CN108135999A

CN108135999A - 针对狂犬病的人抗体及其用途

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Publication number: CN108135999A
Application number: CN201680059761.1A
Authority: CN
Inventors: 小威廉姆·D·托马斯; 汪泱
Original assignee: University of Massachusetts UMass
Current assignee: University of Massachusetts UMass
Priority date: 2015-08-13
Filing date: 2016-08-12
Publication date: 2018-06-08
Anticipated expiration: 2036-08-12
Also published as: HK1250482A1; US10450367B2; US20190002534A1; WO2017027805A1; CA2995109A1; CN108135999B

Abstract

本发明提供针对狂犬病的人抗体及其使用方法。

Description

针对狂犬病的人抗体及其用途

序列表

本申请包含已经以ASCII形式电子提交的序列表且在本文以其整体通过引用并入。2016年8月10日生成的所述ASCII拷贝命名为50720-013WO2_Sequence_Listing_8_10_16_ST25且大小为16,999字节。

发明背景

狂犬病是由家族弹状病毒科(狂犬病病毒属)的RNA病毒的感染引起的急性进行性脑炎。尽管人狂犬病死亡在发达国家是罕见的(美国每年通常死亡人数不到5人)，但据报道，例如印度有大量死亡人数，其中5万人死于该疾病，超过50万人得到治疗。即使在美国，每年有15,000到40,000人接受抗狂犬病治疗。通常情况下，狗是该病的主要储器，但其他哺乳动物如浣熊，臭鼬，蝙蝠和狐狸是常见的储器。病毒从动物贮存器向人传播通常通过穿透皮肤的咬伤或划痕发生。由于狂犬病在人类中几乎总是致死的，所以即使是疑似感染也必须采用积极的暴露后治疗方案进行治疗。

狂犬病在人体中的暴露后预防(PEP)包括适当的伤口护理、伤口内及伤口周围局部施用抗狂犬病血清免疫球蛋白，以及通常在数天和数周内施用多剂狂犬病疫苗。正确的伤口护理可以减少存活进入患者的病毒量。用抗狂犬病血清免疫球蛋白浸润该区域可以与狂犬病病毒结合并帮助清除它，从而减少病毒载量(通过被动免疫)。多剂量的狂犬病疫苗(主动免疫)通常为首次剂量随后为后续加强剂量的形式，其施用允许患者产生强烈的主动免疫，包括体液和细胞应答。抗狂犬病血清免疫球蛋白的当前来源是从接种的人类供体的血液中获得的。认为其他来源的抗狂犬病血清免疫球蛋白例如鼠对人类使用是不安全的。狂犬病疫苗的当前来源是在细胞系中产生并经过化学灭活和冻干。尽管这些作用剂在及时施用时高度有效，但仍存在一些障碍。

例如，人类狂犬病免疫球蛋白(HRIG)必须高度纯化以防止任何外来剂的传播，因为它是从人类供体的血清中收集的。此外，这些抗狂犬病作用剂的制造很少，而且其仍然相对昂贵，特别是在对其需要最多的发展中国家。由于生产大量分馏血液产品涉及费用使得全球HRIG短缺。因此，发展中国家的人们接受世界卫生组织(WHO)不建议的“仅用于疫苗”的PEP。此外，抗狂犬病疫苗需要劳动密集型细胞培养和广泛的灭活和纯化步骤。因此，需要改进的用于治疗和预防狂犬病感染的免疫疗法。用例如单克隆抗体代替HRIG将提供节约成本的替代方案，从而使得PEP向暴露个体适当地递送。

发明概述

本发明涉及针对狂犬病病毒的人抗体及其使用方法。

第一方面，本发明提供与狂犬病病毒G蛋白特异性结合的抗体，其中所述抗体包含重链可变(VH)域，其包含一个、二个或三个下述互补决定区(CDR)：(a)含有GFTFSYFAMH(SEQID NO:1)的氨基酸序列的CDR-H1，或其CDR-H1变体，所述变体含有一个或多个(例如一个或二个)保守的氨基酸取代；(b)含有TIGTGGGTYYADSVKG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的CDR-H2，或其CDR-H2变体，所述变体含有一个或多个(例如一个或二个)保守的氨基酸取代；和/或(c)含有CARDNALRSFDWLFYSFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的CDR-H3，或其CDR-H3变体，所述变体含有一个或多个(例如一个或二个)保守的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述VH结构域进一步包含一个、二个、三个或四个下述重链可变区框架区(FR)：(a)含有EVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCAGS(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列的FR-H1，或其FR-H1变体，所述变体含有一个或多个(例如一个或二个)保守的氨基酸取代；(b)含有WVRQAPGKGLEWVS(SEQID NO:8)的氨基酸序列的FR-H2，或其FR-H2变体，所述变体含有一个或多个(例如一个或二个)保守的氨基酸取代；(c)含有RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDMAVYY(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的FR-H3，或其FR-H3变体，所述变体含有一个或多个(例如一个或二个)保守的氨基酸取代；和/或(d)含有WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的FR-H4，或其FR-H4变体，所述变体含有一个或多个(例如一个或二个)保守的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述VH结构域包含含有与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少90％序列同一性(90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。在一些实施方案中，所述VH结构域包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。

第二方面，本发明提供与狂犬病病毒G蛋白特异性结合的抗体，其中所述抗体包含含有一个、二个或三个下述CDR的轻链可变(VL)域：(a)含有RASQSISSSYLA(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的CDR-L1，或其CDR-L1变体，所述变体含有一个或多个(例如一个或二个)保守的氨基酸取代；(b)含有GASSRAT(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的CDR-L2，或其CDR-L2变体，所述变体含有一个或多个(例如一个或二个)保守的氨基酸取代；和/或(c)含有QRYGSSYT(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的CDR-L3，或其CDR-L3变体，所述变体含有一个或多个(例如一个或二个)保守的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述VL结构域进一步包含一个、二个、三个或四个下述轻链可变区FR：(a)含有EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列的FR-L1，或其FR-L1变体，所述变体含有一个或多个(例如一个或二个)保守的氨基酸取代；(b)含有WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列的FR-L2，或其FR-L2变体，所述变体含有一个或多个(例如一个或二个)保守的氨基酸取代；(c)含有GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列的FR-L3，或其FR-L3变体，所述变体含有一个或多个(例如一个或二个)保守的氨基酸取代；和/或含(d)含有FGQGTKLEIK(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列的FR-L4，或其FR-L4变体，所述变体含有一个或多个(例如一个或二个)保守的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述VL结构域包含含有与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少90％序列同一性(90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。在一些实施方案中，所述VL结构域包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列。

在第一方面或第二方面的一些实施方案中，所述抗体包含下述6个CDR：(a)含有GFTFSYFAMH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有TIGTGGGTYYADSVKG(SEQ IDNO:2)的氨基酸序列的CDR-H2；(c)含有CARDNALRSFDWLFYSFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的CDR-H3；(d)含有RASQSISSSYLA(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有GASSRAT(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)含有QRYGSSYT(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，所述VH结构域包含含有与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少90％序列同一性(90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的序列且所述VL结构域包含含有与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少90％同一性(90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。在一些实施方案中，所述VH结构域包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列且所述VL结构域包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。

第三方面，本发明特征涉及一种分离抗体，其与第一或第二方面的抗体竞争对于狂犬病病毒G蛋白的结合。

第四方面，本发明特征涉及一种分离抗体，其与第一或第二方面的抗体结合狂犬病病毒G蛋白上相同的表位。

上述任何一方面中，所述抗体是单克隆、人、人源化或嵌合的。在一些实施方案中，所述抗体是结合狂犬病病毒G蛋白的抗体片段。例如，在一些实施方案中，所述抗体片段选自下组：Fab、Fab’-SH、Fv、scFv和(Fab’)₂片段。在其他实施方案中，所述抗体是全长抗体。在一些实施方案中，所述全长抗体包含(a)含有与SEQ ID NO:17的氨基酸序列至少90％的序列同一性(90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的重链序列；(b)含有与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少90％的序列同一性(90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的轻链序列；或(c)如(a)中的重链序列和如(b)中的轻链序列。在一些实施方案中，所述全长抗体包含(a)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链序列；(b)含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链序列；或(c)如(a)中的重链序列和如(b)中的轻链序列。

在一些实施方案中，所述抗体是IgG抗体。例如，在一些实施方案中，所述IgG抗体(例如全长抗体)是IgG1抗体。在其他实施方案中，所述IgG抗体(例如全长抗体)是IgG3抗体。

在一些实施方案中，所述抗体结合狂犬病病毒G蛋白抗原位点II中的表位。在一些实施方案中，所述表位包含氨基酸残基Glu33。在一些实施方案中，所述表位进一步包含氨基酸残基Cys35。在一些实施方案中，所述表位进一步包含氨基酸残基Glu33和Cys35。在一些实施方案中，所述抗体能够中和在狂犬病病毒G蛋白抗原位点III中含有突变的狂犬病病毒。在一些实施方案中，所述抗体能够中和在狂犬病病毒G蛋白抗原位点III中的氨基酸残基I338处含有突变的狂犬病病毒。在一些实施方案中，所述抗体能够中和在狂犬病病毒G蛋白抗原位点III中含有I338T突变的狂犬病病毒，如蝙蝠狂犬病病毒变体“3860蝙蝠”。

在上述任何方面中，所述抗体可以约1μM或更低的K_D与狂犬病病毒G蛋白结合。在一些实施方案中，所述抗体可以约500nM或更低的K_D与狂犬病病毒G蛋白结合。在一些实施方案中，所述抗体可以约250nM或更低的K_D与狂犬病病毒G蛋白结合。在一些实施方案中，所述抗体可以约125nM或更低的K_D与狂犬病病毒G蛋白结合。在一些实施方案中，所述抗体可以约100nM或更低的K_D与狂犬病病毒G蛋白结合。在一些实施方案中，所述抗体可以约50nM或更低的K_D与狂犬病病毒G蛋白结合。在一些实施方案中，所述抗体可以约1nM或更低的K_D与狂犬病病毒G蛋白结合。在一些实施方案中，所述抗体可以约1nM至约500nM的K_D与狂犬病病毒G蛋白结合。在一些实施方案中，所述抗体可以约50nM至约500nM的K_D与狂犬病病毒G蛋白结合。在一些实施方案中，所述抗体可以约50nM至约250nM的K_D与狂犬病病毒G蛋白结合。在一些实施方案中，所述抗体可以约100nM至约250nM的K_D与狂犬病病毒G蛋白结合。在一些实施方案中，所述抗体可以约100nM至约200nM的K_D与狂犬病病毒G蛋白结合。在一些实施方案中，所述抗体可以约100nM至约150nM的K_D与狂犬病病毒G蛋白结合。在一些实施方案中，所述抗体可以约125nM的K_D与狂犬病病毒G蛋白结合。在这些实施方案的任一个中，所述K_D可以通过任何本领域认可的方法测量，如表面等离子体共振(SPR)(例如)。

第五方面，本发明提供含有上述任一方面的抗体的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包含与狂犬病病毒G蛋白的不同表位结合的第二抗体。例如，在一些实施方案中，所述第二抗体包含下述6个CDR：(a)含有TYAMH(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有VVSYDGRTKDYADSVKG(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列的CDR-H2；(c)含有ERFSGAYFDY(SEQ ID NO:21)的氨基酸序列的CDR-H3；(d)含有RASQSVSSYLA(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有DASNRAT(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)含有QQRNNWP(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，所述第二抗体包含(a)含有与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的VH结构域或(b)含有与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的VL结构域。在一些实施方案中，所述第二抗体包含(a)含有与SEQID NO:25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的VH结构域和(b)含有与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的VL结构域。在一些实施方案中，所述第二抗体包含(a)含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VH结构域或(b)含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL结构域。在一些实施方案中，所述第二抗体包含(a)含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VH结构域和(b)含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL结构域。在其他实施方案中，含有上述任一方面的抗体的药物组合物进一步包含HRIG。在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包含药物上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。在一些实施方案中，所述药物组合物经配制用于治疗具有狂犬病病毒感染的受试者。在一些实施方案中，所述药物组合物经配制用于治疗处于发展狂犬病病毒感染的风险的受试者。在一些实施方案中，所述受试者是人。

第六方面，本发明涉及编码第一、第二、第三和/或第四方面的一种或多种抗体(例如1、2或3或多种抗体)的核酸(例如分离的核酸分子)。

第七方面，本发明涉及包含第六方面的核酸的载体(例如AAV、质粒、慢病毒载体等)。

第八方面，本发明涉及含有第七方面的载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。在其他实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞(例如大肠杆菌)。

第九方面，本发明涉及产生第一、第二、第三和/或第四方面的抗体的方法，所述方法包括在培养基中培养第八方面的宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从所述宿主细胞或所述培养基回收所述抗体。

第十方面，本发明提供治疗具有狂犬病病毒感染的受试者的方法，包括对所述受试者施用治疗有效量的第一、第二、第三和/或第四方面的抗体或第五方面的药物组合物，由此治疗所述受试者。

第十一方面，本发明提供治疗处于发展狂犬病病毒感染的受试者的方法，包括对所述受试者施用治疗有效量的第一、第二、第三和/或第四方面的抗体或第五方面的药物组合物，由此治疗所述受试者。

在第十或第十一方面的一些实施方案中，所述抗体以下述剂量施用至所述受试者：约0.001mg/kg至约50mg/kg(例如约0.01mg/kg至约50mg/kg，例如约0.1mg/kg至约50mg/kg，例如约1mg/kg至约50mg/kg，例如约10mg/kg至约50mg/kg，例如约22mg/kg)。在一些实施方案中，所述抗体以下述剂量施用至所述受试者：约0.001IU/kg至约50IU/kg(例如约0.01IU/kg至约50IU/kg，例如约0.1IU/kg至约50IU/kg，例如约1IU/kg至约50IU/kg，例如约10IU/kg至约50IU/kg，例如约20IU/kg)。在一些实施方案中，所述抗体或药物组合物通过下述施用：肌内、静脉内、皮内、经皮、动脉内、腹腔内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、腹膜、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、局部(topically)、局部(locally)、通过吸入、通过注射、通过输液、通过连续输液、通过直接局部灌注洗浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、在霜剂中或在脂质组合物中。在一些实施方案中，对所述受试者施用至少一个剂量的抗体或药物组合物。在一些实施方案中，对所述受试者施用至少两个剂量的抗体或药物组合物。在一些实施方案中，对所述受试者施用至少三个剂量的抗体或药物组合物。在一些实施方案中，对所述受试者施用至少四个剂量的抗体或药物组合物。在一些实施方案中，对所述受试者施用至少五个剂量的抗体或药物组合物。在一些实施方案中，对所述受试者施用至少一个剂量的抗体或药物组合物且随后施用至少一个(例如至少一个、二个、三个、四个或五个)剂量的HRIG或其药物组合物。在一些实施方案中，所述受试者是人。

本发明的其他特征和优势从其优选实施方案的下述说明和从权利要求中将变得显而易见。

附图简述

图1是快速荧光聚焦抑制试验(RIFFIT)测定的荧光图像，显示在其G糖蛋白中具有E33K置换突变的狂犬病病毒赋予抗性并逃避抗狂犬病病毒HuMab 2B10的中和。

