CN112592967B - 一种基于液滴pcr快速检测单细胞的方法 - Google Patents

Abstract

一种基于液滴PCR快速检测单细胞的方法。该方法包括如下步骤：对经培养、富集的细胞进行固定后，加水重悬得到细胞悬液；将所述细胞悬液与含细胞裂解剂的PCR反应试剂直接混合作为分散相，将油相作为连续相，分别注入微流控芯片生成含单细胞的液滴；对得到的液滴进行PCR反应；对PCR反应后的液滴进行荧光信号检测及分析。本发明极大地简化了液滴制备和操作过程，降低了液滴生成芯片和试剂成本，提高了液滴PCR检测单细胞的速度、通量、灵敏度和特异性。

Description

一种基于液滴PCR快速检测单细胞的方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于液滴PCR(Polymerase ChainReaction，聚合酶链式反应)快速检测单细胞的方法。

背景技术

细胞作为生命活动的基本单元，与生命活动息息相关，细胞异质性往往包含着与疾病早期诊断、治疗等相关的重要信息，因此单细胞分析具有重要意义。PCR以其高灵敏度、高特异性的特点，广泛应用于检测单细胞，然而传统的获取单细胞的方法通常需要对细胞进行大量稀释或者采用显微操作技术来进行，步骤复杂繁琐，效率低，试剂消耗大。微流控技术通过将单细胞包裹在液滴中，使每一个液滴都成为一个密封的反应体系，提供了一种高通量、快速检测单细胞的途径。然而，在皮升液滴中，裂解试剂及细胞的裂解物对PCR反应具有极大的抑制作用。现存的方法需要先将细胞和裂解试剂包裹在液滴中，再与包裹反应试剂的液滴融合，这需要复杂的芯片设计和外部控制，对操作者的要求高，无法在多数实验室完成。操作液滴进行融合、分裂、再注入等都容易引起液滴融合，在延长检测时间的同时，也大大降低了检测的可靠性。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种基于液滴PCR快速检测单细胞的方法，以期至少部分地解决上述提及的技术问题中的至少之一。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于液滴PCR检测单细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤(1)对经培养、富集的细胞进行固定后，加水重悬得到细胞悬液；步骤(2)将所述细胞悬液与含细胞裂解剂的PCR反应试剂直接混合作为分散相，将油相作为连续相，分别注入微流控芯片生成含单细胞的液滴；步骤(3)对得到的液滴进行PCR反应；步骤(4)对PCR反应后的液滴进行荧光信号检测及分析。

基于上述技术方案，本发明的基于液滴PCR快速检测单细胞的方法，至少具备以下有益效果其中之一或其中一部分：

(1)本发明操作简单，检测通量高，检测速度快：细胞固定后使细胞中的酶失活，从而避免细胞裂解产物对PCR反应的抑制作用，在此基础上，细胞可直接与含细胞裂解剂的PCR反应试剂预先混合，使用一个简单的液滴生成芯片即可制备用于PCR反应的液滴；

(2)本发明检测灵敏度高、特异性强：进一步选用PFA固定可保持细胞结构，避免细胞破裂，使其中的酶失活，反复清洗后PFA不会抑制PCR反应进行。进一步选择添加对PCR反应无影响的牛胎血清蛋白和NP40细胞裂解剂，在不完全破坏细胞结构的同时，可增加细胞膜、核膜的通透性，使与蛋白缠绕的DNA更易接触引物和探针，大大提高检测灵敏度和特异性。

(3)本发明试剂消耗少，价格低廉，可靠性强：NP40细胞裂解液的引入有助于获得更小尺寸的高热稳定性的液滴，收集液滴的PCR管可直接放入PCR仪进行扩增，无需液滴热孵化、融合、再注入，更少的液滴操作可得到更可靠的检测结果。

附图说明

图1是本发明实施例1流动聚焦法生成含单细胞液滴的示意图；

图2是本发明实施例1在PCR反应前的包裹CaSki细胞的液滴；

图3A是本发明实施例1在PCR反应后的包裹CaSki细胞的液滴；

图3B是图3A的荧光信号观察结果；

图4是本发明实施例2在PCR反应后的包裹CaSki和C-33A细胞的液滴的荧光信号观察结果；

图5A是本发明对比例1在PCR反应后的仅添加BSA的包裹CaSki细胞的液滴；

图5B是图5A的荧光信号观察结果；

图6是本发明对比例2在PCR反应后的包裹未固定CaSki细胞的液滴的荧光信号观察结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

在实现本发明的过程中，发现在对细胞进行固定后，可以降低细胞裂解物对PCR反应的抑制作用，在此基础上，固定后的细胞悬液可以直接与含细胞裂解剂的PCR反应试剂进行预混，细胞裂解剂会增加细胞膜、核膜的通透性，使与蛋白缠绕的DNA更易接触引物和探针，由此在一步预混之后可以直接注入微流控芯片生成液滴，并进行后续的液滴PCR反应，从而实现基于液滴的单细胞PCR快速检测。

