CN113874081A - 高-亲和力抗-mertk抗体及其用途 - Google Patents

高-亲和力抗-mertk抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开提供了特异性结合至Mer酪氨酸激酶(MERTK；例如，人MERTK)的抗体(例如，人源化抗体)和包含这些抗体的组合物。本发明公开还提供了抗体‑药物缀合物，其包含(i)本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗‑MERTK抗体或其抗原‑结合片段和(ii)直接缀合至所述抗体或者通过接头缀合至所述抗体的细胞毒性剂，和包含这些抗体‑药物缀合物的组合物。本发明公开还提供了治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的人受试者施用(a)本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗‑MERTK抗体或其抗原‑结合片段，或者(b)抗体‑药物缀合物，所述抗体‑药物缀合物包含(i)特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗‑MERTK抗体或其抗原‑结合片段，和(ii)直接缀合至所述抗体或者通过接头缀合至所述抗体的细胞毒性剂。

Description

高-亲和力抗-MERTK抗体及其用途
1.技术领域
本发明申请主张2019年2月26日提交的美国临时专利申请No 62/810,841的权益，该专利申请以其全部内容作为参考并入本文。
本发明申请作为参考并入了与本发明申请一起提交的序列表，该序列表为处于ASCII格式的文本文件，标题为“13256-008-228_SEQ_LISTING.txt”，创建于2020年2月19日并且大小为94,274字节。
本发明公开提供了特异性结合至Mer酪氨酸激酶(MERTK；例如，人MERTK)的抗体(例如，人源化抗体)和包含这些抗体的组合物。本发明公开还提供了抗体-药物缀合物，其包含(i)本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段和(ii)直接缀合至所述抗体或者通过接头缀合至所述抗体的细胞毒性剂，和包含这些抗体-药物缀合物的组合物。本发明公开还提供了治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的人受试者施用(a)本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，或者(b)抗体-药物缀合物，所述抗体-药物缀合物包含(i)特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，和(ii)直接缀合至所述抗体或者通过接头缀合至所述抗体的细胞毒性剂。
2.背景技术
Mer酪氨酸激酶(MERTK)，也称为c-聚体、MER、原癌基因c-聚体、受体酪氨酸激酶MerTK、酪氨酸-蛋白激酶Mer STK激酶、RP38或MGC133349，它是受体酪氨酸激酶的TAM家族成员，其还包括AXL和TYRO3激酶。MERTK通过经由配体(最值得注意地，Gas-6，可溶性蛋白)结合的激活，从细胞间隙转导信号。结合至MERTK的Gas-6诱导其胞内域上的MERTK的自磷酸化，从而导致下游信号激活(Cummings CT等人,(2013)Clin Cancer Res 19:5275-5280；Verma A等人,(2011)Mol Cancer Ther 10:1763-1773)。
MERTK以膜结合和可溶性形式两者存在。可以切割胞外域以产生可溶性胞外域，其假设起到诱骗受体的作用以通过降低可溶性Gas-6配体结合膜-结合的MERTK的能力和/或可用性来负调控细胞上的MERTK受体的激活(Sather S等人,(2007)Blood 109:1026-1033)。因此，MERTK具有与癌症发展、血管生成和转移有关的双重作用。一方面，内皮细胞上MERTK的Gas-6激活导致共培养系统中通过癌细胞的内皮细胞招募的抑制。内皮细胞招募是使得肿瘤血管生成、肿瘤生长和转移的癌细胞的关键特征。转移性乳腺癌细胞上MERTK的下调还显示抑制内皮细胞招募(Png KJ等人,(2012)Nature 481:190–194)。然而，另一方面，MERTK在癌细胞中起相反作用，其中它的过表达导致了转移提高，这可能是通过释放切割的MERTK以产生可溶性MERTK胞外域蛋白作为诱骗受体所造成的。另外，癌细胞上配体-依赖性MERTK激活刺激致癌通路，包括AKT通路(Linger RM,Cohen RA,Cummings CT,Sather S,Migdall-Wilson J,Middleton DH,Lu X,Barón AE,Franklin WA,Merrick DT,JedlickaP,DeRyckere D,Heasley LE,Graham DK.Mer or Axl receptor tyrosine kinaseinhibition promotes apoptosis,blocks growth and enhances chemosensitivity ofhuman non-small cell lung cancer(Oncogene.2013Jul 18；32(29):3420-31)。因此，肿瘤细胞过表达MERTK以促进致癌信号转导。另外，肿瘤细胞分泌可溶性形式的胞外MERTK受体，其起到诱骗受体的作用以降低可溶性Gas-6配体激活内皮细胞上MERTK的能力(和/或可用性)，最终导致内皮细胞招募、血管生成和癌症发展(Png KJ等人,(2012)Nature 481:190–194)。
MERTK还参与调节巨噬细胞体内平衡和抗炎病况的维持。在巨噬细胞上，MERTK介导了凋亡细胞的吞噬清除以及IL-10和急性炎性细胞因子的释放，它们的表达受到Gas6-依赖性MERTK结合的刺激(Zizzo等人,(2012)J.Immunology Oct 1；189(7):3508-20；Cook等人,J Clin Invest.2013；123(8):3231-3242)。
在历史上，由于认为MERTK仅作为致癌基因起作用，因此对于产生用于治疗癌症的MERTK抑制剂(例如，化合物UNC1062，它是作为抗癌化合物开发的有效的小分子MERTK抑制剂)投入了工作(Liu J等人,(2013)Eur J Med Chem 65:83–93；Cummings CT等人,(2013)Clin Cancer Res 19:5275-5280；Verma A等人,(2011)Mol Cancer Ther 10:1763-1773)。近年来，抗体-药物缀合物(ADC)已成为最快速发展的癌症治疗种类之一(Beck A等人,(2017)Nat Rev Drug Discov 16:315-337；Peters C and Brown S,(2015)Biosci Rep35:art:e00225)。
本文中对参考文献的引用不应视为承认这些参考文献是本发明公开的现有技术。
3.发明内容
本文公开了以高亲和力特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体及其抗原结合片段。在本文所描述的任何抗体或其抗原结合片段的具体实施方式中，所述抗体特异性识别MERTK(例如，人MERTK)的胞外域，并且所述胞外域包含SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)并且导致MERTK从细胞表面内化。在具体的实施方式中，抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段阻断Gas-6引起的AKT磷酸化。在另一个具体的实施方式中，抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段防止MERTK激活。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段特异性识别人MERTK的胞外部分。在另一个具体的实施方式中，抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段减少了癌细胞的集落形成。在具体的实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体或抗原-结合片段是单克隆。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段是包含两条相同的轻链和两条相同的重链的免疫球蛋白。在具体的实施方式中，抗-MERTK抗体是人源化抗体。
在具体的实施方式中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方式中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含SEQID NO：107所示的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方式中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含SEQID NO：108所示的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方式中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含SEQID NO：110所示的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含(a)包含SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH和(b)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VL。在另一个实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含(a)包含SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH和(b)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VL。在另一个实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含(a)包含SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VH和(b)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VL。在另一个实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含(a)包含SEQ IDNO：109所示的氨基酸序列的VH和(b)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VL。在另一个实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含(a)包含SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VH和(b)包含SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列的VL。
在某些实施方式中，本文所提供的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体包含重链恒定区或轻链恒定区或两者。在一些实施方式中，所述重链恒定区选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2组成的人免疫球蛋白组。在某些实施方式中，所述轻链恒定区选自由IgGκ和IgGλ组成的人免疫球蛋白组。在一些实施方式中，所述抗体包含对一种或多种人Fcγ受体具有提高的结合亲和力的恒定区。
在一些实施方式中，所述抗体包含对一种或多种人Fcγ受体具有降低的结合亲和力的恒定区。
在其中所述抗体是包含两条相同的轻链和两条相同的重链的免疫球蛋白的实施方式的具体实施方式中，每条重链包含可变区(VH)，所述可变区(VH)包含SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列。在该具体实施方式的一个其它实施方式中，每条轻链包含可变区(VL)，所述可变区(VL)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸。
在其中所述抗体是包含两条相同的轻链和两条相同的重链的免疫球蛋白的实施方式的具体实施方式中，每条重链包含可变区(VH)，所述可变区(VH)包含SEQ ID NO：107所示的氨基酸。在该具体实施方式的一个其它实施方式中，每条轻链包含可变区(VL)，所述可变区(VL)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列。
在其中所述抗体是包含两条相同的轻链和两条相同的重链的免疫球蛋白的实施方式的具体实施方式中，每条重链包含可变区(VH)，所述可变区(VH)包含SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列。在该具体实施方式的一个其它实施方式中，每条轻链包含可变区(VL)，所述可变区(VL)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列。
在其中所述抗体是包含两条相同的轻链和两条相同的重链的免疫球蛋白的实施方式的具体实施方式中，每条重链包含可变区(VH)，所述可变区(VH)包含SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列。在该具体实施方式的一个其它实施方式中，每条轻链包含可变区(VL)，所述可变区(VL)包含SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列。
在其中所述抗体是包含两条相同的轻链和两条相同的重链的免疫球蛋白的实施方式的具体实施方式中，每条重链包含可变区(VH)，所述可变区(VH)包含SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列。在该具体实施方式的一个其它实施方式中，每条轻链包含可变区(VL)，所述可变区(VL)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列。
在其中所述抗体是包含两条相同的轻链和两条相同的重链的免疫球蛋白的实施方式的具体实施方式中，所述轻链包含可变区(VL)，所述可变区(VL)包含SEQ ID NO：106。
在其中所述抗体是包含两条相同的轻链和两条相同的重链的免疫球蛋白的实施方式的具体实施方式中，所述轻链包含可变区(VL)，所述可变区(VL)包含SEQ ID NO：111。
在其中所述抗体是包含两条相同的轻链和两条相同的重链的免疫球蛋白的实施方式的具体实施方式中，所述重链包含可变区(VH)，所述可变区(VH)包含SEQ ID NO：105。
在其中所述抗体是包含两条相同的轻链和两条相同的重链的免疫球蛋白的实施方式的具体实施方式中，所述重链包含可变区(VH)，所述可变区(VH)包含SEQ ID NO：107。
在其中所述抗体是包含两条相同的轻链和两条相同的重链的免疫球蛋白的实施方式的具体实施方式中，所述重链包含可变区(VH)，所述可变区(VH)包含SEQ ID NO：108。
在其中所述抗体是包含两条相同的轻链和两条相同的重链的免疫球蛋白的实施方式的具体实施方式中，所述重链包含可变区(VH)，所述可变区(VH)包含SEQ ID NO：109。
在其中所述抗体是包含两条相同的轻链和两条相同的重链的免疫球蛋白的实施方式的具体实施方式中，所述重链包含可变区(VH)，所述可变区(VH)包含SEQ ID NO：110。
在本文所提供的任何抗体或其抗原结合片段的具体实施方式中，其中所述抗体是包含两条相同的轻链和两条相同的重链的免疫球蛋白，所述抗体或其抗原结合片段包含来源于人的恒定区。在该具体实施方式的一个其它实施方式中，所述重链恒定区具有选自gamma1、gamma2、gamma3和gamma4的同种型。
在本文所提供的任何抗体或其抗原结合片段的具体实施方式中，所述抗体以约1nM至15nM(例如，6.5nM至8nM)的范围内的EC50结合细胞上的MERTK(例如，人MERTK)。
在本文所提供的任何抗体或其抗原结合片段的具体实施方式中，所述抗体或抗原-结合片段降低了癌细胞(例如，黑素瘤细胞系SKMEL5)上MERTK的表达水平。在本文所提供的任何抗体或其抗原结合片段的另一个具体实施方式中，所述抗体或抗原-结合片段降低了人M2巨噬细胞上MERTK的表达水平。在本文所提供的任何抗体或其抗原结合片段的另一个具体实施方式中，所述抗体或抗原-结合片段降低了体外分化的人M2巨噬细胞上MERTK的水平。
在本文所提供的任何抗体或其抗原结合片段的具体实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含来源于人的恒定区。在该具体实施方式的一个其它实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化免疫球蛋白。
在本文所提供的任何抗体或其抗原结合片段的具体实施方式中，其中所述抗体不是单克隆抗体或者包含两条相同的轻链和两条相同的重链的免疫球蛋白，所述抗体或其抗原结合片段是双重特异性抗体。
在另一个方面，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的免疫球蛋白，其包含(i)包含SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个方面，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的免疫球蛋白，其包含(i)包含SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个方面，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的免疫球蛋白，其包含(i)包含SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个方面，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的免疫球蛋白，其包含(i)包含SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个方面，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的人源化免疫球蛋白，其包含：
(A)(i)包含SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)包含SEQ IDNO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区；或者
(B)(i)包含SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)包含SEQ IDNO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区，或者
(C)(i)包含SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)包含SEQ IDNO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区，或者
(D)(i)包含SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)包含SEQ IDNO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体是IgG。在一些实施方式中，本文所提供的抗原-结合片段是Fab、F(ab')2或scFv片段。
在另一个方面，本文提供了结合至MERTK(例如，人MERTK)的嵌合抗体或其抗原-结合片段。在一些实施方式中，所述嵌合抗体包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：110所示的氨基酸。在一些实施方式中，所述嵌合抗体包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：111所示的氨基酸。在具体的实施方式中，所述嵌合抗体包含SEQ ID NO：110所示的VH和SEQ ID NO：111所示的VL。
在另一个具体的实施方式中，所述抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO：112、114、115、116或117所示的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，特异性结合MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO：113或118所示的氨基酸。在另一个具体的实施方式中，抗-MERTK抗体包含：
包含SEQ ID NO：112所示的氨基酸的重链和包含SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列的轻链；或者
包含SEQ ID NO：114所示的氨基酸的重链和包含SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列的轻链；或者
包含SEQ ID NO：115所示的氨基酸的重链和包含SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列的轻链；或者
包含SEQ ID NO：116所示的氨基酸的重链和包含SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列的轻链；或者
包含SEQ ID NO：117所示的氨基酸的重链和包含SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列的轻链。
在某些实施方式中，抗-MERTK抗体是双重特异性抗体，其包含两个不同的抗原结合区，其中一个结合区特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)并且另一个结合区结合至目标抗原(例如，免疫细胞受体、检查点受体或肿瘤-相关抗原)。
在具体的实施方式中，结合至MERTK的结合区包含本文所述的z10、z11或z13抗体的可变区(例如，下文表11、12和13中所述的那些)。在一些具体的实施方式中，所述双重特异性抗体的另一个结合区结合至CD3。在其它具体的实施方式中，所述双重特异性抗体的另一个结合区结合至PD-L1。在其它具体的实施方式中，所述双重特异性抗体的另一个结合区结合至LRP1。在其它具体的实施方式中，所述双重特异性抗体的另一个结合区结合至LPR8。在其它具体的实施方式中，所述双重特异性抗体的另一个结合区结合至TGF-β。在其它具体的实施方式中，所述双重特异性抗体的另一个结合区结合至ICOS。在其它具体的实施方式中，所述双重特异性抗体的另一个结合区结合至CD40。在其它具体的实施方式中，所述双重特异性抗体的另一个结合区结合至NKGD2。在其它具体的实施方式中，所述双重特异性抗体的另一个结合区结合至TIGIT。在具体的实施方式中，结合至CD40的结合区是激动性抗体。在另一个具体的实施方式中，结合至ICOS的结合区是激动性抗体。在另一个具体的实施方式中，结合至PD-L1的结合区是阻断抗体。
在另一个实施方式中，本文提供了结合至与本文所描述的抗-MERTK抗体相同的MERTK(例如，人MERTK)表位的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段(例如，人源化或人抗体或其抗原-结合片段)。在另一个实施方式中，本文提供了与本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段竞争与MERTK(例如，人MERTK)的结合的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段(例如，人源化或人抗体或其抗原-结合片段)。在另一个具体的实施方式中，本文提供了与本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段竞争与MERTK(例如，人MERTK)的结合的第一抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中由于在存在本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的情况下，所述第一抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段与MERTK(例如，人MERTK)的结合降低了大于80％(例如，85％、90％、95％或98％或者80％至85％、80％至90％、85％至90％或者85％至95％之间)，因此显示出竞争。在具体的实施方式中，结合至与MERTK相同的表位(或者竞争与抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的结合)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段不是鼠科抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，在如本文所描述的测定中，本文所提供的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体的EC50在约1nM至10nM的范围内。在一些实施方式中，抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段特异性结合至人MERTK。在具体的实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段不结合或不明显结合至人Axl、人Tyro3或鼠MERTK，如通过其中所描述的或者本领域技术人员已知的测定所评价的。在一些实施方式中，抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段结合至人MERTK和食蟹猴MERTK。在具体的实施方式中，本文所提供的抗体是分离的。在具体的实施方式中，本文所提供的抗体是单克隆抗体。在具体的实施方式中，本文所提供的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段是二价的并且能够结合至两个MERTK分子(例如，人MERTK分子)。
在另一个方面，本文提供了编码抗体或其抗原-结合片段的多核苷酸序列。在具体的实施方式中，本文提供了包含编码重链可变区的核酸分子的多核苷酸序列，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122或SEQ ID NO：123所示的核酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含编码轻链可变区的核酸分子的多核苷酸序列，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO：120或者SEQ ID NO：124所示的核酸序列。在具体的实施方式中，分离了所述核酸分子或多核苷酸序列。
在另一个方面，本文提供了包含编码本文所描述的抗体或抗原-结合片段的多核苷酸序列的载体。在某些实施方式中，载体(例如，分离的载体)包含编码本文所描述的抗-MERTK抗体的重链可变区和/或轻链可变区或者重链和/或轻链的多核苷酸。在某些实施方式中，宿主细胞包含多核苷酸或载体。宿主细胞的实例包括大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、酵母、293F、CHO、YB/20、NS0、PER-C6、HEK-293、HEK-293T、NIH-3T3、HeLa、BHK、Hep G2、SP2/0、R1.1、B-W、L-M、COS1、COS 7、BSC1、BSC40、BMT10细胞、植物细胞、昆虫细胞和组织培养中的人细胞。在具体的实施方式中，本文提供了生产特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的方法，其包括培养宿主细胞，从而表达所述多核苷酸并且产生所述抗体。
在另一个方面，本文提供了含有编码本文所描述的任何抗体或其抗原结合片段或者本文所描述的任何免疫球蛋白的一个或多个多核苷酸的离体细胞。在具体的实施方式中，离体细胞含有编码选自下列的抗体的一个或多个多核苷酸：
第一免疫球蛋白，其包含(i)包含SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区；
第二免疫球蛋白，其包含(i)包含SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区；和
第三免疫球蛋白，其包含(i)包含SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区；
第四免疫球蛋白，其包含(i)包含SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的重链区，和(ii)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区；和
第五免疫球蛋白，其包含(i)包含SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)包含SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个方面，本文提供了含有编码本文所描述的任何抗体重链的多核苷酸的离体细胞。
在另一个方面，本文提供了含有编码本文所描述的任何抗体轻链的多核苷酸的离体细胞。在另一个方面，本文提供了生产抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在使得细胞表达一个或多个多核苷酸以生产通过所述多核苷酸所编码的抗体或其抗原-结合片段的条件下培养含有编码本文所描述的任何抗体或抗原结合片段的一个或多个多核苷酸的离体细胞。在具体的实施方式中，生产抗体或其抗原结合片段的方法包括培养含有编码选自下列的抗体的一个或多个多核苷酸的离体细胞：
第一免疫球蛋白，其包含(i)包含SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区；
第二免疫球蛋白，其包含(i)包含SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区；
第三免疫球蛋白，其包含(i)包含SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区；
第四免疫球蛋白，其包含(i)包含SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的重链区，和(ii)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区；和
第五免疫球蛋白，其包含(i)包含SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)包含SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列的轻链可变区，
所述方法是在使得所述细胞表达所述一个或多个多核苷酸以生产所述多核苷酸所编码的抗体的条件下进行的。
在另一个方面，本文提供了生产抗体重链的方法，其包括在使得细胞表达多核苷酸以生产通过所述多核苷酸所编码的抗体重链的条件下培养含有编码本文所描述的任何抗体重链的多核苷酸的离体细胞。
在另一个方面，本文提供了生产抗体轻链的方法，其包括在使得细胞表达多核苷酸以生产通过所述多核苷酸所编码的抗体轻链的条件下培养含有编码本文所描述的任何抗体轻链的多核苷酸的离体细胞。
在另一个方面，本文提供了抗体-药物缀合物，其包括：(a)作为特异性结合MERTK(例如，人MERTK)的抗体或其抗原结合片段的本文所描述的抗体部分；(b)一个或多个药物部分，每个药物部分为细胞毒性剂；和(c)任选地接头；其中所述细胞毒性剂直接缀合至所述抗体部分或者通过所述接头缀合至所述抗体部分。
在具体的实施方式中，所述抗体部分与所述药物部分的摩尔比在1:1至1:12之间。
在具体的实施方式中，所述抗体部分与所述药物部分的摩尔比在1:1至1:8之间。
在另一个具体的实施方式中，所述抗体部分与所述药物部分的摩尔比在1:3至1:5之间。
在另一个具体的实施方式中，所述抗体部分与所述药物部分的摩尔比为1:9。
在具体的实施方式中，所述抗体-药物缀合物包含接头并且所述接头是可切割接头。
在另一个具体的实施方式中，所述抗体-药物缀合物包含接头并且所述接头是非可切割接头。
在另一个具体的实施方式中，所述抗体-药物缀合物包含接头并且所述接头是马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄基氧基羰基(也称为“mc-vc-PABC”)(对于mc-vc-PABC的结构；参见图13A)。在另一个具体的实施方式中，所述抗体-药物缀合物包含接头并且所述接头是CL2(对于CL2的结构，参见图13B和Cardillo等人2011,Clin Cancer Res；17(10)；3157–69)。在另一个具体的实施方式中，所述抗体-药物缀合物包含接头并且所述接头是CL2A(对于CL2A的结构，参见图13B和Goldberg等人2018,Oncotarget；9(48)；28989-29006和Cardillo等人2011,Clin Cancer Res；17(10)；3157–69)。
在具体的实施方式中，所述细胞毒性剂是小分子、核苷酸、肽或非抗体蛋白质。在该具体实施方式的一个其它实施方式中，所述细胞毒性剂是小分子。
在另一个具体的实施方式中，所述细胞毒性剂为奥瑞他汀、美登素、吡咯并苯二氮卓、吲哚啉并苯二氮卓、卡里奇霉素(calicheamicin)、喜树碱类似物、倍癌毒素、微管蛋白抑制剂、微管溶素(tubulysin)或微管溶素(tubulysin)类似物、amberstatin269、多柔比星、抗生素、蒽环类抗生素、微管抑制剂、斯考他汀(spliceostatin)或者泰抑素(thailanstatin)。在该具体实施方式的一个其它实施方式中，所述细胞毒性剂为一甲基奥瑞他汀E(MMAE)或一甲基奥瑞他汀F(MMAF)。在这种具体实施方式的另一种其它实施方式中，所述细胞毒性剂为DM1或DM4。在这种具体实施方式的另一种其它实施方式中，所述细胞毒性剂为SN-38。
在另一个方面，本文提供了生产其中不存在接头的本文所描述的抗体-药物缀合物的方法，所述方法包括：(a)将细胞毒性剂直接缀合至抗体部分以产生抗体-药物缀合物；和(b)纯化所述抗体-药物缀合物。
在另一个方面，本文提供了生产其中抗体-药物缀合物包含接头的本文所描述的抗体-药物缀合物的方法，所述方法以所述顺序包括以下步骤：(a)将所述接头直接缀合至抗体部分以产生接头-抗体部分；(b)将所述接头-抗体部分的接头直接缀合至细胞毒性剂以产生抗体-药物缀合物；和(c)纯化所述抗体-药物缀合物。
在另一个方面，本文提供了生产其中抗体-药物缀合物包含接头的本文所描述的抗体-药物缀合物的方法，所述方法以所述顺序包括以下步骤：(a)将所述接头直接缀合至细胞毒性剂以产生接头-细胞毒性剂部分；(b)将所述接头-细胞毒性剂部分的接头直接缀合至抗体部分以产生抗体-药物缀合物；和(c)纯化所述抗体-药物缀合物。
在另一个方面，本文提供了包含本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或者本文所描述的抗体-药物-缀合物的药物组合物。在具体的实施方式中，本文提供了包含治疗有效量的本文所描述的任何抗体或抗原结合片段或者本文所描述的任何抗体-药物缀合物的药物组合物。在具体的实施方式中，药物组合物包含：
第一免疫球蛋白，其包含(i)包含SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区；
第二免疫球蛋白，其包含(i)包含SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区；
第三免疫球蛋白，其包含(i)包含SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区，
第四免疫球蛋白，其包含(i)包含SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的重链区，和(ii)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区；或者
第四免疫球蛋白，其包含(i)包含SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区，
和药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，药物组合物包含含有编码抗体或其抗原-结合片段的核酸序列的多核苷酸序列。
在另一个方面，本文提供了治疗对其有需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或者本文所描述的抗体-药物缀合物。在具体的实施方式中，本文提供了治疗对其有需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所描述的任何药物组合物。
在一些实施方式中，在根据本文所述的方法治疗之前，对来自所述受试者的肿瘤样品评价磷酸化MERTK的过表达。在某些实施方式中，如果肿瘤样品过表达磷酸化MERTK，则治疗所述受试者。
在治疗癌症的方法的上述方面的具体实施方式中，所述癌症是头颈癌、肺癌、乳腺癌、骨癌、卵巢癌、胃癌、胰癌、喉癌、食管癌、睾丸癌、肝癌、腮腺癌、胆道癌、结肠癌、直肠癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌或甲状腺癌。在这种具体实施方式的某些实施方式中，所述癌症是乳腺癌。在这种某种实施方式的其它实施方式中，所述癌症是三阴性乳腺癌。
在治疗癌症的方法的上述方面的具体实施方式中，所述癌症是肉瘤、鳞状细胞癌、黑素瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、胃癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌或卡波氏肉瘤。在治疗癌症的方法的方面的具体的实施方式中，所述癌症是白血病或淋巴瘤。在其它具体实施方式中，所述癌症是急性髓性白血病。在另一个其它具体实施方式中，所述癌症是急性淋巴细胞性白血病。在另一个其它实施方式中，所述癌症是多发性骨髓瘤。
在具体的实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症过表达MERTK，与组成型活性的MERTK(例如，人MERTK)有关或两者。在另一个具体的实施方式中，所述癌症的癌性细胞过表达磷酸化MERTK。
在治疗癌症的方法的具体实施方式中，所述方法还包括向所述受试者施用其它治疗剂。
在其中所述方法还包括向受试者施用其它治疗剂的实施方式的具体实施方式中，所述其它治疗剂用于治疗癌症。所述其它治疗剂可以在与抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或抗体-药物缀合物相同的药物组合物或者在不同的药物组合物中施用。
在其中所述其它治疗剂用于治疗癌症的实施方式的具体实施方式中，所述其它治疗剂是用于治疗乳腺癌的试剂、用于治疗黑素瘤的试剂、免疫疗法或血管生成抑制剂。在该具体实施方式的一个其它实施方式中，所述其它治疗剂是用于治疗乳腺癌的试剂，其选自：他莫昔芬、雷洛昔芬、紫杉醇、环磷酰胺、多西他赛、长春碱、氟尿嘧啶、依维莫司、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-美坦新、帕妥珠单抗和二对甲苯磺酸拉帕替尼。在这种具体实施方式的另一种其它实施方式中，所述其它治疗剂是用于治疗黑素瘤的试剂，其选自BRAF抑制剂、MEK抑制剂和达卡巴嗪。在这种具体实施方式的另一种其它实施方式中，所述其它治疗剂是阻断免疫检查点信号转导的试剂。在另一个其它实施方式中，所述其它治疗剂是抗-CTLA-4抗体、抗-PD-1抗体或抗-PD-L1抗体。在这种具体实施方式的另一种其它实施方式中，所述其它治疗剂是血管生成抑制剂，其选自VEGF抑制剂、VEGFR2抑制剂、舒尼替尼和索拉非尼。
在治疗癌症的方法的具体实施方式中，所述受试者是人。
在具体的实施方式中，本文提供了抗体-药物缀合物，其包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，其中所述VH包含SEQ ID NO：105所示的序列的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列，其中所述抗体部分通过mc-vc-PABC接头连接至MMAE。在另一个具体的实施方式中，本文提供了抗体-药物缀合物，其包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，其中所述VH包含SEQ ID NO：105所示的序列的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列，其中所述抗体部分通过CL2A接头连接至SN-38。
在某些实施方式中，所述抗体-药物缀合物包含作为免疫球蛋白的抗体部分。在一些实施方式中，所述抗体-药物缀合物包含其中所述抗体部分是免疫球蛋白并且所述免疫球蛋白包含人恒定区的抗体部分。
4.附图说明
图1.使用表面等离子共振(SPR)测量的人源化抗-MERTK抗体和嵌合抗-MERTK抗体的解离速率(Kd)的确定。
图2.3种人源化抗-MERTK抗体(z10、z11和z13)和嵌合抗-MERTK抗体(xAb)的蛋白纯化总结。
图3A–图3B.图3A.通过黑素瘤细胞表达的人MERTK的z10抗体结合亲和力的流式细胞术分析。图3B.z10抗体与人胞外MERTK的结合的SPR测量。
图4A–4D.z10抗体特异性结合至人MERTK(图4A)，如使用ELISA的亲和力结合测定中所测量的。然而，z10抗体不结合至人Axl的胞外域(图4B)、人Tyro 3(图4C)或鼠MERTK(图4D)，如使用ELISA在亲和力结合测定中所评价的。将人MERTK、人Axl和鼠MERTK的胞外域缀合至IgG Fc域并在ELISA中使用。
图5A-5B.z10抗体诱导癌细胞(具体地SKMEL5细胞)上的人MERTK的降解。在通过免疫印迹分析评价人MERTK的水平之前，将SKMEL5细胞与不同浓度的z10抗体培育24小时(图5A)或者与0.3μg/mL的所述抗体培育不同的时间段(图5B)。
图6A-6B.z10抗体在体外分化的人M2巨噬细胞上降解人MERTK。用0.3μg/mL z10抗体或对照IgG体外处理M2巨噬细胞，并且在通过免疫印迹分析评价人MERTK的水平之前将所述细胞培育不同的时间段。图6A提供了免疫印迹结果并且图6B提供了人MERTK对于微管蛋白的相对定量。
图7A-7B.通过SKMEL5细胞的人MERTK的内化介导了人MERTK的降解。将SKMEL5细胞与均用pHrodo标记的对照IgG或z10抗体一起培育，所述pHrodo仅在低pH条件下，例如通过溶酶体中的吸收是可测量的。使用可商购的MERTK抗体测量了表面人MERTK。图7A显示了随时间的荧光并且图7B是代表性图象。
图8A-8C.z10抗体阻断了人癌细胞中AKT的Gas6-诱导的磷酸化。在与200nM Gas6培育10分钟之前，将SKMEL5细胞与0.3μl/mL的z10抗体或对照IgG一起培育2小时。图8A显示了免疫印迹结果，图8B显示了人MERTK相对于微管蛋白的量，并且图8C显示了磷酸化AKT对于微管蛋白的量。
图9A-9D.z10抗体抑制人癌细胞的集落形成。该图显示相对于将500个SKMEL5细胞与对照IgG培养12天时所观察到的集落数目，在将500个SKMEL5细胞在存在0.3μg/mL或1μg/mL的z10抗体的情况下培养12天后，所观察到的集落数目降低。图9A显示了与0.3μg/mL z10抗体或对照IgG抗体培育12天之后的癌细胞的集落形成。图9B显示了与1μg/mL z10抗体或对照IgG抗体培育12天之后的癌细胞的集落形成。图9C显示了与0.3μg/mL z10抗体或对照IgG抗体培育12天之后所形成的集落数目。图9D显示了与1μg/mL z10抗体或对照IgG抗体培育12天之后所形成的集落数目。
图10.z10抗体在M2巨噬细胞和CD14+单核细胞中诱导了细胞因子反应。
图11A和11B。z10抑制癌细胞的体外存活。在存在IgG对照或z10的情况下培养1,000个RPMI8226多发性骨髓瘤细胞(图11A)或200个SKMEL5黑素瘤细胞(图11B)。在第6天(RPMI8226)或第4天(SKMel5)，使用CellTiter-Glo 2.0细胞存活力测定评价存活力。
图12A和12B.MDA-MB-231-LM2：z10裸抗体抗-肿瘤效力。将50,000个MDA-MB-231-LM2 TNBC细胞注入NSG小鼠的尾静脉。在肿瘤细胞接种当天开始治疗，在研究期间每周i.p.两次。图12A使用IVIS成像显示了MDA-MB-231LM2三阴乳腺癌细胞的肺定殖。图12B定量了MDA-MB-231LM2三阴乳腺癌细胞的肺定殖。*表示p-值小于0.05。
图13A和13B.图13A显示了缀合至抗体(Ab)的马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄基氧基羰基-一甲基奥瑞他汀E(mc-vc-PABC-MMAE)的结构。图13B显示了通过CL2或CL2A接头缀合至抗体(Ab)的SN-38的结构。“Ab”代表抗体，通过举例而不是限制，其可以是z10或对照IgG。CL2接头具有组织蛋白酶B切割位点(参见图13B，当AA为苯丙氨酸-赖氨酸时)，而CL2A接头没有组织蛋白酶B切割位点(参见图13B，当AA为赖氨酸时)。
图14A和14B显示了尺寸-排阻高压液相色谱的结果，其测量了通过mc-vc-PABC接头缀合至MMAE的z10(z10-MMAE，参见图13A，其中Ab为z10)(图14A)和通过CL2A接头缀合至SN-38的z10(z10-SN-38，参见图13B，其中Ab为z10且AA为赖氨酸)(图14B)的纯度。
图15:z10-ADC以类似于z10的Kd结合至MERTK。图15提供了z10-ADC的结合亲和力数据。在添加至预涂覆了hMER重组蛋白的ELISA板之前，分别用0.3nM z10、z10-MMAE或z10-SN-38平衡hMER重组蛋白(Mer-Fc缀合物)(50nM-0.05nM)。使用AP-缀合的抗-人IgG第二抗体检测抗体结合并使用GloMax酶标仪展开。
图16A和16B.图16A和16B显示在与z10、z10-MMAE或z10-SN-38培育后，通过SKMel5细胞使MERTK内化(图16A)且MERTK降解(图16B)。z10、z10-MMAE和z10-SN-38将MERTK降解至类似程度。将SKMel5细胞与6.7nM pHrodo-标记的z10、z10-MMAE或z10-SN-38一起培育。pHrodo信号仅在低pH条件下，例如通过溶酶体中的吸收是可测量的。用BV421-缀合的MERTK抗体对表面MERTK染色。通过流式细胞术测量结合。
图17A-17E.z10-MMAE和z10-SN-38杀死表达MERTK的癌细胞。将SKMel5(图17A)或RPMI8226(图17B)细胞与IgG对照、通过mc-mv-PABC接头缀合至MMAE的IgG对照(IgG-MMAE，参见图13A，其中Ab为IgG)或者z10-MMAE一起培育7天。使用CellTiterGlo测量细胞存活力。将SKMel5(图17C)或者RPMI8226(图17D)细胞与IgG对照、通过CL2A接头缀合至SN-38的IgG对照(IgG-SN-38，参见图13B，其中Ab为IgG且AA为赖氨酸)或者z10-SN-38在指定浓度培育7天。使用CellTiterGlo测量细胞存活力。图17E显示了从SKMel5或RPMI8226细胞制备的完整细胞裂解液的免疫印迹分析。
图18A和18B.z10-MMAE抑制了MDA-MB-231-LM2 TNBC细胞的肺定殖。图18A使用IVIS成像显示了MDA-MB-231-LM2三阴乳腺癌细胞的肺定殖。图18B定量了MDA-MB-231-LM2三阴乳腺癌细胞的肺定殖。将50,000个MDA-MB-231-LM2 TNBC细胞注入NSG小鼠的尾静脉。在肿瘤细胞接种当天开始治疗，并且通过生物发光成像监测肺转移性定殖。图18B中的箭头表示剂量施用日。**表示p-值小于0.01。
图19A和19B.z10/z10-ADC不影响表达MERTK的M1巨噬细胞(图19A)或者M2巨噬细胞(图19B)的存活力。通过将8×104个单核细胞在具有M-CSF(50ng/mL)的PBMC培养基中培养8天使M2巨噬细胞分化。通过将8×104个单核细胞在具有GM-CSF(20ng/mL)的PBMC培养基中培养5天，然后与GM-CSF(20ng/mL)、IFNg(20ng/mL)、IL-6(20ng/mL)和LPS(10ng/mL)培养另外3天使M1巨噬细胞分化。用指定抗体或ADC在分化培养基中处理M2和M1巨噬细胞4天，并使用CellTiter-Glo2.0细胞存活力测定评价存活力。
5.详细说明
本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体(例如，单克隆抗体)及其抗原结合片段。
在某些实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段特异性识别MERTK(例如，人MERTK)的胞外域。在具体的实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段不结合人Axl、人Tyro 3或鼠MERTK，如通过本领域技术人员已知的或者本文所描述的技术所检测的。在具体的实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段不结合至人Axl、人Tyro3或鼠MERTK，如使用如下文6.2节中所描述的ELISA通过亲和力结合测定所评价的。
在具体的实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段特异性结合至包含SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的人MERTK蛋白。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段特异性结合至包含SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的人MERTK的胞外区。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段特异性结合至SEQ ID NO：132。在具体的实施方式中，抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段是二价的。在具体的实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段包含结合至MERTK(例如，人MERTK)的两个抗原结合位点。在具体的实施方式中，所述两个抗原结合位点结合至MERTK(例如，人MERTK)上的相同表位。在具体的实施方式中，所述两个-抗原结合位点包含相同的CDR。
在某些实施方式中，抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段以约1pM至10nM的KD(如使用本领域技术人员已知的或本文所描述的技术所确定的)结合至重组MERTK-Fc嵌合体(例如，重组人MERTK-Fc嵌合体)。在具体的实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段以约1pM至约6pM的KD(如使用如下文6节中所描述的表面等离子共振(SPR)所确定的)结合至重组MERTK-Fc嵌合体(例如，重组人MERTK-Fc嵌合体)。在某些实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段以约1nM至20nM的EC50(使用本文所描述的或者本领域技术人员已知的测定)结合至MERTK(例如，人MERTK)。在具体的某些实施方式中，如本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段在下文6节中所描述的测定中以约1nM至10nM的KD结合至MERTK(例如，人MERTK)。
在某些实施方式中，如本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗体片段以约1nM至20nM的EC50(如通过如本文所描述的或本领域技术人员已知的流式细胞术所评价的)结合至表达人MERTK的细胞(例如，人MERTK癌细胞或M2巨噬细胞)。在具体的实施方式中，如本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段以1nM至10nM的EC50(如通过如下文6.2节中所描述的流式细胞术所评价的)结合至表达人MERTK的细胞(例如，人MERTK癌细胞或M2巨噬细胞)。
在某些实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段降低了癌细胞上人MERTK的表达水平，如通过本文所描述的测定(例如，下文6.2节中)或者本领域技术人员已知的测定所评价的。在具体的实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段降低了黑素瘤细胞系SKMEL5上人MERTK的表达水平，如通过本文所描述的测定(例如，下文6.2节中)或者本领域技术人员已知的测定所评价的。在某些实施方式中，抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段降低了人M2巨噬细胞上人MERTK的表达水平，如通过本文所描述的测定(例如，下文6.2节中)或者本领域技术人员已知的测定所评价的。在某些实施方式中，抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段通过MERTK的内化降低了人MERTK的表达水平，如通过本文所描述的测定(例如，下文6.2节中)或者本领域技术人员已知的测定所评价的。在某些实施方式中，抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段通过内化至溶酶体中降低了人MERTK的表达水平，如通过本文所描述的测定(例如，下文6.2节中)或者本领域技术人员已知的测定所评价的。
在某些实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段降低了表达人MERTK的细胞(例如，癌细胞)中Gas 6-诱导的AKT磷酸化，如通过本文所描述的测定(例如，下文6.2节)或者本领域技术人员已知的测定所评价的。在具体的实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段防止了表达人MERTK的细胞，如(例如)黑素瘤SKMEL5细胞中Gas-6-诱导的AKT磷酸化，如通过本文所描述的测定(例如，下文6.2节)或者本领域技术人员已知的测定所评价的。在某些实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段降低了表达人MERTK的细胞中人MERTK的Gas-6-诱导的磷酸化，如通过本领域技术人员已知的测定所评价的。在具体的实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段阻断了表达人MERTK的癌细胞(例如，黑素瘤细胞，如(例如)SKMEL5)中MERTK的Gas-6-诱导的激活，如通过本领域技术人员已知的测定所评价的。
在某些实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或抗原-结合片段降低了癌细胞的集落形成能力，如通过本文所描述的测定(例如，下文6.2节中)或者本领域技术人员已知的测定所评价的。在某些实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段抑制癌细胞(例如，黑素瘤细胞，如SKMEL5)的集落形成。
在某些实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段在M2巨噬细胞、CD14+单核细胞或两者中引起了细胞因子反应，如图10中所提供的，如使用本文所描述的或者本领域技术人员已知的测定所评价的。
在具体的实施方式中，分离了本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段。
本文所述的抗体可以包括单克隆抗体或多克隆抗体。在具体的实施方式中，抗体可以是免疫球蛋白、包含两条重链和两条轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、单域抗体、一价抗体、单链抗体、单-链Fv(scFv)、二硫键-连接的Fv(scFv)和抗-独特型(抗-Id)抗体(包括(例如)抗-抗-Id抗体)。
在某些实施方式中，本文所述的抗体可以是多重特异性或双重特异性的。在某些实施方式中，本文所述的抗体是双重特异性单克隆抗体。在某些实施方式中，本文所述的抗体是一价的。在具体的实施方式中，本文所述的抗体是二价的。在具体的实施方式中，本文所述的抗体结合至细胞上的人MERTK。在一些实施方式中，本文所述的抗体是单特异性的。在某些实施方式中，重组产生本文所述的抗体。在一些实施方式中，本文所述的抗体是合成抗体。在具体的实施方式中，本文所述的抗体是人源化抗体。在其它实施方式中，本文所述的抗体可以是人抗体。
本文所述的抗体可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、任何类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a或IgG2b)的免疫球蛋白分子。在某些实施方式中，本文所述的抗体是IgG抗体或其类或亚类。在具体的实施方式中，本文所描述的抗体(例如，人源化抗体)是单克隆抗体。在具体的实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体是IgG抗体。
如本文所使用的，术语“抗原-结合片段”、“抗原-结合区”以及类似的术语是指包含赋予抗体分子其对抗原的特异性的氨基酸残基的抗体分子部分(例如，互补决定区(CDR))。抗原-结合区可以来源于任何动物物种，如啮齿类(例如，小鼠、大鼠或仓鼠)和人。举例来说，抗原结合片段包括任何如上所述的抗体的Fab片段、F(ab')2片段和抗原结合片段。在具体的实施方式中，人源化抗体的抗原-结合片段包含本文所述的z10、z11或z13抗体的重链可变区、轻链可变区或两者。
