KR20150068913A - 광견병 바이러스를 중화시킬 수 있는 결합 분자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 광견병 바이러스를 중화시킬 수 있는 결합 분자에 관한 것으로, 더욱 상세하게 본 발명의 결합 분자는 개, 소, 몽구스, 박쥐, 스컹크, 너구리, 코요테, 여우 및 늑대와 같은 개체에서 유래한 광견병 바이러스를 대상으로 중화하는 능력을 가지고 있으므로, 광범위한 개체에서 유래한 광견병 바이러스에 감염된 환자를 치료하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

광견병 바이러스를 중화시킬 수 있는 결합 분자{A BINDING MOLECULES CAPABLE OF NEUTRALIZING RABIES VIRUS}
본 발명은 광견병 바이러스를 중화시킬 수 있는 결합 분자에 관한 것이다.
광견병(rabies)은 바이러스성 인수공통 감염병이며, 주로 야생 및 애완 동물에 영향을 미칠 뿐 아니라 인간을 포함한 포유류에게 영향을 미쳐 급성 뇌 질환의 원인이 된다. 한 번 발생하면 거의 사망에 이르는 치명적인 질병으로, 에이즈와 더불어 치사율이 가장 높은 질병으로 알려져 있다. 이러한 광견병은 전 세계적으로 퍼져 있으며, 매년 천만 명 이상이 감염 후 치료를 받으며 매년 40,000명에서 70,000명이 사망한다.
광견병은 타액과 피로 전염되는데, 주로 광견병에 감염된 개 또는 고양이 등에 물리게 되면 발병한다. 또한 스컹크, 박쥐 등 대부분의 포유류에 의해 감염될 수 있다.
광견병 바이러스(rabies virus)는 신체의 말단 신경 조직을 통해 뇌신경 조직으로 도달한 뒤 실제 발병 증상을 나타낸다. 원래 인간의 뇌에는 혈액 내 장벽(blood brain barrier)이 존재하여 외부 물질을 차단하기 때문에 바이러스 등이 침투할 수 없으나, 광견병 바이러스는 RVG(rabies virus glycoprotein) 단백질을 통해 혈액 내 장벽을 통과하여 중추신경계(central nervous system) 뇌를 감염시킨다.
초기에는 감기와 비슷한 증상 이외에, 물린 부위에 가려움증이나 열을 느낀다. 광견병이 진행되면서 불안감, 공수증(물 등의 액체를 삼키게 되면 근육이 경련을 일으키고 심한 통증을 느껴 물을 두려워하는 증상), 바람에 대한 두려움(바람이 감각 기관을 과민하게 함), 흥분, 마비, 정신 이상 등의 신경 이상 증상이 나타난다. 또한 햇빛에 과민 반응을 일으키기도 한다. 이러한 증상이 관찰된 지 2-7일 뒤에 전신의 신경이나 근육이 마비를 일으켜 혼수 상태에 빠지고, 결국 호흡 장애로 사망하게 된다.
현재 광견병에 대한 예방 주사는 있으나 치료제는 없는 실정이다. 광견병에 노출된 후의 처치로는 교상 후 치료법 (노출 후 예방요법)이 있다. 교상 후 치료법은 즉각적인 국소 상처 보호와 수동면역을 위한 항체 투여(항-광견병 이뮤노글로블린: 이하 "anti-rabies antibody"라 칭함), 능동 면역을 위한 백신 투여로 이루어 져 있다. 현재 개발된 anti-rabies antibody는 인간 유래 광견병 항체(human derived rabies immunoglobulin: 이하 "HRIG"라 칭함)와 말 유래 광견병 항체(equine derived rabies immunoglobulin: 이하 "ERIG"라 칭함)가 있다. HRIG의 경우 공급이 원활하지 않으며 고가인데다 다클론 항체(polyclonal antibody)여서 단위 무게당 효능이 높지 않다. 또한 인간의 혈액에서 유래한 것이기 때문에 HIV 등 인간 유래 질병의 잠재적 감염 위험성이 높다. ERIG의 경우 HRIG보다 저가이기는 하나 이 역시 원활한 공급이 되지 않고 있고, HRIG 보다도 치료 효율이 낮아 훨씬 높은 용량으로 환자에게 투여된다. 이에 더하여 인간과는 다른 동물인 말에서 유래한 항체이므로 과민증(anaphyaxis)을 일으킬 수 있다. 이와 같이 원활하지 못한 공급과 다클론 항체가 갖는 단점을 극복하고자 광견병 바이러스를 중화시킬 수 있은 단일 항체(monoclonal antibody)의 사용이 제안되었다. 1980년 대에 광견병-바이러스 중화 뮤린 단일 항체가 개발되었으나 (Schumacher CL et al., J. Clin . Invest. Vol. 84, p. 971-975, 1989), 인체 내에서의 짧은 반감기와, 항체에 의한 체내 면역반응의 부재, 인간 항-뮤린 항체의(HAMA ; human anti-mouse antibody)유도 등의 단점으로 인간 환자에 대한 직접적인 투여에는 제한되어 있다.
따라서 효과적인 광견병 치료를 위하여, 혈액에서 유래하지 않아 잠재적 감염에 대한 안전성이 높으며, 배양을 통한 합성으로 대규모 생산 공급이 가능하고, 효능을 갖는 항체만으로 구성되어 균일한 품질 확보와 단위량 당 효능이 높은 인간 단일클론 항체의 개발이 시급한 실정이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 광견병 바이러스에 결합하여 중화 능력을 가지는 결합 분자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 결합 분자에 하나 이상의 태그가 결합된 이뮤노컨쥬게이트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현 벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 발현 벡터가 형질전환된 세포주를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 결합 분자를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 결합 분자를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 결합 분자를 이용한 광견병 진단 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 결합 분자를 이용한 광견병 치료 및 예방 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 세포주를 배양하여 본 발명의 결합 분자를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 결합 분자를 이용한 광견병 바이러스 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하고자, 본 발명의 일 구체예는 광견병 바이러스가 야생형 G 단백질을 포함할 때는 중화활성을 가지나, 광견병 바이러스가 34번 위치의 글리신(Gly)이 발린(Val), 글루타민(Glu) 또는 아르기닌(Arg)으로 돌연변이된 G 단백질을 포함할 때는 중화활성을 가지지 않는 결합 분자를 제공한다. 여기서, 상기 아미노산 위치는 G 단백질의 신호 펩티드(signal peptide)를 제외하고 넘버링한 위치이다. 이하, G 단백질의 아미노산 위치의 넘버링은 이와 동일하다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 결합 분자는 G 단백질의 34번 위치의 글리신(Gly)이 발린(Val), 글루타민(Glu) 또는 아르기닌(Arg)으로 돌연변이된 광견병 탈출 바이러스(Escape virus)를 중화하지 못함을 확인하여 에피토프가 G 단백질의 antigenic site II에 있음을 확인하였다.
일 예로서, 상기 결합 분자는
카바트(Kabat) 방법에 따라,
a) 서열번호 1의 CDR1 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역, 및 서열번호 3의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역; 또는
b) 서열번호 4의 CDR1 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역, 및 서열번호 6의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역
을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
일 예로서, 상기 결합 분자는
카바트(Kabat) 방법에 따라,
a) 서열번호 1의 CDR1 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역, 및 서열번호 3의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역; 및
b) 서열번호 4의 CDR1 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역, 및 서열번호 6의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역
을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
일 예로서, 상기 결합 분자는 서열번호 25의 가변영역 및 서열번호 26의 가변 영역을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
일 예로서, 상기 결합 분자는 서열번호 33의 중쇄 및 서열번호 34의 경쇄를 포함하는 결합 분자일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 광견병 바이러스가 야생형 G 단백질을 포함할 때는 중화활성을 가지나, 광견병 바이러스가 331번 위치의 세린(Ser)이 프롤린(Pro)으로 돌연변이된 G 단백질을 포함할 때는 중화활성을 가지지 않는 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 결합 분자는 G 단백질의 331번 위치의 세린(Ser)이 프롤린(Pro)으로 돌연변이된 광견병 탈출 바이러스(Escape virus)를 중화하지 못함을 확인하여 에피토프가 G 단백질의 antigenic site III에 있음을 확인하였다.
일 예로서, 상기 결합 분자는
카바트(Kabat) 방법에 따라,
a) 서열번호 7의 CDR1 영역, 서열번호 8의 CDR2 영역, 및 서열번호 9의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역; 또는
b) 서열번호 10의 CDR1 영역, 서열번호 11의 CDR2 영역, 및 서열번호 12의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역
을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
일 예로서, 상기 결합 분자는
카바트(Kabat) 방법에 따라,
서열번호 7의 CDR1 영역, 서열번호 8의 CDR2 영역, 및 서열번호 9의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역; 및
서열번호 10의 CDR1 영역, 서열번호 11의 CDR2 영역, 및 서열번호 12의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역
을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
일 예로서, 상기 결합 분자는 서열번호 27의 가변영역 및 서열번호 28의 가변 영역을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
일 예로서, 상기 결합 분자는 서열번호 35의 중쇄 및 서열번호 36의 경쇄를 포함하는 결합 분자일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 광견병 바이러스가 야생형 G 단백질을 포함할 때는 중화활성을 가지나, 광견병 바이러스가 210번 위치의 발린(Val)이 글루탐산(Glu)으로 또는 413번 위치의 글루탐산(Glu)이 아스파르트산(Asp)으로 돌연변이된 G 단백질을 포함할 때는 중화활성을 가지지 않는 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 결합 분자는 G 단백질의 210번 위치의 발린(Val)이 글루탐산(Glu)으로 또는 413번 위치의 글루탐산(Glu)이 아스파르트산(Asp)으로 돌연변이된 광견병 탈출 바이러스(Escape virus)를 중화하지 못함을 확인하여 에피토프가 이제까지 보고된 바 없는 G 단백질의 신규 부위(New site)에 있음을 확인하였다.
상기 G 단백질은 CVS-11의 G 단백질일 수 있으나, 이 균주에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 상기 야생형 G 단백질은 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 예로서, 상기 결합 분자는
카바트(Kabat) 방법에 따라,
a) 서열번호 13의 CDR1 영역, 서열번호 14의 CDR2 영역, 및 서열번호 15의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역;
b) 서열번호 16의 CDR1 영역, 서열번호 17의 CDR2 영역, 및 서열번호 18의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역;
c) 서열번호 19의 CDR1 영역, 서열번호 20의 CDR2 영역, 및 서열번호 21의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역; 및
d) 서열번호 22의 CDR1 영역, 서열번호 23의 CDR2 영역, 및 서열번호 24의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역
으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 가변 영역을 포함하는, 결합 분자일 수 있다.
일 예로서, 상기 결합 분자는
카바트(Kabat) 방법에 따라,
a) 서열번호 13의 CDR1 영역, 서열번호 14의 CDR2 영역, 및 서열번호 15의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역; 및
b) 서열번호 16의 CDR1 영역, 서열번호 17의 CDR2 영역, 및 서열번호 18의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역
을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
일 예로서, 상기 결합 분자는 서열번호 29의 가변영역 및 서열번호 30의 가변 영역을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
일 예로서, 상기 결합 분자는 서열번호 37의 중쇄 및 서열번호 38의 경쇄를 포함하는 결합 분자일 수 있다.