图2是显示通过流式细胞术分析所指示的抗原性位点II G糖蛋白丙氨酸扫描突变体与2B10抗体温育并通过荧光标记的二级抗体检测后的荧光强度的图。将个体荧光强度相对于用作G糖蛋白表达的内部对照的17C7抗体的结合信号标准化。丙氨酸扫描诱变研究的结果表明G糖蛋白的残基33是2B10结合的关键表位残基。

图3是体外狂犬病假病毒感染/中和测定结果的图，显示2B10、17C7和2B10和17C7的组合都能够中和表达狂犬病病毒的ERA株的G糖蛋白的狂犬病假型病毒颗粒(RABVpp)。

图4是体外狂犬病假病毒感染/中和测定结果的图，显示2B10但非17C7能够中和表达狂犬病病毒的“秘鲁蝙蝠”街道分离株的G糖蛋白的RABVpp。

图5是体外狂犬病假病毒感染/中和测定结果的图，显示2B10但非17C7能够中和表达狂犬病病毒的“佛罗里达浣熊”街道分离株的G糖蛋白的RABVpp。

图6A显示了疫苗干扰研究的实验设计，其中示意图显示了疫苗和抗体治疗的时间表(上图)的时间表以及显示试验组和给药信息的表格。

图6B显示了在疫苗干扰研究中针对每个测试组确定的平均RFFIT效价的图。

图7A显示了致死攻击仓鼠模型中暴露后预防(PEP)治疗研究的实验设计，其中示意图显示了疫苗和抗体治疗的时间表(上图)以及显示测试组和给药信息的表格。

图7B是显示PEP治疗研究中每个测试组的无狂犬病存活百分比随时间的存活曲线，其中仓鼠用2.5x 10³FFU的狂犬病病毒德克萨斯山狗323R(Texas coyote 323R)攻击。

图7C是显示PEP治疗研究中每个测试组的无狂犬病存活百分比随时间的存活曲线，其中仓鼠用1.2x 10⁴FFU的蝙蝠狂犬病变体“3860蝙蝠”攻击。

本发明实施方案的详细说明

I.定义

如本文所用，术语“狂犬病病毒”指由狂犬病病毒的RNA编码的病毒粒子或其部分(例如其蛋白部分，如狂犬病病毒G糖蛋白)。

术语“抗狂犬病病毒抗体”是与狂犬病病毒或蛋白质、糖、脂质或由狂犬病病毒产生或与其相关的其他组分相互作用(例如，结合)的抗体。

术语“狂犬病病毒G糖蛋白抗体”或“与狂犬病病毒G蛋白特异性结合的抗体”指能够以足够的亲和力结合狂犬病病毒的G糖蛋白或其片段的抗体，使得抗体在靶向狂犬病病毒G糖蛋白中可用作预防剂、诊断剂和/或治疗剂。抗狂犬病病毒或G糖蛋白抗体可以结合表位，例如构象或线性表位，或结合病毒或其组分的一部分或片段，如狂犬病病毒的G糖蛋白抗原性位点II的全部或部分。在一些实施方案中，表位包含狂犬病病毒G糖蛋白的氨基酸残基Glu33。在一些实施方案中，表位包含狂犬病病毒G糖蛋白的Glu33和/或Cys35。在一些实施方案中，与狂犬病病毒的G糖蛋白结合的抗体具有下述解离常数(K_D)：≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10^-8M或更小，例如10^-8M至10^-13M，例如10^-9M至10^-13M)。

“抗体”是包含至少一个或两个重(H)链可变区(在本文中缩写为VH)和至少一个或两个轻(L)链可变区(本文缩写为VL)的蛋白。VH和VL区可以进一步细分成称为“互补决定区”(CDR)的高变区，其中散布有更保守的区域，称为“框架区”(FR)。框架区和CDR的范围已经被精确定义(参见Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242,1991,and Chothia,C.等人，J.Mol.Biol.196:901-917,1987，其在本文通过引用并入)。优选地，每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

抗体的VH或VL区可以进一步包括重链或轻链恒定区的全部或部分。在一个实施方案中，抗体是两条重免疫球蛋白链和两条轻免疫球蛋白链的四聚体，其中重和轻免疫球蛋白链通过例如二硫键相互连接。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。轻链恒定区由一个域CL组成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。术语“抗体”包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM(及其亚型)类型的完整免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可以是κ或λ型。

术语“免疫球蛋白”是指由一种或多种基本由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白。公认的人免疫球蛋白基因还包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ(IgD)、ε(IgE)和μ(IgM)恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白“轻链”(约25K_D和214个氨基酸)由NH₂-末端的可变区基因(约110个氨基酸)和COOH-末端的κ或λ恒定区基因编码。全长免疫球蛋白“重链”(约K_D和446个氨基酸)类似地由可变区基因(约116个氨基酸)和其他上述恒定区基因之一编码，例如γ(编码约330个氨基酸酸)。术语“免疫球蛋白”包括具有以下的免疫球蛋白：来自人类或非人类来源的CDR。免疫球蛋白的框架可以是人的，人源化的或非人的，例如经修饰以降低人类抗原性的鼠类框架或合成框架，例如共有序列。成熟的免疫球蛋白/抗体可变区通常不含前导序列。免疫球蛋白/抗体可通过它们的恒定区进一步区分类(例如，IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)和分为亚类或同种型(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本文中可互换使用，指具有与天然抗体结构基本相似的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。

术语“人抗体”是具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本文所述的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，术语“人抗体”不包括其中来源于另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已被移植到人构架序列(即人源化抗体)上的抗体。

抗狂犬病病毒抗体或其抗原结合部分可以单独施用或与第二种作用剂联合施用。受试者可以是感染或疑似感染狂犬病病毒或具有狂犬病病毒介导的疾病症状(例如神经病理学、脑脊髓炎或抗狂犬病免疫球蛋白血清效价)的患者。该治疗可用于治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、减轻、改进或影响与感染相关的感染和疾病、疾病症状或对疾病的倾向性。对于狂犬病病毒感染的临床管理，“治疗”通常被理解为意指在疾病发作前预防或预防生产性感染。

有效治疗狂犬病病毒感染的量的抗狂犬病病毒抗体或“治疗有效量”是在单次或多次剂量施用至受试者后有效抑制狂犬病病毒感染、疾病或其后遗症的抗体的量。治疗有效量的抗体或抗体片段可以根据诸如疾病状态、伤口部位、狂犬病病毒株或分离株、狂犬病病毒的动物载体、年龄、性别和个体重量以及抗体或抗体部分在个体中引起的预期响应等因素而变化。治疗有效量也是其中抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用超过治疗有益效果的量。可以在预测人体功效的动物模型系统中评估抗体抑制可测量参数的能力。例如，如实施例中所述，抗狂犬病病毒抗体保护仓鼠免受狂犬病病毒致死攻击的能力可预测对人类的功效。或者，抗体或抗体组合物的这种性质可以通过本领域技术人员已知的测定通过体外研究化合物调节狂犬病病毒/细胞相互作用(例如结合、感染、毒力等)的能力来评估。体外测定包括结合测定，如ELISA和中和测定。

有效预防病症或疾病的抗狂犬病病毒抗体的量，或抗体的“预防有效量”是在单剂量或多剂量施用至受试者后有效预防或延迟狂犬病病毒发作或复发的发生或者抑制其症状的量。但是，如果需要更长的保护时间间隔，则可以施用增加的剂量或更频繁的剂量。

例如，其表示两种状态之间的数量差异的术语“拮抗”、“诱导”、“抑制”、“增强”、“升高”、“增加”、“减少”等指的是差异，例如，这两种状态之间在统计学或临床上显着差异。

术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指抗体以至少1x 10^-6M的亲和力与狂犬病病毒或其部分结合的能力，和/或以其对于非特异性抗原亲和力至少两倍的亲和力与狂犬病病毒或其部分结合的能力。

如本文所用，抗体的术语“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或简称为“抗体部分”、“部分”或“片段”)是指抗体的部分/片段，其特异性结合狂犬病病毒或其组分(例如，狂犬病病毒G糖蛋白)，例如，其中一条或多条免疫球蛋白链不全长，但特异性结合狂犬病病毒或其组分的分子。包含在该术语内的结合部分/片段的实例包括“抗体片段”，其指除完整抗体外的分子，其包含特异性结合完整抗体所结合的抗原(例如狂犬病病毒G糖蛋白)的完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab’)₂；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。使用常规技术获得这些抗体片段，并按照与完整抗体相同的方式筛选片段的实用性。抗体片段可以通过重组DNA技术或通过酶或化学切割完整免疫球蛋白来产生。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指对特定表位显示单一结合特异性和亲和力的抗体。因此，术语“人单克隆抗体”或“HuMab”是指展示出单一结合特异性并且具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括从转基因非人动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞，所述B细胞具有包含人重链转基因和与永生化细胞融合的轻链转基因的基因组。

这里使用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知晓的相应值的常见误差范围。在此提及的“约”一个值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的实施方案。

“亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”指反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间1：1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(K_D)表示。亲和力可以通过本领域已知的常用方法来测量，包括本文所述的那些方法。用于测量结合亲和力的具体说明和示例性实施方案描述如下。

如本文所用的术语“K_D”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，当通过表面等离子体共振(SPR)技术或其他常规手段确定时，本发明的抗体以小于约10^-6M，例如小于约10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的解离平衡常数(K_D)结合狂犬病病毒G蛋白。

“疾病”是将从治疗中受益的任何病症，包括但不限于慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所述疾病的那些病理病症。

如本文所用，术语“狂犬病病毒感染”是指任何感染或疾病，其症状的发作、进展或持续需要狂犬病病毒的参与。

如本文所用，术语“EC50”是指在体内或体外测定法(例如本文所述的中和测定法)中诱导最大响应的50％(即，在最大响应和基线之间的一半)的响应的抗体或其抗原结合部分的浓度。

术语“表位”或“抗原决定簇”是指免疫球蛋白或抗体特异性结合的抗原上的位点(例如狂犬病病毒的G糖蛋白的抗原性位点II，例如包含狂犬病病毒G糖蛋白氨基酸残基Glu33和/或Cys35的表位)。表位可以由连续的氨基酸形成，也可以由蛋白质的三级折叠并列的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常以独特的空间构象包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。测定表位空间构象的方法包括本领域的技术和本文描述的技术，例如X射线晶体学和2维核磁共振。参见例如Epitope MappingProtocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,G.E.Morris,Ed.(1996)。表位还可以通过靶蛋白(例如狂犬病病毒的G糖蛋白)中影响抗体(例如单克隆抗体)的结合的点突变来定义。

如本文所用，术语“宿主细胞”旨在指代其中已经导入了表达载体的细胞。应该理解的是，这样的术语不仅意指特定的受试细胞，而且意指这种细胞的后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后代中发生，所以这样的子代实际上可能不与亲本细胞相同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。

“分离的抗体”是从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收，和/或基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的一种(例如与与狂犬病病毒的G糖蛋白特异性结合的分离抗体实质上不含与狂犬病病毒的G糖蛋白以外的抗体特异性结合的抗体)。其天然环境的污染成分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可能包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，抗体将纯化至：(1)通过Lowry方法测定抗体重量大于95％，并且最优选重量大于99％，(2)至足以获得至少15个N末端残基或旋杯式测序仪所使用的内部氨基酸序列的程度，或(3)至使用Coomassie^TM蓝或优选银染在还原或非还原条件下SDS-PAGE同质性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体天然环境的至少一种组分不会存在。类似地，分离的抗体在重组细胞周围的培养基中包含抗体。然而，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。

如本文所用的术语“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。

本文所用的术语“分离的核酸”是指编码与狂犬病病毒的G糖蛋白结合的抗体或抗体部分(例如VH、VL、CDR)的核酸分子，旨在指其中编码抗体或抗体部分的核苷酸序列不含编码与狂犬病病毒的G糖蛋白以外的抗原结合的抗体的其他核苷酸序列的核酸，该其他序列可天然地位于人类基因组DNA的核酸侧翼。

如本文所用，术语“重组”抗体指通过重组方式制备、表达、产生或分离的抗体，如使用转染入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体、从重组、组合抗体文库分离的抗体，从人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体或通过涉及人免疫球蛋白基因序列剪接成其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、生成或分离的抗体。此类重组抗体包括人源化、CDR移植、嵌合体外产生(例如通过噬菌体展示)的抗体，并且可以任选地包括源自人种系免疫球蛋白序列的恒定区。

关于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并引入缺口后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，如果需要的话，以实现最大百分比序列同一性，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。为了确定百分比氨基酸序列同一性的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括为了在被比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.创作，并且源代码已与用户文档提交至美国版权局，华盛顿特区，20559，以美国版权注册号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从加利福尼亚州南旧金山的Genentech,Inc.获得，或可从源代码编译。ALIGN-2程序应该被编译用于UNIX操作系统，包括数字UNIX V4.0D。所有的序列比较参数都由ALIGN-2程序设置，并且不会改变。

在其中使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与、对或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可以可替代地表示为给定的氨基酸序列A，其与、对或针对给定氨基酸序列B具有或包含特定的％氨基酸序列同一性)计算如下：X/Y分数的100倍，其中X是序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中作为相同匹配打分的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应理解的是，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度，A与B的％氨基酸序列同一性将不等于B与A的％氨基酸序列同一性。除非另外特别说明，否则本文使用的所有％氨基酸序列同一性值如描述在前一段使用ALIGN-2计算机程序获得。

术语“基本上相同”(或“基本上同源的”)是指与第二氨基酸或核苷酸序列具有足够数量的相同或等同的(例如具有相似侧链，例如保守氨基酸取代)氨基酸残基的第一氨基酸或核苷酸序列，使得第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有相似的活性。在抗体的情况下，第二抗体具有相同的特异性，并具有至少50％的第一抗体的亲和力。

如下进行两个序列之间“同源性”的计算。为了最佳比较目的，对序列进行比对(例如，为了进行最佳比对，可以在第一个和第二个氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入缺口，并且为了比较的目的，可以忽略非同源序列)。为比较目的比对的参考序列的长度至少为参考序列长度的50％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则该分子在该位置是相同的(如本文所用，氨基酸或核酸“同一性”相当于氨基酸酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的百分比同一性是由序列共享的相同位置的数目的函数，考虑到缺口的数目和每个缺口的长度(为了最佳比对两个序列需要引入)。

两个序列之间的序列比较和同源性百分比的确定可以使用数学算法完成。两个氨基酸序列之间的同源性百分比使用Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:444-453,1970确定，该算法已并入GCG软件包中的GAP程序，其使用缺口罚分为12、缺口延伸罚分为4且框架缺口罚分为5的Blossum 62评分矩阵。

应理解，本文所述的抗体及其抗原结合部分可具有另外的保守或非必需氨基酸取代，其对多肽功能没有实质影响。可以如Bowie等人，Science,247:1306-1310,1990中所述测定特定的取代是否将被允许，即不会对所需的生物学性质如结合活性产生不利影响。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的一种。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。

“非必需”氨基酸残基是可以从多肽的野生型序列(例如结合剂，例如抗体)改变而基本上不改变生物学活性的残基，而“必需”氨基酸残基导致这样的变化。

术语“药物组合物”是指以允许其中所含有的活性成分的生物学活性的形式有效，并且不含对制剂所施用的受试者具有不可接受的毒性的额外成分的这些形式。

“药学上可接受的载剂”是指除了活性成分之外的药物制剂中对受试者无毒的成分。药学上可接受的载剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

