CN105377879B

CN105377879B - 针对衣原体属物种的疫苗

Info

Publication number: CN105377879B
Application number: CN201480026477.5A
Authority: CN
Inventors: 弗兰克·福尔曼; 艾达·罗森克兰达斯; 安雅·奥尔森; 彼得·拉瓦茨·安德森
Original assignee: Statens Serum Institut SSI
Current assignee: Statens Serum Institut SSI
Priority date: 2013-03-18
Filing date: 2014-03-17
Publication date: 2021-05-04
Anticipated expiration: 2034-03-17
Also published as: PL2976355T3; EP2976355B1; HRP20200511T1; JP2016514713A; JP2021193123A; JP2019163253A; BR112015023886A2; BR112015023886B1; RU2015141214A; CN113185587A; RU2723046C2; US10925954B2; PT2976355T; RS60135B1; US20190099478A1; AU2014234765A1; ES2781579T3; CY1122905T1; LT2976355T; EP2976355A1

Abstract

本发明描述了一种针对沙眼衣原体(Ct)的高效疫苗。该疫苗是以重组融合分子为基础的，这些重组融合分子能够产生针对各种Ct血清变型为保护性的高滴度中和抗体反应。我们的发明以提供可激活免疫系统的两个武器的一种疫苗为目的，进一步描述了这些抗体促进片段与作为T细胞的靶标的Ct抗原的组合。

Description

针对衣原体属物种的疫苗

发明领域

本发明涉及衣原体属物种外膜蛋白表面暴露区免疫原性片段重复单元多肽和包括这些融合蛋白的药物组合物及疫苗。

背景技术

衣原体是引起多种感染的胞内细菌性病原体。肺炎衣原体是引起人类急性呼吸道感染的原因并且被认为在冠心病中发挥作用。沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)是人类性传播疾病和眼部感染(沙眼)的致病物。另外在动物中，已知有几种衣原体属物种的感染，例如感染猪的猪衣原体，和引起小型反刍动物(绵羊和山羊)流产的流产衣原体。

据估计，在全世界有九千二百万个体因性而感染沙眼衣原体(Ct)¹。由于Ct引起的泌尿生殖器感染的高发病率和其成为宫外孕和不孕不育的一个风险因子的事实，Ct引起的泌尿生殖道感染已经成为公共健康问题²。除此之外，Ct感染已经显示出会促进HIV的传播³，并充当HPV诱导的宫颈癌的辅助因子⁴。未治疗的生殖器Ct感染的持续时期可能被延长，并且在头12个月内通常不能实现完全清除⁵。通过人类研究，众所周知，针对生殖器再感染产生了一定程度的保护性免疫，尽管这充其量只是部分的⁶。感染通过抗生素疗法得到有效地控制；但是无症状病例的高发病率表明只有开发一种高效的衣原体疫苗后才有可能设想可持续的疾病控制。

一种针对Ct的疫苗需要引发生殖道粘膜中的保护性T细胞和B细胞免疫⁷。清除感染和对再次感染的抗性的免疫机理在很多研究中已经有所描述。多种动物模型和衣原体属物种被用于尝试鉴别保护性和损伤性的免疫反应。已经形成一种统一意见，即在小鼠中，CD4+Th1细胞介导免疫反应在Ct感染的缓解中发挥重要作用^8，9，10，然而体液免疫在保护中的作用依然不够明确。在豚鼠中，对衣原体感染的免疫至少部分受到在粘膜表面的分泌型IgA的介导^11，12，并且另外在小鼠模型中，越来越多的证据支持抗体在保护性免疫中的作用⁹。在过去几年已经出现的来自动物模型的数据明确证明，如果抗体是在感染建立后形成，它们发挥的作用很小，而它们在感染期间的存在(例如在二次反应中)促进了显著的保护水平，但是在衣原体属特异性CD4⁺细胞的存在下作用被明显放大^9，13，14。另一方面，在无抗体情况下一种强的细胞介导免疫(CMI)反应可以控制细菌复制，但是，在最坏的情况下，会使与衣原体感染相关的病症恶化^15，16。细胞介导免疫和抗体之间的这种相互作用对于支持感染起始阶段中和抗体的优先作用的重要性越来越明确，而CD4⁺细胞在感染的全部其余部分中是主要效应子^17，18，19。总之，平衡抗体和T细胞之间的免疫效应子机理似乎对于疾病转归至关重要。

我们和其他人已经鉴别了人类或动物模型中天然感染期间识别的一系列的衣原体抗原^{20，21 22，23 24 25，26 27}。尤其1998年基因组序列的发表和现代高通量技术已经导向了对几乎是875个开放阅读框的整个基因组的测定²⁸。重要的是，鉴别感染期间作为抗原的蛋白不一定意味着它们作为疫苗是保护性的²⁹，并且，尽管描述了如此大的数量抗原的特征，这些中只有极少数已经得到证明可以在动物模型中作为疫苗来介导保护^{30 31，32}。进一步地，对于最近报告的大多数疫苗，观察到的部分保护是由T细胞在无中和抗体情况下介导。因此缺乏产生能应对起始阶段感染的中和抗体和产生平衡的免疫反应的候选疫苗。

直到现在，只有关于具有三个表面暴露抗原的中和抗体的令人信服的数据；PorB，定位于衣原体外膜，并且其功能是作为一种孔蛋白³³。针对这的抗体已显示中和衣原体的感染性³⁴，专利文献是：US 7,105,171。另一种较新的抗原是PmpD。此蛋白已显示在体外产生中和抗体，但是这些抗体的体内相关性仍未得到证明³⁵。

MOMP是中和抗体的经典靶标抗原，并且是所述的第一抗原分子之一。它是一种表面暴露的跨膜蛋白，该跨膜蛋白具有结构(孔蛋白)特性^36，37，38。MOMP是一种40kDa蛋白，构成Ct细胞膜中大约60％的蛋白，并且是在体外和体内都证明有效的中和抗体的一个靶标。MOMP由被五个恒定片段分开的四个可变表面暴露域(VD-1到VD-4)组成^{36 39}，并且它是衣原体属的血清变型(～15)分组的分子基础(图1)。体外和体内中和抗体表位已经被映射到这些VD^{40 41 42 43 44}。已在全球范围区域描述了Ct泌尿生殖器血清变型的分布谱，提供了以MOMP为基础的疫苗需要的血清变型覆盖范围的流行病学资料。全球范围内检测到的最常见的血清变型是E(22％到49％的病例)，其次是血清变型F和D(分别为17％到22％和9％到19％)^{45 46 47 48 49 50}，意味着一种以血清变型E、D和F为靶标的疫苗将具有重要作用，并且涉及超过70％的人群。

MOMP在人类和动物中具有高度免疫原性，并且因此作为一种疫苗候选(作为天然纯化蛋白、重组地，和作为DNA疫苗)一直受到详细研究。这些接种尝试产生了可变的结果^{17，51，52，53，54，55，56，57}。MOMP作为一种疫苗的相对不一致性的原因仍未得到充分理解，但是合成MOMP免疫原未能模仿该蛋白的天然结构的事实一直备受关注⁵⁴。就这点而言，这种膜结合半胱氨酸富含分子和重折叠不同产物以实现天然蛋白结构的结构一直极具挑战性，因此不适于大规模疫苗生产⁵⁸。因此，尽管疫苗潜力是明确的，全长MOMP迄今为止不是一种可行的疫苗候选物，并且因此已经多次尝试构建基于选定的表位(例如VD4中高度保守的TTLNPTIAG^36，59)的疫苗或基于选定的来自MOMP的富含中和靶标表位的区域(例如VD)的疫苗(WO 9406827，US 6384206)^{60，61 62，63 64 51，65 66}。

VD1、VD2和VD4一直受到特别关注，这是由于用于血清分型的中和单克隆抗体已经显示映射到这些区域。在天然免疫期间，这些VD区成为抗体的靶标，并且据此，这些区域自然地已经成为发展免疫诊断的努力重点。例如，在寻求以ELISA为基础的诊断工具中，米金特(Mygind)等人构建包含来自不同血清变体的VD区的不同的多抗原⁶⁷。该分析表明，通过提高血清变体的数量并将物种特异的TTLNPTIAG包括到一种重组多抗原中，可能增加该测定与基于单一血清变体抗原的测定相比较的特异性和灵敏度。

大体上VD4已经吸引对作为免疫原的兴趣，这是由于该区域显示包含嵌入可变区的高度保守的物种特异的表位TTLNPTIAG。重要的是，在该VD4区的这种保守的表位能够引起广谱交叉反应性免疫反应，其能够中和多种血清变型，其中最流行的是D、E和F(图2)。代表该VD4区或源自该区域的保守表位的肽已经单独用于免疫，作为嵌合肽融合到其他区域例如VD1或和T细胞表位混合以便增强抗体反应^{60，68 51，65 64 69}。所有这些构建体产生了具有体外中和感染的一些功能性能力的抗体，但这些方案通常经历低免疫原性并且滴度不转化为针对生殖器衣原体激发的体内保护效力。

使用这些以肽为基础的构建体时缺乏保护的原因可能很多，包括给药途径、引起的免疫反应的类型、激发剂量，但最可能反映了该疫苗分子用作疫苗没有足够的免疫原性。该以VD4为基础的方案还受到的限制是，除了TTLNPTIAG表位，上述提到的这些片段对于一种或两种血清变体是高度特异的，并且相应地，疫苗必须由几种组分组成以便覆盖引起人类疾病的大多数常见血清变体。

在WO 2012172042中曾披露，在VD区内的B细胞表位，与来自MOMP的非可变域的限定T细胞(Th1和Th2)表位组合，可以作为针对小鸡的鹦鹉热血清变型D的多表位疫苗；在实例中，他们描述了各自来自同一血清变体的不同可变域的一个VD区中的高达三个B细胞表位与几种T细胞表位的组合。不建议使用MOMP的表面暴露区域的一个可变域的重复和使用不同血清变体，并且因此未获得针对不同血清变体的高滴度和广谱反应。

发明内容

本发明的目的是制备能产生高滴度的中和抗体反应的重组融合分子，该中和抗体反应针对体内各种Ct血清变型是保护性的。我们的发明以提供可激活免疫系统的两个武器的一种疫苗为目的，进一步描述了这些抗体促进片段与作为T细胞的靶标的Ct抗原的组合。

本发明披露了针对病原体(例如沙眼衣原体(Ct))的一种高效疫苗，其包含针对最大抗体反应的Ct抗原表面暴露片段的重复(同源免疫重复)。在本发明的一个实施例中，这些表面暴露片段延伸到覆盖可能包含T细胞表位的表面暴露片段的侧翼区。一个实例是代表来自Ct MOMP抗原的VD1或VD4区的延伸形式的一个限定大片段，并且以免疫重复的形式提供了针对Ct的高水平的表面结合和中和抗体。在另一个重要的实施例中，免疫重复技术被用于通过融合包含来自不同血清变体的可变B和T细胞表位的片段(异源免疫重复)来获得针对不同血清变体的高滴度和广谱反应。在本发明的又另一实施例中，这些表面暴露重复与其他表面暴露抗原例如PMP或OMP重组融合。最后我们的发明披露了这些免疫重复构建体与强的T细胞抗原(如来自Ct的MOMP(CT681)、CT043或CT004)的组合，它们一起形成针对Ct感染的不同感染阶段的一种非常有效的疫苗。