如本文所使用的，术语“可变区”或“可变域”是可互换使用的并且在本领域中是常见的。可变区通常是指抗体的一部分，通常，轻链或重链的一部分，其在抗体间在序列中广泛不同并且在特定抗体对于其特定抗原的结合和特异性中使用。序列中的可变性集中在被称为互补决定区(CDR)的那些区域，而可变域中更高度保守的区域被称为框架区(FR)。不希望受任何具体机制或理论的束缚，据信轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。
在本领域中以多种方式定义CDR，包括Kabat、Chothia、AbM、contact、IMGT和Exemplary定义。Kabat定义基于序列可变性并且是预测CDR区的最常用的定义(Kabat,Elvin A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest.Bethesda:National Institutes of Health,1983)。Chothia定义基于结构环区的位置(Chothia等人,(1987)J Mol Biol 196:901-917)。在Kabat和Chothia定义之间折中的AbM定义是通过Oxford Molecular Group(bioinf.org.uk/abs)所产生的抗体结构建模的整套程序(Martin ACR等人,(1989)PNAS 86:9268-9272)。contact定义基于可用的复合物晶体结构(bioinf.org.uk/abs)的分析(参见MacCallum RM等人,(1996)J Mol Biol 5:732-745)。IMGT定义来自IMGT(
Figure BDA0003301650990000161
国际免疫遗传学信息系统(the internationalImMunoGeneTics information
Figure BDA0003301650990000162
)，网址imgt.org，创始人和主管：Marie-PauleLefranc,Montpellier,France)。Exemplary定义是AbM和Kabat的组合(Presta等人,(1997)Cancer Res 57:4593-4599)。
在具体的实施方式中，本文所描述的人源化抗体或其抗原-结合片段包含重链可变区、轻链可变区或两者，其中所述重链可变区、轻链可变区或两者是分别在表11、12和13中所提供的z10、z11或z12抗体的所述重链可变区、所述重链可变区或两者。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的人源化抗体或抗原-结合片段包含重链可变区、轻链可变区或两者，其中所述可变重链包含表14中的重链可变区的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含下文表11、12或13中的轻链可变区的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述人源化抗体是单克隆的。在一些实施方式中，所述人源化抗体是免疫球蛋白、包含两条重链和两条轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体和抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、单域抗体、单链抗体、单链Fv、二硫键-连接的Fv或者抗-独特型抗体。所述人源化抗体可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA或IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a或IgG2b)的免疫球蛋白分子。在具体的实施方式中，本文所描述的人源化抗体是IgG或其类或亚类。
本发明申请不仅考虑了包含本文所公开的序列的抗体及其抗原结合片段(例如，CDR、框架区、可变区)，而且还考虑了由本文所公开的序列组成或基本由其组成的抗体及其抗原结合片段。例如，抗体可以包括本文所述的z10、z11或z13抗体的轻链和重链序列。
在具体的实施方式中，本文提供了嵌合抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其包含重链可变区、轻链可变区或两者，其中所述可变轻链包含下文表15中的轻链可变区的氨基酸序列，并且所述可变重链包含下文表15中的重链可变区的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述嵌合抗体是单克隆的。在一些实施方式中，所述嵌合抗体是免疫球蛋白、包含两条重链和两条轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体和抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、单域抗体、单链抗体、单链Fv、二硫键-连接的Fv或者抗-独特型抗体。所述嵌合抗体可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA或IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a或IgG2b)的免疫球蛋白分子。在某些实施方式中，本文所描述的嵌合抗体是IgG抗体或其类或亚类。
在另一个方面，本文提供了多重特异性抗体和异源缀合抗体。在具体的实施方式中，本文提供了包含两个不同的抗原结合区的双重特异性抗体，其中所述结合区之一结合MERTK(例如，人MERTK)并且包含本文所述的抗体(例如，z10、z11、z13或xAb抗体)的重链可变区、轻链可变区或两者，并且另一个结合区结合至目标抗原。在一些实施方式中，双重特异性抗体包含两个不同的抗原结合区，其中所述结合区之一特异性结合MERTK(例如，人MERTK)而另一个结合区结合目标抗原，并且其中特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的结合区包含本文所述的z10、z12或z13抗体的重链可变区和轻链可变区。在具体的实施方式中，目标抗原是免疫细胞受体或者肿瘤-相关抗原。对于双重特异性抗体，参见下文5.1.3节。
本文还提供了异源缀合抗体。在具体的实施方式中，异源缀合抗体包含对于两个不同的抗原具有特异性的两个单克隆抗体，其中所述单克隆抗体之一包含本文所描述的抗体(例如，z10、z11、z13或xAb抗体)的重链可变区和轻链可变区。
还提供了分离的核酸(多核苷酸)，如互补DNA(cDNA)，其编码本文所描述的抗-MERTK抗体及其抗原结合片段。在某些实施方式中，本文提供了包含表21、22、23或24中所述的z10、z11、z13或xAb抗体的VH、VL或两者的核酸序列的多核苷酸。在一些实施方式中，本文提供了包含表25、26、27或28中所述的z10、z11、z13或xAb抗体的重链、轻链或两者的多核苷酸。
还提供了包含编码本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原结合片段的核酸(多核苷酸)的载体(例如，表达载体)和细胞(例如，宿主细胞)。还提供了制备这些抗体的方法。
在另一个方面，本文提供了抗体-药物缀合物，其包括：(a)作为本文所描述的特异性结合至本文所描述的MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的抗体部分；(b)一个或多个药物部分，每个药物部分为细胞毒性剂；和(c)任选地接头；其中所述细胞毒性剂直接缀合至所述抗体部分或者通过所述接头缀合至所述抗体部分。如本发明公开中所使用的术语“缀合的”应表示共价结合，其可以是直接的或通过中间共价结合结构。
在其中所述细胞毒性剂是肽或蛋白或者其中所述细胞毒性剂和所述接头(如果存在一个)是肽或蛋白的情况下，还提供了编码所述抗体-药物缀合物的核酸。在其它方面，本文提供了生产抗体-药物缀合物的方法，所述抗体-药物缀合物包含(i)抗-MERTK抗体或其抗原结合片段，和(ii)直接缀合至所述抗-MERTK抗体或抗原-结合片段或者通过接头缀合至所述抗-MERTK抗体或抗原结合片段的细胞毒性剂。
在另一个方面，本文提供了包含本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的组合物(例如，药物组合物)。在具体的实施方式中，药物组合物包含本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段、一种或多种药物可用的载体、赋形剂或两者和任选地一种或多种其它治疗剂。
在另一个方面，本文提供了包含本文所描述的抗体-药物缀合物的组合物(例如，药物组合物)。在具体的实施方式中，药物组合物包含本文所描述的抗体-药物缀合物、一种或多种药物可用的载体、赋形剂或两者和任选地一种或多种其它治疗剂。
在另一个方面，本文提供了治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或其组合物。在具体的实施方式中，所述抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段是本文所描述的人源化抗体或抗原-结合片段。在其它实施方式中，所述抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段是本文所描述的双重特异性抗体或异源缀合抗体。在一些实施方式中，所述抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段是嵌合抗体或其抗原-结合片段。
在另一个方面，本文提供了治疗受试者中的癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本文所描述的抗体-药物缀合物。在具体的实施方式中，本文提供了治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的抗体-药物缀合物，所述抗体-药物缀合物包含(i)抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段和(ii)直接缀合至抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或者通过接头缀合至抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的细胞毒性剂。
5.1.抗体
5.1.1.序列和变体
在下文表1和7或8中分别提供了如使用不同系统所定义的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的VH CDR和VL CDR。下文表2、3、4、5和6提供了如使用不同系统所定义的，可以与表1中的CDR组合的VH框架区。在具体的实施方式中，表1中的CDR与使用一种编号系统的共有序列VH框架区3，以及使用相同编号系统的VH框架区1、2和4(在表2、3、4或6中提供)组合。下文表9和10提供了如使用不同系统所定义的，可以与表7或8中的CDR组合的VL框架区。表11、12、13和15提供了特定抗体的VH和VL的氨基酸序列。表14提供了可以与表11、12、13或15中所提供的VL组合的VH的氨基酸序列。表16、17、18和20提供了特定抗体的重链和轻链氨基酸序列。表19提供了可以与表16、17或18中的轻链氨基酸序列组合的重链氨基酸序列。表21、22、23和24提供了编码特定抗体的可变区的核酸序列。表25、26、27和28提供了编码特定抗体的重链和轻链的核酸序列。表29和30提供了本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段可以与之结合的示例性人MERTK氨基酸序列。
在具体的实施方式中，本文所提供的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含如通过Kabat、Chothia、AbM、Contact、IMGT或Exemplary所定义的表1中的抗体的VH CDR1。在一些实施方式中，本文所提供的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含如通过Kabat、Chothia、AbM、Contact、IMGT或Exemplary所定义的表1中的抗体的VH CDR2。在一些实施方式中，本文所提供的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含如通过Kabat、Chothia、AbM、Contact、IMGT或Exemplary所定义的表1中的抗体的VH CDR3。在一些实施方式中，本文所提供的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含如通过一种编号系统所确定的表1中的抗体的1种、2种或全部3种VH CDR。
在具体的实施方式中，本文所提供的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含如通过Kabat、Chothia、AbM、Contact、IMGT或Exemplary所定义的表7中的抗体的VL CDR1。在一些实施方式中，本文所提供的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含如通过Kabat、Chothia、AbM、Contact、IMGT或Exemplary所定义的表7中的抗体的VL CDR2。在一些实施方式中，本文所提供的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含如通过Kabat、Chothia、AbM、Contact、IMGT或Exemplary所定义的表7中的抗体的VL CDR3。在一些实施方式中，本文所提供的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含如通过一种编号系统所确定的表7中的抗体的1种、2种或全部3种VL CDR。
表1.抗体z10/z11/z13/xAb VH CDR氨基酸序列
Figure BDA0003301650990000191
表2.抗体z10 VH框架区氨基酸序列
Figure BDA0003301650990000192
Figure BDA0003301650990000201
表3.抗体z11 VH框架区氨基酸序列
Figure BDA0003301650990000202
表4.抗体z13 VH框架区氨基酸序列
Figure BDA0003301650990000203
Figure BDA0003301650990000211
表5.抗体VH FR3共有氨基酸序列(X1是F或M；X2是T或L)
Figure BDA0003301650990000212
表6.抗体xAb VH框架区氨基酸序列
Figure BDA0003301650990000213
Figure BDA0003301650990000221
表7.抗体z10/z11/z13 VL CDR氨基酸序列
Figure BDA0003301650990000222
表8.抗体xAb VL CDR氨基酸序列
Figure BDA0003301650990000223
表9.抗体z10/z11/z13 VL框架区氨基酸序列
Figure BDA0003301650990000224
Figure BDA0003301650990000231
表10.抗体xAb VL框架区氨基酸序列
Figure BDA0003301650990000232
Figure BDA0003301650990000241
表11.抗体z10可变区氨基酸序列
Figure BDA0003301650990000242
表12.抗体z11可变区氨基酸序列
Figure BDA0003301650990000243
表13.抗体z13可变区氨基酸序列
Figure BDA0003301650990000244
表14.抗体重链可变区共有氨基酸序列(X1是F或M；X2是T或L)
Figure BDA0003301650990000245
表15.抗体xAb可变区氨基酸序列
Figure BDA0003301650990000246
表16.抗体z10重链和轻链氨基酸序列
Figure BDA0003301650990000251
表17.抗体z11重链和轻链氨基酸序列
Figure BDA0003301650990000252
表18.抗体z13重链和轻链氨基酸序列
Figure BDA0003301650990000253
表19.抗体重链共有氨基酸序列(X1是F或M；X2是T或L)
Figure BDA0003301650990000261
表20.抗体xAb重链和轻链氨基酸序列
Figure BDA0003301650990000262
表21.抗体z10可变区DNA序列
Figure BDA0003301650990000263
表22.抗体z11可变区DNA序列
Figure BDA0003301650990000264
Figure BDA0003301650990000271
表23.抗体z13可变区DNA序列
Figure BDA0003301650990000272
表24.抗体xAb可变区DNA序列
Figure BDA0003301650990000273
表25.抗体z10重链和轻链DNA序列
Figure BDA0003301650990000274
Figure BDA0003301650990000281
表26.抗体z11重链和轻链DNA序列
Figure BDA0003301650990000282
表27.抗体z13重链和轻链DNA序列
Figure BDA0003301650990000283
Figure BDA0003301650990000291
表28.抗体xAb重链和轻链DNA序列
Figure BDA0003301650990000292
表29.MERTK蛋白序列
Figure BDA0003301650990000293
Figure BDA0003301650990000301
在具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含框架区(FR)1、重链可变区(VH)CDR1、FR2、VH CDR2、FR3、VH CDR3和FR4，并且其中所述VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3包含使用Exemplary编号系统的表1中所述的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用Exemplary编号系统的表2、3、4或5中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含框架区(FR)1、重链可变区(VH)CDR1、FR2、VH CDR2、FR3、VH CDR3和FR4，并且其中所述VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3包含使用Kabat编号系统的表1中所述的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用Kabat编号系统的表2、3、4或5中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含框架区(FR)1、重链可变区(VH)CDR1、FR2、VH CDR2、FR3、VH CDR3和FR4，并且其中所述VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3包含使用Chothia编号系统的表1中所述的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用Chothia编号系统的表2、3、4或5中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含框架区(FR)1、重链可变区(VH)CDR1、FR2、VH CDR2、FR3、VH CDR3和FR4，并且其中所述VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3包含使用AbM编号系统的表1中所述的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用AbM编号系统的表2、3、4或5中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含框架区(FR)1、重链可变区(VH)CDR1、FR2、VH CDR2、FR3、VH CDR3和FR4，并且其中所述VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3包含使用Contact编号系统的表1中所述的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用Contact编号系统的表2、3、4或5中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含框架区(FR)1、重链可变区(VH)CDR1、FR2、VH CDR2、FR3、VH CDR3和FR4，并且其中所述VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3包含使用IMGT编号系统的表1中所述的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用IMGT编号系统的表2、3、4或5中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含框架区(FR)1、重链可变区(VH)CDR1、FR2、VH CDR2、FR3、VH CDR3和FR4，并且其中所述VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3包含使用一种编号系统的表1中所述的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2和FR4包含使用相同编号系统的表2、3或4中所述的FR1、FR2和FR4的氨基酸序列，并且FR3包含使用相同编号系统的表5中所述的FR3的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含框架区(FR)1、VH CDR1、FR2、VH CDR2、FR3、VH CDR3和FR4，并且其中所述VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3包含使用Exemplary编号系统的表1中所述的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用Exemplary编号系统的表2、3、4或5中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含框架区(FR)1、VH CDR1、FR2、VH CDR2、FR3、VH CDR3和FR4，并且其中所述VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3包含使用Kabat编号系统的表1中所述的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用Kabat编号系统的表2、3、4或5中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含框架区(FR)1、VH CDR1、FR2、VH CDR2、FR3、VH CDR3和FR4，并且其中所述VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3包含使用Chothia编号系统的表1中所述的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用Chothia编号系统的表2、3、4或5中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含框架区(FR)1、VH CDR1、FR2、VH CDR2、FR3、VH CDR3和FR4，并且其中所述VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3包含使用AbM编号系统的表1中所述的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用AbM编号系统的表2、3、4或5中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含框架区(FR)1、VH CDR1、FR2、VH CDR2、FR3、VH CDR3和FR4，并且其中所述VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3包含使用Contact编号系统的表1中所述的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用Contact编号系统的表2、3、4或5中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含框架区(FR)1、VH CDR1、FR2、VH CDR2、FR3、VH CDR3和FR4，并且其中所述VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3包含使用IMGT编号系统的表1中所述的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用IMGT编号系统的表2、3、4或5中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含框架区(FR)1、VH CDR1、FR2、VH CDR2、FR3、VH CDR3和FR4，并且其中所述VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3包含使用一种编号系统的表1中所述的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2和FR4包含使用相同编号系统的表2、3或4中所述的FR1、FR2和FR4的氨基酸序列，并且FR3包含使用相同编号系统的表5中所述的FR3的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含框架区(FR)1、轻链可变区(VL)CDR1、FR2、VL CDR2、FR3、VL CDR3和FR4，并且其中所述VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3包含使用Exemplary编号系统的表7中所述的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用Exemplary编号系统的表9中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含框架区(FR)1、轻链可变区(VL)CDR1、FR2、VL CDR2、FR3、VL CDR3和FR4，并且其中所述VL CDR1、VL CDR2、VLCDR3包含使用Kabat编号系统的表7中所述的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用Kabat编号系统的表9中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含框架区(FR)1、轻链可变区(VL)CDR1、FR2、VL CDR2、FR3、VL CDR3和FR4，并且其中所述VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3包含使用Chothia编号系统的表7中所述的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用Chothia编号系统的表9中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含框架区(FR)1、轻链可变区(VL)CDR1、FR2、VL CDR2、FR3、VL CDR3和FR4，并且其中所述VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3包含使用AbM编号系统的表7中所述的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用AbM编号系统的表9中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含框架区(FR)1、轻链可变区(VL)CDR1、FR2、VL CDR2、FR3、VL CDR3和FR4，并且其中所述VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3包含使用Contact编号系统的表7中所述的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用Contact编号系统的表9中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含框架区(FR)1、轻链可变区(VL)CDR1、FR2、VL CDR2、FR3、VL CDR3和FR4，并且其中所述VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3包含使用IMGT编号系统的表7中所述的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用IMGT编号系统的表9中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含框架区(FR)1、轻链可变区(VL)CDR1、FR2、VL CDR2、FR3、VL CDR3和FR4，并且其中所述VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3包含使用Exemplary编号系统的表7中所述的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用Exemplary编号系统的表9中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含框架区(FR)1、轻链可变区(VL)CDR1、FR2、VL CDR2、FR3、VL CDR3和FR4，并且其中所述VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3包含使用Kabat编号系统的表7中所述的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用Kabat编号系统的表9中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含框架区(FR)1、轻链可变区(VL)CDR1、FR2、VL CDR2、FR3、VL CDR3和FR4，并且其中所述VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3包含使用Chothia编号系统的表7中所述的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用Chothia编号系统的表9中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含框架区(FR)1、轻链可变区(VL)CDR1、FR2、VL CDR2、FR3、VLCDR3和FR4，并且其中所述VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3包含使用AbM编号系统的表7中所述的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用AbM编号系统的表9中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含框架区(FR)1、轻链可变区(VL)CDR1、FR2、VL CDR2、FR3、VL CDR3和FR4，并且其中所述VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3包含使用Contact编号系统的表7中所述的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用Contact编号系统的表9中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含框架区(FR)1、轻链可变区(VL)CDR1、FR2、VL CDR2、FR3、VL CDR3和FR4，并且其中所述VLCDR1、VL CDR2、VL CDR3包含使用IMGT编号系统的表7中所述的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列，并且FR1、FR2、FR3和FR4包含使用IGMT编号系统的表9中所述的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含VH框架区(FR)1、VH CDR1、VH FR2、VH CDR2、VH FR3、VHCDR3和VH FR4，其中所述VL包含VL FR1、VL CDR1、VL FR2、VL CDR2、VL FR3、VL CDR3和VLFR4，其中所述VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3包含使用Exemplary编号系统的表1中所述的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列，其中VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4包含使用示例性编号系统的表2、3、4或5中所示的VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4的氨基酸序列，其中所述VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3包含使用Exemplary编号系统的表7中所述的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3的氨基酸序列，并且其中所述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4包含使用示例性编号系统的表9中所述的VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含VH框架区(FR)1、VH CDR1、VH FR2、VH CDR2、VH FR3、VH CDR3和VH FR4，其中所述VL包含VL FR1、VL CDR1、VL FR2、VL CDR2、VL FR3、VL CDR3和VL FR4，其中所述VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3包含使用Kabat编号系统的表1中所述的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3的氨基酸序列，其中VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4包含使用Kabat编号系统的表2、3、4或5中所示的VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4的氨基酸序列，其中所述VL CDR1、VLCDR2、VL CDR3包含使用Kabat编号系统的表7中所述的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列，并且其中所述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4包含使用Kabat编号系统的表9中所述的VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含VH框架区(FR)1、VH CDR1、VH FR2、VH CDR2、VH FR3、VH CDR3和VH FR4，其中所述VL包含VL FR1、VLCDR1、VL FR2、VL CDR2、VL FR3、VL CDR3和VL FR4，其中所述VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3包含使用Chothia编号系统的表1中所述的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列，其中VHFR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4包含使用Chothia编号系统的表2、3、4或5中所示的VH FR1、VHFR2、VH FR3和VH FR4的氨基酸序列，其中所述VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3包含使用Chothia编号系统的表7中所述的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列，并且其中所述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4包含使用Chothia编号系统的表9中所述的VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含VH框架区(FR)1、VH CDR1、VH FR2、VHCDR2、VH FR3、VH CDR3和VH FR4，其中所述VL包含VL FR1、VL CDR1、VL FR2、VL CDR2、VLFR3、VL CDR3和VL FR4，其中所述VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3包含使用AbM编号系统的表1中所述的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列，其中VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4包含使用AbM编号系统的表2、3、4或5中所示的VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4的氨基酸序列，其中所述VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3包含使用AbM编号系统的表7中所述的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3的氨基酸序列，并且其中所述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4包含使用AbM编号系统的表9中所述的VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含VH框架区(FR)1、VH CDR1、VH FR2、VH CDR2、VH FR3、VH CDR3和VH FR4，其中所述VL包含VL FR1、VL CDR1、VL FR2、VL CDR2、VL FR3、VL CDR3和VL FR4，其中所述VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3包含使用Contact编号系统的表1中所述的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列，其中VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4包含使用Contact编号系统的表2、3、4或5中所示的VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4的氨基酸序列，其中所述VL CDR1、VL CDR2、VLCDR3包含使用Contact编号系统的表7中所述的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列，并且其中所述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4包含使用Contact编号系统的表9中所述的VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含VH框架区(FR)1、VH CDR1、VH FR2、VH CDR2、VH FR3、VH CDR3和VH FR4，其中所述VL包含VL FR1、VL CDR1、VLFR2、VL CDR2、VL FR3、VL CDR3和VL FR4，其中所述VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3包含使用IMGT编号系统的表1中所述的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列，其中VH FR1、VHFR2、VH FR3和VH FR4包含使用IMGT编号系统的表2、3、4或5中所示的VH FR1、VH FR2、VHFR3和VH FR4的氨基酸序列，其中所述VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3包含使用IMGT编号系统的表7中所述的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列，并且其中所述VL FR1、VL FR2、VLFR3和VL FR4包含使用IMGT编号系统的表9中所述的VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含VH框架区(FR)1、VH CDR1、VH FR2、VH CDR2、VH FR3、VHCDR3和VH FR4，其中所述VL包含VL FR1、VL CDR1、VL FR2、VL CDR2、VL FR3、VL CDR3和VLFR4，其中所述VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3包含使用一种编号系统的表1中所述的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列，其中VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4包含使用相同编号系统的表2、3或4中所示的VH FR1、VH FR2和VH FR4的氨基酸序列，其中所述VH FR3包含表5中所述的VH FR3的氨基酸序列，其中所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3包含使用相同编号系统的表7中所述的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列，并且其中所述VL FR1、VLFR2、VL FR3和VL FR4包含使用相同编号系统的表9中所述的VL FR1、VL FR2、VL FR3和VLFR4的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH CDR1包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述VH CDR2包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，所述VH CDR3包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，所述VL CDR1包含SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列，所述VL CDR2包含SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH CDR1包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，所述VH CDR2包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，所述VH CDR3包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，所述VL CDR1包含SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列，所述VL CDR2包含SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO：73所示的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH CDR1包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述VH CDR2包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，所述VH CDR3包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，所述VL CDR1包含SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列，所述VL CDR2包含SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH CDR1包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，所述VH CDR2包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，所述VH CDR3包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，所述VL CDR1包含SEQ ID NO：74所示的氨基酸序列，所述VL CDR2包含SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO：76所示的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH CDR1包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述VH CDR2包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，所述VH CDR3包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，所述VL CDR1包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列，所述VL CDR2包含SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH CDR1包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述VH CDR2包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，所述VH CDR3包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，所述VL CDR1包含SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列，所述VL CDR2包含SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的人源化抗-MERTK或其抗原-结合片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含SEQ IDNO：109所示的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO：106或111所示的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包括表11中所述的VH的氨基酸序列并且所述VL包括表11中所述的VL的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的人源化抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包括表12中所述的VH的氨基酸序列并且所述VL包括表12中所述的VL的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包括表13中所述的VH的氨基酸序列并且所述VL包括表13中所述的VL的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包括表14中所述的VH的氨基酸序列并且所述VL包括表11、12或13中所述的VL的氨基酸序列。
在某些方面，可以通过单独的其VH域或者单独的其VL域来描述本文所述的抗体。参见，例如，Rader C等人,(1998)PNAS 95:8910-8915，以上文献以其全部内容作为参考并入本文，该文献描述了通过分别从人轻链或重链文库识别互补轻链或重链来将小鼠抗-αvβ3抗体人源化，从而导致产生了具有与原始抗体的亲和力同样高或更高的亲和力的人源化抗体变体。还参见，Clackson T等人,(1991)Nature 352:624-628，以上文献以其全部内容作为参考并入本文，该文献描述了通过使用特异性VH域(或者VL域)并对互补可变域筛选文库来产生结合特异性抗原的抗体的方法。还参见，Kim SJ&Hong HJ,(2007)J Microbiol45:572-577，以上文献以其全部内容作为参考并入本文，该文献描述了通过使用特异性VH域并对于互补VL域筛选文库(例如，人VL文库)来产生结合特异性抗原的抗体的方法；所选择的VL域反过来可以用于指导其它互补(例如，人)VH域的选择。
如本文所使用的，术语“免疫特异性结合”、“免疫特异性识别”、“特异性结合”和“特异性识别”在抗体的背景中是类似术语，并且表示通过如本领域技术人员所理解的抗原结合位点结合至抗原(例如，表位或免疫复合物)的抗体及其抗原结合片段并且不排除所述抗体或抗原-结合片段与其它抗原的交叉反应性。本领域中已知的任何方法可以用于确定是否维持与MERTK(例如，人MERTK)的免疫特异性结合。
在具体的方面，本文提供了包含抗体重链和/或轻链，例如，单独的重链、单独的轻链或重链和轻链两者的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段。相对于轻链，在具体的实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的轻链是κ轻链。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的轻链是λ轻链。在另一个具体实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的轻链是人κ轻链或人λ轻链。
在另一个具体的实施方式中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含轻链，其中所述轻链包含轻链可变区(VL)和κ轻链恒定区氨基酸序列，其中所述VL包含SEQ ID NO：106或者SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列。如本文所使用的，术语“恒定区”或“恒定域”是可互换的并且具有其在本领域中常见的含义。所述恒定区是不直接参与抗体与抗原的结合，但是可以显示出多种效应因子功能，如与Fc受体的相互作用的抗体部分，例如，轻链和/或重链的羧基末端部分。免疫球蛋白分子的恒定区通常相对于免疫球蛋白可变域具有更保守的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含轻链，其中所述轻链包含轻链可变区(VL)和人κ或λ轻链恒定区，其中所述VL包含SEQ ID NO：106或者SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列。已在本领域中描述了人恒定区序列的非限制性实例，例如，参见Kabat EA等人,(1991)。
在另一个具体的实施方式中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含轻链，其中所述轻链包含SEQ ID NO：113或SEQ IDNO：118所示的氨基酸序列。
相对于重链，在具体的实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的重链可以是人α、δ、ε、γ或μ重链。在具体的实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含重链，其中所述重链包含本文所描述的或本领域中已知的恒定区或其部分(例如，CH1、CH2或CH3或其组合)和本文所述的抗-MERTK抗体的重链可变区(VH)(例如，SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、109或SEQ IDNO：110)。
在具体的实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含重链，其中所述重链包含本文所述的抗-MERTK抗体的重链可变区(VH)(例如，SEQ ID NO：105、107、108、109或110)和人γ重链恒定区可变区的恒定区或其部分(例如，CH1、CH2或CH3或其组合)。在具体的实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116或者SEQ ID NO：117所示的氨基酸序列。已在本领域中描述了人恒定区序列的非限制性实例，例如，参见Kabat EA等人,(1991)如上。
在具体的实施方式中，本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体包含(i)包含SEQ ID NO：112所示的氨基酸序列的重链和(ii)包含SEQ ID NO：113所示的氨基酸的轻链。在具体的实施方式中，本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体，包含(i)包含SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列的重链和(ii)包含SEQ ID NO：113所示的氨基酸的轻链。在具体的实施方式中，本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体，包含(i)包含SEQ ID NO：115所示的氨基酸序列的重链和(ii)包含SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列的轻链。在具体的实施方式中，本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体，包含(i)包含SEQ ID NO：116所示的氨基酸序列的重链和(ii)包含SEQ ID NO：113所示的氨基酸的轻链。在具体的实施方式中，本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体，包含(i)包含SEQ IDNO：117所示的氨基酸序列的重链和(ii)包含SEQ ID NO：118所示的氨基酸的轻链。
在具体的实施方式中，本文所描述的免疫特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含含有本文所描述的任何氨基酸序列的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，并且其中所述恒定区包含人IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子的恒定区的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的免疫特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含含有本文所描述的任何氨基酸序列的VH和VL，并且其中所述恒定区包含人IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子、任何类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的免疫球蛋白分子的恒定区的氨基酸序列(例如，表11、12、13或15中所述的那些)。
在某些实施方式中，将1、2或更多个突变(例如，氨基酸替换)引入本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的Fc区以改变所述抗体的一种或多种功能性。
在一些实施方式中，将1、2或更多种突变(例如，氨基酸替换)引入本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的Fc区(例如，CH2域(人IgG1的残基231-340)和/或CH3域(人IgG1的残基341-447)和/或铰链区，其中根据Kabat编号系统编号(例如，Kabat中EU指数))以提高或降低所述抗体或其抗原-结合片段对于效应细胞表面上的Fc受体(例如，激活的Fc受体)的亲和力。降低或提高抗体对于Fc受体的亲和力的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的Fc区中的突变以及将这些突变引入所述Fc受体或其片段中的技术是本领域技术人员已知的。可以制备以改变抗体或其抗原-结合片段对于Fc受体的亲和力的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的Fc受体中的突变的实例描述于(例如)Smith P等人,(2012)PNAS109:6181-6186、美国专利No.6,737,056和国际专利公开No.WO 02/060919；WO 98/23289；和WO 97/34631，以上文献作为参考并入本文。
在一些实施方式中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段包含糖基化的恒定区。在一些实施方式中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段包含非糖基化的恒定区。已报道岩藻糖含量降低的抗体对Fc受体，如(例如)FcγRIIIa具有提高的亲和力。因此，在某些实施方式中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段具有降低的岩藻糖含量或者无岩藻糖含量。可以使用本领域技术人员已知的技术产生这些抗体或其抗原结合片段。例如，可以在岩藻糖基化能力缺陷或缺乏的细胞中表达所述抗体或其抗原结合片段。在具体实例中，α1,6-岩藻糖基转移酶的两个等位基因敲除的细胞系可以用于产生岩藻糖含量降低的抗体。