일 예로서, 상기 결합 분자는
카바트(Kabat) 방법에 따라,
a) 서열번호 19의 CDR1 영역, 서열번호 20의 CDR2 영역, 및 서열번호 21의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역; 및
b) 서열번호 22의 CDR1 영역, 서열번호 23의 CDR2 영역, 및 서열번호 24의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역
을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
일 예로서, 상기 결합 분자는 서열번호 31의 가변영역 및 서열번호 32의 가변 영역을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
일 예로서, 상기 결합 분자는 서열번호 39의 중쇄 및 서열번호 40의 경쇄를 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명에 있어서, 이제까지 일반적으로 알려진 광견병 바이러스 G 단백질의 antigenic site 및 아미노산 위치, 에피토프 형태는 표 1과 같다.
광견병 바이러스 G 단백질의 antigenic site 및 아미노산 위치
Antigenic Site Amino acid Epitope Type
1 226-231 Linear
2 34-42, 198-200 Conformational
3 330-338 Conformational
4 251, 264 Linear
한편, 본 발명에 있어서, 가변영역의 CDR은 Kabat 등에 의해 고안된 시스템에 따라 통상적인 방법으로 결정되었다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th), National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 본 발명에 사용된 CDR 결정은 Kabat 방법을 사용했지만, 이외에 IMGT 방법, Chothia 방법, AbM 방법 등 다른 방법에 따라 결정된 CDR을 포함하는 결합분자도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 항체일 수 있다. 또한, 상기 결합 분자는 Fab 절편, Fv 절편, 디아바디(diabody), 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있으나, 이것에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 광견병 바이러스에 결합하는 완전한 인간 항체(fully human antibody)를 제공한다. 본 명세서에서 항체는 최대한 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 무손상(intact) 단일클론 항체, 다클론 항체, 2종 이상의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편을 포함한다. 항체는 특이적인 항원을 인식하고 결합할 수 있는 면역계에 의하여 생성되는 단백질이다. 그 구조적인 면에서, 항체는 통상적으로 4개의 아미노산 쇄(2개의 중쇄 및 2개의 경쇄)로 이루어진 Y-형상의 단백질을 가진다. 각각의 항체는 주로 가변 영역 및 불변 영역의 2개의 영역을 가진다. Y의 팔의 말단 부분에 위치한 가변 영역은 표적 항원에 결합하고 상호작용한다. 상기 가변 영역은 특정 항원 상의 특이적 결합 부위를 인식하고 결합하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. Y의 꼬리 부분에 위치한 불변 영역은 면역계에 의하여 인식되고 상호작용한다. 표적 항원은 일반적으로 다수의 항체 상의 CDR에 의하여 인식되는, 에피토프라고 하는 다수의 결합 부위를 가지고 있다. 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 각각의 항체는 상이한 구조를 가진다. 그러므로, 한 항원은 하나 이상의 상응하는 항체를 가질 수 있다.
아울러 본 발명은 상기 항체의 기능적 변이체를 포함한다. 항체들은 변이체들이 광견병 바이러스 또는 이것의 G 단백질에 특이적으로 결합하기 위해 본 발명의 항체와 경쟁할 수 있다면 본 발명의 항체의 기능적 변이체로 간주된다. 기능적 변이체는 1차 구조적 서열이 실질적으로 유사한 유도체를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, 생체외(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 변형, 화학약품 및/또는 생화학 약품을 포함하며, 이들은 본원 발명의 부모 단일클론 항체에서는 발견되지 않는다. 이와 같은 변형으로는 예를 들어 아세틸화, 아실화, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 가교, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 수산화, 메틸화, 산화, 페길화, 단백질 분해 및 인산화 등이 포함된다. 기능적 변이체는 선택적으로 부모 항체의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입, 결실 또는 그들의 조합을 함유하는 아미노산 서열을 포함하는 항체일 수 있다. 더욱이 기능적 변이체는 아미노 말단 또는 카르복시 말단 중 하나 또는 모두에서 아미노산 서열의 절단체(truncated form)를 포함할 수 있다. 본 발명의 기능적 변이체는 본 발명의 부모 항체와 비교하여 동일하거나 다르거나, 더 높거나 낮은 결합 친화력을 가질 수 있지만, 여전히 광견병 바이러스 또는 이것의 G 단백질에 결합할 수 있다. 일 예로, 골격구조, 초가변(Hypervariable) 영역, 특히 CDR 3 영역을 포함하나 이에 한정되는 것은 아닌 가변 영역의 아미노산 서열이 변형될 수 있다. 일반적으로 경쇄 또는 중쇄 영역은 3개의 CDR 영역을 포함하는, 3개의 초가변 영역 및 더욱 보존된 영역, 즉 골격 영역(FR)을 포함한다. 초가변 영역은 CDR로부터의 아미노산 잔기와 초가변 루프로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 범위에 속하는 기능적 변이체는 본 명세서의 부모 항체와 약 50%~99%, 약 60%~99%, 약 80%~99%, 약 90%~99%, 약 95%~99%, 또는 약 97%~99% 아미노산 서열 동질성을 가질 수 있다. 비교될 아미노산 서열을 최적으로 배열하고 유사하거나 또는 동일한 아미노산 잔기를 정의하기 위해 컴퓨터 알고리즘 중 당업자에게 알려진 Gap 또는 Bestfit 등을 사용할 수 있다. 기능적 변이체는 부모 항체 또는 그것의 일부를 PCR 방법, 올리고머 뉴클레오티드를 이용한 돌연변이 생성 및 부분 돌연변이 생성을 포함하는 공지의 일반 분자생물학적 방법에 의해 변화시키거나 유기합성 방법으로 얻을 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 광견병 바이러스는 개, 소, 몽구스, 박쥐, 스컹크, 너구리, 코요테, 여우 및 늑대로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 개체에서 유래될 수 있으나, 이것에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 상기 결합 분자에 추가적으로 하나 이상의 태그가 결합된 이뮤노컨쥬게이트를 제공한다. 예를 들면, 본 발명에 따른 항체에 약물이 추가로 부착될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 항체는 약제가 결합된 항체-약물 접합체(conjugate)의 형태로 사용될 수 있다. 약물을 국소 전달하기 위해 항체-약물 접합체 (ADC), 즉 면역접합체를 사용하게 되면 상기 약물 모이어티를 감염된 세포에 표적화 전달할 수 있는데, 상기 약물 작용제를 접합시키지 않은 채로 투여하게 되면, 정상 세포에 대해서도 허용될 수 없는 수준의 독성이 야기될 수 있기 때문이다. 약물-연결성 및 약물-방출성뿐만 아니라 폴리클로날 및 모노클로날 항체 (mAb)의 선택성을 높임으로써 ADC의 최대 효능과 최소 독성을 개선할 수 있다.
약물 모이어티를 항체에 부착시키는, 즉 공유 결합을 통하여 연결시키는 통상적인 수단으로는, 일반적으로 약물 모이어티가 항체 상의 수많은 부위에 부착되는 불균질한 분자 혼합물이 유발된다. 예를 들어, 세포독성 약물을 전형적으로, 종종 항체의 수 많은 리신 잔기를 통하여 항체와 접합시켜 불균질한 항체-약물 접합체 혼합물을 생성킬 수 있다. 반응 조건에 따라서, 이러한 불균질한 혼합물은 전형적으로, 약물 모이어티에 부착된 항체 분포도가 0 내지 약 8 이상이다. 또한, 특별한 정수비의 약물 모이어티 대 항체를 수반한 접합체의 각 아군은, 약물 모이어티가 항체 상의 각종 부위에 부착되는 잠재적으로 불균질한 혼합물이다. 항체는 크고, 복잡하며 구조적으로 다양한 생체 분자이고, 종종 많은 반응성 관능기를 갖고 있다. 링커 시약 및 약물-링커 중간체와의 반응성은 pH, 농도, 염 농도 및 조용매와 같은 요인들에 의해 좌우된다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 상기 결합 분자를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 핵산 분자는 본 발명에서 제공하는 항체의 아미노산 서열을 당업자에게 알려진 바와 같이 폴리뉴클레오티드 서열로 번역된 핵산 분자 모두를 포함한다. 그러므로 ORF(open reading frame)에 의한 다양한 폴리뉴클레오티드 서열이 제조될 수 있으며 이 또한 모두 본 발명의 핵산 분자에 포함된다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공한다.
상기 발현 벡터로는 셀트리온 고유의 발현 벡터인 MarEx 벡터(한국특허등록 제10-1076602호 참조) 및 상업적으로 널리 사용되는 pCDNA 벡터, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti 벡터; 코스미드; 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, p1 P22, Qμ, T-even, T2, T3, T7 등의 파아지; 식물 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나에서 선택된 발현 벡터를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 발현 벡터로 알려진 모든 발현 벡터는 본 발명에 사용 가능하며, 발현 벡터를 선택할 때에는 목적으로 하는 숙주 세포의 성질에 따른다. 숙주세포로의 벡터 도입시 인산칼슘 트랜스펙션, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 조절 트랜스펙션, 리포펙타민 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자는 사용하는 발현 벡터 및 숙주 세포에 알맞은 도입 방법을 선택하여 이용할 수 있다. 바람직하게 벡터는 하나 이상의 선별 마커를 함유하나 이에 한정되지 않으며, 선별 마커를 포함하지 않은 벡터도 이용하여 생산물 생산 여부에 따라 선별이 가능하다. 선별 마커의 선택은 목적하는 숙주 세포에 의해 선택되며, 이는 이미 당업자에게 알려진 방법을 이용하므로 본 발명은 이에 제한을 두지 않는다.
본 발명의 결합분자의 정제를 용이하게 하기 위하여 태그 서열을 발현 벡터 상에 삽입하여 융합시킬 수 있다. 상기 태그로는 헥사-히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, myc 태그 또는 flag 태그를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자에게 알려진 정제를 용이하게 하는 태그는 모두 본 발명에서 이용 가능하다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 상기 발현 벡터가 숙주 세포에 형질전환되어, 광견병 바이러스에 결합하여 중화 능력을 가지는 결합 분자를 생산하는 세포주를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포주는 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 상기 포유동물 세포로는 CHO 세포, F2N 세포, CSO 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, HEK 293 세포 및 HEK293T 세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 숙주 세포로 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 포유동물 숙주세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 상기 결합 분자 및 약제학적으로 허용가능한 부형제가 추가적으로 포함된 광견병 치료 및 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 상기 결합 분자 및 약제학적으로 허용가능한 부형제가 추가적으로 포함된 광견병 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 광견병 바이러스 중화 능력을 가지는 결합 분자 이외에 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 당업자에게 이미 잘 알려져 있다.
또한, 본 발명의 예방 및 치료용 조성물은 적어도 하나의 다른 광견병 치료제를 포함할 수 있으며, 또한 여러 종류의 단일클론 항체를 포함할 수 있으며, 이를 통해 중화 활성에 상승 작용을 나타낼 수 있다.
아울러 본 발명의 예방 및 치료용 조성물은 추가로 적어도 하나의 다른 치료제 또는 진단제를 포함할 수 있다. 상기 치료제로는 항-바이러스 약제를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 약제로는 항체, 소분자, 유기 또는 무기 화합물, 효소, 폴리뉴클레오티드 서열, 항-바이러스성 펩티드 등일 수 있다.