附图说明

图1.MOMP(血清变型D，菌株：D/B-120)膜拓扑结构的模型，修改自芬德利(Findlay)等人⁷⁷。在AA序列中，VD1、VD2、VD3和VD4用黑色线条标记，而在线性模型中，描述的MOMP间隔了5个恒定片段(CS)。

图2.血清变型D、E、F、G、Ia和J的Cr MOMP VD4^ext的氨基酸序列的比对。血清变型D序列被用作原型，并且其他血清变型中的保守氨基酸显示为“.”。根据贝尔(Baehr)等人(PNAS，1988)³⁶的可变域VD4以灰色作阴影，并且保守表位TTLNPTIAG被加框。

图3.MOMP(血清变型D，菌株：D/B-120)膜拓扑结构的模型，修改自芬德利(Findlay)等人。本发明所述的VD1ext和VD4ext在图中用阴影表示。

图4.同源和异源免疫重复的设计的图解。免疫重复是例如四个VD4^ext区(来自同一血清变型的，同源免疫重复，或来自不同的血清变型的，异源免疫重复)的融合蛋白。每个VD4^ext区内的可变VD4区被图示为阴影线。

图5.用VD4^ext的同源免疫重复免疫后，与单体VD4^ext单元比较加强和扩大的免疫反应。

图6.由来自SvD、E、F和G的异源免疫重复组成的构建体诱导了比来自SvF的同源免疫重复更强的对多种血清变型的免疫反应。

图7.与由来自(SvE^extVD4)^*4和来自(SvF^extVD4)^*4的同源免疫重复组成的构建体比较，用来自SvD、E和F(CTH89)的延伸的VD4单元的异源免疫重复进行免疫后抗体反应具有优良的特异性。

图8.在SvD激发后，用来自SvD、SvE和SvF(CTH89)的延伸的VD4的异源免疫重复进行免疫生成早期T细胞独立的保护。

图9.用CTH89特异的血清进行体内中和。

图10.将异源免疫重复耦合到重组的MOMP。

图11.与用来自SvD(CTH87)的单一VD1-VD4单元进行的疫苗接种比较，用来自SvD、SvE和SvF(CTH88)的VD1-VD4’区的异源免疫重复进行的疫苗接种。

图12.将T细胞抗原耦合到VD4的免疫重复

图13.用一个异源VD4免疫重复和一个T细胞抗原融合分子的混合物进行免疫

图14.CAF01和明矾作为佐剂递送系统的比较。

图15.用由来自SvD、SvE、SvF和SvG的减长VD4^ext区组成的异源免疫重复进行疫苗接种

图16用由来自SvD、SvE、SvF、SvG、SvIa和SvJ的延伸的VD4^ext区组成的异源免疫重复进行疫苗接种

发明的详细公开

本发明披露了一种多肽，包括

a)如下的一个氨基酸序列，包括以衣原体属物种的一种血清型表达的同一外膜蛋白的一个或多个表面暴露片段的氨基酸序列；和

b)两个或更多个另外的氨基酸序列，其是与a)中所定义的相同的序列，或是来自以衣原体属物种的与a)中血清型不同的一种血清型表达的所述外膜蛋白的一种变体的相应表面暴露片段。

因此本发明披露了包括免疫重复的多肽，这些免疫重复是一个氨基酸序列的3个或更多个例如4个或更多个重复，该氨基酸序列包括衣原体属物种的一种外膜蛋白的表面暴露区的免疫原性部分。因此，本发明可被描述为一种多肽，该多肽包括：一个氨基酸序列，该氨基酸序列包括以衣原体的一种血清型表达的同一外膜蛋白的一个或更多个表面暴露片段；以及两个或更多个例如三个或更多个另外的氨基酸序列，这些氨基酸序列是与a)中所定义的相同的序列，或是来自以衣原体属物种的与a)中血清型不同的一种血清型表达的所述外膜蛋白的一种变体的相应表面暴露片段。

在一个优选实施例中，该多肽包括3个或更多个不同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列各自包括来自以不同的衣原体属物种血清型变化的同一外膜蛋白的不同变体或同种型的一个或多个表面暴露片段，所述氨基酸序列来自不同衣原体属物种血清型(在我们的术语中称为异源免疫重复)，但本发明还披露了包括一个氨基酸序列的3个或更多个重复的多肽，其中所述氨基酸序列包括以不同的衣原体属物种血清型变化的同一外膜蛋白的一个或多个表面暴露片段，所述氨基酸序列源自相同的衣原体属物种血清型(在我们的术语中称为同源免疫重复)。

该外膜蛋白质优选来自任何衣原体属物种血清型的主要外膜蛋白(MOMP)，并且该表面暴露片段选自MOMP的可变域1(VD1)、可变域2(VD2)、可变域3(VD3)或可变域4(VD4)。该表面暴露片段可以通过氨基酸序列中半胱氨酸的取代被可任选地线性化以防止二硫键。

本发明的一个优选实施例是包括多个免疫重复的多肽，该免疫重复具有来自沙眼衣原体的血清变型D、E、F、G、Ia和J中任何一个的MOMP的可变域4(VD4)的3个或更多个重复，其中每个可变域由一个氨基酸序列组成，其对应于沙眼衣原体血清变型D(SvD)的MOMP的氨基酸序列(SEQ ID NO.:68)的氨基酸残基编号309到338的位置，并且其中该免疫重复中的可变域(VD)独立地选自由沙眼衣原体的血清变型D的VD4、血清变型E的VD4、血清变型F的VD4、血清变型G的VD4、血清变型Ia的VD4、和血清变型J的VD4组成的组，或与其具有80％的序列一致性。

来自血清变型D、E、F、G、Ia和J的VD4的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO 15-20。每个可变域可在N端侧通过以下项另外形成侧翼或延伸

i)氨基酸序列EWQASLALSYRLNMFTPYIGVKWSRASFDADTIRIAQPK(SEQ ID NO 21)或

ii)在i)中氨基酸序列的一个子序列，所述序列包括1个或多个氨基酸残基，

在C-端侧，该可变域可通过以下项另外形成侧翼或延伸

iii)氨基酸序列DTMQIVSLQLNK KSRKSCGIAVGTTIVDA(SEQ ID NO 22)

iv)在iv)中的氨基酸序列的一个子序列，所述子序列包括1个或多个氨基酸残基，

或与其具有至少80％序列一致性的一个氨基酸序列。

因此，该优选实施例可以被描述为包括2到8个不同氨基酸序列的多肽，每个氨基酸序列源自沙眼衣原体的MOMP，其包括式I限定的一个氨基酸序列：

xx₁-VD4-xx₂ (式I)

其中

VD4独立地选自SEQ ID NO.15-20或与其具有至少80％序列一致性的一个氨基酸序列，

而且

xx₁由以下各项组成

i)氨基酸序列

EWQASLALSYRLNMFTPYIGVKWSRASFDADTIRIAQPK(SEQ ID NO 21)或

ii)i)中的氨基酸序列的一个子序列，所述子序列包括以i)中的氨基酸序列中的C端K开始的1-38个氨基酸残基

并且

xx₂由以下各项组成

iii)氨基酸序列DTMQIVSLQLNKMKSRKSCGIAVGTTIVDA(SEQ ID NO 22)

v)在iii)中的氨基酸序列的一个子序列，所述子序列包括在iii)中的氨基酸序列从N端D开始的1到29个氨基酸残基。

包括MOMP的VD4的免疫重复的融合蛋白的实例由SEQ ID NO 49-59表示。

在本发明的另一实施例中，该多肽还包括来自沙眼衣原体的血清变型D、E、F、G、Ia和J中任何一个的MOMP的3个或更多个可变域1(VD1)的免疫重复，每个可变域由一个氨基酸序列组成，其与沙眼衣原体血清变型D(SvD)的MOMP的氨基酸序列(SEQ ID NO.:68)的氨基酸残基编号91到105的位置对应，并且独立地选自由沙眼衣原体的血清变型D的VD1、血清变型E的VD1、血清变型F的VD1、血清变型G的VD1、血清变型Ia的VD1和血清变型J的VD1组成的组或与其具有80％序列一致性。

来自血清变型D、E、F、G、Ia和J的VD1的氨基酸序列与SEQ ID NO1-6分别对应。每个可变域可在N端侧通过以下项另外形成侧翼或延伸

vi)氨基酸序列SMRVGYYGDFVFDRVLKTDVNKEFQMG(SEQ ID NO 7)

vii)在v)中的氨基酸序列的一个子序列，所述子序列包括1个或多个氨基酸残基。

在C-端侧，该可变域可通过以下项另外形成侧翼或延伸

viii)氨基酸序列NPAYGRHMQDAEMFTNAACMALNIWD(SEQ ID NO 8)

ix)在x)中的氨基酸序列中的一个子序列，所述子序列包括1个或多个氨基酸残基；

或与其具有至少80％序列一致性的一个氨基酸序列。

因此，另一优选实施例可以被描述为如下的多肽，这些多肽包括2到8个各自源自沙眼衣原体的MOMP的不同氨基酸序列(其包括式I中限定的一个氨基酸序列)并且还包括式II中限定的一个氨基酸序列：

yy₁-VD1-yy₂ (式II)

其中

VD1独立地选自SEQ ID NO.1-6或是与其具有至少80％序列一致性的一个氨基酸序列，

并且

yy₁由以下各项组成

v)氨基酸序列DAISMRVGYYGDFVFDRVLKTDVNKEFQMG(SEQ ID NO 7)或者

vi)v)中的氨基酸序列的一个子序列，所述子序列包括以v)中的氨基酸序列中的C端G开始的1-30个氨基酸残基

并且

yy₂由以下各项组成

vii)氨基酸序列NPAYGRHMQDAEMFTNAA(SEQ ID NO 8)或

viii)vii)中的氨基酸序列的一个子序列，所述子序列包括以vii)中的氨基酸序列中的N端N开始的1-18个氨基酸残基。

包括VD1的免疫重复的多肽的实例由SEQ ID NO 9到14和45到48表示。

本发明的另外的实施例还包括一个片段，该片段包括MOMP的可变域2(VD2)和/或可变域3(VD3)，其分别包括式III和/或式IV限定的一个氨基酸序列：

zz₁-VD2-zz₂ (式III)

qq1-VD3-qq2 (式IV)