“受试者”或“个体”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人和非人类灵长类动物如猴)、兔、鹿和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，受试者或个体是人。

如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指本文所述的预防或治疗措施。“治疗”的方法对需要这种治疗的受试者施用本发明的抗体，例如处于发展狂犬病病毒感染风险的受试者或具有狂犬病病毒感染的受试者，以预防、治愈、延缓、减轻或缓解病症或复发性病症的一种或多种症状，或延长受试者的存活超过在不存在此类治疗时预期的存活。在一些实施方案中，例如，将本发明的抗狂犬病病毒抗体施用于处于发展与狂犬病病毒感染相关的病症(例如居住或旅行至其中狂犬病病毒相关感染和/或死亡流行的地理位置的受试者，例如印度)。治疗的理想效果包括但不限于防止疾病或病症的发生，例如与狂犬病病毒感染相关的病症。治疗的其他理想效果可包括预防疾病复发、缓解症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、降低疾病进展速度、改善或缓解疾病状态，并改善预后。

如本文所用，“施用”是指给予一定剂量的化合物(例如，本发明的抗狂犬病病毒抗体或编码本发明的抗狂犬病病毒抗体的核酸)或组合物(例如，药物组合物，例如包含本发明的抗狂犬病病毒抗体的药物组合物)至受试者的方法。在本文所述方法中使用的组合物可例如通过如下施用：肌内、静脉内、皮内、经皮、动脉内、腹腔内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、腹膜、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、局部(topically)、局部(locally)、通过吸入、通过注射、通过输液、通过连续输液、通过直接局部灌注洗浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、在霜剂中或在脂质组合物中。施用方法可以根据各种因素(例如，施用的化合物或组合物以及所治疗的病况、疾病或病症的严重程度)而变化。

II.组合物和方法

一方面，本发明部分基于抗狂犬病病毒抗体。例如，本发明的抗体可用于治疗患有狂犬病病毒病症或有风险发展狂犬病病毒病症的受试者。

A.抗狂犬病病毒抗体

本发明提供与狂犬病病毒的G糖蛋白结合的分离的抗体。

一方面，本发明提供与狂犬病病毒G蛋白特异性结合的抗体，其中所述抗体包含重链可变(VH)域，其含有下述一个或多个(例如1、2或3)互补决定区(CDR)：(a)含有GFTFSYFAMH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有TIGTGGGTYYADSVKG(SEQ IDNO:2)的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)含有CARDNALRSFDWLFYSFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的CDR-H3，或一个或多个(例如1、2或3)其变体，所述变体与SEQ ID NO:1-3具有至少约80％的序列同一性(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性)。

在某些情况下，抗体的VH域进一步包含一个或多个(例如1、2、3或4)下述重链可变区框架区(FR)：(a)含有EVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCAGS(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列的FR-H1；(b)含有WVRQAPGKGLEWVS(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的FR-H2；(c)含有RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDMAVYY(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的FR-H3；和(d)含有WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的FR-H4，或一个或多个(例如1、2、3或4)其变体，所述变体与SEQ ID NO:8-10具有至少约80％的序列同一性(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性)。在某些情况下，所述VH结构域包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少90％的序列同一性(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的序列。

在本发明的另一方面中，本发明提供与狂犬病病毒G蛋白特异性结合的抗体，其中所述抗体包含含有下述一个或多个(例如1、2或3)CDR的轻链可变(VL)域：(a)含有RASQSISSSYLA(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的CDR-L1；(b)含有GASSRAT(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)含有QRYGSSYT(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的CDR-L3，或一个或多个(例如1、2或3)其变体，所述变体与SEQ ID NO:4-6具有至少约80％的序列同一性(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性)。

在某些情况下，所述VL结构域进一步包含一个或多个(例如1、2、3或4)下述轻链可变区FR：(a)含有EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列的FR-L1；(b)含有WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列的FR-L2；(c)含有GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列的FR-L3；和(d)含有FGQGTKLEIK(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列的FR-L4，或一个或多个(例如1、2、3或4)其变体，所述变体与SEQ ID NO:11-14具有至少约80％的序列同一性(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性)。在某些情况下，所述VH结构域包含含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与SEQ IDNO:16的氨基酸序列至少90％的序列同一性(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的序列。

在某些情况下，例如，所述抗体包含下述6个CDR：(a)含有GFTFSYFAMH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有TIGTGGGTYYADSVKG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的CDR-H2；(c)含有CARDNALRSFDWLFYSFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的CDR-H3；(d)含有RASQSISSSYLA(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有GASSRAT(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)含有QRYGSSYT(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的CDR-L3，或一个或多个上述CDR与一个或多个其变体的组合，所述变体与SEQ ID NO:1-6任一项具有至少约80％的序列同一性(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)。在某些情况下，所述抗体包含(a)VH序列，所述VH序列具有SEQ ID NO:15的序列或与SEQ ID NO:15的序列具有至少90％的序列同一性(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)，和(b)VL序列，所述VL序列具有SEQ ID NO:16的序列或与SEQ ID NO:16的序列具有至少90％的序列同一性(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)。

另一方面，本发明提供分离的抗体，其与上文所述的抗狂犬病病毒抗体如具有SEQID NO:1-6的六个CDR序列的抗体竞争对于狂犬病病毒G蛋白的结合。另一方面，本发明提供分离的抗体，其与上文所述的抗狂犬病病毒抗体如具有SEQ ID NO:1-6的六个CDR序列的抗体结合狂犬病病毒G蛋白上相同的表位。

在某些情况下，上文所述的抗狂犬病病毒抗体可结合狂犬病病毒G蛋白抗原位点II中的表位。所述表位可包含狂犬病病毒G蛋白的氨基酸残基Glu33、狂犬病病毒G蛋白的氨基酸残基Cys35或二者。在某些情况下，所述抗体能够中和在狂犬病病毒G蛋白的抗原位点III中含有突变的狂犬病病毒。在某些情况下，所述抗体能够中和在狂犬病病毒G蛋白的抗原位点III中氨基酸残基I338处含有突变的狂犬病病毒。在某些情况下，所述抗体能够中和在狂犬病病毒G蛋白的抗原位点III中含有I338T突变的狂犬病病毒，如蝙蝠狂犬病病毒变体“3860蝙蝠”。

在某些情况下，上文所述的抗狂犬病病毒抗体可在光谱的狂犬病分离株中呈现中和活性，包括陆地和蝙蝠分离株，如蝙蝠狂犬病病毒变体“3860蝙蝠”。

本发明的抗体可以例如是单克隆、人、人源化或嵌合的。所述抗体可以是全长抗体或抗体片段。所述全长抗体可以是IgG类抗体，如全长IgG1类抗体或全长IgG3类抗体。在某些情况下，其中所述全长抗体包含(a)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:17的氨基酸序列至少90％的序列同一性(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的重链序列；(b)含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少90％的序列同一性(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的轻链序列；或如(a)中的重链序列和如(b)中的轻链序列。所述抗体可以是抗体片段(例如结合狂犬病病毒G蛋白的抗体片段)。所述抗体片段可选自下组：Fab、Fab’-SH、Fv、scFv和(Fab’)₂片段。在某些情况下，所述抗体是IgG抗体(例如IgG1抗体)。本发明的抗体可具有≥3天(例如≥1周，例如≥2周，例如≥1个月，例如≥2个月，例如≥3个月，例如≥个月，例如≥5个月，例如≥6个月)的半衰期。

另一方面，根据上述实施方案任一项的抗狂犬病病毒抗体可并入任何单独或组合的特征，如下文1-5节所述。

1.抗体亲和力

在一些实施方案中，本文提供的抗体可具有≤10μM、≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM或≤0.01nM的解离常数(K_D)。

在一个实施方案中，通过放射性标记的抗原结合测定(RIA)测量K_D。在一个实施方案中，使用感兴趣的抗体的Fab版本及其抗原实施RIA。例如，Fab对抗原的溶液结合亲和力通过在滴定系列的未标记抗原存在下用最小浓度的(¹²⁵I)标记的抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的平板捕获结合的抗原测量(参见例如Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为建立测定条件，将多孔板(Thermo Scientific)用5μg/ml捕获抗-Fab抗体(Cappel Labs)在50mM碳酸钠(pH 9.6)中过夜包被，然后用2％(w/v)牛血清白蛋白灶PBS中于室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[¹²⁵I]-抗原与系列稀释的感兴趣的Fab混合(例如与Presta等人，Cancer Res.57:4593-4599(1997)中的抗VEGF抗体、Fab-12评估一致)。随后将感兴趣的Fab温育过夜；然而，温育可持续更长的时间(例如约65小时)以确保达到平衡。其后，将混合物转移至捕获平板用于在室温的温育(例如持续1小时)。随后去除溶液并使用在PBS中的0.1％聚山梨醇酯20洗涤平板8次。平板已干燥时，添加150μl/孔闪烁体(MICROSCINT-20^TM；Packard)，并在TOPCOUNT ^TMγ计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择给出小于或等于20％最大结合的每种Fab的浓度用于竞争性结合测定。

根据另一实施方案，使用表面等离子体共振测定测量K_D。例如，使用-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)的测定在25℃使用固定化的抗原CM5芯片以～10响应单位(RU)实施。在一个实施方案中，根据供应商的说明使用N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。注射前以5μl/分钟的流速使用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μM)以实现约10响应单位(RU)的耦合蛋白。注射抗原后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注射在具有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20^TM)表面活性剂(PBST)的PBS中的两倍系列稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单的一对一Langmuir结合模型(评估软件版本3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(K_D)计算为比率k_on/k_off。参见例如Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过上述的表面等离子共振测定结合速率超过10⁶M-¹s-¹，则结合速率可通过使用荧光淬灭技术确定，所述技术测量增加浓度的抗原存在下PBS,pH 7.2中20nM抗-抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm,16nm带通)，如在分光光度计如配备停流的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌比色皿的8000-系列SLM-AMINCO ^TM分光光度计(ThermoSpectronic)所测量。

2.抗体片段

在一些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂、Fv和scFv片段，其为本领域已知。还包括双抗体，其具有二价或双特异性的两个抗原结合位点，如本领域已知。三抗体和四抗体也是已知的。单域抗体也是包含抗体的重链可变域的全部或部分或轻链可变域的全部或部分的抗体片段。在一些实施方案中，单域抗体是人单域抗体。

抗体片段可通过如本文所述的多种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生。

3.嵌合和人源化抗体

在一些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类如猴的可变区)和人恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是“类切换”抗体，其中类或亚类已由亲代抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

在一些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非人抗体经人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲代非人抗体的特异性和亲和力。一般而言，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR例如CDR(或其部分)源自非人抗体，且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选将也包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基以来自非人抗体(例如HVR所衍生的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或提高抗体的特异性或亲和力。

可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最合适”的方法选择的框架区(参见例如Sims et al.J.Immunol.151:2296(1993))；源自轻链或重链可变区特定亚群的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta et al.J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和源自筛选的FR文库的框架区(参见例如Baca等人，J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)andRosok等人，J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。

4.人抗体

在一些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体(例如人单克隆抗体(HuMab)，例如抗狂犬病病毒HuMab)。人抗体可使用本领域已知的多种技术产生。

在某些情况下，通过直接从获得自受受试者的人B细胞克隆重链和轻链基因获得人抗体。B细胞分离自外周血(例如通过流式细胞术，例如FACS)，对B细胞标记物进行染色并评估抗原结合。提取编码重链和轻链可变区(或完整的重链和轻链)的RNA并逆转录成DNA，由其进行抗体基因的扩增(例如通过PCR)和测序。随后可将已知的抗体序列用于表达针对已知靶抗原的重组人抗体(例如狂犬病病毒G蛋白)。

在某些情况下，可通过将免疫原(例如狂犬病病毒G蛋白)施用至已经修饰响应抗原攻击产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物来制备人抗体。这样的动物通常包含人免疫球蛋白基因座的全部或一部分，其替换内源免疫球蛋白基因座或其存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在这样的转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座一般已灭活。可进一步修饰来自通过这样的动物生产的完整抗体的人可变区，例如通过与不同的人恒定区组合。

在某些情况下，人抗体还可通过基于杂交瘤的方法制备，如下文进一步详述。已描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。

还可通过分离选自人衍生的噬菌体文库的Fv克隆可变域序列生成人抗体。随后可将这样的可变域序列与预期的人恒定域组合。从抗体文库选择人抗体的技术描述于下文。

5.抗体变体

在一些实施方案中，预期本发明的抗狂犬病病毒抗体的氨基酸序列变体。例如，可预期改进抗体的结合亲和力和/或其他生物性质。抗体的氨基酸序列变体可通过将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列，或通过肽合成制备。这样的修饰包括例如在抗体的氨基酸序列内缺失和/或插入和/或取代残基。可生成缺失、插入和取代的任何组合以实现最终的构建体，只要所述的最终构建体具有预期的特性例如抗原结合。

在一些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代诱变的感兴趣的位点包括CDR和FR。保守取代示于在“优选取代”的标题下的表1中。更多的取代改变提供于“示例性取代”的标题下的表1中，如下文参照氨基酸侧链分类的进一步说明。可将氨基酸取代引入感兴趣的抗体并筛选具有预期活性的产物，例如保留/改进的抗原结合、减少的免疫原性或改进的ADCC或CDC。

表1.示例性和优选的氨基酸取代

氨基酸可根据常见的侧链性质分类：

(1)疏水:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性:Asp、Glu；

(4)碱性:His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基:Gly、Pro；

(6)芳香:Trp、Tyr、Phe。

非保守取代将意味着将这些类别之一的成员交换为另一类别。

一类取代变体涉及取代亲代抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般而言，选择获得的用于进一步研究的变体将在某些生物性质上相对亲代抗体具有修饰(例如增加的亲和力、减少的免疫原性)和/或将具有基本上保留的亲代抗体的一些生物性质。示例性取代变体是亲和性成熟的抗体，其可以是常规生成的，例如使用基于噬菌体展示的亲和成熟技术如本文所述的那些。简而言之，突变一个或多个CDR残基并在噬菌体上展示所述变体抗体并对特定的生物活性进行筛选(例如结合亲和力)。

改变(例如取代)可能在CDR中产生，例如，以提高抗体亲和力。这样的改变可以在CDR“热点”中生成，即由在体细胞成熟过程中以高频经历突变的密码子编码的残基，和/或接触抗原的残基，其中对获得的变体VH或VL进行结合亲和力测试。通过构建和从二级文库重选亲和力成熟为本领域已知。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法的任一种(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)将多样性引入选择用于成熟的可变基因。随后生成二级文库。随后筛选文库以鉴定具有预期的亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及CDR导向的方式，其中随机化数个CDR残基(例如一次4-6残基)。参与抗原结合的CDR残基可以特异性鉴定，例如使用丙氨酸扫描诱变或建模。特别是经常靶向CDR-H3和CDR-L3。

在一些实施方案中，取代、插入或缺失可在一个或多个CDR内发生，只要这些改变不实质降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在CDR中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(如本文提供的保守取代)。例如，这种改变可能在CDR中的抗原接触残基之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，各CDR均未改变，或含有不超过1、2或3个氨基酸取代。