본 발명의 예방 및 치료용 조성물은 제조 및 저장 조건하에서 무균하고 안정하며, 전달 시 또는 전달 전에 적절한 약제학적으로 허용 가능한 부형제 중에 재구성을 위해 분말 형태로 존재할 수 있다. 살균성 주사용액 제조를 위한 살균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 구성성분의 분말과 이의 미리 살균-여과된 용액으로부터 추가의 원하는 구성성분을 생산하는 진공 건조 및 동결 건조이다. 본 발명의 조성물은 용액 상태일 수 있고, 적절한 약제학적으로 허용 가능한 부형제가 단위 투여량 주사형을 제공하기 위해 전달되기 전 또는 전달 시에 첨가 및/또는 혼합될 수 있다. 바람직하게 본 발명에 사용되는 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 약물농도에 알맞고, 알맞은 흐름성을 유지할 수 있고, 필요에 따라 흡수가 지연될 수 있다.
본 발명의 예방 및 치료용 조성물 투여의 최적 경로 선택은 조성물 내의 활성 분자들의 물리-화학적 특성, 임상적 상황의 긴급성 및 원하는 치료용 효과에 대한 활성 분자의 플라즈마 농도의 관계를 포함하는 여러 인자들에 의해 영향을 받는다. 예를 들어 본 발명의 단일클론 항체는 임플란트 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는, 조절된 방출 제형과 같은 그들의 신속한 방출을 막은 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 폴리머가 본 발명에 사용될 수 있다. 또한 단일클론 항체는 항체의 불활성화를 막은 물질 또는 화합물로 코팅되거나 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 단일클론 항체는 적합한 담체-리포좀 또는 희석제-와 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 예방 및 치료용 조성물의 투여 방법은 경구 및 비경구로 나뉠 수 있으며, 바람직한 투여 경로는 정맥 내이나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 경구 형태로는 정제, 트로키제, 약용 드롭스제, 수성 또는 유성 현탁제, 산제 또는 분산과립제, 에멀젼제, 강성 캡슐제, 연성 젤라틴 캡슐제, 시럽제 또는 엘릭서제, 필제, 당의정, 액제, 겔제 또는 슬러리제로서 제제화될 수 있다. 이들 제형은 불활성 희석제, 과립화 또는 붕해제, 결합제, 광택제, 보존제, 착색제, 풍미제 또는 감미제, 식물성유 또는 미네랄유, 습윤제 및 점증제를 함유하는 약제학적 부형제를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 비경구 형태로는 수성 또는 비수성 등장성 살균 비독성 주사 또는 주입 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 용액 또는 현탁액은 적용된 투여량 및 농도에서 수용체에 비독성인 1,3-부탄디올, 링거스 용액, 행크스 용액, 등장성 염화나트륨 용액과 같은 약제, 오일, 지방산, 국소마취제, 보존제, 완충액, 점도 또는 용해도 증가제, 수용성 항산화제, 유용성 항산화제 및 금속 킬레이트화제를 포함할 수 있다.
진단용 조성물에 사용되는 본 발명의 결합분자는 검출가능하게 표식되는 것이 바람직하다. 생분자들을 표식시키는데 사용 가능한 다양한 방법들이 당업자에게 잘 알려져 있고, 본 발명의 범주 내에서 고려된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 표식 종류의 예로는 효소, 방사성 동위원소, 콜로이드금속, 형광 화합물, 화학발광 화합물 및 생발광 화합물이 있다. 통상적으로 사용되는 표식들은 형광물질(가령, 플루레신, 로다민, 텍사스 레드 등), 효소(가령, 고추냉이 퍼옥시다아제, β-갈락토시다아제, 알칼리포스파타 아제), 방사성 동위원소(가령, 32P 또는 125I), 바이오틴, 디곡시게닌, 콜로이드 금속, 화학발광 또는 생발광 화합물(가령, 디옥세탄, 루미놀 또는 아크리디늄)을 포함한다. 효소 또는 바이오티닐기의 공유 결합법, 요오드화법, 인산화법, 바이오틴화법 등과 같은 표식 방법들이 당 분야에 잘 알려져 있다. 검출 방법들로는 오토라디오그래피, 형광 현미경, 직접 및 간접 효소반응 등이 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 통상적으로 사용되는 검출 분석법으로는 방사성 동위원소 또는 비-방사성 동위원소 방법이 있다. 이들은 그 중에서도 웨스턴블롯팅, 오버레이-분석법, RIA(Radioimmuno Assay) 및 IRMA(ImmuneRadioimmunometric Assay), EIA(Enzyme Immuno Assay), ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), FIA(Fluorescent Immuno Assay) 및 CLIA(Chemioluminescent Immune Assay)이 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
a) 상기 결합 분자; 및
b) 용기
를 포함하는 광견병 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
a) 상기 결합 분자; 및 b) 용기
를 포함하는 광견병 치료 및 예방용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
a) 대상 시료와 상기 결합 분자를 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 단계 a)의 결과를 분석하여 광견병 감염 여부를 판별하는 단계
를 포함하는 광견병 진단 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
a) 대상 시료와 상기 결합 분자를 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 결합 분자와 대상 시료의 반응을 검출하는 단계
를 포함하는 광견병 진단을 위해 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 대상에게 상기 결합 분자를 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는 광견병 치료 및 예방 방법을 제공한다. 예를 들어, 광견병 위험지역을 여행할 때 본 발명의 인간 모노클로날 항체를 투여함으로써 1일, 2일, 3일 또는 수일 내에 광견병 바이러스에 대한 면역성을 부여할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
a) 상기 세포주를 배양하는 단계; 및
b) 발현된 결합 분자를 회수하는 단계
를 포함하는 광견병 바이러스에 결합하여 중화 능력을 가지는 결합 분자를 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
a) 대상 시료와 상기 결합 분자를 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 결합 분자가 대상 시료에 특이적으로 결합하는지 측정하는 단계
를 포함하는 광견병 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 광견병 바이러스 검출 방법에 있어서, 상기 대상 시료는 (잠재적) 감염 대상으로부터의 혈액, 혈청, 타액, 가래, 침, 땀, 조직 또는 다른 생물학적 물질을 포함하지만, 이에 한정되지 않으며 당업자에게 알려진 통상적인 방법으로 샘플 준비가 가능하다. (잠재적) 감염 대상은 인간 대상일 수 있지만, 또한 광견병 바이러스의 담체로써 의심되는 동물들일 수 있다. 대상 시료는 먼저 그것을 검출 방법에 더 적절하게 만들기 위해 조작될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 결합 분자 또는 이뮤노컨쥬게이트는 결합 분자와 광견병 바이러스 또는 대상 시료에 존재하는 그것의 항원성 성분 사이의 면역학적 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에서 대상 시료와 접촉된다. 대상 시료 내의 광견병 바이러스의 존재를 나타내는 면역학적 복합체의 형성은 적절한 수단에 의해 검출되고 측정된다. 이러한 방법으로 방사면역측정법(RIA), ELISA, 면역형광법, 면역 조직 화학, FACS, BIACORE, 웨스턴 블롯 분석과 같은 면역분석이 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
카바트(Kabat) 방법에 따라,
a) 서열번호 1의 CDR1 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역, 및 서열번호 3의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역, 및 서열번호 4의 CDR1 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역, 및 서열번호 6의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역을 포함하는 결합 분자;
b) 서열번호 7의 CDR1 영역, 서열번호 8의 CDR2 영역, 및 서열번호 9의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역, 및 서열번호 10의 CDR1 영역, 서열번호 11의 CDR2 영역, 및 서열번호 12의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역을 포함하는 결합 분자;
c) 서열번호 13의 CDR1 영역, 서열번호 14의 CDR2 영역, 및 서열번호 15의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역, 및 서열번호 16의 CDR1 영역, 서열번호 17의 CDR2 영역, 및 서열번호 18의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역을 포함하는 결합 분자; 및
d) 서열번호 19의 CDR1 영역, 서열번호 20의 CDR2 영역, 및 서열번호 21의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역, 및 서열번호 22의 CDR1 영역, 서열번호 23의 CDR2 영역, 및 서열번호 24의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역을 포함하는 결합 분자
로 구성된 군으로부터 선택되는 2 이상의 결합 분자를 포함하는 조성물(이하 "칵테일 조성물")을 제공한다.
일 실시예로서, 상기 칵테일 조성물은
카바트(Kabat) 방법에 따라,
a) 서열번호 1의 CDR1 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역, 및 서열번호 3의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역, 및 서열번호 4의 CDR1 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역, 및 서열번호 6의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역을 포함하는 결합 분자; 및
b) 서열번호 7의 CDR1 영역, 서열번호 8의 CDR2 영역, 및 서열번호 9의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역, 및 서열번호 10의 CDR1 영역, 서열번호 11의 CDR2 영역, 및 서열번호 12의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역을 포함하는 결합 분자를 포함할 수 있다.
다른 일 실시예로서, 상기 칵테일 조성물은
카바트(Kabat) 방법에 따라,
a) 서열번호 7의 CDR1 영역, 서열번호 8의 CDR2 영역, 및 서열번호 9의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역, 및 서열번호 10의 CDR1 영역, 서열번호 11의 CDR2 영역, 및 서열번호 12의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역을 포함하는 결합 분자; 및
b) 서열번호 19의 CDR1 영역, 서열번호 20의 CDR2 영역, 및 서열번호 21의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역, 및 서열번호 22의 CDR1 영역, 서열번호 23의 CDR2 영역, 및 서열번호 24의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역을 포함하는 결합 분자를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명에서 사용되는 단어를 아래와 같이 정의한다.
본 발명에서 사용되는 "결합 분자"라는 용어는 키메라, 인간화 또는 인간 단일클론 항체와 같은 단일클론 항체를 포함하는 온전한(intact) 이뮤노글로블린(immunoglobulin), 또는 항원에 결합하는 이뮤노글로믈린, 예를 들면 광견병 바이러스 또는 바이러스 외부의 G 단백질(Glycoprotein) 또는 그의 단편과의 결합을 위해 온전한(intact) 이뮤노글로블린과 경쟁하는 이뮤노글로블린 단편을 포함하는 가변성 도메인을 뜻한다. 구조와는 상관없이 항원-결합 단편은 온전한(intact) 이뮤노글로블린에 의해 인식된 동일한 항원과 결합된다. 항원-결합 단편은 결합 분자의 아미노산 서열의 2개 이상의 연속(contiguous) 아미노산 잔기, 5개 이상의 연속(contiguous) 아미노산 잔기, 10개 이상의 연속(contiguous) 아미노산 잔기, 15개 이상의 연속(contiguous) 아미노산 잔기, 20개 이상의 연속 아미노산 잔기, 25개 이상의 연속 아미노산 잔기, 30개 이상의 연속 아미노산 잔기, 35개 이상의 연속 아미노산 잔기, 40개 이상의 연속 아미노산 잔기, 50개 이상의 연속 아미노산 잔기, 60개 이상의 연속 아미노산 잔기, 70개 이상의 연속 아미노산 잔기, 80개 이상의 연속 아미노산 잔기, 90개 이상의 연속 아미노산 잔기, 100개 이상의 연속 아미노산 잔기, 125개 이상의 연속 아미노산 잔기, 150개 이상의 연속 아미노산 잔기, 175개 이상 연속 아미노산 잔기, 200개 이상의 연속 아미노산 잔기, 또는 250개 이상의 연속 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
항원-결합 단편은 특히 Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일-쇄 항체(scFv), 2가(bivalent) 단일-쇄 항체, 단일-쇄 파지 항체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 폴리펩티드로의 특정 항원에 결합하기에 충분한 이뮤노글로브린의 하나 이상의 단편을 함유하는 폴리펩티드 등을 포함한다. 상기 단편은 합성으로 또는 완전한 이뮤노글로블린의 효소적 또는 화학적 분해에 의해 생성되거나, 재조합 DNA 기술에 의해 유전공학적으로 생성될 수 있다. 생성 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명에서 사용되는 "약제학적으로 허용가능한 부형제"라는 용어는 용인 가능한 또는 편리한 투약 형태를 제조하기 위한 약물, 제제 또는 결합 분자와 같은 활성 분자로 조합되는 불활성 물질을 의미한다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 비독성이거나, 적어도 독성이 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 이의 의도된 용도를 위해 허용될 수 있는 부형제이고, 약물, 제제 또는 결합 분제를 포함하는 제형화의 다른 성분과 양립할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "치료학적으로 유용한 양"이라는 용어는 광견병 바이러스의 노출 전 또는 노출 후에 예방 또는 치료에 유효한 본 발명의 결합 분자의 양을 나타낸다.
