CN113994006A - 胞内劳森菌组合物及使用其的方法 - Google Patents
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Abstract
描述了用于在亚单位疫苗组合物中使用以引起针对诸如增生性肠病(PE)之类的胞内劳森菌感染的免疫应答的胞内劳森菌抗原,以及编码其的多核苷酸。还描述了用于治疗和预防胞内劳森菌感染的方法。
Description
技术领域
本发明总体上涉及细菌病原体。特别地,本发明涉及胞内劳森菌(Lawsoniaintracellularis)免疫原性组合物以及治疗、预防和/或诊断劳森菌相关病症(如增生性肠病)的方法。
背景技术
胞内劳森菌是一种专性细胞内革兰氏阴性菌,具有苛刻的微需氧生长要求。其是增生性肠病(PE)的致病物,这是猪中的一种重要的经济疾病,也存在于其他哺乳动物中,包括非人类灵长类动物、马、兔和鸟类,如鸸鹋和鸵鸟(Kroll et al.,Animal HealthRes.Rev.(2005)6:173-197)。胞内劳森菌感染远端回肠和空肠的肠细胞,并且不能在真核细胞外复制。细菌附着和侵入肠细胞是细菌感染的重要步骤,但这些细菌与宿主细胞相互作用的机制尚未确定(Vannucci et al.,Vet.Pathol.(2014)51:465-477)。
III型分泌系统(T3SS)是许多肠道侵袭性病原体中常见的分泌系统,并且在入侵和抑制先天防御中发挥作用。在三种劳森菌分离物中检测到作为该系统一部分的蛋白质(Alberdi et al.,Vet.Microbiol.(2009)139:298-303)。这些促进与肠细胞接触的T3SS蛋白和其他未表征的细菌蛋白在细胞表面表达,因此可被宿主免疫系统利用。然而,由于胞内劳森菌的专性细胞内生长要求,以及从样品制备物中去除真核宿主细胞蛋白的困难,确定这些蛋白质对附着的重要性受到阻碍。
已使用质谱(MS)和生物信息学检测到胞内劳森菌自转运蛋白(LatA)(Watson etal.,Clin.and Vaccine Immunol.(2011)18:1282-1287)。此外,鸟枪蛋白质组学分析已用于在体外感染期间鉴定19种独特蛋白质,其中两种蛋白质LI0841和LI0902显示具有抗原特性(Watson et al.,Vet.Microbiol.(2014)174:448-455)。
二维凝胶电泳(2DE)是一种有效的分析工具,用于从组织、哺乳动物和细菌细胞以及分泌物中分离复杂的蛋白质混合物(Magdeldin et al.,Clin.Proteomics(2014)11:16)。2DE是一种强大而确信的技术,具有与其他生化技术兼容的优势(Rabilloud et al.,J.Proteomics(2010)73:2064-2077)。例如,2DE与蛋白质印迹(WB)和质谱(MS)相结合,已被用于检测由人类免疫系统识别的细菌抗原(Lahner et al.,InternationalJ.Med.Microbiol.(2011)301:125-132;Havlsová et al.,Proteomics(2005)5:2090-2103)、癌细胞抗原(Kellner et al.,Proteomics(2002)2:1743-1751)和真菌抗原(Pitarch et al.,Electophoresis(1999)20:1001-1010)。
尽管有这些识别潜在胞内劳森菌抗原的技术,但疫苗开发一直缺乏。已经开发出了一种无毒活疫苗(Kroll et al.,Am.J.Vet.Res.(2004)65:559-565)。然而,接种疫苗的动物仍会大量排出细菌,从而存在感染其他动物的危险。还开发了一种含有灭活全细胞细菌的疫苗(Roerink et al.,Vaccine(2018)36:1500-1508)。然而,由于市售胞内劳森菌疫苗依赖于这种专性细胞内病原体的生长,生产受限且耗时。
很明显,需要鉴别在用于治疗和/或预防劳森菌感染的亚单位疫苗组合物中使用的或在用于检测劳森菌感染的诊断中使用的抗原。
发明内容
本发明人通过将二维凝胶电泳(2DE)的分离能力与蛋白质印迹(WB)分析和质谱(MS)相结合,已成功地鉴别并表征了用于亚单位疫苗组合物中的胞内劳森菌抗原。WB和MS等下游应用增加2DE的分析能力,允许有效识别目标蛋白质。
胞内劳森菌蛋白被鉴别出来,并且进一步的生物信息学分析和流式细胞术分析表明多种蛋白质可能是疫苗抗原。克隆并表达了蛋白编码基因,并且纯化了相应重组蛋白。基于猪超免疫血清和疫苗试验数据,本文所描述的蛋白质显示具有免疫原性。针对胞内劳森菌疫苗株和对重组蛋白特异的血清产生的兔免疫血清显示出对活的、无毒的胞内劳森菌的附着和渗透有抑制作用,表明测试的每种蛋白质都是可用于亚单位疫苗配方的中和抗体靶标。
亚单位疫苗可允许在宿主细胞(如大肠杆菌)中进行重组抗原生产,这为需要生长、减毒和灭活的胞内劳森菌的疫苗提供了一种安全、快速且廉价的替代品。胞内劳森菌蛋白LI0710(鞭毛蛋白)具有佐剂和抗原特性,可在小鼠肠粘膜中诱导特异性免疫应答。因此,包括这种抗原的疫苗可能不需要额外的佐剂来提供针对这种肠道病原体的保护。
因此,本发明提供了用于在猪和其他易感动物中治疗和/或预防劳森菌感染诸如增生性肠病(PE)的胞内劳森菌亚单位组合物。亚单位疫苗,包括源自胞内劳森菌分离物的免疫原和免疫原混合物,用于提供针对后续感染的保护和/或用于诊断感染。因此,本发明提供了一种用于在猪和其他哺乳动物中治疗、预防和/或诊断胞内劳森菌感染的商业有用方法。
在一个实施方式中,提供了一种免疫原性亚单位组合物。该组合物包含:至少一种分离的、免疫原性的胞内劳森菌蛋白,该胞内劳森菌蛋白选自:LI0710、LI0649、LI0169、LI1153、LI0786、LI1171、LI0608、LI0726、LI0823、LI0625、LI0794、其免疫原性片段、其免疫原性变体、或来自另一胞内劳森菌菌株或分离物的相应蛋白;和药学上可接受的赋形剂。
在某些实施方式中,胞内劳森菌蛋白选自包含SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29和32的氨基酸序列的一种或多种蛋白、其免疫原性片段、或其免疫原性片段或变体。
在附加实施方式中,胞内劳森菌免疫原性蛋白包含SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29或32的氨基酸序列,如果存在跨膜结合结构域或天然信号序列的话,该胞内劳森菌免疫原性蛋白缺失跨膜结合结构域或天然信号序列的全部或部分。
在进一步的实施方试中,胞内劳森菌免疫原性蛋白包含与SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29或32的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中,胞内劳森菌免疫原性蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸2-293的氨基酸序列;SEQ ID NO:5的氨基酸31-851的氨基酸序列;SEQ ID NO:8的氨基酸43-552的氨基酸序列,SEQ ID NO:11的氨基酸5-398的氨基酸序列;SEQ ID NO:14的氨基酸1-383的氨基酸序列;SEQ ID NO:17的氨基酸1-562的氨基酸序列;SEQ ID NO:20的氨基酸1-485的氨基酸序列;SEQ ID NO:23的氨基酸1-404的氨基酸序列;SEQ ID NO:26的氨基酸1-363的氨基酸序列;SEQ ID NO:29的氨基酸1-548的氨基酸序列;和/或SEQ ID NO:32的氨基酸1-209的氨基酸序列。
在另一附加的实施方式中,免疫原性组合物包含两种或多种分离的免疫原性胞内劳森菌蛋白质。在某些实施方式中,两种或多种蛋白质作为融合蛋白提供。
在进一步的实施方式中,免疫原性组合物包含免疫性佐剂,诸如但不限于水包油乳液佐剂。在一些实施方式中,免疫性佐剂是明矾。
在其他实施方式中,免疫性佐剂包含(a)聚磷腈;(b)聚(I:C)或CpG寡核苷酸;和(c)宿主防御肽,并且可以是微粒的形式。在某些实施方式中,聚磷腈是PCEP,并且宿主防御肽是肽1002。在一些实施方式中,聚磷腈是直链或环状聚磷腈。
在一些实施方式中,免疫原性组合物还包含粘膜粘附脂质载体系统,具有选自以下的一种或多种阳离子脂质:1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP);3β-[N-(N',N'-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基](DC);二甲基双十八烷基铵(DDA);十八烷基胺(SA);二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB);1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE);蛋L-α-磷脂酰胆碱(EPC);胆固醇(Chol);二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC);1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵-丙烷(DMTAP);二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC);或神经酰胺氨基甲酰基-精胺(CCS)。
在进一步的实施方式中,提供了一种重组载体。该重组载体包含(a)编码免疫原性胞内劳森菌蛋白的DNA分子,该免疫原性胞内劳森菌蛋白选自LI0710、LI0649、LI0169、LI1153、LI0786、LI1171、LI0608、LI0726、LI0823、LI0625、LI0794、其免疫原性片段、其免疫原性变体、或来自另一胞内劳森菌菌株或分离物的相应蛋白;和(b)与DNA分子可操作地连接的控制元件,由此分子中的编码序列可以在宿主细胞中转录和翻译。
在附加实施方式中,提供了一种用重组载体转化的宿主细胞。在某些实施方式中,宿主细胞是大肠杆菌细胞。
在另一进一步的实施方式中,提供了一种生产胞内劳森菌蛋白的方法。该方法包括:(a)提供如上所描述的宿主细胞群;和(b)在由重组载体中存在的DNA分子编码的蛋白质被表达的条件下培养细胞群。
在进一步的实施方式中,提供了一种在脊椎动物受试者中治疗或预防胞内劳森菌感染的方法,该方法包括向受试者给予治疗有效量的任何本文所描述的组合物。在某些实施方式中,受试者是猪或马受试者。在附加实施方式中,胞内劳森菌感染包括增生性肠病。
考虑到本文的公开内容,本领域技术人员将容易想到本发明的这些和其他实施方式。
附图说明
图1A、1B和1C示出了来自胞内劳森菌分离物PHE/MN1-00的LI0710的DNA序列(SEQID NO:1,图1A)、氨基酸序列(SEQ ID NO:2,图1B;NCBI no.CAJ54764)和克隆基因产物的氨基酸序列(SEQ ID NO:3,图1C)。图1B示出了从DNA序列预测的氨基酸序列且图1C示出了克隆序列(SEQ ID NO:3)。
图2A、2B和2C示出了来自胞内劳森菌分离物PHE/MN1-00的LI0649的DNA序列(SEQID NO:4,图2A)、氨基酸序列(SEQ ID NO:5,图2B;NCBI no.CAJ54703)和克隆基因产物的氨基酸序(SEQ ID NO:6,图2C)。图2B中,从实施例中描述的重组分子中缺失了包括跨膜结构域的N末端区域。图2B示出了从DNA序列预测的氨基酸序列并且图2C示出了克隆序列(SEQID NO:6)。从实施例中描述的重组分子中缺失了来自图2B的包括跨膜结构域的N-末端区域,这描绘于图2C中。
图3A、3B和3C示出了来自胞内劳森菌分离物PHE/MN1-00的LI0169的DNA序列(SEQID NO:7,图3A)、氨基酸序列(SEQ ID NO:8,图3B;NCBI no.CAJ54225)和克隆基因产物的氨基酸序列(SEQ ID NO:9,图3C)。图3B示出了从DNA序列预测的氨基酸序列并且图3C示出了克隆序列(SEQ ID NO:9)。
图4A、4B和4C示出了来自胞内劳森菌分离物PHE/MN1-00的LI1153的DNA序列(SEQID NO:10,图4A)、氨基酸序列(SEQ ID NO:11,图4B;NCBI no.CAJ55207)和克隆基因产物的氨基酸序列(SEQ ID NO:12,图4C)。图4B示出了从DNA序列预测的氨基酸序列并且图4C示出了克隆序列(SEQ ID NO:12)。
图5A、5B和5C示出了来自胞内劳森菌分离物PHE/MN1-00的LI0786的DNA序列(SEQID NO:13,图5A)、氨基酸序列(SEQ ID NO:14,图5B;NCBI no.CAJ54840)和克隆基因产物的氨基酸序列(SEQ ID NO:15,图5C)。图5B示出了从DNA序列预测的氨基酸序列并且图5C示出了克隆序列(SEQ ID NO:15)。
图6A、6B和6C示出了来自胞内劳森菌分离物PHE/MN1-00的LI1171的DNA序列(SEQID NO:16,图6A)、氨基酸序列(SEQ ID NO:17,图6B;NCBI no.CAJ55225)和克隆基因产物的氨基酸序列(SEQ ID NO:18,图6C)。图6B示出了从DNA序列预测的氨基酸序列且图6C示出了克隆序列(SEQ ID NO:18)。
图7A、7B和7C示出了来自胞内劳森菌分离物PHE/MN1-00的LI0608的DNA序列(SEQID NO:19,图7A)、氨基酸序列(SEQ ID NO:20,图7B;NCBI no.CAJ54662)和克隆基因产物的氨基酸序列(SEQ ID NO:21,图7C)。图7B示出了从DNA序列预测的氨基酸序列且图7C示出了克隆序列(SEQ ID NO:21)。
图8A、8B和8C示出了来自胞内劳森菌分离物PHE/MN1-00的LI0726的DNA序列(SEQID NO:22,图8A)、氨基酸序列(SEQ ID NO:23,图8B;NCBI no.CAJ54780)和克隆基因产物的氨基酸序列(SEQ ID NO:24,图8C)。图8B示出了从DNA序列预测的氨基酸序列且图8C示出了克隆序列(SEQ ID NO:24)。
图9A、9B和9C示出了来自胞内劳森菌分离物PHE/MN1-00的LI0823的DNA序列(SEQID NO:25,图9A)、氨基酸序列(SEQ ID NO:26,图9B;NCBI no.CAJ54877)和克隆基因产物的氨基酸序列(SEQ ID NO:27,图9C)。图9B示出了从DNA序列预测的氨基酸序列且图9C示出了克隆序列(SEQ ID NO:27)。
图10A、10B和10C示出了来自胞内劳森菌分离物PHE/MN1-00的LI0625的DNA序列(SEQ ID NO:28,图10A)、氨基酸序列(SEQ ID NO:29,图10B;NCBI no.CAJ54679)和克隆基因产物的氨基酸序列(SEQ ID NO:30,图10C)。图10B示出了从DNA序列预测的氨基酸序列且图10C示出了克隆序列(SEQ ID NO:30)。
图11A、11B和11C示出了来自胞内劳森菌分离物PHE/MN1-00的LI0794的DNA序列(SEQ ID NO:31,图11A)、氨基酸序列(SEQ ID NO:32,图11B;NCBI no.CAJ54848)和克隆基因产物的氨基酸序列(SEQ ID NO:33,图11C)。图11B示出了从DNA序列预测的氨基酸序列且图11C示出了克隆序列(SEQ ID NO:33)。
图12A、12B和12C示出了兔血清对IPEC-1细胞中CFSE-标记无毒胞内劳森菌渗透的抑制作用,如实施例中所描述:阴性对照血清(免疫前获得并合并的血清),抗-胞内劳森菌血清(来自用全无毒细菌免疫的兔的血清),来自用重组蛋白抗-rLI0169、抗-rLI0649、抗-rLI0710(rFliC)、抗-rLI1153免疫的兔的血清;测定中使用的血清浓度500μg/mL(图12A);1000μg/mL(图12B)和2000μg/mL(图12C)。所有血清都清除了针对LPS的抗体。抑制百分比=(1-用血清温育的CFSE细菌的荧光%/CFSE细菌(对照)的荧光%)x 100。数据代表4个生物学重复。条示出了4个生物学重复的平均值的标准偏差。(***)p<0.001,(**)p<0.01和(*)p<0.05,(ns)不显著。
图13A-D显示,用VIDO-三重佐剂(见下文)配制的rLI0710疫苗进行肌内疫苗接种导致了抗原特异性全身和肠道抗体应答。VIDO三重佐剂由聚IC、宿主防御肽1002和聚磷腈以1:2:1比率组成。通过肌内途径以用300μg:600μg:300μg聚磷腈(VIDO三重佐剂)配制的rLI0710各300μg对断奶仔猪进行免疫。它们在17天后和32天后接受了加强剂量。对照动物用VIDO三重佐剂在同一天通过相同的途径进行免疫(n=4)。在第46天使仔猪安乐死。量化血抗-rLI0710 IgG滴度。图13A显示了动物试验的示意图,进行该试验以证明用VIDO三重佐剂配制rLI0710并通过肌内途径给予可促进可测量的体液免疫应答。图13B示出了在肌肉注射疫苗与对照动物中的血清抗-rLI0710 IgG滴度。图13C和图13D分别示出来自肌肉注射疫苗与对照动物的回肠和空肠刮屑中的抗-rLI0710 IgA滴度。每个符号代表一只单独的动物,且水平条显示每列的中值。相对于对照动物的统计比较,P<0.05(*)。
图14A-K显示,使用以配制的亚单位疫苗肌内疫苗接种导致了抗原特异性体液应答。图14A是使用重组胞内劳森菌蛋白的免疫、放血和挑战动物试验的示意图,重组胞内劳森菌蛋白促进可测量的免疫应答和/或保护免受传染性胞内劳森菌的影响。断奶仔猪免疫接种各50μg用配制的rLI0710、rLI0625和rLI0169(组1,n=8),50μg rLI0794、50μg rLI0726和25μg用配制的rLI0786(组2,n=8),挑战对照组给予单独的(组3,n=7),且未挑战对照组给予单独的(组4,n=7)。每种疫苗的总体积为1.4mL,其中700μL由佐剂和700μL抗原或盐水缓冲液组成。将猪禁食过夜,然后在第27天用1.9x108在40mL来自先前感染猪的肠粘膜中的致病性胞内劳森菌进行挑战。在第0、14和27天收集血清,并在第48天刮取空肠和回肠。图14B-D示出了在第0、14和27天来自肌肉注射疫苗和对照猪的血清中的抗-rLI0710(图14B)、抗-rLI0625(图14C)和抗-rLI0794 IgG(图14D)。图14E-G和图14H-J分别示出了第48天来自接种疫苗和对照猪的空肠和回肠粘膜刮屑的抗-rLI0710(图14E、14H)、抗-rLI0625(图14F、14I)和抗-rLI0794(图14G、14J)IgA。图14K显示了试验第一周、挑战前的仔猪体重和挑战后的胴体重。每个符号代表一只单独的动物且水平条显示了每列的中值。相对于每个治疗组内第0天的统计比较显示具有统计显著性,P<0.05,P<.01(**)和P<0.001(***)。