Figure BDA0003301650990000411
系统(Lonza)是可以用于产生岩藻糖含量降低的抗体或其抗原结合片段的这种系统的实例。作为另外一种选择，可以通过以下过程产生岩藻糖含量降低或无岩藻糖含量的抗体或抗原结合片段，例如，(i)将细胞在防止或降低岩藻糖基化的条件下培养；(ii)翻译后除去岩藻糖(例如，用岩藻糖苷酶)；(iii)翻译后添加所期望的碳水化合物，例如，在非糖基化的糖蛋白重组表达之后；或者(iv)纯化所述糖蛋白以选择未岩藻糖基化的抗体或其抗原结合片段。有关生产无岩藻糖含量或岩藻糖含量降低的抗体或其抗原结合片段的方法，参见，例如，Longmore GD&Schachter H(1982)Carbohydr Res 100:365-92和Imai-Nishiya H等人,(2007)BMC Biotechnol.7:84。
在另一个具体的实施方式中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含重链或轻链，其中(i)所述重链包含(a)包含SEQID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108或SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的可变区，和(b)包含人IgG的恒定域的氨基酸序列的重链恒定域；或者(ii)所述轻链包含(a)包含SEQID NO：106所示的氨基酸序列的可变区，和(b)包含人轻链的恒定域的氨基酸序列的轻链恒定域。
在另一个具体的实施方式中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含重链和轻链，其中(i)所述重链包含(a)包含SEQID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108或SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的可变区，和(b)包含人IgG的恒定域的氨基酸序列的重链恒定域；和(ii)所述轻链包含含有SEQ IDNO：106所示的氨基酸序列的可变区，和(b)包含人κ轻链的恒定域的氨基酸序列的轻链恒定域。
在另一个具体的实施方式中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含重链或轻链，其中(i)所述重链包含(a)包含SEQID NO：110所示的氨基酸序列的可变区，和(b)包含人IgG的恒定域的氨基酸序列的重链恒定域；或者(ii)所述重链包含(a)包含SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列的可变区，和(b)包含人κ轻链的恒定域的氨基酸序列的轻链恒定域。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含重链和轻链，其中(i)所述重链包含(a)包含SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的可变区，和(b)包含人IgG的恒定域的氨基酸序列的重链恒定域；和(ii)所述轻链包含(a)包含SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列的可变区，和(b)包含人κ轻链的恒定域的氨基酸序列的轻链恒定域。
还可以使用数学算法实现两条序列(例如，氨基酸序列或核酸序列)之间的同一性百分比的确定。用于两条序列比较的数学算法的具体、非限制性实例是Karlin S&AltschulSF(1990)PNAS 87:2264-2268所述,Karlin S&Altschul SF(1993)PNAS 90:5873-5877中改良的算法。这种算法引入了Altschul SF等人,(1990)J Mol Biol 215:403的NBLAST和XBLAST程序。可以通过设置为(例如)得分＝100，字长(wordlength)＝12的NBLAST核苷酸程序参数进行BLAST核苷酸搜索以获得与本文所描述的核酸分子相同的核苷酸序列。可以通过设置为(例如)得分50，字长(wordlength)＝3的XBLAST程序参数进行BLAST蛋白搜索以获得与本文所描述的蛋白分子相同的蛋白序列。出于比较的目的，为了获得空位比对(gappedalignments)，可以如Altschul SF等人,(1997)Nuc Acids Res 25:3389 3402中所述使用Gapped BLAST。作为另外一种选择，PSI BLAST可以用于实施迭代搜索，其检测了分子之间较远的关系(同上)。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI Blast程序时，可以使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数(参见，例如，万维网ncbi.nlm.nih.gov上的国家生物技术信息中心(NCBI))。用于序列比较的数学算法的另一种具体、非限制性实例是Myersand Miller,1988,CABIOS 4:11 17的算法。将该算法引入作为GCG序列比对软件包的一部分的ALIGN程序(2.0版)中。当使用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。
在允许或不允许空位的情况下，可以使用类似于以上所描述的那些的技术确定两条序列之间的同一性百分比。在计算同一性百分比中，通常仅对完全匹配计数。
在某些实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含与SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、或SEQ ID NO：108或SEQ ID NO：109所示的VH的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％的序列同一性的VH。在一些实施方式中，抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含与SEQ ID NO：110所示的VH的氨基酸序列具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VH。
在某些实施方式中，免疫特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含与SEQ ID NO：106所示的VL的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％的序列同一性的VL。在某些实施方式中，抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含与SEQ ID NO：111所示的VH具有至少99％的序列同一性的VL。
在某些实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含：(i)与SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、或SEQ ID NO：108或者SEQ IDNO：109所示的VH域的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％的序列同一性的VH域；和(ii)与SEQ ID NO：106所示的VL域的氨基酸序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少98％序列同一性的VL域。
在某些实施方式中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含(i)与SEQ ID NO：110所示的VH域具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VH域，和(ii)与SEQ ID NO：111所示的VL域具有至少99％的序列同一性的VL域。
在另一个方面，作为本文所述的抗体，本文提供了结合MERTK(例如，人MERTK)的相同或重叠表位的抗体。如本文所使用的，“表位”是本领域中的术语并且是指抗体可以与之特异性结合的抗原的局部区域。表位可以是(例如)多肽的邻接氨基酸(直链或邻接表位)，或者表位可以(例如)一起来自多肽的两个或更多个非邻接区域(构象、非直链、不连续或非邻接表位)。在某些实施方式中，可以通过(例如)NMR光谱、X射线衍射晶体研究、ELISA测定、氢/氘交换偶联质谱(例如，MALDI质谱)、基于阵列的寡肽扫描测定和/或突变定位(例如，定点突变定位)确定抗体的表位。对于X射线晶体学，可以使用任何本领域中已知的方法实现结晶(例如，GiegéR等人,(1994)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4):339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem 189:1-23；Chayen NE(1997)Structure 5:1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251:6300-6303)。可以使用熟知的X射线衍射技术研究抗体：抗原晶体并且可以使用计算机软件，如X-PLOR精修(Yale University,1992,由Molecular Simulations,Inc.分销；参见，例如，Meth Enzymol(1985)114&115卷,WyckoffHW等人主编；美国专利申请No.2004/0014194)和BUSTER(Bricogne G(1993)ActaCrystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1):37-60；Bricogne G(1997)Meth Enzymol276A:361-423,Carter CW主编；Roversi P等人,(2000)Acta Crystallogr D BiolCrystallogr 56(Pt 10):1316-1323)。可以使用本领域技术人员已知的任何方法完成突变定位研究。对于突变技术，包括丙氨酸扫描突变技术的描述，参见，例如，Champe M等人,(1995)和Cunningham BC&Wells JA(1989)。另外，可以使用常规技术，如免疫测定，例如，通过显示一种抗体阻断另一种抗体与靶标抗原结合的能力，即竞争性结合测定来鉴定识别并结合至MERTK(例如，人MERTK)的相同或重叠表位的抗体。竞争结合测定还可以用于确定两种抗体是否对表位具有类似的结合特异性。可以在其中进行测试的免疫球蛋白抑制参考抗体对共同抗原，如MERTK的特异性结合的测定中确定竞争性结合。多种类型的竞争性结合测定是已知的，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见Stahli C等人,(1983)Methods Enzymol 9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Kirkland TN等人,(1986)J Immunol 137:3614-9)；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见Harlow E&Lane D,(1988)Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel GA等人,(1988)Mol Immunol 25(1):7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung RC等人,(1990)Virology 176:546-52)；和直接标记RIA(Moldenhauer G等人,(1990)Scand J Immunol 32:77-82)。通常，这种测定包括结合至具有这些未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白中的任一种的固体表面或细胞的纯化抗原(例如，MERTK(例如，人MERTK))的使用。可以在存在测试免疫球蛋白的情况下，通过确定结合至固体表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。通常，测试免疫球蛋白过量存在。通常，当竞争抗体过量存在时，它将参考抗体与共同抗原的特异性结合抑制至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或以上。可以使用标记抗原或标记抗体中的任一种，以多种不同形式配置竞争结合测定。在这种测定的常见形式中，将抗原固定在96-孔板上。然后，使用放射性或酶标记测量未标记的抗体阻断标记抗体与抗原结合的能力。有关其它细节，参见，例如，Wagener C等人,(1983)J Immunol 130:2308-2315；Wagener C等人,(1984)J ImmunolMethods 68:269-274；Kuroki M等人,(1990)Cancer Res 50:4872-4879；Kuroki M等人,(1992)Immunol Invest 21:523-538；Kuroki M等人,(1992)Hybridoma 11:391-407和Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow E&Lane D主编，如上，第386-389页。
在某些方面，竞争结合测定可以用于确定另一种抗体是否以(例如)剂量依赖性方式竞争性阻断抗体，例如，当两种抗体在可以使用标记抗原或标记抗体中的任一种以一些不同形式配置的竞争结合测定，如竞争ELISA测定中识别相同或空间重叠的表位时，抗体结合与参考抗体基本相同的表位或重叠的表位。在具体的实施方式中，可以在使用本文所述的抗体(例如，抗体z10、z11或z13)的竞争结合测定中测试抗体。
在另一个方面，本文提供了如使用本领域技术人员已知的或者如本文所述的测定(例如，ELISA竞争性测定或表面等离子共振)所确定的，与本文所述的抗-MERTK抗体(例如，z10、z11、z13或xAb)竞争(例如，以剂量依赖性方式)与MERTK(例如，人MERTK)的结合的抗体。在另一个方面，本文提供了如使用本领域技术人员已知的或者如本文所述的测定(例如，ELISA竞争性测定或者悬浮阵列(suspension array)或者表面等离子共振)所确定的，竞争性抑制(例如，以剂量依赖性方式)本文所述的抗-MERTK抗体(例如，z10、z11、z13或xAb)与MERTK(例如，人MERTK)的结合的抗体。
在某些实施方式中，本文提供了与本文所述的抗体竞争对MERTK(例如，人MERTK)的结合的程度达到本文所述的抗体自竞争与MERTK(例如，人MERTK)的结合的相同程度的抗-MERTK抗体。在某些实施方式中，本文提供了与本文所述的抗-MERTK抗体竞争与MERTK(例如，人MERTK)的结合的第一抗体，其中竞争显示为所述第一抗体与MERTK(例如，人MERTK)的结合降低了大于80％(例如，85％、90％、95％或98％或者80％至85％、80％至90％、85％至90％或者85％至95％之间)。
在具体的方面，本文提供了与包含含有SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ IDNO：108、SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VH域和含有SEQ ID NO：106或SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列的VL域的抗体竞争(例如，以剂量依赖性方式)对MERTK(例如，人MERTK)的特异性结合的抗-MERTK抗体。
在具体的实施方式中，抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体或人抗体)或其抗原-结合片段特异性结合至包含具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH域和具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VL域的抗体的相同或重叠表位。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段免疫特异性结合至包含具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH域和具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VL域的抗体的相同或重叠表位。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段免疫特异性结合至包含具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VH域和具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VL域的抗体的相同或重叠表位。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段免疫特异性结合至包含具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VH域和具有SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列的VL域的抗体的相同或重叠表位。本领域技术人员已知的或本文所描述的测定(例如，X射线晶体学、ELISA测定等)可以用于确定两种抗体是否结合至相同表位。在具体的实施方式中，与本文所述的抗体竞争对MERTK(例如，人MERTK)的结合的抗体或其抗原结合片段不是鼠抗体。在具体的实施方式中，结合至本文所述的抗体(例如，人MERTK)的相同或重叠表位的抗体或其抗原结合片段不是鼠抗体。
可以以本领域中已知的一些方式测量和/或表示亲和力，其包括(但不限于)平衡解离常数(KD)和平衡结合常数(KA)。可以通过本领域的技术人员已知的技术确定KD，如生物膜干涉测量法或者表面等离子共振。
在某些实施方式中，本文所描述的与本文所述的抗体竞争对MERTK(例如，人MERTK)的结合的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段或者结合至本文所述的抗-MERTK抗体的相同或重叠表位的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段以约8nM、7nM、6nM、5nM、4.5nM、4nM、3.5nM、3nM、2.5nM、2nM、1.5nM、1nM、0.75nM、0.5nM、0.25nM或者0.1nM的KD结合至MERTK(例如，人MERTK)。在一些实施方式中，在如本文所描述的或者本领域技术人员已知的测定中，本文所描述的与本文所述的抗体竞争对MERTK(例如，人MERTK)的结合的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或者结合至本文所述的抗体的相同或重叠表位的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段以0.1nM至10nM、0.5nM至10nM、1nM至10nM、2nM至10nM、2nM、5nM、4nM至10nM的KD结合至MERTK(例如，人MERTK)。在一些实施方式中，使用本文所描述的或者本领域技术人员已知的测定，本文所描述的与本文所述的抗体竞争对MERTK(例如，人MERTK)的结合的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或者结合至本文所述的抗体的相同或重叠表位的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段以约2pM至8pM的KD亲合力结合至MERTK(例如，人MERTK)。
在具体的实施方式中，在本文所描述的或者本领域技术人员已知的测定中，本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段以约3nM的KD结合至MERTK(例如，人MERTK)。在一些实施方式中，在本文所描述的或本领域中已知的测定中，本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段以约1pM至15pM的KD亲合力结合至MERTK(例如，人MERTK)。在另一个具体的实施方式中，在本文所描述的或者本领域技术人员已知的测定中，本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段以约1.46nM的KD亲合力结合至MERTK(例如，人MERTK)。在另一个具体的实施方式中，在本文所描述的或者本领域技术人员已知的测定中，本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段以约5.74pM的KD亲合力结合至MERTK(例如，人MERTK)。在另一个具体的实施方式中，在本文所描述的或者本领域技术人员已知的测定中，本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段以约3.68pM的KD亲合力结合至MERTK(例如，人MERTK)。在另一个具体的实施方式中，在本文所描述的或者本领域技术人员已知的测定中，本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段以约2.99pM的KD亲合力结合至MERTK(例如，人MERTK)。当用于修饰数值或数值范围时，如本文所使用的，术语“约”表示所述值或范围以上5％至10％和以下5％至10％的偏离仍在所列举的值或范围的预期含义内。
在具体的实施方式中，如通过本文所描述的或本领域中已知的测定所评价的，抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段以1nM至20nM的EC50结合至MERTK(例如，人MERTK)。在另一个具体的实施方式中，如通过本文所描述的或本领域中已知的测定所评价的，抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段以1nM至10nM的EC50结合至MERTK(例如，人MERTK)。在另一个具体实施方式中，如通过本文所描述的或本领域中已知的测定所评价的，抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段以约1nM、约2nM、约3nM、约4nM、约5nM、约6nM、约7nM、约8nM、约9nM或者约10nM的EC50结合至MERTK(例如，人MERTK)。
在具体的实施方式中，抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段是下文第6节中所描述的一种抗体。
5.1.2.功能特征
在一些方面，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段使癌细胞(例如，SKMEL5黑素瘤细胞)上的人MERTK的表达水平降低了超过10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或者85％，如通过本领域技术人员已知的或本文所描述的测定所评价的。在一些方面，本文所描述的特异性结合至人MERTK的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段使人M2巨噬细胞上的人MERTK的表达水平降低了超过10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或者85％，如通过本领域技术人员已知的或本文所描述的测定所评价的。在具体的实施方式中，抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段结合至MERTK(例如，人MERTK，而不是人Axl、人Tyro3或鼠MERTK)，如通过本文所描述的或本领域中已知的方法所评价的。
在一些实施方式中，抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段结合至人MERTK和食蟹猴MERTK。
在一些方面，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段诱导了通过M2巨噬细胞、CD14+单核细胞或两者的细胞因子分泌反应，如图10所示。在某些方面，如图10所示，抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段将通过M2巨噬细胞、CD14+单核细胞或两者的某些细胞因子的表达(例如，所述抗体或其抗原结合片段提高了某些细胞因子的表达)改变了超过10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或者85％，如通过本领域技术人员已知的或本文所描述的测定所评价的。
在一些实施方式中，在本领域技术人员已知的测定中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段(例如，部分或完全)阻断了表达人MERTK的细胞，如(例如)癌细胞(例如，黑素瘤细胞)、M2巨噬细胞或两者中通过Gas-6所诱导的MERTK磷酸化水平。在具体的实施方式中，在本领域技术人员已知的测定中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段使表达人MERTK的细胞，如(例如)癌细胞(例如，黑素瘤细胞)、M2巨噬细胞或两者中通过Gas-6所诱导的人MERTK磷酸化水平降低了至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或者85％。
在某些实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段引起表达人MERTK的细胞，如(例如)癌细胞(例如，黑素瘤细胞)、M2巨噬细胞或两者上人MERTK的降解。在具体的实施方式中，在本文所描述的或者本领域技术人员已知的测定中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段使表达人MERTK的细胞，如(例如)癌细胞(例如，黑素瘤细胞)、M2巨噬细胞或两者的表面上的人MERTK的水平降低了至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或者85％。
在某些实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段引起表达人MERTK的细胞，如(例如)癌细胞(例如，黑素瘤细胞)、M2巨噬细胞或两者上人MERTK的内化。在具体的实施方式中，在本文所描述的或者本领域技术人员已知的测定中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段使通过表达人MERTK的细胞，如(例如)癌细胞(例如，黑素瘤细胞)、M2巨噬细胞或两者的人MERTK的内化提高了至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或者85％。
在一些实施方式中，在本文所描述的或者本领域技术人员已知的测定中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段(例如，部分或完全)抑制通过癌细胞(例如，黑素瘤细胞)的集落形成。在具体的实施方式中，在本文所描述的或者本领域技术人员已知的测定中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段使通过癌细胞(例如，黑素瘤细胞)的集落形成水平降低至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或者85％。在一些方面，本文所描述的免疫特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段使癌细胞(例如，SKMEL5黑素瘤细胞)的集落形成能力降低超过10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或者85％，如通过本领域技术人员已知的或本文所描述的测定所评价的。
在一些方面，在本文所描述的或者本领域中已知的测定中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段防止Gas6-诱导的AKT磷酸化。在某些实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段与Gas-6(例如，人Gas-6)竞争对人MERTK的结合。在一些实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段抑制(例如，完全抑制或仅部分抑制)Gas-6与人MERTK的结合。在一些实施方式中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段将Gas-6(例如，人或小鼠Gas-6)对人MERTK的结合抑制了超过10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或者85％，如通过本领域技术人员已知的或本文所描述的测定所评价的。在具体的实施方式中，用于评价在存在本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的情况下Gas-6(例如，人Gas-6)与人MERTK的结合的抑制的测定是本领域技术人员已知的抗体捕获ELISA，如国际专利公开No.WO2016/106221中所述(例如，国际专利公开No.WO2016/106221的实施例1)。
在一些实施方式中，在本文所描述的或者本领域技术人员已知的测定中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段使表达人MERTK的癌细胞(例如，黑素瘤细胞)中通过Gas-6所诱导的AKT磷酸化水平降低了至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或者85％。
在具体的实施方式中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段抑制肿瘤内的血管生成。在一些实施方式中，血管生成的抑制为至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％。在具体的实施方式中，血管生成的抑制为至少50％、55％、60％、65％或70％。可以通过本文所描述的和/或本领域技术人员已知的方法评价血管生成的抑制。所述抑制可以是相对于没有任何抗体或者使用不相关的抗体(例如，不免疫特异性结合至MERTK的抗体)的血管生成水平的。
在某些实施方式中，本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段抑制肿瘤发展。肿瘤发展的抑制为至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％。可以通过本领域技术人员已知的方法评价肿瘤发展。所述肿瘤发展可以是相对于没有任何抗体或者使用不相关的抗体(例如，不特异性结合至人MERTK的抗体)的癌症状态的。在具体的实施方式中，抗-MERTK抗体或其抗原-结合区具有下文第6节中所述的抗体特征中的1个、2个、3个或更多个。
5.1.3.双重特异性抗体
在具体的方面，本文提供了包含两个不同的抗原结合区的双重特异性抗体，其中所述结合区之一特异性结合至人MERTK并且另一个结合区结合至另一个目标抗原，并且其中特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的结合区是本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段。在具体的实施方式中，本文提供了包含两个不同的抗原结合区的双重特异性抗体，其中所述结合区之一特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)并且另一个结合区结合至另一个目标抗原，并且其中特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的结合区包含本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的重链可变区。在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含两个不同的抗原结合区的双重特异性抗体，其中所述结合区之一特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)并且另一个结合区结合至另一个目标抗原，并且其中特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的结合区包含表11中所述的抗体z10的重链可变区氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含两个不同的结合区的双重特异性抗体，其中所述结合区之一特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)并且另一个结合区结合至另一个目标抗原，并且其中特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的结合区包含表12中所述的抗体z11的重链可变区氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含两个不同的抗原结合区的双重特异性抗体，其中所述结合区之一特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)并且另一个结合区结合至另一个目标抗原，并且其中特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的结合区包含表13中所述的抗体z13的重链可变区氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含两个不同的结合区的双重特异性抗体，其中所述结合区之一特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)并且另一个结合区结合至另一个目标抗原，并且其中特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的结合区包含含有表14中所述的氨基酸序列的重链可变区。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含两个不同的抗原结合区的双重特异性抗体，其中所述结合区之一特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)并且另一个结合区结合至另一个目标抗原，并且其中特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的结合区包含本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的轻链可变区。在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含两个不同的抗原结合区的双重特异性抗体，其中所述结合区之一特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)并且另一个结合区结合至另一个目标抗原，并且其中特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的结合区包含表11中所述的抗体z10的轻链可变区的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含两个不同的抗原结合区的双重特异性抗体，其中所述结合区之一特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)并且另一个结合区结合至另一个目标抗原，并且其中特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的结合区包含表12中所述的抗体z11的轻链可变区的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含两个不同的抗原结合区的双重特异性抗体，其中所述结合区之一特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)并且另一个结合区结合至另一个目标抗原，并且其中特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的结合区包含表13中所述的抗体z13的轻链可变区的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含两个不同的结合区的双重特异性抗体，其中所述结合区之一特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)并且另一个结合区结合至另一个目标抗原，并且其中特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的结合区包含轻链可变区，其中所述轻链可变区包含表11、12或13中所述的VL的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含两个不同的抗原结合区的双重特异性抗体，其中所述结合区之一特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)并且另一个结合区结合至另一个目标抗原，并且其中特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的结合区包含本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的轻链可变区和重链可变区。在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含两个不同的抗原结合区的双重特异性抗体，其中所述结合区之一特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)并且另一个结合区结合至另一个目标抗原，并且其中特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的结合区包含表11中所述的抗体z10的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含两个不同的抗原结合区的双重特异性抗体，其中所述结合区之一特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)并且另一个结合区结合至另一个目标抗原，并且其中特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的结合区包含表12中所述的抗体z11的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含两个不同的抗原结合区的双重特异性抗体，其中所述结合区之一特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)并且另一个结合区结合至另一个目标抗原，并且其中特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的结合区包含表13中所述的抗体z13的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含两个不同的抗原结合区的双重特异性抗体，其中所述结合区之一特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)并且另一个结合区结合至另一个目标抗原，并且其中特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的结合区包含轻链可变区和重链可变区，其中所述重链可变区包含表14中所述的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含表11、12或13中所述的VL氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文所描述的双重特异性抗体的另一个结合区所结合的目标抗原是在免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞或树突状细胞)上递呈的抗原。在一些实施方式中，本文所描述的双重特异性抗体的另一个结合区所结合的目标抗原是免疫检查点受体(例如，PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、Tim3、ICOS、CD40、GITR或OX40)。在具体的实施方式中，本文所描述的双重特异性抗体的另一个结合区包含激动性抗-GITR抗体、激动性抗-OX40抗体或者激动性抗-CD40抗体。在具体的实施方式中，双重特异性抗体的另一个结合区包含结合至PD-1、PD-L1、CTLA-4或LAG3的阻断抗体或其抗原-结合片段。在某些实施方式中，本文所描述的双重特异性抗体的另一个结合区所结合的目标抗原是T细胞受体。在具体的实施方式中，本文所描述的双重特异性抗体的另一个结合区所结合的目标抗原是CD3、PD-L1、LRP1、LRP8、TGF-β、NKGD2或TIGIT。在一些实施方式中，目标抗原是肿瘤-相关抗原。
在具体的实施方式中，本文所描述的双重特异性抗体的另一个结合区是纳武单抗或其抗原-结合片段。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的双重特异性抗体的另一个结合区是兰洛珠单抗或其抗原-结合片段。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的双重特异性抗体的另一个结合区是MEDI-4736或其抗原-结合片段。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的双重特异性抗体的另一个结合区是普利木单抗或其抗原-结合片段。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的双重特异性抗体的另一个结合区是MPDL-3280A或其抗原-结合片段。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的双重特异性抗体的另一个结合区是皮地利珠单抗(pidilizumab)或其抗原-结合片段。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的双重特异性抗体的另一个结合区是阿维鲁单抗(Avelumab)或其抗原-结合片段。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的双重特异性抗体的另一个结合区是派姆单抗或其抗原-结合片段。
5.2.抗体-药物缀合物
本文提供了抗体-药物缀合物，其包括：(a)作为本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的抗体部分；(b)一个或多个药物部分，每个药物部分为细胞毒性剂；和(c)任选地接头；其中所述细胞毒性剂直接缀合至所述抗体部分或者通过所述接头缀合至所述抗体部分。如本发明公开中所使用的术语“缀合的”应表示共价结合，其可以是直接的或通过中间共价结合结构。本文所提供的抗体-药物缀合物的抗体部分可以是第5.1或6节中所述的抗体。抗体-药物缀合物可以是第6节中所述的抗体-药物缀合物。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物的抗体部分与药物部分的摩尔比在1:1至1:20之间。在具体的实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物的抗体部分与药物部分的摩尔比在1:1至1:15之间。在具体的实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物的抗体部分与药物部分的摩尔比在1:1至1:12之间。在具体的实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物的抗体部分与药物部分的摩尔比在1:1至1:8之间。在优选的实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物的抗体部分与药物部分的摩尔比在1:3至1:5之间。在具体的实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物的抗体部分与药物部分的摩尔比为1:3。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物的抗体部分与药物部分的摩尔比为1:4。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物的抗体部分与药物部分的摩尔比为1:5。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物的抗体部分与药物部分的摩尔比为1:9。
所述药物部分缀合至所述抗体部分的一条或多条链。在一些实施方式中，所述药物部分缀合至所述抗体部分的一条链(例如，当所述抗体部分为scFv时或者当所述抗体部分为多链抗体，如(作为四聚体的)免疫球蛋白或其抗原-结合片段时)。在其它实施方式中，所述药物部分缀合至所述抗体部分的两条或更多条链(当所述抗体部分是多链抗体，如免疫球蛋白或其抗原-结合片段时)。在具体的实施方式中，将所述药物部分缀合至免疫球蛋白的两条相同的链，例如，重链或轻链。在其它实施方式中，所述药物部分缀合至所述抗体部分的全部链(当所述抗体部分是多链抗体，如免疫球蛋白或其抗原-结合片段时)。在一些实施方式中，所述药物部分通过下文第6.4节中所述的方法缀合至所述抗体。
在具体的实施方式中，所述药物部分缀合至抗体恒定区中的一个或多个位点。在具体的实施方式中，所述药物部分缀合至抗体可变区中的一个或多个位点。在具体的实施方式中，所述药物部分缀合至所述抗体中的一个或多个赖氨酸残基。在具体的实施方式中，所述药物部分缀合至所述抗体中的一个或多个半胱氨酸残基，例如，当MMAE为所述药物部分时。在具体的实施方式中，所述药物部分缀合至作为免疫球蛋白的抗体的Fc区。在具体的实施方式中，所述药物部分是融合至抗体部分的一条或多条链的N-末端或C-末端的肽或蛋白(直接或通过作为肽或蛋白的接头)。
例如，当所述抗体部分是scFv时，所述药物部分可以在scFv的N-或C-末端融合(直接或通过作为肽或蛋白的接头)。在具体的实施方式中，当所述抗体部分是多链抗体或其抗原结合片段时，所述药物部分可以融合至所述抗体部分的链中的一条(直接或通过作为肽或蛋白的接头)。就作为免疫球蛋白的抗体来说，在具体的实施方式中，两条重链可以融合至药物部分(直接或通过作为肽或蛋白的接头)，和/或两条轻链可以融合至药物部分(直接或通过作为肽或蛋白的接头)。在这些具体实施方式中，本文提供了包含多核苷酸的载体(例如，表达载体)，所述多核苷酸包含用于在宿主细胞中，优选地在哺乳动物细胞中重组表达的编码融合蛋白的核苷酸序列，所述融合蛋白由所述药物部分和所述抗体部分或其链以及位于所述药物部分和所述抗体部分之间的接头(如果存在一个)组成。本文还提供了包含用于重组表达融合蛋白的这些载体的离体宿主细胞，所述融合蛋白由所述药物部分和所述抗体部分或其链以及位于所述药物部分和所述抗体部分之间的接头(如果存在一个)组成。用于产生这些载体和离体宿主细胞的特征和方法可以与以下对于抗-MERTK抗体所描述的相同。本文还提供了生产由所述药物部分和所述抗体部分或其链以及位于所述药物部分和所述抗体部分之间的接头(如果存在一个)组成的融合蛋白的方法，其包括在使得包含编码所述融合蛋白的核苷酸序列的多核苷酸通过离体宿主细胞表达以产生所述融合蛋白的条件下培养这种离体宿主细胞。可以通过本领域中已知的或者如下文第6节所述的方法生产本文所描述的抗体-药物缀合物。
在一些实施方式中，所述抗体-药物缀合物具有图13A或图13B，并且具体地图13A中所示的结构。图13A显示了通过mc-vc-PABC接头连接至抗体(Ab)的MMAE的结构。图13B显示了通过CL2或CL2A接头连接至抗体(Ab)的SN38的结构。如果图13B中的“AA”是苯丙氨酸-赖氨酸，则图13B显示了通过CL2接头(其包含组织蛋白酶B切割位点)连接至SN-38的抗体。如果图13B中的“AA”是赖氨酸，则图13B显示了通过CL2A接头(其不含组织蛋白酶B切割位点)连接至SN-38的抗体。
在具体的实施方式中，所述抗体-药物缀合物的抗体部分包含抗体z10的可变区。在具体的实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，其中所述VH包含SEQ ID NO：105所示的序列的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列，其中所述抗体部分通过mc-vc-PABC接头缀合至MMAE。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，其中所述VH包含SEQ ID NO：105所示的序列的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列，其中所述抗体部分通过CL2A接头缀合至SN-38。
在整个发明公开中所述的抗体-药物缀合物的替代实施方式中，所述药物部分不必需是细胞毒性剂。例如，所述药物部分可以是本领域中已知的适合于使用的任何药物，并且可以包括(但不限于)下文第5.2.3节中所述的那些，或者例如，出于诊断或监测疾病的目的，可以是成像剂。
在整个发明公开中所述的抗体-药物缀合物的优选实施方式中，所述药物部分通过接头缀合至所述抗体部分。
5.2.1.抗体-药物缀合物的功能特征
在某些实施方式中，本文所描述的抗体-药物缀合物以约8nM、7nM、6nM、5nM、4.5nM、4nM、3.5nM、3nM、2.5nM、2nM、1.5nM、1nM、0.75nM、0.5nM、0.25nM、0.17nM、0.1nM、0.081nM或者0.021nM的KD结合至MERTK(例如，人MERTK)。在一些方面，本文所提供的抗体-药物缀合物将癌细胞(例如，SKMEL5黑素瘤细胞)上的人MERTK的表达水平降低了大于10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或者85％，如通过本领域技术人员已知的或者本文所描述的，例如，如下文第6节中所描述的测定所评价的。在具体的实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物结合至MERTK(例如，结合至人MERTK，而不是人Axl、人Tyro3或鼠MERTK)，如通过本文所描述的或本领域中已知的方法所评价的。在某些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包括其中所述抗体-药物缀合物以大于非缀合的抗体部分的亲和力结合至MERTK的抗体部分。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物体外导致表达MERTK(例如，人MERTK)的细胞(例如，M2巨噬细胞、癌细胞或两者)细胞死亡。在一些具体的实施方式中，在存在本文所描述的抗体-药物缀合物的情况下培养一段时间的表达MERTK的细胞的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或者85％在所述一段时间结束时死亡，如通过本领域技术人员已知用于测量细胞体外死亡的方法所评价的。在其它具体的实施方式中，当在存在本文所描述的抗体-药物缀合物的情况下培养一段时间时，相对于当无抗体-药物缀合物培养(例如，无任何抗体-药物缀合物的培养或者具有包含不相关的抗体的抗体-药物缀合物(例如，不免疫特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体)的培养或者与本文所描述的未缀合的抗-MERTK抗体或未缀合的抗-MERTK抗原-结合片段的培养)时，经历细胞死亡的表达MERTK的细胞(例如，M2巨噬细胞、癌细胞或两者)的百分比高至少50％、100％、2-倍、3-倍、5-倍、10-倍、20-倍、50-倍、100-倍、200-倍、500-倍或者1000-倍。所述一段时间可以是(例如)约1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或者1周。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物不影响表达MERTK的巨噬细胞的存活力，如通过本领域技术人员已知用于测量细胞体外死亡的方法或者本文(例如，下文第6节)所描述的方法所评价的。在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物不影响M1巨噬细胞的存活力，如通过本领域技术人员已知用于测量细胞体外死亡的方法或者本文(例如，下文第6节)所描述的方法所评价的。在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物不影响M2巨噬细胞的存活力，如通过本领域技术人员已知用于测量细胞体外死亡的方法或者本文(例如，下文第6节)所描述的方法所评价的。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物引起表达MERTK的细胞，如(例如)癌细胞(例如，黑素瘤细胞)上的MERTK的降解。在具体的实施方式中，在本文所描述的或者本领域技术人员已知的测定中，本文所提供的抗体-药物缀合物将表达人MERTK的细胞，如(例如)癌细胞(例如，黑素瘤细胞)表面上的人MERTK的水平降低了至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或者85％。在某些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物在表达MERTK的细胞上引起了比未缀合的抗体部分更大的MERTK的降解，如在本文所描述的或者本领域中已知的测定中所评价的。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物引起表达MERTK的细胞，如(例如)癌细胞(例如，黑素瘤细胞)上的MERTK的内化。在具体的实施方式中，在本文所描述的或者本领域技术人员已知的测定中，本文所提供的抗体-药物缀合物将通过表达人MERTK的细胞，如(例如)癌细胞(例如，黑素瘤细胞)的人MERTK的内化提高了至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或者85％。在某些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包括抗体部分，并且所述抗体-药物引起了比未缀合的抗体部分更大的表达MERTK的细胞的内化，如通过本文所描述的或者本领域技术人员已知的测定所评价的。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物抑制肿瘤发展。肿瘤发展抑制了至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％。可以通过本领域技术人员已知的方法评价肿瘤发展。肿瘤发展可以是相对于未使用任何抗体治疗，用不相关的抗体(例如，不特异性结合至人MERTK的抗体)治疗，用SN-38治疗，用MMAE治疗，用所述抗体-药物缀合物的未缀合的抗体部分治疗的癌症状态。在具体的实施方式中，抗-MERTK抗体或其抗原-结合区具有下文第6节中所述的抗体特征中的1个、2个、3个或更多个。
在具体的实施方式中，本文所描述的抗体-药物缀合物抑制肿瘤内的血管生成。在一些实施方式中，血管生成的抑制为至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或者85％。在具体的实施方式中，血管生成的抑制为至少50％、55％、60％、65％或70％。可以通过本文所描述的和/或本领域技术人员已知的方法评价血管生成的抑制。所述抑制可以是相对于无所述抗体-药物缀合物(例如，不使用任何抗体-药物缀合物的培养或者使用包含不相关的抗体(例如，不特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体)的抗体-药物缀合物的培养或者使用本文所描述的未缀合的抗-MERTK抗体或未缀合的抗-MERTK抗原-结合片段的培养)的血管生成水平的。
在某些实施方式中，本文所描述的抗体-药物缀合物抑制肿瘤(例如，人乳腺癌肿瘤)的发展。肿瘤发展的抑制为至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或者85％。可以通过本领域技术人员已知的方法评价肿瘤发展。所述肿瘤发展可以是相对于无所述抗体-药物缀合物(例如，不使用任何抗体-药物缀合物的培养或者使用包含不相关的抗体(例如，不特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体)的抗体-药物缀合物的培养或者使用本文所描述的未缀合的抗-MERTK抗体或未缀合的抗-MERTK抗原-结合片段的培养)的癌症状态的。在具体的实施方式中，用于评价肿瘤发展的测定是鼠科肿瘤移植模型。
5.2.2.抗体部分