본 발명의 발명자들은 건강한 성인 피험자 15명을 대상으로 광견병 백신을 접종한 후 채혈하여 PBMC를 분리하고 상기 분리된 PBMC를 이용하여 파지 디스플레이와 B cell sorting 을 통해 후보 항체들을 선별하였다. 선별된 후보 항체들의 기본 역가를 측정한 후 이 중 일정 이상의 중화능력을 보이는 항체를 대상으로 미국질병관리본부(Center for Disease Control: 이하 "CDC"라 칭함)에서 전세계에 만연한 각 대륙과 동물에 대표적인 광견병 바이러스에 중화 능력을 보인다고 검증된 항체 4종에 대해 in vivo 및 in vitro 실험을 수행하여 다양한 광견병 바이러스를 대상으로 중화 능력 시험을 수행하였으며, 이를 통하여 본 발명의 단일클론 항체가 광범위한 개체에서 유래된 광견병 바이러스에 감염된 환자를 치료하는데 유용하게 이용될 수 있음이 확인되었다.
본 발명의 광견병 바이러스를 중화시킬 수 있는 결합 분자는, 다양한 광견병 바이러스를 대상으로 중화 능력을 보유하고 있음을 확인하였으므로, 광견병 치료 및 예방에 유용하다.
도 1은 본 발명의 중쇄 및 경쇄 유전자를 포함하는 인간 항체 발현 벡터를 도시한 것이다.
도 2는 광견병 바이러스의 G-단백질을 이용한 ELISA 결과를 도시한 것이다.
도 3은 동물 실험에서 SV2 바이러스에 대한 mouse의 생존율을 나타내는 그래프이다
이하 본 발명을 실시예에 따라 상세히 설명한다. 하기의 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명이 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 광견병 바이러스에 특이적인 인간 항체 클론의 선별
실시예 1-1: 광견병 백신 예방접종자의 혈액으로부터 PBMC 분리
본 실시예에서 지원자들은 광견병 예방 백신을 접종한 건강한 성인으로 구성되었으며, 이는 임상시험심사 위원회(IRB)의 승인을 받고 이루어졌다. 지원자들은 다른 전염성 바이러스, 즉 VDRL과 HBsAg 에 대하여 음성 반응을, anti-HCV 항체 및 anti-HIV 항체에 대하여 음성 반응을 보임을 확인하였다. 지원자 중 1년 전 광견병 예방 접종을 했던 사람은 1회, 기존에 예방 접종을 받지 않았던 사람들은 총 3회 접종을 실시하였다. 이때, 예방 접종한 광견병 백신은 Verorab®(Sanofi Pasteur)이었다. 마지막 접종 2주 후에 약 50 ㎖의 전혈을 수득하여 Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare) 방법을 사용하여 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)를 분리하였다.
분리된 PBMC는 인산 완충용액으로 2회 세척한 후 냉동 배지(RPMI (Gibco, cat No: A10491-01):FBS:DMSO=5:4:1)로 1x107 cells/㎖ 농도로 맞추어 액체 질소 탱크(Liquid Nitrogen Tank)에 보관하였다.
실시예 1-2: 항체 디스플레이된 파지 라이브러리( phage library ) 제작
실시예 1-1에서 분리한 PBMC에서 TriReagent (Molecular Research Center)를 이용하여 total RNA를 추출한 후 the SuperScriptTM First-Strand cDNA synthesis system (Invitrogen, USA)을 이용하여 cDNA를 합성하였다.
합성된 cDNA로부터 항체 라이브러리의 제작은 선행문헌을 참고하였다 (Barbas C. et . al. Phage display a laboratory manual. 2001. CSHL Press). 간단히 기술하면, 합성된 cDNA로부터 High fidelity Taq polymerase (Roche)와 degenerative primer set을 이용하여 항체의 경쇄와 중쇄의 가변 영역을 PCR (polymerase chain reaction) 방법으로 증폭하였다. 증폭된 DNA 절편은 1% agarose gel electrophoresis 후 gel extraction kit (Qiagen)를 사용하여 분리하였다. 분리된 가변영역 절편을 주형으로 하여 overlap PCR 방법으로 항체 중쇄와 경쇄의 가변영역을 연결하여 scFv 형태의 유전자로 만들어 증폭한 후 1% agarose gel electrophoresis와 gel extraction kit (Qiagen) 방법을 사용하여 유전자를 분리하였다. 증폭된 scFv 유전자는 미리 도입된 SfiI 제한효소 부위를 SfiI (Roche) 제한 효소로 12시간 절단한 뒤 1% agarose gel electrophoresis와 gel extraction kit (Qiagen) 방법을 사용하여 분리하였다. Phagemid 벡터도 SfiI 제한 효소로 절단하고 분리한 뒤 상기 scFv 유전자와 섞고 T4 DNA ligase (Roche)를 넣은 후 16℃에서 12 시간 반응하였다. 반응액을 ER2738 competent cell (Lucigen)과 섞고 electroporation 방법으로 형질 전환하였다. 형질 전환된 ER2738은 진탕 배양 후 VCSM13 helper phage (Agilent Technologies)를 넣고 12 시간 배양하여 파지 라이브러리(phage library)를 제작하였다.
실시예 1-3: 파지 라이브러리를 이용한 항체의 선별
광견병 바이러스 G 단백질에 결합하는 항체분절을 파지 라이브러리로부터 선별하기 위하여 사용할 광견병 바이러스 G 단백질의 분리는 Laboratory techniques in rabies (4th edition, World Health Organization)를 참조하였다.
간단히 기술하면, 광견병 바이러스를 BHK-21 혹은 Vero 세포에 3,4일간 배양한 후 배양 배지를 얻은 후 초원심분리기를 이용 바이러스를 농축시켰다. 농축된 바이러스는 octyl beta glucopytanoside 화학물을 이용하여 바이러스 표면에 위치한 G 단백질을 분리했다. 분리된 단백질체는 ELISA 등의 방법으로 정량, 정성분석을 하였다.
실시예 1-2에서 제작한 파지 라이브러리 배양액은 원심 분리하여 숙주세포를 제거한 뒤 4% PEG와 0.5 M NaCl을 넣고 9000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 파지를 침강시키고 상층액을 제거하였다. 침강된 파지를 1% BSA/TBS 에 희석하여 항원이 결합된 ELISA 플레이트(plate)에 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응액을 제거한 뒤 ELISA 플레이트를 0.05% tween20가 포함된 PBS로 세척한 뒤 60 ㎕ 의 0.1 M glycine-HCl (pH 2.2)를 넣어 항원에 결합한 파지를 떼어내고 2 M Tris (pH 9.1)를 이용하여 중화하였다. 떼어낸 파지는 ER2738에 감염시킨 뒤 VCSM13 헬퍼 파지(helper phage)를 넣고 배양하여 다음번 패닝(panning)에 사용하였다. 2회 혹은 3회의 패닝 후 후보 항체분절을 선별하였다.
실시예 1-4: 파지 효소 면역분석( phage enzyme immunoassay )
2회의 패닝 후 감염시킨 ER2738의 일부를 헬퍼 파지(helper phage)를 넣기 전에 LB 플레이트에 도말하여 콜로니(colony)를 얻었다. 형성된 콜로니를 배양액에 넣어 진탕 배양하여 OD600이 0.7 이상의 값이 되었을 때 VCSM13 헬퍼 파지를 넣고 37℃에서 12 시간 이상 진탕 배양하였다. 배양액을 원심 분리하여 숙주세포를 제거하고 파지를 포함하는 상등액을 준비하였다.
파지 효소 면역분석(Phage enzyme immunoassay)을 위하여 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 G-단백질을 흡착시킨 뒤 150 ㎕의 3% BSA/PBS를 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 준비한 파지 상층액을 6% BSA/PBS 와 1:1 희석한 뒤 각 웰에 넣고 37℃에서 2시간 동안 정치하였다. 각 웰을 0.05% Tween 20가 포함된 PBS로 3회 세척한 뒤 horseradish peroxidase가 표지 된 항 M13 항체를 넣고 37℃에서 1시간 동안 정치하였다. 각 웰을 0.05% Tween 20가 포함된 PBS로 3회 세척한 뒤 ABTS (2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt)를 넣고 405 nm에서의 흡광도를 측정하여 후보 항체를 선별하였다.
실시예 1-5: FACS 를 이용한 항체의 선별
임상 심사 심의 위원회(IRB)로부터 승인을 받은 후 광견병 백신을 접종 받은 건강한 사람으로부터 50ml 전혈을 채취하였다. 전혈 채취 시기는 백신을 접종 받은 후 7일 이내에 이루어졌으며 Ficoll-Plaque PLUS(GE Helthcare)방법을 이용하여 전혈로부터 PBMC를 분리하였다. 분리된 PBMC는 FACS 방법으로 B세포를 분리하기 전까지 액체 질소 하에 보관하였다.
해동된 PBMC의 항체 발현을 높이기 위해 4개의 싸이토카인(IL-4, IL-6, IL-21, CD40L)이 든 세포 배양 배지에서 37℃의 온도 및 5% CO2 조건에서 5.5일 배양하였다. 배양된 PBMC에서 광견병 바이러스에 특이적인 항체를 발현하는 B세포를 분리하기 위해 유세포분석법을 실시하였다. 유세포 분석법은 FcγR blocker 존재 하에 형광이 표지된 항체 또는 항원으로 PBMC를 표지한 후 유세포 분석기(FACS aria II, BD biosciences)를 이용하여 표지된 세포만을 분리하여 96-well PCR plate(applied biosystems)에 담았다. 표지에 사용된 항체 또는 항원은 다음과 같다.
FACS를 이용한 항체 선별을 위해 표지에 사용된 항원 및 항체
항원 항체 염색
FITC 표지 광견병 바이러스 G 단백질 APC-efluor 780 표지 항 인간 CD3 항체(Ebioscience),
PerCP-Cy5.5 표지 항 인간 CD19 항체(Ebioscience),
PE-Cy7 표지 항 인간 CD27 항체(Ebioscience)		 PI 형광 염색
광견병 바이러스 특이적인 항체를 발현하는 B 세포를 얻기 위하여 FITC 표지 광견병 바이러스 G 단백질을 제작하였다. 위에 전술된 정제된 광견병 바이러스 G 단백질을 Pierce사에서 제작된 FITC 항체 표지 키트(Pierce)를 이용하여 매뉴얼대로 실험하여 FITC 표지 광견병 바이러스 G 단백질을 얻었다.