图15A-B显示了用VIDO三重佐剂配制的重组抗原的宫内和宫内/肌内免疫诱导了细胞介导的免疫回忆应答。在用杀死的精液繁殖期间,使用400μg用VIDO三重佐剂(每剂1.2mg聚IC,2.4mg防御防御,1.2mg聚磷磷酸盐)配制的rLI0710抗原对小母猪进行免疫接种。对于第二次和第三次加强疫苗,小母猪用杀死的(第2剂)和活(第3剂)精液繁殖,各自采用了VIDO三重佐剂。在第2和第3剂时,用rLI0710加(每剂400μg聚IC、800μg宿主防御肽和400μg聚磷腈)对小母猪进行免疫。通过宫内或肌肉内途径向对照小母猪给予杀死或活的精液(不含VIDO三重佐剂)。图15A是动物试验的示意图,其进行用于证明用VIDO三重佐剂配制rLI0710并且给予至粘膜和肌肉内途径促进了细胞介导的免疫。图15B示出了在最后一次用活精液免疫/育种后约第38天,采集外周血单核免疫细胞(PBMC)后量化的IFNγ产生。用2μg/mL rLI0710重新刺激PBMC。每个符号代表一只单独的动物且水平条显示每列的中值。相对于每个治疗组内的模拟免疫动物进行统计比较,并标有统计显著性,P<0.001(***)。
具体实施方式
除非另有说明,本发明的实践将使用本领域技术范围内的微生物学、病毒学、化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的常规方法。这些技术在文献中有充分的解释。参见例如Fundamental Virology,现行版,vol.I&II(B.N.Fields and D.M.Knipe,eds.);Handbook of Experimental Immunology,Vols.I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwelleds.,Blackwell Scientific Publications);T.E.Creighton,Proteins:Structures andMolecular Properties(W.H.Freeman and Company);A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,现行版);Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A LaboratoryManual(现行版);Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan eds.,AcademicPress,Inc.)。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请,无论是上文还是下文,均通过引用整体并入本文。
全文中使用了以下氨基酸缩写:
丙氨酸:Ala(A) 精氨酸:Arg(R)
天冬酰胺:Asn(N) 天冬氨酸:Asp(D)
半胱氨酸:Cys(C) 谷氨酰胺:Gln(Q)
谷氨酸:Glu(E) 甘氨酸:Gly(G)
组氨酸:His(H) 异亮氨酸:Ile(I)
亮氨酸:Leu(L) 赖氨酸:Lys(K)
蛋氨酸:Met(M) 苯丙氨酸:Phe(F)
脯氨酸:Pro(P) 丝氨酸:Ser(S)
苏氨酸:Thr(T) 色氨酸:Trp(W)
酪氨酸:Tyr(Y) 缬氨酸:Val(V)
1.定义
在描述本发明时,将使用以下术语,并旨在如下定义。
必须注意的是,在本说明书和所附权利要求中使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数形式,除非内容另有明确规定。因此,例如提及“抗原”包括两种或更多种此类抗原的混合物等等。
胞内劳森菌是一种专性细胞内原细菌,可感染多种哺乳动物和鸟类物种,包括但不限于猪、马、灵长类动物、狗、老鼠、豚鼠、兔子和仓鼠。该细菌感染胃肠道,对回肠末端具有特定的趋向性,并引起肠道隐窝衬里细胞(肠细胞)的增殖,导致粘膜壁增生和本文进一步描述的许多相关病症。胞内劳森菌也会影响空肠和在某些情况下结肠。术语“胞内劳森菌”指能够引起疾病的生物体的任何亚种、菌株或分离物。
术语“来源于”在本文中用于标识分子的原始来源,但并不意味着限制分子的制备方法,例如可以通过化学合成或重组方式制备。
“胞内劳森菌分子”是一种来源于细菌的分子,包括但不限于来自各种胞内劳森菌亚种、菌株或分离物中任一种的多肽、蛋白质、抗原、多核苷酸、寡核苷酸和核酸分子。分子不必物理地源自所讨论的特定细菌,而是可以合成或重组产生。来自许多胞内劳森菌分离物的核酸和多肽序列是已知的和/或在本文中描述。本文的表1和2以及图1-11呈现了用于治疗和/或预防感染如PE的代表性胞内劳森菌蛋白以及编码蛋白的多核苷酸。国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中列出了在各种哺乳动物的分离物中发现的其他代表性序列。也参见Nishikawa et al.,Microbiol.Resourc.Announc.(2018)Sept.6:7(9);Sait et al.,Genome Announc.(2013)Jan.-Feb.:1(1);Mirajkar et al.,Genome Announc.(2017)May11:5(19)。然而,如本文定义的胞内劳森菌分子(诸如抗原)并不限于表1和2以及图1-11中示出和描述的那些,因为已知各种分离物并且在它们之间可能发生序列的变异。因此,如本文定义的“胞内劳森菌”分子是指来自胞内劳森菌分离物或菌株的分子,其对应于特定的胞内劳森菌源分子。
“劳森菌疾病或病症”是指全部或部分由胞内劳森菌细菌引起的疾病或病症。如本文所描述,胞内劳森菌侵入肠上皮细胞,使受感染细胞增生,导致发病。增生是器官或组织中细胞数量的异常增加,从而导致增大。在猪和马等动物中,感染会导致PE。在猪中,PE感染通常表现为急性出血性形式,称为“增殖性出血性肠病(PHE)”,通常见于幼稚的成年猪,或更慢性消耗性增殖形式,称为“猪肠腺瘤病(PIA)”,通常见于生长猪。劳森菌感染可能导致增生性回肠炎、伤寒和/或结肠炎。在马中,胞内劳森菌导致马增生性肠病(EPE),通常称为“劳森菌”。感染也可以是亚临床的。虽然没有观察到疾病的症状,但通过粪便中的脱落传播病原体的能力仍然存在。因此,该术语既指临床疾病又指亚临床疾病。
术语“多肽”和“蛋白质”是指氨基酸残基的聚合物,并且不限于产品的最小长度。因此,肽、寡肽、二聚体、多聚体等包括在定义中。该定义包括全长蛋白质及其片段。该术语还包括多肽的表达后修饰,例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。另外,出于本发明的目的,“多肽”是指一种蛋白,它包括对天然序列的修饰,例如缺失、添加和替换,只要蛋白保持所需的活性即可。这些修饰可以是有意的,例如通过定点诱变,也可以是偶然的,例如通过产生蛋白质的宿主突变或由于PCR扩增而导致的错误。
如本文所用,术语“肽”是指多肽的片段。因此,肽可以包括天然多肽的C末端缺失、N末端缺失和/或内部缺失,只要不存在整个蛋白质序列即可。肽通常包括全长分子的至少约3-10个连续氨基酸残基,并且可以包括全长分子的至少约15-25个连续氨基酸残基,或者全长分子的至少约20-50个或更多个连续氨基酸残基,或者在3个氨基酸和全长序列中氨基酸数目之间的任何整数,前提是所讨论的肽保留了引发所需生物响应的能力。
“免疫原性”蛋白质、多肽或肽是指包括一个或多个表位并因此可以调节免疫应答的分子。可以使用本领域公知的任何数量的表位映射技术来识别此类肽。参见例如EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology(2018)(Johan Rockberg andJohan Nilvebrant,Eds.)Springer,New York。例如,线性表位可以通过例如软件程序确定(参见例如Saha et al.,Structure,Function,and Bioinformatics(2006)65:40-48);或通过在固体支持物上同时合成大量肽(肽对应于蛋白分子的一部分)并且当肽仍然附着在支持物上时使肽与抗体反应来确定。类似地,可以通过确定氨基酸的空间构象,例如通过X-射线晶体学和二维核磁共振,来容易地识别构象表位。参见例如上述Epitope MappingProtocols。还可以使用标准抗原性和亲水性图(诸如使用例如可从Oxford MolecularGroup获自的Omiga软件程序计算的那些)来识别蛋白质的抗原区域。这一计算机程序采用Hopp/Woods方法(Hopp et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA(1981)78:3824-3828)来确定抗原性谱和Kyte-Doolittle技术(Kyte et al.,J.Mol.Biol.(1982)157:105-132)确定亲水性图。
出于本发明的目的,免疫原性分子的长度通常至少为约5个氨基酸,例如至少约10至约15个或更多个氨基酸的长度。分子的长度没有关键的上限,其可以包含蛋白序列的全长,甚至是包含两个或多个表位、蛋白质、抗原等的融合蛋白。
如本文所用,术语“表位”通常是指抗原上被T-细胞受体和/或抗体识别的位点。单个抗原分子可以携带多个不同的表位。术语“表位”还包括修改后的氨基酸序列,其刺激针对整个生物体的应答。表位可以从多肽的氨基酸和相应的DNA序列的知识、以及从特定氨基酸的性质(例如尺寸、电荷等)和密码子字典产生,而不需要过多的实验。参见例如IvanRoitt,Essential Immunology;Janis Kuby,Immunology。
对抗原或组合物的“免疫应答”是在受试者中针对存在于目标组合物中的抗原产生体液和/或细胞免疫应答。出于本发明的目的,“体液免疫应答”是指由抗体分子介导的免疫应答,而“细胞免疫应答”是由T-淋巴细胞和/或其他白细胞介导的免疫应答。细胞免疫的一个重要方面涉及细胞毒性T细胞(“CTL”)的抗原特异性应答。CTL对与由主要组织相容性复合体(MHC)编码的蛋白质相关并在细胞表面表达的肽抗原具有特异性。CTL有助于诱导和促进细胞内微生物的破坏,或被此类微生物感染的细胞的裂解。细胞免疫的另一方面涉及辅助T-细胞的抗原特异性应答。辅助T-细胞的作用是帮助刺激非特异性效应细胞的功能并集中其活性,以对抗在表面上展示与MHC分子相关的肽抗原的细胞。“细胞免疫应答”还指产生细胞因子,例如干扰素γ、趋化因子和由活化的T-细胞和/或其他白细胞产生的其他此类分子,包括来源于CD4+和CD8+T-细胞的那些。
因此,本文使用的免疫应答可以是刺激抗体产生的应答。目标抗原还可以引发产生CTL。因此,免疫应答可以包括以下效应中的一个或多个:B细胞产生抗体;和/或激活特异性针对目标组合物或疫苗中存在的一种或多种抗原的抑制性T-细胞和/或记忆/效应T-细胞。这些应答可用于中和感染性,和/或介导抗体-补体或抗体依赖性细胞毒性(ADCC),从而向免疫宿主提供保护。可以使用本领域众所周知的(例如本文实施例中所描述的)标准免疫测定法和中和测定法来确定此类应答。
哺乳动物的先天免疫系统还通过激活免疫细胞上的Toll样受体和类似受体分子来识别和响应病原生物的分子特征。先天免疫系统激活后,各种非适应性免疫应答细胞被激活,例如产生各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子。由先天免疫应答激活的细胞包括单核细胞和浆细胞样谱系(MDC、PDC)的未成熟和成熟树突状细胞,以及γ、δ、α和βT细胞和B细胞等。因此,本发明还考虑了一种免疫应答,其中该免疫应答涉及先天性和适应性应答。
“免疫原性组合物”是一种包含免疫原性分子的组合物,其中向受试者给予该组合物导致受试者对目标分子产生体液和/或细胞免疫应答。
“抗原”是指含有一个或多个表位(线性、构象或两者)的分子,例如蛋白质、多肽或其片段,这些表位将刺激宿主的免疫系统产生体液和/或细胞抗原-特异性响应。该术语可与术语“免疫原”互换使用。抗体,例如抗-独特型抗体或其片段,以及可以模拟抗原或抗原决定簇的合成肽模拟表位,也包括在本文所用的抗原定义中。类似地,例如在DNA免疫应用中,在体内表达抗原或抗原决定簇的寡核苷酸或多核苷酸也包括在本文抗原的定义中。
“亚单位疫苗”是指一种疫苗组合物,其包含一种或多种选定的抗原,但不是所有抗原,该抗原源自目标病原体或同源于来自目标病原体的抗原。这种组合物基本上不含完整的病原体细胞或病原体颗粒,或这种细胞或颗粒的裂解物。因此,“亚单位疫苗”可以由来自病原体的至少部分纯化的(优选基本上纯化的)免疫原性分子或其类似物制备。因此,获得包括在亚单位疫苗中的抗原的方法可以包括标准纯化技术、重组生产或合成生产。
“基本上纯化”通常是指分离物质,使得该物质占其所在样品的多数百分比。通常在样品中,基本上纯化的组分占样品的至少50%,优选至少80%-85%,更优选至少90-95%,诸如至少96%、97%、98%、99%或更多。纯化目标分子的技术是本领域众所周知的,包括例如离子交换色谱、亲和色谱和密度沉降。
“分离的”是指指定的分子与在自然界中发现该分子的整个生物体分离和离散或者或在基本上不存在其他相同类型的生物大分子的情况下存在。
“抗体”是指“识别”即与抗原中存在的目标表位特异性结合的分子。“特异性结合”是指抗体以“锁和钥匙”型相互作用与表位相互作用以在抗原和抗体之间形成复合物,这跟抗体与例如包括与抗体反应的测试物质的混合物中的组分之间可能发生的非特异性结合相反。本文使用的术语“抗体”包括从多克隆和单克隆制备中获得的抗体,以及以下抗体:杂交(嵌合)抗体分子;F(ab’)2和F(ab)片段;Fv分子(非共价异二聚体);单链Fv分子(sFv);二聚体和三聚体抗体片段构建体;微型体;人源化抗体分子;和从这些分子中获得的任何功能片段,其中此类片段保留了亲本抗体分子的免疫结合特性。
如本文所用,术语“单克隆抗体”是指具有均质抗体群的抗体组合物。该术语不限于抗体的种类或来源,也不旨在受其制备方式的限制。该术语包括完整的免疫球蛋白以及片段,诸如Fab、F(ab')2、Fv和其他片段,以及表现出亲本单克隆抗体分子的免疫结合特性的嵌合和人源化同源抗体群。
“同源性”是指两个多核苷酸或两个多肽部分之间的同一性百分比。当在分子的限定长度上,两个核酸或两个多肽序列表现出至少约50%序列同一性、优选至少约75%序列同一性、更优选至少约80%-85%序列同一性、更优选至少约90%序列同一性且最优选至少约95%-98%序列同一性时,则两个核酸或两个多肽序列彼此“基本同源”。如本文所用,基本同源也指与指定序列显示出完全同一性的序列。
一般而言,“同一性”分别是指两个多核苷酸或多肽序列的确切核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的对应关系。可以通过比对序列来直接比较两个分子之间的序列信息、计算两个比对序列之间的准确匹配数、除以较短序列的长度并将结果乘以100来确定百分比同一性。可以使用现成的计算机程序来辅助分析。参见例如molbiol-tools.ca/alignments用于确定两个或多个氨基酸或核苷酸序列之间相似性的计算机程序列表。使用制造商推荐的默认参数可以容易地利用这些程序。例如,使用具有默认评分表和六个核苷酸位置的缺口罚分的同源性Smith-Waterman算法,可以确定特定核苷酸序列与参考序列的同一性百分比。
在本发明的上下文中建立百分比同一性的另一方面是使用University ofEdinburgh拥有版权、由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发、由IntelliGenetics,Inc.(Mountain View,CA)分发的MPSRCH程序包。从这套软件包中,可以使用Smith-Waterman算法,其中将默认参数用于评分表(例如缺口开放罚分12、缺口延伸罚分1和缺口6)。从生成的数据中,“匹配”值反映了“序列同一性”。用于计算序列之间的百分比同一性或相似性的其他合适程序是本领域公知的,例如另一种比对程序是BLAST,以默认参数使用。例如,可以使用以下默认参数来使用BLASTN和BLASTP:遗传密码=标准;过滤器=无;链=两条;截止=60;期望=10;矩阵=BLOSUM62;描述=50个序列;排序方式=高分;数据库=非冗余,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。这些程序的详细信息很容易获得。
替代地,可以通过在同源区域之间形成稳定双链体的条件下使多核式酸杂交,然后用单链特异性核酸酶消化,并确定消化片段的大小,从而确定同源性。可以在Southern杂交实验中在例如该特定系统所定义的严格条件下鉴别基本上同源的DNA序列。定义合适的杂交条件在本领域技术范围内。参见例如Sambrook et al.,Molecular Cloning,alaboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中用于包括任何长度的核苷酸的聚合形式,核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。该术语仅指分子的一级结构。因此,该术语包括三链、双链和单链DNA,以及三链、双链和单链RNA。它还包括修饰(例如通过甲基化和/或通过加帽)以及未修饰形式的多核苷酸。更特别地,术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(含D-核糖)、任何其他类型的多核苷酸(为嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷)以及其他含有非核苷酸骨架的聚合物,例如聚酰胺(例如肽核酸(PNA))和多吗啉聚合物(可从Anti-Virals,Inc.,Corvallis,Oregon以Neugene商业获得),以及其他合成序列特异性核酸聚合物,前提是该聚合物含有核碱基,其构型允许进行例如在DNA和RNA中发现的碱基配对和碱基堆积。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在长度上没有有意的区别,并且这些术语将互换使用。因此,这些术语包括例如3'-脱氧-2',5'-DNA、寡脱氧核糖核苷酸N3'P5'氨基磷酸酯、2'-O-烷基取代的RNA、双和单链DNA以及双和单链RNA、DNA:RNA杂交体、和PNA与DNA或RNA之间的杂交体,并且还包括已知类型的修饰,例如本领域已知的标记、甲基化、“帽”、用类似物替换一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰,例如诸如具有不带电荷连接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带负电荷连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)以及带正电荷连接(例如氨基烷基磷酸酯,氨基烷基磷酸三酯)的那些,含有悬垂部分的那些,诸如例如蛋白质(包括核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等),具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的那些,含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些,含有烷基化剂的那些,具有修饰连接(例如α异头核酸等)的那些,以及未修饰形式的多核苷酸或寡核苷酸。特别地,DNA是脱氧核糖核酸。
