JP2023090702A - 家禽における壊疽性腸炎に対するワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、家禽における壊疽性腸炎に対するワクチンを調製するのに有用なポリペプチドに関する。より具体的に言うと、本出願は、家禽におけるウェルシュ菌感染に関連する壊疽性腸炎に対するワクチンを調製するのに有用なウェルシュ菌線毛ポリペプチドに関する。
本発明の一側面は、単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチドを提供する。別の側面において、本発明は、単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド(線毛ポリペプチドのバリアント)から選択される免疫原性ポリペプチドを提供する;線毛ポリペプチドのフラグメント;および、バリアントのフラグメント、ここで線毛ポリペプチド、バリアント、ポリペプチドのフラグメント、およびバリアントのフラグメントは、家禽において免疫原性である。少なくとも一態様において、線毛ポリペプチドは、CnaAポリペプチドである。少なくとも一態様において、線毛ポリペプチドは、FimAポリペプチドである。少なくとも一態様において、線毛ポリペプチドは、FimBポリペプチドである。少なくとも一態様において、線毛ポリペプチドは、組み立てられた線毛である。
本発明の更なる特色は、以下の記載および添付の図から明らかになるだろう、すなわち:
家禽における壊疽性腸炎と関連するウェルシュ菌の株において同定されたVR-10B遺伝子座が(Lepp D et al, Journal of Bacteriology (2013) 195: 1152-1166)、粘着性の線毛をコードすることがわかった6つの推定遺伝子を含有することが、本願出願人によってわかった:構造線毛サブユニットをコードする3つの遺伝子(cnaA、fimA、およびfimB)、およびおそらく線毛アセンブリに関わる2つのソルターゼおよびシグナルペプチダーゼをコードする遺伝子。VR-10B遺伝子座の線図表現は、図1中に示される。
本発明の他の特徴は、発明の原理を例という方法によって説明する以下の非限定的例から、明白になるだろう。
3つの線毛サブユニット(cnaA、fimA、およびfimB)のためのコード領域は、コドンを最適化し、予測されたN末端シグナルペプチドおよびC末端細胞壁局在化シグナルLPXTG膜貫通ドメインを除去するために、トランケートした。C末端ドメインは、線毛アセンブリの間、取り除かれると予測される疎水性領域である。トランケートされたコドンを最適化されたコード領域を、合成し(Integrated DNA Technologies, Coralville, USA)、製造業者(Takara Bio USA, Mountain View, California, USA)の説明書に従うIn-Fusion(商標)クローニングによってpET28a発現ベクター(MilliporeSigma, Etobicoke, Ontario, Canada)にクローニングし、配列を確認し、その後大腸菌BL21細胞に形質転換した。形質転換されたコロニーを、50μg/mlのカナマイシンおよび1mMのIPTGで補充された1LのLBブロス中で、振盪によって、37℃で18hの間、増殖させた。培養物を、ペレット化し、結合用緩衝液20ml(20mMのNaPO4、0.5MのNaCl、30mMのイミダゾール)中に再懸濁し、氷上での10分間の超音波処理によって溶解した。(10sパルス、20s停止)。細胞可溶化物を、AEKTA(商標)prime plusシステム上で、50~500mMのイミダゾールのグラディエントを使用して、HisTrap(商標)FFCrudeカラム(GE Healthcare, Montreal, Canada)上で、固有の条件のもとで精製した。1mlの分画を収集し、そして、280nmのピークを提示する分画を、プールし、そして、Pierce(商標)Protein Concentrators(9K分子量カットオフ)(Fisher Scientific, Unionville, Ontario, Canada)で濃縮し、そして、Zeba(商標)Spin 7K分子量カットオッフ脱塩カラム(Fisher Scientific)を使用して、脱塩した。精製されたタンパク質の定量化を、製造業者の説明書に従って、BCA(ビシンコニン酸)タンパク質アッセイキット(Fisher)を使用して、遂行した。ポリペプチドを、SDS-PAGEおよびクーマシー染色によって視覚化した。
以前本質的に記載されているように(Yu, Q., Lepp, D., Mehdizadeh Gohari, I., Wu, T., Zhou, H., Yin, X., Yu, H., Prescott, J.F., Nie, S.P., Xie, M.Y., Gong, J., 2017. The Agr-like quorum sensing system is required for necrotic enteritis pathogenesis in poultry caused by Clostridium perfringens. Infection and Immunity 85(6): e00975-16)、3つの線毛サブユニット遺伝子(cnaA、fimA、およびfimB)を、ClosTron突然変異誘発による有毒なウェルシュ菌株CP1において、それぞれ挿入して不活化し(Heap, J.T., et al, Methods Mol. Biol. (2010), 646: 165-182)、線毛サブユニット遺伝子(CP1ΔcnaA、CP1ΔfimA、およびCP1ΔfimB)のそれぞれに関してCP1ヌル変異体を発生させた。