실시예 1-6: 단일 세포에서의 cDNA 합성 및 항체 유전자의 증폭
96 well plate의 각 well에 분리된 단일 세포에 Invitrogen사에서 제작된 superscript III first strand synthesis system 키트를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성 방법은 kit에서 제공된 매뉴얼대로 시행하였다. 합성된 cDNA로부터 항체 유전자를 얻는 과정은 Thomas Tiller et al(Journal of Immunological Methods, 2008)에서 기술된 방식을 변형하여 진행하였다. 간단히 기술하면, 1차 PCR 과정을 통하여 중쇄와 경쇄 유전자를 PCR을 통하여 증폭하였으며 2차 PCR 과정도 마찬가지로 nested PCR을 통하여 1차 PCR을 통하여 얻은 PCR 산물을 주형으로 하여 중쇄와 경쇄 유전자를 다시 증폭하였다. 증폭된 중쇄와 경쇄 유전자를 agarose 전기영동 후 중쇄 및 경쇄 유전자 크기의 밴드를 확인한 후 블레이드로 절개하고 DNA를 포함하는 agarose 절편을 1.5ml tube에 옮긴 후 PCR 정제 kit(Qiagen)을 사용하여 agarose에서 DNA만을 녹여내어 정제하였다. 정제된 DNA를 중쇄와 카파 경쇄는 Not 1, Age1 제한 효소 처리 후 항체의 일부분이 들어있는 PCDNA3.1 벡터에 클로닝 하였다. 람다 경쇄는 Age1 , Xho1 제한 효소로 처리 후 마찬가지로 항체의 일부분이 들어있는 변형된 PCDNA 3.1 벡터에 클로닝하였다.
실시예 1-7: ELISA 를 이용한 후보 항체의 선별
실시예 1-4, 1-5, 1-6에서 선별된 후보 항체의 유전자를 동물세포 발현 벡터에 넣어 발현시킨 뒤, 배양액으로 분비된 항체를 이용하여 ELISA를 진행하였다. ELISA 플레이트에 광견병 바이러스의 G-단백질을 붙이고 발현된 항체를 넣어주었다. 결합하지 않은 항체를 씻어낸 후 horseradish peroxidase가 결합된 항-인간 항체를 이용하여 항원과 결합한 후보 항체를 선별하였다.
광견병 바이러스의 G-단백질을 이용한 ELISA를 수행한 결과 도 2에서 보는 바와 같이 항원 특이적인 결합을 보이는 후보를 선별할 수 있었다.
실시예 1-8: 바이러스 중화능을 이용한 후보 항체의 선별
실시예 1-7에서 일부 높은 결합특성을 나타내는 약 80 여개의 후보항체들에 대해서 CVS-11을 이용한 기본적인 바이러스 활성 저하 실험을 수행하였다.
이중 일정 이상의 (1000 IU/mg) 역가를 보이는 항체 50 여개를 선별하였다. 이렇게 선별된 항체는 미국질병관리본부(Center for Disease Control: 이하 "CDC"라 칭함)에서 보관중인 전 세계 광견병 바이러스에 대한 RFFIT를 수행하였다. 미국 CDC에서는 전 세계의 약 50 여종에 해당하는 광견병 바이러스를 보유하고 있으며, 바이러스의 리스트는 아래 표 3과 같다. 이중 1차 스크리닝으로 약 6개의 바이러스로 중화능력 시험을 하였으며 결과는 표 4와 같다. Y는 중화능력이 보여지는 항체이며, N은 중화능력이 없는 항체, M은 일부 중화능력이 보이는 항체를 표시하였다.
미국 CDC 보유 광견병 바이러스 리스트
No . 광견병 바이러스 종류 기원
1 CVS-11
2 Mongoose RSA Mongoose, South Africa
3 CASK Skunk, California, USA
4 Dog Tun Dog, Tunisia
5 dog gab Dog, Gabon
6 TXFX Gray fox, TX
7 Dog thai Dog, Thailand
8 Dong son Dog, Mexico
9 Phi 002 Human/dog, Philippines
10 DR MX Bat, Mexico
11 DR Brazil Bat, Brazil
12 phi dog Human/dog, Philippines
13 WA Bat Bat, Washington, USA
14 3860 Bat Bat, California, USA
15 Dog Arg Dog, Argentina
16 TX SK Skunk, Texas, USA
17 RAC Raccoon, Georgia, USA
18 China 2005 Dog, China
19 Rv342 China Cow/dog, China
20 TX Coyote Coyote, Texas, USA
21 rv61 Human (ex dog),United Kingdom(ex India)
22 AL Bat Bat, California, USA
23 LC NY Bat, New York, USA
24 Bat Ef Bat, Pennsylvania, USA
25 C1434 Bat, Alabama, USA
26 ABV (SM 4476) Australia Bat Virus
27 Wu ABLV Australia Bat Lyssa Virus
28 AZ Bat Bat , Arizona
29 VA 399 Bat, Virginia, USA
30 TN 410 Bat, Tennessee, USA
31 TN 132 Bat, Tennessee, USA
32 SK 4384 Skunk, Texas, USA
33 AK FX Arctic Fox, Alaska, USA
34 857r Raccoon dog, Russia, Far East
35 I-148 Dog, India
36 Mongoose PR Mongoose, Puerto-Rico
37 Gray FX-AZ Gray Fox, Arizona, USA
38 NC SK Skunk, Wisconsin, USA
39 323R Dog / Coyote, Texas, USA
40 RVHN Human (ex wolf), Russia, Arctic
41 MI1625 Bat, Tennessee, USA
42 I-151 Dog, India
43 TN-269 Bat, Tennessee, USA
44 Sri Lanka Cow, Sri Lanka
45 Myotis Bat, Washington, USA
미국 CDC에서 수행된 RFFIT 결과 (1차 스크린, 6개 바이러스, 50개 항체)
Virus Gabon
Dog
China
dog 		CASK TN 410
Bat 		I-148
Dog 		3860
CA Bat
mAb
No .
1 Y Y Y M Y Y
2 Y Y Y N Y M
3 Y Y Y Y Y Y
4 Y Y Y Y Y Y
5 Y Y Y Y Y Y
6 Y Y Y Y Y Y
7 Y Y Y Y Y M
8 Y Y Y N N N
9 Y Y Y N Y M
10 Y Y Y Y Y Y
11 M Y Y N Y Y
12 Y M Y 　- 　- 　-
13 Y Y Y 　- 　- 　-
14 Y Y Y Y Y Y
15 Y Y Y M Y Y
16 Y Y Y N Y Y
17 Y Y N N Y Y
18 Y Y N N Y Y
19 Y Y N N Y Y
20 Y Y Y Y Y N
21 　- 　- Y Y Y Y
22 　- 　- Y N Y N
23 　- 　- Y N Y N
24 　- 　- Y N Y N
25 　- 　- Y N Y M
26 　- 　- Y Y Y Y
27 　- 　- Y M Y Y
28 　- 　- Y N Y Y
29 　- 　- Y N Y M
30 　- 　- Y N Y M
31 　- 　- Y N Y N
32 　- 　- Y N Y N
33 　- 　- Y N Y Y
34 　- 　- Y N Y Y
35 　- 　- Y M Y M
36 　- 　- Y N Y Y
37 　- 　- Y N Y M
38 　- 　- M N Y N
39 　- 　- 　- N Y M
40 　- 　- 　- N Y N
41 　- 　- 　- Y Y Y
42 　- 　- 　- Y Y Y
43 　- 　- 　- N M M
44 　- 　- 　- N Y Y
45 　- 　- 　- N Y Y
46 　- 　- 　- N Y M
47 　- 　- 　- N Y Y
48 　- 　- 　- N Y Y
49 　- 　- 　- Y Y Y
50 　- 　- 　- N Y M
이 결과를 바탕으로 15개의 항체가 선별되었으며, 이 항체들은 50 여개의 바이러스 (표 3)를 대상으로 중화능력 시험이 수행되었으며 그 결과는 아래 표 5와 같다.
15개 항체의 중화능력 시험
No. Virus 항체
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1 Dog Tun Dog, Tunisia o o o o o o o o o o o o o o o
2 TXFX Gray fox, TX o o o o o o o o o o o o o o o
3 Dog son Dog, Mexico o o o o o o o o o o o o o o o
4 DR MX TN/MX COW) Bat, Mexico o o o o o o o o o o o o o o o
5 Dog Arg Dog, Argentina o o o o o o o o o o o o x x
6 TX SK Skunk, Texas, USA o o o o o o o o o o o o o o o
7 rv61 Human (ex dog), UK (ex India) o o o o o x o o o o o x o o o
8 857r Raccoon dog, Russia, Far East o o o o o o o o o o o o o o -
9 Phi 002 (231) Human/dog, Philippines o o o o o o o o o o o o o o -
10 WA Bat Bat, Washington, USA o o o o o o o o o o o o o o -
11 LC NY Bat, New York, USA x x x o x x x x x x x x x x x
12 Bat Ef Bat, Pennsyl-vania, USA x o o x o o o o o x o o o x o
13 RAC Raccoon, Georgia, USA x x o o o o o x o o x o o o o
14 TX Coyote Coyote, Texas, USA o o o o o o o o o o x o o o x
15 Mongoose PR Mongoose, Puerto-Rico o o o o o o o o o o o o o x x
16 I-151 Dog, India o o o x o o o o o o o o o o o
17 Gabon dog Dog, Gabon o o o o o o x o o o x o o o o
18 Sri Lanka Cow, Sri Lanka o o o o o o o o o o o o o o o
19 Gray AZ fox Gray Fox, Arizona, USA o o o o o o o o o x x o o o x
20 NC SK Skunk, Wisconsin, USA o o o o o o o o o o o o o o o
21 China dog 2005 Dog, China o o o o o o o o o o o o o o o
22 Dog thai Dog, Thailand o o o o o o o o o o o o o o x
23 phi dog Human/dog, Philippines o o o o o o o o o o o o o x o
24 Rv342 China Cow/dog, China o o o o o o o o o o o o o o o
25 TN-269 Bat, Tennessee USA x x o o o x x o x o x x x x x
26 Wu ABLV Australian bat lyssa, Genotype 7 o o o o o o o o o o o o o o o
27 ABV (SM 4476) Australian bat lyssa, Genotype 7 o o o o o o o o o o o o o o o
28 DR Brazil Bat, Brazil x o o x o o o o x o o o o o x
29 AK FX Arctic Fox, Alaska, USA o o o o o o o o o o o o o o o
30 323R Dog / Coyote, Texas, USA o o o o o o o o o o o o o x x
31 TX SK 4384 Skunk, Texas, USA o o o o o o o o o o o o o o o
32 ERA o o o o o o o o o o o o o o o
33 I-148 Dog, India o o o x o o x o o o o o o x o
34 CASK Skunk, California, USA o o o o o o o o o o o o o x x
35 AZ Bat Bat , Arizona o o o o o x o x o o o o x x x
36 3860 CA Bat Bat, California, USA o o o o o x x o o o o o x o x
37 TN410 Bat, Tennessee, USA x x o o o x x o o o x x x x x
38 AL Bat Bat, California, USA o o o o o o o o o o x o o o o
39 EBLV 1 A09-3484 Genotype 5 o o o o o x x o o o o o o o o
40 EBLV 2 A03-4659 Genotype 6 x o o o o x x o o o x o x o o
41 Duvenhag eGenotype 4 o o o o o x x o o o o x x o x
42 TN 132 Bat, Tennessee, USA x x x o o x x o x x x x x x x
43 Mongoose RSA Mongoose, South Africa o o o o o o o o o o o o o o o
44 Myotis Bat, Washington, USA o o o o o o o o o o o o o o o
45 C1434 Bat, Alabama, USA o o o o x o o o o o o o o o o
46 VA 399 Bat, Virginia, USA x x x o o x x o x o x x x x x
47 MI1625 Bat, Tennessee, USA o o o o o x x o o o x x x x x
이 중에서 항원결합부위와 기본역가를 고려하여 표 5의 3번, 5번, 10번, 11번 4 가지 클론 (이하 각각“이 건 항체 1”, “이 건 항체 2”, “이 건 항체 3”, “이 건 항체 4”라 명명함) 이 선택되었다. 아래 표 6에서 conformational epitope은 3차적인 단백질 구조를 가지고 있는 결합 부위를 의미한다.