其中

VD2独立地选自SEQ ID NO.29到34或与此具有至少80％序列一致性的氨基酸序列，

并且

zz₁由以下各项组成

ix)氨基酸序列TLGATSGYLKGNSASFNLVGLFG(SEQ ID NO 35)或

x)ix)中的氨基酸序列的一个子序列，所述子序列包括以ix)中的氨基酸序列中的C端G开始的1-23个氨基酸残基

并且

zz₂由以下各项组成

xi)氨基酸序列VVELYTDTTFAWSVGARAALWE(SEQ ID NO 36)或

xii)xi)中的氨基酸序列的一个子序列，所述子序列包括以xi)中的氨基酸序列中的N端V开始的1-22个氨基酸残基。

并且其中

VD3独立地选自SEQ ID NO.37-42或与其具有至少80％序列一致性的一个氨基酸序列，

并且

qq₁由以下各项组成

xiii)氨基酸序列

ATLGASFQYAQSKPKVEELNVLCNAAEFTINKPKGYVG(SEQ ID NO 43)或

xiv)xiii)中的氨基酸序列的一个子序列，所述子序列包括以xiii)中的氨基酸序列中的C端G开始的1-22个氨基酸残基

并且

qq₂由以下各项组成：

xv)氨基酸序列TGTKDASIDYHEWQASLALSYRLNMFTPYIGVKWS(SEQ ID NO 44)或

xvi)xv)中的氨基酸序列的一个子序列，所述子序列包括以xv)中的氨基酸序列中的N端T开始的1-35个氨基酸残基。

这些免疫重复可以是异源的，即其中该可变域源自不同血清型或者它们可以是同源的，即其中该可变域源自一个血清型。优选的重复数是2、3、4、5、6、7或8个重复。

此外，这些多肽中的免疫重复可被线性化，即半胱氨酸残基被丝氨酸替换。

包括免疫重复的多肽可另外包括一个在重组产生时促进该多肽输出的部分(例如，信号肽)、一个促进该多肽纯化的部分(例如his-标签)和/或一个增强免疫原性的部分(例如一种T细胞抗原)。该T-细胞靶标可选自Ct抗原，例如CT043、CT004、CT414、CT681或其部分。此类融合蛋白的实例由SEQ ID NO 60到67表示。

根据本发明所述的多肽具有以下功能性能力：

a)当在包括给予异源免疫重复的实验布置中测试时，以10^-3或更低的50％中和滴度在体外中和沙眼衣原体血清变型D；

b)当在包括给予异源免疫重复的小鼠模型中测试时，在感染后第7天在至少50％的小鼠中体内中和沙眼衣原体血清变型D

c)当给予异源免疫重复时，扩大体外针对沙眼衣原体的多种血清变型的免疫反应。

本发明还披露了编码上述多肽的核酸。

披露的多肽或核酸被用于制备一种药物组合物，例如一种疫苗。该疫苗还包括一种药学上可接受的载体(病毒样颗粒)、赋形剂、佐剂(例如DDA/TDB或铝)或免疫调节剂。该药物组合物可用于针对衣原体属物种感染包括沙眼衣原体或肺炎衣原体感染的预防或治疗用途。

还公开了一种通过给予此种药物组合物来预防、治疗衣原体属物种感染包括沙眼衣原体或肺炎衣原体感染和/或降低其发生率的方法。

下文中更详细地描述了本发明并举例说明。

优选的外膜蛋白是MOMP，但也可以包括来自作为体液反应靶标的衣原体属物种的其他表面暴露抗原。

来自一个表面暴露区的免疫重复可以来自相同血清型(同源免疫重复)或代表包含可变表位的片段，并且源自不同血清型(异源免疫重复)。在一个优选实施例中，这些免疫重复包含一个延伸的片段，该片段包含已知富含T细胞表位的一个可变区和一个保守区。

一种外膜蛋白的优选表面暴露区选自MOMP的VD1、VD2、VD3和VD4。

用于构建实例中描述的免疫重复的氨基酸序列选自表1、2、和3。

MOMP的VD4的可变域可以描述为以下限定的一个氨基酸序列：

La1-Aa2-Aa1-Aa3-La2

其中

Aa1由氨基酸序列TTLNPTIAG(其对所有血清变型保守)组成；Aa2选自由以下各项组成的组：SATAIFDT(来自血清变型D和E)，LVTPVVDI(来自血清变型F)，LAKPVVDI(来自血清变型G)和LAEAILDV(来自血清变型Ia和J)。

当Aa2是来自血清变型D或E的序列时，则Aa3选自AGDVKTGAEGQLG(来自血清变型D)和AGDVKASAEGQLG(来自血清变型E)阐明的序列

当Aa2是来自血清变型F的序列时，则Aa3是序列CGSVAGANTEGQIS(来自血清变型F)。

当Aa2是来自血清变型G的序列时，则Aa3是序列CGSVVAANSEGQIS(来自血清变型G)。

当Aa2是来自血清变型Ia或J的序列时，则Aa3选自KGTVVSSAENELA(来自血清变型Ia)和KGTVVASGSENDLA(来自血清变型J)。

在图2中描述了MOMP的可变域VD4。这些免疫重复优选地还包括也在图2中描述的在两侧的延伸。

一个VD4域的N端侧可以通过来自更保守和T细胞表位富含La1的一个或多个氨基酸形成侧翼或延伸，其中La1是嵌入膜内的MOMP的VD4的部分，并具有氨基酸序列EWQASLALSYRLNMFTPYIGVKWSRASFDADTIRIAQPK或者与其具有80％的序列一致性的氨基酸序列。

一个VD4域的C端侧可以相应地通过来自更保守和T细胞表位富含La2的一个或多个氨基酸形成侧翼或延伸，其中La2是嵌入膜内的MOMP的VD4的C端侧部分，并具有氨基酸序列DTMQIVSLQLNKMKSRKSCGIAVGTTIVDA或者与其具有80％的序列一致性的氨基酸序列。

相似的图解(见图1)可以描述包括MOMP的可变域1(VD1)的免疫重复，不同血清变型的可变域(Aa2-Aa1-Aa3)由表1中的SEQ ID NO 1到6给出。相应的N端和C端延伸(La1和La2)具有分别的氨基酸序列SMRVGYYGDFVFDRVLKTDVNKEFQMG(La1)和NPAYGRHMQDAEMFTNAACMALNIWD(La2)，这些在表2中由SEQ ID NO 7到8给出。

包括VD2和VD3的免疫重复可以类似的方式从图1和表1推导出。

因此，上述实例La1-Aa2-Aa1-Aa3-La2限定了免疫重复单元之一。如果此外，例如将VD1加到一个VD4单元上，可将此描述为加入一个或多个序列以构成更大的免疫重复单元。因此，本发明的多肽包括免疫重复单元的2、3、4、5、6、7、或8个重复。

定义

外膜蛋白

衣原体属物种的外膜可以通过用去垢剂如2％肌氨酰处理完整的、纯化的原生小体随后超离心(100,000g，一个小时)来分离，这形成具有胞浆组分的一种上层清液和包含如前所述的外膜的一种小球⁷⁰。然后可以通过标准蛋白质技术，例如在SDS-PAGE之后通过质谱法来鉴别外膜蛋白。

表面暴露的片段或区域

细菌表面或膜蛋白包括跨膜蛋白、分泌和脂蛋白、以及无锚表面蛋白。完整细菌上的表面暴露区域可通向抗体。鉴别蛋白质表面暴露区的方法包括如完整细菌的膜蛋白的生物素酰化，随后使用链霉亲和素分离生物素标记的部分。然后可以通过质谱法鉴别分离的蛋白质。另一个方法是用一种蛋白酶如胰蛋白酶处理完整的细菌(‘整修’)，以剪切表面暴露的肽，随后收集释放的肽以通过质谱法进行鉴别。

变体

在此提供的外膜蛋白的变体描述了由来自衣原体属物种不同血清型的同一基因编码的蛋白质。一种变体蛋白质与对比多肽具有显著的同源性。

蛋白质亚型

在本申请的上下文中，蛋白质的“亚型”被理解为同一蛋白质的几种不同形式中的任何一种，该蛋白质是例如以下的一种蛋白质，该蛋白质具有相同的功能但是由不同的基因编码，并且在其序列上可能有小的差异或来自单核苷酸多态性、mRNA的差异化剪切或翻译后修饰。细菌的不同血清型可能具有某些蛋白质的不同亚型。

衣原体属物种

术语“衣原体属物种”被理解为能导致动物或人类衣原体感染的一种细菌。实例是沙眼衣原体、肺炎衣原体和鼠衣原体(C.muridarum)。另外在动物中，已知一些衣原体属物种的感染，如感染猪的猪衣原体和在小反刍动物(绵羊和山羊)中导致流产的流产衣原体。

血清变体、血清变型或血清型

基于特定单克隆抗体针对MOMP可变区的反应性和MOMP可变区的详细序列分析，Ct可以被分为15个不同血清变体，并且这些血清变体中，A、B、Ba和C导致沙眼，D到K引起性传播疾病(STD)，L1到L3引起性病性淋巴肉芽肿(Lymphogranuloma venerum)，并且MoPn(鼠衣原体)感染小鼠。血清变体有时被称为具有相同含义的血清变型或血清型。

免疫重复

通过免疫重复理解了：包括一种抗原的免疫原性部分或片段的一个或多个氨基酸序列的重复单元。重复的单元可以被描述为一个或多个VD区，其可任选地如上所述延长，是重复的，例如具有三个重复VD4-VD4-VD4的4个实例，即VD4-VD1-VD4-VD1-VD4-VD1、VD4_D-VD4_D-VD4_D、VD4_D-VD4_F-VD4_G、VD4_D-VD3_E-VD4_D-VD3_E-VD4_D-VD3_E。

同源免疫重复

一个或多个氨基酸序列的重复单元，这些氨基酸序列包括来自仅一种血清变体的一种抗原的免疫原性部分或片段(图4)

异源免疫重复

一个或多个氨基酸序列的重复单元，这些氨基酸序列包括编码源自不同血清变体的同一抗原的免疫原性部分或片段(图4)

异源激发

指的是这样的情况，其中用于接种的蛋白质来源于与用于激发的血清变体不同的细菌血清变体。

同源激发

指的是这样的情况，其中用于接种的蛋白质来源于与用于激发的血清变体相同的细菌血清变体。

MOMP

Ct的主要外膜蛋白(MOMP)在Ct的发育生命周期的所有阶段被表达，并且构成大约60％的衣原体外膜的总蛋白质含量。MOMP可被分为被四个高度可变域(VD1-4或VS1-4)打断的保守域⁵⁹(图1)

VD1

如由贝尔(Baehr)等人(1988)³⁶定义的MOMP的可变域1(VD1)对应于氨基酸91-105，并且构成Ct的MOMP中的高度可变区(分别来自SvD、E、F、G、Ia和J的Seq no 1-6VD1)。延伸的VD1区(VD1^ext)对应于氨基酸57到115，并构成侧翼为来自Ct的MOMP的高度保守区的所述高度可变区(分别来自SvD、E、F、G、Ia和J的Seq no 9-14 VD1^ext)(图3)。

VD4

如由贝尔(Baehr)等人(1988)³⁶定义的MOMP的可变域4对应于氨基酸309-338，并且构成Ct的MOMP中的高度可变区(分别来自SvD、E、F、G、Ia和J的Seq no 15-20VD4)。延伸的VD4区(VD4^ext)对应于氨基酸282-349，并构成侧翼为来自Ct的MOMP的高度保守区的所述高度可变区(分别来自SvD、E、F、G、Ia和J的Seq no 23-28 VD4^ext)。

线性化

在本发明中的单词“线性化”是指一种任意长度的氨基酸链，包括一种全长蛋白质、寡肽、短肽和其片段，其中为了阻碍半胱氨酸残基形成二硫键，氨基酸半胱氨酸被丝氨酸取代。

中和表位

在此所用的中和表位是指一个氨基酸序列，其定义了被一种抗体结合的一种抗原决定簇，并且在感染的上下文中，减少衣原体负载的传染性，如通过阻断细菌与宿主细胞相互作用(这在建立细菌感染和疾病中是很重要的)，促进细菌清除。