簡潔には、ClosTronイントロン-ターゲティング領域を、以下の位置に挿入するために、www.clostron.comで実施されるPerutkaアルゴリズム:cnaAセンス鎖の塩基対(bp)183、fimAセンス鎖のbp231、およびfimBセンス鎖のbp273を使用して、設計した。イントロン-ターゲッティング領域は、ClosTronプラスミドpMTL007C-E2に、DNA2.0(Menlo Park, CA, USA)によって合成され、クローニングされた。その結果としてのプラスミドを、以前に軽微な修飾とともに記載のCP1中に個別に電気穿孔した(イメージ1)。簡潔には、5mlのTGYブロス(3%のトリプトン、2%のグルコース、1%の酵母抽出物)中での、37℃で嫌気的にオーバーナイトでの増殖の後、CP1を、50mlのTGYに継代培養し、指数増殖期(600nm[OD600](0.8)の光学密度)へと増殖させた。該細胞を、20℃で10分間、6,000gの遠心分離によって収穫し、10mlのスクロースエレクトロポレーション緩衝液(SEB)(272mMのスクロース、1mMのMgCl2、5mMのNa2HPO4、pH7.4)で洗浄し、その後5mlのSEB中で再懸濁した。アリコート(0.2ml)を、前冷却されたキュベット(0.2-cmgap)中で2μgの濃縮されたプラスミドDNAを混合し、そして、プラスミドDNAを、Bio-Rad GenePulser Xcell装置(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を使用したエレクトロポレーション(1,000V、25F)によって、細胞に導入した。形質転換の直後に、混合物を、1mlのTGYブロスへ転送し、そして、嫌気的にオーバーナイトで37℃3hの間インキュベートし、続いて、形質転換体を選択するために、15μg/mlのチアンフェニコールを含有するTGY寒天上へプレーティングした。得られたコロニーを、成分を選択するために、10μg/mlのエリスロマイシンを含有するTGY寒天上へ継代培養し、その後シャトルベクターをキュアリングするために10日連続で継代した。エリスロマイシン耐性であるが、チアンフェニコールに感受性であるそれらのクローンは、更なる分析のために選択された。
2つのワクチン接種実験を、ニワトリのチャレンジモデルにおける壊疽性腸炎(Ne)から防御するための、3つの精製されたヒスチジンタグを付けられた組み換え線毛サブユニットの能力を評価するために、実行した。市販の日令雄ホワイトプリマスロックのブロイラーニワトリを、ランダムに実験群(n=15-17)に分けて、単離ユニットの中で別々の部屋に収容した。実験設計の概要を、表2に示す。加えて、CP1ΔfimAおよびCP1ΔfimB変異体を、同じモデルにおいて、毒性評価した。
最初の実験に、アジュバントのみのコントロール、CnaA、またはFimAのいずれかのワクチン接種をされた18羽のトリの3つの群を含めた。8日目および20日目に、Quil-A(商標)アジュバント(50μg)を含有する200μlのリン酸塩緩衝食塩水(PBS)および組み換え線毛ポリペプチド(50μg)を、各トリの胸筋の筋肉内(i.m.)に注射し、そして、トリを31日目に安楽死させた。
0、肉眼的病変なし;
1、薄いかまたはもろい壁;
2、局所の壊疽または潰瘍(1~5の病巣);
3、局所の壊疽または潰瘍(6~15の病巣);
4、局所の壊疽または潰瘍(16以上の病巣);
5、長さ2~3cmの壊疽の斑;
6、分野の症例に典型的な瀰漫した壊疽。
第2の実験は、アジュバントのみのコントロール、CnaA、FimB、またはCnaA、FimA、およびFimBの組み合わせのいずれかによるワクチン接種を皮下(s.c.)にされた、18羽のトリの4つの群から、成った。この実験において、各トリを、7、14、および19日目に、50μgのQuil-A(商標)アジュバントと組み合わせた50μgの組み換えポリペプチドによって、皮下に免疫化し、そして、血清を、抗体力価の測定のために、7、19、および29日目に収集した。
トリに、26および27日目に、実験1で記載のウェルシュ菌株CP1により送り込みでチャレンジし、そして29日目に、トリを安楽死させ、そして、腸の病変をスコア化した。
免疫化されなかった実験2における18羽のトリの3つの群に、26および27日目の1日2回、例2に記載のように調製されたCP1、CP1ΔfimA、またはCP1ΔfimBによる送込みにより、チャレンジした。29日目に、トリを安楽死させ、そして、壊疽性腸炎病変を、例3に記載のようにスコア化した。図7において表された結果から示されるように、CP1ΔfimAまたはCP1ΔfimB変異体株も、チャレンジされたトリの疾患を引き起こさず、機能的な線毛が、壊疽性腸炎の病因のために要求されるように見えることを示した。
ウェルシュ菌株CP1およびCP1線毛サブユニット変異体:
表面ポリペプチドを、Chang, C., Huang, I.-H., Hendrickx, A.P.A., Ton-That, H. 2013. Visualization of Gram-positive Bacterial Pili, In: Delcour, H.A. (Ed.) Bacterial Cell Surfaces: Methods and Protocols. Humana Press, Totowa, NJ, 77-95の方法を使用して、ウェルシュ菌株CP1、および、例3に記載の線毛サブユニット変異体CP1ΔcnaA、CP1ΔfimA、およびCP1ΔfimBから抽出した。株を、37℃で、嫌気的にTGY培地(3%のトリプトン、2%のグルコース、1%の酵母抽出物)中で終夜増殖させ、10mlのTGY培地へ1:100で継代培養し、OD600~1に増殖させた。細胞を、6,000×gで5分間ペレット化し、SMM緩衝液、pH6.8(0.5Mのスクロース、10mMのMgCl2、10mMのマレアート)中で、一回洗浄した。細菌ペレットを、1mlのSMM緩衝液に再懸濁し、ムラミダーゼ緩衝液(2mMの酢酸、48mMの酢酸ナトリウム)中の5u/μlムタノリシン(Sigma)の60μl、および0.1Mフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)(Sigma)の10μlをそれに加えた。一定の回転による37℃での少なくとも4hの間のインキュベーションの後、プロトプラストを、20,000×gで5分間ペレット化し、そして、細胞壁タンパク質を含有する上清分画を取り除いた。タンパク質を、1mlにつき81μlの100%(w/v)トリクロロ酢酸(TCA)(Sigma)の添加、および4℃での終夜インキュベーションによって、沈殿させた。4℃で20分間の20,000×gの遠心分離に続いて、タンパク質ペレットを、アセトンによって洗浄し、50μlの試料負荷緩衝液(62.5mMトリス-HCl、pH6.8、2%SDS、20%グリセロール、4%のβメルカプトエタノール、3M尿素、0.01%ブロモフェノールブルー)中に、室温で少なくとも15分間ゆっくり再懸濁した。
家禽(CP1、JGS4141およびJGS4120)または、非家禽(株13、ATCC13124)を源とする、5つのウェルシュ菌単離物からの表面ポリペプチドの抽出を、上記のとおり遂行した。表面タンパク質抽出物(5μl)を、2つのNovex(商標)NuPAGE(商標)3~8%トリス-アセタートゲル(Fisher Scientific)上へ負荷し、150Vで1hの間、電気泳動にかけた。1つのゲルを、Bio-Safe(商標)クーマシー染色(BioRad)で染色するために使用し、そして、第2のゲルを、1×転送緩衝液(48mMトリス、39mMグリシン、20%メタノール、0.1%SDS)中で、350Vで1hの間、ポリビニレン二フッ化物(PVDF)膜上へ転送した。化学発光検出を、一次抗体としてニワトリ抗FimA血清(1:200)、およびヤギ抗ニワトリIgYアルカリ性ホスファターゼ(AP)結合二次抗体(1:2,000)を使用して、製造業者の説明書に従ってWesternBreeze(商標)化学発光キット(Life Technologies)によって遂行した。一次Abとして使用した血清を、FimAを免疫化されその結果高い抗FimA力価を提示したニワトリからのサクリファイスで得た。
ウェルシュ菌株CP1の、または、CP1ヌル変異体CP1ΔfimAおよびCP1ΔfimBの細胞を、一次抗体としてのラビット抗FimAと二次抗体としての6nmのColloidal Gold-AffiniPure(商標)ヤギ抗ラビットIgG(H+L)(min X Hu,Ms,Rat Sr Prot)(Cedarlane)を含む免疫金技法を使用して、金粒子で標識化し、そして、基本的に以前記載のように(Chang, C., Huang, I.-H., Hendrickx, A.P.A., Ton-That, H. 2013. Visualization of Gram-positive Bacterial Pili, In: Delcour, H.A. (Ed.) Bacterial Cell Surfaces: Methods and Protocols. Humana Press, Totowa, NJ, 77-95)、透過型電子顕微鏡によって、調査した。図10に示されるように、天然のCP1株の細胞は、細胞表面上の線毛構造の存在を示し、一方で、CP1ΔfimAおよびCP1ΔfimB変異体の細胞は、このような構造が欠如している。
Claims (24)
- 単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド。
- CnaAポリペプチドである、請求項1に記載の単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド。
- CnaAポリペプチドが、配列番号10および配列番号13から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド;配列番号1、配列番号4、および配列番号7から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;および、配列番号1、配列番号4、および配列番号7から選択される配列を有するポリヌクレオチドに対して、少なくとも穏やかにストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択される、請求項2に記載の単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド。