최종 선별된 인간 항체 4개의 중화능력과 에피토프
ID ( No .) 중화능력 ( IU / mg ) 에피토프
이 건 항체 1 (표 5의 3번) 7353 3 (Conformational)
이 건 항체 2 (표 5의 5번) 7941 New Site
이 건 항체 3 (표 5의 10번) 5294
이 건 항체 4 (표 5의 11번) 2059 2 (Conformational)
실시예 2: 인간 항체 발현 벡터 제작
확보된 중쇄와 경쇄를 포함하는 PCR2.1 TA 클로닝 벡터에 제한효소 Nhe I과 Pme I을 처리하여 중쇄 유전자와 경쇄 유전자를 확보한 후, 확보된 중쇄 유전자와 경쇄 유전자를 각각 동일한 제한효소로 처리된 pCT145 벡터와 pCT146 벡터에 삽입하였다. pCT145 및 pCT146 벡터는 각각 항체의 중쇄와 경쇄를 클로닝하기 위해 제작된 셀트리온 고유의 벡터이다. 이후, 중쇄 전사단위(프로모터-중쇄 유전자-폴리에이)와 경쇄 전사단위(프로모터-경쇄 유전자-폴리에이)를 같이 포함하는 발현 벡터를 제작하기 위하여, 중쇄 유전자를 포함하는 pCT145 벡터에 제한효소 Pac I과 Asc I을 처리하여 중쇄 전사단위를 확보한 다음, 경쇄 유전자를 포함하는 pCT146 벡터에 동일한 제한효소를 처리하여 중쇄 전사단위를 삽입하였다. 이후 제한효소를 이용하여, 중쇄 전사단위와 경쇄 전사단위를 동시에 포함하는 벡터를 선별하여 pCT188로 명명 하였다(도 1 참조, 한국특허등록 제10-1076602호, 특허권자: ㈜셀트리온). 선별된 벡터는 Endofree plasmid maxi kit(QIAGEN, Germany, 12362)를 이용하여 추출되었으며, 추출된 DNA 중 일부를 이용하여 염기서열 분석을 통해 최종적으로 항체의 염기서열을 확인하였다.
실시예 3: 일시적 형질도입 방법에 의한 인간 항체의 생산
세포 내 일시적 형질도입을 위하여 양이온성 폴리머(cationic polymer)인 FreeStyleTM Max(Invitrogen, 16447-100)를 사용하였으며, 제조사의 사용설명서에 따라 형질도입을 수행하였다. 형질도입 전날, EX-CELL 293 Serum free media(Sigma, 14571C: 이하 "EX-CELL 293 배지"라 기재함)에서 자라는 F2N 세포(한국등록특허 제10-1005967호 참조, 특허권자: ㈜셀트리온)를 원심 분리하여, FreeStyle293 serum free media(Gibco, 12338)로 배지를 교체하였으며, ㎖ 당 0.8×106 개의 세포 농도로 250 ㎖ shaker flask 두 개를 이용하여 50 ㎖씩(총 100 ㎖)접종하였다. 형질 도입 당일 날, 항체 유전자를 포함하는 pCT178 DNA 125 ㎍과 FreeStyleTM Max 시약 125 ㎕를 각각 OptiPRO SFM II (Invitrogen, 12309) 배지를 이용하여 2 ㎖ volume으로 희석한 후, 가볍게 섞어 주었다. 즉시 희석된 FreeStyleTM Max 시약 용액을 DNA가 희석되어 있는 용액에 섞은 다음, 상온에서 17분 반응하였다. 상온에서 17분 반응하는 동안, 형질 도입에 사용할 접종된 F2N 세포의 수를 측정하고, 그 FreeStyle293 배지를 이용하여, 세포 농도를 1.0×106 개가 되도록 희석하였다. 17분 후, DNA와 FreeStyleTM Max 시약 혼합 용액을 F2N 세포에 처리함으로써 형질도입을 진행하였다. 형질도입 다음날, 동량의 EX-CELL 293 배지를 형질도입된 세포에 첨가하여 7일 동안 배양함으로써 단일클론 항체를 생산하였다.
실시예 4: 최종 선별된 인간 단일클론 항체의 중화효능 확인
최종 선별된 4개의 항체는 전세계에 만연한 약 50여개의 광견병 바이러스를 대상으로 in vitro 중화능력 실험을 수행하였으며, 이는 RFFIT를 통해 수행되었다. 그 결과는 표 7에 기재하였다.
인간 단일클론 항체의 RFFIT의 결과
No . virus ID 이 건
항체 1 		이 건
항체 2 		이 건
항체 3 		이 건
항체 4
Working conc.(ug/ml) 0.20
1 Mongoose RSA
Mongoose, South Africa		 Titer 320 280 1000 270
IU/mL 9.1 8.0 28.6 7.7
IU/mg 9143 8000 28571 7714
2 Dog Tun
Dog, Tunisia		 Titer 270 230 280 230
IU/mL 2.7 2.3 2.8 2.3
IU/mg 2700 2300 2800 2300
3 Dog thai
Dog, Thailand		 Titer 1300 1100 1300 320
IU/mL 9.3 7.9 9.3 2.3
IU/mg 9286 7857 9286 2286
4 Dog son
Dog, Mexico		 Titer 1100 390 1000 340
IU/mL 8.8 3.1 8.0 2.7
IU/mg 8800 3120 8000 2720
5 Phi 002 (231)
Human/dog, Philippines		 Titer 250 125 250 250
IU/mL 2.5 1.3 2.5 2.5
IU/mg 2500 1250 2500 2500
6 DR MX
Bat, Mexico		 Titer 180 110 230 250
IU/mL 1.7 1.0 2.2 2.4
IU/mg 1714 1048 2190 2381
7 DR Brazil
Bat, Brazil		 Titer 45 50 50 56
IU/mL 1.8 2.0 2.0 2.2
IU/mg 1800 2000 2000 2240
8 WA Bat
Bat, Washington, USA		 Titer 250 180 270 270
IU/mL 2.0 1.4 2.2 2.2
IU/mg 2000 1440 2160 2160
9 rv61
Human (ex dog),UK(ex India)		 Titer 280 230 270 200
IU/mL 2.4 2.0 2.3 1.7
IU/mg 2435 2000 2348 1739
10 AL Bat
Bat, California, USA		 Titer 1100 1000 540 1100
IU/mL 7.6 6.9 3.7 7.6
IU/mg 7586 6897 3724 7586
11 AZ Bat
Bat , Arizona		 Titer 1300 800 1100 125
IU/mL 11.3 7.0 9.6 1.1
IU/mg 11304 6957 9565 1087
12 phi dog
Human/dog, Philippines		 Titer 280 250 230 75
IU/mL 1.04 0.93 0.85 0.28
IU/mg 5185 4630 4259 1389
13 Rv342 China
Cow/dog, China		 Titer 1300 900 1000 280
IU/mL 2.4 1.6 1.8 0.5
IU/mg 11818 8182 9091 2545
14 TX SK 4384
Skunk, Texas, USA		 Titer 250 145 170 75
IU/mL 0.71 0.41 0.49 0.21
IU/mg 3571 2071 2429 1071
15 AK FX
Arctic Fox, Alaska, USA Failed		 Titer 270 110 75 60
IU/mL 2.00 0.81 0.56 0.44
IU/mg 10000 4074 2778 2222
16 Gray FX-AZ (AZ fox)
Gray Fox, Arizona, USA		 Titer 170 60 125 16
IU/mL 5.67 2.00 4.17 0.53
IU/mg 28333 10000 20833 2667
17 323R
Dog / Coyote, Texas, USA		 Titer 625 280 280 60
IU/mL 3.47 1.56 1.56 0.33
IU/mg 17361 7778 7778 1667
18 RVHN
Human (ex wolf), Russia, Arctic		 Titer 42 40 42 54
IU/mL 0.31 0.30 0.31 0.40
IU/mg 1556 1481 1556 2000
19 TN-269
Bat, Tennessee, USA		 Titer 390 320 360 145
IU/mL 3.12 2.56 2.88 1.16
IU/mg 15600 12800 14400 5800
20 China dog 2005
Dog, China		 Titer 13 9 13 12
IU/mL 0.46 0.32 0.46 0.43
IU/mg 2321 1607 2321 2143
21 TN410
Bat, Tennessee, USA		 Titer 200 125 75 19
IU/mL 5.33 3.33 2.00 0.51
IU/mg 26667 16667 10000 2533
22 Dog Arg
Dog, Argentina		 Titer 170 95 210 145
IU/mL 0.43 0.24 0.53 0.36
IU/mg 2125 1188 2625 1813
23 TX SK 4380
Skunk, Texas, USA		 Titer 70 56 70 50
IU/mL 0.56 0.45 0.56 0.40
IU/mg 2800 2240 2800 2000
24 RAC
Raccoon, Georgia, USA		 Titer 145 75 70 95
IU/mL 1.07 0.56 0.52 0.70
IU/mg 5370 2778 2593 3519
25 TX Coyote
Coyote, Texas, USA		 Titer 170 56 60 56
IU/mL 1.00 0.33 0.35 0.33
IU/mg 5000 1647 1765 1647
26 Mongoose PR
Mongoose, Puerto-Rico		 Titer 56 54 125 54
IU/mL 0.40 0.39 0.89 0.39
IU/mg 2000 1929 4464 1929
27 I-151
Dog, India		 Titer 320 170 480 125
IU/mL 1.88 1.00 2.82 0.74
IU/mg 9412 5000 14118 3676
28 Sri Lanka
Cow, Sri Lanka		 Titer 50 40 65 54
IU/mL 0.40 0.32 0.52 0.43
IU/mg 2000 1600 2600 2160
29 Wu ABLV
Australian bat lyssa, Genotype 7		 Titer 440 540 270 250
IU/mL 0.68 0.83 0.42 0.38
IU/mg 3385 4154 2077 1923
30 ABV (SM 4476)
Australian bat lyssa, Genotype 7		 Titer 210 85 170 54
IU/mL 1.56 0.63 1.26 0.40
IU/mg 7778 3148 6296 2000
31 3860 CA Bat
Bat, California, USA		 Titer 210 56 75 56
IU/mL 1.50 0.40 0.54 0.40
IU/mg 7500 2000 2679 2000
32 Gabon dog
Dog, Gabon		 Titer 170 145 180 65
IU/mL 1.06 0.91 1.13 0.41
IU/mg 5313 4531 5625 2031
33 CVS-11 Titer 250 270 180 70
IU/mL 1.47 1.59 1.06 0.41
IU/mg 7353 7941 5294 2059
34 EBLV 1 A09-3484
Genotype 5		 Titer 540 230 180 56
IU/mL 5.40 2.30 1.80 0.56
IU/mg 27000 11500 9000 2800
35 EBLV 2 A03-4659
Genotype 6		 Titer 280 200 270 54
IU/mL 3.11 2.22 3.00 0.60
IU/mg 15556 11111 15000 3000
36 Duvenhage
Genotype 4		 Titer 180 60 95 13
IU/mL 7.20 2.40 3.80 0.44
IU/mg 36000 12000 19000 2200
37 EBLV 1 A09-3485
Genotype 5		 Titer 180 75 95 50
IU/mL 6.67 2.78 3.52 1.85
IU/mg 33333 13889 17593 9259
38 EBLV 2 A09-3483
Genotype 6		 Titer 125 70 125 50
IU/mL 5.56 3.11 5.56 2.22
IU/mg 27778 15556 27778 11111
39 CASK
Skunk, California, USA		 Titer 54 54 56 50
IU/mL 0.43 0.43 0.45 0.40
IU/mg 2160 2160 2240 2000
40 Bat Ef
Bat, Pennsylvania, USA		 Titer 50 42 50 50
IU/mL 1.05 0.88 1.05 1.05
IU/mg 5263 4421 5263 5263
41 C1434
Bat, Alabama, USA		 Titer 36 14 40 19
IU/mL 0.96 0.37 1.07 0.51
IU/mg 4800 1867 5333 2533
42 VA 399
Bat, Virginia, USA		 Titer 50 50 42 10
IU/mL 2.78 2.78 2.33 0.56
IU/mg 13889 13889 11667 2778
43 TN 132
Bat, Tennessee, USA		 Titer 280 180 170 56
IU/mL 10.00 6.43 6.07 2.00
IU/mg 50000 31243 30357 10000
44 TXFX
Gray fox, TX		 Titer 250 125 110 56
IU/mL 1.85 0.93 0.81 0.41
IU/mg 9259 4630 4074 2074
45 I-148
Dog, India		 Titer 10 11 10 13
IU/mL 0.40 0.44 0.40 0.52
IU/mg 2000 2200 2000 2600
46 LC NY
Bat, New York, USA		 Titer 45 42 50 11
IU/mL 2.14 2.00 2.38 0.52
IU/mg 10714 10000 11905 2619
47 857r
Raccoon dog, Russia, Far East		 Titer 54 56 56 56
IU/mL 2.70 2.80 2.80 2.80
IU/mg 2700 2800 2800 2800
48 NC SK
Skunk, Wisconsin, USA		 Titer 270 250 280 280
IU/mL 2.16 2.00 2.24 2.24
IU/mg 2160 2000 2240 2240
49 MI1625
Bat, Tennessee, USA		 Titer 70 45 50 11
IU/mL 2.50 1.61 1.79 0.39
IU/mg 12500 8036 8929 1964
50 Myotis
Bat, Washington, USA		 Titer 280 280 270 230
IU/mL 2.00 2.00 1.93 1.64
IU/mg 10000 10000 9643 8214
51 ERA Titer 250 60 145 50
IU/mL 1.79 0.43 1.04 0.36
IU/mg 8929 2143 5179 1786
실시예 5: 최종 선별된 인간 단일클론항체의 항원결합부위( antigenic site ) 판별
위의 실험을 통해서 선별된 항체의 항원결합부위(antigenic site)를 알기 위해서 탈출 돌연변이 바이러스(escape mutant virus)를 찾기 위한 실험을 진행하였다.
