CN105814077B - 能够中和狂犬病毒的结合分子 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种能够中和狂犬病毒的结合分子。更具体地，本发明的结合分子能够中和来源于对象，如狗、牛、猫鼬、蝙蝠、臭鼬、浣熊、郊狼、狐狸和狼的狂犬病毒，从而可以用于有效治疗感染了来源于广泛对象的狂犬病毒的患者。
Description
技术领域
本发明涉及一种能够中和狂犬病毒的结合分子。
背景技术
狂犬病是一种病毒性人畜共患病，主要感染野生动物和宠物，也感染包括人类的哺乳动物，引起急性脑病。狂犬病是一种致命的疾病，经常是一出现症状就会导致死亡，狂犬病与艾滋病一起被称为最致命的疾病。世界范围内都有狂犬病的发生，每年有超过1000万人在感染狂犬病毒后接受治疗。此外，每年有40,000-70,000人死于狂犬病。
狂犬病通过唾液和血液传播，主要由被感染的狗或猫咬伤引起。此外，它可以通过大多数哺乳动物，包括臭鼬和蝙蝠传播。
狂犬病毒的实际症状，在狂犬病毒通过身体的神经组织到达大脑神经组织后出现。由于阻挡外来物质的血脑屏障的存在，病毒及类似物不能自然地穿透人脑，但狂犬病毒能够通过狂犬病毒糖蛋白(RVG)感染像大脑中枢神经系统，从而穿过血脑屏障。
在狂犬病的初期，病人可能会有类似流感的症状，并感觉咬伤处瘙痒或发热。随着狂犬病的发展，受感染的病人表现出焦虑、恐水(由于吞咽液体如水时出现肌肉痉挛和剧痛而怕水)、怕风(风使感觉器官过于敏感)、激动、麻痹、和异常的神经症状，如精神异常。此外，狂犬病还导致阳光过敏。出现的此类症状后约2-7天，全身的神经或肌肉均瘫痪，导致昏迷状况，进而导致呼吸窘迫，引起死亡。
目前，预防狂犬病的注射剂是已知的，但没有治疗狂犬病的治疗剂。暴露于狂犬病后的治疗包括咬伤后治疗(暴露后的预防性治疗)。咬伤后治疗包括即时局部伤口护理、利用抗狂犬病免疫球蛋白(以下简称“抗狂犬病抗体”)的被动免疫和主动免疫(疫苗)。发展到目前为止，抗狂犬病抗体包括人源狂犬病免疫球蛋白(以下简称“HRIG”)和马源狂犬病免疫球蛋白(以下简称“ERIG”)。HRIG不能获得足够的数量，并且是昂贵的。此外，其是每单位重量疗效低的多克隆抗体。而且，由于HRIG源自人的血液，其有高潜在风险会引起人感染性疾病如艾滋病。同时，ERIG相比HRIG更廉价，但是也不能获得足够的数量。与HRIG相比，其治疗效率低，因而向病人施用的剂量显著高于HRIG。此外，ERIG可能导致过敏反应，因为其是一种来源于不同于人的马的抗体。为克服此类不充分供给和多克隆抗体的缺点，提出使用能够中和狂犬病毒的单克隆抗体。20世纪80年代开发了狂犬病毒-中和鼠单克隆抗体(Schumacher CL等,J.Clin.Invest.第84卷,第971-975页,1989)，然而，直接向人类患者施用此类鼠单克隆抗体是有局限的，由于其在人体内的较短的半衰期，对该抗体的体内免疫应答缺失，人抗鼠抗体(HAMA)诱导等诸如此类的难题。
因此，为有效治疗狂犬病，迫切需要开发一种单克隆抗体，由于其并非来自血液而对潜在感染高度安全，可以通过培养合成大量生产和供应，具有相同品质,并且由于其仅包含有疗效抗体,具有每单位重量的高疗效。
公开
技术问题
本发明的一个目的是提供一种能够结合以及中和狂犬病毒的结合分子。
本发明的另一个目的是提供一种包含至少一个连接至所述结合分子的标记的免疫偶联物。
本发明的另一个目的是提供一种编码所述结合分子的多核苷酸。
本发明的另一个目的是提供一种插入了编码所述结合分子的多核苷酸的表达载体。
本发明的另一个目的是提供一种用所述表达载体转化的细胞系。
本发明的另一个目的是提供一种包含所述结合分子的组合物。
本发明的另一个目的是提供一种包含所述结合分子的试剂盒。
本发明的另一个目的是提供一种利用所述结合分子诊断狂犬病的方法。
本发明的另一个目的是提供一种利用所述结合分子治疗和预防狂犬病的方法。
本发明的另一个目的是提供一种培养所述细胞系生产本发明结合分子的方法。
本发明的另一个目的是提供一种利用所述结合分子检测狂犬病毒的方法。
技术方案
为实现上述目的，本发明的一种实施方式提供一种对包含野生型G蛋白的狂犬病毒具有中和活性的结合分子，但其对包含一类G蛋白的狂犬病毒不具有中和活性，该类G蛋白的第34位氨基酸由甘氨酸(Gly)突变为缬氨酸(Val)、谷氨酰胺(Glu)或精氨酸(Arg)。在此，所述的氨基酸位置是除去G蛋白信号肽后进行编号的位置。在下文中，此编号方法将以同样的方式用于G蛋白氨基酸位置的编号。
在本发明的一个示例中，发现所述结合分子不能中和一种逃脱病毒，该病毒的G蛋白的第34位氨基酸由甘氨酸(Gly)突变为缬氨酸(Val)、谷氨酰胺(Glu)或精氨酸(Arg)，表明抗原表位存在于G蛋白的抗原位点II中。
例如，所述结合分子可包含：
a)可变区，根据Kabat方法测定，其包含SEQ ID NO:1所示的CDR1区，SEQ ID NO:2所示的CDR2区，和SEQ ID NO:3所示的CDR3区；或
b)可变区，根据Kabat方法测定，其包含SEQ ID NO:4所示的CDR1区，SEQ ID NO:5所示的CDR2区，和SEQ ID NO:6所示的CDR3区。
例如，所述结合分子可包含：
a)可变区，根据Kabat方法测定，其包含SEQ ID NO:1所示的CDR1区，SEQ ID NO:2所示的CDR2区，和SEQ ID NO:3所示的CDR3区；和
b)可变区，根据Kabat方法测定，其包含SEQ ID NO:4所示的CDR1区，SEQ ID NO:5所示的CDR2区，和SEQ ID NO:6所示的CDR3区。
例如，所述结合分子可以是包含SEQ ID NO:25所示可变区，和SEQ ID NO:26所示可变区的结合分子。
例如，所述结合分子可以是包含SEQ ID NO:33所示重链，和SEQ ID NO:34所示轻链的结合分子。
本发明的另一种实施方式提供一种对包含野生型G蛋白的狂犬病毒具有中和活性的结合分子，但其对包含一类G蛋白的狂犬病毒不具有中和活性，该类G蛋白的第331位氨基酸由丝氨酸(Ser)突变为脯氨酸(Pro)。
在本发明的一个示例中，发现所述结合分子不能中和一种逃脱病毒，该病毒的G蛋白的第331位氨基酸由丝氨酸(Ser)突变为脯氨酸(Pro)，表明抗原表位存在于G蛋白的抗原位点III中。
例如，所述结合分子可包含：
a)可变区，根据Kabat方法测定，其包含SEQ ID NO:7所示的CDR1区，SEQ ID NO:8所示的CDR2区，和SEQ ID NO:9所示的CDR3区；或
b)可变区，根据Kabat方法测定，其包含SEQ ID NO:10所示的CDR1区，SEQ ID NO:11所示的CDR2区，和SEQ ID NO:12所示的CDR3区。
例如，所述结合分子可包含：