本文所提供的抗体-药物缀合物可以包含本文所提供的任何抗-MERTK抗体。对于本文所提供的抗体-药物缀合物的抗体部分的实例，参见，例如，第5.1.1节。在具体的实施方式中，所述抗体部分是免疫球蛋白，例如，包含人恒定域的免疫球蛋白或者人源化免疫球蛋白。在另一个具体的实施方式中，所述抗体部分是scFv，例如，包含本文第5.1.1节中所述的抗体的VH和VL域的scFv。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含任选地通过接头缀合至包含本文所公开的VH，例如，第5.1.1节中所述的VH的抗体部分的药物部分。在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含任选地通过接头缀合至包含本文所公开的VL，例如，第5.1.1节中所述的VL的抗体部分的药物部分。在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含任选地通过接头缀合至包含本文所公开的抗体的VH和VL，例如，如第5.1.1节中所述的抗体的VH和VL的抗体部分的药物部分。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含任选地通过接头缀合至包含含有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH的抗体部分的药物部分。在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含任选地通过接头缀合至包含含有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VL的抗体部分的药物部分。在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含任选地通过接头缀合至抗体部分的药物部分，所述抗体部分包含(i)包含SEQID NO：105所示的氨基酸序列的VH和(ii)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VL。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至包含VH的抗体部分的MMAE，其中所述VH包含SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至包含VL的抗体部分的MMAE，其中所述VL包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至包含VH的抗体部分的SN-38，其中所述VH包含SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至包含VL的抗体部分的SN-38，其中所述VL包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至包含VH和VL的抗体部分的MMAE，其中所述VH包含SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至包含VH和VL的抗体部分的SN-38，其中所述VH包含SEQ IDNO：105所示的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至包含本文所提供的重链，例如，第5.1.1节中所述的重链的抗体部分的药物部分。在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至包含本文所提供的重链，例如，第5.1.1节中所述的重链的抗体部分的MMAE。在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至包含本文所提供的重链，例如，第5.1.1节中所述的重链的抗体部分的SN-38。在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至包含本文所提供的轻链，例如，第5.1.1节中所述的轻链的抗体部分的药物部分。在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至包含本文所提供的轻链，例如，第5.1.1节中所述的轻链的抗体部分的MMAE。在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至包含本文所提供的轻链，例如，第5.1.1节中所述的轻链的抗体部分的SN-38。在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至抗体部分的药物部分，所述抗体部分包含(i)本文所提供的重链和(ii)本文所提供的轻链，例如，第5.1.1节中所述的重链和轻链。在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至抗体部分的MMAE，所述抗体部分包含(i)本文所提供的重链和(ii)本文所提供的轻链，例如，第5.1.1节中所述的重链和轻链。在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至抗体部分的SN-38，所述抗体部分包含(i)本文所提供的重链和(ii)本文所提供的轻链，例如，第5.1.1节中所述的重链和轻链。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至包含含有SEQ ID NO：112所示的氨基酸序列的重链的抗体部分的药物部分。在一些具体的实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至包含含有SEQ ID NO：112所示的氨基酸序列的重链的抗体部分的MMAE。在一些具体的实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至包含含有SEQ ID NO：112所示的氨基酸序列的重链的抗体部分的SN-38。在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至包含含有SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列的轻链的抗体部分的药物部分。在一些具体的实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至包含SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列的轻链的MMAE。在一些具体的实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至包含SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列的轻链的SN-38。在一些实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至抗体部分的药物部分，所述抗体部分包含(i)包含SEQ ID NO：112所示的氨基酸序列的重链和(ii)包含SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列的轻链。在具体的实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至抗体部分的MMAE，所述抗体部分包含(i)包含SEQ ID NO：112所示的氨基酸序列的重链和(ii)包含SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列的轻链。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的抗体-药物缀合物包含通过接头缀合至抗体部分的SN-38，所述抗体部分包含(i)包含SEQ ID NO：112所示的氨基酸序列的重链和(ii)包含SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列的轻链。
5.2.3.药物部分和接头
在抗体-药物缀合物中使用的细胞毒性剂也经常称为有效负荷或弹头。大部分在抗体-药物缀合物中使用的细胞毒性剂靶向DNA或微管并且具有高细胞毒性效力(IC50在约10-10至10-12M的范围内)(参见Beck A等人,(2017)Nat Rev Drug Discov 16:315-337)。然而，还可以使用不太有效的细胞毒性剂。细胞毒性剂可以是小分子、核苷酸、肽或非抗体蛋白质。在具体的实施方式中，细胞毒性剂是小分子。在另一个具体的实施方式中，细胞毒性剂是非抗体蛋白质。可以在根据本发明的抗体-药物缀合物中使用的非限制性示例性细胞毒性剂描述于Beck A等人,(2017)Nat Rev Drug Discov 16:315-337；Peters Cand BrownS,(2015)Biosci Rep 35:art:e00225；McCombs JR and Owen SC(2015)The AAPS Journal17:339-351；Jackson DY(2016)Org Process Res Dev 20:852-866；和Olivier KJ andHurvitz SA主编,(2016)Antibody-Drug Conjugates:Fundamentals,Drug Development,and Clinical,Wiley。
在某些实施方式中，细胞毒性剂是表30或31中所列的试剂之一。在具体的实施方式中，在抗体-药物缀合物中使用的细胞毒性剂为奥瑞他汀(如一甲基奥瑞他汀E(MMAE)、一甲基奥瑞他汀F(MMAF)、Aur0101、PF06380101、奥瑞他汀W或奥瑞他汀F)或其衍生物、美登素(如DM1或DM4)、吡咯并苯二氮卓(PBD)(如SGD1882或SG3199)、吲哚啉并苯二氮卓(如DGN462或DGN549)、卡里奇霉素(calicheamicin)(ozogamicin)(如CM1)、喜树碱类似物(如SN38、DX-8951f或DX-8951f衍生物)、倍癌毒素(如seco-倍癌毒素-羟基-苯甲酰胺-吖吲哚(seco-DUBA)、小沟结合烷化剂(MGBA)或者MED-2460)、微管蛋白抑制剂(如念珠藻素)、微管溶素(tubulysin)或微管溶素(tubulysin)类似物(如AZ13599185)、amberstatin269、多柔比星、抗生素(如利福罗格(rifalogue))、蒽环类抗生素(如PNU-159682)、微管抑制剂(如根霉素)、斯考他汀(spliceostatin)或泰抑素(thailanstatin)。在具体的实施方式中，在抗体-药物缀合物中使用的细胞毒性剂是MMAE或MMAF。在具体的实施方式中，在抗体-药物缀合物中使用的细胞毒性剂是MMAE(参见，例如，图13A)。在另一个具体的实施方式中，在抗体-药物缀合物中使用的细胞毒性剂是DM1或DM4。在另一个具体的实施方式中，在抗体-药物缀合物中使用的细胞毒性剂是SN-38。在另一个具体的实施方式中，在抗体-药物缀合物中使用的细胞毒性剂是如图13B所示的SN-38。
表30：药物部分的实例
Figure BDA0003301650990000561
Figure BDA0003301650990000571
Figure BDA0003301650990000581
Figure BDA0003301650990000591
Figure BDA0003301650990000601
表31：药物部分的其它实例。
Figure BDA0003301650990000602
Figure BDA0003301650990000611
Figure BDA0003301650990000621
如本文所使用的，术语“小分子”是指分子量小于约10,000克每摩尔的有机或无机化合物(其可以是(例如)杂有机或有机金属化合物)。在具体的实施方式中，所述小分子具有小于约5,000克每摩尔，或者小于约2,000克每摩尔，或者小于约1,000克每摩尔，或者小于约500克每摩尔，或者小于约100克每摩尔的分子量。
在一些实施方式中，所述细胞毒性剂直接缀合至抗体部分。在其它实施方式中，所述细胞毒性剂通过接头缀合至抗体部分。适合根据本发明使用的接头优选地在血流中稳定以限制脱靶毒性，并且在癌症位点不稳定以允许释放细胞毒性剂(参见Peters C andBrown S,(2015)Biosci Rep 35:art:e00225)。可以根据本发明使用的非限制性示例性接头描述于Beck A等人,(2017)Nat Rev Drug Discov 16:315-337；Peters C and Brown S,(2015)Biosci Rep 35:art:e00225；McCombs JR and Owen SC(2015)The AAPS Journal17:339-351；Jackson DY(2016)Org Process Res Dev 20:852-866；和Olivier KJ andHurvitz SA主编,(2016)Antibody-Drug Conjugates:Fundamentals,Drug Development,and Clinical,Wiley。在一些实施方式中，所述接头是可切割接头，例如，具有对溶酶体蛋白酶敏感的基序(例如，组织蛋白酶B)、对酸性pH敏感的基序(例如，腙)或者含有可以通过谷胱甘肽还原的二硫桥键的基序。在其它实施方式中，所述接头是不可切割的接头。通过举例而不是限制，所述接头可以是小分子、核苷酸、肽或非抗体蛋白质。在具体的实施方式中，所述接头是小分子。在具体的实施方式中，在抗体-药物缀合物中使用的接头是组织蛋白酶B、腙、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、马来酰亚胺基己酸(mc)、缬氨酸-瓜氨酸(vc)、N-羟基琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)、N-羟基琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸(SPP)、缬氨酸-丙氨酸(va)、聚乙二醇8-缬氨酸-瓜氨酸(PEG8-va)、mb-vc、CL2A、基于可切割的vc的接头或者柔性聚合物接头(fleximer polymer linker)。在具体的实施方式中，选择用于在本文所描述的抗体药物缀合物中使用的接头不干扰抗体部分与其抗原、细胞毒性剂或两者的结合。在具体的实施方式中，选择用于在本文所描述的抗体-药物缀合物中使用的接头是马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄基氧基羰基(mc-vc-PABC)。在其它具体的实施方式中，选择用于在本文所描述的抗体-药物缀合物中使用的接头是CL2。在其它具体的实施方式中，选择用于在本文所描述的抗体-药物缀合物中使用的接头是CL2A。在一些具体的实施方式中，选择用于在本文所描述的抗体-药物缀合物中使用的接头是如图13A中所示的接头。在其它具体的实施方式中，选择用于在本文所描述的抗体-药物缀合物中使用的接头是如图13B中所示的接头，其中AA是赖氨酸。在其它具体的实施方式中，选择用于在本文所描述的抗体-药物缀合物中使用的接头是如图13B中所示的接头，其中AA是苯丙氨酸-赖氨酸。在具体的实施方式中，所述抗体-药物缀合物包含接头并且所述接头是马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄基氧基羰基(也称为“mc-vc-PABC”)(对于mc-vc-PABC的结构；参见图13A)。在另一个具体的实施方式中，抗体-药物缀合物包含接头并且所述接头是CL2(对于CL2的结构，参见图13B和Cardillo等人2011,ClinCancer Res；17(10)；3157–69)。在另一个具体的实施方式中，所述抗体-药物缀合物包含接头并且所述接头是CL2A(对于CL2A的结构，参见图13B和Goldberg等人2018,Oncotarget；9(48)；28989-29006和Cardillo等人2011,Clin Cancer Res；17(10)；3157–69)。
在一些实施方式中，选择用于在本文所描述的抗体-药物缀合物中使用的接头包含一个或多个切割位点。在具体的实施方式中，选择用于在本文所描述的抗体-药物缀合物中使用的接头含有组织蛋白酶B蛋白酶位点。在其它具体的实施方式中，选择用于在本文所描述的抗体-药物缀合物中使用的接头含有组织蛋白酶B蛋白酶位点和pH-依赖性切割位点。
可以在本文所描述的抗体-药物缀合物中使用的非限制性示例性接头-药物部分对描述于Beck A等人,(2017)Nat Rev Drug Discov 16:315-337；Peters C and Brown S,(2015)Biosci Rep 35:art:e00225；McCombs JR and Owen SC(2015)The AAPS Journal17:339-351；Jackson DY(2016)Org Process Res Dev 20:852-866；和Olivier KJ andHurvitz SA主编,(2016)Antibody-Drug Conjugates:Fundamentals,Drug Development,and Clinical,Wiley。在具体的实施方式中，所述抗体-药物缀合物中的接头-药物部分对是vc-MMAE、mc-MMAF、SMCC-DM1、磺基-SPDB-DM4、SPDB-DM4、SPP-DM1、va-SGD1882、聚乙二醇8(PEG8)-va-SG3199、磺基-SPDB-DGN462、腙-CM1、vc-seco-DUBA、mb-vc-MGBA、CL2A-SN-38、具有DX-8951衍生物的肽接头、腙-多柔比星、具有Aur0101的基于可切割的vc的接头、vc-PF06380101、具有奥瑞他汀F的柔性聚合物接头、可切割的接头-微管蛋白抑制剂或者vc-利福罗格(rifalogue)。在具体的实施方式中，所述抗体-药物缀合物中的接头-药物部分对是mc-vc-PABC-MMAE(如图13A所示)。在其它具体的实施方式中，所述抗体-药物缀合物中的接头-药物部分对是CL2-SN-38(如图13B所示，其中AA是苯丙氨酸-赖氨酸)。在其它具体的实施方式中，所述抗体-药物缀合物中的接头-药物部分对是CL2A-SN-38(如图13B所示，其中AA是赖氨酸)。
在具体的实施方式中，本文所描述的抗体-药物缀合物的药物部分不干扰抗体部分与其抗原(例如，MERTK(例如，人MERTK))的结合。
5.3.抗体生产
5.3.1.生产和筛选抗体
在另一个方面，本文提供了生产本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原结合片段的方法。
可以通过本领域中已知的用于抗体合成的任何方法，例如，通过化学合成或者通过重组表达技术生产本文所描述的抗体或其抗原结合片段。除非另外说明，否则本文所描述的方法使用了分子生物学、微生物学、基因分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交以及本领域技术范围内的相关领域中的常规技术。这些技术描述于(例如)本文所引用的参考文献并且在文献中得到了全面解释。参见，例如，Maniatis T等人,(1982)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press；Sambrook J等人,(1989),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook J等人,(2001)MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY；Ausubel FM等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1987和每年的更新版)；Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(1987和每年的更新版)Gait(主编)(1984)Oligonucleotide Synthesis:A PracticalApproach,IRL Press；Eckstein(主编)(1991)Oligonucleotides and Analogues:APractical Approach,IRL Press；Birren B等人(主编)(1999)Genome Analysis:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press。
在具体的实施方式中，本文所述的抗体是通过包括产生，例如，通过DNA序列的合成、基因工程的产生的任何方式制备、表达、产生或分离的抗体(例如，重组抗体)。在某些实施方式中，这种抗体包含通过体内非天然存在于动物或哺乳动物(例如，人)的抗体种系库内的DNA序列所编码的序列。在具体的实施方式中，通过包括使用人MERTK(SEQ ID NO：131)或其胞外域(SEQ ID NO：132)作为免疫原的方法制备本文所述的抗体。
在某个方面，本文提供了制备特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的方法，所述方法包括培养本文所描述的细胞或宿主细胞。在某个方面，本文提供了制备特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的方法，所述方法包括使用本文所描述的细胞或宿主细胞(例如，包含编码本文所述的抗体的多核苷酸的细胞或宿主细胞)表达(例如，重组表达)所述抗体或其抗原结合片段。在具体的实施方式中，所述细胞是分离的细胞。在具体的实施方式中，已将外源多核苷酸引入所述细胞。在具体的实施方式中，所述方法还包括纯化得自所述细胞或宿主细胞的抗体或其抗原结合片段的步骤。
用于生产多克隆抗体的方法在本领域中是已知的(参见，例如，第11章，ShortProtocols in Molecular Biology中,(2002)第5版,Ausubel FM等人主编,John Wileyand Sons,New York)。
如本文所使用的术语“单克隆抗体”不局限于通过杂交瘤技术生产的抗体。可以使用本领域中已知的多种技术制备单克隆抗体，其包括杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或它们的组合的使用。例如，可以从外源表达本文所述的抗体或其片段，例如，该抗体的轻链和/或重链的宿主细胞重组产生单克隆抗体。用于制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的方法在本领域中是熟知的(参见，例如，第11章，Short Protocols in Molecular Biology中,(2002)第五版,Ausubel FM等人,如上)。例如，可以使用杂交瘤技术，包括本领域中已知和教导的那些，例如Harlow E&Lane D,Antibodies:A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press,第二版1988)；Hammerling GJ等人,Monoclonal Antibodiesand T-Cell Hybridomas 563 681中(Elsevier,N.Y.,1981)；和Kohler G&Milstein C(1975)Nature 256:495中已知和教导的那些生产单克隆抗体。使用杂交瘤技术用于产生和筛选特异性抗体的方法是本领域中常规且熟知的。在一些实施方式中，可以用抗原(例如，人)使小鼠(或其它动物，如大鼠、猴、驴、猪、绵羊、仓鼠或狗)免疫，并且一旦检测到免疫应答，例如，在小鼠血清中检测到对抗原特异的抗体，则收获小鼠脾脏并分离脾细胞。然后，通过熟知的技术将脾细胞融合至任何适合的骨髓瘤细胞，例如，来自得自美国模式培养物保藏所
Figure BDA0003301650990000651
(Manassas,VA)的细胞系SP2/0的细胞以形成杂交瘤。通过有限稀释选择并克隆杂交瘤。
将因此制备的杂交瘤细胞接种并在优选地含有抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞的生长或存活的一种或多种物质的适合的培养基中生长。对其中生长杂交瘤细胞的培养基测定抗MERTK(例如，人MERTK)的单克隆抗体的产生。在识别了产生具有所期望的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，可以通过标准方法(Goding JW(主编),MonoclonalAntibodies:Principles and Practice，如上)使所述克隆亚克隆、生长和从培养基分离。通过本领域中已知的方法，例如，免疫沉淀或者通过体外结合测定，如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)确定通过杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性。
在具体的实施方式中，本文公开了通过单细胞(例如，产生重组抗体的杂交瘤或宿主细胞)所产生的单克隆抗体，其中所述抗体免疫特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)，如(例如)通过ELISA或者本领域中已知的或如本文第6节中所述的其它抗原-结合或竞争性结合测定所确定的。在某些实施方式中，单克隆抗体是一价抗体或多价(例如，二价)抗体。在具体的实施方式中，单克隆抗体是单特异性或多重特异性抗体(例如，双重特异性抗体)。
可以通过本领域技术人员已知的任何技术产生识别MERTK(例如，人MERTK)的抗体片段。例如，可以通过使用酶，如木瓜蛋白酶(以生产Fab片段)或胃蛋白酶(以生产F(ab')2片段)的免疫球蛋白分子的蛋白水解切割产生本文所描述的Fab和F(ab')2片段。Fab片段对应于抗体分子的两个相同的臂中的一个，并且含有与重链的VH和CH1域配对的完整轻链。F(ab')2片段含有通过铰链区中的二硫键连接的抗体分子的两个抗原-结合臂。
此外，还可以使用本领域中已知的多种噬菌体展示方法产生本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段。在噬菌体展示法中，在具有编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上展示功能性抗体域。具体地，从动物cDNA文库(例如，受影响组织的人或鼠科cDNA文库)扩增编码VH和VL域的DNA序列。通过PCR将编码VH和VL域的DNA与scFv接头重组在一起并克隆至噬粒载体。将所述载体电穿孔至大肠杆菌(E.coli)细胞并用辅助噬菌体感染所述大肠杆菌(E.coli)。在这些方法中使用的噬菌体通常是包含fd和M13的丝状噬菌体，并且通常将VH和VL域重组融合至噬菌体基因III或基因VIII中的任一个。可以用抗原，例如，使用标记抗原或者结合或捕获至固体表面或珠上的抗原选择或识别表达结合至特定抗原的抗原结合域的噬菌体。可以用于制备本文所述的抗体的噬菌体展示方法的实例包括在Brinkman U等人,(1995)J Immunol Methods 182:41-50；Ames RS等人,(1995)JImmunol Methods 184:177-186；Kettleborough CA等人,(1994)Eur J Immunol 24:952-958；Persic L等人,(1997)Gene 187:9-18；Burton DR&Barbas CF(1994)Advan Immunol57:191-280；PCT专利申请No.PCT/GB91/001134；国际专利公开No.WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401和WO 97/13844；和美国专利No.5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108中公开的那些。
如以上参考文献中所述，在噬菌体选择后，可以将来自噬菌体的抗体编码区分离并用于产生完整抗体，包括人源化抗体，嵌合抗体或者任何其它所期望的抗原-结合片段，并且在任何所期望的宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如，如以下详细描述的。使用本领域中已知的方法，还可以使用重组产生抗体片段，如Fab、Fab'和F(ab')2片段的技术，如PCT专利公开No.WO 92/22324；Mullinax RL等人,(1992)BioTechniques 12(6):864-9；Sawai H等人,(1995)Am J Reprod Immunol34:26-34；和Better M等人,(1988)Science 240:1041-1043中所公开的那些。
在一个方面，为了产生完整抗体，可以将PCR引物用于从模板，例如，scFv克隆扩增VH或VL序列，所述PCR引物包括VH或VL核苷酸序列、限制性位点和保护所述限制性位点的侧接序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，可以将PCR扩增的VH域克隆至表达VH恒定区的载体中，并且可以将PCR扩增的VL域克隆至表达VL恒定区，例如，人κ或λ恒定区的载体中。还可以将所述VH和VL域克隆到表达必需的恒定区的一个载体中。然后，使用本领域技术人员已知的技术，将重链转化载体和轻链转化载体共转染到细胞系中以产生表达全长抗体，例如，IgG的稳定或瞬时细胞系。
嵌合抗体是其中抗体的不同部分来源于不同免疫球蛋白分子的分子。例如，嵌合抗体可以含有融合至人抗体的恒定区的小鼠或大鼠单克隆抗体的可变区。用于产生嵌合抗体的方法在本领域中是已知的。参见，例如，Morrison SL(1985)Science 229:1202-7；OiVT&Morrison SL(1986)BioTechniques 4:214-221；Gillies SD等人,(1989)J ImmunolMethods 125:191-202；和美国专利No.5,807,715、4,816,567、4,816,397和6,331,415。在具体的实施方式中，嵌合抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH和VL分别包含分别在表13中所述的VH和VL的氨基酸序列。
人源化抗体能够结合至预定抗原并且包含基本具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的框架区和基本具有非人免疫球蛋白(例如，鼠免疫球蛋白)的氨基酸序列的CDR。在具体的实施方式中，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。所述抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。人源化抗体可以选自任何类的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，和任何同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可以使用本领域中已知的多种技术生产人源化抗体，所述技术包括(但不限于)CDR-移植(欧洲专利No.EP 239400；国际专利公开No.WO 91/09967；和美国专利No.5,225,539、5,530,101和5,585,089)、贴面化(veneering)或表面重塑(resurfacing)(欧洲专利No.EP 592106和EP 519596；Padlan EA(1991)Mol Immunol 28(4/5):489-498；Studnicka GM等人,(1994)Prot Engineering 7(6):805-814；和Roguska MA等人,(1994)PNAS 91:969-973)、链改组(美国专利No.5,565,332)和(例如)美国专利No.6,407,213、美国专利No.5,766,886、国际专利公开No.WO 93/17105；Tan P等人,(2002)J Immunol 169:1119-25；Caldas C等人,(2000)Protein Eng.13(5):353-60；Morea V等人,(2000)Methods20(3):267-79；Baca M等人,(1997)J Biol Chem 272(16):10678-84；Roguska MA等人,(1996)Protein Eng 9(10):895 904；Couto JR等人,(1995)Cancer Res.55(23Supp):5973s-5977s；Couto JR等人,(1995)Cancer Res 55(8):1717-22；Sandhu JS(1994)Gene150(2):409-10和Pedersen JT等人,(1994)J Mol Biol 235(3):959-73。还参见美国专利申请公开No.US 2005/0042664 A1(2005年2月24日)中所公开的技术，以上文献以其全部内容作为参考并入本文。
在具体的实施方式中，特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的人源化抗体或其抗原-结合片段包含抗体z10的VH和VL(参见表11)、抗体z11的VH和VL(参见表12)或者抗体z13的VH和VL(参见表13)。已描述了用于制备多重特异性(例如，双重特异性抗体)的方法，参见，例如，美国专利No.7,951,917；7,183,076；8,227,577；5,837,242；5,989,830；5,869,620；6,132,992和8,586,713。
可以通过本领域中熟知的方法生产单域抗体，例如，缺少轻链的抗体。参见Riechmann L&Muyldermans S(1999)J Immunol 231:25-38；Nuttall SD等人,(2000)CurrPharm Biotechnol 1(3):253-263；Muyldermans S,(2001)J Biotechnol 74(4):277-302；美国专利No.6,005,079；和国际专利公开No.WO 94/04678、WO 94/25591和WO 01/44301。
此外，反过来，使用本领域技术人员熟知的技术，可以使用免疫特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)抗原的抗体产生“模拟”抗原的抗-独特型抗体。(参见，例如，Greenspan NS&Bona CA(1989)FASEB J 7(5):437-444；和Nissinoff A(1991)J Immunol147(8):2429-2438)。
在具体的实施方式中，本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段结合至与本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段相同或重叠的MERTK(例如，人MERTK)表位。在具体的实施方式中，竞争性阻断(例如，以剂量-依赖性方式)本文所述的抗体中的任一个(例如，z10、z11或z13或xAb)与MERTK(例如，人MERTK)的结合的本文所述的抗体是人抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段。可以使用本领域中已知的任何方法生产人抗体。例如，可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但是可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。具体地，可以将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合体随机或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞。作为另外一种选择，除人重链和轻链基因之外，可以将人可变区、恒定区和多变区引入小鼠胚胎干细胞。通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座，可以单独或同时使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因无功能性。具体地，JH区的纯合缺失防止了内源抗体产生。将修饰的胚胎干细胞扩增并微量注射到胚囊中以产生嵌合小鼠。然后，使嵌合小鼠繁殖以产生表达人抗体的纯合子代。以正常方式，通过所选的抗原，例如，抗原(例如，MERTK)的全部或部分使转基因小鼠免疫。使用常规杂交瘤技术，抗所述抗原的单克隆抗体可以得自免疫的转基因小鼠。转基因小鼠所具有的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，并且随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，有可能产生有治疗性用途的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。对于产生人抗体的这种技术的综述，参见，例如，Lonberg N&Huszar D(1995)Int RevImmunol 13:65-93。对于产生人抗体和人单克隆抗体的这种技术的详细讨论以及产生这类抗体的规程，参见，例如，国际专利公开No.WO 98/24893、WO 96/34096和WO 96/33735；和美国专利No.5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598。能够产生人抗体的小鼠的实例包括XenomouseTM(Abgenix,Inc.；美国专利No.6,075,181和6,150,184)、HuAb-MouseTM(Mederex,Inc./Gen Pharm；美国专利No.5,545,806和5,569,825)、Trans Chromo MouseTM(Kirin)和KM MouseTM(Medarex/Kirin)。
可以通过本领域中已知的多种方法，包括使用来源于人免疫球蛋白序列的抗体文库的以上所描述的噬菌体展示方法来制备特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的人抗体。还参见美国专利No.4,444,887、4,716,111和5,885,793；和国际专利公开No.WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741。
在一些实施方式中，可以使用小鼠-人杂交瘤产生人抗体。例如，用埃-巴二氏病毒(EBV)转化的人外周血单核细胞可以与小鼠骨髓瘤细胞融合以生产分泌人单克隆抗体的小鼠-人杂交瘤，并且可以筛选这些小鼠-人杂交瘤以确定分泌免疫特异性结合至靶标抗原(例如，人MERTK)的人单克隆抗体的那些小鼠。这些方法是已知的并且在本领域中进行了描述，参见，例如，Shinmoto H等人,(2004)Cytotechnology 46:19-23；Naganawa Y等人,(2005)Human Antibodies 14:27-31。
在具体的实施方式中，筛选和选择本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体或其抗原结合片段的方法如下文实施例1中所述。
一旦产生了本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，则可以通过本领域中已知的用于免疫球蛋白分子纯化的任何方法，例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱、亲合色谱，具体地在蛋白A(Protein A)之后通过对特异性抗原的亲和力和尺寸排阻色谱)、离心、差异溶解度或通过用于蛋白纯化的任何其它标准技术进行纯化。此外，可以将本文所述的抗体融合至本文所描述的或另外本领域中已知的异源多肽序列以帮助纯化。
在具体的实施方式中，分离或纯化了本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段。通常，分离的抗体是基本不含具有不同于所述分离的抗体的抗原特异性的其它抗体的抗体。例如，在具体的实施方式中，本文所述的抗体的制备基本不含细胞材料和/或化学前体。语言“基本不含细胞材料”包括抗体的制备，其中所述抗体与从中分离或重组产生所述抗体的细胞的细胞组分分离。因此，基本不含细胞材料的抗体包括具有小于约30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(按干重计)的异源蛋白质(在本文中也称为“污染蛋白”)和/或抗体的变体，例如，抗体的翻译后修饰形式或者抗体的其它不同形式(例如，抗体片段)的抗体的制备。当重组产生抗体时，它通常也基本不含培养基，即培养基占蛋白制备体积的小于约20％、10％、2％、1％、0.5％或0.1％。当通过化学合成产生抗体时，它通常基本不含化学前体或其它化学品，即它与参与蛋白合成的化学前体或其它化学品分离。因此，除目标抗体以外，这些抗体制备具有小于约30％、20％、10％或5％(按干重计)的化学前体或化合物。在具体的实施方式中，本文所述的抗体是分离或纯化的。
5.3.2.多核苷酸
在某些方面，本文提供了包含编码本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)抗原的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的核苷酸序列的多核苷酸，和载体，例如，包含这些多核苷酸以用于它们在宿主细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)和哺乳动物细胞)中的有效表达的载体。在一些实施方式中，分离或纯化了多核苷酸。
如本文所使用的，“分离的”多核苷酸或核酸分子是与存在于所述核酸分子的天然来源(例如，小鼠或人中)的其它核酸分子分离的多核苷酸或核酸分子。此外，“分离的”核酸分子，如cDNA分子当通过重组技术产生时可以基本不含其它细胞材料或者培养基，或者当化学合成时，可以基本不含化学前体或其它化学品。例如，语言“基本不含”包括具有小于约15％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％的其它材料，例如，细胞材料、培养基、其它核酸分子、化学前体和/或其它化学品的多核苷酸或核酸分子的制备。
在具体的方面，本文提供了包含编码本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的核苷酸序列的多核苷酸，所述抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)多肽并且包含如本文所描述的氨基酸序列，以及(例如，以剂量-依赖性方式)与这些抗体竞争对MERTK(例如，人MERTK)多肽的结合或者结合至与这些抗体相同或重叠的表位的抗体。
在某些方面，本文提供了包含编码本文所述的抗体的轻链或重链的核苷酸序列的多核苷酸。
在某些实施方式中，本文所描述的多核苷酸包含编码特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的核苷酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含本文所描述的氨基酸序列(SEQ ID NO：105、SEQID NO：107、SEQ ID NO：108或SEQ ID NO：109)。在某些实施方式中，本文所描述的多核苷酸包含编码本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的核苷酸序列，其中所述抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含本文所描述的氨基酸序列(SEQ ID NO：106或者SEQ ID NO：111)。在某些实施方式中，本文所描述的多核苷酸包含编码本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的核苷酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，本文所描述的多核苷酸包含编码本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的核苷酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，本文所描述的多核苷酸包含编码本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的核苷酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，本文所描述的多核苷酸包含编码特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的核苷酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，本文所描述的多核苷酸包含编码特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的核苷酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：109所示的氨基酸的重链可变区和含有SEQ IDNO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在某些实施方式中，本文所描述的多核苷酸编码VH，其中所述多核苷酸包含SEQID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122或SEQ ID NO：123所示的核酸序列。在某些实施方式中，本文所描述的多核苷酸编码VL，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：120或SEQ IDNO：124所示的核酸序列。在具体的实施方式中，本文所描述的多核苷酸编码VH和VL，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：119所示的核酸序列，并且其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：120所示的核酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的多核苷酸编码VH和VL，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：121所示的核酸序列，并且其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO：120所示的核酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文所描述的多核苷酸编码VH和VL，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：122所示的核酸序列，并且其中所述多核苷酸包含SEQID NO：120所示的核酸序列。在另一个实施方式中，本文所描述的多核苷酸编码VH和VL，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：123所示的核酸，并且其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：124所示的核酸序列。
在具体的方面，本文提供了多核苷酸，所述多核苷酸包含编码包含轻链和重链，例如，分离的轻链和重链的抗体的核苷酸序列。对于轻链，在具体的实施方式中，本文所提供的多核苷酸包含编码本文所述的抗体的核苷酸序列，所述抗体包含人κ轻链或人λ轻链。
在具体的方面，本文所提供的多核苷酸包含编码抗体轻链的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：106所示的轻链可变区和人κ或λ轻链的人轻链恒定区核苷酸序列。在另一个方面，本文所提供的多核苷酸包含编码抗体轻链的核苷酸序列，其中所述轻链包含SEQ ID NO：111所示的轻链可变区和人κ或λ轻链的人轻链恒定区。
在具体的实施方式中，本文所提供的多核苷酸包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的核苷酸序列，其中所述抗体包含轻链，并且其中所述轻链可变区的氨基酸序列可以包含SEQ ID NO：106或SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列中的任一个，并且其中所述轻链的恒定区包含人κ轻链恒定区的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的多核苷酸包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)并且包含轻链的抗体的核苷酸序列，其中所述轻链可变区的氨基酸序列可以包含SEQ ID NO：106或SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列中的任一个，并且其中所述轻链恒定区包含人λ轻链恒定区的氨基酸序列。在另一个方面，本文所提供的多核苷酸包含编码抗体轻链的核苷酸序列，其中所述轻链包含SEQ ID NO：113或118所示的氨基酸序列。在另一个方面，本文所提供的多核苷酸包含编码特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的轻链的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：126或130。
在具体的实施方式中，本文所提供的多核苷酸包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的核苷酸序列，其中所述抗体包含重链，其中所述重链包含SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列和重链恒定区。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的多核苷酸包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)并且包含重链的抗体的核苷酸序列，其中所述重链包含SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列和重链恒定区。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的多核苷酸包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)并且包含重链的抗体的核苷酸序列，其中所述重链包含SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列和重链恒定区。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的多核苷酸包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)并且包含重链的抗体的核苷酸序列，其中所述重链包含SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列和重链恒定区。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的多核苷酸包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)并且包含重链的抗体的核苷酸序列，其中所述重链包含SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列和重链恒定区。
在具体的实施方式中，本文所提供的多核苷酸包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的核苷酸序列，其中所述抗体包含重链，其中所述重链包含SEQ ID NO：112所示的氨基酸序列。在具体的实施方式中，本文所提供的多核苷酸包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的核苷酸序列，其中所述抗体包含重链，其中所述重链包含SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列。在具体的实施方式中，本文所提供的多核苷酸包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的核苷酸序列，其中所述抗体包含重链，其中所述重链包含SEQ ID NO：115所示的氨基酸序列。在具体的实施方式中，本文所提供的多核苷酸包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的核苷酸序列，其中所述抗体包含重链，其中所述重链包含SEQ ID NO：116所示的氨基酸序列。在具体的实施方式中，本文所提供的多核苷酸包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的核苷酸序列，其中所述抗体包含重链，其中所述重链包含SEQ ID NO：117所示的氨基酸序列。
在具体的方面，本文所提供的多核苷酸包含编码特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体重链的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：119和人重链恒定区核苷酸序列。在另一个方面，本文所提供的多核苷酸包含编码特异性结合MERTK的抗体重链的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：125。
在具体的方面，本文所提供的多核苷酸包含编码特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体重链的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：121和人重链恒定区核苷酸序列。在另一个方面，本文所提供的多核苷酸包含编码特异性结合MERTK的抗体重链的核苷酸序列，其中所述核苷酸包含SEQ ID NO：127。
在具体的方面，本文所提供的多核苷酸包含编码特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体重链的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：122和人重链恒定区核苷酸序列。在另一个方面，本文所提供的多核苷酸包含编码特异性结合MERTK(例如，人MERTK)的抗体重链的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：128。
在具体的方面，本文所提供的多核苷酸包含编码特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体重链的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：123和人重链恒定区核苷酸序列。在另一个方面，本文所提供的多核苷酸包含编码特异性结合MERTK(例如，人MERTK)的抗体重链的核苷酸序列，其中所述核苷酸包含SEQ ID NO：129。
在具体的方面，本文所提供的多核苷酸包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的轻链的核苷酸序列和编码所述抗体的重链的核苷酸序列，其中编码所述重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：119和人重链恒定区核苷酸序列，并且其中编码所述轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：120和人重链恒定区核苷酸序列。在另一个具体方面，本文所提供的多核苷酸包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的轻链的核苷酸序列和编码所述抗体的重链的核苷酸序列，其中编码所述轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：120和人轻链恒定区核苷酸序列，并且其中编码所述重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：121和人重链恒定区核苷酸序列。在另一个具体方面，本文所提供的多核苷酸包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的轻链的核苷酸序列和编码所述抗体的重链的核苷酸序列，其中编码所述轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：120和人轻链恒定区核苷酸序列，并且其中编码所述重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：122和人重链恒定区核苷酸序列。在另一个具体方面，本文所提供的多核苷酸包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的轻链的核苷酸序列和编码所述抗体的重链的核苷酸序列，其中编码所述轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：124和人轻链恒定区核苷酸序列，并且其中编码所述重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：123和人重链恒定区核苷酸序列。
在具体的方面，本文所提供的多核苷酸包含编码特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的核苷酸序列，其中所述抗体包含：(1)包含SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的重链可变区和人重链恒定区；和(2)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区和人轻链恒定区。在另一个具体方面，本文所提供的多核苷酸包含编码特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的核苷酸序列，其中所述抗体包含：(1)包含SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的重链可变区和人重链恒定区；和(2)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区和人轻链恒定区。在另一个具体方面，本文所提供的多核苷酸包含编码特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的核苷酸序列，其中所述抗体包含：(1)包含SEQID NO：108所示的氨基酸序列的重链可变区和人重链恒定区；和(2)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区和人轻链恒定区。在另一个具体方面，本文所提供的多核苷酸包含编码特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的核苷酸序列，其中所述抗体包含：(1)包含SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的重链可变区和人重链恒定区；和(2)包含SEQID NO：111所示的氨基酸序列的轻链可变区和人轻链恒定区。
在另一个具体方面，本文所提供的多核苷酸包含编码特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的核苷酸序列，其中所述抗体包含：(1)包含SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的重链可变区和人重链恒定区；和(2)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的轻链可变区和人轻链恒定区。