如Cunningham and Wells(1989)Science,244:1081-1085所述，用于鉴定可靶向诱变的抗体的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在该方法中，鉴定残基或靶残基组(例如带电残基，例如arg、asp、his、lys和glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)取代以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。进一步的取代可以在证明对最初取代具有功能敏感性的氨基酸位置处引入。或者，或此外，还有抗原-抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体和抗原之间的接触点。这种接触残基和相邻残基可以作为取代的候选靶向或消除。可以筛选变体以确定它们是否包含预期的性质。

氨基酸序列插入包括长度从一个残基到含有上百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括将抗体的N-或C-末端与酶(例如用于ADEPT)或增加抗体的血清半衰期的多肽融合。

在一些实施方案中，可以对抗体的Fc区进行改变。这些改变可以单独进行，或者除了改变一个或多个抗体可变结构域(即VH或VL区)或其区域(例如一个或多个CDR或FR)以外，也可以进行这些改变。例如，通过将C1q亲合力提高至调理的细胞，Fc区的改变可导致抗体效应器功能增强(例如补体依赖性细胞毒性(CDC))。增强CDC的示例性突变包括例如Fc突变E345R、E430G和S440Y。因此，本发明的抗狂犬病病毒抗体可以包含一个或多个CDC增强性Fc突变，其促进IgG六聚体形成以及C1(补体的第一组分)的后续募集和活化(参见例如Diebolder et al.Science.343:1260-1263,2014)。

在一些实施方案中，抗体的Fc区的氨基酸序列的改变可能改变宿主中抗体的半衰期。改变与新生Fc受体(FcRn)结合的某些突变可延长抗体在血清中的半衰期。例如，在重链252位的酪氨酸、254位的苏氨酸和256位的谷氨酸中具有酪氨酸的抗体可以显着延长血清中的半衰期(参见例如美国专利号7,083,784)。

B.狂犬病病毒G蛋白的人抗体的制备

1.免疫原

通常，用狂犬病病毒表达的病毒和/或抗原免疫动物以产生抗体。为了产生抗狂犬病病毒抗体，通常用灭活狂犬病病毒免疫动物。狂犬病病毒可以灭活，例如通过化学处理和/或冻干法且数种狂犬病病毒疫苗可商购。

结合并中和狂犬病病毒的抗狂犬病病毒抗体可以与狂犬病病毒的特定表位相互作用，例如狂犬病病毒G糖蛋白。例如，抗狂犬病病毒G糖蛋白可结合狂犬病病毒G蛋白的抗原性位点II内的表位。在一个实例中，结合并中和狂犬病病毒的抗体结合包含狂犬病病毒G糖蛋白的氨基酸残基Glu33和/或Cys35的表位。如本文所讨论的，这样的表位还可以用于鉴定与狂犬病病毒以与本发明的抗体(例如2B10)相似的期望性质结合狂犬病病毒的其它抗体。

2.HuMAn小鼠中人单克隆抗体的生成

单克隆抗体可以用不可用于多克隆抗体的方式产生。多克隆抗血清因动物而异，而单克隆制剂显示出均匀的抗原特异性。鼠类动物系统可用于产生单克隆抗体，并且免疫方案，分离和融合脾细胞的技术以及用于产生杂交瘤的方法和试剂是众所周知的。单克隆抗体可以通过多种技术产生，包括常规单克隆抗体方法学，例如标准体细胞杂交技术。

尽管这些标准技术是已知的，但是希望使用人源化或人抗体而不是鼠类抗体来治疗人类受试者，因为人类对来自小鼠和其他物种的抗体产生免疫应答。对鼠类抗体的免疫应答称为人抗小鼠抗体或HAMA应答(Schroff,R.等人，Cancer Res.45:879-885,1985)，并且是导致人体血清病并导致从个体循环中迅速清除鼠类抗体的条件。已显示人类的免疫应答针对鼠类免疫球蛋白的可变区和恒定区。与源自其他动物和人多克隆抗体的抗体相比，人单克隆抗体对人类施用更安全。

产生人单克隆抗体的一种有用类型的动物是表达人免疫球蛋白基因而不是其自身的小鼠免疫球蛋白基因的转基因小鼠。这种转基因小鼠，例如“HuMAb^TM”小鼠，含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，以及灭活内源μ和κ链基因座的靶向突变(参见例如Lonberg,N.et al.Nature 368(6474):856-859,1994和美国专利5,770,429，其全部内容通过引用并入本文)。因此，小鼠表现出小鼠IgM或κ的表达降低，并且响应于免疫，导入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力的人IgGκ单克隆抗体(参见例如Lonberg,N.等人，supra；reviewed inLonberg,N.Handbook of Experimental Pharmacology113:49-101,1994；Lonberg,N.andHuszar,D.,Intern.Rev.Immunol.,13:65-93,1995和Harding,F.and Lonberg,N.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,764:536-546,1995，其全部内容通过引用并入本文)。

这些转基因小鼠的制备更详细地描述于，例如，Taylor,L.等人，Nucleic AcidsResearch,20:6287-6295,1992；Chen,J.等人，International Immunology 5:647-656,1993；Tuaillon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 90:3720-3724,1993；Choi等人，NatureGenetics,4:117-123,1993；Chen,J.等人，EMBO J.,12:821-830,1993；Tuaillon等人，J.Immunol.,152:2912-2920,1994；Taylor,L.等人，International Immunology,6:579-591,1994；和Fishwild,D.等人，Nature Biotechnology,14:845-851,1996。进一步参见美国专利5,545,806；美国专利5,569,825、美国专利5,625,126、美国专利5,633,425、美国专利5,661,016、美国专利5,770,429、美国专利5,789,650、美国专利5,814,318、美国专利5,874,299和美国专利5,877,397，全部由Lonberg和Kay完成，和PCT公开号WO 01/14424、WO98/24884、WO 94/25585、WO 93/1227和WO 92/03918，其全部内容通过引用并入本文。

为了产生针对抗原的完全人类单克隆抗体，可以用免疫原免疫HuMAb小鼠如Lonberg,N.等人，Nature,368(6474):856-859,1994；Fishwild,D.et al.,NatureBiotechnology,14:845-851,1996and WO 98/24884.所述。优选地，小鼠在第一次免疫时是6-16周龄。例如，纯化的灭活狂犬病病毒制剂可用于腹膜内(IP)免疫HuMAb小鼠。为了产生针对狂犬病病毒蛋白质、脂质和/或糖分子的抗体，可以用活的、死亡的或无生命的灭活的，和/或冻干的狂犬病病毒对小鼠进行免疫。在另一个实施方案中，狂犬病病毒G糖蛋白或其一个或多个片段可用作免疫原。

当最初用完全弗氏佐剂中的抗原IP免疫，随后每隔一周用不完全弗氏佐剂中的抗原进行IP免疫(总共达6次)时，HuMAb转基因小鼠响应最好。可以在免疫方案的过程中监测免疫应答，其中血浆样本通过眼眶后出血获得。例如可以通过ELISA或流式细胞术筛选血浆，并且具有足够效价的抗狂犬病病毒人免疫球蛋白的小鼠可以用于融合。在处死前3天将小鼠用抗原静脉内加强并除去脾脏。预计可能需要对每种抗原进行多次融合。通常对每种抗原免疫数只小鼠。

基于标准方案，可将小鼠脾细胞分离并与PEG融合至小鼠骨髓瘤细胞系。随后筛选产生的杂交瘤以产生抗原特异性抗体。例如，将来自免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液与具有50％PEG的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)的数量的六分之一融合。在平底微量滴定板中将细胞以约2x10⁵个铺板，接着在含有20％胎儿克隆血清、18％“653”条件培养基、5％origen(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和1x HAT(Sigma；HAT在融合后24小时添加)的选择培养基中温育两周。两周后，将细胞在其中HAT被HT取代的培养基中培养。然后通过ELISA筛选来自单个孔的上清液中的人抗狂犬病病毒单克隆IgM和IgG抗体。两周后，将细胞在其中HAT被HT取代的培养基中培养。随后通过ELISA筛选来自单个孔的上清液中的人抗狂犬病病毒单克隆IgM和IgG抗体。将分泌杂交瘤的抗体重新铺板，再次筛选，如果人IgG仍然呈阳性，抗狂犬病病毒单克隆抗体可以通过有限稀释亚克隆至少两次。随后将稳定的亚克隆体外培养以在组织培养基中产生少量抗体用于表征。

在一个实施方案中，用于产生狂犬病病毒的人抗体的转基因动物含有与WO 98/24884的实施例12(例如pHC1或pHC2)中所述的转基因的至少一个，通常2-10，并且有时25-50或更多个拷贝的转基因，其与含有WO 98/24884的实施例5、6、8或14中描述的轻链转基因的单拷贝的动物繁殖，且其后代与WO 98/24884的实施例10中所述的JH缺失的动物繁殖，其内容在此明确通过引用并入。将动物繁殖至对于三种性状的每一种都为纯合。这样的动物具有下述基因型：人重链未重排微型基因座的单拷贝(每单倍体染色体组)(在WO 98/24884的实施例12中描述)、重排的人K轻链构建体的单拷贝(每单倍体染色体组)(在WO 98/24884的实施例14中描述)和在每个内源小鼠重链基因座上移除所有功能性J_H区段的缺失(在WO98/24884的实施例10中描述)。这样的动物与对于J_H区段缺失为纯合(WO 98/24884的实施例10)的小鼠繁殖以产生对于J_H缺失是纯合且人类重链和轻链构建体为半合子的后代。给所得动物注射抗原并用于产生针对这些抗原的人单克隆抗体。

从这种动物分离的B细胞对于人重链和轻链是单特异性的，因为其仅包含每个基因的单个拷贝。此外，就如WO 98/24884的实施例9和12中所述引入的跨越J_H区的缺失而言，由于两个内源小鼠重链基因拷贝都是非功能性的，其对于人或小鼠重链而言将是单特异性的。此外，相对于人或小鼠轻链，B细胞的大部分将是单特异性的，因为重排的人类κ轻链基因的单拷贝的表达将等位关联的，并且同型地排除内源性小鼠κ和λ链基因在相当一部分B细胞中的重排。

在一个实施方案中，转基因小鼠将以显著的组成成分呈现免疫球蛋白的产生，理想的是与天然小鼠的基本上相似。因此，例如在其中内源Ig基因已灭活的实施方案中，总免疫球蛋白水平的范围将为约0.1至10mg/ml的血清，例如0.5至5mg/ml或至少约1.0mg/ml。当将能够实现从IgM向IgG的转换转基因引入转基因小鼠时，成年小鼠血清IgG比IgM的比率优选约10:1。IgG比IgM的比率将比未成熟小鼠中低得多。一般而言，大于约10％例如约40％至80％的脾和淋巴结B细胞将仅表达人IgG蛋白。

转基因小鼠中的所有组成成分理想将近似非转基因小鼠中所示的，通常至少高约10％，优选高25％至50％或更多。一般而言，将产生至少约一千种不同的免疫球蛋白(理想为IgG)，优选10⁴至10⁶或更多，主要取决于引入小鼠基因组的不同V、J和D区的数目。通常，免疫球蛋白针对预选抗原将呈现至少约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M、10^-13M、10^-14M或更大，例如直至10^-15M或更大的亲和力。

HuMAb小鼠可产生B细胞，所述B细胞经历经由转基因内转换重组经历(顺式转换)的类别转换并表达与狂犬病病毒具有反应性的免疫球蛋白。免疫球蛋白可以是人序列抗体，其中所述重链和轻链多肽由人转基因序列编码，其可以包括由体细胞突变和V区重组接合衍生的序列以及种系编码序列，以及种系编码的序列。这些人序列免疫球蛋白可称为与由人VL或VH基因区段和人JL或JL区段编码的多肽序列基本上相同，尽管其他非种系序列可作为体细胞突变和差异V-J和V-D-J重组接合的结果存在。对于这些人序列抗体，每条链的可变区通常至少80％由人种系V、J基因区段且在重链的情况中由D基因区段编码。通常至少85％的可变区由存在于转基因上的人种系序列编码。经常的是，90％或95％或更多的可变区序列由存在于转基因上的人种系序列编码。然而，由于通过体细胞突变和VJ和VDJ接合引入非种系序列，所以人序列抗体将经常具有一些可变区序列(以及不太常见的恒定区序列)，其并非如在小鼠种系中发现的人转基因由人V、D或J基因区段编码。通常，这些非种系序列(或单个核苷酸位置)将聚集在CDR中或附近，或在已知体细胞突变聚集的区域中。

与狂犬病病毒结合的人序列抗体可由同种型转换产生，使得包含人序列γ链(例如γ1、γ2或γ3)的人抗体和人序列轻链(例如K)产生。这种同种型转换的人类序列抗体通常含有一个或多个体细胞突变，典型地在可变区中并且经常在CDR的约10个残基之中或之内，这是由于亲和力成熟和通过抗原选择B细胞特别是在第二(或随后的)抗原攻击后的结果。

其他哺乳动物也可以产生抗狂犬病病毒抗体，包括非转基因小鼠、人、兔和山羊。事实上，特别考虑抗体也可以来源于免疫或感染受试者的B细胞，作为使用HuMAb小鼠的替代方案。

3.抗体的产生和修饰

在本发明中有用的抗狂犬病病毒抗体或其部分也可以是由用编码所需抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA转化的宿主细胞产生的重组抗体。重组抗体可以通过已知的基因工程技术产生，如在美国专利号4,816,567中所述的，其通过引用以其整体并入本文。例如，可以通过克隆编码所需抗体的免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列(例如cDNA或基因组DNA)来产生重组抗体。如果需要，可以操纵编码那些多肽的核苷酸序列(例如克隆以从一种同种型转换到另一种，例如克隆以从IgG3类型同种型转换成IgG1类型同种型)，然后插入到表达载体中，使得两种基因与它们自己的转录和翻译表达控制序列可操作地连接。选择表达载体和表达控制序列以与所用的表达宿主细胞相容。通常，两种基因都被插入相同的表达载体中。可以使用原核或真核宿主细胞。

在真核宿主细胞中的表达是优选的，因为这样的细胞比原核细胞更有可能装配和分泌适当折叠和免疫活性的抗体。然而，可以根据已知的方法使任何由于不适当折叠而产生的无活性抗体复性(Kim and Baldwin,Ann.Rev.Biochem.51:459-89,1982,which isherein incorporated by reference in its entirety)。宿主细胞可能会产生部分完整抗体，例如轻链二聚体或重链二聚体，其也是根据本发明的抗体同系物。