- FimAポリペプチドである、請求項1に記載の単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド。
- FimAポリペプチドが、配列番号11および配列番号14から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド;配列番号2、配列番号5、および配列番号8から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;および、配列番号2、配列番号5、および配列番号8から選択される配列を有するポリヌクレオチドに対して、少なくとも穏やかにストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択される、請求項4に記載の単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド。
- FimBポリペプチドである、請求項1に記載の単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド。
- FimBポリペプチドが、配列番号12および配列番号15から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド;配列番号3、配列番号6、および配列番号9から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;および、配列番号3、配列番号6、および配列番号9から選択される配列を有するポリヌクレオチドに対して、少なくとも穏やかにストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択される、請求項6に記載の単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド。
- 組み立てられた線毛である、請求項1に記載の単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド。
- 組み立てられた線毛が、CnaAポリペプチド、FimAポリペプチド、およびFimBポリペプチドから互いに個別に選択された1以上のサブユニットを備える、請求項9に記載の単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド。
- 請求項1~9のいずれか一項に記載の単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド、線毛ポリペプチドのバリアント;線毛ポリペプチドのフラグメント;およびバリアントのフラグメントから選択される免疫原性ポリペプチドであって、ここで、線毛ポリペプチド、バリアント、ポリペプチドのフラグメント、およびバリアントのフラグメントは、家禽において免疫原性である、前記免疫原性ポリペプチド。
- バリアントが、線毛ポリペプチドに対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または少なくとも99.9%の配列同一性を有する、請求項10に記載の免疫原性ポリペプチド。
- 請求項10または11に記載の免疫原性ポリペプチドをコードする配列を備えるポリヌクレオチド。
- 宿主細胞の免疫原性ポリペプチドの発現のために構成される、請求項12に記載のポリヌクレオチドを備えるベクター。
- 少なくとも1の請求項10または11に記載の免疫原性ポリペプチドを備える、家禽における壊疽性腸炎の処置または予防のためのワクチン。
- 少なくとも1の請求項10または11に記載の免疫原性ポリペプチドを備える、家禽におけるウェルシュ菌感染の処置または予防のためのワクチン。
- 家禽における壊疽性腸炎の処置または予防のための医薬の調製における、請求項10または11に記載の免疫原性ポリペプチドの使用。
- 家禽におけるウェルシュ菌感染の処置または予防のための医薬の調製における、請求項10または11に記載の免疫原性ポリペプチドの使用。
- 家禽に有効量の請求項10または11に記載の免疫原性ポリペプチド、または有効量の請求項14に記載のワクチンを投与することを備える、家禽における壊疽性腸炎の処置または予防の方法。
- 家禽に有効量の請求項10または11に記載の免疫原性ポリペプチド、または有効量の請求項15に記載のワクチンを投与することを備える、家禽におけるウェルシュ菌感染の処置または予防の方法。
- 家禽における壊疽性腸炎の処置または予防のためのワクチンとしての、請求項10または11に記載の免疫原性ポリペプチドの使用。
- 家禽におけるウェルシュ菌感染の処置または予防のためのワクチンとしての、請求項10または11に記載の免疫原性ポリペプチドの使用。
- 請求項10または11に記載の免疫原性ポリペプチドに選択的に結合する抗体。
- 家禽から生体試料を得て、生体試料において請求項22に記載の抗体の存在を検出することによって、家禽におけるウェルシュ菌感染を検出する方法。
- 請求項22に記載の抗体に、免疫原性ポリペプチドを暴露して、抗体への免疫原性ポリペプチドの結合を検出することを備える、請求項10または11に記載の免疫原性ポリペプチドを検出する方法。
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