本文中用来描述核酸分子的“重组”是指基因组、cDNA、病毒、半合成或合成来源的多核苷酸,由于其来源或操作,与自然界中与之相关的多核苷酸的全部或部分无关。用于蛋白或多肽的术语“重组”是指通过表达重组多核苷酸产生的多肽。一般来说,目的基因被克隆,然后在转化的生物体中表达,如下文进一步描述。宿主生物在表达条件下表达外源基因以产生蛋白。
“重组宿主细胞”、“宿主细胞”、“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”和其他表示作为单细胞实体培养的微生物或高等真核细胞系的此类术语,是指可以是或已经用作重组载体或其他转移DNA的接受体的细胞,并且包括已转染的原始细胞的原始后代。
“编码序列”或“编码”选定多肽的序列是一种核酸分子,其当置于适当的调控序列(或“控制元件”)的控制下时,在体外或体内转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽。编码序列的边界可由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括但不限于来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA,来自病毒或原核DNA的基因组DNA序列,和甚至合成的DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3'。
典型的“控制元件”包括但不限于转录启动子、转录增强子元件、转录终止信号、聚腺苷酸化序列(位于翻译终止密码子的3')、用于优化翻译起始的序列(位于编码序列的5')和翻译终止序列。“可操作地连接”是指元件的排列,其中如此描述的组件被配置为执行它们的通常功能。因此,当存在合适的酶时,与编码序列可操作地连接的给定启动子能够影响编码序列的表达。启动子不需要与编码序列相邻,只要它起到指导其表达的作用即可。因此,例如,在启动子序列和编码序列之间可以存在中间未翻译但已转录的序列,并且启动子序列仍然可以被认为与编码序列“可操作地连接”。
“表达盒”或“表达构建体”是指能够指导目的序列或基因的表达的组件。表达盒通常包括如上所描述的控制元件,例如与目的序列或基因可操作地连接(以指导转录)的启动子,并且通常还包括聚腺苷酸化序列。在本发明的某些实施方式中,本文所描述的表达盒可以包含在质粒构建体中。除了表达盒的组件外,质粒构建体还可以包括一种或多种可选择的标志物、允许质粒构建体作为单链DNA存在的信号(例如M13复制起点)、至少一个多克隆位点和“哺乳动物”复制起点(例如SV40或腺病毒复制起点)。
术语“转化”用于指细胞摄取外源DNA。当外源DNA被引入细胞膜内时,则细胞就被“转化”。许多转化技术是本领域公知的。参见例如Sambrook et al.,Molecular Cloning,alaboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York;Davis et al.BasicMethods in Molecular Biology,Elsevier。此类技术可用于将一个或多个外源DNA部分引入合适的宿主细胞。该术语指的是遗传物质的稳定和瞬时摄取,并且包括肽或抗体-连接的DNA的摄取。
“载体”能够将核酸序列转移到靶细胞(例如病毒载体、非病毒载体、微粒载体和脂质体)。通常,“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”是指能够指导目的核酸的表达并且能够将核酸序列转移至靶细胞的任何核酸构建体。因此,该术语包括克隆和表达载体,以及病毒载体。
“基因转移”或“基因递送”是指将目的DNA或RNA可靠地插入宿主细胞的方法或系统。此类方法可导致瞬时表达非整合的转移DNA、染色体外复制和表达转移的复制子(例如附加体)、或将转移的遗传物质整合到宿主细胞的基因组DNA中。基因递送表达载体包括但不限于源自细菌质粒载体、病毒载体、非病毒载体、甲病毒、痘病毒和痘苗病毒的载体。当用于免疫时,此类基因递送表达载体可称为疫苗或疫苗载体。
“脊椎动物受试者”是指脊索亚门的任何成员,包括但不限于人类和其他灵长类动物,包括非人类灵长类动物,如黑猩猩和其他猿类和猴子物种;农场动物,如牛、羊、猪、山羊和马;家养哺乳动物,如狗和猫;非家养动物,如麋鹿、鹿、貂和野猫;实验室动物,包括啮齿动物,如小鼠、大鼠和豚鼠;鸟类,包括家禽、野鸟和猎鸟,诸如鸡、火鸡和其他鹑鸡类鸟、鸭、鹅、雉鸡、鸸鹋、鸵鸟等。该术语不表示特定年龄。因此,旨在涵盖成年和新生个体。
在本文描述的免疫原性组合物的上下文中的“治疗有效量”是指可诱导如本文所描述的免疫应响的免疫原的量,以用于抗体产生或用于治疗或预防感染。
如本文所用,“治疗”是指但不限于以下任何一种:(i)如传统疫苗中一样,预防感染或再感染,和/或(ii)减少或消除受感染个体的症状。治疗可以预防性(感染前)或治疗性(感染后)进行。此外,在本发明的上下文中,预防或治疗可以是预防或减少存在于受治疗受试者中或受治疗受试者的粪便中的细菌量。
2.实施本发明的方式
在详细描述本发明之前,应理解的是,本发明不限于特定的配方或工艺参数,因为它们当然可以变化。还应当理解的是,此处使用的术语仅用于描述本发明的特定实施方式,并非旨在限制。
尽管在本发明的实践中可以使用与本文所描述的那些方法和材料相似或等效的许多方法和材料,但本文描述了优选的材料和方法。
本发明部分地基于使用二维电泳(2DE)、蛋白质印迹(WB)和质谱(MS)的独立组合发现的免疫原性胞内劳森菌分子。这些分子包括用于在目标受试者中刺激免疫应答的一个或多个表位。分子可以以分离的形式提供为离散组分或为融合蛋白。可以将抗原掺入药物组合物中,例如疫苗组合物。如实施例中所示,来自用包括胞内劳森菌重组蛋白的亚单位疫苗组合物免疫的动物的血清对活的、无毒的胞内劳森菌的附着和渗透显示出抑制效应,由此表明这些蛋白能够产生中和抗体,以便预防胞内劳森菌感染。
因此,本发明提供了一种免疫组合物和一种用于治疗和/或预防胞内劳森菌疾病的方法。免疫可通过本领域已知的任何方法实现,包括但不限于使用含有分离的胞内劳森菌抗原的疫苗或包含多种抗原的融合蛋白,或通过使用针对抗原的抗体进行被动免疫。下文详细描述了此类方法。另外,本文描述的抗原可以用于例如在生物样品中检测胞内劳森菌细菌的存在。
疫苗可用于易受胞内劳森菌感染影响的脊椎动物受试者,包括但不限于哺乳动物和鸟类,诸如但不限于猪、马、灵长类动物、狗、大鼠、豚鼠、兔子和仓鼠。
为了进一步理解本发明,以下提供了关于胞内劳森菌抗原、其生产、包含它的组合物、和在感染的治疗和/或预防以及感染的诊断中使用此类组合物的方法的更详细的讨论。
A.胞内劳森菌抗原
用于本发明组合物中的抗原可以来源于多种胞内劳森菌菌株和分离物中的任何一种。如本文所描述,胞内劳森菌有能力感染许多脊椎动物包括哺乳动物和鸟类物种。感染可以导致增生性肠病(PE)并且对畜牧业产生深远的经济影响。
表1、表2和图1B、2B、3B、4B、5B、6B、7B、8B、9B、10B和11B(分别为SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29和32)显示了用于刺激针对胞内劳森菌的免疫应答的组合物中的代表性抗原。表1和表2以及附图中所列的分子被识别为具有免疫原性并且如实施例中所描述的SEQ ID NO 2、5、8、11和29中详述的那些蛋白与来自致病性胞内劳森菌感染的猪的超免疫血清反应。
优选地,本组合物包括这些搞原中的一种或多种,诸如一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种抗原的任意组合,以及来自其他胞内劳森菌菌株或分离物的对应于表格中所列和附图中所示的胞内劳森菌抗原的抗原。另外,存在于组合物中的抗原可以包括全长氨基酸序列、这些序列的片段或变体,只要抗原刺激免疫应答(优选中和和/或保护性免疫应答)即可。因此,抗原可以提供有不破坏免疫原性的N末端或C末端缺失,包括但不限于N-末端甲硫氨酸(如果存在)的缺失、全部或部分跨膜结构域(如果存在)的缺失、全部或部分细胞质结构域(如果存在)的缺失以及天然信号序列(如果存在)的缺失。附加地,分子可以包括其他与免疫原性无关的N末端、C末端或内部氨基酸或序列缺失。另外,分子可以包括添加,诸如存在异源信号序列(如果需要)以及氨基酸接头,和/或有用于蛋白纯化的配体,诸如组氨酸标签、谷胱甘肽-S-转移酶或葡萄球菌蛋白A。
以下详细描述并且表1中示出了代表性蛋白质。应当理解的是,本发明并不限于使用这些代表性蛋白质,因为已知许多胞内劳森菌的菌株和分离物,并且本文旨在包括来自这些菌株和分离物的相应蛋白质。
表1:代表性胞内劳森菌蛋白质
LI0710在本文中也称为鞭毛蛋白、flag和filC,发现于胞内劳森菌外膜细胞表面的外侧。鞭毛蛋白是聚合形成细菌鞭毛细丝的亚基蛋白,并且在细菌运动和趋化性中起重要作用。如本文所描述,LI0710具有免疫原性,兼具佐剂和抗原特性,并在动物肠黏膜中诱导特异性免疫应答。鞭毛蛋白是一种TLR5激动剂,并且在革兰氏阴性菌的免疫识别过程中起重要作用。由于其双抗原和佐剂性质,胞内劳森菌rLI0710是亚单位疫苗的理想选择。
图1A和1B分别示出了LI0710的代表性天然DNA序列(SEQ ID NO:1)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。图1B中所示的天然蛋白(SEQ ID NO:2)包括293个氨基酸并且由氨基酸5-141之间的PF00669结构域和氨基酸208-291的PF00700结构域组成,如使用生物信息学工具PFAM、蛋白家庭的数据库(pfam.xfam.org)所预测的。
实施例中生产的重组蛋白包括N-末端序列,该N-末端序列包含用于纯化目的的His-标签和接头(MHHHHHHGS)(SEQ ID NO:3,图1C),并且从重组蛋白中排除了天然分子的N-末端蛋氨酸。因此,去除了含有His-标签的序列的在免疫原性组合物中使用的代表性重组分子包括图1B所示天然分子的氨基酸2-293(SEQ ID NO:2)。
LI1153存在于胞内劳森菌的外膜细胞表面并且被注释为推定的外蛋白N。如本文所示,这一分子也具有免疫原性。图4A和4B分别示出了LI1153的代表性天然DNA序列(SEQID NO:10)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)。图4B所示的天然蛋白(SEQ ID NO:11)包括398个氨基酸。LI1153是T3SS系统的一部分,并且由两个在侵入真核细胞过程中具有重要功能的突出结构域组成:HrpJ,位于SEQ ID NO:11的氨基酸63-222之间(PF07201(PFAM)),和TyeA,位于SEQ ID NO:11的氨基酸299-378之间(PF09059(PFAM))。HrpJ结构域预计是T3SS的一部分。基于与其他T3SS系统结构的比较,LI1153似乎对应于预测的胞内劳森菌T3SS的第二部分,并具有控制效应蛋白分泌到宿主细胞中的作用。考虑于如本文所描述的这种蛋白与靶细胞之间的相互作用,蛋白可能在细菌入侵和附着到小肠肠细胞中起作用。
实施例中产生的蛋白质包括N-末端序列,该N-末端序列包含如上所描述的His-标签和接头(MHHHHHHGS)(SEQ ID NO:12,图4C),并且其缺失了图4B所示天然分子中的前4个氨基酸。因此,用于免疫原性组合物中、去除了含His-标签的序列以及天然分子的4个N-末端氨基酸的代表性重组分子包括图4B所示天然分子(SEQ ID NO:11)的氨基酸5-398。
LI0169是一种跨膜蛋白,并且似乎作为ATP结合盒(ABC)转运蛋白复合物的一部分在细菌膜上表达。在细菌中,ABC转运蛋白复合物在糖、氨基酸、金属、生长因子、离子和其他溶质跨过细胞膜的吸收中起着核心作用。如本文所示,该蛋白也是免疫原性的。
图3A和3B分别示出了LI0169的代表性天然DNA序列(SEQ ID NO:7)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。SEQ ID NO:8中所示的天然蛋白包括552个氨基酸并且在膜的细胞内面包括跨膜螺旋结构域(氨基酸12-34)、周质结构域(氨基酸98-456,PF00496)和ATP结合卷曲结构域(氨基酸476-496),它们一起形成中心孔。它以ATP依赖性方式运输二肽和三肽。
在克隆期间去除了天然蛋白(SEQ ID NO:8,图4B)的氨基酸1-42(SEQ ID NO:9中的粗体氨基酸,图3C)。实施例中生产的重组蛋白具有His-标签和接头(MHHHHHHSSGLVPRGSGMKE TAAAKFERQH MDSPDLGTDD DDKAMD,SEQ ID NO:9的氨基酸1-46)。此外,重组分子缺失了图4B所示的天然分子的最后4个C-末端氨基酸(SEQ ID NO:8,粗体氨基酸)。分子在C-末端包括额外的13个氨基酸。因此,重复蛋白(SEQ ID NO:9)包括His-标签,其不包括跨膜结构域氨基酸以及天然序列中的最后4个C-末端氨基酸(总共氨基酸43-552),并且其在C-末端中包括额外的13个氨基酸。
LI0649,也称为LatA,是一种自转运蛋白且如本文所示,具有免疫原性。LI0649在细菌-宿主相互作用中起作用。这一分子是一种跨膜蛋白。图2A和2B分别示出了LI0649的代表性天然DNA序列(SEQ ID NO:4)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。SEQ ID NO:5所示的天然蛋白包括851个氨基酸并且不包括N-末端跨膜结构域中的30个氨基酸(粗体氨基酸)。
实施例中生产的重组蛋白(SEQ ID NO:6,图2C)包括N-末端序列,该N-末端序列包含用于纯化目的的His-标签和接头(MHHHHHHSSG LVPRGSGMKE TAAAKFERQH MDSPDLGTDDDDKAMD),如上所描述。附加地,从SEQ ID NO:5所示的天然蛋白中缺失了包括N-末端跨膜结构域的氨基酸1-30。因此,用于免疫原性组合物中、除去了含His-标签的序列以及天然分子中的N-末端氨基酸的代表性重组分子包括图2B所示天然分子的氨基酸31-851。
LI0786是一种具有催化活性的DNA聚合酶III亚基B分子。图5A和5B分别示出了LI0786的代表性天然DNA序列(SEQ ID NO:13)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO:14)。SEQID NO:14所示的天然蛋白包括383个氨基酸。SEQ ID NO:15示出了具有His-标签和接头(MHHHHHHGS)的重组蛋白(图5C)。
LI1171是一种5’-核苷酸酶/2’,3’-环状磷酸二酯酶,并且显示出水解酶活性,作用于酯键、金属离子结合和核苷酸结合。图6A和6B分别示出了LI1171的代表性天然DNA序列(SEQ ID NO:16)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)。SEQ ID NO:17所示的天然蛋白包括562个氨基酸。SEQ ID NO:18中示出了具有His-标签和接头(MHHHHHHGS)的重组蛋白(图6C)。
LI0608是一种半胱氨酸-tRNA连接酶。图7A和7B分别示出了LI0608的代表性天然DNA序列(SEQ ID NO:19)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)。SEQ ID NO:20所示的天然蛋白包括485个氨基酸。SEQ ID NO:21中示出了具有His-标签和接头(MHHHHHHGS)的重组蛋白(图7C)。
LI0726是一种S-腺苷甲硫氨酸合酶并且位于细胞的细胞质中。其催化甲硫氨酸和ATP形成S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)。图8A和8B分别示出了LI0726的代表性天然DNA序列(SEQID NO:22)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)。SEQ ID NO:23中所示的天然蛋白包括404个氨基酸。SEQ ID NO:24中示出了具有His-标签和接头(MHHHHHHGS)的重组蛋白(图8C)。
LI0823是一种Xaa-Pro-氨肽酶,其催化多肽链中N-末端氨基酸残基的水解并且具有氨肽酶活性。图9A和9B分别示出了LI0823的代表性天然DNA序列(SEQ ID NO:25)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO:26)。SEQ ID NO:26所示的天然蛋白包括363个氨基酸。SEQ IDNO:27中示出了具有His-标签和接头(MHHHHHHGS)的重组蛋白(图9C)。
LI0625是一种60kDa的伴侣蛋白,其防止错误折叠并促进在应激条件下生成的未折叠多肽的重新折叠和正确组装。图10A和10B分别示出了LI0625的代表性天然DNA序列(SEQ ID NO:28)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO:29)。SEQ ID NO:29所示的天然蛋白包括548个氨基酸。SEQ ID NO:30中示出了具有His-标签和接头(MHHHHHHGS)的重组蛋白(图10C)。
