-P7)和对TCRα和β、TMG和选定基因特异性的外部(PCR1)和内部(PCR2)正向引物，通过两步巢式PCR产生测序文库。

测序：最终产物在Illumina(MiSeq/Nextseq)上测序，其允许对α和βTCR的整个CDR3结构域、TMG抗原和20个基因以及条形码序列进行测序。

实施例1：液滴中抗CD137抗体的滴定

为了评估基于液滴中CD137活化标志物表达的免疫反应的信号检测灵敏度和动态范围，进行液滴中的抗CD137抗体滴定。将T细胞用Transact(1/100)在37℃、5％CO₂下活化48小时，然后用PBS中的5μM细胞追踪黄色染色。然后将细胞以450g自旋向下5分钟，并重新悬浮于含有完全X体内培养基(其具有补充有0.1％Pluronic F68、23.6％Nycodenz和6％DNA标志物(Nucgreen)的5％人血清)的共流中。

第二共流含有在指定为不同液滴代码浓度DY754的几种乳状液中测试的不同抗体浓度中的每一种(参见，Gerard等，“High-throughput single-cell activity-basedscreening and sequencing of antibodies using droplet microfluidics,”Nat.Biotechnology 38:715-21(2020))。抗CD137BV421抗体以共流的两倍浓度加入，以在产生的液滴中达到指定的浓度(例如5nM、10nM和20nM)。细胞和抗CD137抗体分别从来自2个不同入口的两种不同的共流注射。实验结果如图1所示。

在100pL液滴中至少需要20nM的抗CD137抗体浓度以有效地检测在T细胞表面的抗体的再定位，如通过最大峰值检测相对于UserInt信号的变化所例证的。因此，试验的灵敏度计算为在T细胞表面表达以导致足够的抗体再定位和荧光信号检测的分子的最小数目。在该试验中计算的分子数目为每活化T细胞120,460个CD137分子，这将导致80％的活化T细胞检测。较低的CD137表达将阻止在这种试验形式中检测活化的T细胞。

实施例2：液滴中T细胞活化

为了评估基于液滴中CD137活化标志物表达的液滴中T细胞活化的效率和信号检测灵敏度，进行通过抗原呈递细胞的T细胞刺激，并在导致有效CD137检测的条件下监测使用抗CD137抗体的活化(如上所定义)。

K562细胞用1μM的细胞追踪红色染色，然后负载10μM的病毒肽(爱泼斯坦巴尔病毒抗原BMLF1)。(在其它实验中，肽可以是任何T细胞抗原，其可以包括病毒抗原、细菌抗原或寄生虫抗原)。将这些细胞重新悬浮于含有完全X体内培养基(其具有补充有0.1％PluronicF68、23.6％的Nycodenz和6％DNA标志物(Nucgreen)的5％人血清)的共流中。另一方面，对BMLF1抗原特异性的T细胞克隆用5μM的细胞追踪黄色标记，并悬浮在与上述相似的共流组合物中。将抗CD137 BV421抗体以40nM加入到K562细胞悬浮液中，在2个不同的入口中分别使2种细胞悬浮液共流并因此使用HFE 2％的表面活性剂产生100皮升(pl)液滴后，产生20nM的液滴浓度。在37℃和5％CO₂下孵育后，基于感兴趣的标志物表达和在T细胞中/上的感兴趣的标志物的定位来分选这些液滴。图2显示液滴中T细胞活化的示意图。

图3示出了从图2中描述的示意性方法收集的数据。简言之，产生100皮升(pl)液滴用于同时包封2种细胞类型(即，K562细胞和T细胞)。将这些液滴收集在含有HFE 0.1％的表面活性剂的5ml管中。将该管在37℃下孵育过夜。然后将这些液滴注射到微流体装置中，并且同时检查液滴在含有活K562和T细胞的液滴中的CD137表达，所述液滴用不同颜色标记。用户整合是微流体装置中的特征，其允许估计峰下面积，用于排除任何潜在的背景和非特异性信号(图3)。

经证实，使用高亲和力抗原和T细胞克隆，在液滴中使用20nM的CD137抗体检测到有效(～94％)T细胞活化，其具有最小的非特异性检测(0％-0.1％)。

实施例3：使用不同读数的抗原呈递细胞(APC)-T细胞相互作用

为了证实试验在单个细胞水平上对液滴形式的T细胞和APC细胞衔接(engagement)/相互作用是特异性的，通过液滴中的抗原呈递细胞进行T细胞刺激，并监测明视野中的细胞-细胞相互作用。使用抗CD137抗体的活化、T细胞的杀伤活性(使用NucGreen读数)和受控特异性定位监测每个读数。