本文所述的抗体还可以在宿主细胞转染瘤中产生，使用例如本领域已知的重组DNA技术和基因转染方法的组合(Morrison,S.,Science,229:1202,1985,其在本文通过引用以其整体并入)。例如，在一个实施方案中，可以将感兴趣的基因(例如人抗体基因)连接到表达载体如真核表达质粒中，如用于WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338 841中公开的GS基因表达系统中，其通过引用整体并入本文，或者在本领域已知的其它表达系统中。在另一个实例中，可以在真核宿主细胞例如CHO细胞中选择感兴趣的抗体基因(例如通过甲氨蝶呤选择)。具有克隆的抗体基因的纯化的质粒可以导入真核宿主细胞如CRO-细胞或NSO-细胞或可替换地其他真核细胞例如植物来源的细胞、真菌或酵母细胞。用于引入这些基因的方法可以是本领域中描述的任何方法，例如电穿孔、脂质体(lipofectine)、脂质体(lipofectamine)、转染(例如氯化钙介导的)或弹道转染，其中用携带感兴趣DNA的微粒轰击细胞(Rodin,et al.Immunol.Lett.74(3):197-200,2000，其在本文通过引用以其全文并入)。在宿主细胞中引入这些抗体基因后，可以鉴定和选择表达抗体的细胞。这些细胞代表转染瘤，然后可以针对它们的表达水平进行扩增并扩大以产生抗体。可以使用标准技术从这些培养上清和/或细胞中分离和纯化重组抗体。

应该理解的是，上述过程的变化在本发明中是有用的。例如，可能需要用编码抗体的轻链或重链(但不是两者)的DNA转化宿主细胞。重组DNA技术也可以用于除去编码对于结合不是必需的轻链或重链或两者中的一些或全部DNA，例如可以通过缺失特定氨基酸来修饰恒定区。由这种截短的DNA分子表达的分子可用于本文所述的方法中。此外，可以产生其中一条重链和一条轻链与狂犬病病毒结合并且另一条重链和轻链对狂犬病病毒以外的抗原或狂犬病病毒的另一表位具有特异性的双功能抗体。

如上所述，在本发明的范围内还有其中已取代、缺失或添加特定氨基酸的抗体。具体而言，优选的抗体在构架区中具有氨基酸取代，例如以改善与抗原的结合。例如，选择的少量免疫球蛋白链的受体框架残基可以由相应的供体氨基酸替换。取代的优选位置包括与CDR相邻的氨基酸残基，或能够与CDR相互作用的氨基酸残基(参见例如美国专利5,585,089，其在本文通过引用以其全文并入)。美国专利5,585,089描述了从供体中选择氨基酸的标准(例如col.12-16)。受体框架可以是成熟的人抗体框架序列或共有序列。根据需要，可以改变本发明抗体的Fc区以调节效应器功能，如例如补体结合和/或Fc受体结合。框架改变的标准和子集和/或适用于改变的恒定区(通过例如取代、缺失或插入)描述于美国专利号6,548,640；5,859,205；6,632,927；6,407,213；6,054,297；6,639,055；6,737,056和6,673,580，其在本文通过引用以其全文并入。

抗狂犬病病毒抗体或其抗原结合部分可衍生或连接至另一功能分子(例如另一肽或蛋白)。例如，抗体可以与一种或多种其它分子实体功能性连接(通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式)，所述其他分子如另一种抗体、可检测试剂、细胞毒性剂、药剂和/或可以介导与另一种分子(如链霉亲和素核心区或多组氨酸标签)结合的蛋白或肽。一种类型的衍生抗体(或其片段)通过交联两种或更多种这样的蛋白(相同类型或不同类型)而产生。适当的交联剂包括异双官能的，具有由合适的间隔物分开的两个不同的反应性基团的那些(例如间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双功能的(例如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)。这种接头可从Pierce Chemical Company,Rockford,IL获得。

使用其将抗体或其片段衍生(或标记)的有用的可检测试剂包括荧光化合物、多种酶、辅基、发光材料、生物发光材料和放射性材料。示例性荧光可检测剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明和藻红蛋白。蛋白或抗体也可以用可检测的酶衍生，如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、13-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶等。当用可检测的酶衍生蛋白时，其通过添加酶用于产生可检测的反应产物的附加试剂检测。例如，当存在可检测的作用剂辣根过氧化物酶时，过氧化氢和二氨基联苯胺的添加产生可检测的有色反应产物。蛋白质也可以用辅基衍生(例如链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素)。例如，抗体可以用生物素衍生化，并通过间接测量抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素结合来检测。

可以使用标记的蛋白和抗体，例如，诊断地和/或在许多情况下用实验方法，包括(i)通过标准技术如亲和层析或免疫沉淀来分离预定的抗原；和(ii)检测预定的抗原(例如狂犬病病毒，或狂犬病病毒蛋白(例如狂犬病病毒G蛋白)、糖或脂质或其组合，例如在细胞裂解物或患者样品中)以监测组织中的病毒和/或蛋白水平作为临床测试程序的一部分，例如以确定给定治疗方案的功效。

任何上述蛋白衍生化/标记技术也可用于病毒靶标上，例如狂犬病蛋白如G糖蛋白或其片段。

C.筛选方法

通过多种已知技术可以表征抗狂犬病病毒抗体的特征在于与狂犬病病毒的结合。通常首先通过ELISA来表征抗体。简而言之，微量滴定板可用PBS中的靶抗原包被，例如狂犬病病毒或G糖蛋白或其部分，然后用稀释于PBS中的无关蛋白如牛血清白蛋白(BSA)封闭。将来自用靶抗原免疫的小鼠的血浆稀释液(例如狂犬病疫苗)添加到各孔中，并在37℃孵育1-2小时。用PBS/吐温20洗涤平板，然后在37℃用与碱性磷酸酶偶联的山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂温育1小时。洗涤后，将板用ABTS底物显色，并在405的OD分析。优选地，产生最高滴度的小鼠将用于融合。

如上所述的ELISA测定法可用于筛选抗体，从而筛选产生与狂犬病病毒呈阳性反应性的抗体的杂交瘤。产生与狂犬病病毒优选以高亲和力结合的抗体的杂交瘤可以随后亚克隆并进一步表征。随后可以选择(通过ELISA)来自每个杂交瘤的保留亲本细胞的反应性一个克隆用于制备细胞库和用于抗体纯化。

为了纯化抗狂犬病病毒抗体，选择的杂交瘤可以在滚瓶、2升旋转瓶或其他培养系统中生长。在用蛋白A-Sepharose(Pharmacia,Piscataway,N.J.)进行亲和层析之前，可以过滤并浓缩上清液以纯化蛋白。缓冲液交换成PBS后，浓度可以通过分光光度法测定。

为了确定选择的单克隆抗体是否与独特的表位结合，可以使用市售试剂(Pierce,Rockford,Ill.)将每种抗体生物素化。生物素化的MAb结合可以用抗生蛋白链菌素标记的探针检测。通过免疫沉淀或免疫印迹可以进一步测试抗狂犬病病毒抗体与狂犬病病毒或狂犬病病毒蛋白的反应性。

本发明的特定抗体的特征在于结合狂犬病G糖蛋白的一个或多个表位，例如狂犬病G糖蛋白的抗原性位点II，其包括其它抗原性位点如抗原性位点I、抗原性位点III和较小的抗原性位点A。

测量抗狂犬病病毒抗体活性的其他测定法包括中和测定法。体外中和测定可以测量抗体抑制细胞病变效应、传染性或病毒在培养细胞上或细胞中存在的能力。这样的体外中和测定法包括快速荧光焦点抑制测试(RFFIT)测定法，如下所述并且例示了本文所述的实施例。在合适的动物模型中，体内中和或存活测定可用于测量狂犬病病毒中和作为降低的发病率和/或死亡率的函数。

D.治疗方法和药物组合物

本发明的抗体和抗体片段具有体外和体内治疗、预防和诊断用途。例如，可将这些抗体施用于培养中的细胞，例如体外或离体或体内施用于受试者，优选人受试者，以治疗、抑制、预防复发和/或诊断狂犬病病毒和与狂犬病相关的疾病。

一方面，本发明的特征在于一种治疗患有狂犬病病毒感染或暴露于受试者处于获得狂犬病病毒感染的实质风险中的环境的受试者的方法，其中所述方法包括施用治疗有效量的与狂犬病病毒(例如狂犬病病毒的G糖蛋白)特异性结合的单克隆抗体(例如人单克隆抗体)，如抗体2B10或与2B10抗体共享相同或基本上相同的CDR或VH/VL结构域的抗体，或其药物组合物，由此治疗受试者。因此，在某些情况下，本文提供的抗体可用于受试者的暴露后治疗。并且在其他情况下，本文提供的抗体可用于受试者的预防性治疗。在某些情况下，如果受试者处于狂犬病死亡率或狂犬病病毒暴露显着的地理区域，则可以将受试者视为处于狂犬病病毒感染风险。在其他情况下，如果受试者已经旅行或将前往狂犬病死亡率或狂犬病病毒暴露显着的地理区域，则可以将受试者视为处于狂犬病病毒感染风险。

本发明的抗体可以单独使用或与其他药物组合用于治疗。例如，本发明的抗体可以与至少一种另外的治疗剂(例如另一种抗狂犬病病毒抗体，如17C7、狂犬病疫苗和/或HRIG)共同施用。这种组合疗法包括组合施用(其中两种或多种治疗剂包含在相同或分开的制剂中)和分开施用，在这种情况下，本发明抗体的施用可以在施用另外的治疗剂或作用剂之前、同时和/或之后进行。在一个实施方案中，第一抗狂犬病病毒抗体的施用和另外的治疗剂(例如狂犬病疫苗和/或第二抗狂犬病病毒抗体)的施用彼此在约一个月内，或在约一、二或三周内，或在约一、二、三、四、五或六天内发生。施用的抗狂犬病病毒抗体和/或另外的治疗剂可以在特定的方案中在多天内根据情况给药(例如，在暴露后预防性治疗的一个实例中，暴露后的受试者可以在第0、3、7、14和28天给药)。

本文提供的抗狂犬病病毒抗体可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要局部治疗，则病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。在某些情况下，抗体基因(例如编码本发明的任何一种或多种抗狂犬病病毒抗体的基因)可作为基因疗法施用，以使用DNA载体或病毒载体(例如rAAV载体、慢病毒载体等)在受试者中产生一种或多种抗狂犬病病毒抗体。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑多种给药方案，包括但不限于在各种时间点的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。

本发明的抗体将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括治疗的具体病症、治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的原因、药物递送部位，施用方法、施用时间表以及医师已知的其他因素。抗体不需要，但是可选地用一种或多种目前用于预防或治疗所述病症的作用剂配制。这些其他作用剂的有效量取决于制剂中存在的抗体量、病症或治疗的类型以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或约1至99％的本文所述的剂量，或以任何剂量和通过经验/临床确定为合适的任何途径使用。

为了预防或治疗疾病，例如狂犬病病毒感染，本发明抗体的合适剂量(当单独使用或与一种或多种其他额外治疗剂组合使用时)将取决于待预防/治疗疾病的类型、所需有效抗体浓度的持续时间、抗体类型、疾病的严重程度和病程、抗体是用于预防还是治疗目的、先前的疗法，患者的临床历史和对抗体的反应，以及主治医师的自由裁量权。抗体以一次或通过一系列治疗适当地施用于患者。

作为一般建议，通过一次或多次施用施用至人的抗狂犬病病毒抗体的治疗有效量将在约0.001至约100mg/kg患者体重的范围。在一些实施方案中，使用的抗体为一次(单次施用)或多次(多次施用，例如每日施用)施用的约0.001至约45mg/kg、约0.001至约40mg/kg、约0.01至约35mg/kg、约0.001至约30mg/kg、约0.001至约25mg/kg、约0.001至约20mg/kg、约0.001至约15mg/kg、约0.001至约10mg/kg、约0.01至约45mg/kg、约0.01至约40mg/kg、约0.01至约35mg/kg、约0.01至约30mg/kg、约0.01至约25mg/kg、约0.01至约20mg/kg、约0.01至约15mg/kg、约0.01至约10mg/kg、约0.1至约10mg/kg或约1至约10mg/kg。在一些实施方案中，使用的抗体为一次(单次施用)或多次(多次施用，例如每日施用)施用的约0.001至约45IU/kg、约0.001至约40IU/kg、约0.01至约35IU/kg、约0.001至约30IU/kg、约0.001至约25IU/kg、约0.001至约20IU/kg、约0.001至约15IU/kg、约0.001至约10IU/kg、约0.01至约45IU/kg、约0.01至约40IU/kg、约0.01至约35IU/kg、约0.01至约30IU/kg、约0.01至约25IU/kg、约0.01至约20IU/kg、约0.01至约15IU/kg、约0.01至约10IU/kg、约0.1至约10IU/kg或约1至约10IU/kg。在一个实施方案中，本文所述的抗狂犬病病毒抗体以约1mg、约10mg、约20mg、约50mg、约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1000mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg或约1400mg的剂量施用至人。在一个实施方案中，本文所述的抗狂犬病病毒抗体以约1IU、约10IU、约20IU、约50IU、约100IU、约200IU、约300IU、约400IU、约500IU、约600IU、约700IU、约800IU、约900IU、约1000IU、约1100IU、约1200IU、约1300IU或约1400IU的剂量施用至人。所述剂量可作为单次剂量或作为多次剂量(例如2或3次剂量)如输注施用。对于几天或更长时间的重复施用，取决于病症，通常将持续治疗直至出现所需的疾病症状的抑制。抗体的一个示例性剂量将在约0.01mg/kg至约10mg/kg的范围。这种剂量可以间歇施用，例如每周或每三周(例如进而患者接受约2至约20个剂量，或例如约6个剂量的抗狂犬病病毒抗体)。可以施用初始较高负荷剂量，然后施用一次或多次较低剂量。这种疗法的进展很容易通过常规技术和测定进行监测。

本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得有效实现特定患者，组合物和施用方式的所需治疗响应和持续时间的活性成分的量，而不会对患者产生毒性。选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所用本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、使用特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所用特定组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史，以及医学领域众所周知的类似因素。本领域普通技术医师或兽医可以容易地确定并开出所需药物组合物的有效量。例如，医师或兽医可以以低于实现所需治疗效果所需的水平开始药物组合物中采用的本发明化合物的剂量，并逐渐增加剂量直至达到所需效果。通常，本发明组合物的合适的日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。这种有效剂量通常取决于上述因素。优选静脉内、肌内、腹膜内或皮下施用，优选在靶部位的近侧施用。如果需要，治疗组合物的有效日剂量可以在一天中以适当间隔分别以2、3、4、5、6或更多亚剂量分开施用，任选以单位剂量形式施用。尽管本发明化合物可以单独给药，但优选将该化合物作为药物制剂(组合物)给药。

治疗组合物可以与本领域已知的医疗装置一起施用。例如，在优选的实施方案中，本发明的治疗组合物可以与无针皮下注射装置一起施用，如美国专利No.5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中所述的装置。用于本发明的众所周知的植入物和模块的实例包括：美国专利No.4,487,603，其公开了用于以受控速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利No.4,486,194，其公开了用于通过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利No.4,447,233，其公开了用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利No.4,447,224，其公开了用于连续药物递送的可变流量可植入输注装置；美国专利No.4,439,196，其公开了具有多室隔室的渗透药物递送系统；和美国专利No.4,475,196，其公开了渗透药物递送系统。本领域技术人员已知许多其他这样的植入物、递送系统和模块。