a)可变区，根据Kabat方法测定，其包含SEQ ID NO:7所示的CDR1区，SEQ ID NO:8所示的CDR2区，和SEQ ID NO:9所示的CDR3区；和
b)可变区，根据Kabat方法测定，其包含SEQ ID NO:10所示的CDR1区，SEQ ID NO:11所示的CDR2区，和SEQ ID NO:12所示的CDR3区。
例如，所述结合分子可以是包含SEQ ID NO:27所示可变区，和SEQ ID NO:28所示可变区的结合分子。
例如，所述结合分子可以是包含SEQ ID NO:35所示重链，和SEQ ID NO:36所示轻链的结合分子。
本发明的另一种实施方式提供一种对包含野生型G蛋白的狂犬病毒具有中和活性的结合分子，但其对包含一类G蛋白的狂犬病毒不具有中和活性，该类G蛋白的第210位氨基酸由缬氨酸(Val)突变为谷氨酸(Glu)或第413位氨基酸由谷氨酸(Glu)突变为天冬氨酸(Asp)。
在本发明的一个示例中，发现所述结合分子不能中和一种逃脱病毒，该病毒的G蛋白的第210位氨基酸由缬氨酸(Val)突变为谷氨酸(Glu)或第413位氨基酸由谷氨酸(Glu)突变为天冬氨酸(Asp)，表明抗原表位存在于G蛋白的新的、尚未报道的位点中。
所述G蛋白可以是CVS-11的G蛋白，但并不限于此。更具体地，野生型G蛋白包含SEQID NO:81所示的氨基酸序列。
例如，所述结合分子可以包含任一选自下组的可变区:
a)可变区，根据Kabat方法测定，其包含SEQ ID NO:13所示的CDR1区，SEQ ID NO:14所示的CDR2区，和SEQ ID NO:15所示的CDR3区；
b)可变区，根据Kabat方法测定，其包含SEQ ID NO:16所示的CDR1区，SEQ ID NO:17所示的CDR2区，和SEQ ID NO:18所示的CDR3区；
c)可变区，根据Kabat方法测定，其包含SEQ ID NO:19所示的CDR1区，SEQ ID NO:20所示的CDR2区，和SEQ ID NO:21所示的CDR3区；和
d)可变区，根据Kabat方法测定，其包含SEQ ID NO:22所示的CDR1区，SEQ ID NO:23所示的CDR2区，和SEQ ID NO:24所示的CDR3区。
例如，所述结合分子可包含：
a)可变区，根据Kabat方法测定，其包含SEQ ID NO:13所示的CDR1区，SEQ ID NO:14所示的CDR2区，和SEQ ID NO:15所示的CDR315区；和
b)可变区，根据Kabat方法测定，其包含SEQ ID NO:16所示的CDR1区，SEQ ID NO:17所示的CDR2区，和SEQ ID NO:18所示的CDR3区。
例如，所述结合分子可以是包含SEQ ID NO:29所示可变区，和SEQ ID NO:30所示可变区的结合分子。
例如，所述结合分子可以是包含SEQ ID NO:37所示重链，和SEQ ID NO:38所示轻链的结合分子。
例如，所述结合分子可包括：
a)可变区，根据Kabat方法测定，其包含SEQ ID NO:19所示的CDR1区，SEQ ID NO:20所示的CDR2区，和SEQ ID NO:21所示的CDR3区；和
b)可变区，根据Kabat方法测定，其包含SEQ ID NO:22所示的CDR1区，SEQ ID NO:23所示的CDR2区，和SEQ ID NO:24所示的CDR3区。
例如，所述结合分子可以是包含SEQ ID NO:31所示可变区，和SEQ ID NO:32所示可变区的结合分子。
例如，所述结合分子可以是包含SEQ ID NO:39所示重链，和SEQ ID NO:40所示轻链的结合分子。
在本发明中，狂犬病毒G蛋白的抗原位点，氨基酸位置和抗原表位类型，通常是目前已知的，如下表1所示。
表1：狂犬病毒G蛋白的抗原位点和氨基酸位置
| 抗原位点 | 氨基酸 | 抗原表位类型 |
| 1 | 226-231 | 线性 |
| 2 | 34-42,198-200 | 构象 |
| 3 | 330-338 | 构象 |
| 4 | 251,264 | 线性 |
在本发明中，可变区中的互补决定区(CDR)由根据Kabat等人设计的系统的常规方法进行测定(见Kabat等，免疫学相关蛋白序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)(5th),国立卫生研究院,Bethesda,MD.(1991))。用于本发明的CDR编号根据Kabat方法进行，但本发明还包括通过其他方法，包括IMGT方法、Chothia方法和AbM方法测定的CDR构成的结合分子。
在本发明的一个实施方式中，所述结合分子可以是抗体。此外，所述结合分子包括但不限于Fab片段、Fv片段、双链抗体、三链抗体、四链抗体(tetrabody)、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在本发明的一个实施方式中，提供了一种与狂犬病毒结合的全人源抗体。在说明书中，术语“抗体”的使用是广义的，具体包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体构成的多特异性抗体(如双特异性抗体)、和抗体片段，只要其表现出所需的生物活性即可。抗体是一种由免疫系统产生的蛋白，能够识别并与特定抗原结合。就其结构而言，抗体是一种Y形蛋白，由四条氨基酸链(两条重链和两条轻链)组成。每个抗体都有两个主要区域：可变区和恒定区。可变区位于Y的臂末端，与靶抗原结合并相互作用。该可变区包含识别并与特定抗原的特异性结合位点结合的互补决定区(CDR)。恒定区，位于Y的尾部，被免疫系统识别并与其相互作用。靶抗原通常有众多的结合位点，也称为抗原表位，可被多种抗体的CDR所识别。每个特异性结合于不同抗原表位的抗体具有不同的结构。因此，一个抗原可以有不止一个对应的抗体。
此外，本发明还包括抗体的功能性变异体。如果抗体的变异体可以与本发明的抗体竞争，特异性结合狂犬病毒或其G蛋白，该抗体可视为本发明抗体的功能性变异体。功能性变异体包括但不限于主要结构序列实质上相同的衍生物，其包含，如在本发明亲本单克隆抗体中未发现的，体外或体内、化学和/或生物化学的修饰。此类修饰包括，如乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合、脂类或脂类衍生物的共价结合、交联、二硫键的形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。或者，功能性变异体可包括具有与亲本抗体的氨基酸序列相比，包含一个或多个氨基酸的替换、插入、删除或其组合的氨基酸序列的抗体。此外，功能性变异体可包括氨基或羧基末端中一个或全部截短的氨基酸序列。与本发明的亲本抗体相比，根据本发明的功能性变异体可具有相同或不同，更高或更低的结合亲和力，但仍能与狂犬病毒或其G蛋白结合。例如，可修饰的可变区氨基酸序列包括但不限于，框架区、高变区，特别是CDR3。通常，轻链区或重链区包含三个高变区，包含三个CDR和更保守的区域，即所谓框架区(FRs)。高变区包含来自CDR的氨基酸残基和来自高变环(hypervariable loops)的氨基酸残基。与此处定义的亲本抗体相比，本发明范围内的功能性变异体具有50-99％、约60-99％、约80-99％、约90-99％、约95-99％或约97-99％的氨基酸序列的同源性。可以利用本领域技术人员已知的计算机算法如Gap或Bestfit，优化调整进行比较氨基酸序列，以及限定相似或相同的氨基酸残基。功能性变异体可通过但不限于本领域已知的常规分子生物学方法(包括PCR、定点突变和定点诱变)或有机合成方法改变亲本抗体或其部分获得。