在另一个具体的实施方式中，本文所提供的多核苷酸包含编码特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的核苷酸序列，其中一个核苷酸序列编码所述抗体的重链而另一个核苷酸序列编码所述抗体的轻链，并且其中编码所述重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：125，并且编码所述轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：126。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的多核苷酸包含编码特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的核苷酸序列，其中一个核苷酸序列编码所述抗体的重链而另一个核苷酸序列编码所述抗体的轻链，并且其中编码所述重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：127，并且编码所述轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：126。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的多核苷酸包含编码特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的核苷酸序列，其中一个核苷酸序列编码所述抗体的重链而另一个核苷酸序列编码所述抗体的轻链，并且其中编码所述重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：128，并且编码所述轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：126。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的多核苷酸包含编码特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的核苷酸序列，其中一个核苷酸序列编码所述抗体的重链而另一个核苷酸序列编码所述抗体的轻链，并且其中编码所述重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：129，并且编码所述轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：130。
在另一个具体的实施方式中，本文所提供的多核苷酸包含编码特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的核苷酸序列，其中一个核苷酸序列编码所述抗体的重链而另一个编码所述抗体的轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO：112所示的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的多核苷酸包含编码特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的核苷酸序列，其中一个核苷酸序列编码所述抗体的重链而另一个编码所述抗体的轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的多核苷酸包含编码特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的核苷酸序列，其中一个核苷酸序列编码所述抗体的重链而另一个编码所述抗体的轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO：115所示的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的多核苷酸包含编码特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的核苷酸序列，其中一个核苷酸序列编码所述抗体的重链而另一个编码所述抗体的轻链，其中所述重链包含SEQ IDNO：116所示的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文所提供的多核苷酸包含编码特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的核苷酸序列，其中一个核苷酸序列编码所述抗体的重链而另一个编码所述抗体的轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO：117所示的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO：118所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，多核苷酸、核酸或核苷酸包括脱氧核糖核酸、核糖核酸、核糖核苷酸及其多聚形式。在一些实施方式中，多核苷酸、核酸或核苷酸是单链或双链的。在具体的实施方式中，多核苷酸、核酸或核苷酸序列是cDNA序列。
在一些实施方式中，本文所描述的编码抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的多核苷酸序列(例如，核酸序列)是使用本领域技术人员已知的方法密码子优化的。在某些实施方式中，编码本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段(例如，VH域和/或VL域)的优化的多核苷酸序列可以杂交至编码本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段(例如，VH域和/或VL域)的未优化的多核苷酸序列的反义(例如，互补)多核苷酸。在具体的实施方式中，编码本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的优化的核苷酸序列在高严格性条件下杂交至编码本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的未优化的多核苷酸序列的反义多核苷酸。在具体的实施方式中，编码抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的优化的核苷酸序列在高严格性、中或低严格性杂交条件下杂交至编码本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的未优化的核苷酸序列的反义多核苷酸。已描述了有关杂交条件的信息，参见，例如，美国专利申请公开No.US 2005/0048549(例如，第72-73段)，该专利申请作为参考并入本文。
可以获得多核苷酸，并通过本领域中已知的任何方法确定所述多核苷酸的核苷酸序列。可以使用本领域中熟知的方法确定编码本文所述的抗体以及这些抗体的修饰形式的核苷酸序列，即将已知编码特定氨基酸的核苷酸密码子以这种方式组装以产生编码所述抗体的核酸序列。可以从化学合成的寡核苷酸组装编码所述抗体的这种多核苷酸(例如，如Kutmeier G等人,(1994),BioTechniques 17:242-6中所述)，简要地，这包括含有编码所述抗体的序列部分的重叠寡核苷酸的合成、那些寡核苷酸的退火和连接，然后通过PCR扩增所述连接的寡核苷酸。
作为另外一种选择，可以使用本领域中熟知的方法(例如，PCR及其它分子克隆方法)从来自适合来源(例如，杂交瘤)的核酸产生编码本文所述的抗体的多核苷酸。例如，可以使用得自生产目标抗体的杂交瘤细胞的基因组DNA实施使用可杂交至已知序列的3'和5'端的合成引物的PCR扩增。这些PCR扩增方法可以用于获得包含编码抗体的轻链和/或重链的序列的核酸。这些PCR扩增方法可以用于获得包含编码抗体的轻链可变区和/或重链可变区的序列的核酸。可以将扩增的核酸克隆到载体中以用于在宿主细胞中表达和用于进一步克隆，例如，以产生人源化抗体。
如果含有编码特定抗体的核酸序列的克隆不可得，但是所述抗体分子的序列已知，则可以化学合成或者通过使用可杂交至所述序列的3'和5'端的合成引物的PCR扩增或者通过使用对特定基因序列特异的寡核苷酸探针的克隆以(例如)从编码所述抗体的cDNA文库中鉴别cDNA克隆，从适合的来源(例如，从表达所述抗体的任何组织或细胞(如选择以表达本文所述的抗体的杂交瘤细胞)产生的抗体cDNA文库或cDNA文库，或者分离自所述表达所述抗体的任何组织或细胞的核酸，优选地多聚A+RNA)获得编码所述免疫球蛋白的核酸。然后，可以使用本领域中熟知的任何方法将通过PCR所产生的扩增的核酸克隆到可复制的克隆载体中。
可以使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合至编码所述抗-MERTK抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地对编码本文所描述的抗-MERTK抗体的DNA进行分离和测序。杂交瘤细胞可以用作这种DNA的来源。一旦分离，可以将所述DNA置于表达载体中，然后转染至宿主细胞，如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如，来自CHO GS SystemTM(Lonza)的CHO细胞)、293F细胞、HEK293细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中，以在所述重组宿主细胞中获得MERTK激动性抗体的合成。
为了产生完整抗体，可以将PCR引物用于扩增scFv克隆中的VH或VL序列，所述PCR引物包括VH或VL核苷酸序列、限制性位点和保护所述限制性位点的侧接序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，可以将PCR扩增的VH域克隆至表达重链恒定区，例如，人γ4恒定区的载体中，并且可以将PCR扩增的VL域克隆至表达轻链恒定区，例如，人κ或λ恒定区的载体中。在某些实施方式中，用于表达VH或VL域的载体包含启动子、分泌信号、可变域的克隆位点、恒定域和选择标志物。还可以将所述VH和VL域克隆到表达必需的恒定区的一个载体中。然后，使用本领域技术人员已知的技术，将重链转化载体和轻链转化载体共转染到细胞系中以产生表达全长抗体，例如，IgG的稳定或瞬时细胞系。
还可以(例如)通过以下方式修饰DNA：用编码序列替换人重链和轻链恒定域以代替鼠科序列，或者通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接至免疫球蛋白编码序列。
还提供了在高严格性、中或低严格性杂交条件下杂交至编码本文所述的抗体或其抗原-结合片段的多核苷酸的多核苷酸。在具体的实施方式中，本文所描述的多核苷酸在高严格性、中或低严格性杂交条件下杂交至本文所提供的编码VH(SEQ ID NO：119、121、122或123)和/或VL(SEQ ID NO：120或124)的多核苷酸。
已在本领域中描述了杂交条件并且所述杂交条件是本领域技术人员已知的。例如，严格条件下的杂交可以包括在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，在约45℃下杂交至过滤器-结合的DNA，然后在0.2×SSC/0.1％SDS中，在约50-65℃清洗一次或多次；高严格条件下的杂交可以包括在6×SSC中，在约45℃杂交至过滤器-结合的核酸，然后在0.1×SSC/0.2％SDS中，在约68℃清洗一次或多次。其它严格杂交条件下的杂交是本领域技术人员已知的并且已得到描述，参见，例如，Ausubel FM等人主编,(1989)Current Protocols inMolecular Biology,I卷,Green Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.,New York，6.3.1-6.3.6和2.10.3页。
5.3.3.细胞和载体
在某些方面，本文提供了包含含有用于在宿主细胞，优选地在哺乳动物细胞中重组表达的编码本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的核苷酸序列的多核苷酸的载体(例如，表达载体)。表达载体可以是(例如)质粒或病毒载体(如新城疫病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、牛痘等)。本文还提供了包含用于重组表达本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原结合片段的这些载体的宿主细胞。
本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体(例如，全长抗体、抗体的重链和/或轻链或者本文所述的单链抗体)的重组表达包括含有编码所述抗体的多核苷酸的表达载体的构建。一旦已获得了本文所描述的编码抗体分子的多核苷酸、抗体的重链和/或轻链或其抗原-结合片段(例如，重链和/或轻链可变区)，则可以使用在本领域中熟知的技术，通过DNA重组技术产生用于抗体分子生产的载体。因此，本文描述了通过表达含有抗体或抗体片段(例如，轻链或重链或两者)的编码核苷酸序列的多核苷酸用于制备蛋白的方法。对于本领域技术人员来说是熟知的方法可以用于构建含有抗体或抗体片段(例如，轻链或重链或两者)编码序列和适合的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括(例如)体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。还提供了包含可操作性地连接至启动子的，编码本文所描述的抗体分子、抗体的重链或轻链或者抗-MERTK抗体的重链或轻链可变域或其抗原-结合片段的核苷酸序列的可复制载体。这些载体可以(例如)包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见，例如，国际专利公开No.WO 86/05807和WO 89/01036；和美国专利No.5,122,464)，并且可以将所述抗体的可变域克隆至该载体以用于整个重链、整个轻链或整个重链和轻链两者的表达。
可以通过常规技术将表达载体转移至细胞(例如，宿主细胞)，然后通过常规技术培养所产生的细胞以生产本文所述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段。因此，本文提供了宿主细胞，其含有可操作性地连接至启动子的编码本文所述的抗体或其抗原-结合片段，或者其重链或轻链或其片段，或者本文所述的单链抗体的多核苷酸以用于这些序列在宿主细胞中的表达。如本文所使用的，术语“宿主细胞”可以是任何类型的细胞，例如，原代细胞、培养中的细胞或者来自细胞系的细胞。在具体的实施方式中，术语“宿主细胞”是指用核酸分子转染的细胞和这种细胞的子代或潜在子代。由于可能在核酸分子向宿主细胞基因组的成功产生或整合中发生的突变或环境影响，这种细胞的子代可以与用所述核酸分子转染的亲代细胞不相同。
可以使用多种宿主-表达载体系统来表达本文所描述的抗体分子。这些宿主-表达系统代表了通过它们可以产生目标编码序列并随后纯化的媒介物，而且还代表了当用适合的核苷酸编码序列转化或转染时，可以原位表达本文所描述的抗体分子的细胞。这些包括(但不限于)微生物，如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，毕赤酵母(Saccharomyces pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或者用重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统(例如，绿藻，如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii))；或者具有包含来源于哺乳动物细胞的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或者来源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS(例如，COS1或COS)、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa和NIH 3T3、HEK-293T、293F、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20和BMT10细胞)。在具体的实施方式中，用于表达本文所述的抗体或其抗原-结合片段的细胞是CHO细胞，例如，来自CHO GSSystemTM(Lonza)的CHO细胞。在具体的实施方式中，用于表达本文所述的抗体的细胞是人细胞，例如，人细胞系。在具体的实施方式中，哺乳动物表达载体是pOptiVECTM或pcDNA3.3。在具体的实施方式中，将细菌细胞，如大肠杆菌(Escherichia coli)，或者真核细胞(例如，哺乳动物细胞)用于重组抗体分子的表达，特别是用于完整重组抗体分子的表达。例如，哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，结合载体，如来自人巨细胞病毒的主要的中间早期基因启动子元件是抗体的有效表达系统(Foecking MK&Hofstetter H(1986)Gene 45:101-5；和Cockett MI等人,(1990)Biotechnology 8(7):662-7)。在某些实施方式中，通过CHO细胞或NS0细胞产生了本文所述的抗体。在具体的实施方式中，通过组成型启动子、诱导型启动子或者组织特异性启动子调控编码本文所描述的免疫特异性结合MERTK(例如，人MERTK)的抗体的核苷酸序列的表达。
在细菌系统中，可以基于旨在用于要表达的抗体分子的使用，有利地选择一些表达载体。例如，当产生大量这种抗体时，对于抗体分子的药物组合物的产生，指导易于纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体可以是所期望的。这些载体包括(但不限于)大肠杆菌(E.coli)表达载体pUR278(Ruether U&Mueller-Hill B(1983)EMBO J 2:1791-1794)，其中可以将抗体编码序列在具有lac Z编码区的框中单独连接至所述载体，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye S&Inouye M(1985)Nuc Acids Res 13:3101-3109；Van Heeke G&Schuster SM(1989)J Biol Chem 24:5503-5509)；等。例如，pGEX载体还可以作为与谷胱甘肽5-转移酶(GST)的融合蛋白用于表达外源多肽。通常，这些融合蛋白是可溶性的并且可以通过吸附并结合至基质谷胱甘肽琼脂糖珠，然后在存在游离谷胱甘肽的情况下洗脱，从裂解的细胞中容易地纯化。pGEX载体设计以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，从而可以从GST部分中释放克隆的靶标基因产物。
在昆虫系统中，例如，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病病毒(AcNPV)可以用作载体以表达外源基因。病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可以将抗体编码序列单独克隆至病毒的非必要区(例如，多角体蛋白基因)，并且置于AcNPV启动子的控制之下(例如，多角体蛋白启动子)。
在哺乳动物宿主细胞中，可以使用一些基于病毒的表达系统。如果将腺病毒用作表达载体，则目标抗体编码序列可以连接至腺病毒转录/翻译控制复合物，例如，晚期启动子和三联前导序列。然后，可以将这种嵌合基因通过体外或体内重组插入腺病毒基因组。病毒基因组的非必要区(例如，El或E3区)中的插入将导致产生在受感染的宿主中存活且能够表达所述抗体分子的重组病毒(例如，参见Logan J&Shenk T(1984)PNAS81(12):3655-9)。对于插入的抗体编码序列的有效翻译，还可以需要特异性起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻的序列。此外，起始密码子必须与所期望的编码序列的阅读框同步(in phasewith)以确保整个插入物的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是多种来源的，即天然和合成来源两者。可以通过包含适合的转录增强子元件、转录终止子等来提高表达效率(参见，例如，Bitter G等人,(1987)Methods Enzymol.153:516-544)。
另外，可以选择调控插入的序列的表达或者以所期望的特异性方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白产物的这些修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)可以对于蛋白功能是重要的。不同宿主细胞对于蛋白和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性和特异性机制。可以选择适合的细胞系或宿主系统以确保所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可以使用具有初级转录本的适当加工、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。这些哺乳动物宿主细胞包括(但不限于)CHO、VERO、BHK、Hela、MDCK、HEK293、NIH 3T3、W138、293F、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不会内源产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O、COS(例如，COS1或COS)、PER.C6 VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HEK293、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20、BMT10和HsS78Bst细胞。在某些实施方式中，在哺乳动物细胞，如CHO细胞中产生了本文所述的抗-MERTK抗体。
在具体的实施方式中，本文所述的抗体或其抗原-结合片段具有降低的岩藻糖含量或者无岩藻糖含量。可以使用本领域技术人员已知的技术产生这些抗体。例如，在岩藻糖基化能力缺陷或缺乏的细胞中表达所述抗体。在具体实例中，α1,6-岩藻糖基转移酶的两个等位基因敲除的细胞系可以用于产生岩藻糖含量降低的抗体或其抗原结合片段。
Figure BDA0003301650990000781
系统(Lonza)是可以用于产生岩藻糖含量降低的抗体或其抗原结合片段的这种系统的实例。
对于重组蛋白的长期、高产量生产，可以产生稳定的表达细胞。例如，可以工程设计稳定表达本文所述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或本文所描述的嵌合抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的细胞系。在具体的实施方式中，本文所提供的细胞稳定表达结合以形成本文所述的抗体或其抗原-结合片段的轻链/轻链可变域和重链/重链可变域。
在某些方面，不使用含有病毒复制起点的表达载体，可以用通过适合的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)和可选择标志物控制的DNA转化宿主细胞。在外源DNA/多核苷酸的引入后，可以允许工程细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转移至选择培养基。重组质粒中的可选择标志物赋予了选择耐受性并且允许细胞将质粒稳定整合到它们的染色体中并生长以形成反过来可以克隆并扩增为细胞系的点(foci)。这种方法可以有利地用于工程化表达本文所述的人源化抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或者本文所述的嵌合抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的细胞系。这些工程化细胞系可以在与抗体分子直接或间接相互作用的组合物的筛选和评价中特别有用。
可以使用一些选择系统，其包括(但不限于)单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler M等人,(1977)Cell 11(1):223-32)、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska EH&SzybalskiW(1962)PNAS 48(12):2026-2034)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy I等人,(1980)Cell 22(3):817-23)基因，其分别可以在tk-、hgprt-或者aprt-细胞中使用。另外，可以将抗代谢物耐受性用作以下基因的选择基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的耐受性(Wigler M等人,(1980)PNAS 77(6):3567-70；O’Hare K等人,(1981)PNAS 78:1527-31)；gpt，其赋予对麦考酚酸的耐受性(Mulligan RC&Berg P(1981)PNAS 78(4):2072-6)；neo，其赋予对氨基糖苷类G-418的耐受性(Wu GY&Wu CH(1991)Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev P(1993)Ann RevPharmacol Toxicol 32:573-596；Mulligan RC(1993)Science 260:926-932；和MorganRA&Anderson WF(1993)Ann Rev Biochem 62:191-217；Nabel GJ&Felgner PL(1993)Trends Biotechnol 11(5):211-5)；和hygro，其赋予对潮霉素的耐受性(Santerre RF等人,(1984)Gene 30(1-3):147-56)。可以常规地应用DNA重组技术领域中通常已知的方法来选择所期望的重组克隆，并且这些方法描述于，例如，Ausubel FM等人(主编),CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1993)；Kriegler M,GeneTransfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)；和在第12和13章,Dracopoli NC等人(主编),Current Protocols in Human Genetics,John Wiley&Sons,NY(1994)；Colbère-Garapin F等人,(1981)J Mol Biol 150:1-14，以上文献以其全部内容作为参考并入本文。
可以通过载体扩增来提高抗体分子的表达水平(对于综述，参见Bebbington CR&Hentschel CCG,The use of vectors based on gene amplification for theexpression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning,第3卷(AcademicPress,New York,1987))。当表达抗体的载体系统中的标志物是可扩增的时，存在于宿主细胞培养物中的抑制剂水平的升高将提高标志物基因的拷贝数。由于扩增区与抗体基因有关，因此抗体的产生也将提高(Crouse GF等人,(1983)Mol Cell Biol 3:257-66)。
可以将宿主细胞与本文所描述的两种或更多种表达载体共转染，其中第一载体编码重链来源的多肽而第二载体编码轻链来源的多肽。所述两种载体可以含有相同的可选择标志物，其使得重链和轻链多肽的表达相等。宿主细胞可以与不同的量的两种或更多种表达载体共转染。例如，可以使用以下第一表达载体和第二表达载体比值中的任一种转染宿主细胞：1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45或1:50。
在具体的方面，本文所提供的宿主细胞包含载体，其中所述载体包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的轻链可变区(VL)的核苷酸序列和编码所述抗体的重链可变区(VH)的核苷酸序列，其中所述VL包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列，并且其中所述VH包含SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列。在另一个具体方面，本文所提供的宿主细胞包含载体，其中所述载体包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的轻链的核苷酸序列和编码所述抗体的重链的核苷酸序列，其中所述轻链包含含有SEQ ID NO：106所示的氨基酸的轻链可变区和人轻链恒定区，并且其中所述重链包含含有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的重链可变区和人重链恒定区。
在具体的方面，本文所提供的宿主细胞包含载体，其中所述载体包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的轻链可变区(VL)的核苷酸序列和编码所述抗体的重链可变区(VH)的核苷酸序列，其中所述VL包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列，并且其中所述VH包含SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列。在另一个具体方面，本文所提供的宿主细胞包含载体，其中所述载体包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的轻链的核苷酸序列和编码所述抗体的重链的核苷酸序列，其中所述轻链包含含有SEQ ID NO：106所示的氨基酸的轻链可变区和人轻链恒定区，并且其中所述重链包含含有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的重链可变区和人重链恒定区。
在具体的方面，本文所提供的宿主细胞包含载体，其中所述载体包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的VL的核苷酸序列和编码所述抗体的VH的核苷酸序列，其中所述VL包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列，并且其中所述VH包含SEQID NO：107所示的氨基酸序列。在另一个具体方面，本文所提供的宿主细胞包含载体，其中所述载体包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的轻链的核苷酸序列和编码所述抗体的重链的核苷酸序列，其中所述轻链包含含有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VL和人轻链恒定区，并且其中所述重链包含含有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH和人重链恒定区。
在具体的方面，本文所提供的宿主细胞包含载体，其中所述载体包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的VL的核苷酸序列和编码所述抗体的VH的核苷酸序列，其中所述VL包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列，并且其中所述VH包含SEQID NO：108所示的氨基酸序列。在另一个具体方面，本文所提供的宿主细胞包含载体，其中所述载体包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的轻链的核苷酸序列和编码所述抗体的重链的核苷酸序列，其中所述轻链包含SEQ ID NO：108所示的轻链可变区和人轻链恒定区，并且其中所述重链包含SEQ ID NO：105所示的重链可变区核苷酸序列和人重链恒定区。
在具体的方面，本文所提供的宿主细胞包含载体，其中所述载体包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的VL的核苷酸序列和编码所述抗体的VH的核苷酸序列，其中所述VL包含SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列，并且其中所述VH包含SEQID NO：110所示的氨基酸序列。
在另一个具体方面，本文所提供的宿主细胞包含载体，其中所述载体包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的轻链的核苷酸序列和编码所述抗体的重链的核苷酸序列，其中编码轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：120和人轻链恒定区核苷酸序列，并且其中编码重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：119和人重链恒定区核苷酸序列。
在另一个具体方面，本文所提供的宿主细胞包含载体，其中所述载体包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的轻链的核苷酸序列和编码所述抗体的重链的核苷酸序列，其中编码轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：120和人轻链恒定区核苷酸序列，并且其中编码重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：121和人重链恒定区核苷酸序列。在另一个具体方面，本文所提供的宿主细胞包含载体，其中所述载体包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的轻链的核苷酸序列和编码所述抗体的重链的核苷酸序列，其中编码轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：120和人轻链恒定区核苷酸序列，并且其中编码重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：122和人重链恒定区核苷酸序列。在另一个具体方面，本文所提供的宿主细胞包含载体，其中所述载体包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的轻链的核苷酸序列和编码所述抗体的重链的核苷酸序列，其中编码轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：124和人轻链恒定区核苷酸序列，并且其中编码重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：123和人重链恒定区核苷酸序列。
在具体的方面，本文所提供的宿主细胞包含第一载体和第二载体，其中所述第一载体包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的重链可变区的核苷酸序列，其中所述第二载体包含所述抗体的轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ IDNO：105所示的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列。在另一个具体方面，本文所提供的宿主细胞包含第一载体和第二载体，其中所述第一载体包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的重链可变区的核苷酸序列，其中所述第二载体包含所述抗体的轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ IDNO：107所示的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列。在另一个具体方面，本文所提供的宿主细胞包含第一载体和第二载体，其中所述第一载体包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的重链可变区的核苷酸序列，其中所述第二载体包含所述抗体的轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ IDNO：108所示的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列。在另一个具体方面，本文所提供的宿主细胞包含第一载体和第二载体，其中所述第一载体包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的重链可变区的核苷酸序列，其中所述第二载体包含所述抗体的轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ IDNO：109所示的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列。在另一个具体方面，本文所提供的宿主细胞包含第一载体和第二载体，其中所述第一载体包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的重链可变区的核苷酸序列，其中所述第二载体包含所述抗体的轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ IDNO：110所示的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述第一载体包含重链恒定区和/或所述第二载体包含轻链恒定区。
作为另外一种选择，可以使用单个载体，其编码并且能够表达重链和轻链多肽两者。在这种表达载体中，可以通过常见的启动子驱动两种基因的转录，然而来自第一基因的mRNA的翻译可以通过帽依赖性(cap-dependent)扫描机理，而来自第二基因的mRNA的翻译可以通过非帽依赖性(cap-independent)机制，例如，通过IRES。
在具体的方面，本文所提供的宿主细胞包含载体，其中所述载体包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的重链可变区的核苷酸序列和编码所述抗体的轻链可变区的核苷酸，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列。在另一个具体方面，本文所提供的宿主细胞包含载体，其中所述载体包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的重链可变区的核苷酸序列和编码所述抗体的轻链可变区的核苷酸，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含SEQID NO：106所示的氨基酸序列。在另一个具体方面，本文所提供的宿主细胞包含载体，其中所述载体包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的重链可变区的核苷酸序列和编码所述抗体的轻链可变区的核苷酸，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列。在另一个具体方面，本文所提供的宿主细胞包含载体，其中所述载体包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的重链可变区的核苷酸序列和编码所述抗体的轻链可变区的核苷酸，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列。在另一个具体方面，本文所提供的宿主细胞包含载体，其中所述载体包含编码本文所述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗体的重链可变区的核苷酸序列和编码所述抗体的轻链可变区的核苷酸，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含SEQID NO：111所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述载体包含重链恒定区和/或轻链恒定区。
在具体的实施方式中，在使用本领域中已知的技术生产通过包含在宿主细胞中的多核苷酸序列所编码的抗体或其抗原结合片段的条件下，培养本文所描述的宿主细胞(例如，离体宿主细胞)。在某些实施方式中，使用本领域中已知的技术从宿主细胞分离或纯化抗体或其抗原结合片段。
5.4.抗体-药物缀合物的生产
在另一个方面，本文提供了生产其中不存在接头的本文所描述的抗体-药物缀合物的方法，所述方法包括：(a)将细胞毒性剂直接缀合至抗体部分以生产抗体-药物缀合物；和(b)纯化所述抗体-药物缀合物。在第6节(例如，实施例4中)描述了生产抗体-药物缀合物的方法的实例。
在另一个方面，本文提供了生产其中抗体-药物缀合物包含接头的本文所描述的抗体-药物缀合物的方法，所述方法以所述顺序包括以下步骤：(a)将所述接头直接缀合至抗体部分以产生接头-抗体部分；(b)将所述接头-抗体部分的接头直接缀合至细胞毒性剂以产生抗体-药物缀合物；和(c)纯化所述抗体-药物缀合物。
在另一个方面，本文提供了生产其中抗体-药物缀合物包含接头的本文所描述的抗体-药物缀合物的方法，所述方法以所述顺序包括以下步骤：(a)将所述接头直接缀合至细胞毒性剂以产生接头-细胞毒性剂部分；(b)将所述接头-细胞毒性剂部分的接头直接缀合至抗体部分以产生抗体-药物缀合物；和(c)纯化所述抗体-药物缀合物。
可以通过本领域中已知用于产生抗体-药物缀合物的方法来实施所述缀合和纯化步骤，如Beck A等人,(2017)Nat Rev Drug Discov 16:315-337；Peters C and Brown S,(2015)Biosci Rep 35:art:e00225；McCombs JR and Owen SC(2015)The AAPS Journal17:339-351；Jackson DY(2016)Org Process Res Dev 20:852-866；或者Olivier KJ andHurvitz SA主编,(2016)Antibody-Drug Conjugates:Fundamentals,Drug Development,and Clinical,Wiley中所述的方法。在一些实施方式中，所述药物部分缀合至所述抗体部分的一条链(例如，当所述抗体部分为scFv时或者当所述抗体部分为多链抗体，如(作为四聚体的)免疫球蛋白或其抗原-结合片段时)。在其它实施方式中，所述药物部分为缀合至所述抗体部分的两条或更多条链(当所述抗体部分是多链抗体，如免疫球蛋白或其抗原-结合片段时)。在具体的实施方式中，将所述药物部分缀合至免疫球蛋白的两条相同的链，例如，重链或轻链。在其它实施方式中，所述药物部分缀合至所述抗体部分的全部链(当所述抗体部分是多链抗体，如免疫球蛋白或其抗原-结合片段时)。在具体的实施方式中，通过色谱纯化本文所描述的抗体-药物缀合物。在另一个具体的实施方式中，通过离心纯化本文所描述的抗体-药物缀合物。通过举例而不是限制，可以用于产生抗体-药物缀合物的缀合化学可以是硫醇加马来酰亚胺、硫醇加自水解马来酰亚胺、硫醇加苯基恶二唑砜、肟连接、烷氧基胺-向-酮基的反应、张力诱导型叠氮-炔基环化加成(SPAAC)、无铜点击化学、氧化为甲酰甘氨酸的半胱氨酸、联氨基-异-Pictet-Spengler(HIPS)连接、来自谷氨酰胺残基的γ-酰胺基加伯胺的连接、连接LPETG加聚甘氨酸基序的伯胺、马来酰亚胺加6-硫代岩藻糖、酰肼的岩藻糖-特异性缀合、高碘酸盐氧化(醛)加氨基-氧-有效负荷(amino-oxy-payload)、张力诱导型炔基-叠氮环化加成、C2-酮-半乳糖部分肟化(C2-keto-gal oximation)、位点选择性醛氧化加肟连接、肟连接NH2加吲哚-基5-二氟-2,4-二硝基苯衍生物、硫醇加双-砜、硫醇加二溴代马来酰亚胺、硫醇加马来酰亚胺，然后pH 9.2处理(45℃，48小时)或者硫醇加芳基丙腈(参见Beck A等人,(2017)Nat Rev Drug Discov 16:315-337)。
可以如下文5.3中所述产生本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段。在具体的实施方式中，通过本领域中已知的方法工程化或修饰本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段以辅助与药物部分的缀合，具体地以帮助与药物部分的位点-特异性缀合，例如，通过Beck A等人,(2017)Nat Rev Drug Discov 16:315-337；Peters C and BrownS,(2015)Biosci Rep 35:art:e00225；McCombs JR and Owen SC(2015)The AAPS Journal17:339-351；Jackson DY(2016)Org Process Res Dev 20:852-866；或者Olivier KJ andHurvitz SA主编,(2016)Antibody-Drug Conjugates:Fundamentals,Drug Development,and Clinical,Wiley中所述的方法。可以用于工程化或修饰抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段(参见Beck A等人,(2017)Nat Rev Drug Discov 16:315-337)以辅助与药物部分的缀合的非限制性示例性方法包括添加一个或多个其它半胱氨酸或硒代半胱氨酸、非天然氨基酸工程化、添加通过可以辅助缀合的某些酶可识别的一个或多个氨基酸标签、聚糖重塑、添加氨基末端丝氨酸和天然半胱氨酸桥连。
可以通过本领域中分别对于接头和细胞毒性剂已知的任何方法产生接头和细胞毒性剂。
5.5.药物组合物
本文提供了药物组合物，其包含(a)本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段和(b)药物可用的载体。在具体的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是纯化的。在具体的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段以治疗有效量存在于所述药物组合物中。在具体的实施方式中，所述药物组合物包含抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其含有包含SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VL(例如，抗体z10)。在另一个具体的实施方式中，所述药物组合物包含抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其含有包含SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VL(例如，抗体z11)。在另一个具体的实施方式中，所述药物组合物包含抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其含有包含SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VL(例如，抗体z13)。在另一个具体的实施方式中，所述药物组合物包含抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，其含有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列和包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VL。
本文还提供了药物组合物，其包含(a)本文所描述的嵌合抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段和(b)药物可用的载体。在具体的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是纯化的。在具体的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段以治疗有效量存在于所述药物组合物中。在具体的实施方式中，所述药物组合物包含嵌合抗体或其抗原-结合片段，其含有包含SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列的VL(例如，抗体xAb)。本文还提供了药物组合物，其包含本文所描述的多核苷酸或载体和药物可用的载体。
本文还提供了药物组合物，其包含(a)本文所描述的抗体-药物缀合物和(b)药物可用的载体。在具体的实施方式中，所述抗体-药物缀合物以治疗有效量存在于所述药物组合物中。
本文还提供了药物组合物，其包含结合MERTK(例如，人MERTK)和另一个目标抗原(例如，如本文所描述的)的双重特异性抗体和(b)药物可用的载体。在具体的实施方式中，所述双重特异性抗体是纯化的。在具体的实施方式中，所述双重特异性抗体以治疗有效量存在于所述药物组合物中。
在具体的实施方式中，包含在药物组合物中的抗体-药物缀合物群体具有1至20之间的药物-抗体比(DAR)。DAR是缀合至抗体的细胞毒性剂的平均数。在另一个具体的实施方式中，包含在所述药物组合物中的抗体-药物缀合物群体具有1至15之间的DAR。在另一个具体的实施方式中，包含在所述药物组合物中的抗体-药物缀合物群体具有1至12之间的DAR。在另一个具体的实施方式中，包含在所述药物组合物中的抗体-药物缀合物群体具有1至8之间的DAR。在另一个具体的实施方式中，包含在所述药物组合物中的抗体-药物缀合物群体具有3至5之间的DAR。在另一个具体的实施方式中，包含在所述药物组合物中的抗体-药物缀合物群体具有3.5至4之间的DAR。
可以是赋形剂或稳定剂的可接受的载体在所使用的剂量和浓度下对受体是无毒的，并且包括(但不限于)缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟苯甲酸，如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；盐-形成反离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或者聚乙二醇(PEG)。
在具体的实施方式中，药物组合物包含本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段和处于药物可用的载体中的任选地一种或多种其它预防或治疗剂。在具体的实施方式中，药物组合物包含有效量的本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段和处于药物可用的载体中的任选地一种或多种其它预防或治疗剂。在具体的实施方式中，本文所描述的药物组合物和/或抗体或其抗原结合片段可以与治疗有效量的本文所描述的任何其它治疗剂合并(参见下文5.4.2节)。
在具体的实施方式中，药物组合物包含本文所描述的抗体-药物缀合物和处于药物可用的载体中的任选地一种或多种其它预防或治疗剂。在具体的实施方式中，药物组合物包含有效量的本文所描述的抗体-药物缀合物和处于药物可用的载体中的任选地一种或多种其它预防或治疗剂。在具体的实施方式中，本文所描述的药物组合物和/或抗体-药物缀合物可以与治疗有效量的本文所描述的任何其它治疗剂合并(参见下文5.4.2节)。
在一些实施方式中，所述抗体-药物缀合物是包括在所述药物组合物中的唯一活性成分。
在一些实施方式中，抗-MERTK抗体是包括在所述药物组合物中的唯一活性成分。在具体的实施方式中，本文所描述的人源化抗体或其抗原-结合片段是包括在所述药物组合物中的唯一活性成分。在另一个实施方式中，编码抗体或其抗原-结合片段的多核苷酸或载体是包括在所述药物组合物中的唯一活性成分。
本文所描述的药物组合物可以用于治疗癌症。药物组合物可以配制用于任何施用途径(例如，肠胃外、表面、肿瘤内等)。
在肠胃外制剂中使用的药物可用的载体包括水性媒介物、非水媒介物、抗微生物剂、等张剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、混悬剂和分散剂、乳化剂、多价螯合或螯合剂及其它药物可用的物质。水性媒介物的实例包括氯化钠注射液、林格注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、葡萄糖和乳酸林格注射液。非水肠胃外媒介物包括植物来源的固定油剂、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。可以将抑菌或抑真菌浓度的抗微生物剂添加至在多-剂量容器中包装的肠胃外制剂中，其包括苯酚或甲酚、汞剂、苯甲醇、氯代丁醇、甲基和丙基p-羟基苯甲酸酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等张剂包括氯化钠和葡萄糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因。混悬剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨酯80(
Figure BDA0003301650990000851
80)。金属离子的多价螯合或螯合剂包括EDTA。药物载体还包括用于水可混溶的媒介物的乙醇、聚乙二醇和丙二醇；和用于pH调节的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。
可以将药物组合物配制用于对受试者的任何施用途径。施用途径的具体实例包括鼻内、口服、肺部、透皮、皮内和肠胃外。在本文中还考虑了以皮下、肌内或静脉注射为特征的肠胃外施用。可以以常规形式作为液体溶液或混悬液、在注射前适合于液体中的溶液或混悬液的固体形式或者作为乳液制备注射剂。所述注射剂、溶液和乳液还含有一种或多种赋形剂。适合的赋形剂为(例如)水、盐水、葡萄糖、甘油或乙醇。另外，如果需要，要施用的药物组合物还可以含有少量的无毒助剂物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、增溶剂和其它这些试剂，如(例如)乙酸钠、单月桂酸山梨聚糖酯、油酸三乙醇胺酯和环糊精。
用于抗体的肠胃外施用的制剂包括随时可注射的无菌溶液、在正要使用前随时可与溶剂合并的无菌干燥可溶性产品，如冷冻干燥粉剂，包括皮下片剂、随时可注射的无菌混悬液、在正要使用前随时可与媒介物合并的无菌干燥不溶性产品和无菌乳液。所述溶液可以是水性或非水性的。
如果静脉内施用，则适合的载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，和含有增稠剂和增溶剂，如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物的溶液。
如对于局部和全身施用所述，制备了包含抗体的局部混合物。所得混合物可以是溶液、混悬液、乳液等并且可以配制为乳膏剂、凝胶剂、软膏剂、乳剂、溶液剂、酏剂、洗剂、混悬剂、浸剂、糊剂、泡沫剂、气溶胶、冲洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴片或适合于表面施用的任何其它制剂。
可以将本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或抗体-药物缀合物配制为用于表面施用，如通过吸入的气溶胶(参见，例如，美国专利No.4,044,126、4,414,209和4,364,923，其描述了用于递送对于炎性疾病，具体地哮喘的治疗有用的类固醇的气溶胶)。这些用于施用至呼吸道的制剂可以处于用于喷雾器的气溶胶或溶液的形式，或者作为单独或与惰性载体，如乳糖结合的用于吹入的微细粉末的形式。在这种情况下，制剂颗粒在一个实施方式中将具有小于50微米，在一个实施方式中，小于10微米的直径。
可以将本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或抗体-药物-缀合物配制用于局部或表面施用，如以凝胶剂、乳膏剂和洗剂的形式表面应用至皮肤和粘膜，如眼中，并且用于应用至眼或用于脑池内或脊柱内应用。考虑了用于透皮递送以及用于眼或粘膜的施用或者用于吸入疗法的局部施用。还可以施用单独或与其它药物可用的赋形剂组合的抗体的鼻溶液。
透皮贴片，包括离子电渗和电泳装置对本领域技术人员是熟知的并且可以用于施用抗体。例如，在美国专利No.6,267,983、6,261,595、6,256,533、6,167,301、6,024,975、6,010715、5,985,317、5,983,134、5,948,433和5,860,957中公开了这些贴片。
在某些实施方式中，包含本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或抗体-药物缀合物的药物组合物是冻干粉末，其可以复原以用于作为溶液、乳液及其它混合物施用。它还可以复原并配制为固体或凝胶剂。通过将本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或抗体-药物缀合物或其药物可用的衍生物在适合的溶剂中溶解来制备冻干粉末。在一些实施方式中，所述冻干粉末是无菌的。所述溶剂可以含有改善粉末或从所述粉末所制备的复原溶液的稳定性或其它药理学成分的赋形剂。可以使用的赋形剂包括(但不限于)葡萄糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它适合的试剂。所述溶剂还可以含有缓冲剂，如柠檬酸盐、磷酸钠或钾或者在一个实施方式中，本领域技术人员已知的处于约中性pH的其它这些缓冲剂。本领域技术人员已知的溶液的后续无菌过滤以及随后在标准条件下的冷冻干燥提供了所期望的制剂。在一个实施方式中，将所得溶液分配到小瓶中用于冷冻干燥。每个小瓶将含有单剂量或多剂量的化合物。冻干粉末可以在适当的条件，如在约4℃至室温下储存。
用注射用水对这种冻干粉末的复原提供了用于在肠胃外施用中使用的制剂。对于复原，将冻干粉末加入至无菌水或其它适合的载体中。准确的量取决于所选择的化合物。这些量可以通过经验确定。
在一些实施方式中，以不需要复原的液体形式提供包含本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或者本文所描述的抗体-药物缀合物的药物组合物。
还可以配制本文所描述的抗体或其抗原结合片段或者本文所描述的抗体-药物缀合物以及本文提供的其它组合物以靶向要治疗的受试者身体的特定组织、受体或其它区域。多种这些靶向方法对于本领域技术人员是熟知的。在本文中考虑了用于在本发明的组合物中使用的所有这些靶向方法。对于靶向方法的非限制性实例，参见，例如，美国专利6,316,652、6,274,552、6,271,359、6,253,872、6,139,865、6,131,570、6,120,751、6,071,495、6,060,082、6,048,736、6,039,975、6,004,534、5,985,307、5,972,366、5,900,252、5,840,674、5,759,542和5,709,874。在具体的实施方式中，将本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或者本文所描述的抗体-药物缀合物靶向至肿瘤。