LI0794是一种ATP依赖性Clp蛋白酶蛋白水解亚基并且存在于细胞内。其在需要ATP水解的过程中切割各种蛋白质中的肽,具有胰凝乳蛋白酶样活性,并在错误折叠蛋白质的降解中起主要作用。图11A和11B分别示出了LI0794的代表性天然DNA序列(SEQ ID NO:31)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO:32)。SEQ ID NO:32所示的天然蛋白包括209个氨基酸。SEQ ID NO:33中示出了具有His-标签和接头(MHHHHHHGSEF)的重组蛋白(图11C)。
如上所描述,任何这些胞内劳森菌抗原以及来自不同菌株和分离物的相应抗原可以单独或组合用于本文所描述的免疫原性组合物中,以提供保护免受胞内劳森菌感染。组合物可以包括来自多于一个菌株或分离物的胞内劳森菌抗原。因此,亚单位组合物或整合蛋白的各个组分可以获自相同的胞内劳森菌菌株或分离物或者获自不同的胞内劳森菌菌株或分离物。
此外,亚单位组合物中存在的胞内劳森菌抗原可以包括本文所描述的任何胞内劳森菌蛋白的各种组合,诸如rLI0710、rLI1153、rLI0169、LI0649、rLI0786、rLI1171、rLI0608、rLI0726、rLI0823、rLI0625和rLI0794中的一种或多种。
免疫原性组合物可以包括离散抗原,即单独提供的分离并纯化的抗原,或者可以包括所需抗原的融合体。融合体可以包括两种或更多种免疫原性胞内劳森菌蛋白,诸如二、三、四、五、六、七、八、九、十种等,如一种或多种本文所描述的胞内劳森菌抗原,或者来自对应于胞内劳森菌抗原的其他胞内劳森菌菌株或分离物的抗原。另外,如上所描述,融合体中存在的抗原可以包括全长氨基酸序列,或者这些序列的片段或变体,只要抗原刺激免疫应答(优选保护性免疫应答)即可。可以存在来自这些抗原的至少一个表位。在一些实施方式中,融合体可以包括所需表位的重复。如上所描述,融合体中存在的抗原可以来源于相同的胞内劳森菌菌株或分离物,或者来自不同的菌株或分离物,以提供抵抗更广泛的胞内劳森菌细菌的防护。
在某些实施方式中,融合体包括多种抗原,诸如来自一种特定胞内劳森菌抗原的多个表位,和/或来自多种胞内劳森菌抗原的表位。表位可以作为全长抗原序列提供,或以包括表位的部分序列提供。表位可以来自相同的胞内劳森菌菌株或分离物,或不同的胞内劳森菌菌株或分离物。此外,表位可以来源于相同的胞内劳森菌蛋白,或者来源于来自相同或不同胞内劳森菌菌株或分离物的不同胞内劳森菌蛋白。
更特别地,嵌合融合蛋白可以包含多个表位,来自相同或不同菌株或分离物的许多不同胞内劳森菌蛋白、以及选定的胞内劳森菌序列的多重或串联重复、选定的胞内劳森菌表位的多重或串联重复、或其任何可能的组合。可以使用如本文所描述的技术来鉴别表位,或者可以测试胞内劳森菌蛋白片段的免疫原性并且在组合物中使用活性片段代替整个多肽。融合体也可以包括全长序列。
融合体中存在的抗原序列可以由间隔区隔开,但不必隔开。选定的间隔区序列可以编码多种长度为一个或多个氨基酸的部分。选择的间隔区基团还可以提供酶切位点,以便表达的嵌合分子可以在体内被蛋白水解酶加工,产生许多肽。
例如,氨基酸可以被用作间隔区序列。此种间隔区通常可包括1-500个氨基酸,诸如1-100个氨基酸,例如1-50个氨基酸,诸如1-25个氨基酸,1-10个氨基酸,1-5个氨基酸或1-500之间的任何整数。各个抗原之间的间隔区氨基酸可以相同或不同。特别优选用作间隔区的氨基酸是具有小侧基团的氨基酸,诸如丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸和缬氨酸。可以使用氨基酸的各种组合或者相同氨基酸的重复。
为了增强胞内劳森菌蛋白以及多抗原融合分子的免疫原性,它们可以与载体偶联。“载体”是指当与目的抗原缔合时赋予抗原免疫原性的任何分子。合适的载体的例子包括大的、缓慢代谢的大分子,例如:蛋白质;多糖,如琼脂糖、琼脂糖、纤维素、纤维素珠等;聚合氨基酸,诸如聚谷氨酸、聚赖氨酸等;氨基酸共聚物;无活性的病毒颗粒;细菌毒素,诸如破伤风类毒素、血清白蛋白、钥孔虫戚血兰素、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、抹香鲸肌红蛋白和本领域技术人员已知的其他蛋白。
这些载体可以以其天然形式使用,或者它们的官能团含量可以通过例如赖氨酸残基的琥珀酰化或与Cys-硫内酯反应进行修改。巯基也可以通过例如氨基官能团与2-亚氨基硫杂环戊烷或3-(4-二硫代吡啶基)丙酸酯的N-羟基琥珀酰亚胺酯的反应掺入到载体(或抗原)中。适合的载体还可以经修饰以掺入用于附接肽的间隔臂(诸如六亚甲基二胺或其他类似大小的双官能分子)。
附加地,胞内劳森菌蛋白和多个抗原融合分子可以融合到载体分子的羧基或氨基末端或两者,或融合在载体内部的位点。
可以使用标准偶联反应将载体与目的蛋白进行物理偶联。替代地,可以重组地制备用于本发明的嵌合分子,诸如通过将编码适合多肽载体的基因融合至编码选定的胞内劳森菌蛋白或胞内劳森菌多表位融合分子的基因或其片段的一个或多个副本。
优选地,上述抗原、融合体和载体偶联物是重组产生的。可以将编码这些蛋白的多核苷酸引入到可以在适当表达系统中表达的表达载体中。本领域可获得多种细菌、酵母、哺乳动物和昆虫表达系统,并且可以使用任何此类表达系统。任选地,可以在无细胞翻译系统中翻译编码这些蛋白的多核苷酸。此类方法是本领域众所周知的。也可以通过固相蛋白合成来构建蛋白。
B.胞内劳森菌多核苷酸
用于本组合物中的编码胞内劳森菌抗原的胞内劳森菌多核苷酸可以来源于任何胞内劳森菌菌株或分离物。
SEQ ID No:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28和31(分别为图1A、2A、3A、4A、5A、6A、7A、8A、9A、10A和11A)示出了编码胞内劳森菌抗原的代表性多核苷酸序列。多核苷酸可以被修饰以在特定的宿主细胞诸如大肠杆菌中表达。
编码胞内劳森菌抗原的多核苷酸序列可以编码全长氨基酸序列,或这些序列的片段或变体,只要所得抗原刺激免疫应答(优选保护性免疫应答)即可。因此,多核苷酸可以编码具有如上所描述缺失或添加的抗原。
一旦分离或合成了所需抗原的编码序列,就可以将它们克隆到任何合适的载体或复制子中进行表达。许多克隆载体是本领域技术人员已知的,并且选择合适的克隆载体是一个选择问题。本领域可获得多种细菌、酵母、植物、哺乳动物和昆虫表达系统,并且可以使用任何此类表达系统。任选地,可以在无细胞翻译系统中翻译编码这些蛋白的多核苷酸。此类方法是本领域众所周知的。
用于克隆的重组DNA载体和它们可以转化的宿主细胞的例子包括噬菌体λ(大肠杆菌)、pBR322(大肠杆菌)、pACYC177(大肠杆菌)、pKT230(革兰氏阴性菌)、pGV1106(革兰氏阴性菌)、pLAFR1(革兰氏阴性菌)、pME290(非大肠杆菌革兰氏阴性菌)、pHV14(大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)、pBD9(芽孢杆菌)、pIJ61(链霉菌)、pUC6(链霉菌)、YIp5(酵母菌)、YCp19(酵母菌)和牛乳头状瘤病毒(哺乳动物细胞)。一般参见Sambrook et al.,Molecular Cloning,alaboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York。
也可以使用昆虫细胞表达系统,例如杆状病毒系统,并且是本领域技术人员已知的。可以使用植物表达系统来生产免疫原性蛋白。通常,此类系统使用基于病毒的载体来用异源基因转染植物细胞。
病毒系统,例如基于牛痘的感染/转染系统,也可用于本发明。在这种系统中,首先用编码噬菌体T7 RNA聚合酶的痘苗病毒重组体在体外转染细胞。这种聚合酶表现出极好的特异性,因为它只转录带有T7启动子的模板。感染后,由T7启动子驱动用目标DNA转染细胞。牛痘病毒重组体在细胞质中表达的聚合酶将转染的DNA转录成RNA,然后由宿主翻译机制翻译成蛋白。方法提供了大量RNA及其翻译产物的高水平、瞬时、细胞质生产。
可以将编码序列置于启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)和任选的操纵子(在本文中统称为“控制元件”)的控制之下,以便编码所需抗原的DNA序列在被含有该表达结构的载体转化的宿主细胞中转录成RNA。编码序列可包含或可不包含信号肽或前导序列。前导序列可以在翻译后处理中被宿主去除。
其他调控序列也可能是合乎需要的,它们允许相对于宿主细胞的生长调节蛋白序列的表达。此类调控序列是本领域技术人员已知的,并且实例包括响应于化学或物理刺激(包括存在的调控化合物)而导致基因表达开启或关闭的那些。其他类型的调控元件也可以存在于载体中,例如增强子序列。
可以在插入到载体中之前,将控制序列和其他调控序列连接到编码序列。或者,可以将编码序列直接克隆到已经含有控制序列和适当限制性位点的表达载体中。
在某些情况下,可能需要修饰编码序列,以便它可以以适当的方向附接至控制序列;即保持正确的阅读框架。还可取的是生产免疫原性蛋白的突变体或类似物。可以通过缺失编码蛋白质的序列的一部分、通过插入序列和/或通过替换序列中的一个或多个核苷酸来制备突变体或类似物。用于修饰核苷酸序列的技术,例如定点诱变,是本领域技术人员众所周知的。参见例如Sambrook et al.,Molecular Cloning,a laboratory manual,ColdSpring Harbor Laboratories,New York。
然后使用表达载体来转化合适的宿主细胞。许多哺乳动物细胞系是本领域已知的,并且包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系,诸如但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)以及其他细胞。类似地,诸如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和链球菌属等细菌宿主可与本表达构建体一起使用。可用于本发明的酵母宿主尤其包括酿酒酵母、白色念珠菌、麦芽糖念珠菌、多形汉逊酵母、脆弱克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、贝氏毕赤酵母、毕赤酵母、粟酒裂殖酵母和解脂耶氏酵母。用于杆状病毒表达载体的昆虫细胞尤其包括埃及伊蚊、苜蓿银纹夜蛾、家蚕、黑腹果蝇、草地贪夜蛾和粉纹夜蛾。
根据所选择的表达系统和宿主,本发明的蛋白是通过在表达目的蛋白的条件下生长由上述表达载体转化的宿主细胞来产生的。合适生长条件的选择在本领域技术范围内。如果不分泌蛋白,则使用化学、物理或机械方法破碎细胞,其溶解细胞但保持蛋白基本完整。细胞破碎后,通常通过离心去除细胞碎片。无论是在细胞内产生还是分泌,都可以使用标准纯化技术进一步纯化蛋白,标准纯化技术例如但不限于柱色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、电泳、高效液相色谱(HPLC)、免疫吸附技术、亲和色谱、免疫沉淀等。
C.抗体
本发明的抗原可以用来生产用于治疗(例如被动免疫)、诊断和纯化目的的抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体制剂、单特异性抗血清,或者可以是杂交或嵌合抗体,诸如人源化抗体、改变的抗体、F(ab')2片段、F(ab)片段、Fv片段、单结构域抗体、二聚体或三聚体抗体片段构建体、微型体或与所讨论的抗原结合的其功能性片段。使用本领域技术人员熟知的技术生产抗体。
对于已知患有胞内劳森菌相关疾病的受试者,抗-胞内劳森菌-抗原抗体可能具有治疗益处并且可以用来向所讨论的受试者赋予被动免疫。或者,抗体可用于如下文进一步描述的诊断应用,以及用于纯化目的抗原。
D.组合物
胞内劳森菌分子可配制成组合物以递送给受试者,从而引发免疫应答,例如抑制感染。如上所描述,本发明的组合物可包含非胞内劳森菌抗原或胞内劳森菌抗原的组合,或与非胞内劳森菌抗原或与胞内劳森菌抗原的组合共同给予。制备此类配方的方法描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania,22nd Edition,2012。本发明的组合物可以制成注射剂,可以是液体溶液或悬浮液。也可以制备适合在注射前溶解或悬浮在液体载体中的固体形式。制剂还可以被乳化或者活性成分被包封在脂质体载体中。通常将活性免疫原性成分与相容的药物载体混合,诸如例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的组合。此外,如果需要,载体可以含有少量辅助物质,如润湿剂或乳化剂和pH缓冲剂。
不可以向配方中添加增强组合物效力的佐剂。此类佐剂包括增加对胞内劳森菌抗原或抗原组合的免疫应答的任何化合物或化合物组合,从而减少疫苗中所需抗原的量,和/或为产生足够免疫应答所需的注射频率。
例如,在本组合物中可以使用例如美国专利No.9,061,001(通过引用以其整体并入本文)中描述的三重佐剂配方。三重佐剂配方包括宿主防御肽和聚阴离子聚合物,诸如聚磷腈,以及具有免疫刺激特性(ISS)的核酸序列,诸如带有或不带有CpG基序(胞嘧啶后接鸟苷并通过磷酸键连接)的寡脱氧核苷酸分子或合成的dsRNA类似物聚(I:C)。
用于组合佐剂以及单独与抗原一起使用的宿主防御肽的例子包括但不限于HH2(VQLRIRVAVIRA,SEQ ID NO:34);1002(VQRWLIVWRIRK,SEQ ID NO:35);1018(VRLIVAVRIWRR,SEQ ID NO:36);Indolicidin(ILPWKWPWWPWRR,SEQ ID NO:37);HH111(ILKWKWPWWPWRR,SEQ ID NO:38);HH113(ILPWKKPWWPWRR,SEQ ID NO:39);HH970(ILKWKWPWWKWRR,SEQ ID NO:40);HH1010(ILRWKWRWWRWRR,SEQ ID NO:41);乳酸链球菌肽Z(Ile-Dhb-Ala-Ile-Dha-Leu-Ala-Abu-Pro-Gly-Ala-Lys-Abu-Gly-Ala-Leu-Met-Gly-Ala-Asn-Met-Lys-Abu-Ala-Abu-Ala-Asn-Ala-Ser-Ile-Asn-Val-Dha-Lys,SEQ ID NO:42);JK1(VFLRRIRVIVIR,SEQ ID NO:43);JK2(VFWRRIRVWVIR,SEQ ID NO:44);JK3(VQLRAIRVRVIR,SEQ ID NO:45);JK4(VQLRRIRVWVIR,SEQ ID NO:46);JK5(VQWRAIRVRVIR,SEQ ID NO:47);和JK6(VQWRRIRVWVIR,SEQ ID NO:48)。本文中可以使用任何上述肽以及展示适合生物活性的其片段和类似物,活性诸如调节免疫应答的能力,例如增强对共同递送抗原的免疫应答。
在三重佐剂组合物中使用或单独使用的ISS的示例性非限制性例子包括CpG寡核苷酸或非-CpG分子。“CpG寡核苷酸”或“CpG ODN”是指含有至少一个胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(即5'胞苷后接3'鸟苷并通过磷酸键连接)并且激活免疫系统的免疫刺激核酸。“未甲基化的CpG寡核苷酸”是一种核酸分子,其含有未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(即未甲基化的5'胞苷后接3'鸟苷并通过磷酸键连接)并激活免疫系统。“甲基化的CpG寡核苷酸”是一种核酸,其含有甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(即甲基化的5'胞苷后接3'鸟苷并通过磷酸键连接)并激活免疫系统。CpG寡核苷酸是本领域中众所周知的并且描述于例如美国专利No.6,194,388;6,207,646;6,214,806;6,218,371;6,239,116和6,339,068;PCT公开No.WO 01/22990;PCT公开No.WO 03/015711;美国公开No.20030139364,所描述专利和公开通过引用以其整体并入本文。
此类CpG寡核苷酸的例子包括但不限于5’TCCATGACGTTCCTGACGTT3’,称为CpG ODN1826(SEQ ID NO:49),B类CpG;5’TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT3’,称为CpG ODN 2007(SEQ IDNO:50),B类CpG;5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3’,也称为CPG 7909或10103(SEQ ID NO:51),B类CpG;5'GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3',称为CpG 8954(SEQ ID NO:52),A类CpG;和5’TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3’,也称为CpG 2395或CpG 10101(SEQ ID NO:53),C类CpG。所有上述B类和C类分子都被完全硫代磷酸化。
用于本组合物中的非-CpG寡核苷酸包括双链聚核糖肌苷酸:聚核糖胞苷酸也称为聚(I:C);和非-CpG寡核苷酸5’AAAAAAGGTACCTAAATAGTATGTTTCTGAAA3’(SEQ ID NO:54)。
用于三重组合佐剂或单独使用的聚阴离子聚合物包括聚磷腈(有时称为“聚磷嗪”)。通常,与本佐剂组合物一起使用的聚磷腈可以是聚合物水溶液或聚合物微粒的形式,具有或不具有包封或吸附的物质,如抗原或其他佐剂。例如,聚磷腈可以是可溶性聚磷腈,诸如聚磷腈聚电解质,其具有含有例如羧酸、磺酸或羟基部分的电离或可电离侧基以及在使用条件下易于水解以赋予聚合物可生物降解特性的侧基。此类聚磷腈聚电解质众所周知并且描述于例如美国专利No.5,494,673;5,562,909;5,855,895;6,015,563和6,261,573,它们通过引用以其整体并入本文。或者,本文也可以使用交联微粒形式的聚磷腈聚合物。此类交联的聚磷腈聚合物微粒是本领域公知的并且描述于例如美国专利No.5,053,451;5,149,543;5,308,701;5,494,682;5,529,777;5,807,757;5,985,354和6,207,171,它们通过引用以其整体并入本文。
