RS60135B1 - Vakcine protiv hlamidije sp. - Google Patents

Description

Opis

Polje pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na polipeptide repetitivnih jedinica imunogenih fragmenata površinski izloženih regiona spoljnomembranskih proteina Chlamydia sp. za upotrebu kao farmaceutika i farmaceutskih kompozicija i vakcina koje sadrže ove fuzione proteine ili nukleinske kiseline koje ih kodiraju.

Opšta pozadina

[0002] Hlamidija predstavlja intracelularne bakterijske patogene odgovorne za mnoštvo infekcija. Chlamydia pneumoniae je odgovorna akutnu respiratornu infekciju kod ljudi i veruje se da ima ulogu kod koronarne srčane bolesti. Chlamydia trachomatis je kauzativan agens seksualno prenosivih bolesti kod ljudi i očnih infekcija (Trahom). Takođe kod životinja, poznato je nekoliko infekcija sa hlamidijom sp., na primer Chlamydia Suis koja inficira svinje, i Chlamydiaphila abortus koja izaziva podbačaj kod sitnih preživara (ovce i koze).

[0003] Procenjuje se da je širom sveta 92 miliona pojedinaca seksualno zaraženo sa Chlamydia trachomatis (Ct)<1>. Urogenitalne infekcije sa Ct predstavljaju brigu za javno zdravlje zbog svoje visoke rasprostranjenosti i činjenice da su faktor rizika za ektopičnu trudnoću i neplodnost<2>. Pored toga, pokazalo se da Ct infekcije olakšavaju prenošenje HIV<3>i deluju kao zajednički faktor kod cervikalnog karcinoma indukovanog sa HPV. Trajanje nelečene genitalne Ct infekcije može biti produženo, a potpuni klirens se često ne postigne u prvih 12 meseci<5>. Iz ljudskih ispitivanja je poznato da se razvija određeni stepen zaštitnog imuniteta protiv ponovne genitalne infekcije, iako se u najboljem slučaju čini kao delimičan<6>. Infekcija se efikasno kontroliše antibiotskom terapijom; međutim visoka prevalenca asimptomatskih slučajeva ukazuje na to da se održiva kontrola bolesti može predvideti samo ukoliko se razvije efikasna vakcina protiv hlamidije.

[0004] Vakcina protiv Ct mora da izazove zaštitni T-ćelijski i B-ćelijski imunitet na mukozi genitalnog trakta<7>. U brojnim studijama su opisani imuni mehanizmi klirensa infekcije i otpornosti na ponovnu infekciju. Mnoštvo životinjskih modela i vrsta hlamidije je korišćeno u pokušajima da se identifikuju zaštitni i štetni imuni odgovori. Opšti konsenzus se pojavio da, kod miševa, CD4+ Th1 ćelijski posredovani imuni odgovori imaju glavnu ulogu u rezoluciji Ct infekcije<8,9,10>, pri čemu, uloga humoralnog imuniteta u zaštiti je i dalje slabo definisana. Kod zamorčića imunitet na hlamidijsku infekciju je posredovan barem delimično sektretornim IgA na mukozalnoj površini<11,12>i takođe kod modela miša postoji sve veći broj dokaza koji podržavaju ulogu antitela u zaštitnom imunitetu<9>. Podaci iz životinjskih modela koji su se pojavljivali poslednjih godina jasno pokazuju da ukoliko su antitela formirana nakon uspostavljanja infekcije imaju minimalnu ulogu, dok njihovo prisustvo u vreme infekcije (na primer, u sekundarnom odgovoru) proizvodi značajne nivoe zaštite, efekat koji je ipak jasno pojačan u prisustvu hlamidijski specifičnih CD4<+>ćelija<9,13,14>. Snažni ćelijski posredovani imuni (CMI) odgovori bez antitela mogu sa druge strane kontrolisati bakterijsku replikaciju ali mogu u najgorem slučaju pogoršati patologiju povezanu sa hlamidijskom infekcijom<15,16>. Važnost ove interakcije između ćelijski posredovanog imuniteta i antitela takođe postaje sve jasnija kako bi se podržala preferencijalna uloga neutrališućih antitela u početnoj fazi infekcije, pri čemu su CD4<+>ćelije glavni efektori tokom ostatka infekcije<17,18,19>. Ukratko, čini se da je balansiranje imunih efektorskih mehanizama između antitela i T ćelija ključno za ishod bolesti.