同时，所述狂犬病毒可来源自选自下组的任意动物：狗、牛、猫鼬、蝙蝠、臭鼬、浣熊、丛林狼、狐狸和狼，但不限于此。
本发明的另一种实施方式中，提供了一种包含至少一个连接至所述结合分子的标记的免疫偶联物。例如，本发明的抗体可进一步附着某种药物。具体地，根据本发明的抗体可以抗体药物偶联物形式使用。抗体药物偶联物(ADC)即免疫偶联物可用于药物的局部给药，允许药物部分对被感染细胞的靶向给药，因为游离药物制剂的施用可能会对正常细胞产生不可接受的毒性水平。ADC的最大效能和最小毒性可以通过增加多克隆和单克隆抗体(单抗)的选择性以及药物链接和药物释放性能来获得。
常规手段的附着，即通过共价键连接，将药物部分与抗体连接通常会导致微粒的非均相混合，其中药物部分附着于抗体的多个位点。例如，典型地，通过抗体中往往较多的赖氨酸残基，将细胞毒性药物偶联到抗体，从而产生非均相抗体-药物共轭混合物。根据反应条件，非均相混合物通常包含附着有0至约8个或更多个药物部分的抗体分布。此外，每种具有特定整数比例药物部分和抗体的偶联物的亚群，均是潜在的非均相混合物，其中药物部分附着于抗体的多个位点。抗体是一种大的、复杂和结构多样的生物分子，经常具有许多活性官能团。他们与接头试剂和药物-接头中间体的反应活性取决于下述因素，如pH值、浓度、盐浓度、共溶剂。
本发明的另一种实施方式提供了一种编码结合分子的核酸分子。
根据本发明的核酸分子包括所有具有本领域技术人员已知的由本发明抗体的氨基酸序列翻译过来的核苷酸序列的核酸分子。因此，可以生产各种具有ORF(开放阅读框)的多核苷酸序列，也落在本发明的核酸分子的范围内。
本发明的另一种实施方式提供了一种插入所述核酸分子的表达载体。
优选地，所述表达载体来源于选自下组的任意载体：由Celltrion公司(韩国)生产的MarEx表达载体(见韩国专利No.10-1076602)、商业上广泛应用的pCDNA载体，F、R1、RP1、Col、pBR322、ToL、Ti载体；粘粒；噬菌体如lambda、lambdoid、M13、Mu、p1P22、Qμ、T-even、T2、T3、T7等；和植物病毒，但不限于此。任何本领域技术人员已知的表达载体都以用于本发明，表达载体的选择取决于选择的宿主细胞的性质。向宿主细胞中导入载体可以通过，但不是限于磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔，以及任何本领域技术人员可选择和使用的适合表达载体和宿主细胞的导入方法来实现。优选的表达载体包含一个或多个选择性标记，但不限于此，也可以根据产品的是否会生产使用和选择不包含选择性标记的载体。选择性标记的选择取决于宿主细胞的选择，尽管这并不是本发明的关键，正如本领域技术人员众所周知的。
可在表达载体中插入并融合标签序列，以便于本发明结合分子的纯化。标签的例子包括，但并不限于六聚组氨酸标签、血凝素标签、myc标签或FLAG标签。任何本领域技术人员已知的、便于纯化的标签都可以在本发明中使用。
本发明的另一种实施方式提供了一种生产能够结合并中和狂犬病毒的结合分子的细胞系，所述细胞系包括转化了所述表达载体的宿主细胞。
在本发明中，所述细胞系包括哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细胞来源的细胞，但不限于此。优选地，以选自下组的哺乳动物细胞作为宿主细胞：CHO细胞、F2N细胞、CSO细胞、BHK细胞、Bowes黑色素瘤细胞、HeLa细胞、911细胞、AT1080细胞、A549细胞、HEK 293细胞和HEK293T细胞，但不限于此。任何本领域技术人员已知的、可用作哺乳动物宿主细胞的细胞，都可以在本发明中使用。
本发明的另一种实施方式提供了一种治疗和预防狂犬病的药物组合物，包括所述结合分子和药学上可接受的赋形剂。
本发明的另一种实施方式提供了一种诊断狂犬病的药物组合物，包括所述结合分子和药学上可接受的赋形剂。
除了能够结合并中和狂犬病毒的结合分子外，本发明的组合物还包括药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂是本领域技术人员众所周知的。
进一步地，根据本发明的、用于预防和治疗的组合物可包含一种或多种治疗狂犬病的其他治疗剂，还可包含各种单克隆抗体，从而在中和活性方面表现出协同效应。
此外，根据本发明的、用于预防或治疗的组合物还可包含一种或多种其他治疗剂或诊断剂。所述治疗剂包括，但不是限于，抗病毒药物。此类药物的例子包括抗体、小分子化合物、有机或无机化合物、酶、多核苷酸序列、抗病毒肽等。
根据本发明的、用于预防或治疗的组合物在制造和储存过程中是无菌和稳定的。此外，其可以是粉末形式，在释放前或释放时，用适当的药学上可接受的赋形剂还原。至于用于制备无菌注射液的无菌粉末，优选的制备方法是利用真空干燥和冷冻干燥从该粉末的预先过滤除菌的溶液生产含有有效成分以及任何额外需要的成分的粉末。另外，本发明的组合物可以是溶解状态，并且可以在释放前或释放时，添加和/或混合适当的药学上可接受的赋形剂，以提供可注射的单元剂型。优选地，本发明使用的药学上可接受的赋形剂，与药物浓度相配，可以保持适当的流动性，并且如需要，可以延迟吸收。
本发明的用于预防和治疗的组合物的最佳给药途径的选择，受几个因素的影响，包括组合物中活性分子的物理化学性质、临床情况的紧迫性和活性分子的血药浓度与达到理想治疗效果之间的关系。例如，本发明的单克隆抗体可以用避免其快速释放的载体制备，如控释剂，包括埋植剂和微胶囊运载系统。本发明可使用生物降解性和生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。此外，本发明的单克隆抗体可以用防止抗体灭活的材料或化合物联合用药或包被。例如，本发明的单克隆抗体可与适当的载体一同施用，例如，脂质体或稀释剂。
本发明的用于预防和治疗的组合物的施用途径可分为口服途径和非肠道途径。优选的给药途径是静脉注射途径，但不限于此。