中和

中和是包含细菌的任何生物活性，包括降低细菌建立感染或引起疾病或疾病症状的效率或能力、抑制衣原体EB的形成。

中和抗体

如上所述结合中和表位的抗体。

多肽

本发明的“多肽”这个词应该有其平常的含义。这是一种任意长度的氨基酸链，包括一种全长蛋白质、寡肽、短肽和其片段，其中这些氨基酸残基通过共价肽键连接。

IFN-γ

术语“IFN-γ”被理解为干扰素-γ。IFN-γ的测定被用作免疫学的T细胞反应的指示。

包括

贯穿本说明书，除非上下文另外需要，否则“包括(comprise)”一词或其变化形式(如“包括(comprises或comprising)”)应被理解为意指包括所陈述的要素或完整的事物、或者多个要素或多个完整的事物的群组，但不排除任何其他要素或完整的事物、或者多个要素或多个完整的事物的群组。

免疫原性部分或片段

在本发明的一个优选实施例中，该多肽包括多肽的免疫原性部分或片段，比如B细胞或T细胞的一个表位。

一种多肽的免疫原性部分或片段是该多肽的一部分，其引发动物或人和/或通过在此描述的任何生物测定确定的生物样品中的免疫反应。一种多肽的免疫原性部分或片段可能是一个T细胞表位或者一个B细胞表位。免疫原性部分或片段可以与多肽的一个或几个相对较小部分相关，它们可以分散在整个多肽序列中或位于该多肽的特定部分中。对于几种多肽，已经被证明表位分散在覆盖全长序列的整个多肽中⁷¹。

为了鉴别在免疫反应中识别的相关的T细胞表位，可以使用一种“强力”方法：由于T细胞表位是线性的，如果系统性地构建，该多肽的缺失突变体揭示了免疫识别中至关重要的多肽区域，如通过让这些缺失突变体经受例如在此所述的IFN-γ测定。另一种方法利用重叠寡肽(优选地合成的，如长度为源自该多肽的20个氨基酸残基)检测MHC II级的表位。可以在生物测定(如在此所描述的IFN-γ测定)测试这些肽，并且这些中的一些产生阳性反应(并且因此是免疫原性的)，证明肽中的T细胞表位的存在。为检测MHC I类表位，可以预测将结合的肽⁷²并在此后产生这些合成肽并且在相关生物测定(如在此描述的IFN-γ测定)中测试它们。优选地，这些肽长度为源自该多肽的例如8到11个氨基酸。可以通过分析对覆盖感兴趣的多肽的重叠肽的B细胞识别来确定B细胞表位，如例如哈尔博(Harboe)等人描述的⁷³。

免疫原性

一种免疫原性多肽被定义为一种多肽，该多肽诱发一个生物样品或当前或之前被衣原体感染的个体中的免疫反应。

融合蛋白

融合蛋白被理解为共价连接在一起的两个或更多个多肽。这些融合蛋白可以被产生为具有该多肽的优越特征。例如，当重组产生时促进融合蛋白输出的融合配偶体(如信号肽)、促进融合蛋白纯化的融合配偶体(如his-标签)、和增强融合蛋白的免疫原性的融合配偶体都是使人感兴趣的可能性。为了增强免疫原性，融合配偶体可以是另一种来自沙眼衣原体的多肽，例如一种多肽、一个多肽片段或至少一个T细胞表位或B细胞表位。

药物组合物

一种药物组合物被定义为任何疫苗(治疗性和预防性两者)或任何诊断试剂。

疫苗，蛋白质

本发明的另一部分关于一种疫苗组合物，该疫苗组合物包括一种融合蛋白或编码根据本发明所述的融合蛋白的一种核酸。为了确保这样的疫苗组合物具有最优性能，优选地，其包括一种免疫学和药学上可接受的载剂、溶媒或佐剂。

一种有效的疫苗，其中本发明的一种融合蛋白被哺乳动物(包括人类)识别，与未接种的个体相比，用致命的衣原体细菌激发后，会减少靶器官的细菌负载，延长生存时间和/或减轻体重。

合适的载剂选自下组，该组由以下各项组成：该一种或多种多肽通过疏水非共价相互作用结合的一种聚合物(如塑料，如聚苯乙烯)，或该一种或多种多肽共价结合的一种聚合物(如多糖)，或一种多肽，如牛血清白蛋白、卵清蛋白或眼孔戚属血蓝蛋白。合适的溶媒选自由一种稀释剂和一种悬浮剂组成的组。该佐剂优选地选自下组，该组由以下各项组成：二甲基-双十八烷基溴化铵(DDA)、Quil A、聚I:C、氢氧化铝、弗氏不完全佐剂、IFNγ、IL-2、IL-12、单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(Trehalose Dimycoiate)(TDM)、海藻糖二山嵛酸酯(TDB)和胞壁酰二肽(MDP)、单分枝酰甘油(Monomycolyl glycerol)(MMG)或其一种组合。一个优选的组合是一种阳离子脂质体，例如与TDB和/或聚I:C组合的DDA。

包含肽序列作为活性成分的疫苗的制备在本领域中被充分理解，如由美国专利4,608,251；4,601,903；4,599,231和4,599,230示例的，这些都通过引用结合于此。

治疗性疫苗。

本发明还涉及使用本发明的多肽或核酸用作治疗性疫苗的用途，如已在D.洛瑞(Lowry)(洛瑞等人1999)示例的文献中描述的。当作为疫苗给予时，具有治疗属性的抗原可以基于它们降低实验动物中Ct感染的严重程度或防止以前感染的再活化的能力而被鉴别。用于治疗性疫苗的组合物可以按如上针对疫苗所述制备。

本发明描述了新型高免疫原性疫苗抗原，这些抗原具有防卫不同沙眼衣原体血清变体的基于广谱抗体的中和能力。我们证明了MOMP抗原的定义片段的重复单元提供了我们称之为免疫重复的高度免疫原性分子。在不同佐剂中的具有包含VD4延伸片段(覆盖了MOMP的VD4可变域和相邻保守侧翼区)的同源免疫重复的疫苗提供了很高的抗体滴度，并且我们证明了这些构建体比用VD4延伸片段的单一单元免疫更有效。增加的效果可以观察到为显著增加的滴度、增加的细菌表面的抗体靶向、增加的中和能力、增加的和拓宽的T细胞反应、以及增加的针对同源菌株激发的保护。我们进一步证明，通过基于来自不同血清变体例如血清变型D、E、F和G的VD4延伸片段构建异源免疫重复，免疫重复技术还可用于改善针对其他血清变体的保护和中和(图3)。

表1.在构建免疫重复中使用的序列说明

异源免疫重复具有高度免疫原性，但另外增加了抗体反应广度，这与抗体反应的更广谱精细的特异性(采用肽扫描测定)相关，该抗体反应以比同源免疫重复更多样的VD4区域内线性表位组库为靶标。我们还证明，高免疫原性异源免疫重复可以合并VD1和VD4延伸片段的融合的甚至更大的片段为基础，并且我们证实，在动物模型中，这些异源免疫重复促进的保护主要由抗体介导。由于公认在一个有效的针对Ct的保护性免疫反应中需要有一个强的CMI成分(如T细胞表位)，我们也证明了通过充分延伸VD4区N端以便包括T细胞富集区域，我们可以产生如下免疫重复，这些免疫重复将产生高滴度中和抗体的能力与清除一个构建体中的残余感染的强的T细胞反应组合。我们也证明，免疫重复可以与具有疫苗潜力的T细胞抗原融合或混合，并且这种组合提供了针对Ct的早期抗体介导的保护以及对残留微生物有效的CMI介导的清除。

MOMP是一种在Ct疫苗上具有公认潜力的重要保护性抗原。然而，MOMP抗原是疫苗靶向的一种非常复杂的抗原，是因为它具有一个有众多内部二硫键的复杂结构，并且其中重要的中和表位极难暴露在重组分子中。此外，MOMP抗原是高度可变的，并且是在引起人类疾病的不同菌株中发现的大多数血清变异的基础。因此，基于完整MOMP的任何疫苗必须合并多种不同版本的分子(至少4到5种)以覆盖引起人类疾病的主要菌株。如上所述的，该MOMP抗原包含4个可变区(VD1-4)，其中尤其是VD1和VD4包含重要的中和表位，但基于代表这些区域的片段的疫苗至今未能诱导足够高滴度的功能性抗体以在动物激发研究中有任何体内作用^51，74。

本发明的免疫重复技术解决的问题是：通过重复来自MOMP抗原的保守序列侧翼的重要可变VD1和/或VD4区，我们已经获得免疫原，这些免疫原促进非寻常水平的功能性抗体。令人惊奇地，我们也证明了改进的免疫原性甚至可以在异源免疫重复构建体中实现，这些异源免疫重复构建体采用在保守片段之间间隔的来自不同血清变型的可变区，并且这种方案产生针对不同血清变体进行保护的广谱中和抗体反应。此外，该免疫重复技术提供了大量相关的T细胞表位，这些表位促进如下T细胞，这些T细胞具有直接效应子功能以及促进对邻近的B细胞表位的增强记忆反应的能力。因此，本发明代表了在开发具有广谱反应和中和不同血清变型能力的有效Ct疫苗上的突破。

众所周知，具有大量的重复和组织结构的抗原对于激活B细胞受体(BCR)(导致增加的体液反应和减少的对T细胞帮助的依赖)是最佳的。这最初是以来自不同病原体(肺炎球菌多糖和沙门氏菌多聚鞭毛蛋白)的基于天然多糖的抗原报道的，其中假定该抗原的重复性质同时触发几个BCR从而降低整体激活阈值，这触发抗体从血浆B细胞产生而不需要在先的T细胞帮助。这样的抗原是指2型T细胞独立的B细胞抗原，并且在人工系统中已显示依赖大量的重复(通常最少12到16⁷⁵)，其构成最小的表位，并且位置靠近。这显然是不同于我们的重复技术，其中大型片段(69个氨基酸，Mw>7kDa)被重复，并且这些片段含有B细胞和T细胞表位⁷⁶。

与以前的观察相反⁷⁵，我们观察到增加4个重复而未进一步提高到8个重复。重要的是，具有插入的高变异域的保守序列的重复不仅放大了对重复保守元件的反应而且重要地放大了对于可变的插入物的反应。这种令人惊讶的放大之后的分子机制并不完全清楚，但最有可能与如下事实有关，即重要表位中的许多位于可变区域和保守区域之间的重叠中，这因此可以允许同时触发不同的BCR，这些BCR都分享该表位的保守部分的一些识别。虽然机制并不完全清楚，实际后果是异源免疫重复技术允许多价免疫原的合成，这些免疫原促进以不同血清变体为靶标的不同抗体反应的产生。

我们的免疫重复构建体提供了相比于使用来自Ct MOMP的变量域的之前尝试具有非凡的免疫原性的抗原。尽管产生具有一些功能性能力的抗体，所有以前基于MOMP的VD的疫苗都不能产生转化为针对生殖器衣原体激发的体内保护的滴度^{51，65 64}。尤其是异源免疫重复方案解决了针对许多病原体看到的一个非常基本的问题，并且该问题即如何促进对多样和可变抗原的多样抗体反应。