ml당 106의 감염성을 가지는 CVS-11 바이러스를 96 well 세포 배양 플레이트에 연속적으로 1.5배씩 희석한 후 0.5~1 IU/ml의 항체와 37℃에서 1시간 동안 반응시켜준다. 1시간 반응 후에 2x105cells/ml의 BHK 세포를 넣어주고 3일을 배양하였다. 3일 후에 바이러스는 얻고, 세포를 고정시키고 CVS-11 바이러스가 감염되었는지 Rabies Nucleocapsid protein의 발현을 염색하여 확인하였다(Jenobiotech, 9061). 두 번째 계대(passage)에서는 첫 번째 계대에서 얻은 바이러스에 항체의 양을 늘려 위와 동일한 실험을 반복한다. 각 항체에 대해서 진행된 계대의 정보는 표 8과 같다. 첫 번째 혹은 두 번째 계대에서는 CVS-11가 감염되지 않거나 소량으로 감염된 것으로 확인된 곳에서 얻은 바이러스가 항체를 점차적으로 늘렸음에도 감염이 일어나거나 감염 정도가 증가된 것으로 확인된 바이러스 4~5 clones은 증폭(amplification)한 후 QIAamp Viral RNA Mini kit(QIAGEN, 52904)을 이용하여서 RNA를 분리하였다.
탈출 돌연변이 바이러스 실험
항체 Passage 1 Passage 2 Passage 3 증폭
이 건 항체 4 1 IU/ml 10 IU/ml - 5 clones
이 건 항체 1 1 IU/ml 5 IU/ml 10 IU/ml 4 clones
이 건 항체 3 0.5 IU/ml 2 IU/ml 7 IU/ml 5 clones
RNA를 주형(template)으로 하여 SuperScriptIII First-strand Synthesis system for RT-PCR(Invitrogen, 18080-051)를 이용하여 cDNA를 합성한 후에, Takara ExTaq(Takara, RR001A)으로 증폭한 후에 시퀀싱(sequencing)을 진행하였다. 시퀀싱 결과 각 항체의 에피토프와 변이된 뉴클레오티드 및 아미노산 정보는 표 9와 같다.
이 건 항체 2의 경우는 이 건 항체 3을 통해서 얻은 210번 아미노산에 변이가 있는 Mutant virus를 중화하지 못함을 확인하여 이 건 항체 3과 같이 antigenic site가 New site임을 알 수 있었다.
항체 대한 항원 결합 부위 확인 결과
항체 에피토프 뉴클레오티드 변이 아미노산 변이 아미노산 위치*
이 건 항체 4 II GGA->GTA Gly(G)->Val(V) 34
GGA->GAA Gly(G)->Glu(E) 34
GGA->AGA Gly(G)->Arg(R) 34
이 건 항체 1 III TCA-> CCA Ser(S)->Pro(P) 331
이 건 항체 3 New site GTG->GAG Val(V)->Glu(E) 210
GAG->GAT Glu(E)->Asp(D 413
* 상기 아미노산 위치는 광견병 바이러스 G 단백질의 신호 펩티드(Signal peptide)를 제외하고 넘버링한 위치임
실시예 6: CR4098 항체로 생성된 탈출바이러스에 대한 중화능력 확인
실시예 6-1. CR4098 항체에 대한 탈출바이러스 생성
CR4098 항체(Crucell)에 대한 DNA 서열은 특허(US7579446 참조)와 NCBI (National Center for Biotechnology Information) database로부터 확보하였고 엔지노믹스 (대전시 유성구 소재)에서 합성하여 pCT146 발현 벡터(실시예 2 참고)에 클로닝 후 Celltrion으로 전달되었다. 합성된 부분의 서열은 제한효소 절단 분석과 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다. CR4098 항체는 실시예 3에서와 같이 F2N78 세포주에서 단기생산 방식으로 생산하였다.
이후 CR4098을 이용하여 해당 항체에 대한 탈출 돌연변이 바이러스(escape mutant virus)를 생성하기 실험을 진행하였다.
ml당 106의 감염성을 가지는 CVS-11 바이러스를 96 well 세포 배양 플레이트에 연속적으로 1.5배씩 희석한 후 10~40 IU/ml의 CR4098 항체와 37℃에서 1시간 동안 반응시켜준다. 1시간 반응 후에 2x105cells/ml의 BHK 세포를 넣어주고 3일을 배양한다. 3일 후에 바이러스는 얻고, 세포를 고정시키고 CVS-11 바이러스가 감염되었는지 Rabies Nucleocapsid protein의 발현을 염색하여 확인하였다(Jenobiotech, 9061). 두 번째 계대(passage)에서는 첫 번째 계대에서 얻은 바이러스에 CR4098 항체의 양을 늘려 위와 동일한 실험을 반복한다. 첫 번째 혹은 두 번째 계대에서는 CVS-11가 감염되지 않거나 소량으로 감염된 것으로 확인된 곳에서 얻은 바이러스가 CR4098 항체를 점차적으로 늘렸음에도 감염이 일어나거나 감염 정도가 증가된 것으로 확인된 바이러스 4~5 clones은 증폭(amplification)한 후 QIAamp Viral RNA Mini kit(QIAGEN, 52904)을 이용하여서 RNA를 분리하였다.
RNA를 주형(template)으로 하여 SuperScriptIII First-strand Synthesis system for RT-PCR(Invitrogen, 18080-051)를 이용하여 cDNA를 합성한 후에, Takara ExTaq(Takara, RR001A)으로 증폭한 후에 시퀀싱(sequencing)을 진행하였다. 시퀀싱 결과 CR4098 항체에 대한 탈출 변이 바이러스의 변화된 시퀀스는 N336K에서 보였다.
실시예 6-2. CR4098 항체로 생성된 탈출바이러스에 대한 중화능력 실험
CR4098 항체로 생성된 탈출바이러스(N336K)에 대하여, 본 발명의 항체가 중화능력이 있는지 확인하였다.
중화능력 실험 결과, 본 발명의 모든 항체는 CR4098 항체 탈출바이러스(N336K)에 중화효력을 보였으며, 오직 CR4098 항체만 중화능력이 없음을 확인하였다.
CR4098 항체로 생성된 탈출바이러스에 대한 중화능력 실험 결과
Virus 항체 IU/mg
CR4098 mutant
(N336K)		 CR4098 All infection
이 건 항체 4 1352
이 건 항체 1 3081
이 건 항체 3 2336
실시예 7: 이 건 항체의 인도 분리 광견병 바이러스에 대한 중화 능력 시험
7-1. in - vitro 실험
이 건 항체 1, 3, 4, Mix 1 (이 건 항체 1 + 이 건 항체 4), Mix 2 (이 건 항체 1 + 이 건 항체 3) 를 이용하여 인도에서 창궐한 표 11의 wild type 바이러스로 중화 능력시험(RFFIT)을 하였다, 실험 진행은 인도신경과학센터 (National Institute Mental Health and Science : NIMHANS) 에서 수행하였다. 각 항체는 약 1 ug 의 농도로, 아래 각 바이러스의 100 FFD50 로 Neuro 2 a cell에서 실험을 진행하였다. RFFIT 결과는 다섯 가지 항체 모두에서 각 바이러스에 대해 중화능력을 보였다.
인도에서 창궐한 광견병 바이러스
바이러스 약칭 바이러스가 분리된 동물 바이러스가 분리된 지역
SV1 Dog Kerala, India
SV2 Dog Kerala, India
SV3 Human Karnataka, India
SV4 Human Karnataka, India
SV5 Dog Chennai, Tamilnadu ,India
SV6 Dog Chennai, Tamilnadu, India
7-2. in - vivo 실험
위의 In vitro 실험에 이어서 mouse에서 in vivo 실험을 진행하였고, 표 12에 나타낸 바와 같이 각 동물실험 군에서 모든 항체는 높은 중화능력을 나타내었다. 각 동물 실험군에는 마우스 10마리씩 사용이 되었으며, 사용된 바이러스는 100 LD50 (in 0.1 mL) 이 사용되었다. 바이러스 접종 후 (근육 주사) 3시간 뒤에 각 항체 (약 1 ug) 를 동일한 곳(근육 주사)에 접종을 하였으며, 이 후 생존율은 30일까지 관찰되었다. 도 3은 동물 실험에서 총 여섯 가지 바이러스 중 (SV1~SV6) SV2 바이러스에 대한 mouse의 생존율을 나타내는 그래프이다.