将用于体内施用的组合物可以是无菌的。这容易地通过经由(例如)无菌过滤膜的过滤完成。
5.6使用和方法
5.6.1治疗性使用和方法
5.6.1.1癌症
在一个方面，本文提供了治疗受试者中的癌症的方法，其包括向对其有需要的受试者施用本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或者包含本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的药物组合物。在具体的实施方式中，治疗癌症的方法包括向对其有需要的受试者施用抗-MERTK抗体，其含有包含SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VL(例如，抗体z10)。在另一个具体的实施方式中，治疗癌症的方法包括向对其有需要的受试者施用抗-MERTK抗体，其含有包含SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VL(例如，抗体z11)。在具体的实施方式中，治疗癌症的方法包括向对其有需要的受试者施用抗-MERTK抗体，其含有包含SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VL(例如，抗体z13)。在具体的实施方式中，治疗癌症的方法包括向对其有需要的受试者施用抗-MERTK抗体，其含有包含SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VL(例如，抗体z13)。
在另一个方面，本文提供了治疗受试者中的癌症的方法，其包括向对其有需要的受试者施用本文所描述的嵌合抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或者包含本文所描述的嵌合抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的药物组合物。在具体的实施方式中，治疗癌症的方法包括向对其有需要的受试者施用嵌合抗体，其含有包含SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列的VL(例如，抗体xAb)。
在另一个方面，本文提供了治疗受试者中的癌症的方法，其包括向对其有需要的受试者施用本文所描述的抗体-药物缀合物或者包含本文所描述的抗体-药物缀合物的药物组合物。在另一个方面，本文提供了治疗受试者中的癌症的方法，其包括向对其有需要的受试者施用本文所描述的双重特异性抗体或者包含本文所述的双重特异性抗体的药物组合物。在另一个方面，本文提供了治疗受试者中的癌症的方法，其包括向对其有需要的受试者施用编码本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的多核苷酸或载体或者包含编码本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段的多核苷酸或载体的药物组合物。
在具体的实施方式中，本文提供了治疗受试者中的癌症的方法，其包括向对其有需要的受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含本文所描述的特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或者本文所描述的抗体-药物缀合物。
在某些实施方式中，本文所述的治疗癌症的方法包括从受试者获得肿瘤活组织检查、肿瘤样品或癌细胞样品并使用本文所描述的或者本领域技术人员已知的测定评价MERTK(例如，人MERTK)的表达水平。在一些实施方式中，使用本文所描述的或者本领域技术人员已知的测定评价了通过得自受试者的癌细胞、肿瘤样品或肿瘤活组织检查的MERTK(例如，人MERTK)的磷酸化水平。在一些实施方式中，本文所述的治疗癌症的方法包括从受试者获得肿瘤活组织检查、肿瘤样品或癌细胞样品并使用本文所描述的或者本领域中已知的测定评价突变的MERTK(例如，突变的人MERTK)的水平。本领域技术人员已知的技术可以用于获得肿瘤活组织检查或癌细胞样品。在一些实施方式中，将免疫印迹、ELISA或流式细胞术用于评价MERTK(例如，人MERTK)表达水平。在某些实施方式中，将免疫印迹或ELISA用于评价MERTK(例如，人MERTK)的磷酸化水平。在一些实施方式中，将本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或者本领域技术人员已知的抗-MERTK抗体(例如，国际专利申请公开No.WO 2016106221中所描述的抗-MERTK抗体)用于测量MERTK(例如，人MERTK)水平。在一些实施方式中，根据本文所述的方法治疗的受试者具有过表达MERTK的癌细胞，表达组成型激活的MERTK的癌细胞或两者。
在某些实施方式中，本文所述的治疗癌症的方法包括从受试者获得PMBC、分离巨噬细胞并使用本文所描述的或者本领域技术人员已知的测定评价MERTK(例如，人MERTK)的表达水平。在一些实施方式中，从受试者获得PMBC，分离巨噬细胞并使用本文所描述的或者本领域技术人员已知的测定评价通过巨噬细胞的MERTK(例如，人MERTK)表达的磷酸化水平或者突变的MERTK(例如，突变的人MERTK)的水平或两者。本领域技术人员已知的技术可以用于获得PMBC和分离巨噬细胞。在一些实施方式中，将免疫印迹、ELISA或流式细胞术用于评价MERTK(例如，人MERTK)表达水平。在某些实施方式中，将免疫印迹或ELISA用于评价MERTK(例如，人MERTK)的磷酸化水平。在一些实施方式中，将本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或者本领域技术人员已知的抗-MERTK抗体(例如，国际专利申请公开No.WO2016106221中所描述的抗-MERTK抗体)用于测量MERTK(例如，人MERTK)水平。在一些实施方式中，根据本文所述的方法治疗的受试者具有过表达MERTK的癌细胞，表达组成型激活的MERTK的癌细胞或两者。
在某些实施方式中，在根据本文所述的方法治疗受试者之前评价癌细胞、巨噬细胞或两者上MERTK(例如，人MERTK)的表达水平。在某些实施方式中，在根据本文所述的方法治疗受试者之前评价癌细胞上突变的MERTK(例如，突变的人MERTK)的水平。在一些实施方式中，在根据本文所述的方法治疗受试者之前评价通过癌细胞、巨噬细胞或两者表达的磷酸化MERTK(例如，人MERTK)的水平以及突变的MERTK(例如，突变的人MERTK)的水平。在某些实施方式中，在根据本文所述的方法治疗受试者之前评价癌细胞、巨噬细胞或两者上MERTK(例如，人MERTK)的表达水平。
在某些实施方式中，在根据本文所述的方法治疗受试者的同时评价癌细胞、巨噬细胞或两者上MERTK(例如，人MERTK)的表达水平以评价治疗的有效性。在一些实施方式中，在根据本文所述的方法治疗受试者的同时评价通过癌细胞、巨噬细胞或两者表达的磷酸化MERTK(例如，人MERTK)的水平以评价治疗的有效性。在一些实施方式中，在根据本文所述的方法治疗受试者的同时评价突变的MERTK(例如，突变的人MERTK)的水平以评价治疗的有效性。在某些实施方式中，在根据本文所述的方法治疗受试者的同时评价癌细胞、巨噬细胞或两者上MERTK(例如，人MERTK)的磷酸化的表达水平以及突变的MERTK(例如，突变的人MERTK)的水平以评价治疗的有效性。
在具体的实施方式中，本文所描述的抗体或抗原-结合片段或抗体-药物缀合物或者本文所描述的药物组合物向患有癌症的受试者的施用实现了下列作用中的至少1、2、3、4或更多种：(i)癌症的一种或多种症状的严重程度的减轻或改善；(ii)与癌症有关的一种或多种症状的持续时间的降低；(iii)与癌症有关的症状的复发的预防；(iv)受试者住院治疗的减少；(v)住院治疗长度的降低；(vi)受试者存活的增加；(vii)另一种疗法的治疗效果的增强或改善；(viii)与癌症有关的一种或多种症状的出现或发病的抑制；(ix)与癌症有关的症状数目的减少；(x)如通过本领域中熟知的方法所评价的生活质量的改善；(x)肿瘤复发的抑制；(xi)肿瘤和/或与之有关的一种或多种症状的消退；(xii)肿瘤和/或与之有关的一种或多种症状发展的抑制；(xiii)肿瘤生长的减轻；(xiv)肿瘤尺寸(例如，体积或直径)的减小；(xv)新形成的肿瘤的形成的减少；(xvi)原发性、局部和/或转移性肿瘤的预防、根除、除去或控制；(xvii)转移数目和尺寸的减少；(xviii)死亡率降低；(xix)无复发存活期的提高；(xx)如通过本领域技术人员可用的常规方法，如磁共振成象(MRI)、动态对比增强MRI(DCE-MRI)、X射线和计算机断层成像(CT)扫描或正电子发射断层成象术(PET)扫描所测量的，维持肿瘤尺寸并且所述尺寸不增加或者增加小于施用标准疗法之后的肿瘤的增加；和/或(xxi)患者中缓解长度的增加。
在一些实施方式中，如本文所描述的治疗癌症的方法导致产生了下列作用中的1、2、3或更多个：完全性反应、部分反应、客观反应、整体存活期增加、无病存活期的增加、客观反应率的增加、发展时间的增加、稳定的疾病、无恶化存活期的增加、治疗失败时间的增加以及癌症的一种或多种症状的改善或消除。在具体的实施方式中，如本文所描述的治疗癌症的方法导致整体存活期的增加。在另一个具体的实施方式中，如本文所描述的治疗癌症的方法导致无恶化存活期的增加。在另一个具体的实施方式中，如本文所描述的治疗癌症的方法导致整体存活期的增加和无恶化存活期的增加。
在具体的实施方式中，完全性反应具有本领域技术人员所理解的含义。在具体的实施方式中，完全性反应是指对治疗起反应，癌症的所在病征消失。完全性反应可以不表示癌症治愈，但是患者处于症状缓解中。在具体的实施方式中，如果通过已知技术，如放射照相研究、骨髓和活组织检查或蛋白测量检测不到临床可检测的疾病，则结肠直肠癌处于完全缓解。
在具体的实施方式中，部分反应具有本领域技术人员所理解的含义。例如，部分反应可以表示对治疗起反应，人体中结肠直肠癌的尺寸减小。在具体的实施方式中，部分反应是指在不存在新的病变的情况下，所有可测量的肿瘤负荷(例如，受试者中存在的恶性细胞的数目或者肿瘤块的测量体积或者异常单克隆蛋白的量)的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或者90％的减少。
在具体的实施方式中，整体存活期具有本领域技术人员所理解的含义。在具体的实施方式中，整体存活期是指从结肠直肠癌的诊断日期或治疗开始起，诊断为结肠直肠癌的人受试者仍存活的时间长度。如果毒性谱是可接受的，则整体存活期中的统计学显著的改善的证实可以认为是临床显著的，并且通常支持新药的批准。
一些终点通常基于肿瘤评价。这些终点包括无病存活期(DFS)、客观反应率(ORR)、发展时间(TTP)、无恶化存活期(PFS)和治疗失败时间(TTF)。有关这些时间依赖的终点的数据的收集和分析通常基于间接评价、计算和估计(例如，肿瘤测量)。
在具体的实施方式中，无病存活期(DFS)具有本领域技术人员所理解的含义。在具体的实施方式中，无病存活期可以表示在用于结肠直肠癌终止的基本治疗后，人受试者存活且无任何癌症病征或症状的时间长度。在可以延长存活期，从而使存活终点不实用的情况下，DFS可以是重要终点。DFS可以是临床益处的替代或者它可以提供临床益处的直接证据。这种参数的确定通常基于影响的大小、其风险-益处关系和疾病背景。DFS的定义可以是复杂的，特别是当在无在先肿瘤发展记录的情况下注意到死亡时。可以将这些事件打分为疾病复发或审查事件。尽管用于死亡的统计分析的所有方法具有一些限制，但是将所有死亡(由于所有原因所造成的死亡)认为是复发可以最大程度减小偏差。使用该定义可以过高估计DFS，特别是在长期无观察后死亡的患者中。如果研究组之间的长期随访频率不同或者如果由于毒性所造成的中途退出不是随机的，则可以引入偏差。
在具体的实施方式中，客观反应率具有本领域技术人员所理解的含义。在一个实施方式中，将客观反应率定义为具有预定量且对于最小时间段的肿瘤尺寸减小的患者的比例。反应持续时间可以从初始反应时间算起直至记录的肿瘤发展。通常，FDA将ORR定义为部分反应加完全性反应之和。当以这种方式定义时，ORR是药物抗肿瘤活性的直接测量，其可以在单组研究中进行评价。如果可用，应将标准化标准用于确定反应。已将多种反应标准认为是合适的(例如，RECIST1.1标准)(参见，例如，Eisenhower等人,2009,European J.ofCancer,45:228-247)。通过其幅度和持续时间以及完全性反应(无可检测的肿瘤迹象)的百分比评价ORR的显著性。
在具体的实施方式中，发展时间(TTP)具有本领域技术人员所理解的含义。在具体的实施方式中，发展时间是指从结肠直肠癌的诊断日期或治疗开始算起直至癌症恶化或扩散至人体其它部分的时间长度。
在具体的实施方式中，TTP是从随机分组直至客观肿瘤发展的时间；TTP不包括死亡。
在具体的实施方式中，无恶化存活期(PFS)具有本领域技术人员所理解的含义。在具体的实施方式中，PFS是指在结肠直肠癌的治疗期间和之后，人患者带癌存活，但癌症不恶化的时间长度。在具体的实施方式中，将PFS定义为从随机分组直至客观肿瘤发展或死亡的时间。PFS可以包括死亡并因此可以与整体存活期更好地相关。
在具体的实施方式中，治疗失败时间(TTF)具有本领域技术人员所理解的含义。在具体的实施方式中，TTF是测量从随机分组至出于任何原因，包括疾病发展、治疗毒性和死亡的治疗终止的时间的复合终点。
在具体的实施方式中，稳定的疾病是指程度或严重程度既不降低也不提高的结肠直肠癌。
在具体的实施方式中，将RECIST 1.1标准用于测量人受试者对本文所描述的治疗方法的反应的良好程度。
在一些实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是头颈癌、肺癌、乳腺癌、骨癌、卵巢癌、胃癌、胰癌、喉癌、食管癌、睾丸癌、肝癌、胃癌、腮腺癌、胆道癌、结肠癌、直肠癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌或甲状腺癌。在一些实施方式中，所述癌症是肉瘤、鳞状细胞癌、黑素瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈癌、结肠直肠癌或卡波济氏肉瘤。在一些实施方式中，所述癌症是白血病或淋巴瘤。在一些实施方式中，所述癌症是多发性骨髓瘤。在一些实施方式中，根据所述方法治疗的癌症是转移性的。
在具体的实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是乳腺癌。在具体的实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是三阴性乳腺癌。三阴性乳腺癌是指不表达基因Her2(也称为Neu)、雌激素受体(也称为ER)或者孕激素受体(也称为PR)的来源于乳腺组织或者在乳腺组织中生长的任何肿瘤或细胞。
在另一个具体的实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是急性髓性白血病。在另一个具体的实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是急性淋巴细胞性白血病。
在某些实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症的癌性细胞过表达MERTK。在具体的实施方式中，MERTK在根据本文所述的方法治疗的癌症的癌性细胞中是组成型活性的。
在某些实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症与组成型活性的MERTK有关。在另一个具体的实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症与MERTK的过表达有关。在另一个具体的实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症与组成型活性的MERTK的过表达有关。
如本文所使用的，术语“受试者”和“患者”是可互换使用的。在一些实施方式中，所述受试者是哺乳动物，如灵长类动物(例如，猴或人)，最优选地人。
在具体的实施方式中，向受试者施用特异性结合至MERTK(例如，人MERTK)的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段(例如，z10、z11、z13或xAb抗体)或者本文所描述的抗体-药物缀合物。在某些实施方式中，向受试者施用本文所描述的特异性结合MERTK(例如，人MERTK)的两种或更多种不同的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，与一种或多种其它疗法(参见下文5.4.2节)组合，向受试者施用本文所描述的特异性结合MERTK(例如，人MERTK)的本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段。
在某些实施方式中，向受试者施用本文所描述的两种或更多种不同的抗体-药物缀合物。在一些实施方式中，与一种或多种其它疗法组合，向受试者施用本文所描述的抗体-药物缀合物。在一些实施方式中，与一种或多种其它疗法(参见下文5.4.2节)组合，向受试者施用本文所描述的抗-MERTK抗体(例如，人源化抗体)或其抗原-结合片段或抗体-药物缀合物。在具体的实施方式中，所述一种或多种其它疗法是抗-癌疗法。
5.6.1.2施用途径和剂量
可以通过多种途径将本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段、嵌合抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或者抗体-药物缀合物或者本文所描述的药物组合物递送至受试者。这些包括(但不限于)肠胃外、鼻内、气管内、口服、皮内、表面、肌内、腹膜内、透皮、静脉内、肿瘤内、结膜、肿瘤内和皮下途径。还可以使用肺部施用，例如，通过使用吸入器或喷雾器，以及用作喷雾的具有雾化剂的制剂。在一个实施方式中，将本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或抗体-药物缀合物或者本文所描述的药物组合物肠胃外施用至受试者。在具体的实施方式中，所述肠胃外施用是静脉内、肌内或皮下施用。
将在病况的治疗和/或预防中有效的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或抗体-药物缀合物或药物组合物的量将取决于疾病性质并且可以通过标准临床技术确定。
在药物组合物中使用的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或抗体-药物缀合物的准确剂量还将取决于施用途径和癌症类型，并且应根据开业医生的判断和每位受试者的情况来决定。例如，有效剂量还可以基于施用方式、目标位点、患者的生理状态(包括年龄、体重和健康)、患者是人还是动物、所施用的其它药物治疗或者治疗是预防性的还是治疗性的来改变。最优地，滴定治疗剂量以优化安全性和效力。
在某些实施方式中，使用体外测定来帮助识别最优剂量范围。可以根据来源于体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线来外推有效剂量。
对于抗体(或其抗原-结合片段)或抗体药物缀合物，剂量在约0.0001至100mg/kg，并且更通常地0.01到15mg/kg的患者体重范围内。例如，剂量可以是1mg/kg体重、10mg/kg体重或者在1-10mg/kg的范围内，或者换言之，对于70kg的患者，分别为70mg或700mg或者在70-700mg的范围内。在一些实施方式中，向患者施用的剂量为约1mg/kg至约20mg/kg患者体重。
示例性治疗方案需要每两周施用一次或者每月一次或者每3至6个月一次，施用一年或几年，或间隔几年。在一些方法中，将具有不同结合特异性的两种或更多种抗体或其抗原结合片段同时施用于受试者。通常，在多种情况下施用抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或抗体-药物缀合物。单一剂量之间的间隔可以是每周、每月、每3个月、每6个月或者每年。
5.6.1.3组合疗法
在具体的方面，本文所述的治疗癌症的方法还包括施用一种或多种其它疗法，如抗-癌疗法(例如，手术、辐射、化疗或其它治疗剂)。在具体的实施方式中，本文所提供的用于治疗受试者中的癌症的方法包括向对其有需要的受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或者抗体-药物缀合物，所述方法还包括向所述受试者施用一种或多种其它治疗剂。在具体的实施方式中，所述其它治疗剂用于治疗癌症。在具体的实施方式中，所述其它治疗剂用于治疗使用本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原结合片段或者抗体-药物缀合物的治疗的任何副作用。
在具体的实施方式中，所述其它试剂是用于治疗乳腺癌的试剂、用于治疗黑素瘤的试剂、免疫疗法或血管生成抑制剂。
在具体的实施方式中，所述其它治疗剂是用于治疗乳腺癌的试剂，其选自：他莫昔芬、雷洛昔芬、紫杉醇
Figure BDA0003301650990000922
环磷酰胺、多西他赛、长春碱、氟尿嘧啶、依维莫司、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-美坦新、帕妥珠单抗和二对甲苯磺酸拉帕替尼。
在具体的实施方式中，其它治疗剂是用于治疗黑素瘤的试剂，其选自BRAF抑制剂、MEK抑制剂和达卡巴嗪。
在具体的实施方式中，所述其它治疗剂是阻断免疫检查点信号转导的试剂。在具体的实施方式中，所述其它治疗剂是抗-CTLA-4阻断抗体、抗-PD-1阻断抗体或者抗-PD-L1阻断抗体。
在具体的实施方式中，所述其它治疗剂是血管生成抑制剂，其选自VEGF抑制剂、VEGFR2抑制剂、舒尼替尼和索拉非尼。
在其它实施方式中，所述其它治疗剂是表32中所列的试剂。
表32：用于在与MERTK抗体或其抗原结合片段的组合疗法中使用的其它治疗剂
Figure BDA0003301650990000921
Figure BDA0003301650990000931
Figure BDA0003301650990000941
Figure BDA0003301650990000951
Figure BDA0003301650990000961
Figure BDA0003301650990000971
Figure BDA0003301650990000981
Figure BDA0003301650990000991
在具体的实施方式中，本文所述的治疗癌症的方法包括向受试者施用抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段，所述方法还可以包括施用抗-PD1抗体(例如，派姆单抗、西米普利单抗(cemiplimab)、皮地利珠单抗(pidilizumab)或纳武单抗)、抗-PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗、阿维鲁单抗(Avelumab)、durvaniab、BMS-936552或者CK-301)、抗-LAG3抗体、抗-GITR激动抗体、抗-TGF-β抗体、抗-OX 40激动抗体、CAR-T疗法(例如，Kymriah、JCar017或Yescarta)、RGX-104或RGX-202。
本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或抗体-药物缀合物可以与其它治疗剂同时或顺序(之前和/或之后)施用。可以在相同或不同的组合物中并且通过相同或不同的施用途径施用抗体或其抗原结合片段和其它治疗剂或者抗体-药物缀合物和其它治疗剂。可以在向患有癌症的受试者施用第二疗法(本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或抗体-药物缀合物或者其它治疗剂)之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、同时或之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)施用第一疗法(它是本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或抗体-药物缀合物或者其它治疗剂)。在某些实施方式中，与抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或抗体-药物缀合物组合，在相同组合物(药物组合物)中施用向受试者施用的其它治疗剂。在其它实施方式中，在与抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或抗体-药物缀合物不同的组合物中，向受试者施用与抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或抗体-药物缀合物组合施用的其它治疗剂(例如，使用两种或更多种药物组合物)。
5.7试剂盒
本文还提供了包含本文所描述的一种或多种抗体或抗体-药物缀合物或其抗原结合片段的试剂盒。在具体的实施方式中，本文提供了包含装填了本文所描述的药物组合物的一种或多种成分，如本文所描述的一种或多种抗体或其抗原-结合片段或者一种或多种抗体-药物缀合物的一个或多个容器的药物包装或试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒含有本文所描述的药物组合物和预防或治疗剂。
任选的，与这类容器相关的可以是管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构所规定形式的注意事项、剂量形式和/或其使用说明书。在某些实施方式中，与试剂盒一起包含的说明书对于剂量的量和/或药物组合物施用的剂量施用方案提供了指导。
药物包装材料的实例包括(但不限于)泡罩包装、瓶、小包(packets)、小袋、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器和适合于所选药物组合物以及预期施用形式和治疗的任何包装材料。
本文所提供的试剂盒还可以包括用于施用活性成分的装置。这些装置的实例包括(但不限于)注射器、无针注射器、滴注袋、贴片和吸入器。
本文所提供的试剂盒还可以包括可以用于施用所述成分的药物可用的媒介物。例如，如果以对于肠胃外施用必须复原的固体形式提供成分，则所述试剂盒可以包含适合的媒介物的密封容器，其中所述成分可以溶解以形成适合于肠胃外施用的无颗粒无菌溶液或者可以复原为用于口服施用的混悬液。药物可用的媒介物的实例包括(但不限于)：水媒介物，其包括(但不限于)注射用水USP、氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液和乳酸林格氏注射液；水可混溶的媒介物，其包括(但不限于)乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；和非水媒介物，其包括(但不限于)玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
在一些实施方式中，本文所描述的试剂盒包括试剂(例如，本文所描述的抗-MERTK抗体或其抗原-结合片段或者本领域技术人员已知的抗-MERTK抗体(例如，国际专利申请公开No.WO 2016106221中所述的抗-MERTK抗体))以测量在根据本文所述的方法治疗受试者之前和/或同时，来自受试者的细胞(例如，癌细胞、巨噬细胞或两者)上的MERTK(例如，人MERTK)水平。在某些实施方式中，本文所描述的试剂盒包括试剂以测量来自要根据本文所述的方法治疗的受试者的细胞(例如，癌细胞、巨噬细胞或两者)的磷酸化MERTK(例如，人MERTK)水平。在某些实施方式中，本文所描述的试剂盒包括试剂以测量来自要根据本文所述的方法治疗的受试者的细胞(例如，癌细胞、巨噬细胞或两者)的突变的MERTK(例如，人MERTK)的水平。在一些实施方式中，试剂盒包括对于以下中的一个、两个或全部的读数，指导临床医师/医师的信息：MERTK(例如，人MERTK)表达水平、磷酸化MERTK(例如，人MERTK)的水平、突变的MERTK(例如，人MERTK)的水平。
通过说明，而非通过限制提供了以下实施例。
6.实施例
6.1.实施例1：对人MERTK特异的人源化、高亲和力、特异性抗体的产生
本实施例描述了通过内化导致来自细胞表面的MERTK降解的单克隆抗体。
6.1.1.候选抗体的人源化、表达和纯化
为了产生人源化抗-MERTK，分别用任选地具有一个或多个回复突变的人重链和轻链框架区替代美国专利No.10,221,248中所公开的M6抗体的亚克隆，鼠抗-MERTK抗体的重链和轻链框架区。重链(S24、S25、S26、S27、S28、S29、S30、S31)和轻链(S32、S33)的组合总计产生了16种人源化抗体。在HEK-293细胞或293F细胞中表达人源化抗体候选并通过凝胶电泳确认表达(数据未显示)。对于人源化抗体z1至z16以及xAb(嵌合抗体，泳道17)和两种杂交瘤系(HyAb 1和HyAb2，泳道18和19)，在预期约150kD的尺寸存在条带。通过SPR测量了候选抗体对人MERTK的结合亲和力。图1中总结了SPR结果。图1中小于1×10-6的解离速率(Kd)值表示Kd低于仪器检测限。相对于轻链可变区，据发现轻链可变区的框架区3中的第四残基(丝氨酸，S)(以Exemplary定义)向门冬氨酸(D)的回复突变与人源化抗体对人MERTK的结合亲和力的升高有关。相对于重链可变区，据发现第27残基(酪氨酸，T，倒数第二个残基)的回复突变与人源化抗体对人MERTK的低结合亲和力有关。如图2所示，具有z10、z11和z13的框架区的重链可变区与具有z10、z11和z13的框架区的轻链可变区(所述框架区是相同的)的组合导致人源化抗体的亲和力比当具有z10、z11和z13的框架区的重链可变区与具有下文表33中的框架区的轻链可变区组合时更高。
下文表34提供了使用SPR的z10、z11和z13抗体的亲合力。下文表34提供了使用SPR和基于ELISA细胞的测定的z10抗体的亲和力。对于使用SPR的亲合力和亲和力测量，使用以下规程。在本研究中使用的z10抗体包含表16中所述的重链和轻链。在本研究中使用的z11抗体包含表17中所述的重链和轻链。在本研究中使用的z13抗体包含表18中所述的重链和轻链。
使用SPR的z10对人MERTK的亲和力测量
用400mM EDC和100mM NHS的混合物将CM5传感器芯片激活420s。然后，将30μg/mL的抗-人Fc IgG抗体(Jackson,109-005-098)在10mM NaAc(pH 4.5)中的溶液以10μL/min的流速注入420s。通过1M乙醇胺-HCl使芯片失活。将5μg/mL z10抗体在运行缓冲液(1×HBS-EP+)中的溶液以10μL/min的流速注入15s。以30μL/min的流速，将6种浓度(2.78、5.56、11.11、22.22、44.44和88.88nM)的胞外MERTK域(W3725-hPro1,Sino Biological,10298-HCCH)和运行缓冲液注入180s的结合期，然后是600s的解离。在每个解离期后，作为再生缓冲液注入10mM甘氨酸pH 1.5。用10mM甘氨酸pH 1.5使芯片再生。将一个表面通道(无捕获的配体)用作用于参比减去的对照表面。将每个相互作用的最终数据减去参比通道和缓冲液通道数据。通过1:1结合模式拟合结合至W3725-hPro1的z10抗体的实验数据。将54kDa的分子量用于计算分析物的摩尔浓度。
使用SPR对z10、z11和z13对人MERTK的亲合力测量
在注入前，立即用400mM EDC和100mM NHS的混合物制备激活剂。用所述混合物激活CM5传感器芯片420s。然后，以10μL/min的流速将5μg/mL rhMer/Fc嵌合体(R&D Systems,8910MR)在10mM NaAc(pH 4.5)中的溶液注入30s。通过1M乙醇胺-HCl使芯片失活。用运行缓冲液(1×HBS-EP+)稀释Z10、z11和z13抗体。以30μL/min的流速，将8种浓度(0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20和40nM)的抗体和运行缓冲液注入240s的结合期，然后是4800s的解离。在每个解离期后，作为再生缓冲液注入10mM甘氨酸pH 1.5。用10mM甘氨酸pH 1.5使芯片再生。将无捕获的配体的一个表面通道用作用于参比减去的对照表面。将每个相互作用的最终数据减去参比通道和缓冲液通道数据。通过1:1结合模式拟合结合至rhMer/Fc嵌合体的抗体的实验数据。除去40nM和0.3125nM抗体曲线以使得更好的拟合。将150kDa的分子量用于计算抗体的摩尔浓度。
表33：S32重链框架区
Figure BDA0003301650990001011
表34：使用SPR的z10、z11和z13抗体的亲合力和亲和力。
Figure BDA0003301650990001012
Figure BDA0003301650990001021
基于它们对于MERTK的高亲和力，选择z10、z11和z13用于进一步研究。使用蛋白A纯化并通过尺寸-排阻高效液相色谱(SEC HPLC)分析抗体。图2显示了4种抗体的纯度分析的总结。将SDS-PAGE用于鉴定4种抗体。如所期望的，150kDa、50kDa和25kDa条带在凝胶上可见，表明所述抗体是正常的。
6.2.实施例2：人源化抗-MERTK抗体的活性。
本实施例证实特定人源化抗体特异性结合至人MERTK并且不结合至人Axl、人Tyro3或鼠MERTK的胞外域。本实施例还证实特异性结合至人MERTK的人源化抗体阻断了Gas6-诱导的激活并且抑制癌细胞的体外集落形成。此外，本实施例证实特异性结合至人MERTK的人源化抗体通过诱导人MERTK的内化和降解，降低了人MERTK在癌细胞和巨噬细胞表面上的表达。
6.2.1.材料和方法
细胞系、抗体和试剂。
SKMEL5细胞得自ATCC(atcc,HTB-70)并在补充有10％FBS、青霉素和链霉素的伊戈尔最低必须培养液(EMEM)中，在37℃，5％CO2中培养。用于流式细胞术的抗体得自以下来源：抗-MERTK抗体(Biolegend,367603)、抗-CD86抗体(ThermoFisher,12-0869-41)和抗-CD163抗体(ThermoFisher,17-1639-41)。可固定活力染料(fixable viability dye)(eFluor 780)得自Thermofisher。用于免疫印迹的抗体得自以下来源：抗-MERTK(abcam,ab52968)、抗-AKT(abcam,ab32505)、抗-AKT1磷酸S473(abcam,ab81283)、抗-β-肌动蛋白(Sigma,A5316)和抗-α-微管蛋白(Sigma,T5168)。
细胞表面结合测定
根据生产商的说明书，用Zenon别藻蓝蛋白(APC)人IgG标记试剂盒(ThermoFisher,Z25451)标记Z10和人IgG对照(R&D Systems,1-001-A)。用胰蛋白酶收获SKMEL5细胞，用PBS清洗两次并通过70μm过滤器过滤。将50,000个细胞在60μL含有10％人AB血清(Sigma,H4522)的FACS缓冲液(2％BSA、10mM EDTA、25mM HEPES、0.1％叠氮化钠在无Ca/Mg的PBS中)中再混悬。用DAPI(500ng/mL)和在0.002至13.5μg/mL(0.13至90nM)的范围内的浓度的APC-标记的Z10或IgG对照，在冰上染色细胞20min，然后用FACS缓冲液清洗两次并进行流式细胞分析(BD LSR Fortessa)。在FlowJo中分析来自活单细胞的APC信号并用GraphPad Prism对MFI作图。将单色对照样品用于产生补偿基质。
内化测定
根据生产商的说明书，使用pHrodo红微尺度标记试剂盒(ThermoFisher,Cat#)，用pH-敏感性染料pHrodo红标记Z10和人IgG对照(R&D Systems)。通过检测pHrodo荧光的流式细胞术确定抗体内化，所述荧光在中性pH最小并且在酸性环境，如溶酶体中最大。将100万个SKMEL5在6-孔板上铺板，并与1μg/mL pHrodo-标记的Z10或IgG对照抗体培育1、3、6或24小时。用细胞解离缓冲液(ThermoFisher)收获细胞，清洗两次，通过70μm过滤器过滤并在200μL含有10％人AB血清的FACS缓冲液(2％BSA、10mM EDTA、25mM HEPES、0.1％叠氮化钠在无Ca/Mg的PBS中)中再混悬。在冰上用抗MERTK BV421-缀合抗体顺序染色细胞20min，然后在冰上用可固定活力染料(fixable viability dye)(eFluor 780)染色20min。通过ImageStream成像流式细胞仪(Aminis)对每个样品采集5,000个事件多光谱图象。将单色对照样品用于产生补偿基质并通过IDEA软件(Amnis)和GraphPad Prism分析所得的补偿数据。
PBMC-来源的细胞培养物和巨噬细胞分化
通过在室温下以250×g Histopaque-1077(Sigma,10771)密度梯度离心30min，从健康供体的血沉棕黄层制备周围血单核细胞(PBMC)。收集含有PBMC的中间层并用具有2mMEDTA的PBS清洗细胞三次。根据生产商的说明书，使用人经典单核细胞分离Kit(Miltenyi,130-117-337)通过磁力分离从PBMC分离人单核细胞。将2.5×105个单核细胞在24-孔板中含有10％人AB血清、10％FBS、L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基(Gibco，11875093)中在37℃，5％CO2下培养。用1μg/mL Z10或IgG对照处理单核细胞24hr并收获上清液用于细胞因子分析。为了使M1或M2巨噬细胞分化，将单核细胞分别与GM-CSF(100ng/mL；Miltenyi，130-093-864)或M-CSF(50ng/mL；Miltenyi，130-096-485)培育7天，并且在整个分化时间期间，通过在存在0.3至1μg/mL Z10或IgG的情况下的培养评价Z10对分化的影响。为了确定对M2巨噬细胞的细胞因子产生的影响，在分化第5天用具有M-CSF(50ng/mL)的无血清X-Vivo15培养基(Lonza,04-418Q)更换培养基并且如所指明的，用1μg/mL Z10或IgG处理48hr。为了测量细胞因子，收集细胞培养上清液并送至Eve Technologies,Canada用于人细胞因子/趋化因子阵列(HD42)分析。
巨噬细胞上表面分子的分析
用细胞解离缓冲液(ThermoFisher)收获极化巨噬细胞，清洗两次，通过70μm过滤器过滤并在含有10％人AB血清的FACS缓冲液(2％BSA、10mM EDTA、25mM HEPES、0.1％叠氮化钠在无Ca/Mg的PBS中)中再混悬。在冰上用荧光团-缀合的抗MERTK(BV421)、CD86(PE)和CD163(APC)抗体染色细胞20min，然后在冰上用可固定活力染料(fixable viability dye)(eFluor 780)染色20min。用流式细胞仪(BD LSR Fortessa)采集荧光信号，并通过FlowJo和GraphPad Prism分析。将单色对照样品用于产生补偿基质。
增殖测定
将SKMEL5细胞以2,000个细胞/孔在具有0.1、0.3、0.9、2.7、8.1和24.3μg/mL的浓度的Z10或IgG对照的96孔测定板中接种。在培养72hr后，通过WST-8细胞增殖测定试剂盒(Cayman Chemical,10010199)确定细胞增殖。将细胞与WST-8混合物培育1hr，并且使用GloMax Multi Detection酶标仪(Promega)读取450nm的光密度。减去来自无细胞对照孔的背景值，并且使用GraphPad Prism对三个重复孔的平均值作图。
集落形成测定
将SKMEL5细胞以500个细胞/孔在6-孔板中铺板。用0.3或1μg/mL IgG对照或Z10处理细胞，重复三次。培养7天后，用含有相同浓度制品的新鲜培养基更换所述培养基。在第12天染色细胞。首先，用PBS清洗孔一次，然后在室温下用2mL 6％戊二醛(v/v)，0.5％结晶紫(w/v)在PBS中的溶液染色30分钟。然后，通过浸没在充满自来水的容器中，将板漂洗两次。然后，使它们在室温下干燥。一旦板完全干燥，则通过显微镜观察对大于50个细胞的集落数目计数。使用GraphPad Prism，将结果绘制为柱状图。
免疫印迹
将SKMEL5细胞以3×105个细胞/孔在6-孔板中培养过夜，并且用0.01、0.03、0.1、0.3、1,3和10μg/mL的Z10处理24hr，或者以0.3μg/mL处理10min、30min、2hr、4hr、8hr、24hr、48hr和72hr。对于GAS6刺激研究，将SKMEL5细胞以1×105个细胞/孔在24-孔板中培养过夜，用0.3μg/mL Z10或IgG对照处理2hr，然后用200nM GAS6(R&D Systems,885-GSB-050)刺激10min。
在含有蛋白酶抑制剂(Sigma,4693159001)和磷酸酶抑制剂(Sigma,P2850和P5726)的RIPA缓冲液(Sigma,20-188)中制备完整-细胞裂解液。使用BCA蛋白质测定试剂盒(ThermoFisher,23225)测量蛋白浓度。将相等的蛋白量加载至4-20％的Tris-甘氨酸凝胶(Bio-Rad，4561094)上，然后转移至PVDF膜(Bio-Rad,1620177)。在用5％BSA封闭后，在室温下用第一抗体探查膜1hr。用HRP-缀合的第二抗体(Sigma,AP187P和AP181P)检测结合的抗体并使用ChemiDoc成像系统(Bio-Rad)通过ECL免疫印迹底物(ThermoFisher,32106)显象。
通过hMER、mMER、hAxl和hTyro3的竞争ELISA的亲和力测量
在4℃，用0.01ug/mL hMER重组蛋白(RnD Systems,891-MR-100)涂覆96-孔NuncMaxiSorp平底板(ThermoFisher,44-2404-21)过夜。用PBS 0.1％吐温清洗板三次，并用3％在PBS中的无脂肪脱脂奶粉(non-fat dry skim milk)封闭2h。
在饱和步骤期间，以50nM作为最高浓度，并在PBS中依次1:1稀释至0.098nM，制备抗原hAxl(RnD Systems,154-AL-100)、hTyro3(RnD Systems,859-DK-100)或mMER(RnDSystems,591-MR-100)的稀释液。将每个抗原稀释液与150uL 6nM MERTK(z10)抗体在室温下培育1h。然后，用PBS 0.1％吐温清洗饱和板三次并将抗原-抗体混合物加入至孔中(重复两次)，并在室温下培育1h。然后，用PBS 0.1％吐温清洗板3次，并与在PBS中1:3000稀释的抗-人碱性磷酸酶抗体(Sigma,SAB 3701248)在室温下培育1h。在用PBS 0.1％吐温清洗三次后，在每个孔中加入100uL黄色碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase Yellow)(pNPP)液体底物系统(Sigma,P7998)并在室温下培育70min。使用来自Promega的Glomax DiscoverSystem在405nm和570nm读取板以修正板的不一致性。将吸光值作为抗原浓度的函数作图，并使用GraphPad Prism 7.0c计算Kd。
6.2.2.结果
将表达MERTK的黑素瘤细胞(SKMEL5)与逐渐升高的浓度(0.002-13.5μg/mL(0.013-90nM))的APC-标记的z10抗体一起培育，然后通过流式细胞术对APC MFI进行评价。如图3A所示，z10抗体以高亲和力(EC50＝6.7nM)结合至表达人MERTK的黑素瘤细胞。SPR测量还证实z10抗体对人MERTK具有高亲和力(KD＝3nM)。
z10抗体特异性结合至人MERTK并且不结合至人axl、人Tyro3或鼠MERTK的胞外域，如图4A-4D所示。在结合至固相抗原(人MERTK)之前，建立了z10抗体(0.6nM)和人MERTK、人Axl、人Tyro3和鼠MERTK胞外域(50nM-0.1nM)之间的平衡。用碱性磷酸酶(AP)第二抗体标记结合的z10抗体并对ELISA显色。
据显示z10抗体诱导癌细胞的人MERTK降解(参见图5A-5B)。具体地，使用0、0.03、0.1、0.3和1μg/mL浓度的z10抗体，在24小时后在SKMEL5细胞中观察到了人MERTK的显著降解。此外，使用0.3μg/mL z10抗体，在4小时后，观察到了SKMEL5细胞上人MERTK的显著降解。
另外，证实z10抗体诱导体外分化的M2巨噬细胞的人MERTK的降解(参见图6A-6B)。在用0.3μg/mL z10抗体处理体外分化的M2巨噬细胞后约4小时，通过免疫印迹分析检测到大于50％的人MERTK的减少(参见图6A-6B)。在用0.3μg/mL z10抗体处理8小时后，检测到体外分化的M2巨噬细胞上人MERTK更大的减少(参见图6A-6B)。
z10抗体似乎通过人MERTK的内化和后续向溶酶体的运输使SKMEL5人癌细胞上的人MERTK降解。如图7A-7B所示，在SKMEL5细胞与z10抗体培育24h之后，大部分MERTK信号存在于溶酶体中，并且仅在细胞表面上检测到最低的信号(<20％)。
z10抗体防止在表达人MERTK的SKMEL5细胞中的Gas6-诱导的AKT磷酸化(参见图8A-8C)。具体地，通过用z10抗体处理细胞，阻断了Gas6诱导的AKT磷酸化。将SKMEL5细胞与0.3μg/mL z10抗体或IgG对照培育2小时，然后是200nM的Gas6或者缓冲液处理10分钟。如图8A-8C所示，在与Gas6培育之前，SKMEL5细胞与z10抗体的培育降低了Gas6诱导的AKT磷酸化水平。图8B显示在用z10抗体处理后，总裂解液中的人MERTK水平降低。
如图9A-9D所示，z10抗体抑制癌细胞的集落形成。在存在对照IgG或z10抗体(0.3和1μg/mL)的情况下，将500个SKMEL5细胞在6孔板上培养12天。对大于50个细胞的集落计数。相对于当将所述细胞与对照IgG培育时所计数的集落，当将SKMEL5细胞与z10抗体培育时所计数的集落数目显著降低。
z10抗体在M2巨噬细胞和CD14+单核细胞中诱导了细胞因子反应(参见图10)。具体地，将M2巨噬细胞与1μg/mL z10抗体或对照IgG培育48小时并评价某些细胞因子的表达。将CD14+单核细胞与1μg/mL z10抗体或对照IgG培育24小时并评价某些细胞因子的表达。相对于对照IgG，z10抗体包括通过M2巨噬细胞和CD14+单核细胞的某些细胞因子的表达的升高(参见图10)。M2巨噬细胞已显示抑制抗-肿瘤反应(参见J.Immunol.Cancer 5(1):53(2017))并且人MERTK的表达大部分局限于M2巨噬细胞(Crittenden等人Oncotarget.2016；7:78653-78666)。因此，z10抗体可以在癌细胞中具有间接抗-癌作用，并且使得z10抗体对于毒性剂向癌细胞的递送有用。另外，已发现通过多种癌细胞系表达人MERTK(参见人类蛋白质图谱(Human Protein Atlas)中MERTK的条目，其可得自www.proteinatlas.org[2019年2月26日访问])。因此，对人MERTK具有高亲和力和特异性的z10抗体诱导通过免疫细胞的细胞因子反应并且抑制通过癌细胞的集落形成，并且具有治疗多种癌症的治疗潜能。
另外，使用类似于以上对于z10在第6.2节中所述的测定的基于细胞的测定确定抗体z11和z13的EC50。z11抗体对于人MERTK具有7.9nM的EC50，而z13抗体对于人MERTK具有7.6nM的EC50。
6.3.实施例3：z10对癌细胞存活力和存活的影响
6.3.1.材料和方法
存活力测定
将1000个SKMEL5细胞和RPMI8226细胞在96-孔板的孔中铺板，并在100μL补充有10％FBS和青霉素/链霉素且含有3和30μg/mL的IgG对照(BioXCell,BE0092)或z10中的任一种的RPMI-1640培养基(ATCC)中培养。在第4天(SKMEL5)或第6天(RPMI8226)，将100μLCellTiter-Glo 2.0细胞存活力测定试剂(Promega,G9241)加入至每个孔中，培育10min并用GloMax Discover酶标仪(Promega)检测发光信号。使用GraphPad Prism对来自重复的孔的平均相对光度计单元(RLU)作图。
转移测定
将具有荧光素酶报告基因的MDA-MB-231LM2 TR三阴乳腺癌细胞(来源于SohailTavazoie教授，Rockefeller University,NYC)(Minn等人,Nature.2005年7月28日；436(7050):518-524)在D10F培养基(DMEM Life Technologies,11965-092)、10％FBS(Sigma,F4135-500ml)、1％NEAA(Fisher,11140-050)、1％丙酮酸钠(Fisher,11360-070)、1％Hepes(Fisher,15630-080)和1％青霉素/链霉素(Fisher,15140-122)中培养。在注射当天，用DPBS(Fisher,14190-144)清洗细胞并使用每个15cm细胞培养皿3mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA(Fisher,25200-056)，在37℃细胞培养箱中分离5min。将分离的细胞在5mL D10F中再混悬，使用血球计计数并在室温下以220×g离心5min。将小粒在DPBS中以500,000个细胞/mL的浓度再混悬。将8-周大的NSG雌性小鼠(Jackson,005557)暴露于小动物加热灯(MorganvilleScientific,HL0100)2-3分钟。将100μl细胞混悬液(50000个细胞)注射到雌性8-周大NSG小鼠的扩张的侧尾静脉。在0.9％无菌NaCl溶液中制备IgG同种型对照(BioXCell,BE0092)或z10并在MDA-MB-231LM2细胞注射当天开始，每3.5天i.p.施用。以10mg/kg剂量施用IgG同种型对照并以1、3、10和30mg/kg剂量施用z10。一旦i.p.施用150mg/kg D-萤光素(Thermofisher Scientific,Waltham,MA)，使用IVIS成像监测肺定殖。将每个时间点的发光数据对第0天或肿瘤注射当天归一化，并使用Prism(Graphpad Software,La Jolla,CA)作图。将单尾曼-惠特尼U-检验用于评价如通过生物发光成像所测量的转移的显著性。
6.3.2.结果：
在存在IgG对照或z10中的任一种的情况下，分别培养RPMI8226多发性骨髓瘤或者SKMEL5黑素瘤细胞。在第6天(RPMI8226)或第4天(SKMel5)，使用CellTiter-Glo2.0细胞存活力测定评价存活力。图11A和11B显示z10分别抑制RPMi8226和SKMEL5细胞中的细胞存活。
将50,000个MDA-MB-231-LM2 TNBC细胞注入NSG小鼠的尾静脉。在肿瘤细胞接种当天开始治疗，在研究期间每周两次i.p.。图12A显示用z10处理的小鼠中肿瘤减少。在图12B中定量数据。
6.4.实施例4：包含人源化抗-MERTK抗体的抗体-药物缀合物的活性
本实施例证实包含人源化抗-MERTK抗体的抗体-药物缀合物导致MERTK内化和降解，并且抑制癌细胞体外和体内生长。
6.4.1.材料和方法
IgG1-mc-vc-PABC-MMAE(在本文中也称为“IgG-MMAE”)的合成
mc-vc-PABC-MMAE：将6317.7μL IgG1同种型对照(11.08mg/mL,WuXi,562)与432.6μL三(2-羧乙基)膦(TCEP)(2.5mM,Sigma,1002068588)在最终体积12.6mL的40mM PB pH7.0溶液(Sigma,101943380和101900512)中在37℃，在温和旋转下培育3h。然后，将830.5μL二甲基乙酰胺(DMA)(Sigma,ARK2190)和569.5μL的mc-vc-PABC-MMAE(10mg/mL,LevenaBiopharma,LN101-006)在DMA中的溶液添加至10％v/v的最终DMA含量且马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄基氧基羰基-一甲基奥瑞他汀E(mc-vc-PABC-MMAE)/mAb的比为9。将反应混合物在22℃，在温和旋转下培育1h。
在反应期间，用PBS pH 7.2平衡40KD旋转脱盐柱。将该脱盐柱用于缓冲液交换和最终产物纯化。将产物保存在20mM组氨酸，pH 5.5中。通过280nm下的吸光度(EC280为1.61)来确定该产物的蛋白浓度。以下表35所示的条件，通过尺寸-排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)确定产物的纯度和聚集水平。该产物的聚集水平为0.57％，并且该产物的单体纯度为99.43％。通过HIC-HPLC测量产物的药物比抗体比(DAR)为4.06。
z10-mc-vc-PABC-MMAE(在本文中也称为“z10-MMAE”)的合成
将9002.8μL z10(7.22mg/mL)与410.535μL TCEP(2.5mM)在最终体积11.7mL的40mM PB pH 7.0溶液中，在37℃，在温和旋转下培育3h。然后，添加771.2μL DMA和528.76μLmc-vc-PABC-MMAE(10mg/mL)在DMA中的溶液至最终DMA含量10％v/v和mc-vc-PABC-MMAE/mAb比为9。将反应混合物在4℃，在温和旋转下培育22h。在反应期间，用PBS pH 7.2平衡40KD旋转脱盐柱。将该脱盐柱用于缓冲液交换和纯化。将产物保存在20mM组氨酸，pH 5.5中。通过280nm下的吸光度(EC280为1.53)来确定该产物的蛋白浓度。以下表35所示的条件，通过尺寸-排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)确定产物的纯度和聚集水平。产物的单体纯度为100％。通过HIC-HPLC将产物的DAR确定为3.88。
IgG1-CL2A-SN-38(在本文中也称为“IgG-SN-38”)的合成
将6272μL IgG1同种型对照(11.16mg/mL,WuXi,562)与8eq TCEP(769μL,5mM)在总体积12.6mL的PB pH 7.0溶液中培育。将反应在37℃，在温和旋转下培育3h。然后，通过冰浴使反应混合物冷却至4℃，然后添加327μL DMA和1073μLCL2A-SN-38(10mg/mL,LevenaBiopharma,LN291-60)在DMA中的溶液。将混合物在4℃保持1h。在反应期间，用乙酸pH 6.0平衡40KD旋转脱盐柱。将该脱盐柱用于缓冲液交换和最终产物纯化。将产物保存在20mM乙酸pH 6.0中。通过280nm下的吸光度(EC280为1.88，参比波长700nm)来确定该产物的蛋白浓度。使用下表36中所述的条件，通过SEC-HPLC确定产物的聚集和纯度。该产物的聚集水平为1.14％且纯度为99.14％。通过LC-MS将产物的DAR确定为7.78。
z10-CL2A-SN-38(在本文中也称为“z10-SN-38”)的合成
将9002μL z10(7.22mg/mL)与8eq TCEP(714μL,5mM)在总体积11.7mL的PB pH 7.0溶液中培育。将反应混合物在37℃，在温和旋转下培育3h。然后，通过冰浴使反应混合物冷却至4℃，然后添加90μL DMA和1210μL CL2A-SN-38(10mg/mL,Levena Biopharma,LN291-60)在DMA中的溶液。将混合物在4℃保持1h。在反应期间，用乙酸pH 6.0平衡40KD旋转脱盐柱。将该脱盐柱用于缓冲液交换和最终产物纯化。将产物保存在20mM乙酸pH 6.0中。通过280nm下的吸光度(EC280为1.82)来确定该产物的蛋白浓度。使用下表36中所述的条件，通过SEC-HPLC确定产物的单体纯度。因此，该产物的聚集水平为1.14％，并且该产物的单体纯度为98.86％。通过LC-MS将产物的DAR确定为7.49。
纯度和聚集水平的确定
表35和36提供了通过它们确定抗体-药物缀合物的纯化和聚集的SEC-HPLC参数。
表35：Ab-mc-vc-PABC-MMAE产物的纯度和聚集水平的SEC-HPLC
Figure BDA0003301650990001081
表36：Ab-CL2A-SN38的纯度和聚集水平的SEC-HPLC
Figure BDA0003301650990001082
内化测定
根据生产商的说明书，使用pHrodo iFL红微尺度标记试剂盒(ThermoFisher,P36014)，用pH-敏感性染料pHrodo iFL红标记IgG对照(R&D 1-001-A)、z10、z10-MMAE和z10-SN-38。通过检测pHrodo荧光的流式细胞术确定抗体内化，所述荧光在中性pH最小并且在酸性环境，如溶酶体中最大。
将10万个SKMEL5细胞每孔在24-孔板上的1mL补充有10％FBS和青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基(ATCC)中铺板并分别与10nM pHrodo-标记的IgG、z10、z10-MMAE或z10-SN-38培育3或6小时。将细胞胰蛋白酶化，通过70μm过滤器过滤并在含有人TruStain FcX阻断试剂(Biolegend,422301)的FACS缓冲液(2％BSA、10mM EDTA、25mM HEPES、0.1％叠氮化钠在无Ca/Mg的PBS中)中再混悬。在冰上用BV421-缀合的抗MERTK抗体顺序染色细胞20min以检测表面MERTK水平(Biolegend,367603)，然后在冰上用可固定活力染料(fixableviability dye)(eFluor 780)(Thermofisher,65-0865-14)染色20min。
用LSRFortessa流式细胞仪(BD Biosciences)分析pHrodo和BV-421的平均荧光强度(MFI)并用GraphPad Prism对补偿数据作图。用pHrodo-标记的IgG、z10、z10-MMAE和z10-SN38的标记程度(DOL)归一化pHrodo的MFI。根据生产商所提供的公式，从标记后蛋白的A280和A560吸光值计算DOL。
癌细胞系的存活力测定
将200个SKMEL5细胞或1000个RPMI8226细胞每孔在96-孔板的孔中铺板，并在100μL补充有10％FBS和青霉素/链霉素且含有浓度分别为0.015、0.046、0.137、0.412、1.24、3.70、11.1、33.3和100nM的IgG对照(BioXCell,BE0092)、IgG1-MMAE、z10-MMAE、IgG1-SN-38或z10-SN-38中的任一种的RPMI-1640培养基(ATCC)中培养。在第7天，将100μL CellTiter-Glo 2.0细胞存活力测定试剂(Promega,G9241)加入至每个孔中，培育10min并用GloMaxDiscover酶标仪(Promega)检测发光信号。使用GraphPad Prism对来自重复的孔的平均相对光度计单元(RLU)作图。
巨噬细胞存活力测定