表2.免疫重复

表3.与T-细胞抗原融合的免疫重复的实例

VD4血清变型E肽(20mer)	氨基酸序列
		CT681_25_SvE	DASIDYHEWQASLALSYRLN
CT681_26_SvE	ASLALSYRLNMFTPYIGVKW
		CT681_27_SvE	MFTPYIGVKWSRASFDADTI
CT681_28_SvE	SRASFDADTIRIAQPKSATA
		CT681_29_SvE	RIAQPKSATAIFDTTTLNPT
CT681_30_SvE	IFDTTTLNPTIAGAGDVKAS
		CT681_31_SvE	IAGAGDVKASAEGQLGDTMQ
CT681_32_SvE	AEGQLGDTMQIVSLQLNKMK

表4.来自血清变型E的VD4的重叠肽

血清变型F肽(20mer)	氨基酸序列
		CT681_25_SvF	DASIDYHEWQASLSLSYRLN
CT681_26_SvF	ASLSLSYRLNMFTPYIGVKW
		CT681_27_SvF	MFTPYIGVKWSRASFDSDTI
CT681_28_SvF	SRASFDSDTIRIAQPRLVTP
		CT681_29_SvF	RIAQPRLVTPVVDITTLNPT
CT681_30_SvF	VVDITTLNPTIAGCGSVAGA
		CT681_31_SvF	IAGCGSVAGANTEGQISDTMQ
CT681_32_SvF	TEGQISDTMQIVSLQLNKMK

表5.来自血清变型F的VD4的重叠肽

表6.来自血清变型D的VD4的重叠肽

表7.来自血清变型F的VD4的重叠肽

表8.CT681的氨基酸序列

根据参考文献所包含的乌尔默(Ulmer)等人1993的综述，本发明的核酸(是编码上述融合蛋白的核酸)可以用于影响免疫原性多肽的体内表达，即该核酸可用于所谓的DNA疫苗。

在构建和制备编码针对DNA接种定义使用的融合多肽的质粒DNA中，可以使用宿主菌株如大肠杆菌。然后质粒DNA可以从携带感兴趣的质粒的宿主菌株的过夜培养中制备，并且使用如凯杰吉加(Qiagen Giga)质粒柱试剂盒(凯杰(Qiagen)，美国加利福尼亚州圣塔克拉利塔(Santa Clarita,CA,USA)包括内毒素清除步骤进行纯化。用于DNA疫苗接种的质粒DNA必须是不含内毒素的。

因此，本发明还涉及一种包括根据本发明的核酸的疫苗，该疫苗影响已接种该疫苗的动物(包括人类)的免疫原性多肽的体内表达，有效于大幅度提高对动物(包括人类)中的由致命病菌引起的感染的抗性的表达多肽的量。

通过将编码表达产物的基因连同编码具有调节免疫反应的能力的多肽的一个DNA片段一同给予，可能增强这种DNA疫苗的功效。

通过在非致病性的微生物或病毒中表达相关的免疫原性多肽可能实现有效激活细胞免疫反应的一个可能性。这些微生物的众所周知的例子是牛结核分枝杆菌BCG、沙门氏菌属以及假单胞菌属，并且病毒的例子有牛痘病毒和腺病毒。

因此，本发明的另一个重要方面是目前可用的活BCG疫苗的一个进步，其中编码上面定义的一种或多种融合多肽的DNA序列的一个或多个复制以允许微生物表达和分泌融合多肽的方式合并到微生物的基因组中。考虑了合并本发明的核酸序列的超过一个复制以加强免疫反应。

另一种可能性是将编码根据本发明的融合多肽的DNA整合到减毒病毒如牛痘病毒或腺病毒中(拉尔夫(Rolph)等1997)。该重组痘苗病毒能够进入受感染宿主细胞的细胞质或细胞核内，并且感兴趣的融合多肽可以因此诱发免疫反应，该免疫反应被设想为诱导对TB的保护。

尽管DNA疫苗是超过16年之前开发的，在人类中临床试验前阶段I和II仍然是罕见的。然而，两种兽药DNA疫苗已获得许可：一种针对西尼罗病毒(马中)而第二种针对鲑鱼中的传染性造血组织坏死病毒。这表明DNA疫苗可以有很好的保护作用，并且新的DNA疫苗不受动物的大小或物种的限制。对于第一代DNA疫苗，对鼠科模型观察到的DNA疫苗上的巨大成功没有很好的转化给人类，尽管如此，研究人员最近通过单一剂量的对人类基因枪给予的HA DNA疫苗证实了保护性抗体水平。

“核酸免疫”或一般首选名称“DNA疫苗”是接种作为表达盒或表达载体或合并到病毒载体中的编码抗原的DNA或RNA，目的是诱导对基因产物的免疫。因此，在我们的DNA疫苗的定义中，我们包括编码抗原的DNA或RNA的各种递送系统。该疫苗基因可以是处于只具有表达所需的关键特性(启动子，疫苗基因和聚腺苷酸化信号)的环形质粒或线性表达盒的形式。递送系统可能最经常是在含或不含佐剂的缓冲液中的裸DNA，耦合到纳米颗粒和/或配制到包含佐剂的化合物中或插入到活病毒或细菌载体(如腺病毒、腺相关病毒、甲病毒、痘病毒、疱疹病毒等)中的DNA。由于引起体液和细胞介导的免疫性而没有与活病毒疫苗相关的相同危险，DNA疫苗有巨大的前景。与减毒活病毒疫苗相反，与不得不结合到特定的受体的活病毒比较DNA疫苗可能会被递送给相同或不同的组织或细胞。天然形式的抗原的产生改善了抗原向宿主免疫系统的呈递。与减毒活疫苗不同，DNA疫苗没有传染性，并且不能恢复毒性。

DNA疫苗比传统疫苗提供了许多优势。该疫苗可以在短时间内大量生产，不再需要卵繁殖，该疫苗是经济的，可再生的，并且因为DNA是稳定和耐极端温度的，最终产物不需要冷藏条件。所有当前得到许可的灭活疫苗对于诱导体液抗体反应是有效的，但只有减毒活病毒疫苗也有效地诱导细胞毒性细胞反应。DNA疫苗也有这种能力，并且因此关于特异性和抗体同型，诱导的反应可能比灭活疫苗更好地模仿对病毒感染的自然反应。

DNA疫苗诱导一种免疫反应，该反应能够与通过天然病毒感染通过激活体液免疫和细胞介导的免疫两者获得的反应媲美。对DNA疫苗的广谱反应是由于转染的宿主细胞表达编码基因，诱导Th1和Th2免疫反应。处于其天然形式的抗原的产生改善了抗原向宿主的免疫系统的呈递。

两种最常见的DNA疫苗给药类型是裸DNA的盐水注射液和基因枪DNA接种(DNA包覆在固体黄金珠子上，用氦气压力给药)。DNA的盐水肌内注射液优先生成一种Th1 lgG2a反应，而基因枪递送倾向于发起再次的Th2 lgG1反应。肌内注射质粒有被细胞外脱氧核糖核酸酶降解的风险，然而，诱导的反应往往比基因枪方法诱导的那些反应成活的时间更长。通过基因枪递送DNA将疫苗接种到表皮已经被证明是最有效的免疫方法，可能是因为皮肤包含所有必要的细胞类型，包括用于诱发体液和细胞毒性细胞免疫反应(朗格汉斯和树突细胞)的专门的抗原呈递细胞(APC)。在小鼠中，用小到1μg的DNA获得了对致命剂量的流感病毒的完整保护。标准DNA疫苗载体由克隆到被工程化以在真核细胞中最佳表达的细菌质粒中的感兴趣的基因组成。基本特征包括：一个允许在细菌中产生的复制原点，一种允许在细菌培养中进行质粒选择的细菌抗生素抗性基因，一种适于在哺乳动物细胞中最佳表达的强的组成型启动子(来自巨细胞病毒(CMV)或猴病毒的启动子提供最高的基因表达)，一个用于稳定mRNA转录物的聚腺苷酸化序列(如牛生长激素(BHG)或猴病毒聚腺苷酸化)，以及一个用于插入抗原基因的多克隆位点。内含子A序列显著提高基因的表达。许多细菌性DNA疫苗载体包含可能引起强的宿主先天免疫反应的未甲基化的磷酸化胞嘧啶核苷-鸟嘌呤核苷(CpG)二核苷酸基序。近年来已经有几种方法来提高和定制对DNA疫苗构建体(第二代DNA疫苗)的免疫反应。例如双顺反子载体或多基因表达质粒已同时被用来表达两个基因。特定启动子已经被工程化以将基因表达限制到某些组织中，并且细胞因子/抗原融合基因已被构建以加强免疫反应。此外，基因可能经过密码子优化以用于在宿主中的最佳基因表达，并且天然的前导序列可能被优化的前导序列取代以提高转化效率。

DNA疫苗的给药可以通过裸DNA或RNA的盐水或缓冲的盐水注射液，或者耦合到颗粒的表达DNA片段的DNA质粒或线性基因的注射液，或通过基因枪接种或由病毒载体(病毒样颗粒)例如腺病毒、改性的牛痘病毒安卡拉(MVA)、牛痘、腺相关病毒(AAV)和甲病毒等递送。

材料和方法

沙眼衣原体的培养

将Ct的血清变型D、E和F在Hela 229细胞中增殖(ATCC，美国马里兰州罗克维尔市(Rockville,MD,USA))在含5％胎牛血清(吉博科公司(Gibco BRL)，热灭活)，1％v/v的羟乙基哌嗪乙磺酸，1％v/v的L-谷氨酰胺，1％v/v的丙酮酸盐和10μg/ml吉他霉素的RPMI 1640培养基(吉博科公司(Gibco BRL)，美国纽约州格兰德岛(Grand Island,NY,USA))中培养细胞。用在0.3毫升SPG-缓冲液/孔中的Ct血清变型E或F以每个细胞1.5内含物形成单元感染在6孔板中的半流动的单层Hela 229细胞。将各板在贺利氏离心机(Heraeus Multifuge)3S中以750g离心1小时，并且然后在板摇床上在35℃孵化2h。2h后，每个孔添加2毫升补充有5％葡萄糖和1μg/ml放线菌酮的培养基，并且然后将细胞在37℃下，在湿润空气中5％CO₂的气氛下进一步孵化72h。

收获Ct

感染72h后收获衣原体用细胞刮刀将细胞从孔中移出，并在35000g和4℃离心30分钟。将各小球重新悬浮于HBSS，在冰上进行声处理，并在500g和4℃离心15分钟。收集上层清液，并于冰上储存，并且将小球重新悬浮到与之前相同的体积，并且重复声处理和离心。将两次上层清液混合，并于30000g和4℃离心30分钟，用针头和注射器将各小球重悬于SPG缓冲液(3ml/板)。经过短暂的声处理后，轻轻地将悬浮液置于30％泛影酸盐溶液(50g泛影酸葡甲胺，76ml H₂O中的7.7g的泛影酸钠)，并在40,000g离心30分钟。离心后，在SPG缓冲液中重悬小球并存储在-70℃。通过在McCoy细胞上的滴定法，定量各批次的IFU，并通过BCA确定各批次的浓度。