본 동물실험에서 SV1~SV6 바이러스의 각각에 해당되는 생존율은 표 12와 같다.
동물실험을 통한 이 건 항체의 인도 분리 광견병 바이러스에 대한 중화능력 시험
SV1 SV2 SV3 SV4 SV5 SV6
이 건 항체 1 80 90 90 80 90 90
이 건 항체 3 90 90 100 90 90 100
이 건 항체 4 100 100 100 100 100 100
이 건 항체 1 +
이 건 항체 4		 100 100 100 100 100 100
이 건 항체 1 +
이 건 항체 3		 100 100 100 100 100 100
Control 0 0 0 0 0 0
지금까지 예시적인 실시 태양을 참조하여 본 발명을 기술하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며, 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구범위의 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
<110> CELLTRION INC. <120> A BINDING MOLECULES CAPABLE OF NEUTRALIZING RABIES VIRUS <130> CPD2014033KR <160> 81 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11B6 heavy chain CDR1 <400> 1 Arg Arg Arg Asp Tyr Trp Gly 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11B6 heavy chain CDR2 <400> 2 Ser Phe Phe His Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11B6 heavy chain CDR3 <400> 3 His Pro Ser Thr Pro Phe Ala Glu Tyr Leu Leu Leu Pro Asp Ala Phe 1 5 10 15 Asp Ser <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11B6 light chain CDR1 <400> 4 Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Ser Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11B6 light chain CDR2 <400> 5 Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11B6 light chain CDR3 <400> 6 Gln Gln Tyr Ser Asp Trp Pro 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cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 960 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1020 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1080 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1140 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1200 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1260 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1320 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1380 tga 1383 <210> 76 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NP-19-9 light chain <400> 76 gagctcgtga tgacgcagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180 aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatattg caacatatta ctgtcaacag tatgataatc tcccccttac tttcggccct 300 gggaccaaag tggatatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645 <210> 77 <211> 1383 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NP-19-11 heavy chain <400> 77 gaggtgcagc tggtggagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatgatg tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaggggtaa cacaaagtat 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240 atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagccaaa 300 tcccacccgt attatgattt ttggagtggg tactatgtcc ccggggcttt tgatatctgg 360 ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca gcttccacca agggcccatc ggtcttcccc 420 ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcag ccctgggctg cctggtcaag 480 gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg 540 cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc 600 gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc 660 aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca 720 ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 780 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 840 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 900 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 960 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1020 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1080 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1140 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1200 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1260 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1320 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1380 tga 1383 <210> 78 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NP-19-11 light chain <400> 78 gagctccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa cttggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180 aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatattg caacatatta ctgtcaacag tatgataatc tccctccaac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645 <210> 79 <211> 1383 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NP-19-35 heavy chain <400> 79 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatgatg tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaggggtaa cacaaagtat 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240 atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagccaaa 300 tcccacccgt attatgattt ttggagtggg tactatgtcc ccggtgcttt tgatatctgg 360 ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc 420 ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcag ccctgggctg cctggtcaag 480 gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg 540 cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc 600 gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc 660 aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca 720 ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 780 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 840 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 900 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 960 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1020 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1080 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1140 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1200 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1260 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1320 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1380 tga 1383 <210> 80 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NP-19-35 light chain <400> 80 gagctcgtga tgactcagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180 aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatattg caacatatta ctgtcaacag tatgataatc tccctccaac tttcggcgga 300 gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645 <210> 81 <211> 524 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CVS-11 strain G protein <400> 81 Met Val Pro Gln Val Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Gly Phe Ser Leu 1 5 10 15 Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro 20 25 30 Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val 35 40 45 Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Glu Phe Ser Tyr Met Glu 50 55 60 Leu Lys Val Gly Tyr Ile Ser Ala Ile Lys Val Asn Gly Phe Thr Cys 65 70 75 80 Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr 85 90 95 Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala 100 105 110 Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu 115 120 125 Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val 130 135 140 Arg Thr Thr Lys Glu Ser Leu Ile Ile Ile Ser Pro Ser Val Thr Asp 145 150 155 160 Leu Asp Pro Tyr Asp Lys Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Gly Gly 165 170 175 Lys Cys Ser Gly Ile Thr Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His 180 185 190 Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Arg Thr Pro Cys 195 200 205 Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Asn Lys 210 215 220 Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly 225 230 235 240 Ala Cys Arg Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp 245 250 255 Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asp Glu Thr Lys Trp Cys Pro 260 265 270 Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu 275 280 285 His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Lys Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp 290 295 300 Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu 305 310 315 320 Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile 325 330 335 Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg 340 345 350 Thr Trp Asn Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Lys Val Gly Gly 355 360 365 Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu 370 375 380 Gly Pro Asp Gly His Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu 385 390 395 400 Gln Gln His Met Glu Leu Leu Lys Ser Ser Val Ile Pro Leu Met His 405 410 415 Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Glu Gly Asp Glu Ala Glu 420 425 430 Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val Tyr Lys Gln Ile Ser Gly 435 440 445 Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Met Thr Ala 450 455 460 Gly Ala Met Ile Gly Leu Val Leu Ile Phe Ser Leu Met Thr Trp Cys 465 470 475 480 Arg Arg Ala Asn Arg Pro Glu Ser Lys Gln Arg Ser Phe Gly Gly Thr 485 490 495 Gly Arg Asn Val Ser Val Thr Ser Gln Ser Gly Lys Val Ile Pro Ser 500 505 510 Trp Glu Ser Tyr Lys Ser Gly Gly Glu Ile Arg Leu 515 520

Claims (33)

  1. 광견병 바이러스가 야생형 G 단백질을 포함할 때는 중화활성을 가지나, 광견병 바이러스가 34번 위치의 글리신(Gly)이 발린(Val), 글루타민(Glu) 또는 아르기닌(Arg)으로 돌연변이된 G 단백질을 포함할 때는 중화활성을 가지지 않는 결합 분자.
  2. 광견병 바이러스가 야생형 G 단백질을 포함할 때는 중화활성을 가지나, 광견병 바이러스가 331번 위치의 세린(Ser)이 프롤린(Pro)으로 돌연변이된 G 단백질을 포함할 때는 중화활성을 가지지 않는 결합 분자.
  3. 광견병 바이러스가 야생형 G 단백질을 포함할 때는 중화활성을 가지나, 광견병 바이러스가 210번 위치의 발린(Val)이 글루탐산(Glu)으로 또는 413번 위치의 글루탐산(Glu)이 아스파르트산(Asp)으로 돌연변이된 G 단백질을 포함할 때는 중화활성을 가지지 않는 결합 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 G 단백질은 CVS-11의 G 단백질임을 특징으로 하는 결합 분자.
  5. 제4항에 있어서, 상기 야생형 G 단백질은 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 결합 분자.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는
    카바트(Kabat) 방법에 따라,
    a) 서열번호 1의 CDR1 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역, 및 서열번호 3의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역; 및
    b) 서열번호 4의 CDR1 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역, 및 서열번호 6의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역
    을 포함함을 특징으로 하는 결합 분자.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 결합 분자는
    카바트(Kabat) 방법에 따라,
    a) 서열번호 7의 CDR1 영역, 서열번호 8의 CDR2 영역, 및 서열번호 9의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역; 및
    b) 서열번호 10의 CDR1 영역, 서열번호 11의 CDR2 영역, 및 서열번호 12의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역
    을 포함함을 특징으로 하는 결합 분자.
  8. 제3항에 있어서,
    상기 결합 분자는
    카바트(Kabat) 방법에 따라,
    a) 서열번호 13의 CDR1 영역, 서열번호 14의 CDR2 영역, 및 서열번호 15의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역; 및
    b) 서열번호 16의 CDR1 영역, 서열번호 17의 CDR2 영역, 및 서열번호 18의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역
    을 포함함을 특징으로 하는 결합 분자.
  9. 제3항에 있어서,
    상기 결합 분자는
    카바트(Kabat) 방법에 따라,
    a) 서열번호 19의 CDR1 영역, 서열번호 20의 CDR2 영역, 및 서열번호 21의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역; 및
    b) 서열번호 22의 CDR1 영역, 서열번호 23의 CDR2 영역, 및 서열번호 24의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역
    을 포함함을 특징으로 하는 결합 분자.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 결합 분자는 서열번호 25의 가변영역 및 서열번호 26의 가변 영역을 포함함을 특징으로 결합 분자.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 결합 분자는 서열번호 27의 가변영역 및 서열번호 28의 가변 영역을 포함함을 특징으로 결합 분자.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 결합 분자는 서열번호 29의 가변영역 및 서열번호 30의 가변 영역을 포함함을 특징으로 결합 분자.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 결합 분자는 서열번호 31의 가변영역 및 서열번호 32의 가변 영역을 포함함을 특징으로 결합 분자.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 결합 분자는 서열번호 33의 중쇄 및 서열번호 34의 경쇄를 포함함을 특징으로 결합 분자.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 결합 분자는 서열번호 35의 중쇄 및 서열번호 36의 경쇄를 포함함을 특징으로 결합 분자.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 결합 분자는 서열번호 37의 중쇄 및 서열번호 38의 경쇄를 포함함을 특징으로 결합 분자.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 결합 분자는 서열번호 39의 중쇄 및 서열번호 40의 경쇄를 포함함을 특징으로 결합 분자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 분자는 항체인 것을 특징으로 하는 결합 분자.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 분자는 Fab 절편, Fv 절편, 디아바디(diabody), 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인 것을 특징으로 하는 결합 분자.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 광견병 바이러스는 개, 소, 몽구스, 박쥐, 스컹크, 너구리, 코요테, 여우 및 늑대로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 개체에서 유래된 것을 특징으로 하는 결합 분자.
  21. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 결합 분자에 추가적으로 하나 이상의 태그가 결합된 이뮤노컨쥬게이트.
  22. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 결합 분자를 암호화하는 핵산 분자.
  23. 제22항의 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터.
  24. 제23항의 발현 벡터가 숙주 세포에 형질전환되어, 광견병 바이러스에 결합하여 중화 능력을 가지는 결합 분자를 생산하는 세포주.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 CHO 세포, F2N 세포, CSO 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, HEK 293 세포 및 HEK293T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세포주.
  26. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 결합 분자 및 약제학적으로 허용가능한 부형제가 추가적으로 포함된 광견병 치료 및 예방용 약학적 조성물.
  27. a) 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 결합 분자; 및
    b) 용기
    를 포함하는 광견병 진단용 키트.
  28. a) 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 결합 분자; 및
    b) 용기
    를 포함하는 광견병 치료 및 예방용 키트.
  29. a) 대상 시료와 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 결합 분자를 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 단계 a)의 결과를 분석하여 광견병 감염 여부를 판별하는 단계
    를 포함하는 광견병 진단 방법.
  30. a) 대상 시료와 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 결합 분자를 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 결합 분자와 대상 시료의 반응을 검출하는 단계
    를 포함하는 광견병 진단을 위해 정보를 제공하는 방법.
  31. 대상에게 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 결합 분자를 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계
    를 포함하는 광견병 치료 및 예방 방법.
  32. a) 제24항의 세포주를 배양하는 단계; 및
    b) 발현된 결합 분자를 회수하는 단계
    를 포함하는 광견병 바이러스에 결합하여 중화 능력을 가지는 결합 분자를 생산하는 방법.
  33. a) 대상 시료와 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 결합 분자를 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 결합 분자가 대상 시료에 특이적으로 결합하는지 측정하는 단계
    를 포함하는 광견병 바이러스를 검출하는 방법.
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