可以制成口服剂型，如片剂、锭剂、糖锭、水性或油性悬浮剂、可分散性粉剂或颗粒剂、乳剂、硬胶囊、软胶囊、糖浆剂或酏剂、丸剂、糖衣丸、液体、凝胶剂、或悬浮剂。这些剂型可包含药用辅料，包括但不是限于惰性稀释剂、制粒和崩解剂、粘结剂、润滑剂、防腐剂、着色剂、调味剂或甜味剂、植物或矿物油、润湿剂和增稠剂。
用于非经肠施用的剂型可以是水性或非水性等渗无菌无毒注射剂或输液剂或混悬剂。溶液剂或混悬剂可包含使用剂量和浓度下对受试者无毒的制剂，如1，3-丁二醇、林格氏溶液、Hank’s溶液、等渗氯化钠溶液、油类、脂肪酸、局部麻醉剂、防腐剂、缓冲剂、粘度或溶解度增加剂、水溶性抗氧化剂、油溶性抗氧化剂和金属螯合剂。
优选地，用于本发明诊断组合物的结合分子具有可检测标记。本领域技术人员众所周知，大量的技术可以用于标记生物分子，这些技术被认为包括在本发明的范围内。本发明可用的标记的示例包括酶、放射性同位素、胶体金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物。常用的标记尤其包括，荧光染料(如荧光素、罗丹明、德克萨斯红等)、酶(如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶)、放射性同位素(如32P或125I)、生物素、洋地黄毒苷、胶体金属、化学或生物发光化合物(如，二氧杂环丁烷、鲁米诺或吖啶鎓)。标记过程，如酶或生物素基团的共价偶联、碘化、磷酸化、生物素酰化等，是本领域已知的。检测方法包括，但不是限于，放射自显影法、荧光显微法、直接和间接的酶促反应等。常用的检测分析包括放射性同位素或非放射性同位素方法。这尤其包括，免疫印迹叠加分析，RIA(放射性同位素分析)、IRMA(免疫放射度量分析)、EIA(酶免疫分析)、ELISA(酶联免疫分析)、FIA(荧光免疫分析)和CLIA(化学发光免疫分析)。
本发明的另一实施方式提供了用于诊断狂犬病的试剂盒，包括：
a)所述结合分子；和
b)容器。
本发明的另一实施方式提供了用于治疗或预防狂犬病的试剂盒，包括：
a)所述结合分子；和
b)容器。
本发明的另一实施方式提供了用于诊断狂犬病的方法，包括步骤：
a)将样本与所述结合分子相互接触；和
b)分析步骤(a)的结果，判断对象是否感染狂犬病。
本发明的另一实施方式提供了为诊断狂犬病提供信息的方法，所述方法包括步骤：
a)将样本与所述结合分子相互接触；和
b)检测结合分子和样本之间的反应情况。
本发明的另一实施方式提供了治疗和预防狂犬病的方法，包括向一对象施用治疗有效量的结合分子的步骤。例如，当一对象计划前往狂犬病风险区时，向该对象施用本发明的人单克隆抗体，从而给予其1天、2天、3天或数天内的抗狂犬病免疫力。
本发明的另一种实施方式提供了一种生产能够结合并中和狂犬病毒的结合分子的方法，所述方法包括步骤：
a)培养所述细胞系；和
b)收集所述细胞系中表达的结合分子。
本发明的另一实施方式提供了一种用于检测狂犬病毒的方法，包括：
a)将样本与结合分子相互接触；和
b)检测结合分子是否与样本特异性结合。
本发明的检测狂犬病毒的方法中，来自对象的样本包括(潜在)感染对象的血液、血清、痰、唾液、汗液、组织和其他生物材料，但不限于此。根据本领域技术人员已知的常规方法制备样本。(潜在)感染对象可以是人类对象，但也可以是疑似狂犬病毒携带者的动物。来自对象的样本可先进行使其更适合于检测方法的操作。较佳地，在允许结合分子与样本中的狂犬病毒或其抗原成分之间形成免疫复合物的条件下，将本发明的结合分子或免疫偶合物与对象的样本进行接触。指示样本中狂犬病毒存在的免疫复合物的形成，可以用合适的方法检测和测量。此类方法包括，但并不限于免疫分析，如放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、免疫荧光分析、免疫细胞化学检测、FACS、BIACORE和蛋白印记分析。
本发明的另一实施方式提供了一种包含两个或多个选自下组的结合分子的组合物(以下简称“鸡尾酒式组合物”)：
a)结合分子，其包含一根据Kabat方法测定的，包含SEQ ID NO:1所示的CDR1区，SEQ ID NO:2所示的CDR2区，和SEQ ID NO:3所示的CDR3区的可变区；和一根据Kabat方法测定的，包含SEQ ID NO:4所示的CDR1区，SEQ ID NO:5所示的CDR2区，和SEQ ID NO:6所示的CDR3区的可变区；
b)结合分子，其包含一根据Kabat方法测定的，包含SEQ ID NO:7所示的CDR1区，SEQ ID NO:8所示的CDR2区，和SEQ ID NO:9所示的CDR3区的可变区；和一根据Kabat方法测定的，包含SEQ ID NO:10所示的CDR1区，SEQ ID NO:11所示的CDR2区，和SEQ ID NO:12所示的CDR3区的可变区；
c)结合分子，其包含一根据Kabat方法测定的，包含SEQ ID NO:13所示的CDR1区，SEQ ID NO:14所示的CDR2区，和SEQ ID NO:15所示的CDR3区的可变区；和一根据Kabat方法测定的，包含SEQ ID NO:16所示的CDR1区，SEQ ID NO:17所示的CDR2区，和SEQ ID NO:18所示的CDR3区的可变区；和
d)结合分子，其包含一根据Kabat方法测定的，包含SEQ ID NO:19所示的CDR1区，SEQ ID NO:20所示的CDR2区，和SEQ ID NO:21所示的CDR3区的可变区；和一根据Kabat方法测定的，包含SEQ ID NO:22所示的CDR1区，SEQ ID NO:23所示的CDR2区，和SEQ ID NO:24所示的CDR3区的可变区。
在一种实施方式中，所述鸡尾酒式组合物包括：
a)结合分子，其包含一根据Kabat方法测定的，包含SEQ ID NO:1所示的CDR1区，SEQ ID NO:2所示的CDR2区，和SEQ ID NO:3所示的CDR3区的可变区；和一根据Kabat方法测定的，包含SEQ ID NO:4所示的CDR1区，SEQ ID NO:5所示的CDR2区，和SEQ ID NO:6所示的CDR3区的可变区；和
b)结合分子，其包含一根据Kabat方法测定的，包含SEQ ID NO:7所示的CDR1区，SEQ ID NO:8所示的CDR2区，和SEQ ID NO:9所示的CDR3区的可变区；和一根据Kabat方法测定的，包含SEQ ID NO:10所示的CDR1区，SEQ ID NO:11所示的CDR2区，和SEQ ID NO:12所示的CDR3区的可变区。
在另一种实施方式中，所述鸡尾酒式组合物包括：