在一些实施方案中，可配制本发明的人单克隆抗体以确保在体内适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高亲水性化合物。为了确保本发明的治疗化合物穿过BBB(如果需要)，可以将它们配制成例如脂质体。脂质体可以包含一个或多个选择性转运到特定细胞或器官中的部分，从而增强靶向药物递送。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如Low等人的美国专利No.5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(P.G.Bloeman et al.(1995)FEBSLett.357:140；M.Owais et al.(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面蛋白A受体(Briscoe et al.(1995)Am.J.Physiol.1233:134)，其不同种类可以包含本发明的制剂，以及本发明分子的组分；p 120(Schreier et al.(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。在本发明的一个实施方案中，本发明的治疗化合物配制在脂质体中；在更优选的实施方案中，脂质体包含靶向部分。该组合物必须是流动性的，以便容易注射。其必须在制造和储存条件下稳定，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。

在某些情况下，基于抗体的疗法可以与另外的疗法组合以进行受试者的更有效的治疗(例如加成或协同治疗)。因此，可以另外施用用本发明的抗体治疗的受试者(在施用本发明的HuMab抗狂犬病病毒抗体之前、同时或之后)增强或提供人抗体治疗效果的另一种治疗剂。

此外，本文提供的抗体可用于培养的细胞，例如在体外或离体。例如，细胞可以在培养基中体外培养，接触步骤可以通过将抗狂犬病病毒抗体或其片段添加到培养基中来实现。作为体内(例如治疗或预防)方案的一部分，可对存在于受试者中的病毒体或细胞进行所述方法。对于体内实施方案，接触步骤在受试者中实现并且包括在有效允许抗体或片段与存在于受试者中的狂犬病病毒或其任何部分结合的条件下向所述受试者施用抗狂犬病病毒抗体或其片段，例如在伤口中或周围或在感染部位上或附近。所用分子的合适剂量取决于受试者的年龄和体重以及所用的具体药物。抗体分子可以用作配体结合的竞争剂，以抑制或减少不希望的相互作用，例如抑制狂犬病病毒对细胞的结合和/或感染。

抗狂犬病病毒抗体或其抗原结合片段如HuMab 2B10可以与其它抗狂犬病病毒抗体(例如其他单克隆抗体，如HuMab 17C7(参见美国专利号7,727,532和8,226,952)或人狂犬病免疫球蛋白(HRIG)组合施用。因此，在一些实施方案中，对受试者施用至少一个剂量的抗体或药物组合物并随后施用至少一个(例如至少1、2、3、4或5)剂量的HRIG或其药物组合物，如以约20IU/kg的剂量施用HRIG。如下文实施例所述，包含2B10抗体(例如2B10和17C7的组合)的抗狂犬病病毒抗体的组合可提供强效的狂犬病病毒抑制，特别是，例如特定狂犬病的街道分离物，其不能通过用单次抗狂犬病病毒抗体治疗有效地中和，例如用17C7或HRIG的单一疗法。本发明的抗体适用于治疗、检测、诊断等的特征性狂犬病病毒分离物包括，例如CVS-11分离物、ERA分离物、巴氏病毒分离物、灰狐(德克萨斯州)分离物、灰狐(亚利桑那)分离物、北极狐(阿肯色)分离物、臭鼬(北中部)分离物、臭鼬(南中部)分离物、莞熊分离物、郊狼(德克萨斯州)分离物、狗(德克萨斯州)分离物、蝙蝠(Lasiurus borealis；田纳西)分离物、蝙蝠(Eptesicus fuscus-Myotis spp.；科罗拉多)分离物、蝙蝠(鼠耳蝠属.；华盛顿)分离物、蝙蝠(Lasiurus cinereus；亚利桑那)分离物、蝙蝠(Pipistrellus subflavus；阿拉巴马)分离物、蝙蝠(Tadarida brasiliensis；阿拉巴马)分离物、蝙蝠(Lasionycetrisnoctivagans；华盛顿)分离物、蝙蝠(Eptesicus fuscus；宾夕法尼亚)分离物、猫鼬(纽约/波多黎各)分离物、狗(阿根廷)分离物、狗(索诺拉)分离物、狗(加蓬)分离物、狗(泰国)分离物、秘鲁蝙蝠分离物及其组合。

应该理解，本发明的任何试剂，例如抗狂犬病病毒抗体或其片段可以例如以不同的比例或量组合，以改善治疗效果。事实上，本发明的作用剂可以配制成混合物，或者使用本领域公认的技术进行化学或遗传连接，从而产生具有抗狂犬病结合特性的共价连接的抗体(或共价连接的抗体片段)，例如针对如狂犬病病毒G糖蛋白的多表位结合特性。组合制剂可以通过确定一种或多种参数如亲和力，亲合力或单独作用剂或与另一作用剂组合的生物效力来指导。本发明的作用剂还可以与增强治疗剂在靶向、清除和/或隔离狂犬病病毒或其抗原中的获取、半衰期或稳定性的其他作用剂组合施用。

这样的组合疗法在其治疗活性中优选是加成并且甚至是协同的，例如在狂犬病病毒相关疾病或病症的抑制、预防、感染和/或治疗中。施用这类组合疗法可降低达到所需效果所需的治疗剂(例如抗体或抗体片段混合物，或交联的或遗传融合的双特异性抗体或抗体片段)的剂量。

本发明还提供了含有免疫原性有效量的狂犬病病毒组分的免疫原性组合物，例如狂犬病病毒G糖蛋白或其片段，并且可用于产生抗狂犬病病毒抗体。狂犬病病毒蛋白质序列中的免疫原性表位可如本文所述或根据本领域已知的方法鉴定，并且含有那些表位的蛋白或片段可通过多种方式在疫苗组合物中递送。合适的组合物可以包括例如脂肽(例如Vitiello等人，J.Clin.Invest.95:341(1995))、包封在聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”)微球中的肽组合物(参见例如Eldridge等人，Molec.Immunol.28:287-94(1991)；Alonso等人，Vaccine 12:299-306(1994)；Jones等人，Vaccine 13:675-81(1995))、包含在免疫刺激复合物中的肽组合物(ISCOMS)(参见例如Takahashi等人，Nature344:873-75(1990)；Hu等人，Clin.Exp.Immunol.113:235-43(1998))和多种抗原肽系统(MAP)(参见例如Tam,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5409-13(1988)；Tam,J.Immunol.Methods 196:17-32(1996))。

抗狂犬病抗体(例如2B10)或抗体(例如2B10和17C7)可与其他作用剂组合施用，如治疗狂犬病病毒介导的疾病的组合物。例如，可与抗狂犬病抗体组合施用的治疗剂包括抗病毒剂、血清免疫球蛋白和/或用于治疗、预防或抑制狂犬病的疫苗(例如，疫苗如RABIVAX(Serum Institute of India)、RABAVERT^TM(Chiron)、狂犬病吸附疫苗(Bioport)和狂犬病(Aventis)和/或免疫球蛋白如BAYRAB^TM(Bayer)和IMOGAM^TM狂犬病-HT(Aventis)。抗体可以在狂犬病病毒疫苗之前、之后或同时施用。

包含一种或多种本发明的抗狂犬病抗体的药物组合物可以通过本领域已知的多种方法施用。如本领域技术人员将理解的，施用的途径和/或模式将取决于期望的结果而变化。活性化合物可以与保护化合物免于快速释放的载剂一起制备，例如控释制剂包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。可以与本发明组合物一起使用的有用载剂是众所周知的，并且包括例如甲状腺球蛋白、白蛋白例如人血清白蛋白、破伤风类毒素、聚氨基酸如聚L-赖氨酸、聚L-谷氨酸、流感、乙肝病毒核心蛋白等。所述组合物可含有生理上可耐受的(即可接受的)稀释剂如水或盐水，通常是磷酸盐缓冲盐水。组合物和疫苗通常还包含佐剂。如不完全弗氏佐剂、磷酸铝、氢氧化铝或明矾等佐剂是本领域公知的材料的实例。另外，可通过将靶抗原(例如狂犬病病毒蛋白(或其片段、无活性衍生物或类似物))与脂质(如棕榈酰-S-甘油半胱氨酰-丝氨酰-丝氨酸(P₃CSS))偶联来引发CTL应答。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这种制剂的许多方法是专利的或通常为本领域技术人员所知。

为了通过某些给药途径来施用本发明的化合物，可能有必要给该化合物包被或与该化合物共同施用材料以防止其失活。例如，该化合物可以在合适的载剂中施用至受试者，例如脂质体或稀释剂。药学上可接受的稀释剂包括盐水和缓冲水溶液。脂质体包括水包油包水CGF乳剂以及常规脂质体。

药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。本领域已知用于药物活性物质的此类介质和作用剂的使用。任何常规介质或试剂，除与活性化合物不相容之外，考虑将其用于本发明的药物组合物中。补充活性化合物也可以掺入组合物中。

本发明的药物组合物也可以在组合疗法中施用，即与其他作用剂组合。例如，所述组合疗法可包括发明的组合物，如治疗的特定适应症(例如狂犬病病毒感染)所必需，其具有至少一种或多种额外的治疗剂。

活性成分可以包埋在制备的微胶囊中，例如通过凝聚技术或通过界面聚合，例如分别在胶体药物递送系统中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中。

可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的适当的实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，所述基质为成形制品形式，例如膜或微胶囊。

待用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如通过无菌滤膜过滤可以容易地完成无菌操作。无菌注射溶液可通过将所需量的活性化合物与上述列举的一种或多种成分的组合(如果需要)掺入合适的溶剂中，然后进行无菌微滤来制备。通常，通过将活性化合物掺入含有基础分散介质和来自上面列举的那些的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其从先前的无菌过滤的其溶液中产生活性成分加任何另外的所需成分的粉末。治疗组合物通常在制造和储存条件下必须是无菌的和稳定的。该组合物可以配制成适合于高药物浓度的溶液、微乳液、脂质体或其他有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，以及其合适的混合物。例如，通过使用如卵磷脂的包衣，通过在分散的情况下维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂如80来维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的作用剂例如单硬脂酸盐和明胶来引起可注射组合物的延长吸收。

或者，可将编码本发明的抗狂犬病病毒抗体的基因直接递送到受试者中进行表达，而不是施用用于预防或治疗的纯化抗体。例如，病毒载体如重组病毒可用于递送重链和轻链基因。在一个实例中，rAAV病毒颗粒可用于递送抗HIV单克隆抗体(Balazs等人，Nature.481:81,2012)。抗体基因也可以通过用含有重和/或轻链基因(例如VH和/或VL基因)的质粒DNA电穿孔肌肉细胞来有效递送(Muthumani等人，Hum Vaccin Immunother.10:2253,2013)。能够递送转基因的慢病毒载体或其他核酸(例如RNA)也可以用于递送抗体基因以建立能够预防的血清抗体水平。

E.用于诊断和检测的方法和组合物

在一些实施方案中，本发明的任何抗狂犬病病毒抗体可用于体外或体内检测生物样品中狂犬病病毒(特别是狂犬病病毒的G糖蛋白)的存在。如本文所用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。在一些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。

在一个实施方案中，提供用于诊断方法(例如狂犬病病毒感染的诊断)或检测(例如检测狂犬病病毒感染)中使用的抗狂犬病病毒抗体。另一方面，提供了检测生物样品(例如血清样品)中狂犬病病毒(特别是狂犬病病毒的G糖蛋白)存在的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在允许抗狂犬病病毒抗体与狂犬病病毒结合(特别是狂犬病病毒的G糖蛋白)的条件下使生物样品与本文所述的抗狂犬病病毒抗体(例如2B10抗狂犬病病毒HuMab)接触，并检测抗狂犬病病毒抗体与狂犬病病毒靶标之间是否形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。因此该方法允许筛选样品中狂犬病病毒的存在/暴露。如上所述，本文提供的抗狂犬病抗体也可以用于诊断地监测病毒水平，例如在组织中作为临床测试程序的一部分，例如，确定给定治疗方案的效力。此外，狂犬病病毒表位，例如G糖蛋白表位(线性、构象或其组合)可用作免疫原或用作鉴定中和抗狂犬病结合分子的靶标，包括例如人血清、多克隆抗体、单克隆抗体或其片段。

在一些实施方案中，提供了标记的抗狂犬病病毒抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(例如荧光、发色团、电子密度、化学发光和放射性标记)以及间接检测的部分(例如酶或配体)，例如通过酶促反应或分子相互作用。示例性标记包括但不限于放射性同位素³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H和¹³¹I、荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、萤光素酶、例如萤火虫荧光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456)、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，其与采用过氧化氢的酶偶联以氧化染料前体例如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记、噬菌体标记，稳定的自由基等。

F.制品

在本发明的另一方面中，提供了包含用于治疗、预防和/或诊断上述狂犬病病毒感染的材料的制品(例如试剂盒)。该制品包括容器以及在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉输液袋(IV solution bag)等。容器可以由各种材料形成，例如玻璃或塑料。该容器装有组合物，该组合物本身或与另一种组合物组合有效治疗、预防和/或诊断病况并可具有无菌入口(例如容器可以是静脉输液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本文提供的抗体(例如2B10)。该制品(例如试剂盒)可以进一步含有一种或多种另外的试剂，如具有与狂犬病病毒上的表位(例如狂犬病病毒G糖蛋白上的表位)结合的互补活性的第二种不同的抗狂犬病病毒抗体，其与第一抗狂犬病病毒抗体结合的表位不同(例如17C7)。标签或包装插页表明该组合物用于治疗选择的病况。此外，所述制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的细胞毒素或其他治疗剂。本发明该实施方案中的制品可以进一步包含指示组合物可用于治疗特定病况(例如狂犬病)的包装插页。或者，或此外，制品还可以包含第二(或第三)容器，其包含药物上可接受的缓冲剂，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。其可以进一步包括从商业和用户观点来看所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。

在以下实施例中描述了本发明的其他实施方式。通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应理解为进一步的限制。本申请通篇引用的序列表、附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容明确地通过引用并入本文。

III.实施例

以下是本发明的方法和组合物的实例。应该理解，给定以上提供的一般描述，可以实践各种其他实施方案。

实施例1.材料和方法

在以下实施例中进一步描述了本发明，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。

小鼠免疫和杂交瘤的分离

HuMan小鼠(Medarex)是含有人免疫球蛋白基因和失活的小鼠重链基因和κ轻链基因的转基因小鼠。HuMan小鼠通常注射约1/10人类剂量的市售狂犬病疫苗使用狂犬病包膜糖蛋白ELISA来测量血清响应，并且当血清响应被认为是最大时将动物处死。通过融合脾细胞和伴侣细胞(P3X63Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞)产生杂交瘤。首先使用人IgG捕获ELISA对杂交瘤筛选分泌人IgG的细胞。通过蛋白A琼脂糖层析(Amersham)从杂交瘤培养物纯化阳性抗体。在狂犬病G糖蛋白特异性ELISA中进一步筛选人IgG。结合狂犬病G糖蛋白的抗体在针对RABV病毒库的RFFIT中进一步测试。

快速荧光聚焦抑制测试(RFFIT)

如本领域所述进行快速荧光聚焦抑制测试(RFFIT)测定。使用的狂犬病病毒株，街道病毒分离株和小鼠神经母细胞瘤细胞(MNA)均来自美国亚特兰大疾病控制和预防中心。

细胞和细胞培养

将从ATCC获得的HEK-293T117细胞在补充有10％胎牛血清和100IU青霉素-链霉素(完全培养基)的Dulbeccos改良Eagle培养基(Dulbeccos modified Eagle’s medium，DMEM)中在37℃，5％CO₂下生长。在含有5mM EDTA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中收获细胞。