本文使用的特定聚磷腈聚合物的例子包括各种形式的聚[二(羧基苯氧基钠)磷腈](PCPP)和聚(二-4-氧基苯丙酸酯)磷腈(PCEP),诸如钠盐或酸性形式,以及由带有不同百分比羟基的PCPP或PCEP共聚物组成的聚合物,例如90:10PCPP/OH。本文描述的组合物可以使用环状或直链聚磷腈。合成这些化合物的方法是已知的并且描述于以上引用的专利中以及描述于Andrianov et al.,Biomacromolecules(2004)5:1999;Andrianov et al.,Macromolecules(2004)37:414;Mutwiri et al.,Vaccine(2007)25:1204。预期的环状聚磷腈可以包括在下述中找到的那些:环聚磷腈、相关的制备方法和使用方法,美国临时申请号No:YYY。
附加佐剂包括明矾、基于壳聚糖的佐剂、和各种皂苷中的任何一种、油和本领域已知的其他物质,诸如AMPHIGENTM,它包含溶解在油(通常是轻质液体石蜡)中的脱油卵磷脂。在疫苗制剂中,AMPHIGENTM以水包油乳液的形式分散在免疫抗原的水溶液或悬浮液中。其他佐剂是LPS、细菌细胞壁提取物、细菌DNA、合成的寡核苷酸及其组合(Schijns et al.,Curr.Opi.Immunol.(2000)12:456)、草分枝杆菌(M.phlei)细胞壁提取物(MCWE)(美国专利No.4,744,984)、草分枝杆菌DNA(M-DNA)和M-DNA-草分枝杆菌细胞壁复合物(MCC)。例如,本文中可用作乳化剂的化合物包括天然和合成乳化剂,以及阴离子、阳离子和非离子化合物。在合成化合物中,阴离子乳化剂包括例如月桂酸和油酸的钾、钠和铵盐,脂肪酸的钙、镁和铝盐(即金属皂),以及有机磺酸盐如月桂基硫酸钠。合成阳离子试剂包括例如十六烷基三甲基溴化铵,而合成非离子试剂的例子是甘油酯(例如单硬脂酸甘油酯)、聚氧乙烯乙二醇酯和醚、以及脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)和它们的聚氧乙烯衍生物(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)。天然乳化剂包括金合欢、明胶、卵磷脂和胆固醇。
其他合适的佐剂可以由油组分形成,例如单一油、油混合物、油包水乳液或水包油乳液。油可以是矿物油、植物油或动物油。优选矿物油或油组分为矿物油的水包油乳液。另一种油组分是以商品名出售的水包油乳液,诸如但不限于可从MVPLaboratories,Ralston,NE获得的包含轻质矿物油以及0.05%福尔马林和30μg/mL庆大霉素作为防腐剂的EMULSIGEN本文还使用称为“VSA3”的佐剂,其是包含DDA的EMULSIGEN的改良形式(参见美国专利No.5,951,988,通过引用以其整体并入本文)。本文中也可以使用佐剂MONTANIDETM。适合的矿物油包括例如鳕鱼肝油、大比目鱼油、鲱鱼油、大西洋胄胸鲷油和鲨鱼肝油,所有这些都可以市售的。适合的植物油包括但不限于菜籽油、杏仁油、棉籽油、玉米油、橄榄油、花生油、红花油、芝麻油、豆油等。
替代地,许多脂肪族含氮碱可用作疫苗配方的佐剂。例如,已知的免疫佐剂包括胺、季铵化合物、胍、苯甲脒和硫脲盐(Gall,D.(1966)Immunology 11:369 386)。具体化合物包括二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)(可从Kodak获得)和N,N-双十八烷基-N,N-双(2-羟乙基)丙二胺("AVRIDINE")。已经描述了DDA作为免疫佐剂的用途;参见例如KodakLaboratory Chemicals Bulletin 56(1):1 5(1986);Adv.Drug Deliv.Rev.5(3):163 187(1990);J.Controlled Release 7:123 132(1988);Clin.Exp.Immunol.78(2):256 262(1989);J.Immunol.Methods 97(2):159 164(1987);Immunology 58(2):245 250(1986);和Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.68(3):201 208(1982)。AVRIDINE也是众所周知的佐剂。参见例如通过引用整体并入本文的美国专利No.4,310,550,其大致描述了N,N-高级烷基-N',N'-双(2-羟乙基)丙烷二胺且特别是AVRIDINE作为疫苗佐剂的用途。通过引用整体并入本文的Babiuk的美国专利No.5,151,267以及Babiuk et al.(1986)Virology 159:5766也涉及AVRIDINE作为疫苗佐剂的用途。
在某些情况下,配方可以包含粘膜粘附脂质载体系统,诸如本领域已知的那些,例如通过引用并入本文的题为“粘膜粘附脂质递送系统”的PCT申请序列号no.PCT/CA2019/051347中的那些。粘膜粘附脂质载体系统当通过合适的方法给予时,例如粘膜或肌肉内给予,可以增强对选定抗原的免疫应答。在某些实施方式中,粘膜粘附脂质载体包含阳离子脂质体,例如但不限于包含从1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、3β-[N-(N',N'-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基](DC)、二甲基双十八烷基铵(DDA)、十八烷基胺(SA)、二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、蛋L-α-磷脂酰胆碱(EPC)、胆固醇(Chol)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵-丙烷(DMTAP)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或神经酰胺氨基甲酰基-精胺(CCS)中选择的一种或多种阳离子脂质的粘膜粘附阳离子脂质载体。
一旦制备,配方将包含“药学有效量”的活性成分,即能够在给予组合物的受试者中实现所需响应的量。在胞内劳森菌疾病的治疗和预防中,“药学有效量”可以优选是预防、减少或改善所讨论疾病的症状的量。本领域技术人员使用标准测试可很容易确定准确的量。活性成分通常占组合物的约1%至约95%(w/w),或者甚至更高或更低(如果合适)。使用本发明的配方,当每受试者给予1至5mL剂量时,每mL注射溶液1μg至2mg(诸如10μg至1mg,例如25μg至0.5mg,50μg至200μg,或这些范围之间的任何值)的活性成分应足以治疗或预防感染。给予量取决于待治疗的受试者、受试者免疫系统合成抗体的能力以及所需的保护程度。本领域普通技术人员可以通过建立剂量响应曲线的常规试验容易地确定有效剂量。
组合物可以肠胃外给予,例如通过气管内、肌肉内、皮下、腹膜内或静脉内注射。向受试者给予至少一剂组合物。另外,可以向受试者给予尽可能多的剂量以产生所需的生物学效应。
适用于其他给予方式的其他配方包括栓剂,在某些情况下,还包括气雾剂、粘膜(如鼻内)、口服配方和缓释配方。对于栓剂,载体组合物可以包括传统的粘合剂和载体,例如聚碱二醇或甘油三酯。此类栓剂可由含有约0.5%至约10%(w/w)、优选约1%至约2%的活性成分的混合物形成。口服载体包括通常使用的赋形剂,例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精纤维素钠、碳酸镁等。这些口服疫苗组合物可以溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释配方或粉末的形式服用,并且含有约10%至约95%的活性成分,优选约25%至约70%。
粘膜配方,例如鼻内、阴道内、直肠内和宫内配方,通常包括限制对粘膜刺激的载体。在鼻内配方的情况下,载体可既不会刺激粘膜也不会显著干扰纤毛功能。本发明可以使用稀释剂,例如水、盐水或其他已知物质。鼻用配方还可含有防腐剂,例如但不限于氯丁醇和苯扎氯铵。可存在表面活性剂以增强鼻粘膜对受试者抗原的吸收。
控释或缓释配方可以通过将抗原掺入到载体或载具中来制得,载体或载具计如脂质体,不可吸收的不可渗透聚合物如乙烯醋酸乙烯酯共聚物和HYTREL共聚物,可溶胀聚合物如水凝胶,可吸收聚合物例如胶原蛋白和某些多元酸或聚酯,例如用于制造可吸收缝合线的那些,聚磷腈,藻酸盐,微粒,明胶纳米球,壳聚糖纳米颗粒等。也可以使用本领域众所周知的植入式微型泵来递送本文所描述的抗原。
疫苗可向哺乳动物(例如哺乳仔猪、断奶仔猪、生长猪或小母猪/母猪)给予。疫苗也可向小马驹、母马、公猪或种马,或本文所描述的任何其他各种物种给予。
可以采用启动增强方法,其中在“启动”步骤中递送一种或多种组合物,随后在“增强”步骤中递送一种或多种组合物。在某些实施方式中,用本文所描述的一种或多种组合物启动和增强之后是另外的增强。递送的组合物可以包括以任何顺序和通过任何给予途径给予的相同抗原或不同抗原。
E.确定免疫应答效力的测试
评估治疗性治疗效果的一种方式包括在给予本发明的组合物后监测感染。评估预防性治疗功效的一种试包括在给予组合物之后监测本发明组合物中胞内劳森菌抗原的免疫应答。评估本发明的免疫原性组合物的免疫原性的另一种方式是通过免疫印迹筛选受试者的血清。阳性反应表明受试者先前已对胞内劳森菌抗原产生了免疫应答,即胞内劳森菌蛋白是一种免疫原。该方法也可用于鉴别表位。
检查治疗性治疗功效的另一种方式包括在给予本发明的组合物后监测感染。检查预防性治疗功效的一种方式包括在给予组合物之后,监测针对本发明组合物中抗原的全身性(诸如监测IgG1和IgG2a的产生水平)和粘膜(例如监测IgA的产生水平)的免疫应答。典型地,血清特异性抗体应答是在免疫后但挑战之前确定的,而粘膜特异性抗体应答是在免疫后和挑战后确定的。
可以在宿主给予之前在体外和体内动物模型中评价本发明的免疫原性组合物。
还可以使用免疫原性组合物挑战感染的动物模型在体内确定本发明的免疫原性组合物的功效。免疫原性组合物可以或可以不是来源于与挑战菌株相同的菌株。优选地,免疫原性组合物可来源于与挑战菌株相同的菌株。
免疫应答可以是TH1型免疫应答和TH2型应答之一或两者。免疫应答可以是改善的或增强的或改变的免疫应答。免疫应答可以是全身和粘膜免疫应答之一或两者。增强的全身和/或粘膜免疫反映在增强的TH1型和/或TH2型免疫应答中。优选地,增强的免疫应答包括IgG1和/或IgG2a和/或IgA的产生增加。优选地,粘膜免疫应答是一种TH2型免疫应答。优选地,粘膜免疫应答包括IgA产生增加。
活化的TH2细胞可增强抗体产生,因此在应对细胞外感染方面具有价值。活化的TH2型细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一种或多种。TH2免疫应答可导致产生IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞,以备将来保护。
TH1型免疫应答可包括以下中的一种或多种:CTL增加,一种或多种与TH1型免疫应答相关的细胞因子(如IL-2、IFNγ和TNFβ)增加,活化巨噬细胞增加,NK活性增加和IgG2a产生增加。优选地,增强的TH1型免疫应答将包括IgG2a产生增加。
本发明的免疫原性组合物可以优选地诱导持久的免疫力,在接触一种或多种感染性抗原时可以迅速进行响应。
F.试剂盒
本发明还提供了包含一个或多个本发明组合物的容器的试剂盒。组合物可以是液体形式,也可以是冻干的,单个抗原也可以。适合用于组合物的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可以由多种材料制成,包括玻璃或塑料。容器可能具有无菌存取口(例如,容器可以是静脉溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。
该试剂盒还可包括第二容器,其中包含药学上可接受的缓冲液,例如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液或葡萄糖溶液。它还可以含有对最终用户有用的其他材料,包括其他药学上可接受的配制溶液,例如缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器或其他递送装置。该试剂盒还可包括包含佐剂的第三组件。
试剂盒还可以包含包装插页,含有关于诱导免疫或治疗感染的方法的书面或计算机可读说明。包装插页可以是未经批准的包装插页草稿,也可以是食品和药物管理局(FDA)或其他监管机构批准的包装插页。
本发明还提供了一种预填充了本发明的免疫原性组合物的递送装置。
类似地,试剂盒中可以提供有抗体,具有适合的说明以及其他所需的试剂。取决于抗体是否用于免疫测定,试剂盒还可以含有合适的标签和其他包装的试剂和材料(即洗涤缓冲液等)。可以使用这些试剂盒进行标准免疫测定。
3.实验
以下是用于实施本发明的具体实施方式的实施例。提供的实施例仅用于说明目的,并不旨在以任何方式限制本发明的范围。
已努力确保所用数字(例如量、温度等)的准确性,但当然应允许一些实验误差和偏差。
材料和方法
细胞培养条件:
在具有5%牛胎儿血清(FBS)(Sigma-Aldrich,Oakville,ON,Canada)、青霉素/链霉素(Gibco 5000单位/mL青霉素,5000μg/mL链霉素)、胰岛素(10μg/mL)、转铁蛋白(5.5μg/mL)、硒(5ng/mL)(ITS;Sigma-Aldrich,Oakville,ON,Canada))和5ng/mL表皮生长因子(Sigma-Aldrich,Oakville,ON,Canada)的DMEM/F-12(SH30271.01;HyCloneTM(ThermoFisher Scientific,San Jose,CA,USA))中,培养和维持来源于未哺乳的一日龄仔猪的空肠和回肠的未分化猪肠上皮细胞系(IPEC-1)(Cano et al.,PLOS One(2013)8:e53647)。将细胞保持在37℃下在5%CO2和95%空气气氛中的加湿培养箱中,并在Corning 75cm2细胞培养瓶中以1:5的比例每周传代两次。如上所描述,但在没有抗生素的情况下生产用于胞内劳森菌感染和中和测定的IPEC-1细胞。
胞内劳森菌蛋白样品制备
将从感染的McCoy细胞制备的胞内劳森菌团粒(详述于Lawson et al.,J.Clin.Microbiol.(1993)31:1136-1142)重悬于用0.1M在异丙醇(Sigma-Aldrich)中的PMSF(Sigma-Aldrich)完成的放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液中(0.05M Tris pH 8,BioBasic Canada INC,Markham.ON,Canada);0.15M氯化钠(Bio Basic Canada INC.);0.10%SDS(Bio Basic Canada INC.);1%脱氧胆酸(VWR-Amresco,Dublin,Ireland);1%NonidetP40代用品(Sigma-Aldrich);蒸馏水)。将样品冷冻/解冻3次以使细胞破裂,并将混合物以10,000x g离心10分钟。然后用冰冷的丙酮从上清液中沉淀出细菌蛋白。将混合物涡旋并在-20℃下储存1小时,然后将温育混合物以14,000x g离心10分钟。按照制造商的说明(Pierce,Thermo Fisher Scientific),小心丢弃上清液并干燥沉淀,然后用NaHCO3缓冲液重新悬浮并通过二辛可宁酸(BCA)分析进行定量。
遵循制造商推荐的协议,以8:1的染料/蛋白摩尔比使用Cy5染料(GE HealthcareLife Sciences-Amersham Biosciences,Mississauga,ON,Canada)标记胞内劳森菌蛋白。将混合物在室温下避光温育4小时。使用3000MWCO 15mL体积过滤器(Millipore,Etobicoke,ON,Canada)通过尺寸过滤去除未结合的染料,并额外洗涤四次。在2DE之前,通过BCA测定(Pierce)确定Cy5-标记的胞内劳森菌蛋白的最终浓度。
Cy5-标记的胞内劳森菌蛋白与IPEC细胞的结合:
IPEC-1细胞在T-75烧瓶中生长至汇合,用不含抗生素和FBS的IPEC培养基进行三重处理和洗涤3次。接着,在4℃下温和章动,使用700μgCy5-标记的细菌蛋白将1x106个IPEC细胞温育3小时。如上所描述将细胞离心并且与上清液一起去除未结合的胞内劳森菌蛋白。然后将IPEC-1细胞和结合的胞内劳森菌蛋白重新悬浮于具有PMSF(Sigma-Aldrich)的RIPA缓冲液中,并且如上所描述进行重复冷冻/解冻。然后对IPEC-1蛋白和Cy5-标记的粘附胞内劳森菌蛋白进行二维凝胶电泳(2DE)。
二维凝胶电泳:
将来自裂解IPEC-1细胞的蛋白和结合的Cy5-标记的胞内劳森菌(250μg分析凝胶,600μg用于制备凝胶)重新悬浮在再水化缓冲液中过夜(9M尿素,2%CHAPS(FisherBioReagents)、1%DTT(Promega,Medison,Wi,USA)、2%pharmalyte 5-8(GE Healthcare)、0.002%溴酚蓝(BioRad,Hercules,CA,USA))并且加载至IPG条带(ImmobilineTM DryStrip,pH 4-7,13cm,GE Healthcare)。使用逐步协议(150V步并且保持3h,300V步并且保持1200Vh,1000V递度至3900Vh,8000V梯度至13500Vh和8000V步并保持25000Vh),使用IPGphorTM装置(GE Healthcare-Amersham Biosciences)将条带分别进行等电聚焦(IEF)。IEF之后,将两个IPG条带存储在-80℃。在室温下将具有等电聚焦蛋白的IPG条带解冻并且在室温下将具有1%DTT(6M尿素,75mM Tris-HCl pH 8.8,29.3%甘油,2%SDS和0.002%溴酚蓝)的SDS平衡缓冲液平衡15分钟,随后使用具有2.5%碘乙酰胺(GE Healthcare)的SDS平衡缓冲液洗涤15分钟。平衡后,将条带置于SDS凝胶上并用密封溶液(0.5%琼脂糖在1xSDS电泳缓冲液中)覆盖。使用BIO-RAD protean II xi细胞仪和两个中号10%SDS PAGE凝胶进行二维电泳。使用90V恒定电压进行电泳16小时,同时对设备(Bio-Rad Power pack200,Hercules,CA,USA)进行恒定水冷。