a)结合分子，其包含一根据Kabat方法测定的，包含SEQ ID NO:7所示的CDR1区，SEQ ID NO:8所示的CDR2区，和SEQ ID NO:9所示的CDR3区的可变区；和一根据Kabat方法测定的，包含SEQ ID NO:10所示的CDR1区，SEQ ID NO:11所示的CDR2区，和SEQ ID NO:12所示的CDR3区的可变区；和
b)结合分子，其包含一根据Kabat方法测定的，包含SEQ ID NO:19所示的CDR1区，SEQ ID NO:20所示的CDR2区，和SEQ ID NO:21所示的CDR3区的可变区；和一根据Kabat方法测定的，包含SEQ ID NO:22所示的CDR1区，SEQ ID NO:23所示的CDR2区，和SEQ ID NO:24所示的CDR3区的可变区。
下文中，将定义在本发明中使用的术语。
如本文所用，术语“结合分子”是指一种完整的免疫球蛋白，包括单克隆抗体，如嵌合的、人源化或人单克隆抗体，或指一种抗原结合区或可变区，包括与完整的免疫球蛋白竞争性结合免疫球蛋白结合配体(例如狂犬病病毒或其片段，如病毒外部的G蛋白(糖蛋白))的免疫球蛋白的片段。无论何种结构，抗原结合片段与被完整免疫球蛋白识别的同一抗原结合。抗原结合片段包括具有下述氨基酸序列的肽或多肽：所述结合分子的氨基酸序列的至少2个连续的氨基酸残基、至少5个连续的氨基酸残基、至少10个连续的氨基酸残基、至少15个连续的氨基酸残基、至少20个连续的氨基酸残基、至少25个连续的氨基酸残基、至少30个连续的氨基酸残基、至少35个连续的氨基酸残基，至少40个连续的氨基酸残基，至少50个连续的氨基酸残基、至少60个连续的氨基酸残基、至少70个连续的氨基酸残基、至少连续80个氨基酸残基、至少连续90个氨基酸残基、至少连续100个氨基酸残基、至少连续125个氨基酸残基、至少150个连续的氨基酸残基，至少连续175个氨基酸残基，至少200个连续的氨基酸残基、或至少连续250个氨基酸残基。
抗原结合片段包括Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、双价单链抗体、噬菌体单链抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、包含至少一个免疫球蛋白片段的多肽(该片段足够赋予该多肽特异性抗原结合能力)等。上述片段可以合成生产，或通过酶解或化学裂解完整免疫球蛋白生产，或利用重组DNA技术进行基因工程化。生产的方法是本领域众所周知。
如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”是指任何与活性分子如药物、制剂或结合分子联用的惰性物质，来制备适合且方便的剂型。药学上可接受的赋形剂是在使用剂量和浓度下对受试者无毒的赋形剂，且与剂型中的其他成分相容，包括药物、试剂或结合分子。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指对在暴露于狂犬病毒之前或之后,对预防或治疗狂犬病毒有效的本发明结合分子的量。
在本发明中，向15个健康成人受试者接种狂犬病疫苗，随后收集其血液。从收集的外周血中分离PBMCs。利用分离的PBMCs，通过噬菌体展示和B细胞分选，筛选候选抗体。测量筛选的候选抗体的基础效价，从候选抗体中筛选出中和性能高于一定值的抗体。此外，由美国疾病控制与预防中心(以下简称“CDC”)，对确认表现出中和代表性狂犬病毒(在各大洲和世界范围的动物体内存在)性能的4株抗体，进行体内和体外实验，从而测定抗体中和各种狂犬病毒的能力。因此，发现本发明的单克隆抗体可以有效地用于治疗感染了来源于多种不同动物的狂犬病毒的患者。
有益的效果
本发明的能够中和狂犬病毒的结合分子具有中和各种狂犬病毒的能力。因此，它可以用于狂犬病的预防和治疗。
附图说明
图1显示了包括本发明的重链和轻链基因的人抗体表达载体。
图2显示了使用狂犬病毒G蛋白进行ELISA检测的结果。
图3为动物试验中小鼠抗SV2病毒的存活率图。
最佳实施例
接下来，参考实施例进一步详细地阐述本发明。然而应理解，这些例子仅仅是用于说明目的，而并不旨在限定本发明的范围。
实施例
实施例1：对狂犬病毒特异的人抗体克隆的筛选
实施例1-1：接种狂犬疫苗的对象的血液中的PBMCs的分离
本实施例中，志愿者由接种狂犬疫苗的健康成人组成，实验由伦理审查委员会(IRB)核准。发现志愿者对其他感染性病毒为阴性(即VDRL和HBsAg)，并且对抗-HCV抗体和抗-HIV抗体为阴性。志愿者中，一年前接种过狂犬疫苗的人接种一次，从未接种过狂犬疫苗的人共接种三次。在此，用于接种的疫苗为(赛诺菲巴斯德)。末次接种两周后，采集约50mL全血，并通过Ficoll-Paque PLUS(通用电气医疗集团)方法，从采集的全血中分离PBMCs(外周血单核细胞)。
分离的PBMCs用磷酸盐缓冲液清洗两次，随后用冷冻剂(RPMI(Gibco，商品目录号：A10491-01):FBS:DMSO＝5:4:1)调整浓度为1x107细胞/mL，并储存于液氮罐中。
实施例1-2：噬菌体展示抗体库的构建
利用TriReagent(分子研究中心)，从实施例1-1分离的PBMCs中提取总RNA，随后利用SuperScriptTM第一链cDNA合成系统(Invitrogen,USA)，以总RNA进行cDNA的合成。
利用本领域已知的方法(见Barbas C.等.噬菌体展示实验室手册.2001.CSHL出版社)，以合成的cDNA，进行抗体库的构建。简言之，通过PCR(聚合酶链式反应)，利用高保真Taq聚合酶(Roche)和退行性引物，从合成的cDNA中扩增抗体的轻链区和重链区。扩增的DNA片段在1％的琼脂糖凝胶上电泳，随后利用凝胶回收试剂盒(Qiagen)分离。以分离的可变区片段为模板，通过重叠PCR，连接抗体的重链和轻链可变区，形成scFv类基因，随后将其扩增，并用1％琼脂糖凝胶电泳和凝胶回收试剂盒(Qiagen)分离。在扩增的scFv基因中插入了SfiI限制性酶切位点，用SfiI限制性内切酶(Roche)消化12小时，随后用1％琼脂糖凝胶电泳和凝胶回收试剂盒(Qiagen)分离该基因。噬菌粒载体也用SfiI限制性内切酶消化，分离，然后将其与scFv基因混合，并在T4DNA连接酶(Roche)的存在下，16℃反应12小时。将反应溶液与ER2738感受态细胞(Lucigen)混合，并利用电穿孔法，将其转化入细胞。振荡培养转化的ER2738细胞，随后向其中加入VCSM13辅助噬菌体(安捷伦科技)，并培养12小时，从而构建噬菌体文库。
实施例1-3：利用噬菌体文库筛选抗体
根据狂犬病实验室技术(第4版，世界卫生组织)，利用分离的狂犬病毒G蛋白，从噬菌体文库中筛选能与狂犬病毒G蛋白结合的抗体片段。
简言之，BHK-21或Vero细胞中，培养狂犬病病毒3-4天，随后收集培养液，超速离心机离心收集病毒。利用辛基-β-吡喃葡萄糖苷，分离位于收集病毒表面的G蛋白。利用如ELISA等其他方法，对分离的蛋白进行定量和定性分析。