狂犬病糖蛋白的克隆

使用狂犬病G蛋白(ERA菌株，Genbank：AF406693)的氨基酸序列设计跨越来自氨基酸1-524的全长糖蛋白的狂犬病糖蛋白基因的密码子优化版本。将合成基因与c-Myc和6-组氨酸(His)标签一起框内克隆到pcDNA3.1Myc/His(Invitrogen)中。这些免疫标签使得易于纯化和检测。构建含有整个胞外域的截短版本的标记糖蛋白编码基因(20-439a.a.)。通过PCR从全长糖蛋白克隆中扩增所需片段进行截短，然后限制性消化并连接到pcDNA3.1Myc/His(Invitrogen)中，并通过DNA序列分析验证。

为了分离编码狂犬病G糖蛋白的各种菌株的天然基因，用预期的狂犬病病毒菌株感染MNA细胞。使用Trizol试剂从感染细胞或从病毒体提取RNA。RTPCR分两步进行。首先，使用Ambion Retroscript试剂盒合成cDNA，然后使用Turbo Pfu(Stratagene)和狂犬病病毒特异性引物扩增狂犬病糖蛋白编码基因。将狂犬病糖蛋白编码基因在hindIII/XbaI位点处与c-Myc和His表位标签一起框内克隆到哺乳动物表达载体pCDNA3.1Myc/His(Invitrogen)中。使用定点诱变合成编码狂犬病糖蛋白的重组基因，其在分类为抗原性位点I、II、III和次要位点a的残基处突变。使用含有所需点突变的重叠引物扩增来自先前克隆的密码子优化的ERA糖蛋白的全长突变糖蛋白基因和pcDNA3.1Myc/His载体。用DpnI消化PCR扩增的DNA以去除野生型非扩增起始模板，转化成细菌，并通过测序筛选预期的突变。确认每个突变体的完整编码序列，并将所得构建体克隆到pcDNA3.1Myc/His表达载体中。

重组糖蛋白的表达

如制造商所述使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将所有构建体转染到HEK-293T/17细胞中。在15ml DMEM-10％胎牛血清(FCS)中的150mm组织培养皿中使细胞生长至85％汇合。向细胞中加入与75μl Lipofectamine混合的30μg的量的DNA，并将平板在37℃温育过夜。培养基在转染后24、48和72小时除去并保存，用于分泌的可溶性蛋白，或丢弃用于膜结合蛋白。

细胞表面染色

用编码全长狂犬病G蛋白的构建体转染的细胞在转染48小时后收获，并与不同浓度的HuMab一起温育。通过藻红蛋白标记的抗人IgG(Jackson)检测HuMabs的结合，并使用FACScan和CellQuest软件(Becton Dickinson)进行流式细胞术。

狂犬病假病毒分析

狂犬病假病毒测定是体外感染/中和测定，其利用由缺乏天然糖蛋白的慢病毒产生的狂犬病假型病毒颗粒(RABVpp)，并工程化以含有全长膜结合狂犬病G糖蛋白。RABVpp通过共转染膜结合狂犬病G糖蛋白和携带萤光素酶基因的慢病毒骨架产生。RABVpp特异性感染细胞系，如幼仓鼠肾细胞(BHK)或293细胞，并可由针对狂犬病包膜糖蛋白(例如17C7/2B10)的抗体中和。当RABVpp感染细胞时，其递送可以测量其表达(光)的萤光素酶基因。狂犬病假病毒检测法在分光光度计输出时定量更多，比需要活狂犬病病毒的RFFIT检测更安全。该测定还具有以下优点：可评估来自任何感兴趣的狂犬病病毒的G糖蛋白，因为一些天然狂犬病分离物难以适应RFFIT测定的细胞培养。

仓鼠中的疫苗干扰研究

根据WHO Essen时间表，将未感染的雌性叙利亚金仓鼠组与狂犬病疫苗(赛诺菲巴斯德)一起施用狂犬病mAb或HRIG以进行暴露后预防。动物在相对腿的腓肠肌中接受疫苗和抗体注射。注射的第一天包括指定的抗体和疫苗，随后在第3、7、14和28天进行额外剂量的狂犬病疫苗。在第7、21、35和49天，通过隐静脉从仓鼠获得血清样品。施用的疫苗剂量是人剂量的5％，且HRIG的剂量是20IU/Kg的人剂量。以三种剂量评估由17C7和2B10组成的单克隆抗体鸡尾酒(R172)：(1)1mg/kg的17C7:2B10以1:1比率；(2)0.1mg/kg的17C7:2B10以1:1比率；和(3)1.1mg/kg的17C7:2B10以10:1比率。通过ELISA和RFFIT测试仓鼠血清的抗狂犬病抗体应答。每个测试组包括12-18只动物。进行统计分析以比较测试组之间抗体浓度的差异。

在致死攻击的仓鼠模型中的暴露后预防(PEP)

雌性叙利亚金仓鼠在第1天通过在腓肠肌或咬肌中肌内注射使用狂犬病病毒的攻击。攻击后24小时(第0天)，在接种部位肌内注射指定抗体(R172或HRIG)，并在对侧肢体肌内注射狂犬病疫苗开始PEP。在第3天、第7天、第14天和第28天施用额外的疫苗剂量，遵循用于人类暴露的WHO Essen PEP给药方案。每个治疗组包括12只或21只动物，并且每天两次观察所有动物45天，包括评估整个外观和评估狂犬病特异性临床体征，例如癫痫发作、肢体瘫痪、瘫痪或自残。对显示狂犬病征兆的动物实施安乐死。通过直接荧光抗原(DFA)染色脑干，在所有安乐死的动物中确认狂犬病感染。还通过DFA染色测试每个测试组中存活的动物的子集(50％)以确认狂犬病病毒的阴性染色。

实施例2.抗狂犬病单克隆抗体2B10的生成

含有人免疫球蛋白基因和灭活的小鼠重链和κ轻链基因的转基因小鼠(Bristol-Myers Squibb；Medarex HuMab小鼠)用1/10人剂量的和佐剂RIBI免疫10次免疫。将小鼠与P3X小鼠细胞融合以产生杂交瘤。首先使用人IgG捕获ELISA对杂交瘤筛选分泌人IgG的细胞。2B10鉴定为人IgG，然后在狂犬病糖蛋白ELISA中测试以证明与狂犬病病毒的结合。从杂交瘤2B10培养物制备抗体并通过蛋白A层析纯化。如下所述，将2B10抗体随后用于中和快速荧光聚焦抑制试验(RFFIT)中的狂犬病病毒。

实施例3.抗狂犬病单克隆抗体2B10序列的确定

对2B10杂交瘤进行RT-PCR以使用靶向人重链基因可变区的引物鸡尾酒确定抗体重链基因的序列。设计正向引物以与转基因小鼠中表达的所有人重链基因退火，并且反向引物对包括IgG1和IgG3的转基因小鼠中表达的人IgG恒定基因是特异性的。对PCR产物进行测序并推导氨基酸序列。将2B10抗体确定为IgG3抗体，其中VHOrph 44作为V区，D3-9作为D区并且JH4作为J区。为有效表达并纯化2B10抗体，2B10抗体的可变区随后与IgG1恒定区克隆入表达载体并表达为IgG1抗体。

2B10轻链序列通过轻链蛋白片段的质谱分析确定为VKIII A27轻链。随后使用VKIII A27轻链基因特异性引物序列来扩增2B10的轻基因以确定序列(表1)。

表2. 2B10的种系信息

实施例4.通过CVS-11逃逸诱变鉴定2B10结合位点

在中和浓度的2B10存在下将CVS-11在MNA细胞上培养以选择耐2B10中和的狂犬病病毒。进行快速荧光中和抑制测试(RFFIT)分析以鉴定在2B10存在下可生长的病毒(图1)。从抗性病毒分离RNA，反转录并测序以确定赋予抗性的G糖蛋白的部分。鉴定了33位从谷氨酸到赖氨酸(E33K)的单一改变。位置33是狂犬病病毒G糖蛋白的抗原位点II的一部分(狂犬病病毒G糖蛋白的氨基酸残基33-42和198-200)。

实施例5.通过细胞表面染色确认E33

通过将E33K突变克隆到CO-CVS背景中证实逃逸病毒。重组蛋白在293T细胞中表达。细胞用2B10染色并通过FACS测试。使用抗狂犬病病毒人单克隆抗体17C7(参见例如美国专利号7,727,532和8,226,952，其各自以全文引用的方式并入本文中)用作阳性对照。FACS确认2B10不识别E33K突变。

实施例6.通过丙氨酸扫描诱变确认抗原性位点II

将来自ERA的表面表达的密码子优化的重组G糖蛋白中的抗原性位点II的氨基酸残基33-42和198-200从它们的野生型残基改变为丙氨酸(丙氨酸扫描)以探测它们对2B10结合的重要性。还测试了位置33中针对实验室逃逸突变(E33K)和Lasiurus蝙蝠残基(E33D)的关键改变。将突变体转染至293T细胞并在细胞表面表达。通过荧光标记的二级抗体检测2B10识别G糖蛋白，并通过流式细胞术分析。单独的荧光强度用抗狂犬病病毒HuMab 17C7结合信号作为G糖蛋白表达的内部对照标准化。结果如下所示。确认残基33对2B10结合至关重要(图2)。

实施例7.2B10可中和浓度非常低的狂犬病病毒分离株

通过RFFIT分析测试实验室菌株CVS-11的中和。制备2B10的稀释物并加入用于感染MNA细胞的狂犬病病毒保存物中。然后使用狂犬病病毒核蛋白的荧光标记抗体鉴定感染灶。计算病灶，记录将病灶数量减少50％的蛋白浓度(EC₅₀)。2B10非常强烈地中和大多数分离株，EC₅₀值小于10ng。当针对对照株CVS-11进行检测时，以重量计2B10比人类狂犬病免疫球蛋白(HRIG)或17C7强200倍以上(表3)。

表3.通过RFFIT的CVS-11的EC₅₀中和

实施例8.2B10可中和多种的狂犬病病毒街道分离物的

如RFFIT测试所证明的，2B10可以中和多种狂犬病病毒街道分离株。相HRIG或17C7，2B10明显需要较少的蛋白来有效地中和来自各种陆地和蝙蝠分离物的狂犬病病毒分离物(表4)。

表4.通过RFFIT由2B10的街道狂犬病病毒的EC₅₀中和

实施例9.2B10与17C7组合显示出广泛的中和

当2B10与中和狂犬病HuMab抗体17C7组合使用时，两种抗体的鸡尾酒(R172)在中和广谱狂犬病分离物方面非常有效。将17C7和2B10以1:1组合(2B10+17C7)的混合物针对一组狂犬病分离物的中和在RFFIT测定中在具有标准化方法学的两个独立实验室中进行测试(表5A和5B)。除非另有说明，所报道的EC₅₀值是多次测试重复的算术平均值。对所有测试的陆地和蝙蝠分离物都证明了强烈的中和作用。2B10和17C7抗狂犬病病毒抗体的组合在几乎所有测试病毒的以重量计出乎意料地比HRIG更有效，并且在某些情况下比单独17C7或2B10更有效(例如CA臭鼬、NC臭鼬、蝙蝠3860和蝙蝠TN410)。2B10和17C7组合针对这些病毒的活性表明，以重量计该组合比HRIG更有效，并且具有比单独17C7或2B10更宽的中和。

表5A.通过2B10+17C7RFFIT(测试A)的街道狂犬病病毒的EC₅₀中和

a.具有相同起始浓度抗体的测定的分离物显示RFFIT载玻片的第一个孔(1：5稀释)中高于50％中和阈值的结果，以及其他测定显示RFFIT载玻片的第一个孔中低于50％中和阈值的结果。对于具有小于50％中和的结果的测定，使用为第一个孔计算的抗体浓度(即起始浓度除以5)来确定平均EC 50。#^#HRIG 1IU/ml＝10³μg/ml

表5B.通过2B10+17C7RFFIT(测试B)的街道狂犬病病毒的EC₅₀中和

b TCID50<30.对于每种测定中的病毒剂量，可接受的TCID50范围是30-100。如果TCID50<30或>100，则报告结果，只要满足以下任一标准：(1)如果在2种不同浓度(例如2IU/mL和6IU/mL)测试HRIG，在2个浓度HRIG的EC50滴度在预期比例的50％以内，测定中所有抗体制剂的结果被认为是有效的；或(2)如果在2个不同浓度下测试HRIG但在2种不同浓度测试个体抗体，所测得的该抗体的EC50滴度比率在预期比率的50％以内，在该测定中用该抗体获得的结果被认为是有效的。

c来自单个RFFIT测定的结果，在该测定的可解释范围内具有50％中和滴度。

实施例10.体外狂犬病假病毒感染/中和试验

由于2B10的中和机制是阻断狂犬病G-糖蛋白及其受体的相互作用，所以基于狂犬病G-糖蛋白的假型病毒可用于测量抗体的效价。

狂犬病假病毒测定是体外感染/中和测定，其利用由缺乏天然糖蛋白的慢病毒产生的狂犬病假型病毒颗粒(RABVpp)，并且工程化以含有全长膜结合狂犬病G-糖蛋白和萤光素酶基因。RABVpp特异性感染细胞系，如幼仓鼠肾细胞(BHK)或293细胞，并可由针对狂犬病包膜糖蛋白(例如2B10或2B10与17C7组合)的抗体中和。当RABVpp感染细胞时，其递送可以测量其表达(光)的萤光素酶基因。该测定还具有以下优点：可以评估来自任何感兴趣的狂犬病病毒的G糖蛋白，因为某些天然狂犬病分离物不可用或难以适应于RFFIT测定的细胞培养。

2B10、17C7和2B10与17C7组合能够用ERA G糖蛋白中和RABVpp(图3)。值得注意的是，2B10尤其可以中和“秘鲁蝙蝠”RABVpp，它抵抗17C7的中和(图4)。2B10也可以中和“佛罗里达浣熊”RABVpp，其抵抗中17C7的中和(图5)。这些研究证明了2B10在中和未由已知的抗狂犬病病毒中和抗体(如17C7和HRIG)中和的狂犬病病毒中的优势。

实施例11.疫苗干扰研究

人类和动物中的先前研究表明，与仅疫苗相比，当将HRIG与疫苗一起给予时，通过产生抗狂犬病抗体测量的对狂犬病疫苗的免疫应答减少。进行动物实验以研究2B10与17C7(R172)组合对狂犬病疫苗的免疫应答的作用。该实验根据WHO埃森推荐的暴露后预防疗程设计(图6A)。如图6B所示，将12-18只动物包括在每个测试组中，并且将每个R172测试组中的平均RFFIT滴度与HRIG加疫苗对照组进行比较，如图6B所示。

取决于配方，R172抗体鸡尾酒对疫苗应答有不同的作用。剂量为1mg/kg的R172(17C7/2B10 1:1比例)组比HRIG更大程度地干扰疫苗应答。当1:1鸡尾酒组合的剂量降低至0.1mg/kg时，或者当给予总计1.1mg/kg的R172的17C7/2B10 10:1比率时(p<0.05)，观察到对HRIG的可比较的响应。值得注意的是，与HRIG组相比，(1：1)1mg/kg和(10:1)的1.1mg/kg的R172在第7天显示出显着更高的中和活性(p<0.05)。这些实验确定了不会比HRIG更加干扰狂犬病疫苗应答的2B10和17C7混合物(R172)的剂量，并选择以在暴露后预防实验中评估。