蛋白质印迹分析和银染:
使用Bio-Rad Trans-Blot SD Semi-DryTM传递细胞(15V,60分钟)以半干转移将分析凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜(BIO-RAD,162-0094),然后使用兔超免疫血清(1:500;从用全细菌免疫的兔中获得)作为一级抗体进行蛋白质印迹(WB)分析。使用抗-兔IR800抗体(1μg/mL;Li-COR,Lincoln,NE,USA)作为二级抗体。使用Odyssey扫描仪(Li-COR)在IR 700和IR 800通道下对膜进行扫描。IR800-染色的蛋白指示了细菌蛋白对IPEC-1细胞具有亲和力并且被针对全细菌的免血清结合。
对于制备凝胶,使用银染色试剂盒(PROTSIL-1-KTTM,Sigma Aldrich)根据制造商的协议将胞内劳森菌蛋白染色并且该凝胶保留用于切下质谱分析用的凝胶点。
质谱用样品的制备:
使用无菌活检穿孔器(3mm直径)从制备凝胶中切下凝胶上对应于WB分析检测到的IR-800标记蛋白的银染蛋白,以避免凝胶样品被环境蛋白污染。收集凝胶塞,并储存在-20℃的超纯水中。将凝胶塞样品(标注为1.4,2.3,3.1,3.2和4)发送至Plateforme Protéomique Centre de Recherche du CHU de Québec CHUL,Québec,Canada进行质谱(MS)分析。
胰蛋白酶消化:
使用CHU de Québec Research Center(Quebec,Canada)的蛋白质组学平台进行蛋白消化和MS分析。将切下的凝胶片置于96孔板中,然后用水洗涤,然后使用液体处理机器人(MultiProbeTM,Perkin Elmer)根据制造商的说明进行胰蛋白酶消化。简言之,用10mMDTT将蛋白还原并且使用55mM碘乙酰胺烷基化。使用126nM改良猪胰蛋白酶(测序级,Promega,Madison,WI)在37℃下进行胰蛋白酶消化18小时。消化产物使用1%甲酸、2%乙腈、1%甲酸、50%乙腈提取。收集回收的提取物,真空离心干燥,然后重悬于12μl 0.1%甲酸中,通过MS分析5μl。
质谱:
通过在线反相(RP)纳米级毛细管液相色谱(nanoLC)进样并分离肽样品,并且通过电喷射质谱(ESI MS/MS)进行分析。使用连接至用Orbitrap Fusion Tune应用程序2.0驱动并配备有纳米电喷雾离子源的Orbitrap FusionTM质谱仪(Thermo Fisher Scientific)的Dionex UltiMateTM3000nanoRSLC色谱系统(Thermo Fisher Scientific/Dionex SoftronGmbH,Germering,Germany)进行实验。在5分钟期间,在加载溶剂(2%乙腈,0.05%TFA)中以20μL/min将肽捕获在5mm x 300μm C18 pepmap小柱预柱(Thermo Fisher Scientific/Dionex Softron GmbH,Germering,Germany)上。然后用填充有ReproSil-Pur C18-AQ 3-μm树脂(Dr.Maisch HPLC GmbH,Ammerbuch-Entringen,Germany)的自制50cm x 75μm内径分离柱在线切换预柱,并且在30分钟内使用从5-40%溶剂B(A:0.1%甲酸,B:80%乙腈,0.1%甲酸)的线性梯度以300nL/min对肽进行洗脱。使用Thermo XCalibur软件版本3.0.63使用数据依赖采集模式采集质谱。使用4e5的AGC目标、50ms的最大注入时间和120 000的分辨率在轨道阱中获得全扫描质谱(350至1800m/z)。使用锁定质量对m/z 445.12003硅氧烷离子进行内部校准。每次MS扫描后采集最强离子的碎片MS/MS谱图,总循环时间为3秒(最高速度模式)。所选离子使用四极杆分析器在1.6m/z的窗口中分离,并通过更高能量碰撞诱导解离(HCD)以35%的碰撞能量进行碎裂。通过线性离子阱以快速扫描速率检测所得碎片,AGC目标为1e4,最大注射时间为50ms。将先前碎片化的肽的动态排除设置为周期20秒和容差10ppm。
数据库检索:
使用Mascot(Matrix Science,London,UK;版本2.5.1)分析所有MS/MS样品。将Mascot设置为检索TAX_Desulfovibrio_CI_194924_20160714数据库(104802个条目),假设用胰蛋白酶消化。Mascot以碎片离子质量容差0.60Da和母离子容差10ppm进行检索。在Mascot中指定半胱氨酸的氨基甲酰甲基为固定修饰。脱酰胺的天冬酰胺和谷氨酰胺以及蛋氨酸的氧化在Mascot中被指定为可变修饰。允许两个错过的分裂。
蛋白鉴别的标准:
使用Scaffold(版本Scaffold_4.7.5,Proteome Software Inc.,Portland,OR)来验证MS/MS-基肽和蛋白鉴别。通过Peptide Prophet算法(Keller et al.,Anal.Chem.(20012)74:5383-5392)以Scaffoldδ-质量校正,如果肽鉴别可以在大于95.0%的概率下成立,则被接受。如果蛋白质鉴别可以在大于95.0%的概率下成立并且含有至少2个鉴别的肽,则被接受。蛋白概率由Peptide Prophet算法分配(Nesvizhskii et al.,Anal.Chem.(2003)75:4646-4658)。将含有相似肽并且仅基于MS/MS分析无法区分的蛋白进行分组以满足简约原则。
蛋白质的生物信息学分析:
将来自由质谱鉴别的肽的氨基酸序列提交给BLAST算法(Altschul etal.Nucl.Acids Res.(1997)25:3389-3402)以鉴别相应的蛋白。使用UniProt(uniprot.org)和Pfam(pfam.xfam.org)进行功能结构域和基序的预测并且蛋白列示于表2中。为了计算MS/MS检测的蛋白质的物理和化学参数,将蛋白序列提交给ExPasy ProtParam工具(web.expasy.org/protparam)(Gasteiger et al.,The Proteomics ProtocolsHandbook,Walker,J.M.(Ed.)Humana Press,Totowa,NJ(2005)pp.571-607)。
表2:MS检测的胞内劳森菌蛋白
分子克隆:
为了构建用于表达的蛋白,使用GenEluteTM细菌基因组DNA试剂盒(Sigma-Aldrich)遵循制造商的协议,从无毒胞内劳森菌N343分离细菌基因组DNA。使用PhusionTM高保真PCR试剂盒(New England Biosciences(NEB),Ispwitch,MA,USA)进行开放阅读框的PCR扩增。引物具有用于框内克隆的切割位点,N-末端His-标签包含在用于LI0169和LI0649的表达载体pET30a内以及用于其他剩余基因的pET30a.1内。两种质粒均为IPTG诱导型T7表达载体,C末端His标签(Novagen/Millapore Sigma,Burlington,MA,USA)。用于克隆各基因的引物见表3。这些基于胞内劳森菌(PHE/MN1-00)的基因组序列。凝胶纯化DNA,使用适当的限制性内切酶(BamHI/XhoI或NcoI/XhoI)切割并且使用T4 DNA连接酶(NEB,Ispwitch,MA,USA)连接到pET30a中。使用标准程序将所得的构建体转化至全能Dh5α大肠杆菌中。使用Presto MiniTM质粒试剂盒(Genaid,New Taipei City)从细菌中分离质粒DNA的储库。通过DNA测序和限制性消化验证克隆序列和载体插入。
重组胞内劳森菌蛋白在N末端包含用于纯化目的的带有接头的His标签。此外,从rLI0649和rLI0169中缺失了N末端跨膜结构域。在具有His标签序列的框内克隆的基因序列及表达蛋白见图1-11。
表3:引物
重组蛋白的表达和纯化:
在使用质粒转化后的LOBSTR-BL21(DE3)pRosetta2大肠杆菌(Kerafast,Inc.,Boston,MA,USA)中表达重组蛋白。在添加卡那霉素(50μg/mL)的2x YT培养基中使大肠杆菌生长至指数中期(OD=0.6)并且通过添加IPTG至1mM进行诱导。在16℃下以200rpm振荡将表达LI1153、LI0710、LI0649和LI0169的细菌温育16小时。在37℃下以200rpm振荡将表达LI0786、LI0726、LI0823、LI0794和LI0625的下细菌温育4小时。
通过离心收获用编码LI1153、LI0710、LI0649和LI0169的质粒转化的细菌,并且重新悬浮于尿素裂解缓冲液(8M尿素,50mM NaHPO4,300mM NaCl)中,然后超声以裂解细菌细胞。裂解液以20,000x g离心15分钟以去除不溶性物质。将含有目的重组蛋白的上清液与用尿素裂解缓冲液平衡的1mL His60超流树脂(Clontech,Takara Bio USA,Inc.,MountainView,CA,USA)温育并且章动至多4小时。将溶液倒入Ni超流树脂柱中,收集流出液并加到柱顶两次。然后用10mL洗涤缓冲液1(8M尿素和20mM咪唑在250mM磷酸钠缓冲液中和1.5MNaCl,pH 8.0)洗涤柱子。接下来,用洗涤缓冲液2(8M尿素和40mM咪唑在250mM磷酸钠缓冲液中和1.5M NaCl,pH 8.0)洗涤柱子。使用6mL洗脱缓冲液(8M尿素和500mM咪唑在250mM磷酸钠缓冲液中和1.5M NaCl,pH 8.0)从Ni-柱上洗脱蛋白。
通过离心收获用编码LI0786、LI0726、LI0823、LI0794和LI0625的质粒转化的细菌,并且将团粒重新悬浮于约50mL由溶解于100mL 10mM PBS和1%triton x-100中的Sigma无EDTA-的蛋白酶抑制剂片组成的缓冲液中。使溶液经受15,000psi的弗氏压碎器(AvestinC3均质器)。
对于rLI0786、rLI0794和rLI0625,将裂解的细菌丸粒化以去除细菌碎片并且将10mL等分试样含有目的重组蛋白的上清液与用尿素裂解缓冲液平衡的1mL His60超流树脂(Clontech,Takara Bio USA,Inc.,Mountain View,CA,USA)温育并且章动长达4小时。将溶液倒入到Ni超流树脂中,收集流出液并且加入到柱顶两次。然后,使用10mL洗涤缓冲液1(8M尿素和20mM咪唑在250mM磷酸钠缓冲液中和1.5M NaCl,pH 8.0)洗涤柱子。接下来,使用洗涤缓冲液2(8M尿素和40mM咪唑在250mM磷酸钠缓冲液中和1.5M NaCl,pH 8.0)洗涤柱子。使用6mL洗脱缓冲液(8M尿素和500mM咪唑在250mM磷酸钠缓冲液中和1.5M NaCl,pH 8.0)从Ni-柱上洗脱蛋白。
对于rLI0726和rLI0823,将裂解的细菌丸粒化并且收获这一级分以获得重组蛋白。将细菌丸粒重新悬浮于10mL平衡缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液,300mM NaCl,pH 8.0)中。然后,使用20ml平衡缓冲液+1%Triton x-100稀释2ml重悬丸粒。在12,000x g下将这一溶液旋转15分钟。将这一丸粒重悬于洗涤缓冲液3(6M盐酸胍和250mM磷酸钠缓冲液,pH 8.0)。使用1mL用尿素裂解缓冲液平衡的His60超流树脂(Clontech,Takara Bio USA,Inc.,Mountain View,CA,USA)温育10mL溶液并且章动长达4小时。收集流出液并两次加到柱顶。然后用洗涤缓冲液2洗涤树脂。使用6mL洗脱缓冲液(8M尿素和300mM咪唑在250mM磷酸钠缓冲液中和1.5M NaCl,pH 8.0)从Ni-柱上洗脱蛋白。
为了透析所有的重组蛋白,使用6-8,000MWCO分子多孔膜管(California,USA),用缓冲液(由4M和2M在250mM磷酸钠缓冲液中的尿素与1.5M NaCl组成,pH 8.0)逐步透析后,从纯化的蛋白中去除尿素。将透析的级分施加到Amicon 3kDa离心过滤器(Millipore/Simga)的顶部并且在3,000g下离心长达1小时。将磷酸盐缓冲盐水(100mM,约5mL)添加到Amicon膜的顶部并重复离心以从目的蛋白(留在膜的顶部)中冲洗尿素。将目的蛋白重新悬浮在2mL PBS中并用BCA测定进行定量。
蛋白质表达:
对存在和不存在IPTG的细菌蛋白进行SDS-PAGE分析(8%-12%),用考马斯蓝染色显示蛋白质的诱导。蛋白质印迹分析表明,rLI0710、rLI1153、rLI0169、rLI0649和rLI0625与来自具有PHE临床症状的动物的猪血清的抗体结合。
动物和免疫血清的产生:
如Obradovic et al.,J.Microbiol.Meth.(2016)126:60-66中所报道的,获取针对全细胞胞内劳森菌的兔血清。为了获得rLI0710、rLI0649、rLI0625和rLI1153的超免疫血清,将四只雌性新西兰白兔(2-3kg体重)保存在隔离单元中。兔通过皮下途径注射由100μg重组蛋白组成的接种体用于第一次免疫和50μg相同的重组蛋白用于两次加强注射。对于所有注射,将重组蛋白重新悬浮于500μL无菌PBS中并且与500μL无菌不完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich)混合至1mL最终体积,并且使用250μL接种体/位点,在4个注射点皮下给予疫苗。每只兔子在第0天、第20天和第40天接收四种重组蛋白中的一种。第一次接种60天后,安乐死(Euthanyl,Bimeda-MTC Animal Health INC.,Cambridge ON,Canada)后放血收集兔免疫血清。收集所有血样并离心(2500×g),然后将血清存储在-20℃下直至使用。
从兔免疫血清中去除针对LPS的抗体:
为了从血清中预先清除任何LPS特异性抗体,在室温下每mL各兔血清温育10000EU/mL来自大肠杆菌055:B5的LPS(Sigma-Aldrich)1小时,以使血清抗-LPS抗体结合。在温育1小时之后,根据制造商的协议使用内毒素去除凝胶(Pierce大容量内毒素去除凝胶,Thermo Scientific),从兔血清中去除LPS和LPS结合抗体。收集LPS洗脱前和LPS洗脱后的流出级分并进行WB以测试清除程序的功效。在LPS(作为对照)、全细胞胞内劳森菌和所有4种重组蛋白上进行WB,并且使用1:500稀释度的清除了LPS的兔血清作为一级抗体和抗-兔IR 800抗体(1μg/mL;Li-COR)作为二级抗体进行检测。
中和测定:
为了确定重组胞内劳森菌蛋白特异性血清对细菌渗透IPEC细胞的影响,如先前的描述(Obradovic et al.,J.Microbiol.Meth.(2016)126:60-66),使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)-染色的细菌进行中和测定。简言之,使用CFSE将无毒胞内劳森菌染色并且使用低(500μg/mL)、中(1000μg/mL)和高(2000μg/mL)补体灭活的预清除了LPS的兔超免疫血清在室温下将染色细菌温育1小时。将血清抗体结合的细菌用来在24孔板(Corning)中感染105个IPEC-1细胞,在ZiplocTM袋中在37℃下在三气环境(10%氢、10%二氧化碳和80%氮气(Praxair Canada Inc.,Mississauga,ON,Canada))中温育(Vannucci et al.,J.Clin.Microbiol.(2012)50:1070-1072)。温育4小时之后,胰蛋白酶消化细胞,然后在500x g下离心5分钟以去除培养基和未结合的细菌。然后将细胞重新悬浮于具有2%FBS(Gibco Life Technologies)的PBS(Gibco Life Technologies)中,并且通过流式细胞术分析。该测定独立重复4次以获得生物学重复。使用BD FACS CaliburTM流式细胞仪(BDBiosciences,Mississauga,ON,Canada)进行流式细胞术分析。在FL1通道中检测CFSE荧光,门控选择基于未感染的IPEC-1细胞(阴性对照)和感染了CFSE标记细菌的IPEC-1细胞(阳性对照)。每个样品采集三万个事件,并在Kaluza软件中分析流式细胞仪(Beckman-Coulter,Indianapolis,Indiana,USA)结果。使用以下公式计算抑制百分比:抑制百分比=(1-用血清温育的CFSE细菌的荧光%/CFSE细菌的荧光(对照)%)x 100。
评估重组胞内劳森菌蛋白免疫特性的疫苗试验:
动物伦理:所有实验程序均按照加拿大动物护理委员会(CCAC)的指南进行,并经Saskatchewan大学动物研究伦理委员会批准。猪均为来自Prairie Swine Centre,Inc.(PSC,Saskatoon,Saskatchewan)的Landrace/Large White。
动物试验和样品收集:
试验1:图13A为免疫试验示意图。用由rLI0710组成并用VIDO三重佐剂配制的疫苗对断奶仔猪进行肠胃外疫苗接种。通过肌内途径用以300μg聚IC、600μg宿主防御肽和300μg聚磷腈(VIDO三重佐剂)配制的300μg rLI0710将.断奶仔猪(5周龄,n=4)免疫。它们在17天后和32天后接收加强剂量。通过相同的途径在相同的天数使用VIDO三重佐剂(n=4)将对照动物免疫。在第46天将猪安乐死。对血清IgG滴度定量(图13B)。刮擦回肠和空肠并且对粘膜抗-rLI0710 IgA定量(图13C-D)。