通过在室温下以250×g Histopaque-1077(Sigma,10771)密度梯度离心30min，从健康供体的血沉棕黄层制备周围血单核细胞(PBMC)。收集含有PBMC的中间层并用PBS/2mMEDTA清洗细胞三次。根据生产商的说明书，使用人经典单核细胞分离试剂盒(Miltenyi,130-117-337)通过磁力分离从PBMC分离人单核细胞。将8万个单核细胞每孔在96-孔板上的150μL PBMC培养基(含有10％人AB血清、10％FBS、L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素的RPMI1640培养基(Gibco,11875093))中，在37℃，5％CO2下培养。用GM-CSF(20ng/mL；Biolegend,766102)或M-CSF(50ng/mL；Biolegend,574804)处理单核细胞8天以分别分化M1或M2巨噬细胞。然后，用IgG对照(2或20nM；BioXCell,BE0092)、z10(2或20nM)、IgG1-MMAE(1或10nM)、z10-MMAE(1或10nM)、IgG1-SN-38(0.03或0.3nM)、z10-SN-38(0.03或0.3nM)或者1μM小分子MERTK抑制剂UNC-1062(Aobious,AOB4488)，在100μL含有GM-CSF或M-CSF的分化培养基中处理分化的巨噬细胞。在第4天，将100μL CellTiter-Glo 2.0细胞存活力测定试剂(Promega,G9241)加入至每个孔中，培育10min并用GloMax Discover酶标仪(Promega)检测发光信号。使用GraphPad Prism对来自重复的孔的平均相对光度计单元(RLU)作图。
免疫印迹
将SKMEL5细胞和RPMI8226细胞培养并维持在补充有10％FBS和青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基(ATCC)中。在含有蛋白酶抑制剂(Sigma,4693159001)和磷酸酶抑制剂(Sigma,P2850和P5726)的RIPA缓冲液(Sigma,20-188)中制备完整-细胞裂解液。使用BCA蛋白质测定试剂盒(ThermoFisher,23225)测量蛋白浓度。将相等的蛋白量(30μg)加载至4-20％的Tris-甘氨酸凝胶(Bio-Rad，4561094)上，然后转移至PVDF膜(Bio-Rad,1620177)。在用5％BSA封闭后，在室温下用在具有1％BSA的PBST(0.1％吐温-20在PBS中)中的第一抗体探查膜1hr。在具有1％BSA的PBST中的3步清洗步骤后，加入在具有1％BSA的PBST中的HRP-缀合的第二抗体并培育1h(Sigma,AP187P和AP181P)。用PBST清洗印迹并使用ChemiDoc成像系统(Bio-Rad)，使用ECL免疫印迹底物(ThermoFisher,32106)显色。将信号对于用作内部对照的微管蛋白归一化。在免疫印迹测定中使用了以下第一抗体；MERTK(abcam,ab52968)、磷酸MERTK(abcam,ab14921)、AXL(CST,8661)、Tyro3(CST,5585)、AKT(abcam,ab32505)、磷酸AKT(abcam,ab81283)、微管蛋白(Sigma,T5168)。
转移测定
将具有荧光素酶报告基因的MDA-MB-231LM2 TR三阴乳腺癌细胞(来源于SohailTavazoie教授，Rockefeller University,NYC)(Minn等人,Nature.2005年7月28日；436(7050):518-524)在D10F培养基(DMEM Life Technologies,11965-092)、10％FBS Sigma,F4135-500ml、1％NEAA Fisher,11140-050、1％丙酮酸钠Fisher,11360-070、1％HepesFisher,15630-080和1％青霉素/链霉素Fisher,15140-122中培养。在注射当天，用DPBS(Fisher,14190-144)清洗细胞并使用每个15cm细胞培养皿3mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA(Fisher,25200-056)，在37℃细胞培养箱中分离5min。将分离的细胞在5mL D10F中再混悬，使用血球计计数并在RT下以220×g离心5min。将小粒在DPBS中以500,000个细胞/mL的浓度再混悬。将8-周大的NSG雌性小鼠(Jackson,005557)暴露于小动物加热灯(MorganvilleScientific,HL0100)2-3分钟。将100μL细胞混悬液(50000个细胞)注射到雌性8-周大NSG小鼠的扩张的侧尾静脉。在无菌PBS中制备IgG-MMAE同种型对照和z10-MMAE并在MDA-MB-231LM2细胞注射后第0、3、10、18、33和41天i.p.施用。起初，以3mg/kg剂量施用IgG-MMAE和z10-MMAE，并在第18天降低至2mg/kg，并在第33天降低至1mg/kg。
一旦i.p.施用150mg/kg D-萤光素(Thermofisher Scientific,Waltham,MA)，使用IVIS成像监测肺定殖。将每个时间点的发光数据对第0天或肿瘤注射当天归一化，并使用Prism(Graphpad Software,La Jolla,CA)作图。将单尾曼-惠特尼U-检验用于评价如通过生物发光成像所测量的转移的显著性。
通过竞争性ELISA的亲和力测量
在4℃，用0.01μg/mL hMER重组蛋白(R&D Systems,891-MR-100)涂覆96-孔NuncMaxiSorp平底板(ThermoFisher,44-2404-21)过夜。用PBS 0.1％吐温清洗板三次，并用3％在PBS中的无脂肪脱脂奶粉(non-fat dry skim milk)封闭2h。在板的预培育期间，在室温下将处于多种浓度(50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10、0.05和0nM)的hMER重组蛋白在PBS中的溶液分别与0.3nM的z10、z10-MMAE或z10-SN-38平衡1h。然后，用PBST(0.1％吐温-20在PBS中)清洗hMER-涂覆的板三次并将抗原-抗体混合物加入至孔中(重复两次)，并在室温下培育1h。用PBST清洗板3次，并与在PBS中1:3000稀释的碱性磷酸酶-缀合的抗-人IgG抗体(Sigma,SAB3701248)在室温下培育1h。在用PBST清洗三次后，在每个孔中加入100uL黄色碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase Yellow)(pNPP)液体底物(Sigma,P7998)并在室温下培育70min。使用
Figure BDA0003301650990001101
Discover酶标仪(Promega)测量板在405nm和560nm的吸光值。用560nm的吸光值对405nm的吸光值归一化。将来自重复孔的平均值作为抗原浓度的函数作图，并使用GraphPad Prism 7.0c，通过非线性回归分析确定Kd。
6.4.2.结果
合成了z10-mc-vc-PABC-MMAE(z10-MMAE)和IgG1-mc-vc-PABC-MMAE(IgG-MMAE)，它们的结构显示于图13A中，其中Ab(抗体部分)分别为z10和对照IgG。合成了z10-CL2A-SN-38(z10-SN-38)和IgG1-CL2A-SN-38(IgG-SN-38)，它们的结构显示于图13B中，其中Ab(抗体部分)分别为z10和对照IgG。
通过SEC-HPLC评价抗体-药物缀合物的纯度。图14A和14B分别显示了z10-MMAE和z10-SN-38的SEC-HPLC结果。对于两种缀合物，未测量到或测量到最小的聚集，这表明了缀合物的高纯度。
为了评价抗体-药物缀合物和z10的结合亲和力，在添加至预涂覆了hMER重组蛋白的ELISA板之前，分别用0.3nM z10、z10-MMAE或z10-SN-38平衡hMER重组蛋白(50nM-0.05nM)。使用AP-缀合的抗-人IgG第二抗体检测抗体结合并使用GloMax酶标仪展开。图15显示z10、z10-MMAE和z10-SN-38分别以0.17nM、0.081nM和0.021nM的Kd值结合至人MER。
将SKMel5细胞与6.7nM pHrodo-标记的z10、z10-MMAE、z10-SN-38或IgG对照培育。用BV421-缀合的MERTK抗体对表面MERTK染色。通过流式细胞术测量结合。图16A中所示的数据表明z10以及z10-MMAE和z10-SN-38缀合物诱导MERTK内化。图16B中所示的数据表明z10以及z10-MMAE和z10-SN-38缀合物诱导MERTK的降解。
将SKMel5或RPMI8226细胞与IgG对照、IgG-MMAE、z10-MMAE、IgG-SN-38或z10-SN-38培育7天。使用CellTiterGlo测量细胞存活力。图17A和17B中所示的数据显示在与IgG-MMAE或者IgG对照培育后，与这些细胞的存活力相比，z10-MMAE分别降低了SKMel5黑素瘤和RPMI8226多发性骨髓瘤细胞的存活力。图17C和17D中所示的数据显示与和IgG-SN-38或IgG对照培育的那些细胞的存活力相比，z10-SN-38分别降低了SKMel5黑素瘤和RPMI8226多发性骨髓瘤细胞的存活力。图17E显示了在从SKMel5和RPMI8226细胞制备的完整细胞裂解液中MERTK、磷酸MERTK、AXL、Tyro3、AKT、磷酸AKT和微管蛋白的表达。
将50,000个MDA-MB-231-LM2 TNBC细胞注入NSG小鼠的尾静脉。在肿瘤细胞接种当天开始治疗，并且通过生物发光成像监测肺转移性定殖。图18A显示与IgG-MMAE相比，z10-MMAE体内抑制MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞的肺定殖。在图18B中定量数据。
通过将8×104个单核细胞在具有M-CSF(50ng/mL)的PBMC培养基中培养8天使M2巨噬细胞分化。通过将8×104个单核细胞在具有GM-CSF(20ng/mL)的PBMC培养基中培养5天，然后与GM-CSF(20ng/mL)、IFNg(20ng/mL)、IL-6(20ng/mL)和LPS(10ng/mL)培养另外3天使M1巨噬细胞分化。用指定抗体或ADC在分化培养基中处理M2和M1巨噬细胞4天，并使用CellTiter-Glo 2.0细胞存活力测定评价存活力。图19A中所示的数据显示z10、z10-MMAE、z10-SN-38、MERTK抑制剂UNC1062均不影响表达MERTK的M1巨噬细胞的存活力。图19B中所示的数据显示z10、z10-MMAE、z10-SN-38、MERTK抑制剂UNC1062均不影响表达MERTK的M2巨噬细胞的存活力。
上述内容不应受限于本文所述的具体实施方式的范围。的确，除了本文所描述的那些之外，根据以上描述和附图，本文所提供的抗体和方法的多种修改以及它们的等价形式将对于本领域技术人员变得显而易见。这些改变旨在处于所附权利要求的范围内。
本文所引用的所有参考文献以好象每个单个专利公开或专利或专利申请具体且单独表明出于所有目的以其全部作为参考并入的相同程度以其全部内容并且出于所有目的作为参考并入本文。
序列表
<110> 睿治尼斯公司
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<160> 132
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13/xAb VH CDR1 (Antibody z10/z11/z13/xAb VH CDR1)(Kabat)
<400> 1
Asn Tyr Gly Met Asn
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<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
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<223> 抗体z10/z11/z13/xAb VH CDR2 (Antibody z10/z11/z13/xAb VH CDR2)(Kabat/Exemplary)
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Gly
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1
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Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr
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<223> 抗体z10/z11/z13/xAb VH CDR2 (Antibody z10/z11/z13/xAb VH CDR2)(IMGT)
<400> 10
Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro
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<220>
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Lys Ser Thr Val Val Ser Arg Tyr Phe Asp Val
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Ser Thr Val Val Ser Arg Tyr Phe Asp
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1 5 10
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<211> 13
<212> PRT
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<220>
<223> 抗体z10/z11/z13/xAb VH CDR3 (Antibody z10/z11/z13/xAb VH CDR3)(IMGT)
<400> 14
Ala Arg Lys Ser Thr Val Val Ser Arg Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 15
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<212> PRT
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<220>
<223> 抗体z10/Z11/z13 VH 框架区 VH FR1 (Antibody z10/Z11/z13 VH FrameworkRegion VH FR1) (Kabat)
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体 z10/z11/z13 VH 框架区 VH FR2 (Antibody z10/z11/z13 VHFramework Region VH FR2) (Kabat)
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Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10 VH框架区域VH FR3 (Antibody z10 VH Framework Region VH FR3)(Kabat/Exemplary)
<400> 17
Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VH框架区域VH FR4 (Antibody z10/z11/z13 VH FrameworkRegion VH FR4)(Kabat)
<400> 18
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 19
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VH框架区域VH FR1 (Antibody z10/z11/z13 VH FrameworkRegion VH FR1)(Chothia)
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 20
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VH 框架区域 VH FR2 (Antibody z10/z11/z13 VHFramework Region VH FR2)(Chothia)
<400> 20
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
1 5 10 15
Gly Trp Ile Asn
20
<210> 21
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10 VH 框架区域 VH FR3 (Antibody z10 VH Framework Region VHFR3)(Chothia)
<400> 21
Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr
1 5 10 15
Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser
20 25 30
Asp Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys
35 40
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VH 框架区域 VH FR4 (Antibody z10/z11/z13 VHFramework Region VH FR4)(Chothia)
<400> 22
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 23
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VH 框架区域 VH FR1 (Antibody z10/z11/z13 VHFramework Region VH FR1)(AbM)
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VH 框架区域 VH FR2 (Antibody z10/z11/z13 VHFramework Region VH FR2)(AbM)
<400> 24
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 25
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10 VH 框架区域 VH FR3 (Antibody z10 VH Framework Region VHFR3) (AbM)
<400> 25
Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser
1 5 10 15
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Met
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
35
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VH 框架区域 VH FR4 (Antibody z10/z11/z13 VHFramework Region VH FR4) (AbM)
<400> 26
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 27
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VH 框架区域 VH FR1 (Antibody z10/z11/z13 VHFramework Region VH FR1) (Contact)
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VH 框架区域 VH FR2 (Antibody z10/z11/z13 VHFramework Region VH FR2) (Contact)
<400> 28
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
1 5 10
<210> 29
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10 VH 框架区域 VH FR3 (Antibody z10 VH Framework Region VHFR3) (Contact)
<400> 29
Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser
1 5 10 15
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Met
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VH 框架区域 VH FR4 (Antibody z10/z11/z13 VHFramework Region VH FR4) (Contact)
<400> 30
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 31
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VH 框架区域 VH FR1 (Antibody z10/z11/z13 VHFramework Region VH FR1) (IMGT)
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VH 框架区域 VH FR2 (Antibody z10/z11/z13 VHFramework Region VH FR2) (IMGT)
<400> 32
Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Trp
<210> 33
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10 VH 框架区域 VH FR3 (Antibody z10 VH Framework Region VHFR3) (IMGT)
<400> 33
Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr
1 5 10 15
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp
20 25 30
Met Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VH 框架区域 VH FR4 (Antibody z10/z11/z13 VHFramework Region VH FR4) (IMGT)
<400> 34
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 35
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VH 框架区域 VH FR1 (Antibody z10/z11/z13 VHFramework Region VH FR1) (Exemplary)
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 36
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VH 框架区域 VH FR2 (Antibody z10/z11/z13 VHFramework Region VH FR2) (Exemplary)
<400> 36
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VH 框架区域 VH FR4 (Antibody z10/z11/z13 VHFramework Region VH FR4) (Exemplary)
<400> 37
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 38
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z11 VH 框架区域 VH FR3 (Antibody z11 VH Framework Region VHFR3) (Kabat/Exemplary)
<400> 38
Arg Val Thr Met Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 39
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z11 VH 框架区 VH FR3 (Antibody z11 VH Framework Region VH FR3(Chothia))
<400> 39
Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Leu
1 5 10 15
Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser
20 25 30
Asp Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys
35 40
<210> 40
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z11 VH 框架区 VH FR3 (Antibody z11 VH Framework Region VH FR3)(AbM)
<400> 40
Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Leu Asp Thr Ser
1 5 10 15
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Met
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
35
<210> 41
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z11 VH 框架区 VH FR3 (Antibody z11 VH Framework Region VH FR3)(Contact)
<400> 41
Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Leu Asp Thr Ser
1 5 10 15
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Met
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 42
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z11 VH 框架区 VH FR3 (Antibody z11 VH Framework Region VH FR3)(IMGT)
<400> 42
Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Leu Asp Thr
1 5 10 15
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp
20 25 30
Met Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 43
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z13 VH 框架区 VH FR3 (Antibody z13 VH Framework Region VH FR3)(Kabat/Exemplary)
<400> 43
Arg Val Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 44
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z13 VH 框架区 VH FR3 (Antibody z13 VH Framework Region VH FR3)(Chothia)
<400> 44
Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Leu
1 5 10 15
Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser
20 25 30
Asp Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys
35 40
<210> 45
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z13 VH 框架区 VH FR3 (Antibody z13 VH Framework Region VH FR3)(AbM)
<400> 45
Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser
1 5 10 15
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Met
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
35
<210> 46
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z13 VH 框架区 VH FR3 (Antibody z13 VH Framework Region VH FR3)(Contact)
<400> 46
Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser
1 5 10 15
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Met
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 47
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z13 VH 框架区 VH FR3 (Antibody z13 VH Framework Region VH FR3)(IMGT)
<400> 47
Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Leu Asp Thr
1 5 10 15
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp
20 25 30
Met Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 48
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体VH FR3 共有序列 (Antibody VH FR3 Consensus sequence) (Kabat)
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = Phe or Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa = Thr or Leu
<400> 48
Arg Val Thr Xaa Thr Xaa Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 49
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体VH FR3 共有序列 (Antibody VH FR3 Consensus sequence) (Chothia)
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Xaa = Phe or Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Xaa = Thr or Leu
<400> 49
Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Xaa Thr Xaa
1 5 10 15
Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser
20 25 30
Asp Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys
35 40
<210> 50
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体VH FR3 共有序列 (Antibody VH FR3 Consensus sequence) (AbM)
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Phe or Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa = Thr or Leu
<400> 50
Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Xaa Thr Xaa Asp Thr Ser
1 5 10 15
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Met
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
35
<210> 51
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体VH FR3 共有序列 (Antibody VH FR3 Consensus sequence) (Contact)
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<Antibody> Xaa = Phe or Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
< (Antibody)> Xaa = Thr or Leu
<400> 51
Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Xaa Thr Xaa Asp Thr Ser
1 5 10 15
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Met
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 52
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
< (Antibody)> Antibody VH FR3 Consensus sequence (IMGT)
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
< (Antibody)> Xaa = Phe or Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
< (Antibody)> Xaa = Thr or Leu
<400> 52
Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Xaa Thr Xaa Asp Thr
1 5 10 15
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp
20 25 30
Met Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 53
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
< (Antibody)> Antibody VH FR3 Consensus sequence (Exemplary)
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
< (Antibody)> Xaa = Phe or Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
< (Antibody)> Xaa = Thr or Leu
<400> 53
Arg Val Thr Xaa Thr Xaa Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 54
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<Antibody> Antibody xAb VH Framework Region VH FR1 (Kabat)
<400> 54
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 55
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<Antibody> Antibody xAb VH Framework Region VH FR2 (Kabat/AbM/Exemplary)
<400> 55
Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly
1 5 10
<210> 56
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体xAb VH 框架区 VH FR3 (Antibody xAb VH Framework Region VH FR3)(Kabat/Exemplary)
<400> 56
Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 57
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体xAb VH 框架区 VH FR4 (Antibody xAb VH Framework Region VH FR4)
(Kabat/AbM/IMGT/Exemplary)
<400> 57
Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 58
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体xAb VH 框架区 VH FR1 (Antibody xAb VH Framework Region VH FR1)
(Chothia/AbM/IMGT/Exemplary)
<400> 58
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 59
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体xAb VH 框架区 VH FR2 (Antibody xAb VH Framework Region VH FR2)(Chothia)
<400> 59
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
1 5 10 15
Gly Trp Ile Asn
20
<210> 60
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体 xAb VH 框架区 VH FR3 (Antibody xAb VH Framework Region VH FR3)(Chothia)
<400> 60
Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu
1 5 10 15
Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn
20 25 30
Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Lys
35 40
<210> 61
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体 xAb VH 框架区 VH FR4 (Antibody xAb VH Framework Region VH FR4)(Chothia/Contact)
<400> 61
Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 62
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体xAb VH 框架区 VH FR3 (Antibody xAb VH Framework Region VH FR3)(AbM)
<400> 62
Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Thr Ser
1 5 10 15
Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met
20 25 30
Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg
35
<210> 63
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体xAb VH 框架区 VH FR1(Antibody xAb VH Framework Region VH FR1)(Contact)
<400> 63
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体xAb VH 框架区 VH FR2 (Antibody xAb VH Framework Region VH FR2)(Contact)
<400> 64
Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys
1 5 10
<210> 65
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体xAb VH 框架区 VH FR3 (Antibody xAb VH Framework Region VH FR3)(Contact)
<400> 65
Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Thr Ser
1 5 10 15
Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met
20 25 30
Ala Thr Tyr Phe Cys
35
<210> 66
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体 xAb VH 框架区 VH FR2 (Antibody xAb VH Framework Region VH FR2)(IMGT)
<400> 66
Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly
1 5 10 15
Trp
<210> 67
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体xAb VH 框架区 VH FR3 (Antibody xAb VH Framework Region VH FR3)(IMGT)
<400> 67
Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Thr
1 5 10 15
Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp
20 25 30
Met Ala Thr Tyr Phe Cys
35
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13/xAb VL CDR1 (Antibody z10/z11/z13/xAb VL CDR1)(Kabat/AbM/Exemplary)
<400> 68
Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Asp Ala Val Thr
1 5 10
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13/xAb VL CDR2 (Antibody z10/z11/z13/xAb VL CDR2)(Kabat/AbM/Exemplary)
<400> 69
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
1 5
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13/xAb VL CDR3 (Antibody z10/z11/z13/xAb VL CDR3)(Kabat/AbM/IMGT/Exemplary)
<400> 70
Gln Gln Tyr Arg Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 71
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13/xAb VL CDR1 (Antibody z10/z11/z13/xAb VL CDR1)(Chothia)
<400> 71
Ser Gln Asp Val Gly Asp Ala
1 5
<210> 72
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13/xAb VL CDR2 (Antibody z10/z11/z13/xAb VL CDR2)(Chothia/IMGT)
<400> 72
Trp Ala Ser
1
<210> 73
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13/xAb VL CDR3 (Antibody z10/z11/z13/xAb VL CDR3)(Chothia)
<400> 73
Tyr Arg Ser Tyr Pro Leu
1 5
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VL CDR1 (Antibody z10/z11/z13 VL CDR1) (Contact)
<400> 74
Gly Asp Ala Val Thr Trp Tyr
1 5
<210> 75
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13/xAb VL CDR2 (Antibody z10/z11/z13/xAb VL CDR2)(Contact)
<400> 75
Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His
1 5 10
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13/xAb VL CDR3 (Antibody z10/z11/z13/xAb VL CDR3)(Contact)
<400> 76
Gln Gln Tyr Arg Ser Tyr Pro Leu
1 5
<210> 77
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13/xAb VL CDR1 (Antibody z10/z11/z13/xAb VL CDR1)(IMGT)
<400> 77
Gln Asp Val Gly Asp Ala
1 5
<210> 78
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体xAb VL CDR1 (Antibody xAb VL CDR1) (Contact)
<400> 78
Gly Asp Ala Val Thr Trp Cys
1 5
<210> 79
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体 z10/z11/z13 VL 框架区 VL FR1 (Antibody z10/z11/z13 VLFramework Region VL FR1)
(Kabat/AbM/Exemplary)
<400> 79
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VL 框架区 VL FR2 (Antibody z10/z11/z13 VL FrameworkRegion VL FR2)
(Kabat/AbM/Exemplary)
<400> 80
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 81
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VL 框架区 VL FR3 (Antibody z10/z11/z13 VL FrameworkRegion VL FR3)
(Kabat/AbM/Exemplary)
<400> 81
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 82
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VL 框架区 VL FR4 (Antibody z10/z11/z13 VL FrameworkRegion VL FR4)
(Kabat/AbM/IMGT/Exemplary)
<400> 82
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 83
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VL 框架区 VL FR1 (Antibody z10/z11/z13 VL FrameworkRegion VL FR1) (Chothia)
<400> 83
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala
20 25
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VL 框架区 VL FR2 (Antibody z10/z11/z13 VL FrameworkRegion VL FR2) (Chothia/IMGT)
<400> 84
Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 85
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VL 框架区 VL FR3 (Antibody z10/z11/z13 VL FrameworkRegion VL FR3) (Chothia)
<400> 85
Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
35
<210> 86
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VL 框架区 VL FR4 (Antibody z10/z11/z13 VL FrameworkRegion VL FR4) (Chothia/Contact)
<400> 86
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 87
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VL 框架区 VL FR1 (Antibody z10/z11/z13 VL FrameworkRegion VL FR1) (Contact)
<400> 87
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val
20 25
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VL 框架区 VL FR2 (Antibody z10/z11/z13 VL FrameworkRegion VL FR2) (Contact)
<400> 88
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
1 5
<210> 89
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 VL 框架区 VL FR3 (Antibody z10/z11/z13 VL FrameworkRegion VL FR3) (Contact)
<400> 89
Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
1 5 10 15
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
20 25 30
Cys
<210> 90
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体 z10/z11/z13 VL 框架区 VL FR1 (Antibody z10/z11/z13 VLFramework Region VL FR1) (IMGT)
<400> 90
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 91
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体 z10/z11/z13 VL 框架区 VL FR3 (Antibody z10/z11/z13 VLFramework Region VL FR3) (IMGT)
<400> 91
Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 92
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体 xAb VL 框架区 VL FR1 (Antibody xAb VL Framework Region VL FR1)(Kabat/AbM/Exemplary)
<400> 92
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys
20
<210> 93
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体 xAb VL 框架区 VL FR2 (Antibody xAb VL Framework Region VL FR2)(Kabat/AbM/Exemplary)
<400> 93
Trp Cys Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 94
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体 xAb VL 框架区 VL FR3 (Antibody xAb VL Framework Region VL FR3)(Kabat/AbM/Exemplary)
<400> 94
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys
20 25 30
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体 xAb VL 框架区 VL FR4 (Antibody xAb VL Framework Region VL FR4)(Kabat/AbM/IMGT/Exemplary)
<400> 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
1 5 10
<210> 96
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体 xAb VL 框架区 VL FR1 (Antibody xAb VL Framework Region VL FR1)(Chothia)
<400> 96
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala
20 25
<210> 97
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体 xAb VL 框架区 VL FR2 (Antibody xAb VL Framework Region VL FR2)(Chothia/IMGT)
<400> 97
Val Thr Trp Cys Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 98
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体 xAb VL 框架区 VL FR3 (Antibody xAb VL Framework Region VL FR3(Chothia))
<400> 98
Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala
20 25 30
Asp Tyr Phe Cys Gln Gln
35
<210> 99
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体 xAb VL 框架区 VL FR4 (Antibody xAb VL Framework Region VL FR4)(Chothia/Contact)
<400> 99
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
1 5 10
<210> 100
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体 xAb VL 框架区 VL FR1 (Antibody xAb VL Framework Region VL FR1）(Contact)