抗原和融合物制备方法

沙眼衣原体血清变型D、E、F和G的基因组是公众可获得的(NCBI-基因库)。编码沙眼衣原体抗原和融合物的基因全部通过合成获得，用于克隆到大肠杆菌的细菌蛋白表达系统(DNA2.0)。pET411载体用于在带组氨酸亲和标签的大肠杆菌中表达重组沙眼衣原体蛋白。细菌宿主是BL21-STAR^TM。使大肠杆菌在37℃生长到对数生长期OD600～0.5，并诱导蛋白质表达4小时，并且通过离心收获细胞(6,000g持续15min)。使用包含全能核酸酶(Benzonase)的博哥斯特(Bugbuster)(诺瓦根(Novagen))、r溶菌酶和蛋白酶抑制剂混合物I(卡比化学(Calbiochem))来裂解大肠杆菌。内含体是由离心分离(10000g，10分钟)。将小球溶解在50mM NaH₂PO₄、0.4M NaCl、8M尿素、10mM咪唑pH 7.5中，并加载到HisTrap HP柱(安玛西亚生物科学(Amersham Biosciences))，通过应用一个50mM到500mM咪唑的梯度洗脱结合的蛋白。根据抗原和融合等电点，进一步通过离子交换层析纯化它们。通过BCA蛋白测定(皮尔斯(Pierce))确定蛋白质浓度。

动物

雌性B6C3F1小鼠，8-12周龄，自哈伦实验室(Harlan Laboratories)获得。动物被安置在标准环境条件下，并供给标准的食物和水，自由采食。按照丹麦司法部(Lov om

jvf lovbekendelser nr.726 af 9.1993年9月)和动物保护委员会提出的法规的指导使用小鼠。递交了详细的实验说明，并获得申请者成立的地区伦理评审委员会的批准(2012-15-2934-00100)。

免疫

将小鼠免疫3次，免疫之间有14天。将聚肽在CAF01中乳化，并通过皮下(sc)和鼻内(i.n)路线同时给予。采用两种路线给出的疫苗由在250ug的DDA和100ug的TDB中乳化的5ug的肽组成(参见上述)。作为阴性对照，注射单独的DDA/TDB(没有肽)。

衣原体属特异的细胞反应

纯化血液淋巴细胞或脾细胞。从每组中8只小鼠收集血液淋巴细胞，并将脾细胞单独培育(n＝4)并一式三份培养在含2x 10⁵个细胞/孔的圆底微量滴定板(恩科公司(Nunc)，丹麦(Denmark))于体积为200μl的补充有5x 10-⁵M 2-巯基乙醇、1mM谷氨酰胺、1％丙酮酸盐、1％青霉素-链霉素、1％羟乙基哌嗪乙磺酸和10％的胎牛血清(FCS)(英杰公司(Invitrogen)，丹麦(Denmark))的RPMI-1640中。将细胞用1-10μg/ml的单个抗原或VD1和VD4肽池(2μg/ml的每种肽)再次刺激。分别地，用伴刀豆球蛋白(5μg/ml)刺激或针对细胞活性作为阳性对照的培养基以及阴性对照。在37℃下以5％的CO₂孵化72小时后，收获上清液并在使用前储存在-20℃。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定IFN-γ分泌量。

血清抗体

在最后接种后不同的时间点对小鼠取血，并且离心分离血清。针对Ct表面(SvD、SvE和SvF)、针对SvE VD4单体、和针对跨越SvD、SvE和SvF的VD4区的肽(表4和5)，通过ELISA检测血清。简而言之，在4℃在碳酸盐缓冲液中将各板包覆抗原(1到10μg/ml)过夜，用BSA封闭，并且洗涤。然后用预先稀释的样品在4℃将这些板孵化过夜，洗涤并用过氧化物酶共轭二次抗体孵化1小时。通过与TMB基质孵化使反应可视化，并用硫酸终止反应，并且在450nm读数。在研究针对跨越SvD(SvE)(表6)和SvF(表7)的VD4区的9mer重叠肽面板的ELISA反应性时，进行了微小的改变。简单地说，将各板用链霉亲和素处理和包覆生物素化的肽，在室温下用脱脂奶粉封闭2小时，并且洗涤。然后这些板与预稀释的(1:100)血清样本在室温下被孵化2h，洗涤并且用过氧化物酶共轭二次抗体孵化1小时。通过与TMB基质孵化使反应可视化，并用硫酸终止反应，并且在450nm读数。

中和试验

在96孔的平底微量滴定板中使HaK细胞在补充5％胎牛血清(Gibco BRL；热灭活)、1％v/v羟乙基哌嗪乙磺酸、1％v/v L-谷氨酰胺、1％v/v丙酮酸盐和10μg/ml吉他霉素的RPMI 1640培养基中生长至会合。

预先滴定衣原体母液并且稀释为针对SvE的3x 10⁶IFU/ml、针对SvD的2x 10⁶IFU/ml和针对SvF的5x 10⁶IFU/ml。将从免疫接种的小鼠分离的血清(混合的)在56℃热灭活1/2h，稀释2-4次，并且4-5倍滴定。将80μl的该细菌悬浮液与80μl血清(+/-20g/ml肽)混合，并在37℃在慢慢摇动的平台上孵化30分钟，并且然后将50μl的该悬浮液一式两份接种到之前制备的HaK细胞。为此，将培养基从HaK单层移除，并且添加100μl补充0.5％的葡萄糖和10μg/ml的环十二碳三烯的上述培养基，随后添加50μl血清/细菌悬浮液。在35℃下在慢慢摇摆的平台上孵化各板，然后移除培养液，并且添加100μl的补充0.5％葡萄糖和10μg/ml放线菌酮的上述培养基。然后将各板在37℃下，在湿润空气中5％CO₂的气氛下孵化24h。孵化后移除培养基，并且将单层用96％乙醇固定10分钟。用我们实验室制备的多克隆兔抗-CT755血清染色，随后用FITC共轭猪抗兔免疫球蛋白(Dako)染色，使内含物可视化。采用碘化丙啶(英杰公司(Invitrogen))进行背景染色。

阴道激发和阴道衣原体负载

Ct血清变型D激发前的10天和3天，注入2.5毫克醋酸甲羟孕酮(甲孕酮(Depo-Provera)；辉瑞(Pfizer))使发情周期同步。最后接种6周后，将小鼠用10μl SPG缓冲液中的4-8x 10⁵IFU的Ct血清变型D进行i.vag.激发。在感染后的3、7、10和14天获得阴道拭子。用在0.6mL SPG缓冲液中的玻璃珠涡旋拭子，并在分析前储存在-80℃。如¹⁷所述确定感染负载。简单地说，用滴定体积的拭子悬浮液一式两份感染McCoy细胞单层。在室温下750x g将各板离心1h，随后35℃孵化2h。然后将感染培养基替换为新培养基，并且将细胞在37℃下孵化30h。通过在我们实验室制备的多克隆兔抗-CT681血清，随后用FITC共轭猪抗兔Ig(达科公司(DAKO)，丹麦格洛斯楚普(Glostrup,Denmark))染色使内含物可视化。采用碘化丙啶(英杰公司(Invitrogen)，丹麦塔斯川普市(Taastrup,Denmark))进行背景染色。通过荧光显微镜对内含物计数，每个孔观察到至少20个单独视域。

CD4⁺和CD8⁺T-细胞的损耗

使用HiTrap蛋白G HP柱(丹麦通用电气医疗集团生命科学部(GE-HealthcareLife Sciences,Denmark))，从在我们实验室制备的杂种瘤上层清液纯化单克隆抗鼠CD4(克隆GK1.5)和抗鼠CD8(克隆YTS156和YTS169，来自斯蒂芬·科波德(Stephen Cobbold)的赠送)^78，79。将纯化IgG针对PBS进行透析，通过0.22um过滤器过滤并由OD 280nm确定蛋白质浓度。在相对于感染当天的第-7、-4、-1及+2和+6天，通过4次注射250-300μg纯化的抗CD4或多种抗CD8抗体的混合物，损耗掉小鼠的CD4⁺和CD8⁺T细胞。在感染后的第1天用FITC共轭抗CD4细胞抗体(克隆RM4-4)和PE共轭抗CD8抗体(克隆53-6)(BD生物科学公司(BDBiosciences)，丹麦(Denmark))通过在PBMC上的FACS分析证实CD4⁺和CD8⁺T细胞损耗。

体内损耗

预先滴定衣原体感染血清变型D原液，并稀释至8x 10⁴IFU/μl，与从用异源的VD4免疫重复SvD-SvE-SvF(CTH89)免疫的小鼠分离的血清1:1混合。Ct的血清变型D激发前的10天和3天，注入2.5mg的醋酸甲羟孕酮(甲孕酮；辉瑞(Pfizer)，使发情周期同步。将小鼠用10μl的上述混合物(4x 10⁵IFU的Ct血清型D)进行i.vag.激发。在感染后的3、7和10天获得阴道拭子。

统计分析

使用GraphPad Prism 4进行统计分析。使用克鲁斯卡·沃利斯(Kruskall-Wallis)，随后使用曼-惠特尼(Mann-Whitney)分析阴道衣原体负载的中值。

实例1：与单体的VD4^ext单元比较，用VD4^ext的同源免疫重复免疫后增强的免疫反应。

引言

在此我们选择了包含血清变型E的延伸的VD4片段的多肽单元(序列参见图2)(SvEVD4^ext)。为了加强针对这些域的免疫反应，我们设计的重组多肽是以重复方式出现的SvEVD4^ext单元。为了研究重复形式的构建体与单体形式相比是否可能会提高抗体反应，我们设计了重组多肽，其中这些单元以单一单元或重复方式呈现。针对血清变型E(SvE)，构建了该延伸的VD4单元的1个单体(SvE VD4^ext)*1(CTH181)、4个免疫重复(SvE VD4^ext)*4(CTH527)和8个免疫重复(SvE VD4^ext)*8(CTH526)。这些同源免疫重复构建体是在佐剂CAF01中配制的，并且用于给小鼠接种疫苗；每个小鼠接种2x 5μg的肽，因此VD4的量是一样的。通过针对SvE VD4^ext、覆盖SvE VD4^ext的肽和衣原体的细菌表面的ELISA研究了构建体的免疫原性。

结果

将6只小鼠/组免疫2次，免疫之间有14天。疫苗(2x 5μg)在CAF01中乳化并同时通过sc.和i.n路线给予。在最后一次接种疫苗的特定时间点收集血液，并由ELISA测定针对来自SvE的延伸的VD4单元和针对SvE的细菌表面的抗体水平。用单一VD4^ext单元(单体的VD4^ext，CTH181)进行的接种诱导了比用由(SvE VD4^ext)*4的4个VD4^ext重复组成的同源免疫重复进行免疫后诱导的抗体水平更低的VD4^ext特异抗体水平(图5A)。采用(SvE VD4^ext)*4免疫后看到的更高的抗体反应导致与从(VD4^ext)*1免疫小鼠分离的血清相比对细菌表面的更强识别(图5B)。当以1:500血清稀释测试时，对具有跨越延伸的VD4区域的10aa重叠的20mer肽的反应(表4)也增强，导致与用单体的VD4单元进行免疫的小鼠组相比在(VD4^ext)*4同源免疫重复组中具有更广谱的抗原决定簇识别模式(图5C)。单体构建体免疫的组中，反应专门靶向包含TTLNPTIAG表位的中部区域，然而用同源免疫重复进行的免疫暴露了该表位上游和下游的几个B细胞表位，导致不同表位的多样识别模式。我们继续研究是否8(SvEVD4^ext)*8(CTH526，seq no 30)免疫重复比4(SvE VD4^ext)*4免疫重复的免疫原性更强。这两种构建体针对延伸的VD4单元和针对SvE细菌表面诱导类似的抗体水平。