对实施例1-2中构建的噬菌体文库培养液进行离心，弃去宿主细胞，随后向其中添加4％PEG和0.5M NaCl，接着9000rpm离心15分钟，沉淀噬菌体并弃去上清液。用1％BSA/TBS稀释沉淀的噬菌体，并将其添加至抗原结合ELISA板，随后室温孵化2小时。除去反应液后，用含0.05％吐温20的PBS清洗ELISA板，随后向其中加入60μL 0.1M甘氨酸-盐酸(pH2.2)，以分离抗原结合噬菌体，随后用2M Tris(pH9.1)对其进行中和。用分离的噬菌体感染ER2738细胞并与辅助噬菌体VCSM13一同孵育，由此产生的噬菌体用于下一筛选过程。经过两或三轮的淘选，挑选出候选抗体片段。
实施例1-4：噬菌体的酶免疫分析
两轮淘选后，添加辅助噬菌体前，将部分感染的ER2738细胞接种于LB平板，以获得克隆。将形成的克隆添加至培养基中，振荡培养。当OD600达到0.7或更高时，向细胞中添加VCSM13辅助噬菌体，随后37℃振荡培养12小时或更长时间。对培养基进行离心，弃去宿主细胞并收集含有噬菌体的上清液。
为进行噬菌体酶免疫分析，将G蛋白吸附到96孔微量滴定板上，随后向其中添加150μL 3％BSA/PBS，接着37℃孵育1小时。用6％BSA/PBS，以1:1的比例稀释上述制备的噬菌体上清液，将其添加至板的每个孔中，随后37℃孵育2小时。每个孔用含0.05％吐温20的PBS清洗三次，随后加入辣根过氧化物酶标记的M13抗体，接着37℃孵育1小时。每个孔用含0.05％吐温20的PBS清洗三次，随后向其中添加ABTS(2,2’-连氮-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐，2,2'-azinobis[3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammoniumsalt)。接下来，通过在405nm处测量吸光度，对候选抗体进行筛选。
实施例1-5：通过FACS筛选抗体
伦理审查委员会(IRB)核准后，采集50mL接种狂犬病疫苗的健康人的全血。全血在接种疫苗后的7天内采集，利用Ficoll-Paque PLUS(通用电气医疗集团)从全血中分离PBMCs。在利用FACS分离B细胞之前，分离的PBMCs存储于液氮中。
为了增加解冻后的PBMCs中的抗体表达，将PBMC细胞在包含四种细胞因子(IL 4、IL-6、IL-21和CD40L)的培养基中，37℃和5％CO2的条件下，培养5.5天。进行流式细胞术，以从培养的PBMCs中分离表达狂犬病病毒特异性抗体的B细胞。为进行流式细胞术，在FcγR阻断剂存在下，用荧光标记抗体或抗原对PBMCs进行标记，随后利用流式细胞仪(FACS ariaII,BD生物科学)，只有标记细胞会被分离，将其添加到96孔PCR板(应用生物系统)。用于标记的抗体或抗原如表2所示。
表2：FACS抗体筛选中用于标记的抗原和抗体
为获取表达狂犬病病毒特异性抗体的B细胞，制备FITC标记的狂犬病毒G蛋白。利用FITC抗体标记试剂盒(Pierce)，根据制造商手册，对上述的狂犬病毒G蛋白进行纯化，以获得FITC标记的狂犬病毒G蛋白。
实施例1-6：单细胞中cDNA的合成和抗体基因的扩增
以96孔板的每个孔中分离的单细胞，利用SuperScriptIII第一链合成系统试剂盒(Invitrogen)，进行cDNA的合成。根据试剂盒中提供的手册进行cDNA的合成。利用修改的Thomas Tiller等记述的方法(免疫学方法杂志，2008年)，从合成的cDNA获得抗体基因。简言之，在初次PCR中，PCR扩增重链和轻链基因，在二次PCR中，以初次PCR的产物为模板，利用巢式PCR再次扩增重链和轻链基因。扩增的重链和轻链基因进行琼脂糖凝胶电泳，确定重链和轻链基因条带大小。随后，用刀片切割琼脂糖凝胶，将含有DNA的琼脂糖凝胶片段移至1.5mL管内，利用PCR纯化试剂盒(Qiagen)，纯化琼脂糖片段中的DNA。利用Not1和Age1限制性内切酶，处理纯化DNA中的重链和κ轻链，随后将克隆插入包含部分抗体的PCDNA3.1载体。利用Age1和Xho1限制性内切酶，处理λ轻链，随后将克隆插入修饰的包含部分抗体的PCDNA3.1载体。
实施例1-7：利用ELISA筛选候选抗体
将实施例1-4、1-5和1-6中筛选到的候选抗体基因插入到动物细胞表达载体中并进行表达，随后对分泌到培养液中的抗体进行ELISA。向附着有狂犬病毒G蛋白的ELISA板上添加表达的抗体。洗去未结合抗体，随后利用辣根过氧化物酶复合物抗人抗体，筛选出抗原结合候选抗体。
利用狂犬病毒G蛋白进行ELISA，结果如图2所示，特异性结合抗原的候选抗体被筛选出来。
实施例1-8：以病毒的中和活性筛选候选抗体
实施例1-7中，确认了约80种表现出高结合亲和力的候选抗体，利用CVS-11进行降低基底病毒活性的实验。
在候选抗体中，筛选出约50种效价高于特定值(1000IU/mg)的抗体。对此类筛选抗体进行针对世界范围内出现的、保藏于美国疾病控制与预防中心(此后简称“CDC”)的狂犬病毒的RFFIT实验。US CDS拥有约50种世界范围内出现的狂犬病毒，病毒清单如下表3所示。利用上述狂犬病毒中的6种病毒，检测抗体的中和活性，进行初步筛选，检测结果如下表4所示。表4中，Y表示抗体表现出中和活性，N表示抗体不具有中和性能，M表示抗体表现出部分中和性能。
表3：保藏于US CDC的狂犬病毒清单
表4：由US CDC进行的REFIT结果(初筛、6种病毒、50种抗体)
基于上述结果，筛选出15种抗体，测试其中和约50种病毒(表3)的能力。测试结果如下表5所示。
表5：15抗体的中和活性测试
从这些抗体中，鉴于其抗原结合位点和基底效价，筛选出四株克隆(上表5中克隆编号为3、5、10和11；以下分别简称为：发明抗体1、发明抗体2、发明抗体3和发明抗体4)。下表6中，构象表位表示具有三维蛋白结构的结合位点。
表6：4种最终选定的人抗体的中和活性和抗原表位
实施例2：人抗体表达载体的构建
用限制性内切酶Nhe I和Pme I，处理包含重链和轻链的PCR2.1TA克隆载体，以分离重链基因和轻链基因。分别将分离的重链基因和轻链基因插入到用相同限制酶处理的pCT145载体和pCT146载体。PCT145和pCT146载体是赛特瑞恩股份有限公司(Celltrion,Inc.)，为分别克隆抗体的重链和轻链而构建的载体。接下来，为了构建包含重链转录单元(启动子-重链基因-poly A)和轻链转录单元(启动子-轻链基因-polyA)的表达载体，用限制性内切酶Pac I和Asc I处理包含重链基因的pCT145载体，从而获得重链转录单元，随后用相同的限制性内切酶处理包含轻链基因的pCT146载体，并将重链转录单元插入其中。随后，利用限制性内切酶筛选包含重链转录单元和轻链转录单元的载体，并将其命名为“pCT188”(见图1；韩国专利No.10-1076602；专利权人：赛特瑞恩股份有限公司)。使用Endofree质粒maxi试剂盒(QIAGEN，德国，12362)，提取筛选后的载体，通过基因测序，分析提取DNA的部分核苷酸序列，从而确定抗体的核苷酸序列。