<400> 100
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val
20 25
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体 xAb VL 框架区 VL FR2 (Antibody xAb VL Framework Region VL FR2)(Contact)
<400> 101
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys
1 5
<210> 102
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体 xAb VL 框架区 VL FR3 (Antibody xAb VL Framework Region VL FR3)(Contact)
<400> 102
Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
1 5 10 15
Thr Leu Thr Ile Asn Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
20 25 30
Cys
<210> 103
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体xAb VL 框架区 VL FR1 (Antibody xAb VL Framework Region VL FR1)(IMGT)
<400> 103
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 104
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体xAb VL 框架区 VL FR3(Antibody xAb VL Framework Region VL FR3)(IMGT)
<400> 104
Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala
20 25 30
Asp Tyr Phe Cys
35
<210> 105
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10重链可变区 (Antibody z10 Heavy Chain Variable Region) (VH)
<400> 105
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Ser Thr Val Val Ser Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 106
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13轻链可变区 (Antibody z10/z11/z13 light ChainVariable Region) (VL)
<400> 106
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Asp Ala
20 25 30
Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 107
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z11重链可变区 (Antibody z11 Heavy Chain Variable Region) (VH)
<400> 107
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Ser Thr Val Val Ser Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 108
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z13重链可变区 (Antibody z13 Heavy Chain Variable Region) (VH)
<400> 108
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Ser Thr Val Val Ser Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 109
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体 重链可变区共有序列 (Antibody Heavy Chain Variable RegionConsensus sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(70)
<223> Xaa = Phe or Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(72)
<223> Xaa = Thr or Leu
<400> 109
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Xaa Thr Xaa Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Ser Thr Val Val Ser Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 110
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体 xAb 重链可变区 (Antibody xAb Heavy Chain Variable Region) (VH)
<400> 110
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Ser Thr Val Val Ser Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 111
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体 xAb 重链可变区 (Antibody xAb Light Chain Variable Region) (VL)
<400> 111
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Asp Ala
20 25 30
Val Thr Trp Cys Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Arg Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 112
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10重链 (Antibody z10 Heavy Chain)
<400> 112
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Ser Thr Val Val Ser Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 113
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13轻链 (Antibody z10/z11/z13 Light Chain)
<400> 113
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Asp Ala
20 25 30
Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 114
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z11重链 (Antibody z11 Heavy Chain)
<400> 114
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Ser Thr Val Val Ser Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 115
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z13重链 (Antibody z13 Heavy Chain)
<400> 115
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Ser Thr Val Val Ser Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 116
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体重链共有序列 (Antibody Heavy Chain Consensus Sequences)
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(70)
<223> Xaa = Phe or Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(72)
<223> Xaa = Thr or Leu
<400> 116
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Xaa Thr Xaa Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Ser Thr Val Val Ser Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 117
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体xAb 重链 (Antibody xAb Heavy Chain)
<400> 117
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Ser Thr Val Val Ser Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 118
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体xAb 轻链 (Antibody xAb Light Chain)
<400> 118
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Asp Ala
20 25 30
Val Thr Trp Cys Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Arg Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 119
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10 可变区 VH DNA 序列 (Antibody z10 Variable Region VH DNASequences)
<400> 119
caggtgcagc tggtgcagag cggcgctgag gtgaagaagc ccggcgctag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggca tgaactgggt gaggcaggct 120
cctggacagg gcctggagtg gatgggctgg atcaacacat acaccggcga gcccacctac 180
gccgacgact tcaagggcag ggtgaccttt accaccgaca ccagcaccag caccgcctac 240
atggagctga ggagcctgag aagcgacgac atggccgtgt actactgcgc cagaaagagc 300
accgtggtgt ccaggtactt cgacgtgtgg ggccagggca ccacagtgac cgtgagcagc 360
<210> 120
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13可变区 VL DNA 序列 (Antibody z10/z11/z13 VariableRegion VL DNA Sequences)
<400> 120
gacatccaga tgacccagag ccccagcttc ctgtccgcta gcgtgggcga cagggtgacc 60
atcacctgca aggccagcca ggacgtgggc gatgccgtga cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctactgg gccagcacaa ggcacacagg cgtgcccgac 180
agattcagcg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaggagct accccctgac cttcggccag 300
ggcaccaagc tggaaatcaa g 321
<210> 121
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z11 可变区 VH DNA 序列 (Antibody z11 Variable Region VH DNASequences)
<400> 121
caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaagc ctggcgccag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggca tgaactgggt gaggcaggct 120
cctggccagg gactggagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcga gcccacctac 180
gccgacgact tcaagggcag ggtgaccatg accctggaca ccagcaccag caccgcctac 240
atggagctga ggagcctgag gagcgacgac atggccgtgt actactgcgc caggaagagc 300
accgtggtgt ccaggtactt cgacgtgtgg ggacagggca ccaccgtgac cgtgagcagc 360
<210> 122
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z13 可变区 VH DNA 序列 (Antibody z13 Variable Region VH DNASequences)
<400> 122
caggtgcagc tggtgcagag cggagccgaa gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggca tgaactgggt gagacaggcc 120
cctggacagg gactggagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcga gcccacctac 180
gccgacgact tcaagggcag ggtgaccttc accctggaca ccagcaccag caccgcctac 240
atggagctga ggagcctgag gagcgacgac atggccgtgt actattgcgc caggaagagc 300
accgtggtga gcaggtactt cgacgtgtgg ggccagggaa ccaccgtgac cgtgagcagc 360
<210> 123
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体xAb 可变区 VH DNA 序列 (Antibody xAb Variable Region VH DNASequences)
<400> 123
cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60
tcctgcaagg cttctggata taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120
ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct acactggaga gccaacatat 180
gctgatgact tcaagggacg gtttgtcttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctac 240
ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac atggccacat atttctgtgc aagaaaaagt 300
acggtagtaa gtaggtactt cgatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
<210> 124
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体xAb 可变区 VL DNA 序列 (Antibody xAb Variable Region VL DNASequences)
<400> 124
gacattgtgc tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgggt gatgctgtaa cctggtgtca acagaaacca 120
ggtcaacctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtgggtc tgggacagat ttcactctca ccattaacaa tgtgcagtct 240
gaggacttgg cagattattt ctgtcagcaa tatcgcagct atcctctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa a 321
<210> 125
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10 重链 DNA 序列 (Antibody z10 Heavy Chain DNA Sequences)
<400> 125
caggtgcagc tggtgcagag cggcgctgag gtgaagaagc ccggcgctag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggca tgaactgggt gaggcaggct 120
cctggacagg gcctggagtg gatgggctgg atcaacacat acaccggcga gcccacctac 180
gccgacgact tcaagggcag ggtgaccttt accaccgaca ccagcaccag caccgcctac 240
atggagctga ggagcctgag aagcgacgac atggccgtgt actactgcgc cagaaagagc 300
accgtggtgt ccaggtactt cgacgtgtgg ggccagggca ccacagtgac cgtgagcagc 360
gcgtcgacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcc 480
tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtctacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagct taagcctgtc tccgggtaaa tga 1353
<210> 126
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z10/z11/z13 轻链 DNA 序列 (Antibody z10/z11/z13 Light Chain DNASequences)
<400> 126
gacatccaga tgacccagag ccccagcttc ctgtccgcta gcgtgggcga cagggtgacc 60
atcacctgca aggccagcca ggacgtgggc gatgccgtga cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctactgg gccagcacaa ggcacacagg cgtgcccgac 180
agattcagcg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaggagct accccctgac cttcggccag 300
ggcaccaagc tggaaatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttga 645
<210> 127
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z11 重链 DNA 序列 (Antibody z11 Heavy Chain DNA Sequences)
<400> 127
caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaagc ctggcgccag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggca tgaactgggt gaggcaggct 120
cctggccagg gactggagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcga gcccacctac 180
gccgacgact tcaagggcag ggtgaccatg accctggaca ccagcaccag caccgcctac 240
atggagctga ggagcctgag gagcgacgac atggccgtgt actactgcgc caggaagagc 300
accgtggtgt ccaggtactt cgacgtgtgg ggacagggca ccaccgtgac cgtgagcagc 360
gcgtcgacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcc 480
tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtctacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagct taagcctgtc tccgggtaaa tga 1353
<210> 128
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体z13 重链 DNA 序列 (Antibody z13 Heavy Chain DNA Sequences)
<400> 128
caggtgcagc tggtgcagag cggagccgaa gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggca tgaactgggt gagacaggcc 120
cctggacagg gactggagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcga gcccacctac 180
gccgacgact tcaagggcag ggtgaccttc accctggaca ccagcaccag caccgcctac 240
atggagctga ggagcctgag gagcgacgac atggccgtgt actattgcgc caggaagagc 300
accgtggtga gcaggtactt cgacgtgtgg ggccagggaa ccaccgtgac cgtgagcagc 360
gcgtcgacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcc 480
tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtctacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagct taagcctgtc tccgggtaaa tga 1353
<210> 129
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体xAb 重链 DNA 序列 (Antibody xAb Heavy Chain DNA Sequences)
<400> 129
cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60
tcctgcaagg cttctggata taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120
ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct acactggaga gccaacatat 180
gctgatgact tcaagggacg gtttgtcttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctac 240
ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac atggccacat atttctgtgc aagaaaaagt 300
acggtagtaa gtaggtactt cgatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
gcgtcgacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcc 480
tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtctacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagct taagcctgtc tccgggtaaa tga 1353
<210> 130
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体 xAb 轻链 DNA 序列 (Antibody xAb Light Chain DNA Sequences)
<400> 130
gacattgtgc tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgggt gatgctgtaa cctggtgtca acagaaacca 120
ggtcaacctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtgggtc tgggacagat ttcactctca ccattaacaa tgtgcagtct 240
gaggacttgg cagattattt ctgtcagcaa tatcgcagct atcctctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttga 645
<210> 131
<211> 999
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 全长人MERTK (Full-Length Human MERTK) (Swiss-Prot ID: Q12866.2)
<400> 131
Met Gly Pro Ala Pro Leu Pro Leu Leu Leu Gly Leu Phe Leu Pro Ala
1 5 10 15
Leu Trp Arg Arg Ala Ile Thr Glu Ala Arg Glu Glu Ala Lys Pro Tyr
20 25 30
Pro Leu Phe Pro Gly Pro Phe Pro Gly Ser Leu Gln Thr Asp His Thr
35 40 45
Pro Leu Leu Ser Leu Pro His Ala Ser Gly Tyr Gln Pro Ala Leu Met
50 55 60
Phe Ser Pro Thr Gln Pro Gly Arg Pro His Thr Gly Asn Val Ala Ile
65 70 75 80
Pro Gln Val Thr Ser Val Glu Ser Lys Pro Leu Pro Pro Leu Ala Phe
85 90 95
Lys His Thr Val Gly His Ile Ile Leu Ser Glu His Lys Gly Val Lys
100 105 110
Phe Asn Cys Ser Ile Ser Val Pro Asn Ile Tyr Gln Asp Thr Thr Ile
115 120 125
Ser Trp Trp Lys Asp Gly Lys Glu Leu Leu Gly Ala His His Ala Ile
130 135 140
Thr Gln Phe Tyr Pro Asp Asp Glu Val Thr Ala Ile Ile Ala Ser Phe
145 150 155 160
Ser Ile Thr Ser Val Gln Arg Ser Asp Asn Gly Ser Tyr Ile Cys Lys
165 170 175
Met Lys Ile Asn Asn Glu Glu Ile Val Ser Asp Pro Ile Tyr Ile Glu
180 185 190
Val Gln Gly Leu Pro His Phe Thr Lys Gln Pro Glu Ser Met Asn Val
195 200 205
Thr Arg Asn Thr Ala Phe Asn Leu Thr Cys Gln Ala Val Gly Pro Pro
210 215 220
Glu Pro Val Asn Ile Phe Trp Val Gln Asn Ser Ser Arg Val Asn Glu
225 230 235 240
Gln Pro Glu Lys Ser Pro Ser Val Leu Thr Val Pro Gly Leu Thr Glu
245 250 255
Met Ala Val Phe Ser Cys Glu Ala His Asn Asp Lys Gly Leu Thr Val
260 265 270
Ser Lys Gly Val Gln Ile Asn Ile Lys Ala Ile Pro Ser Pro Pro Thr
275 280 285
Glu Val Ser Ile Arg Asn Ser Thr Ala His Ser Ile Leu Ile Ser Trp
290 295 300
Val Pro Gly Phe Asp Gly Tyr Ser Pro Phe Arg Asn Cys Ser Ile Gln
305 310 315 320
Val Lys Glu Ala Asp Pro Leu Ser Asn Gly Ser Val Met Ile Phe Asn
325 330 335
Thr Ser Ala Leu Pro His Leu Tyr Gln Ile Lys Gln Leu Gln Ala Leu
340 345 350
Ala Asn Tyr Ser Ile Gly Val Ser Cys Met Asn Glu Ile Gly Trp Ser
355 360 365
Ala Val Ser Pro Trp Ile Leu Ala Ser Thr Thr Glu Gly Ala Pro Ser
370 375 380
Val Ala Pro Leu Asn Val Thr Val Phe Leu Asn Glu Ser Ser Asp Asn
385 390 395 400
Val Asp Ile Arg Trp Met Lys Pro Pro Thr Lys Gln Gln Asp Gly Glu
405 410 415
Leu Val Gly Tyr Arg Ile Ser His Val Trp Gln Ser Ala Gly Ile Ser
420 425 430
Lys Glu Leu Leu Glu Glu Val Gly Gln Asn Gly Ser Arg Ala Arg Ile
435 440 445
Ser Val Gln Val His Asn Ala Thr Cys Thr Val Arg Ile Ala Ala Val
450 455 460
Thr Arg Gly Gly Val Gly Pro Phe Ser Asp Pro Val Lys Ile Phe Ile
465 470 475 480
Pro Ala His Gly Trp Val Asp Tyr Ala Pro Ser Ser Thr Pro Ala Pro
485 490 495
Gly Asn Ala Asp Pro Val Leu Ile Ile Phe Gly Cys Phe Cys Gly Phe
500 505 510
Ile Leu Ile Gly Leu Ile Leu Tyr Ile Ser Leu Ala Ile Arg Lys Arg
515 520 525
Val Gln Glu Thr Lys Phe Gly Asn Ala Phe Thr Glu Glu Asp Ser Glu
530 535 540
Leu Val Val Asn Tyr Ile Ala Lys Lys Ser Phe Cys Arg Arg Ala Ile
545 550 555 560
Glu Leu Thr Leu His Ser Leu Gly Val Ser Glu Glu Leu Gln Asn Lys
565 570 575
Leu Glu Asp Val Val Ile Asp Arg Asn Leu Leu Ile Leu Gly Lys Ile
580 585 590
Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly Ser Val Met Glu Gly Asn Leu Lys Gln
595 600 605
Glu Asp Gly Thr Ser Leu Lys Val Ala Val Lys Thr Met Lys Leu Asp
610 615 620
Asn Ser Ser Gln Arg Glu Ile Glu Glu Phe Leu Ser Glu Ala Ala Cys
625 630 635 640
Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn Val Ile Arg Leu Leu Gly Val Cys
645 650 655
Ile Glu Met Ser Ser Gln Gly Ile Pro Lys Pro Met Val Ile Leu Pro
660 665 670
Phe Met Lys Tyr Gly Asp Leu His Thr Tyr Leu Leu Tyr Ser Arg Leu
675 680 685
Glu Thr Gly Pro Lys His Ile Pro Leu Gln Thr Leu Leu Lys Phe Met
690 695 700
Val Asp Ile Ala Leu Gly Met Glu Tyr Leu Ser Asn Arg Asn Phe Leu
705 710 715 720
His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Arg Asp Asp Met Thr
725 730 735
Val Cys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys Lys Ile Tyr Ser Gly Asp
740 745 750
Tyr Tyr Arg Gln Gly Arg Ile Ala Lys Met Pro Val Lys Trp Ile Ala
755 760 765
Ile Glu Ser Leu Ala Asp Arg Val Tyr Thr Ser Lys Ser Asp Val Trp
770 775 780
Ala Phe Gly Val Thr Met Trp Glu Ile Ala Thr Arg Gly Met Thr Pro
785 790 795 800
Tyr Pro Gly Val Gln Asn His Glu Met Tyr Asp Tyr Leu Leu His Gly
805 810 815
His Arg Leu Lys Gln Pro Glu Asp Cys Leu Asp Glu Leu Tyr Glu Ile
820 825 830
Met Tyr Ser Cys Trp Arg Thr Asp Pro Leu Asp Arg Pro Thr Phe Ser
835 840 845
Val Leu Arg Leu Gln Leu Glu Lys Leu Leu Glu Ser Leu Pro Asp Val
850 855 860
Arg Asn Gln Ala Asp Val Ile Tyr Val Asn Thr Gln Leu Leu Glu Ser
865 870 875 880
Ser Glu Gly Leu Ala Gln Gly Ser Thr Leu Ala Pro Leu Asp Leu Asn
885 890 895
Ile Asp Pro Asp Ser Ile Ile Ala Ser Cys Thr Pro Arg Ala Ala Ile
900 905 910
Ser Val Val Thr Ala Glu Val His Asp Ser Lys Pro His Glu Gly Arg
915 920 925
Tyr Ile Leu Asn Gly Gly Ser Glu Glu Trp Glu Asp Leu Thr Ser Ala
930 935 940
Pro Ser Ala Ala Val Thr Ala Glu Lys Asn Ser Val Leu Pro Gly Glu
945 950 955 960
Arg Leu Val Arg Asn Gly Val Ser Trp Ser His Ser Ser Met Leu Pro
965 970 975
Leu Gly Ser Ser Leu Pro Asp Glu Leu Leu Phe Ala Asp Asp Ser Ser
980 985 990
Glu Gly Ser Glu Val Leu Met
995
<210> 132
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于免疫的 MERTK 细胞外结构域 (Extracellular Doman of MERTK Usedfor Immunization)
<400> 132
Arg Glu Glu Ala Lys Pro Tyr Pro Leu Phe Pro Gly Pro Phe Pro Gly
1 5 10 15
Ser Leu Gln Thr Asp His Thr Pro Leu Leu Ser Leu Pro His Ala Ser
20 25 30
Gly Tyr Gln Pro Ala Leu Met Phe Ser Pro Thr Gln Pro Gly Arg Pro
35 40 45
His Thr Gly Asn Val Ala Ile Pro Gln Val Thr Ser Val Glu Ser Lys
50 55 60
Pro Leu Pro Pro Leu Ala Phe Lys His Thr Val Gly His Ile Ile Leu
65 70 75 80
Ser Glu His Lys Gly Val Lys Phe Asn Cys Ser Ile Ser Val Pro Asn
85 90 95
Ile Tyr Gln Asp Thr Thr Ile Ser Trp Trp Lys Asp Gly Lys Glu Leu
100 105 110
Leu Gly Ala His His Ala Ile Thr Gln Phe Tyr Pro Asp Asp Glu Val
115 120 125
Thr Ala Ile Ile Ala Ser Phe Ser Ile Thr Ser Val Gln Arg Ser Asp
130 135 140
Asn Gly Ser Tyr Ile Cys Lys Met Lys Ile Asn Asn Glu Glu Ile Val
145 150 155 160
Ser Asp Pro Ile Tyr Ile Glu Val Gln Gly Leu Pro His Phe Thr Lys
165 170 175
Gln Pro Glu Ser Met Asn Val Thr Arg Asn Thr Ala Phe Asn Leu Thr
180 185 190
Cys Gln Ala Val Gly Pro Pro Glu Pro Val Asn Ile Phe Trp Val Gln
195 200 205
Asn Ser Ser Arg Val Asn Glu Gln Pro Glu Lys Ser Pro Ser Val Leu
210 215 220
Thr Val Pro Gly Leu Thr Glu Met Ala Val Phe Ser Cys Glu Ala His
225 230 235 240
Asn Asp Lys Gly Leu Thr Val Ser Lys Gly Val Gln Ile Asn Ile Lys
245 250 255
Ala Ile Pro Ser Pro Pro Thr Glu Val Ser Ile Arg Asn Ser Thr Ala
260 265 270
His Ser Ile Leu Ile Ser Trp Val Pro Gly Phe Asp Gly Tyr Ser Pro
275 280 285
Phe Arg Asn Cys Ser Ile Gln Val Lys Glu Ala Asp Pro Leu Ser Asn
290 295 300
Gly Ser Val Met Ile Phe Asn Thr Ser Ala Leu Pro His Leu Tyr Gln
305 310 315 320
Ile Lys Gln Leu Gln Ala Leu Ala Asn Tyr Ser Ile Gly Val Ser Cys
325 330 335
Met Asn Glu Ile Gly Trp Ser Ala Val Ser Pro Trp Ile Leu Ala Ser
340 345 350
Thr Thr Glu Gly Ala Pro Ser Val Ala Pro Leu Asn Val Thr Val Phe
355 360 365
Leu Asn Glu Ser Ser Asp Asn Val Asp Ile Arg Trp Met Lys Pro Pro
370 375 380
Thr Lys Gln Gln Asp Gly Glu Leu Val Gly Tyr Arg Ile Ser His Val
385 390 395 400
Trp Gln Ser Ala Gly Ile Ser Lys Glu Leu Leu Glu Glu Val Gly Gln
405 410 415
Asn Gly Ser Arg Ala Arg Ile Ser Val Gln Val His Asn Ala Thr Cys
420 425 430
Thr Val Arg Ile Ala Ala Val Thr Arg Gly Gly Val Gly Pro Phe Ser
435 440 445
Asp Pro Val Lys Ile Phe Ile Pro Ala His Gly Trp Val Asp Tyr Ala
450 455 460
Pro Ser Ser Thr Pro Ala Pro Gly Asn Ala
465 470

Claims (64)

1.特异性结合至人Mer酪氨酸激酶(MERTK)的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或抗原-结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列。
2.特异性结合至人MERTK的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或抗原-结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含SEQ ID NO：107或108所示的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列。
3.特异性结合至人MERTK的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或抗原-结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含SEQ ID NO：108或109所示的序列的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列。
4.特异性结合至人MERTK的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体或抗原-结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含SEQ ID NO：110所示的序列的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO：120所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为单克隆抗体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为包含两条相同的重链和两条相同的轻链的免疫球蛋白。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含人-来源的重链和轻链恒定区。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为IgG。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含人-来源的重链和轻链恒定区的一部分。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原-结合片段为Fab或F(ab')2片段。
11.包含两种不同的抗原-结合区的双重特异性抗体，其中一个抗原-结合区包含根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或抗原-结合片段，并且其中另一个抗原-结合区结合至目标抗原。
12.根据权利要求11所述的双重特异性抗体，其中所述目标抗原是免疫细胞受体或肿瘤-相关抗原。
13.根据权利要求11所述的双重特异性抗体，其中所述目标抗原是CD3、PD-L1、LRP1、LPR8、TGF-β、ICOS、CD40、NKGD2或TIGIT。
14.抗体-药物缀合物，其包括：(a)作为根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原-结合片段的抗体部分；(b)一个或多个药物部分，每个药物部分为细胞毒性剂，和(c)任选地接头，其中所述细胞毒性剂直接缀合至所述抗体部分或者通过所述接头缀合至所述抗体部分。
15.根据权利要求14所述的抗体-药物缀合物，其具有1:3至1:12之间的所述抗体部分比所述药物部分的摩尔比。
16.根据权利要求14所述的抗体-药物缀合物，其具有1:9的所述抗体部分比所述药物部分的摩尔比。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述细胞毒性剂是小分子、核苷酸、肽或非抗体蛋白质。
18.根据权利要求14-16中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述细胞毒性剂是小分子。
19.根据权利要求14至16中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述细胞毒性剂是奥瑞他汀、美登素、吡咯并苯二氮卓、吲哚啉并苯二氮卓、卡里奇霉素(calicheamicin)、喜树碱类似物、倍癌毒素、微管蛋白抑制剂、微管溶素(tubulysin)或微管溶素(tubulysin)类似物、amberstatin269、多柔比星、SN-38、抗生素、蒽环类抗生素、微管抑制剂、斯考他汀(spliceostatin)或泰抑素(thailanstatin)。
20.根据权利要求14至16中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述细胞毒性剂为一甲基奥瑞他汀E(MMAE)或一甲基奥瑞他汀F(MMAF)。
21.根据权利要求14至16中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述细胞毒性剂为DM1或DM4。
22.根据权利要求14至16中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述细胞毒性剂为一甲基奥瑞他汀E。
23.根据权利要求14至16中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述细胞毒性剂为SN-38。
24.根据权利要求14至23中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体-药物缀合物包含接头并且所述接头是可切割接头。
25.根据权利要求14至23中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体-药物缀合物包含接头并且所述接头是非可切割接头。
26.根据权利要求14至23中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体-药物缀合物包含接头并且所述接头是马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄基氧基羰基。
27.根据权利要求14至23中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体-药物缀合物包含接头并且所述接头是CL2。
28.根据权利要求14至23中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体-药物缀合物包含接头并且所述接头是CL2A。
29.分离的核酸序列，其包含编码根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
30.分离的核酸序列，其包含编码根据权利要求1至10中任一项所述的VH的多核苷酸。
31.分离的核酸序列，其包含编码根据权利要求1至10中任一项所述的VL的多核苷酸。
32.离体细胞，其含有编码根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或抗原-结合片段的一个或多个多核苷酸。
33.产生抗体或抗原-结合片段的方法，其包括将根据权利要求26所述的细胞在使得通过所述细胞表达所述一个或多个多核苷酸的条件下培养以产生通过所述多核苷酸所编码的抗体或抗原-结合片段。
34.产生根据权利要求14至28中任一项所述的抗体-药物缀合物的方法，其中所述接头不存在，所述方法包括：(a)将所述细胞毒性剂直接缀合至所述抗体部分以产生所述抗体-药物缀合物；和(b)纯化所述抗体-药物缀合物。
35.产生根据权利要求14至28中任一项所述的抗体-药物缀合物的方法，其中所述抗体-药物缀合物包含所述接头，所述方法以所述顺序包括以下步骤：(a)将所述接头直接缀合至所述抗体部分以产生接头-抗体部分；(b)将所述接头-抗体部分的接头直接缀合至所述细胞毒性剂以产生所述抗体-药物缀合物；和(c)纯化所述抗体-药物缀合物。
36.产生根据权利要求14至28中任一项所述的抗体-药物缀合物的方法，其中所述抗体-药物缀合物包含所述接头，所述方法以所述顺序包括以下步骤：(a)将所述接头直接缀合至所述细胞毒性剂以产生接头-细胞毒性剂部分；(b)将所述接头-细胞毒性剂部分的接头直接缀合至所述抗体部分以产生所述抗体-药物缀合物；和(c)纯化所述抗体-药物缀合物。
37.药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或抗原-结合片段或者根据权利要求14至28中任一项所述的抗体-药物缀合物，和药物可用的载体。
38.治疗对其有需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求37所述的药物组合物。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述癌症是头颈癌、肺癌、乳腺癌、骨癌、卵巢癌、胃癌、胰癌、喉癌、食管癌、睾丸癌、肝癌、腮腺癌、胆道癌、结肠癌、直肠癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌或甲状腺癌；或者其中所述癌症为黑素瘤、肉瘤或白血病。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述癌症是肉瘤、鳞状细胞癌、黑素瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、卡波济氏肉瘤、胃癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、头颈癌或多发性骨髓瘤。
41.根据权利要求38所述的方法，其中所述癌症为白血病或淋巴瘤。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述白血病为急性髓性白血病或急性淋巴细胞性白血病。
43.根据权利要求38所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌。
44.根据权利要求38所述的方法，其中所述癌症为三阴性乳腺癌。
45.根据权利要求38至44中任一项所述的方法，其中所述癌症的癌性细胞过表达MERTK。
46.根据权利要求38至44中任一项所述的方法，其中所述癌症的癌性细胞过表达磷酸化的MERTK。
47.根据权利要求38至46中任一项所述的方法，其中MERTK在所述癌症的癌性细胞上是组成型活性的。
48.根据权利要求38至44中任一项所述的方法，其中所述癌症与MERTK的过表达有关。
49.根据权利要求38至44或48中任一项所述的方法，其中所述癌症与组成型活性的MERTK有关。
50.根据权利要求38至44中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在治疗所述受试者之前评价磷酸化MERTK是否在来自所述受试者的肿瘤样品中过表达，并且如果磷酸化MERTK在所述肿瘤样品中过表达，则治疗所述受试者。
51.根据权利要求38至50中任一项所述的方法，还包括向所述受试者施用其它治疗剂。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述其它治疗剂用于治疗所述癌症。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述其它治疗剂是用于治疗乳腺癌的试剂、用于治疗黑素瘤的试剂、免疫疗法或血管生成抑制剂。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述其它治疗剂是血管生成抑制剂，其选自VEGF抑制剂、VEGFR2抑制剂、舒尼替尼和索拉非尼。
55.根据权利要求52所述的方法，其中所述其它治疗剂是用于治疗乳腺癌的试剂，其选自：他莫昔芬、雷洛昔芬、紫杉醇、环磷酰胺、多西他赛、长春碱、氟尿嘧啶、依维莫司、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-美坦新、帕妥珠单抗和二对甲苯磺酸拉帕替尼。
56.根据权利要求52所述的方法，其中所述其它治疗剂是用于治疗黑素瘤的试剂，其选自BRAF抑制剂、MEK抑制剂和达卡巴嗪。
57.根据权利要求52所述的方法，其中所述其它治疗剂是阻断免疫检查点信号转导的试剂。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述其它治疗剂是抗-CTLA-4抗体、抗-PD1抗体或抗-PDL1抗体。
59.根据权利要求38至58中任一项所述的方法，其中所述其它治疗剂是抗-Lag3抗体、GITR激动抗体、OX40激动抗体、抗-ICOS抗体、抗-NKGD2抗体、抗-TIGIT抗体、抗-TGF-β抗体、CAR-T疗法、ApoE模拟物、RGX-104或RGX-202。
60.根据权利要求38至59中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
61.抗体-药物缀合物，其包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，其中所述VH包含SEQ ID NO：105所示的序列的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列，其中所述抗体部分通过mc-vc-PABC接头缀合至MMAE。
62.抗体-药物缀合物，其包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，其中所述VH包含SEQ ID NO：105所示的序列的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列，其中所述抗体部分通过CL2A接头缀合至SN-38。
63.根据权利要求61或62所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体部分是免疫球蛋白。
64.根据权利要求63所述的抗体-药物缀合物，其中所述免疫球蛋白包含人恒定区。
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