实施例12.致死的攻击仓鼠模型中的暴露后预防(PEP)

仓鼠是已建立的狂犬病发病机制模型，用于治疗评估，包括暴露后预防(PEP)。在该模型中，仓鼠在第0天在腓肠肌(或咬肌)中受到狂犬病病毒的攻击，然后在病毒攻击部位用中和抗体(2B10+17C7[R172]或HRIG)处理，并第1天在相反的腓肠肌中施用0.05％人剂量的狂犬病疫苗。在第3、7、14和28天施用额外剂量的疫苗以完成PEP方案(图7A)。接受PEP的动物监测狂犬病的体征或症状45天。通过直接荧光抗体染色测试在研究过程中死亡的动物或对可疑狂犬病的临床体征实施安乐死。

使用陆地狂犬病变体德克萨斯土狼323R评估R172mAb鸡尾酒保护暴露于致死性狂犬病病毒攻击的仓鼠的能力。德克萨斯土狼323R分离株糖蛋白含有“E33N336R346”表位变体，它是Genbank数据库中北美和全球报道的最常见的变体。来自CDC与德克萨斯土狼323R狂犬病分离株的先前仓鼠数据显示，在病毒攻击后24小时启动使用PEP(由HRIG加狂犬病疫苗组成)的70-100％保护。相反，100％未接受治疗或仅使用疫苗处理的动物发展狂犬病，突出了病毒攻击的严重性。

将来自未感染仓鼠的疫苗干扰研究的数据(实施例11)用于鉴定R172的剂量以在PEP模型中检查。这些R172剂量与狂犬病疫苗(Sanofi Pasteur)组合评估，作为仓鼠攻击研究中的暴露后预防(图7A)。

每群中的12只雌性叙利亚金仓鼠用2.5x 10³FFU的狂犬病病毒德克萨斯土狼323R进行攻击。在未治疗的群和接受不相关的HuMAb加疫苗的群中，观察到100％的死亡率(图7B)。未经处理的动物的中位存活为11天，接受疫苗和不相关的MAb的中位存活为10天。接受20IU/kg的HRIG和疫苗的标准看护PEP方案的群具有75％的存活率。有趣的是，含有R172的PEP方案以剂量依赖性方式保护仓鼠。所有用R172(17C7/2B10 10:1比率)以1.1mg/kg处理的动物都存活下来，以0.1mg/kg给予R172(17C7/2B10 1:1比率)的动物的存活率为75％，接受0.01mg/kg R172(17C7/2B10 1:1比率)的动物的存活率为42％(图7B)。在研究期间死亡的所有动物均确认具有狂犬病病毒。

还使用蝙蝠狂犬病变体“3860蝙蝠”评估了R172mAb鸡尾酒保护暴露于致死性狂犬病病毒攻击的仓鼠的能力。3860蝙蝠狂犬病病毒是从亚利桑那的Pipistrellus hesperus蝙蝠中分离出来的，并适应CDC的细胞培养。3860蝙蝠分离物含有“E33N336S346”表位变体，其具有在细胞培养适应(CDC)期间获得的独特的I338T突变。I338T突变位于抗原性位点III内并消除RFFIT中的17C7中和；2B10保留了针对I338T变体的活性。

每个群中的21只仓鼠用1.2x 10⁴FFU的3860蝙蝠病毒进行攻击。在未治疗的群中，5％的动物存活，并且在用无关mAb加狂犬病疫苗处理的群中，10％的动物存活。这些群中的其余动物发展为狂犬病。接受20IU/kg HRIG和疫苗的标准看护PEP方案的群具有62％的存活率。所有用R172(17C7/2B1010:1比率)加1.1mg/kg疫苗的动物存活，除了在晚期时间点死于非狂犬病相关原因的两只动物(第35天(损伤)和第40天(可能败血症))。来自这两只动物的大脑由DFA测试为狂犬病阴性。所有用R172(17C7/2B10 1:1比率)加上0.1mg/kg疫苗的动物存活，33％接受0.01mg/kg R172(17C7/2B10 1:1比率)加上疫苗的动物存活，而本群中的其余动物发展狂犬病(图7C)。在所有发展狂犬病的动物中验证了狂犬病的感染。鉴于观察到对含有I338T突变的3860蝙蝠病毒储存体外17C7中和的抗性，2B10mAb可能提供了对3860蝙蝠病毒的致死攻击的体内保护。

总之，这些PEP实验证明R172人单克隆抗体鸡尾酒在建立的致死狂犬病挑战的仓鼠模型中是保护性的。分别使用1.1mg/kg R172(10:1比率)和0.1mg/kg R172(1:1比率)作为被动抗体组分的R172PEP方案的治疗证实在致死攻击模型中75-100％的存活率，其与接收20IU/kg HRIG和疫苗的标准看护组中62-75％的存活率是可比较的。这些体内动物数据支持将R172单克隆抗体鸡尾酒用作暴露于疑似狂犬病动物的人类的潜在PEP疗法。

其他实施方案

尽管为了清楚理解的目的已经通过举例说明和实例详细描述了前述发明，但是说明书和实施例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地通过引用整体并入。

序列表

<110> 马萨诸塞大学

<120> 针对狂犬病的人抗体及其用途

<130> 50720-013WO2

<150> US 62/204,894

<151> 2015-08-13

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Phe Ala Met His

1 5 10

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Thr Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Cys Ala Arg Asp Asn Ala Leu Arg Ser Phe Asp Trp Leu Phe Tyr Ser

1 5 10 15

Phe Asp Tyr

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

Gln Arg Tyr Gly Ser Ser Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser

20 25

<210> 8

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 9

<211> 29

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr

20 25

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 11

<211> 23

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys

20

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 12

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 13

<211> 32

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 13

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 14

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 15

<211> 124

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Phe

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Asn Ala Leu Arg Ser Phe Asp Trp Leu Phe Tyr Ser Phe Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 16

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Gly Ser Ser Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 17

<211> 454

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Phe

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Asn Ala Leu Arg Ser Phe Asp Trp Leu Phe Tyr Ser Phe Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

325 330 335

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 18

<211> 214

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 18

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Gly Ser Ser Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 19

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 19

Thr Tyr Ala Met His

1 5

<210> 20

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 20

Val Val Ser Tyr Asp Gly Arg Thr Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 21

Glu Arg Phe Ser Gly Ala Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 22

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 22

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 23

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 24

Gln Gln Arg Asn Asn Trp Pro

1 5

<210> 25

<211> 125

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Val Ser Tyr Asp Gly Arg Thr Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Arg Phe Ser Gly Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

<210> 26

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 26

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Ser Cys Gln Gln Arg Asn Asn Trp Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 27

<211> 1365

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 27

atggaggttc agctggtgca gtctggggga ggcttggtac atcctggggg gtccctgaga 60

ctctcctgtg caggctctgg attcaccttc agttactttg ctatgcactg ggttcgccag 120

gctccaggaa aaggtctgga gtgggtatca actattggta ctggtggtgg cacatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctccttgtat 240

cttcaaatga acagcctgag agccgaggac atggctgtgt attactgtgc aagagataac 300

gcattacgat cttttgactg gttattttac tcctttgact actggggcca gggaaccctg 360

gtcaccgtct cctcagcttc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc accctcctcc 420

aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 480

ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 540

gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 600

ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 660

aagagagttg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 720

gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 780

atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 840

gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 900

gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 960

tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1020

gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1080

ccatcccggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1140

tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1200

accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg 1260

gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1320

cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaa 1365

<210> 28

<211> 645

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 28

atggaaattg tgttgacgca gtctccaggc accctgtctt tgtctccagg ggaaagagcc 60

accctctcct gcagggccag tcagagtatt agcagcagct acttagcctg gtaccagcag 120

aaacctggcc aggctcccag gctcctcatc tatggtgcat ccagcagggc cactggcatc 180

ccagacaggt tcagtggcag tgggtctggg acagacttca ctctcaccat cagcagactg 240

gagcctgaag attttgcagt gtattactgt cagcggtatg gtagctcata cacttttggc 300

caggggacca agctggagat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600

ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645

Claims

1.与狂犬病病毒G蛋白特异性结合的抗体，其中所述抗体包含重链可变(VH)域，其含有下述互补决定区(CDR)：

(a)含有GFTFSYFAMH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的CDR-H1；

(b)含有TIGTGGGTYYADSVKG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的CDR-H2；和

(c)含有CARDNALRSFDWLFYSFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的CDR-H3。

2.权利要求1的抗体，其中所述VH结构域进一步包含下述重链可变区框架区(FR)：

(a)含有EVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCAGS(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列的FR-H1；

(b)含有WVRQAPGKGLEWVS(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的FR-H2；

(c)含有RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDMAVYY(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的FR-H3；和

(d)含有WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的FR-H4。

3.权利要求1或2的抗体，其中所述VH结构域包含含有与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少90％序列同一性的序列。

4.权利要求3的抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。

5.与狂犬病病毒G蛋白特异性结合的抗体，其中所述抗体包含含有下述CDR的轻链可变(VL)域：

(a)含有RASQSISSSYLA(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的CDR-L1；

(b)含有GASSRAT(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的CDR-L2；和

(c)含有QRYGSSYT(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的CDR-L3。

6.权利要求5的抗体，其中所述VL结构域进一步包含下述轻链可变区FR：

(a)含有EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列的FR-L1；

(b)含有WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列的FR-L2；

(c)含有GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列的FR-L3；和

(d)含有FGQGTKLEIK(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列的FR-L4。

7.权利要求5或6的抗体，其中所述VL结构域包含含有与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少90％序列同一性的序列。

8.权利要求7的抗体，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。

9.权利要求1-8任一项的抗体，其中所述抗体包含下述6个CDR：

(a)含有GFTFSYFAMH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的CDR-H1；

(b)含有TIGTGGGTYYADSVKG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的CDR-H2；

(c)含有CARDNALRSFDWLFYSFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的CDR-H3；

(d)含有RASQSISSSYLA(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的CDR-L1；

(e)含有GASSRAT(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的CDR-L2；和

(f)含有QRYGSSYT(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的CDR-L3。

10.权利要求9的抗体，其中所述VH结构域包含含有与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少90％序列同一性的序列且所述VL结构域包含含有与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少90％同一性的序列。

11.权利要求10的抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列且所述VL结构域包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。

12.一种分离抗体，其与权利要求1-11任一项的抗体竞争对于狂犬病病毒G蛋白的结合。

13.一种分离的抗体，其与权利要求1-11任一项的抗体结合狂犬病病毒G蛋白上相同的表位。

14.权利要求1-13任一项的抗体，其中所述抗体是单克隆、人、人源化或嵌合的。

15.权利要求1-14任一项的抗体，其中所述抗体是结合狂犬病病毒G蛋白的抗体片段。

16.权利要求15的抗体，其中所述抗体片段选自下组：Fab、Fab’-SH、Fv、scFv和(Fab’)₂片段。

17.权利要求1-14任一项的抗体，其中所述抗体是全长抗体。

18.权利要求1-17任一项的抗体，其中所述抗体是IgG抗体。

19.权利要求18的抗体，其中所述IgG抗体是IgG1抗体。

20.权利要求17-19任一项的抗体，其中所述全长抗体包含(a)含有与SEQ ID NO:17的氨基酸序列至少90％的序列同一性的重链序列；(b)含有与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少90％的序列同一性的轻链序列；或(c)如(a)中的重链序列和如(b)中的轻链序列。

21.权利要求20的抗体，其中所述全长抗体包含(a)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链序列；(b)含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链序列；或(c)如(a)中的重链序列和如(b)中的轻链序列。

22.权利要求1-21任一项的抗体，其中所述抗体结合狂犬病病毒G蛋白抗原位点II中的表位。

23.权利要求22的抗体，其中所述表位包含氨基酸残基Glu33。

24.权利要求23的抗体，其中所述表位进一步包含氨基酸残基Cys35。

25.包含权利要求1-24任一项的抗体的药物组合物。

26.权利要求25的药物组合物，进一步包含与狂犬病病毒G蛋白的不同表位结合的第二抗体。

27.权利要求26的药物组合物，其中所述第二抗体包含下述6个CDR：

(a)含有TYAMH(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列的CDR-H1；

(b)含有VVSYDGRTKDYADSVKG(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列的CDR-H2；

(c)含有ERFSGAYFDY(SEQ ID NO:21)的氨基酸序列的CDR-H3；

(d)含有RASQSVSSYLA(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列的CDR-L1；

(e)含有DASNRAT(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列的CDR-L2；

(f)含有QQRNNWP(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列的CDR-L3。

28.权利要求27的药物组合物，其中所述第二抗体包含(a)含有与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的VH结构域和(b)含有与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的VL结构域。

29.权利要求28的药物组合物，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列且所述VL结构域包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。

30.权利要求25-29任一项的药物组合物，进一步包含药物上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。

31.权利要求25-30任一项的药物组合物，其中所述药物组合物经配制用于治疗具有狂犬病病毒疾病的受试者。

32.权利要求25-30任一项的药物组合物，其中所述药物组合物经配制用于治疗处于发展狂犬病病毒感染的风险的受试者。

33.编码权利要求1-24任一项的抗体的分离的核酸。

34.包含权利要求33的核酸的载体。

35.包含权利要求34的载体的宿主细胞。

36.权利要求35的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

37.权利要求36的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

38.权利要求35的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。

39.权利要求38的宿主细胞，其中所述原核细胞是大肠杆菌。

40.产生权利要求1-24任一项的抗体的方法，所述方法包括在培养基中培养权利要求35的宿主细胞。

41.权利要求40的方法，其中所述方法进一步包括从所述宿主细胞或所述培养基回收所述抗体。

42.治疗具有狂犬病病毒感染的受试者的方法，包括对所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-24任一项的抗体或权利要求25-32任一项的药物组合物，由此治疗所述受试者。

43.治疗处于发展狂犬病病毒感染的受试者的方法，包括对所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-24任一项的抗体和权利要求25-32任一项的药物组合物，由此治疗所述受试者。

44.权利要求42或43的方法，其中所述抗体以约0.001mg/kg至约10mg/kg的剂量施用至所述受试者。

45.权利要求44的方法，其中所述抗体以约0.01mg/kg至约10mg/kg的剂量施用至所述受试者。

46.权利要求45的方法，其中所述抗体以约0.1mg/kg至约10mg/kg的剂量施用至所述受试者。

47.权利要求46的方法，其中所述抗体以约1mg/kg至约10mg/kg的剂量施用至所述受试者。

48.权利要求42-47任一项的方法，其中对所述受试者施用至少一个剂量的所述抗体或所述药物组合物。

49.权利要求48的方法，其中对所述受试者施用至少两个剂量的所述抗体或所述药物组合物。

50.权利要求49的方法，其中对所述受试者施用至少三个剂量的所述抗体或所述药物组合物。

51.权利要求50的方法，其中对所述受试者施用至少四个剂量的所述抗体或所述药物组合物。

52.权利要求51的方法，其中对所述受试者施用至少五个剂量的所述抗体或所述药物组合物。