实施例3：通过瞬时转染生产抗体
按制造商说明书，利用阳离子聚合物FreeStyleTM Max(英杰公司，16447-100)，进行细胞的瞬时转染。转染前一天，离心分离在EX-CELL 293无血清培养基(西格玛，14571C；此后简称“Ex-CELL 293培养基”)中生长的F2N细胞(见韩国专利No.10-1005967，专利权人：赛特瑞恩股份有限公司)，用FreeStyle293无血清培养基(Gibco,12338)替换原培养基。分别向两个250mL摇瓶中接种50mL细胞，细胞浓度为0.8×106细胞每毫升。转染当天，利用OptiPRO SFM II培养基(英杰公司，12309)，分别将含有抗体基因的125μg pCT178DNA和125μL FreeStyleTM Max试剂稀释至体积为2mL，随后轻柔搅拌。搅拌步骤后，立即混合稀释的含有FreeStyleTM Max试剂的溶液和稀释的含DNA的溶液，混合溶液室温孵育17分钟。在室温孵育17分钟期间，对用于转染的种子F2N细胞进行计数，并用FreeStyle293培养基将细胞稀释至细胞浓度为1.0×106细胞。室温孵育17分钟后，用包含DNA和FreeStyleTM Max试剂的混合溶液转染F2N细胞。转染后一天，向转染细胞中添加等量的EX-CELL 293培养基，随后孵育7天，从而产生单克隆抗体。
实施例4：最终筛选出的人单克隆抗体的中和活性测试
利用RFFIT，对4株最终筛选出的抗体对世界范围内出现的约50种狂犬病毒的中和活性进行体外测试。测试结果如下表7所示。
表7：人单克隆抗体的RFFIT结果
实施例5：最终筛选出的人单克隆抗体的抗原位点测定
为确定上述筛选抗体的抗原位点，进行寻找逃逸突变病毒的实验。
在96孔细胞培养板上，对具有106每毫升的传染性CVS-11病毒进行1.5倍连续稀释，随后与0.5-1IU/mL的抗体一起，37℃孵育1小时。孵育1小时后，以2×105细胞/毫升的浓度，将BHK细胞添加至板上，培养3天。3天后，获得病毒，且细胞被固定，通过染色分析细胞内狂犬病毒核衣壳蛋白的表达，以确定细胞是否被CVS-11病毒感染(Jenobiotech，9061)。传代2次时，利用增大量的1次传代获得的抗病毒抗体，重复进行相同实验。对每个抗体进行的传代信息如下表8所示。对传代1或2，4-5次的病毒克隆扩增，其中，尽管抗体的量逐步增加，仍出现病毒(从不感染CVS-11或感染少量CVS-11的细胞中获得)感染或病毒感染程度增加，随后利用QIAamp病毒RNA迷你试剂盒(QIAGEN，52904)，对RNA进行纯化。
表8：逃逸突变病毒的实验
| 抗体 | 传代1次 | 传代2次 | 传代3次 | 放大 |
| 发明抗体4 | 1IU/ml | 10IU/ml | - | 5倍克隆 |
| 发明抗体1 | 1IU/ml | 5IU/ml | 10IU/ml | 4倍克隆 |
| 发明抗体3 | 0.5IU/ml | 2IU/ml | 7IU/ml | 5倍克隆 |
通过用于RT-PCR的SuperScriptIII第一链的合成系统(英杰公司，18080-051)，以RNA为模板，合成cDNA。用Takara ExTaq(Takara,RR001A)对合成cDNA进行扩增，随后对扩增基因测序。测序获得的关于抗原表位和突变核苷酸以及每个抗体的氨基酸的信息如下表9所示。
结果表明，发明抗体2不能中和第210位氨基酸突变的突变病毒，通过发明抗体3获知，提示发明抗体2的抗原位点是新的位点，与发明抗体3类似。
表9：对于抗体的抗原位点的测试结果
*所述的氨基酸位置是除去狂犬病毒G蛋白信号肽后进行编号的位置。
实施例6：针对CR4098抗体产生的逃逸病毒的中和活性实验
实施例6-1：CR4098抗体逃逸病毒的产生
从专利(见US7579446)和NCBI(国家生物技术信息中心)数据库中获得了CR4098抗体(Crucell)的DNA序列，并通过Enzynomics(儒城区，大田市，韩国)进行合成。将合成的序列克隆到pCT146表达载体(见实施例2)，随后递送至赛特瑞恩(Celltrion)。通过限制性内切酶酶切和DNA测序，分析合成的序列。如实施例3所述，CR4098抗体可以短时间内，在F2N78细胞系中生产。
接下来，利用CR4098抗体，进行产生对于需要抗体的逃逸突变病毒的实验。
在96孔细胞培养板上，对106每毫升的传染性CVS-11病毒进行1.5倍连续稀释，随后与10-40IU/mL的CR4098抗体一起，37℃孵育1小时。孵育1小时后，以2×105细胞/毫升的浓度，将BHK细胞添加至板上，培养3天。3天后，获得病毒，并固定细胞，通过染色分析细胞内狂犬病毒核衣壳蛋白的表达，以确定细胞是否被CVS-11病毒感染(Jenobiotech，9061)。传代2次时，利用增大量的1次传代获得的抗病毒抗体，重复进行相同实验。对传代1或2，4-5次的病毒克隆进行放大，其中，尽管CR4098抗体的量逐步增加，仍出现病毒(从不感染CVS-11或感染少量CVS-11的细胞中获得)感染或病毒感染程度增加，随后利用QIAamp病毒RNA迷你试剂盒(QIAGEN，52904)，对RNA进行纯化。
通过用于RT-PCR的SuperScriptIII第一链的合成系统(英杰公司，18080-051)，以RNA为模板，合成cDNA。用Takara ExTaq(Takara,RR001A)对合成cDNA进行扩增，随后对扩增基因测序。
测序结果表明，对于CR4098抗体的逃逸突变病毒的序列更改出现在N336K。
实施例6-2：CR4098抗体产生的逃逸病毒的中和活性实验
检测本发明的抗体是否具有中和CR4098抗体产生的逃逸病毒(N336K)的活性。
中和活性实验的结果表明，本发明的所有抗体都表现出抗CR4098抗体逃逸病毒(N336K)的活性，只有CR4098抗体不具有中和活性。
表10：CR4098抗体产生的逃逸病毒的中和活性实验结果
实施例7：测试发明抗体中和印度分离的狂犬病毒的活性
7-1:体外实验
利用发明抗体1、3和4，混合1(发明抗体1+发明抗体4)和混合2(发明抗体1+发明抗体3)，进行抗体对印度流行的、如下表11所示的野生型病毒的活性测试(RFFIT)。由印度国家心理健康和科学研究所(NIMHANS)进行了实验。分别用约1μg抗体与100FFD50的Neuro 2-a细胞中的下表11所述的病毒进行测试。RFFIT测试结果表明，五种抗体都表现出抗各个病毒的中和活性。