具体地，根据本发明的一些实施例，提供了一种基于液滴PCR检测单细胞的方法，包括如下步骤(1)～(4)。

在步骤(1)中，对经培养、富集的细胞进行固定后，加水重悬得到细胞悬液。

在本发明的一些实施例中，细胞的培养、富集为本领域中常规方法，在此不作赘述，可依据待测的细胞种类进行具体选择。

在本发明的一些实施例中，固定细胞的试剂为4％多聚甲醛(PFA)溶液，经反复冲洗后PFA不会抑制PCR反应的进行。

在步骤(2)中，将该细胞悬液与含细胞裂解剂的PCR反应试剂直接混合作为分散相，将油相作为连续相，分别注入微流控芯片生成含单细胞的液滴。由于本步骤采用细胞悬液与PCR反应试剂的直接混合并生成液滴的操作，极大地简化了流体控制过程，有利于提高检测通量和检测速度。

在本发明的一些实施例中，细胞裂解剂优选为牛胎血清蛋白(BSA)和NP40细胞裂解液，优选BSA在分散相中的浓度为1-5mg/ml，例如1、2、3、4、5mg/ml，NP40细胞裂解液使用体积浓度为5％-20％，例如为5％、10％、15％、20％。在PCR反应试剂中加入BSA首先可以降低微流控芯片表面对聚合酶的吸附，提高PCR反应效率，其次可以在一定程度上提高液滴稳定性，再次，在BSA浓度为1mg/mL以上的大体积体系中BSA还起到一定的细胞裂解作用。该NP40细胞裂解液首先增加了细胞膜、核膜的通透性，以使细胞DNA更易接触引物和探针，提高PCR检测灵敏度和特异性；其次，NP40细胞裂解液在很大程度上提高了含细胞的液滴的热稳定性；再次，该NP40细胞裂解液不会完全破坏细胞结构，使得细胞DNA分子不会自细胞结构中释放，由此可以直接进行细胞和反应试剂的混合。

在本发明的一些实施例中，PCR反应试剂还包括含Mg²⁺、dNTPs、Tris-HCl、DNA聚合酶的预混液，特异性引物，探针。其中，特异性引物和探针可依据具体细胞DNA的目标序列进行特异性设计得到。

在本发明的实施例中，油相为含表面活性剂的HFE-7500氟化油，能够确保生成液滴的稳定性。

在本发明的一些实施例中，微流控芯片为流动聚焦结构，但并不以此为限，还可以采用T型通道结构等。具体包括油相入口，用于注入连续相，水相入口，用于注入分散相，以及出口，用于液滴收集。收集的液滴为油包水型液滴，这些液滴中或者不含待测的细胞，或者仅含一个待测的细胞，然后逐个地对这些液滴进行PCR扩增。

在步骤(3)中，对得到的液滴进行PCR反应。

在本发明的一些实施例中，为了提升PCR反应时的液滴热稳定性，即减少融合等现象，在对得到的液滴进行PCR反应之前，还将液滴中的含表面活性剂的HFE-7500氟化油替换为含表面活性剂的FC40氟化油，因为FC40氟化油相对于HFE-7500氟化油对于提升液滴热稳定性更加有利。此处的“替换”是利用水相和油相的密度差异实现的。

在本发明的一些实施例中，PCR的热循环条件为95℃，2min；95℃，15s，60℃，45s，40个循环，但并不以此为限。

步骤(4)对PCR反应后的液滴进行荧光信号检测及分析。

在本发明的一些实施例中，本步骤是通过将液滴注入到液滴储存芯片中，从而对液滴储存芯片进行荧光检测。作为优选，在步骤(4)之前还包括：将PCR反应后的液滴中所述含表面活性剂的FC40氟化油替换回所述含表面活性剂的HFE-7500氟化油，以提高在液滴在转移过程中稳定性。

下面将结合本发明具体实施例，对本发明的技术方案进行进一步的描述。需要说明的是，下文中的具体实施例仅用于示例，并不用于限制本发明。

下述具体实施方式中，所用CaSki细胞和C-33A细胞购自国家细胞实验细胞资源共享平台；所用PCR反应试剂成分及浓度见表1：

表1

*终浓度为在PCR反应试剂与细胞悬液混合后分散相体系中的浓度。

实施例1：基于液滴PCR扩增CaSki细胞中的HPV16 DNA

引物和探针的序列如表2所示：

表2

	序列
		正向引物	5’-CTGCAATGTTTCAGGACCCA-3’
反向引物	5’-TCACGTCGCAGTAACTGTTG-3’
		探针	5’FAM-AGGAGCGACCCGGAAAGTTACCACAGTT-3’BHQ

本实施例以流动聚焦生成液滴为例，公开了基于液滴PCR快速检测单细胞的方法，具体包括：

(1)平均每个CaSki细胞含有600个拷贝的HPV16 DNA，培养、富集CaSki细胞，用4％PFA固定细胞15分钟，用水冲洗至少三次，加水重悬，用细胞计数器计数，调节细胞密度后4℃保存；