对于该实验，将细胞以特定的荧光配置染色以在荧光显微镜下检查。K562细胞在PBS中用5μM的细胞追踪紫色标记，然后负载10μM肽，而T细胞在PBS中用5μM细胞追踪黄色标记。将两种细胞重新悬浮于含有X体内培养基(其具有补充有0.1％Pluronic F68、23.6％Nycodenz和6％DNA标志物(Nucgreen)的5％人血清)的共流中。将40nM抗体CD137 APC加入到K562细胞共流中，同时在开始产生液滴之前将液滴代码以所需浓度加入到T细胞共流中。在37℃、5％CO₂下孵育过夜后，在荧光显微镜下检查液滴。这些图像显示红色信号(CD137)清楚地定位于活的T细胞(黄色)而非紫色(T细胞)(图4)。Nucgreen是可用于控制T细胞杀伤活性(或不控制)与活化标志物共表达的一致性(和动力学)的活力标志物。

证实了T-APC细胞在液滴中一起衔接和相互作用，活化的T细胞产生/表达可检测的CD137蛋白质，如通过CD137抗体在T细胞表面的再定位所显现的，并且在实验过程中没有检测到杀伤活性，然而CD137抗体再定位不是由于死亡/垂死的T细胞。

实施例4：用于检测活化细胞的抗IFN-γ抗体的用途

为了评估基于细胞因子分泌的液滴中T细胞活化的效率(在与T和APC相关和生理条件下，其中APC展示CMV pp65病毒抗原)和信号检测灵敏性，IFNγ活化标志物表达被用作读数。通过抗原呈递细胞进行T细胞刺激，并在导致有效IFNγ检测(未显示)的条件下使用抗IFNγ抗体监测活化。

K562细胞用5μM的细胞追踪紫色标记，然后负载(或不负载)10μM的肽。然后通过加入冷缓冲液洗涤K562细胞，并在4℃下自旋向下10分钟，然后将细胞重新悬浮于由含有X体内培养基(其具有补充有0.1％Pluronic F68、23.6％Nycodenz、6％DNA标志物(Nucgreen)的5％人血清)组成的共流中。将抗IFN-γ检测抗体以1/25稀释度加入到该细胞悬液中。对于效应细胞，用细胞追踪黄色标记T细胞，然后用靶向CD45和IFNγ的双特异性抗体以1/10稀释度在冷却的培养基中在4℃下和10M/ml的细胞浓度下标记5分钟。然后洗涤T细胞并重新悬浮于含有X体内培养基(其含有补充有0.1％Pluronic F68、23.6％Nycodenz、6％DNA标志物(Nucgreen)的5％人血清，)和适当浓度的液滴代码的共流中。最后，将这些细胞分别共流入微流体装置，从而产生100pl的液滴，然后在37℃、5％CO₂下孵育过夜。使用用10μg编码具有荧光报告基因的病毒肽CMV pp65的mRNA转染的K562细胞进行了类似的实验。实验结果如图5所示。

使用细胞因子分泌(例如，IFNg)作为液滴中的读数、使用高亲和力抗原和T细胞克隆来检测特异性T细胞活化，其具有最小的非特异性检测。

实施例5：利用CellCap装置从富集细胞中回收TCR和抗原连接序列。

为了回收抗原和/或TCR序列其中之一或二者，将具有感兴趣的表型的细胞分选到称为CellCap的微流体芯片中。在视觉检查表型后，通过在液滴中使用条形码化珠进行单个细胞条形码化来回收TCR和抗原信息对，所述液滴含有带有表达抗原的APC和T细胞的富集液滴。可选择的液滴回收和序列回收是可能的。

在细胞分选到Cell Cap期间，将所制备的条形码化珠的文库在5ml的1x BW缓冲液(20mM Tris-Hcl Ph8.0，50mM NaCl，0.1％Tween20)中洗涤5次，然后将水凝胶珠在4℃下以3200g自旋向下2分钟，然后用1ml变性溶液(970μl H₂O+30μl 10M NaOH，最终300mM)在室温(RT)下变性2分钟。然后用5ml的BW缓冲液洗涤条形码化珠3次，然后在室温下用生物素化FITC以5μM终浓度标记条形码化珠10分钟。洗涤后，将条形码化珠重新悬浮于1ml文库缓冲液(Tris pH 8，10mM，EDTA 0,1mM，Tween 20 0.1％)中，并在70℃下加热2分钟，并在4℃下以3200g自旋向下2分钟。将沉淀重新悬浮于含有第一链缓冲液(Igepal CA_630、磺酰罗丹明B和无核酸酶的水)的缓冲液中，并在不同的入口分别与逆转录(RT)混合物共流。