表11：印度流行的狂犬病病毒
7-2:体内实验
上述的体外测试后，进行小鼠体内试验。结果如下表12所示，在所有动物组中，全部抗体都表现出高中和活性。每个动物组包括10只小鼠，每种病毒的使用剂量为100LD50(0.1mL)。接种(肌内注射)病毒3小时后，分别将约1μg的抗体注射到相同位点(肌内注射)，30天后，观察小鼠的存活率。图3显示了动物实验中小鼠抗六种病毒(SV1-SV6)中的SV2病毒的存活率的图。
动物实验中小鼠分别抗病毒SV1-SV6的存活率如下表12所示。
表12：本发明抗体抗印度分离的狂犬病毒的中和活性动物试验
| SV1 | SV2 | SV3 | SV4 | SV5 | SV6 | |
| 发明抗体1 | 80 | 90 | 90 | 80 | 90 | 90 |
| 发明抗体3 | 90 | 90 | 100 | 90 | 90 | 100 |
| 发明抗体4 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 发明抗体1+发明抗体4 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 发明抗体1+发明抗体3 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 对照 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
尽管本发明参考示范性实施方式进行了阐述，本领域技术人员应理解，可以在本发明基础上，进行不脱离本发明范围的各种变换和修改，以及等价替换。因此，本发明并不限于披露的具体实施方式，其是实施本发明的最佳方式，本发明包括所有落在本发明所附权利要求范围内的实施方式。
Claims (20)
1.一种对包含野生型G蛋白的狂犬病毒具有中和活性的结合分子，其中所述结合分子选自下组：
(i)一种结合分子，包含：
a)可变区，根据Kabat方法测定，包含SEQ ID NO:1所示的CDR1区，SEQ ID NO:2所示的CDR2区，和SEQ ID NO:3所示的CDR3区；和
b)可变区，根据Kabat方法测定，包含SEQ ID NO:4所示的CDR1区，SEQ ID NO:5所示的CDR2区，和SEQ ID NO:6所示的CDR3区；
(ii)一种结合分子，包含：
a)可变区，根据Kabat方法测定，包含SEQ ID NO:7所示的CDR1区，SEQ ID NO:8所示的CDR2区，和SEQ ID NO:9所示的CDR3区；和
b)可变区，根据Kabat方法测定，包含SEQ ID NO:10所示的CDR1区，SEQ ID NO:11所示的CDR2区，和SEQ ID NO:12所示的CDR3区；
(iii)一种结合分子，包含：
a)可变区，根据Kabat方法测定，包含SEQ ID NO:13所示的CDR1区，SEQ ID NO:14所示的CDR2区，和SEQ ID NO:15所示的CDR3区；和
b)可变区，根据Kabat方法测定，包含SEQ ID NO:16所示的CDR1区，SEQ ID NO:17所示的CDR2区，和SEQ ID NO:18所示的CDR3区；或
(iv)一种结合分子，包含：
a)可变区，根据Kabat方法测定，包含SEQ ID NO:19所示的CDR1区，SEQ ID NO:20所示的CDR2区，和SEQ ID NO:21所示的CDR3区；和
b)可变区，根据Kabat方法测定，包含SEQ ID NO:22所示的CDR1区，SEQ ID NO:23所示的CDR2区，和SEQ ID NO:24所示的CDR3区。
2.如权利要求1所述的结合分子，其中，所述结合分子包含SEQ ID NO:25所示的可变区，和SEQ ID NO:26所示的可变区。
3.如权利要求1所述的结合分子，其中，所述结合分子包含SEQ ID NO:27所示的可变区，和SEQ ID NO:28所示的可变区。
4.如权利要求1所述的结合分子，其中，所述结合分子包含SEQ ID NO:29所示的可变区，和SEQ ID NO:30所示的可变区。
5.如权利要求1所述的结合分子，其中，所述结合分子包含SEQ ID NO:31所示的可变区，和SEQ ID NO:32所示的可变区。
6.如权利要求2所述的结合分子，其中，所述结合分子包含SEQ ID NO:33所示的重链，和SEQ ID NO:34所示的轻链。
7.如权利要求3所述的结合分子，其中，所述结合分子包含SEQ ID NO:35所示的重链，和SEQ ID NO:36所示的轻链。
8.如权利要求4所述的结合分子，其中，所述结合分子包含SEQ ID NO:37所示的重链，和SEQ ID NO:38所示的轻链。
9.如权利要求5所述的结合分子，其中，所述结合分子包含SEQ ID NO:39所示的重链，和SEQ ID NO:40所示的轻链。
10.如权利要求1-9中任一项所述的结合分子，其中，所述结合分子是抗体。
11.如权利要求1-9中任一项所述的结合分子，其中，所述结合分子是Fab片段、Fv片段、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或人抗体。
12.一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包括
(i)权利要求1-9中任一项所述结合分子；和
(ii)至少一个与权利要求1-9中任一项所述结合分子连接的标签。
13.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1-9中任一项所述结合分子。
14.一种表达载体，所述表达载体中插入了权利要求13所述的核酸分子。
15.一种用于生产能够结合并中和狂犬病毒的所述结合分子的细胞系，所述细胞系为转入了权利要求14所述表达载体的宿主细胞。
16.如权利要求15所述的细胞系，其中，所述宿主细胞选自下组：CHO细胞、F2N细胞、CSO细胞、BHK细胞、Bowes黑色素瘤细胞、HeLa细胞、911细胞、AT1080细胞、A549细胞、HEK293细胞、和HEK293T细胞。
17.一种治疗和预防狂犬病的药物组合物，包括：权利要求1-9中任一项所述结合分子和药学上可接受的赋形剂。
18.一种诊断狂犬病的试剂盒，包括：
a)权利要求1-9中任一项所述的结合分子；和
b)容器。
19.一种治疗和预防狂犬病的试剂盒，包括：
a)权利要求1-9中任一项所述的结合分子；和
b)容器。
20.一种生产能够结合并中和狂犬病毒的结合分子的方法，所述方法包括步骤：
a)培养权利要求15所述的细胞系；和
b)收集所述细胞系中表达的结合分子。
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