(2)将CaSki细胞与PCR反应试剂直接混合，加入预先注入HFE7500的注射器中，将含2％008-fluoroSurfactant的HFE-7500注入另一个注射器，两个注射器竖直放置在注射泵上，将液体分别注入到液滴生成芯片的水相和油相入口中，调节两相的流速，利用如图1所示的流动聚焦结构，制备如图2所示的液滴，收集到PCR管中；

(3)将含表面活性剂的HFE-7500替换为含5％008-fluoroSurfactant表面活性剂的FC40，直接放入PCR仪中，进行扩增，热循环参数设置为95℃、5min；95℃、15s，60℃、45s，40个循环；

(4)PCR反应后，将含5％表面活性剂的FC40替换为2％表面活性剂的HFE7500，用移液枪吸取液滴，注入到液滴储存芯片，用倒置荧光显微镜观察液滴的荧光信号。如图3A和3B所示，包含细胞的液滴产生荧光信号，不包含细胞的液滴不产生荧光信号。

实施例2：在混合细胞中检测CaSki细胞

本实施例与实施例1类似，区别在于检测混合细胞体系中的CaSki细胞，具体包括：

(1)C-33A细胞中无HPV16 DNA，分别培养、富集CaSki和C-33A细胞，用4％PFA溶液固定15分钟，用水清洗三次，加水重悬，调节密度，4℃存储；

(2)将CaSki和C-33A细胞与PCR反应试剂混合后，将水相和油相分别注入液滴生成芯片，制备液滴，收集到PCR管中；

(3)将含表面活性剂的HFE-7500替换为含5％008-fluoroSurfactant表面活性剂的FC40，直接放入PCR仪中，进行扩增，热循环参数设置为95℃、5min；95℃、15s，60℃、45s，40个循环；

(4)PCR反应后，将含5％表面活性剂的FC40替换为2％表面活性剂的HFE7500，用移液枪吸取液滴，注入到液滴储存芯片，用倒置荧光显微镜观察液滴的荧光信号；

(5)如图4所示，含有CaSki细胞的液滴产生TaqMan荧光信号，含C-33A细胞的液滴不产生TaqMan荧光信号，统计液滴荧光信号，调节CaSki和C-33A细胞的比例，重复以上实验。以CaSki细胞所占混合样本的比例为横轴，以检测出的含细胞且PCR阳性的液滴占所有含细胞液滴的比例为纵轴，绘制标准曲线。

对比例1至2：

对比例1采用与实施例1类似的步骤，区别仅在于，没有添加NP40细胞裂解剂。如图5A和5B所示，仅添加BSA作为裂解剂，扩增后大多数包裹细胞的液滴融合，热稳定性较差。

对比例2采用与实施例1类似的步骤，区别仅在于，没有用4％PFA固定细胞。如图6所示，在细胞裂解剂的作用下，细胞破裂DNA扩散到液滴中，产生荧光信号。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于液滴PCR检测单细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤(1)利用固定细胞的试剂4％多聚甲醛溶液对经培养、富集的细胞进行固定后，加水重悬得到细胞悬液；

步骤(2)将所述细胞悬液与含细胞裂解剂的PCR反应试剂直接混合作为分散相，将油相作为连续相，分别注入微流控芯片生成含单细胞的液滴，所述的细胞裂解剂为1-5mg/ml牛胎血清蛋白和5％-20％v/v NP40细胞裂解剂；

步骤(3)对得到的液滴进行PCR反应；

步骤(4)对PCR反应后的液滴进行荧光信号检测及分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR反应试剂还包括含Mg²⁺、dNTPs、Tris-HCl、DNA聚合酶的预混液，特异性引物，探针。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述单细胞直径为10-20μm；得到的液滴直径30-100μm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述油相为含表面活性剂的HFE-7500氟化油。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(3)之前还包括：将所述含表面活性剂的HFE-7500氟化油替换为含表面活性剂的FC40氟化油。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述PCR的热循环条件为95℃，2min；95℃，15s，60℃，45s，40个循环。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(4)之前还包括：在PCR反应后将所述含表面活性剂的FC40氟化油替换回所述含表面活性剂的HFE-7500氟化油。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微流控芯片为流动聚焦结构，包括：

油相入口，用于注入连续相；

水相入口，用于注入分散相；以及

出口，用于液滴收集。

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