一旦用100pl含有细胞的液滴填充CellCap，使用连接在入口(没有腔室)的注射器从芯片中去除空气，同时翻转CellCap贮液器。以2000μl/hr冲洗HFE以完全去除系统中的气泡。然后将流量降低至150μl/hr，并且翻转含有条形码化珠乳状液的管，直到每个孔填充有1nl液滴，并且将所有剩余的和漂浮的液滴从芯片中冲洗出。然后将液滴以5*5s融合，且两侧(夹住入口和出口)均融合，使用热混合器(thermomixer)启动逆转录(RT)，并将液滴在50℃下孵育2小时，然后保持在4℃，然后使RT失活，处理文库制备并测序。图6示出了表示工作流程的示意图。

图7显示了预期测序数据的代表图，其中TCRα和β以及抗原被回收以鉴定受体和配体的同源对。

虽然已经参考本发明的特定实施方案详细描述了本发明，但是对于本领域的普通技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在其中进行各种改变和修改。

Claims (14)

1.一种鉴定配体种类和受体种类的同源对的方法，所述方法包括：

a.提供配体种类组，其中每种配体种类被呈现至少一次；

b.提供受体种类组，其中每种受体种类被呈现至少一次；

c.使所述配体种类组与所述受体种类组在微反应器中接触，其中在配体种类与受体种类选择性结合后产生增强信号；

d.通过所述信号的产生检测配体种类和受体种类的同源对；以及

e.鉴定配体种类和受体种类的所述同源对。

2.根据权利要求1所述的方法，其中每种配体种类和/或每种受体种类包含条形码序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中每种配体种类和/或每种受体种类由细胞表达或在珠表面上展示，或者在无细胞提取物或溶液中表达或存在。

4.根据权利要求3所述的方法，其中抗原呈递细胞选自巨噬细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞、B细胞、单核细胞衍生的树突细胞或表达MHC I类或II类分子的另一种细胞。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述微反应器选自水性液滴、微胶囊、微珠、微流体芯片的隔室、或孔；和/或所述信号选自细胞、配体或受体中任何一个的形态学变化；荧光信号增强；使用笼形化合物或通过猝灭反应修饰的荧光信号；光吸收；可见的结构修饰/创建；或其信号的组合。

6.根据权利要求2所述的方法，其中鉴定配体种类和受体种类的所述同源对包括扩增所述配体种类和/或所述受体种类，其中对所扩增的配体种类和受体种类中的至少一种进行测序以用于鉴定。

7.根据权利要求1或2所述的方法、其中(a)所述配体种类组选自T细胞抗原、B细胞抗原、病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原、新抗原、肿瘤相关抗原(TAA)、肿瘤特异性抗原、免疫检查点分子、细胞因子、碳水化合物、免疫球蛋白超家族成员、选择素、趋化因子、激素、生长因子、G蛋白偶联受体配体或酶底物；和/或(b)所述受体种类组选自T细胞受体、B细胞受体、免疫检查点受体、细胞因子受体、选择素、整联蛋白、免疫球蛋白超家族成员、钙粘蛋白、趋化因子受体、激素受体、生长因子受体、G蛋白偶联受体(GPCR)或酶。

8.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中：

a)所述配体种类为T细胞抗原且所述受体种类为T细胞受体，并且在所述T细胞抗原与所述T细胞受体选择性结合后，产生所述增强信号，其中产生的所述增强信号是T细胞活化的结果；

b)所述配体种类为病毒抗原且所述受体种类为T细胞受体，并且在所述病毒抗原与所述T细胞受体选择性结合后，产生所述增强信号，其中产生的所述增强信号是T细胞活化的结果；或

c)所述配体种类为B细胞抗原且所述受体种类为B细胞受体，并且在所述B细胞抗原与所述B细胞受体选择性结合后，产生所述增强信号。

9.根据权利要求8所述的方法，其中使所述配体种类组与所述受体种类组在微反应器中接触：

a)约0.001小时至约8小时；或

b)至少约8小时。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述配体种类和所述受体种类以高亲和力结合，并且产生的所述增强信号是T细胞活化的早期标志物或晚期标志物。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述配体种类和所述受体种类以低亲和力结合，并且产生的所述增强信号是T细胞活化的早期标志物或晚期标志物。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其中(a)T细胞活化的所述早期标志物选自CD69、CD107a或转铁蛋白受体；和/或(b)T细胞活化的所述晚期标志物选自CD137、HLA-DR、VLA1、PTA1、CD71、CD27、PD-1、TIM3、LAG3或CTLA4。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述增强信号用抗CD69抗体、抗CD107a抗体、抗转铁蛋白受体抗体、抗CD137抗体、抗HLA-DR抗体、抗VLA1抗体、抗PTA1抗体、抗CD71抗体、抗CD27抗体、抗PD1抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体或抗CTLA4抗体进行检测。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述信号用抗CD138抗体、抗CD19抗体、抗CD45R抗体、抗CD45抗体、荧光报告基因表达的活化或荧光报告基因表达的抑制进行检测。

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