结论

我们证明，通过用来自血清变型E的延伸VD4单元的免疫重复进行免疫，我们可极大提高抗体反应，该抗体反应测量为针对引起对细菌表面的强烈反应性的延伸的VD4单元的反应的滴度(图5A和B)和广度(图5C)。我们没有发现通过将重复数量从4增加到8而增强的抗体滴度和中和滴度。

实例2：与来自SvF的同源免疫重复相比，由来自SvD、E、F和G(CTH518)的异源免疫重复组成的一种构建体诱导对多种血清变型的更强的反应。

引言

我们研究了与由来自SvF(SvF VD4^ext)*4(CTH529)的延伸的VD4单元组成的同源免疫重复进行的免疫比较，用由来自SvD、SvE、SvF和SvG(CTH518)的延伸的VD4单元组成的异源免疫重复进行的免疫是否保持了强的免疫原性并且能够诱导识别多个血清变型的表面的更广谱抗体反应。这些免疫重复构建体是在佐剂CAF01中配制的，并且用于给小鼠接种疫苗。通过针对血清变型D、E和F的细菌表面的ELISA来研究这些构建体的免疫原性。

结果

异源免疫重复促进了与以来自SvF的同源免疫重复看到的同样高的水平识别血清变型F菌株的表面的一种抗体反应。然而，通过用包含来自四种血清型(SvD、SvE、SvF、SvG)的延伸的VD4区的异源免疫重复进行免疫，我们观察到与来自血清变型F的同源免疫重复(图6)比较，对D和E型血清变体显著增加的滴度。

结论

在维持宣称的同源免疫重复的免疫原性时，用由异源延伸的VD4的免疫重复组成的构建体进行的免疫诱导了识别多种血清变型(D、E和F)的更广谱反应。

实例3：与由来自(SvE^ext VD4)*4、(SvF^ext VD4)^*4的异源免疫重复和一种之前发表的A8-VD4肽⁶⁵组成的构建体比较，用来自血清变型D、E、和F(CTH89)的延伸的VD4单元的异源免疫重复进行免疫后抗体反应的特异性。

引言

我们研究了与用由来自血清变型E(SvE^ext VD4)^*4(CTH527)、SvF(SvF^ext VD4)^*4重复(CTH524)的延伸的VD4重复和A8-VD4肽组成的同源免疫重复进行的免疫比较，用来自SvD、SvE、SvF(CTH89)的延伸的VD4域组成的异源重复进行的免疫后的免疫反应的特异性。这些构建体是在佐剂CAF01中配制的，并且用于给小鼠接种疫苗。通过针对跨越D、E、和F(表到4-7)的VD4区的肽面板(9和22AA长)的ELISA来研究构建体的免疫原性。测试血清(从6到8只小鼠)，并且一个空心框表示了高于背景但低于OD＝1.0的反应，一个实心框标示高于1.0的反应。框的长度表示抗体识别的区域。

结果

所有构建体诱导对位于可变域(VD)中的VD4^ext的保守TTLNPTIAG部分的高抗体反应。一般而言，同源免疫重复产生的抗体在识别它们的代表性同源VD4^ext区上是优越的，而很明显，当对这些构建体针对来自不同血清变型的覆盖VD4^ext的肽进行测试时，它们的表位识别组库受到限制，例如通过来自用构建体(SvF^exl VD4)*4免疫的动物的血清对血清变型EVD4区进行识别(图7A和C)(并且反之亦然)(图7B和C)。异源免疫重复(CTH89)免疫后产生的抗体，比来自用同源免疫重复和A8-VD4(7A、B、C和D)免疫的动物的血清识别更广谱表位组库。该构建体能够以通过用同源免疫重复进行的免疫实现的水平(或更好)覆盖一种覆盖了血清变型E和F的表位组库。

为了表明代表中心VD4肽FDTTTLNPTIAGAGDVK的17AA肽是否能够与沙眼衣原体生物竞争CTH89特异的抗体结合，实施了竞争中和测定。不同浓度的CTH89和A8-VD4特异血清在浓度20μg/ml与肽混合(图7D)。结果表明，与A8-VD4特异血清相反，该肽无法完全消除CTH89特异血清的中和能力，表明这种血清靶向中和表位的更广谱组库。

结论

用异源延伸的VD4的免疫重复进行的免疫诱导识别了VD4区的保守的和血清变型特异部分的更广谱反应，转化为更广谱的中和表位组库。

实例4：SvD激发后，用来自SvD、SvE、和SvF(CTH89)的延伸的VD4的异源免疫重复进行免疫产生了早期的T细胞独立的保护。

引言

为了研究负责用VD4重复单元进行疫苗接种后看到的早期保护的效应子机制，使接种了CTH89的小鼠在激发前耗竭T细胞，并且在耗尽和非耗竭小鼠中比较诱导早期保护的能力。

结果

将8只小鼠/组免疫3次，免疫之间有14天。疫苗(2x 5μg)在CAF01中乳化并同时通过sc.和i.n路线给予。在最后接种后的特定时间点，使小鼠出血，并且在有和没有T细胞耗竭的情况下测量针对衣原体的抗体反应、中和滴度、和体内保护。T细胞亚群的耗竭消除了对CTH89的T细胞反应(图8A)。CTH89诱导识别血清变型D(图8C)的表面的一个强的抗体反应(图8B)，并能够以约1:10³的50％中和滴度体外中和细菌(图8D)。然而，我们仍然在T细胞耗竭小鼠中观察到激发后第3天显著的保护(图8E)，表明了在针对衣原体的早期保护中识别VD4单元的抗体的体内作用。最后，我们证明了CTH89血清还能够在用SvD获得的水平以非常高的50％中和滴度中和SvE及SvF感染(图8D)。

结论

免疫重复产生针对用血清变型D进行的阴道激发的T细胞独立性早期保护，表明VD4特异抗体的体内作用。

实例5：用CTH89特异的血清进行的体内中和

引言

为了研究体外中和是否可以转化为血清体内介导的保护作用，我们接着研究与来自天然小鼠的血清比较，包覆CTH89免疫后产生的抗体的SvD细菌是否能够在体内中和/抑制感染。

结果

将SvD细菌与从CTH89免疫的小鼠分离的血清或从天然小鼠分离的血清混合。然后将甲孕酮处理的小鼠用4x 10⁵细菌感染。与采用天然血清包覆的SvD激发的小鼠比较，用包覆了CTH89血清的SvD感染的小鼠有效控制了细菌复制。在对照组(图9)中，分别与2和3比较，8只小鼠中的6只在第7和10天受到清理。

结论

与从天然小鼠分离的血清比较，在用异源VD4免疫重复进行免疫后产生的血清有效封闭了SvD对小鼠的感染。

实例6.重组的MOMP与异源延伸VD4的免疫重复的融合

引言

MOMP是体液和细胞免疫反应两者的靶标，但尽管复性天然MOMP疫苗在产生中和抗体和防止感染中相对成功^54，56，以重组MOMP(rMOMP)为基础的实验性疫苗已经失败。我们设计了从氨基酸56到349变化的一种重组MOMP，包括所有可变域(CTH521)。我们也选择包含血清变型D、E、F和G(CT518)的延伸的VD4片段(覆盖MOMP的VD4可变域和相邻保守侧翼区)的多肽单元。最后构建了其中CTH521被融合到CTH518(CT522)的杂种(图10)。

结果

将8只小鼠/组免疫3次，免疫之间有14天。疫苗在CAF01中乳化并同时通过sc.(5μg)和i.n.(5μg)路线给予。接种后收集血样，并测量针对VD4^ext单元、重组MOMP和针对细菌表面的抗体。在用CT522和CT518免疫后产生的抗体与CT521免疫后分离的血清比较，在更高水平上识别VD4区(图10A)和细菌表面(图10C)此外抗体形式CTH518和CTH522能够在与CTH521(图10D)相同的水平和更高的水平中和SvD感染。

结论

重组的MOMP和异源延伸的VD4的免疫重复融合，产生了诱发与单独的免疫重复相同的功能性抗体反应的分子。

实例7：与接种来自SvD(CTH87)的单一VD1-VD4单元相比，接种来自SvD、SvE和SvF(CTH88)的VD1^ext-VD4^ext区域的异源免疫重复。

引言

我们接下来研究是否可能将另一个VD区融合到延伸的VD4区，并且仍然保持诱导中和抗体的能力。因此构建体被设计为耦合到延伸的VD4区的VD1区的延伸版本。我们产生了由来自SvD(CTH87)的VD1和VD4的一个延伸单元组成的同源单元，和由来自不同血清变型(D、E和F；CTH88)的VD1和VD4的延伸单元组成的异源免疫重复。

结果

将12只小鼠/组免疫3次，免疫之间有14天。疫苗在CAF01中乳化并同时通过sc.(5μg)和i.n.(5μg)路线给予。来自用CTH87免疫的小鼠的抗体识别SvD、SvE和SvF的细菌表面(图11A)；针对同源的SvD菌株观察到最高滴度并且针对最远缘的SvF观察到最低滴度。与单体构建体比较，用异源VD1^ext-VD4^ext单元的免疫重复进行免疫导致针对细菌表面的显著更高水平的抗体，并且扩大了如下反应，该反应导致针对SvD和SvE增加6到12倍且针对抗SvF增加将近25倍的滴度(图11)。在一个体外中和测定中，这些抗体中和感染的能力甚至被进一步提高，因为来自血清变型D的单体VD1^ext-VD4^ext构建体免疫的动物的血清仅具有最小的中和能力，与异源VD1-VD4免疫重复构建体相比(中和滴度为1:2000)(图11B)。最终用异源VD1^ext-VD4^ext免疫重复构建体进行接种非常有效地防卫了阴道激发模式中的SvD激发(图11)。

结论

我们证明了通过用来自血清变型D、E和F的异源VD1^ext-VD4^ext单元的免疫重复进行免疫，我们可以极大地增强针对所有三个血清变型的细菌表面的抗体反应。重要的是，我们还表明，通过接种异源免疫重复，我们观察到血清变型F表面识别上的选择性的更高的增加(25倍对比针对血清变型D和E的6-12倍)，这表明这些异源免疫重复不仅增加了针对共享表位的抗体水平，而且也增加了针对血清变型F特异表位的抗体水平。我们证明了与来自SvD(CTH87)的单一VD1-VD4单元相比(图11C)，以异源VD1-VD4(CTH88)的免疫重复诱导的抗体产生导致早期体内保护的体外中和滴度。

实例8：T细胞抗原耦合到VD4的免疫重复

引言

由于在针对沙眼衣原体的有效保护免疫反应中对CMI成分有公认的需要，我们接下来研究异源免疫重复是否可以融合具有疫苗潜力的T细胞抗原。我们的目的是提供针对Ct的早期抗体介导的保护以及对残留生物的有效CMI介导的清除。由CT043以及部分CT414和T681组成的构建体融合到异源VD1-VD4(CTH91)的免疫重复。