试验2:使用由3个重组抗原组成并用佐剂(MVP Laboratories,Inc.,Omaha,NE,USA)配制的疫苗进行肠外疫苗接种。通过肌内途径使用用30%配制的50μg rLI0710、50μg rLI0169和50μg rLI0625(对于1.4mL总体积,700μL所有抗原:700μL)(组1,n=8);用30%配制的50μg rLI0794、25μg rLI0786和50μg rLI0726(1:1体积,1.4mL总体积)(组2,n=8)将断奶仔猪(5周龄)免疫;仅用免疫的断奶仔猪(组3,挑战对照组,n=7)和仅用免疫的断奶仔猪(组4,非挑战对照组,n=7)。断奶仔猪在14天后接收一次加强剂量(图14A)。然后将组1-3的仔猪禁食过夜,然后在第27天使用在40mL中的约1.9x108个致病性胞内劳森菌进行口服挑战(灌服)。评估血清抗体(图14B-D)并且还评估了安乐死时粘膜刮屑的抗体滴度(图14E-J)。采集直肠温度并称重仔猪至并包括胴体重量(图14K)。收集粪便样本18天,并使用PCR分析评估胞内劳森菌的脱落(表4)。表4示出了来自挑战猪和对照猪的粪便样品,其进行了PCR分析以鉴别胞内劳森菌DNA作为细菌脱落的证据。示出了从每个时间点每头猪200mg粪便计算的粪便胞内劳森菌(加工成200μL体积)。每个符号代表一只单独的动物,并且水平条显示了每列的中值。每个框代表一只动物和一个时间点。每200mg粪便的胞内劳森菌基因组DNA浓度的色调为:+/-(绿;<200),+(黄;200-1,000),++(粉;1,000-5,000)和+++(红,>5,000)。
表4:来自挑战猪和对照猪的粪便样本的PCR分析
试验3:使用用VIDO三重佐剂配制的蛋白进行粘膜接种。图15A示出了免疫试验示意图。在繁殖时对发情期小母猪进行免疫接种,将疫苗添加到80mL商业扩展精液(PICGenetics)中,该精液经过-80℃至37℃的反复温度变化以杀死精液(虽然精子在显微镜下没有出现破裂)。用于第一剂的疫苗由配制在在1mL总体积中具有1200μg聚IC、2400μg宿主防御肽1002和1200μg聚磷腈的400μg rLI0710组成(n=8)。根据发情期小母猪的正常宫颈内繁殖实践,将精液加疫苗给予到导管管中。因此,将这种疫苗引向子宫。大约21天后,小母猪恢复发情,用杀死的精液加VIDO三重佐剂进行第二次模拟繁殖。还使用用400μg聚IC、800μg宿主防御肽1002和400μg聚磷腈VIDO三重佐剂配制的rLI0710(400μg)将小母猪免疫,并且这种疫苗通过肌肉内途径对接种的动物进行给予(即不是在模拟免疫的猪中)。对于第三次接种,除了使用活精液外,小母猪完全按照第二次接种的规定进行免疫。对照动物按照正常饲养实践在发情期用活精液繁殖(模拟,n=10),无宫内或肌内VIDO三重佐剂。对于所有动物,约38天后,从所有小母猪获得外周血单核细胞(PBMC),并测试细胞对抗原的离体IFNγ产生应答(图15B)。
PBMC分离和细胞离体再刺激:
使用EDTA真空采血管(BD Biosciences)从收集的血液中分离PBMC,然后在1100xg下离心30分钟。收集血沉棕黄层并且铺在Ficoll-Paque plus(GE life sciences)上,并且在400x g下离心40分钟。收集PBMC层,在PBS中洗涤3次,在250x g下离心10分钟。以总共1x106个细胞/孔接种细胞。使用Con A(5μg/mL)、rLI0710(2μg/mL)或培养基将细胞培养24小时。将板以500x g离心10分钟,除去上清液并且冷冻在-20℃下以备后续IFNγ定量。
IFNγELISA:
以1.0μg/ml缓冲液的小鼠抗重组猪干扰素γ(Fisher ENMP700(PierceEndogen))将板包被过夜。用TBST将板洗涤4次。样品在稀释剂(TBST+0.5%脱脂牛奶)中按1:4稀释。在稀释剂中将标准rPoIFNγ(Ceiba Geigy 212243lot#016144)预稀释至4000pg/mL。标准品从4000pg/mL开始,并进行两倍稀释。将板在4℃下温育过夜。用TBST将板洗涤4次,并且向每孔添加100μL稀释至2μg/mL的检测抗体(兔抗重组猪IFNγ(Fisher ENPP700(Pierce Endogen)),在室温下温育1小时。用TBST将板洗涤4次,并且将山羊抗兔IgG(H+L)生物素(Zymed#62-6140)(1/10,000)温育至100uL/孔,在室温下1小时。用4x TBST洗涤板,然后向每孔添加在稀释剂中以1/5000稀释的链霉亲和素碱性磷酸酶(Jackson#016-050-084;50%甘油),在室温下1小时。最后,用TBST将板洗涤4次,然后向每孔添加100μL PNPP底物(在PNPP缓冲液中稀释至1mg/mL),在室温下约30分钟。加入30uL 0.3M EDTA终止反应,在λ05nm、参比λ490nm下读板。从标准曲线确定样品的IFNγ浓度。
抗体ELISA:
对血清以及空肠和回肠的粘膜刮屑进行抗体ELISA以测量抗体响应抗原rLI0710、rLI0625和rLI0794。使用高达2μg/mL在包被缓冲液中的蛋白将Immulon II板(VWR)包被过夜。用含有2%Tween-20(TBST)的Tris-缓冲盐水洗涤板。血清在测定稀释缓冲液TBST中连续稀释。温育2小时之后,在TBST中洗涤板,然后作用1/5000碱性磷酸酶偶联的山羊抗-猪IgG(H+L)(KPL目录#151-14-06)温育1小时。然后在DE缓冲液(1M二乙醇胺,0.5M氯化镁)中用1mg/mL对硝基苯基磷酸酯将ELISA显影,并且在SpectraMax plus酶标仪(MolecularDevices)上测量λ405nm处的吸光度。所有终点滴度均使用4倍系列稀释确定,血清和培养上清液的初始稀释比例为1:4。
PCR分析:
从挑战日开始每隔一天从所有组的所有仔猪收集粪便样品(200mg),并且在18天后结束。使用QIAmp DNA粪便试剂盒(Qiagen)如制造商所报道的加工样品。使用针对来自胞内劳森菌PHE/MN1-00基因组的氨基酸ABC转运底物-结合蛋白(GlnH,Locus LI0754)设计的引物(正向:5’-GGTTAGTCGTTGCCCATGATA-3’(SEQ ID NO:77),反向:5’-CTGCGATATGCTCCCATAGTT-3’(SEQ ID NO:78))来量化基因组拷贝数。使用Kapa SyberGreen Mastermix(Kapa Biosystems,Wilmington,MA)进行定量实时PCR(qPCR),使用StepOne Real-Time PCR系统(Applied Biosystems by Life Technologies)采集数据。
统计分析:
使用Shapiro-Wilk正态性检验来确定数据是否服从高斯分布。使用单向普通ANOVA检验来比较每种血清的抑制百分比值的平均值。使用GraphPad Prism 5软件(GraphPad Software,San Diego,CA)进行所有统计分析和绘图。如果p小于0.05,则认为差异是显著的。
实施例1
鉴别与IPEC细胞相互作用的细胞蛋白
使用与WB分析和MS/MS偶联的2DE来鉴别与IPEC-1细胞表面蛋白相互作用并且被兔超免疫血清识别的胞内劳森菌蛋白。在WB上,Cy5-标记的胞内劳森菌蛋白显示为红斑,而绿色/黄色斑点表明这些蛋白也被兔抗体结合,因此具有免疫原性。在75kDa至100kDa区域内观察到了丰富的白蛋白蛋白质的特征性积聚,这也得到了MS/MS分析的证实。尽管用无血清培养基洗涤了3次,但污染的白蛋白始终存在,并且尝试预清除白蛋白样品失败。然而,尽管存在白蛋白,低MW蛋白仍能很好地分离,并且可以看到红色和绿色斑点,指示了单独的和被抗体结合的Cy5-标记的胞内劳森菌蛋白。使用WB作为模板,在银染制备凝胶中分离出相应的斑点。从凝胶上切下这些蛋白质/斑点并进行MS/MS分析。
通过UNIPROT和PFAM对MS/MS检测的蛋白进行生物信息学分析揭示了由MS鉴别的11种独特细菌蛋白(表2)。预计四种指示的蛋白在细菌外膜中表达,并选择这些蛋白进行进一步分析。这些蛋白鉴别为鞭毛蛋白(FliC,LI0710)、推定的外蛋白N(YopN,LI1153)、ABC二肽转运系统(OppA,LI0169)和自转运蛋白(LI0649)(也称为LatA;Watson et al.,Clin.andVaccine Immunol.(2011)18:1282-1287)。
鞭毛蛋白(LI0710,FliC;SEQ ID NO:1和2;NCBI-蛋白ID:CAJ54764;UNIPROT:Q1MQG3,MW 31kDa,PI 5.97ExPasy)是一种亚基蛋白,可聚合形成鞭毛并在细菌运动和趋化性中起重要作用。鞭毛已被观察为胞内劳森菌的一种细菌细胞结构(Lawson et al.,J.Compar.Path.(2000)122:77-100)。鞭毛蛋白LI0710具有293个氨基酸并且由氨基酸5至141之间的PF00669(PFAM)结构域和氨基酸208-291之间的PF00700(PFAM)结构域组成。鞭毛蛋白是一种TLR5激动剂,其在革兰氏阴性菌的免疫识别过程中起重要作用。由于其双重抗原和佐剂性质,胞内劳森菌鞭毛蛋白LI0710是用于亚单位疫苗的理想选择。
LI1153,标注为推定的外蛋白N(SEQ ID NO:10和11;NCBI-蛋白ID:CAJ55207;UNIPROT:Q1MP70;MW 44kDa;PI 4.62,ExPasy),是T3SS系统的一部分。LI1153由两个在侵入真核细胞过程中具有重要功能的突出结构域组成:位于63-222个氨基酸之间的HrpJ,PF07201(PFAM),和位于299-378个氨基酸之间的TyeA,PF09059(PFAM)。HrpJ结构域预测是T3SS的一部分并且相关蛋白包括分别参与宿主病原体相互作用(Michael et al.,Molec.Microbiol.(1997)24:155-167)和侵入(Ginocchio et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:5976-5980)的来自鼠伤寒沙门氏菌的SsaL和InvE侵袭蛋白。相关的大肠杆菌蛋白SepL在肠出血性大肠杆菌的感染中起着至关重要的作用并且在EspA、EspD和EspB的分泌中具有潜在作用(Kresse et al.,J.Bacteriol.(2000)182:6490-6498)。在耶尔森氏菌中鉴别的结构域TyeA位于细菌表面,在控制效应蛋白的分泌中起重要作用,并有助于T3SS内的易位控制装置(Iriarte et al.,EMBO J.(1998)17:1907-1918)。这些分泌调节蛋白已被描述为主要革兰氏阴性细菌物种中的“守门人”,它们的缺失导致易位蛋白分泌减少或效应蛋白分泌增加(Burkinshaw et al.,Mol.Cell Res.(2014)1843:1649-1663)。基于其他T3SS系统结构的对比(参见例如Alberdi et al.,Vet.Microbiol.(2009)139:298-303),LI1153(标注为推定的外蛋白N)似乎对应于胞内劳森菌T3SS的预测第二部分并且在控制效应蛋白分泌到宿主细胞中起作用。考虑到这种蛋白与本文所描述的靶细胞之间的相互作用,蛋白可能在细菌侵入和附着到小肠肠细胞中起作用。
LI0169,oppA(SEQ ID NO:7和8);NCBI-蛋白ID:CAJ54225;UNIPROT:Q1MS01;MW63.5kDa和PI 6.59,ExPasy)由基因oppA编码并预测作为ATP结合盒(ABC)转运蛋白复合物的一部分表达在细菌膜上。在细菌中,ABC转运蛋白复合物在糖、氨基酸、金属、生长因子、离子和其他溶质穿过细胞膜的吸收中起着核心作用(Singh et al.,Microbiol.(2008)154:797-809)。LI0169由跨膜螺旋结构域(12-34aa)、周质结构域(98-456aa,PF00496)和位于膜细胞内表面的ATP结合卷曲结构域(476-496aa)组成,它们共同形成一个中心孔。它以ATP依赖性方式运输二肽和三肽(Higgins et al.,Microbiol.(2001)152:205-210)。
蛋白LI0649(SEQ ID NO:4和5;NCBI-蛋白ID:CAJ54703;UNIPROT:Q1MQM4;PI4.81,MW 91.9kDa;ExPasy)先前已经被鉴别为自转运蛋白LatA(Watson et al.,Clin.andVaccine Immunol.(2011)18:1282-1287)。如本文所示,LatA具有免疫原性,因为其被兔抗-胞内劳森菌超免疫血清结合并且在细菌-宿主相互作用中起作用。LatA具有91.9kDa的预测分子质量(ExPasy),但使用2DE SDS-PAGE凝胶测定,相应的蛋白为60kDa,表明可能发生了一些裂解。这种蛋白具有免疫原性并且可以用于亚单位疫苗配方中。
蛋白LI0786(SEQ ID NO:13和14;NCBI-蛋白ID:CAJ54840.1;UNIPROT:Q1MQ87;PI4.70,MW 43.62kDa;ExPasy)已被预测具有DNA聚合酶滑动钳亚基(PCNA同系物)。基因本体论(GO)表明,其具有3’-5’外切酶功能、DNA结合功能和DNA指导的DNA聚合酶活性。
蛋白LI1171(SEQ ID NO:16和17;NCBI-蛋白ID:CAJ55225.1;UNIPROT:Q1MP52,PI5.71,MW 62.29kDa;ExPasy)具有提交的名称5’-核苷酸酶/2’,3’-环状磷酸二酯酶和相关酯酶。GO分子功能预测它具有水解酶活性,以及金属离子结合和核苷酸结合活性。用于金属结合的结构域存在于氨基酸30-250之间并且用于核苷酸结合的结构域存在于氨基酸365-518之间。
蛋白LI0608(SEQ ID NO:19和20;NCBI-蛋白ID:CAJ54662;UNIPROT:Q1MQR5,PI5.55,MW 55.49;ExPasy)是一种半胱氨酰-tRNA合成酶,每个亚基结合1个锌离子。GO分子功能预测它具有ATP结合位点、半胱氨酸-tRNA连接酶活性和锌离子结合活性。这是立克次体的同源物也被鉴别为免疫反应蛋白的一些证据。
蛋白LI0726(SEQ ID NO:22和23;NCBI-蛋白ID:CAJ54780.1;UNIPROT:Q1MQE7,PI5.41,MW 44.4;ExPasy)是一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶。GO分子功能预测其具有ATP和镁结合位点以及甲硫氨酸腺苷转移酶活性。我们没有发现证据表明这种蛋白已被用作疫苗抗原。然而,一项研究表明,S-腺苷甲硫氨酸合成酶在布氏锥虫亚种之间差异表达,并且该同源物可能是开发疫苗以阻断锥虫传播的潜在疫苗靶点。
蛋白LI0823(SEQ ID NO:25和26;NCBI-蛋白ID:CAJ54877.1;UNIPROT:Q1MQ50,PI6.52,MW 63.6;ExPasy)是一种Xaa-Pro氨肽酶。其具有肌酸酶结构域和肽酶结构域。我们没能发现证据表明这种蛋白已被用作疫苗抗原。
蛋白LI0625(SEQ ID NO:28和29;NCBI-蛋白ID:CAJ54679.1;UNIPROT:Q1MQP8,PI5.30,MW 58.6;ExPasy)是一种伴侣蛋白,也称为groEL和Cpn60。它在蛋白重折叠中起作用,并具有ATP结合域和未折叠蛋白结合结构域。GroEL在许多病原微生物中是保守的并且已经被鉴别为具有免疫原性和/或作为针对包括迟钝爱德华菌(Liu et al 2016)、肾脏钩端螺旋体(Natarajaseenivasan et al 2011)、百日咳博代氏杆菌(Luu et al.2020)等在内的许多病原体的疫苗开发候选物进行研究。我们没有发现证据表明这种蛋白被鉴别为在胞内劳森菌中具有免疫原性。
蛋白LI0794(SEQ ID NO:31和32;NCBI-蛋白ID:CAJ54848.1;UNIPROT:Q1MQ79,PI4.73,MW 23.5ExPasy)是一种ATP依赖性Clp蛋白酶亚基(ClpP)。其具有胰凝乳蛋白酶样活性,并且在错误折叠蛋白质的降解中起主要作用。当14个ClpP亚基组装成2个七聚体环时,它们形成一个圆盘状结构,中央空腔类似于真核蛋白酶体。ClpP功能的改变已被证明会影响病原体毒力和传染性,这表明它可能是一种抗菌药物的有吸引力的靶(Moreno-Cinos,etal 2019)。ClpP已被研究作为小鼠中肺炎链球菌疫苗的潜在抗原(Wu et al 2010,Cao,etal 2009)。我们未发现证据表明这种蛋白已被鉴别为在胞内劳森菌中具有免疫原性。
实施例2
重组蛋白抗原特性的评价
使用LOBSTR-BL21(DE3)pRosetta2大肠杆菌表达重组蛋白。SDS-PAGE分析和考马斯染色证实,rLI1153(44kDa)、rLI0710(32kDa)、rLI0649(92kDa)、rLI0169(64kDa)、rLI0786(45kDa)、rLI0726(44kDa)、rLI0794(25kDa)和rLI0625(60kDa)以其预测的分子量表达。
接下来,为了确认这些重组蛋白在猪中具有免疫原性,汇集来自胞内劳森菌地方性农场的诊断为具有PE的猪的血清并且用于WB分析。图1C、2C、3C、4C和10C列出了用于WB的重组蛋白的序列。
rLI0710、rLI0649、rLI0169、rLI1153和rLI0625被PE感染猪的血清识别,这表明这些重组蛋白保留了免疫原性并且证明了使用兔血清检测猪增生性肠病的病原体抗原的相关性。在WB中中,来自PE感染猪的血清仅微弱地识别rLI0649,这可能是因为汇集的猪血清仅来自一个农场的5只感染动物所致。为了测试4种重组蛋白各自的免疫原性潜力,兔子接种四种重组蛋白中的一种,以生成对各靶特异的超免疫血清。然后将超免疫血清用于WB分析并且抗-兔二级IR800进行可视化。重组LI1153被兔超免疫血清(来自针对重组LI1153进行疫苗接种的兔)结合。重组LI0710(32kDa)被兔超免疫血清(来自针对重组鞭毛蛋白进行疫苗接种的兔)结合。重组LI0649(92kDa)被兔超免疫血清(来自针对重组LI0649进行疫苗接种的兔)结合。最后,重组LI0169(64kDa)被兔超免疫血清(来自针对重组LI0169进行疫苗接种的兔)结合。未免疫兔的血清未识别四种重组蛋白中的任何一种。这些结果表明,蛋白具有免疫原性特性。
为了量化抗原特异性抗体对阻止CFSE标记的无毒胞内劳森菌渗透到真核细胞中的抑制水平,如上所描述进行中和测定(参见图12)。在低(500μg/mL)、中(1000μg/mL)和高(2000μg/mL)浓度下测试了以下血清:免疫前兔血清,针对全无毒细菌的兔血清,对rLI0169、rLI0649、rLI0710FliC或rLI1153具有特异性的兔超免疫血清。CFSE染色的胞内劳森菌的0.1的感染多重性保持恒定。因为其他人已经证明,阴性小鼠血清显示出48%至59%的胞内劳森菌入侵抑制,可能是由于在产生超免疫血清之前存在的抗LPS抗体所致(McOrist et al.,Vet.Microbiol.(1997)54:385-392),测试了阴性兔血清以确定其是否与LPS结合。发现兔阴性血清与一分子量在20到25kDa之间的条带结合,这对应于LPS的分子量(Kroll et al.,Clin,Diagn.Lab.Immunol.(2005)12:693-699)。因此,在进行中和测定之前,从所有血清中预先清除抗-LPS抗体。
流式细胞术分析的门控基于在FL-1通道中检测到的单独IPEC-1细胞和感染有CFSE胞内劳森菌的IPEC-1细胞的荧光百分比。如所预期的,单独的IPEC-1细胞具有可忽略的阳性荧光事件(FL1通道中的荧光平均值为0.20%)并且感染了CFSE-标记的胞内劳森菌的IPEC-1细胞,感染4小时后,FL1通道中的荧光平均值为8.86%。当使用2000μg/mL来自用全细菌免疫的兔的血清温育CFSE-标记的胞内劳森菌时,FL1通道中阳性事件的百分比降低到2.29%。图12A-12C显示了血清抗体阻断胞内劳森菌侵袭IPEC-1细胞的百分比抑制。阴性对照血清由为超免疫血清产生进行免疫前从兔汇集的血清组成。用低(500μg/mL)、中(1000μg/mL)和高(2000μg/mL)浓度的阴性对照血清预温育的CFSE-胞内劳森菌分别显示出46.7%(±7.9)、58.9%(±8)和65.7%(±5.7)的百分比抑制。阴性对照血清的这种抑制并不意外,因为其他人已经证明,针对大肠杆菌制备的兔多克隆血清和从产生胞内劳森菌超免疫血清之前获得的其他阴性对照血清抑制了胞内劳森菌渗透培养的大鼠肠细胞(IEC-18)(McOrist et al.,Vet.Microbiol.(1997)54:385-392)。
将针对全胞内劳森菌产生的兔超免疫血清用作阳性对照血清。使用低(500μg/mL)、中(1000μg/mL)和高(2000μg/mL)血清温育的CFSE-标记的胞内劳森菌分别产生了64.8%±5.7、73.4%±4.7和79.88%±5.9的感染抑制(图12A-12C)。相对于阴性对照血清,对于低(p<0.05;图12A)、中(p<0.01;图12B)和高(p<0.001;图12C)血清浓度,阳性对照血清显著地抑制了更多的细胞粘附/渗透,表明抗-胞内劳森菌抗体是中和的。为了辨别对rLI0169、rLI0649、rLI0710和rLI153具有特异性的抗体是否阻断细菌粘附/渗透到IPEC-1细胞中,使用500μg/mL(图12A)、1000μg/mL(图12B)和2000μg/mL(图12C)对各重组蛋白具有特异性的超免疫血清预温育CFSE-胞内劳森菌。在最低浓度的超免疫血清下(图12A),,抗-rLI0169显示出68.7%±5.9的百分比抑制,抗-rLI0649显示出64%±9.0的百分比抑制,抗-rLI0710/FliC显示出69.5%±5.2的百分比抑制且抗-rLI1153显示出60.4%±11.8的百分比抑制。除了抗-rLI1153之外,所有3个超免疫血清相对于阴性对照血清均显示出显著更高的百分比抑制(分别p<0.01,p<0.05,p<0.01)。当使用中和高浓度的各抗血清时,抗-rLI0169(p<0.01图12B,p<0.001图12C)、抗-rLI649(p<0.01图12B,p<0.001图12C)、抗-rLI0710/FliC(p<0.01图12B,p<0.001图12C)和抗-rLI1153(p<0.01图12B,p<0.01图12C),都是相对于对照血清的相对剂量。
因此,对重组蛋白具有特异性的血清抗体显示与使用针对全细菌的阳性兔血清所观察到的抑制效应相当的抑制效应,并且所有血清的抑制效应均随着血清浓度的增加而增加。重组血清中和测定的结果证实,在亚单位疫苗配方中将重组蛋白用作抗原可产生抑制胞内劳森菌渗透和感染的中和抗体。
由于胞内劳森菌是一种专性细胞内细菌,预计细胞免疫应答在抵御有毒细菌方面起主要作用(Cordes et al.,Vet.Res.(2012)43:9;Guedes et al.,Canadian J.Vet.Res.(2010)74:97-101),然而,体液免疫应答也可能在防止胞内劳森菌感染中起重要作用。针对细胞内细菌的IgG抗体可以通过Ab-FcR-介导的宿主细胞刺激将细胞内病原体靶向溶酶体,从而在体液免疫和细胞免疫之间架起桥梁(Armstrong et al.,J.Exper.Med.(1975)142:1-16),通过Fc受体介导的溶酶体靶向抵御细胞内细菌(Joller et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2010)107:20441-20446)并且调节细胞因子分泌(Polat etal.,Immunol.(1993)80:287-292)。此外,IgA抗体在抵御肠道病原体方面发挥重要作用。已对报道了肠细胞和固有层内与胞内劳森菌结合的IgA的积累(McOrist et al.,Infect.Immun.(1992)60:4184-4191),并且在实验感染3周后在猪的肠道灌洗中检测到了胞内劳森菌-特异性IgA(Guedes et al.,Canadian J.Vet.Res.(2010)74:97-101)。口服疫苗接种并使用有毒胞内劳森菌对动物进行挑战的一项疫苗试验结果表明,保护与粘膜细胞因子和特异性IgG和IgA应答有关,并且全身抗体应答在挑战后被增强(Nogueira et al.,Vet.Microbiol.(2013)164:131-138)。
基于上述内容,预计由一种或多种鉴别的胞内劳森菌蛋白组成的亚单位疫苗可以在猪的肠黏膜中诱导针对胞内劳森菌的特异性保护性免疫应答。
因此,描述了一种免疫原性组合物,制备免疫原性组合物的方法以及使用该免疫原性组合物治疗和预防用胞内劳森菌重组抗原的胞内劳森菌感染的方法。虽然已经以一些细节描述了本发明的优选实施方式,但应当理解的是,在不脱离由所附权利要求限定的本发明的精神和范围的情况下,可以做出明显的变化。
试验1:验证rLI0710胞内劳森菌蛋白在猪中具有免疫原性
使用300μg用VIDO三重佐剂配制的rLI0710通过肌内途径将断奶仔猪(5周龄,n=4)免疫。它们在17天后和32天后接受了加强剂量,通过相同的途径并在相同的天数使用VIDO三重佐剂将对照动物免疫(n=4)。在第46天将仔猪安乐死。收集血清以评估抗-rLI0710 IgG(图13B)。刮擦回肠(图13C)和空肠(图13D)以允许粘膜抗-rLI0710 IgA定量。与模拟接种的动物相比,疫苗接种动物中的血清抗-rLI0710 IgG滴度显著更高(p<0.05)(图13B)。与模拟接种的动物相比,疫苗接种动物中的回肠(图13C)和空肠(图13D)抗-rLI0710 IgA滴度显著更高(分别为p<0.05,p<0.05)。这些数据表明,使用VIDO三重佐剂配制并且经由肌内途径向仔猪给予的重组rLI0710触发了显著的全身性和肠道抗体。
试验2:验证由免疫原性重组胞内劳森菌蛋白组成的肌肉注射疫苗具有免疫原性
并且抵御传染性挑战
使用用30%EMULSIGEN(1:1;对于1400μL总体积,700μL所有抗原:700μL)(组1,n=8)配制的50μg rLI0710、50μg rLI0169和50μg rLI0625通过肌内途径将断奶仔猪(5周龄)免疫。组2动物(n=8)通过相同的途径以用30%EMULSIGEN(1:1体积,1400μL总体积)配制的50μg rLI0794、25μg rLI0786和50μg rLI0726进行免疫。组3断奶仔猪(挑战对照组,n=7)和组4断奶仔猪(非挑战对照组,n=7)使用单独的EMULSIGEN进行免疫。所有动物在14天后接受了一次加强剂量。
相对于组4,组1分别在14(p<0.001)和27(p<0.001)后,显示出了显著更高的抗-rLI0710(图14B)和抗-rLI0625(图14C)IgG滴度。相对于组4,在27天后,组2中的动物显示出了显著更高的抗-rLI0794 IgG(p<0.001)(图14D)。这些数据表明,当在通过肌内途径给予的疫苗中用EMULISGEN配制时,rLI0710、rLI0625和rLI0794抗原触发了显著的体液免疫。我们还观察到,在第0天所有仔猪均具有较低水平对重组胞内劳森菌抗原具有特异性的抗体,表明了(仔猪或来自它们的母猪产生的初乳)事先暴露于胞内劳森菌。由于这些细菌是地方性细菌,因此预计会出现这种事先暴露,并且数据表明,尽管先前暴露过,但仍观察到对亚单位疫苗的体液应答。
还调查了第48天空肠和回肠的粘膜刮屑的抗-rLI0710、抗-rLI0625和抗-rLI0794IgA滴度。相对于组4,在任何组中,粘膜组织未显示在空肠(图14E)或回肠(图14H)中的抗-rLI0710 IgA升高。相对于组4,来自使用rLI0710、rLI0625和rLI0169免疫的猪的粘膜组织(组1)显示空肠(图14F,p<0.01)和回肠(图14I,p<0.001)中的抗-rLI0625 IgA显著升高。最后,相对于组4,在所有组而不是在任何特定组,粘膜组织显示空肠中的抗-rLI0794 IgA显著不同(图14G,p<0.05)。然而,相对于组4,用rLI0794、rLI0726和rLI0786加上VIDO三重佐剂免疫的猪(组2)显示回肠中的抗-rLI0794 IgA抗体显著升高(p<0.01)(图14J)。这些数据表明,肌内注射给予的用EMULSIGEN配制的亚单位疫苗在肠道内触发了抗原特异性粘膜体液应答。
在细菌挑战之前从猪收集PBMC。离体使用rLI0625、rLI0710、rLI0794、rLI0726、rLI0169和rLI0786重新刺激细胞,并且将IFNγ产生量化为T细胞免疫应答的量度。结果表明,细胞对ConA有响应,表明在任何猪组中,测定有效且细胞是活的,但它们均不产生IFNγ。这些数据表明,至少当辅以EMULSIGEN时,通过肌内途径递送的亚单位疫苗未能触发细胞免疫应答。
挑战研究:
对于上述试验中的所有仔猪,将它们禁食过夜,然后在第27天口服(灌服)挑战在40ml中的约1.9x108个致病性胞内劳森菌。临床评分显示直肠温度没有变化。免疫和挑战试验过程中的体重在任何组之间没有显著差异(图14K)。采集粪便样品18天,显示组4无胞内劳森菌的迹象(正如该非挑战对照组所预期的那样)。当量化在任何时间点在粪便中具有极高浓度胞内劳森菌DNA的动物数量时(红框,表4),组3有5/7(挑战,未接种疫苗),组2有2/8(接种rLI0794、rLI0726和rLI0786与EMULSIGEN)和组1有0/7(接种rLI0710、rLI0625和rLI0169与EMULSIGEN)。事实上,低水平的胞内劳森菌DNA,组1中为3/7只猪,组2中为1/8只猪,且组4中为0/7只猪。
通过肌内途径给予由用EMULSIGEN配制的3种重组蛋白组成的疫苗触发了全身和粘膜体液免疫,但它们并没有表现出细胞介导的免疫应答,至少当与EMULSIGEN一起配制时如此。组1中的接种猪表现出针对感染性挑战的保护。
试验3:使用用VIDO三重佐剂配制的重组LI0710蛋白进行粘膜接种疫苗触发了强
大的抗原特异性和细胞介导的免疫
我们研究了通过粘膜途径免疫猪并用VIDO三重佐剂代替EMULSIGEN是否会影响细胞介导的对rLI0710亚基蛋白的免疫应答。为了测试这一点,在繁殖时用1mL总体积用1200μg聚IC、2400μg宿主防御肽1002,和1200μg聚磷腈VIDO三重佐剂配制的400μg rLI0710免疫小母猪(n=8)。将疫苗添加到80mL商业扩展精液(PIC Genetics)中,该精液经过-80℃至37℃的反复温度变化以杀死但不使精液破裂。对于第二和第三剂,小母猪分别用死精液和活精液以及VIDO三重佐剂繁殖。通过包括杀死的精液,小母猪在21天间隔后恢复发情期。在这些后期的发情周期中,还通过肌内途径使用用400μg聚IC、800μg宿主防御肽1002和400μg聚磷腈配制的400μg rLI0710将接种疫苗的猪免疫。对照动物繁殖时不向精液中添加任何物质,也不用肌肉给予VIDO三重佐剂(模拟,n=10)。
最后一次免疫后大约38天,获得PBMC并测试细胞对抗原的离体应答。结果表明,来自宫内免疫和模拟免疫猪的PBMC响应于伴刀豆球蛋白A(ConA;封闭和开放的圆圈)产生了IFNγ,伴刀豆球蛋白A是包括作为阳性对照的有丝分裂原(图15B)。正如预期的那样,当未将抗原引入分离的PBMC时,产生的IFNγ很少,表明动物具有低水平的分离T细胞活性(培养基,实心和空心方块)。然而,在宫内免疫的小母猪中,相对于模拟免疫的小母猪,当细胞重新暴露于rLI0710时,我们观察到显著更高水平的IFNγ产生(p<0.001)。这些数据表明,该途径和/或佐剂组合在成年猪中触发了对rLI0710的细胞介导的免疫应答。
向子宫中给予由使用VIDO三重佐剂组合配制的rLI0710组成的疫苗,随后进行两剂肌内免疫接种,触发了抗原特异性细胞介导的免疫。
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Claims (29)
1.一种免疫原性亚单位组合物,包含:至少一种分离的、免疫原性的胞内劳森菌蛋白,所述胞内劳森菌蛋白选自LI0710、LI0649、LI0169、LI1153、LI0786、LI1171、LI0608、LI0726、LI0823、LI0625、LI0794、其免疫原性片段、其免疫原性变体、或来自另一胞内劳森菌菌株或分离物的相应蛋白;和药学上可接受的赋形剂。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物,其中,所述胞内劳森菌蛋白选自:包含SEQID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29和32的氨基酸序列的一种或多种蛋白、其免疫原性片段、或其免疫原性片段或变体。
3.根据权利要求2所述的免疫原性组合物,其中,所述胞内劳森菌免疫原性蛋白包含SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29或32的氨基酸序列,如果存在跨膜结合结构域或天然信号序列,所述胞内劳森菌免疫原性蛋白缺失所述跨膜结合结构域或天然信号序列的全部或部分。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫原性组合物,其中,所述胞内劳森菌免疫原性蛋白包含与SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29或32的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的免疫原性组合物,其中,所述胞内劳森菌免疫原性蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸2-293的氨基酸序列。
6.根据权利要求4所述的免疫原性组合物,其中,所述胞内劳森菌免疫原性蛋白包含SEQ ID NO:5的氨基酸31-851的氨基酸序列。
7.根据权利要求4所述的免疫原性组合物,其中,所述胞内劳森菌免疫原性蛋白包含SEQ ID NO:8的氨基酸43-552的氨基酸序列。
8.根据权利要求4所述的免疫原性组合物,其中,所述胞内劳森菌免疫原性蛋白包含SEQ ID NO:11的氨基酸5-398的氨基酸序列。
9.根据权利要求4所述的免疫原性组合物,其中,所述胞内劳森菌免疫原性蛋白包含SEQ ID NO:14的氨基酸1-383的氨基酸序列。
10.根据权利要求4所述的免疫原性组合物,其中,所述胞内劳森菌免疫原性蛋白包含SEQ ID NO:17的氨基酸1-562的氨基酸序列。
11.根据权利要求4所述的免疫原性组合物,其中,所述胞内劳森菌免疫原性蛋白包含SEQ ID NO:20的氨基酸1-485的氨基酸序列。
12.根据权利要求4所述的免疫原性组合物,其中,所述胞内劳森菌免疫原性蛋白包含SEQ ID NO:23的氨基酸1-404的氨基酸序列。
13.根据权利要求4所述的免疫原性组合物,其中,所述胞内劳森菌免疫原性蛋白包含SEQ ID NO:26的氨基酸1-363的氨基酸序列。
14.根据权利要求4所述的免疫原性组合物,其中,所述胞内劳森菌免疫原性蛋白包含SEQ ID NO:29的氨基酸1-548的氨基酸序列。
15.根据权利要求4所述的免疫原性组合物,其中,所述胞内劳森菌免疫原性蛋白包含SEQ ID NO:32的氨基酸1-209的氨基酸序列。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的免疫原性组合物,包含两种或更多种分离的免疫原性胞内劳森菌蛋白。
17.根据权利要求1-15中任一项所述的免疫原性组合物,其中,存在两种或更多种免疫原性胞内劳森菌蛋白,并且所述两种或更多种蛋白作为融合蛋白提供。
18.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物,还包含免疫性佐剂。
19.根据权利要求18所述的免疫原性组合物,其中,所述免疫性佐剂包括水包油乳液。
20.根据权利要求18所述的免疫原性组合物,其中,所述免疫性佐剂包含:(a)聚磷腈;(b)聚(I:C)或CpG寡核苷酸;和(c)宿主防御肽。
21.根据权利要求20所述的免疫原性组合物,其中,所述免疫性佐剂是微粒的形式。
22.根据权利要求21所述的免疫原性组合物,其中,所述聚磷腈是PCEP,并且所述宿主防御肽是肽1002。
23.一种重组载体,包含:
(a)编码免疫原性胞内劳森菌蛋白的DNA分子,所述免疫原性胞内劳森菌蛋白选自:LI0710、LI0649、LI0169、LI1153、LI0786、LI1171、LI0608、LI0726、LI0823、LI0625、LI0794、其免疫原性片段、其免疫原性变体、或来自另一胞内劳森菌菌株或分离物的相应蛋白;和
(b)与所述分子可操作地连接的控制元件,由此所述分子中的编码序列能够在宿主细胞中转录和翻译。
24.一种用权利要求23所述的重组载体转化的宿主细胞。
25.根据权利要求24所述的宿主细胞,其中,所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。
26.一种生产胞内劳森菌蛋白的方法,所述方法包括:
(a)提供根据权利要求25所述的宿主细胞群;和
(b)在由所述重组载体中存在的DNA分子编码的蛋白被表达的条件下培养所述细胞群。
27.一种在脊椎动物受试者中治疗或预防胞内劳森菌感染的方法,所述方法包括向所述受试者给予治疗量的权利要求1-22中任一项所述的组合物。
28.根据权利要求27所述的方法,其中,所述受试者是猪或马受试者。
29.根据权利要求28所述的方法,其中,所述胞内劳森菌感染包括增生性肠病。
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