结果

将12只小鼠/组免疫3次，免疫之间有14天。疫苗(2x 5μg)在CAF01中乳化并通过sc.和i.n路线给予。在最后接种后的不同时间点，使小鼠出血，并且测量抗体反应和中和滴度。在CTH91和CTH88免疫后产生的抗体在类似的水平识别VD4^ext区(图12A)，并且分离自两个组的血清能够中和SvD感染(图12B)。相比CTH88免疫的小鼠，对CTH91的T细胞反应在识别CT414和CT043上更强(图12C)。在感染后的第三天，这种T细胞和B细胞反应导致针对两组的显著保护，但在感染后的第7天和10天，与CTH88相比，接种了融合的T和B细胞靶标(CTH91)的组诱导高水平的保护(图12D)。

结论

我们能够融合T细胞抗原与重复VD区，并仍保持诱导早期保护的能力，并且另外这些构建体诱导残留生物的有效CMI介导的清除，导致在感染后的第7天高水平的保护。

实例9：用异源VD4免疫重复和T细胞抗原融合分子的混合物进行的免疫

引言

我们下一步研究是否免疫重复可以与具有疫苗潜力的T细胞抗原混合并还提供针对Ct的早期抗体介导的保护以及对残留生物的有效的CMI介导的清除。因此我们研究是否我们可以把由CT043、部分CT414和CT681(CTH93)组成的强的T细胞杂种与CTH89混合(图13A)并且仍然维持体外中和SvD细菌并诱导针对阴道激发的早期保护的能力。

结果

将12只小鼠/组免疫3次，免疫之间有14天。疫苗(2x 5μg)在CAF01中乳化并同时通过皮下(sc)和鼻内(i.n)路线给予(图13)。用CTH89或CTH89和CTH93的混合物免疫后产生的抗体强烈识别VD4区(图13B)，并且采用类似的50％中和滴度来中和细菌(图13C)。在用T细胞抗原融合物(CTH93，图13D)接种后，看到了大幅减少水平的VD4识别和中和，虽然该分子也包含MOMP(CT681)和因此可能相同的中和表位。该分子也对TTLNPTIAG表位(数据没有显示)给出非常低的水平的识别。如前所报道，这显然强调了全尺寸重组MOMP作为疫苗抗原对诱导中和抗体的限制。CTH89以及CTH89和CTH93疫苗的混合物诱导了在感染后3天的保护(图13E)。这与在感染后3天未诱导显著保护的CTH93接种的小鼠相反。在感染后的第七天，包括强的T细胞靶标(CTH93)的两种疫苗诱导显著水平的保护(图13D和E)。

结论

我们可以将异源VD4重复和强的T细胞抗原混合，而不会失去针对血清变型D激发的体外中和及早期体内保护。此外，B和T细胞靶标的混合物诱导残留生物的有效CMI介导的清除，导致在感染后的第7天高水平的保护。

实例10：测试不同佐剂系统的作用

引言

为了研究针对异源免疫重复的高抗体反应是否只是当疫苗在CAF01中给予时看到，我们比较了在用CAF01或明矾中的CTH527(SvE VD4^ext)*4免疫后的抗体反应与中和滴度。

结果

与CTH527一起给予时，两种佐剂系统诱导针对SvE表面的高抗体反应，并且来自两组的抗体能够体外中和SvE(图14)。

实例11：用由来自SvD、SvE、SvF、和SvG的降低长度的VD4^ext区组成的异源免疫重复进行接种

引言

我们接下来比较了由降低长度的VD4区(CTH285 SEQ ID NO 69和CTH286 SEQ IDNO 70)组成的异源免疫重复构建体，与CTH518构建体(CTH518 SEQ ID NO 53)进行比较(图15A)。

结果

将12只小鼠/组免疫3次，免疫之间有14天。疫苗在CAF01中乳化并同时通过皮下(sc，5μg)和鼻内(i.n，5μg)路线给予。从4只小鼠/组分离脾细胞，并且研究了代表VD4^ext区的重叠肽的T细胞反应(图15B)和血清中和血清变型D和F感染的能力(图15C)。用CTH285接种后，看到了大幅减少水平的VD4识别和中和，其中来自不同血清变型的VD4^ext区在38aa上减少。另一方面CTH286(每个VD4^ext区域在24aa上减少)诱导类似水平的T细胞反应并且具有与CTH518一样的中和血清变型D感染的能力。

结论

我们证明了通过减少具有38aa的VD4^ext区的长度，我们降低了T细胞反应及中和血清变型D和F感染的能力。

实例12：由来自SvD、SvE、SvF、SvG、SvIa、和SvJ的延伸的VD4^ext区组成的异源免疫重复进行的疫苗接种。

引言

我们接下来研究，如果我们延伸VD4^ext区的长度可以增强对免疫重复构建体的T细胞应答。我们设计了两种构建体CTH69(SEQ ID NO 47)和CTH72(SEQ ID NO 48)。CTH69与CTH88相似，但是来自SvD、SvE和SvF的VD4^ext区通过12aa氨基端延伸(图16B)。CTH72也包含来自SvG、SvIa和SvJ的VD1和VD4^ext区。

结果

将小鼠免疫3次，免疫之间有14天。疫苗在CAF01中乳化并同时通过皮下(sc，5μg)和鼻内(i.n，5μg)路线给予。研究了对用于免疫的抗原和对代表来自不同血清变型的VD1和VD4的肽池的T细胞反应(图16)。与采用CTH88(<20.000pg/ml)获的T细胞反应相比，延伸VD4^ext区诱导显著更高的T细胞反应(>40.000pg/ml)(图16B)。重要的是，这两种延伸的构建体仍能够体外中和血清变型D感染(图16C)。与CTH88相比，比较疫苗的保护效果可知，感染后第7天，CTH69和CTH72诱导显著水平的保护，这可以可能通过这些疫苗诱导的更强T细胞反应来解释(图16D)。

结论

与在感染后第7天引起增强的保护的CTH88比较，延伸VD4^ext区增强T细胞反应。

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Claims

1.一种多肽，该多肽包括3个或更多个免疫重复单元，其中每个免疫重复单元是由来自任何衣原体属物种(Chlamydia sp.)血清型的主要外膜蛋白的表面暴露片段组成的氨基酸序列，并且其中每个表面暴露片段包括选自任何衣原体属物种血清型的主要外膜蛋白的可变域4(VD4)区。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中该3个或更多个免疫重复单元是同源的。

3.根据权利要求1所述的多肽，其中包括来自任何衣原体属物种血清型的主要外膜蛋白的VD4区的氨基酸序列彼此相邻地安置。

4.根据权利要求1所述的多肽，其中该3个或更多个免疫重复单元是异源的。

5.根据权利要求1所述的多肽，其中来自任何衣原体属物种血清型的主要外膜蛋白来自肺炎衣原体或沙眼衣原体的血清型D、E、F、G、Ia或J。

6.根据权利要求1所述的多肽，该多肽另外包括选自来自任何衣原体属物种血清型的主要外膜蛋白的可变域1、可变域2、可变域3及可变域4的一个或更多个可变域。

7.根据权利要求6所述的多肽，其中这些氨基酸序列是线性化的。

8.根据权利要求1所述的多肽，其中包括来自任何衣原体属物种血清型的主要外膜蛋白的VD4区的氨基酸序列被一个连接子隔开。

9.根据权利要求1所述的多肽，该多肽包括式I中定义的一个氨基酸序列：

xx₁-VD4-xx₂ 式I

其中

VD4独立地选自SEQ ID NO:15-20或与SEQ ID NO:15-20具有至少80％序列一致性的氨基酸序列

并且

xx₁由以下各项组成

i)氨基酸序列

EWQASLALSYRLNMFTPYIGVKWSRASFDADTIRIAQPK，即SEQ ID NO:21或

并且

xx₂由以下各项组成

iii)氨基酸序列DTMQIVSLQLNKMKSRKSCGIAVGTTIVDA，即SEQ ID NO:22或

iv)iii)中的氨基酸序列的一个子序列，所述子序列包括以iii)中的氨基酸序列中的N端D开始的1-29个氨基酸残基。

10.根据权利要求1所述的多肽，该多肽包括选自SEQ ID NO:23-28和49-59的氨基酸序列。

11.根据权利要求1所述的多肽，该多肽包括来自任何衣原体属物种血清型的主要外膜蛋白的另外的片段，其中所述另外的片段包括可变域1(VD1)。

12.根据权利要求11所述的多肽，该多肽包括式II中定义的一个氨基酸序列：

yy₁-VD1-yy₂ 式II

其中

VD1独立地选自SEQ ID NO:1-6或与SEQ ID NO:1-6具有至少80％序列一致性的氨基酸序列

并且

yy₁由以下各项组成

v)氨基酸序列DAISMRVGYYGDFVFDRVLKTDVNKEFQMG，即SEQ ID NO:7或

并且

yy₂由以下各项组成

vii)氨基酸序列NPAYGRHMQDAEMFTNAA，即SEQ ID NO:8或

13.根据权利要求11所述的多肽，该多肽包括选自SEQ ID NO:9-14和45-48的氨基酸序列。

14.根据权利要求1所述的多肽，该多肽包括来自任何衣原体属物种血清型的主要外膜蛋白的另外的片段，其中所述另外的片段包括可变域2(VD2)。

15.根据权利要求14所述的多肽，该多肽包括式III中定义的一个氨基酸序列：

zz₁-VD2-zz₂ 式III

其中

VD2独立地选自SEQ ID NO:29-34或与SEQ ID NO:29-34具有至少80％序列一致性的氨基酸序列，

并且

zz₁由以下各项组成

ix)氨基酸序列TLGATSGYLKGNSASFNLVGLFG，即SEQ ID NO:35或

并且

xx₂由以下各项组成

xi)氨基酸序列VVELYTDTTFAWSVGARAALWE，即SEQ ID NO:36或

16.根据权利要求1所述的多肽，该多肽包括来自任何衣原体属物种血清型的主要外膜蛋白的另外的片段，其中所述另外的片段包括可变域3(VD3)。

17.根据权利要求16所述的多肽，该多肽包括式IV中定义的一个氨基酸序列：

qq₁-VD3-qq₂ 式IV

其中

VD3独立地选自SEQ ID NO:37-42或与SEQ ID NO:37-42具有至少80％序列一致性的一个氨基酸序列，

并且

qq₁由以下各项组成

xiii)氨基酸序列

ATLGASFQYAQSKPKVEELNVLCNAAEFTINKPKGYVG，即SEQ ID NO:43或

并且

qq₂由以下各项组成

xv)氨基酸序列

TGTKDASIDYHEWQASLALSYRLNMFTPYIGVKWS，即SEQ ID NO:44或

18.根据权利要求1所述的多肽，该多肽另外包括一个在重组产生时促进该多肽输出的部分、一个促进融合蛋白纯化的部分或一个增强免疫原性的部分。

19.根据权利要求18所述的多肽，其中所述增强免疫原性的部分是一种另外的T细胞靶标，其选自一种沙眼衣原体抗原，该沙眼衣原体抗原选自CT043、CT004、CT414、CT681以及免疫原性部分或其片段。

20.根据权利要求19所述的多肽，其中所述增强免疫原性的部分选自SEQ ID NO:60-68。