[0005] Mi i drugi smo identifikovali niz hlamidijalnih antigena prepoznatih tokom prirodne infekcije bilo kod ljudskih ili životinjskih modela<20,21,22,23,24,25,26,27>. Naročito je objavljivanje sekvence genoma 1998. godine i savremene tehnike visoke propusnosti dovelo do ispitivanja gotovo celog genoma 875 otvorenih očitavajućih okvira<28>. Važnije, identifikovanje proteina kao antigena tokom infekcije ne znači nužno da su protektivni kao vakcine<29>i uprkos karakterizaciji tako velikog broja antigena pokazalo se da vrlo mali broj njih posreduje u zaštiti kao vakcine kod životinjskih modela<30,31,32>. Osim toga, za većinu nedavno prijavljenih vakcina uočena delimična zaštita je posredovana T ćelijama bez neutrališućih antitela. Stoga postoji manjak vakcinskih kandidata koji generišu neutralizujuća antitela koja se mogu nositi sa infekcijom u početnoj fazi i stvaraju uravnotežen imuni odgovor.

[0006] Do sada su postojali uverljivi podaci samo o neutralizujućim antitelima sa tri površinski izložena antigena; PorB, koji je lokalizovan u hlamidijalnoj spoljnoj membrani i deluje kao porin<33>. Pokazalo se da antitela protiv ovoga neutralizuju hlamidijalnu infektivnost<34>, patentna referenca: US 7,105,171. Još jedan noviji antigen je PmpD. Pokazalo se da ovaj protein generiše neutralizujuća antitela in vitro, međutim in vivo relevantnost ovih antitela još uvek nije dokazana<35>.

[0007] MOMP je klasični ciljni antigen za neutralizujuća antitela i jedan od prvih opisanih antigenskih molekula. To je površinski izložen transmembranski protein koji ima strukturalna (porin) svojstva<36 37 38>. MOMP je 40 kDa protein koji čini ugrubo 60% proteina u Ct membrani i cilj je za neutralizujuća antitela sa dokazanom efikasnošću i in vitro i in vivo. MOMP se sastoji od četiri varijabilna površinski izložena domena (VD-1 do VD-4) razdvojena sa pet konstantnih segmenata<36 39>i to je molekularna osnova serovar (∼15) grupisanja hlamidije (sliika 1). In vitro i in vivo epitopi neutralizujućih antitela su mapirani za ove VD<40 41 42 43 44>. Distribucioni profil Ct urogenitalnih serovara je opisan za regione širom sveta, pružajući epidemiološke podatke za serovarnu pokrivenost potrebnu za vakcinu zasnovanu na MOMP. Najčešće detektovan serovar u svetu je E (22-49% slučajeva) a prate ga serovari F i D (17-22% i 9-19%, respektivno)<45 46 47 48 49 50>, što znači da bi vakcina koja cilja serovare E, D i F imala značajan uticaj i pokrila više od 70% ljudske populacije.

[0008] MOMP je visoko imunogen kod ljudi i životinja i iz tog razloga je detaljno proučavan kao kandidat za vakcinu, i kao nativno prečišćen protein, rekombinantno i kao DNK vakcina. Ovi pokušaji vakcinacije su dali promenljive rezultate<17, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57>. Razlog relativne nekonzistencije MOMP kao vakcine nije u potpunosti shvaćen, ali činjenica da sintetički MOMP imunogeni ne oponašaju nativnu strukturu proteina jeste glavna briga<54>. Sa tim u vezi, struktura ovog membranski vezanog cisteinom bogatog molekula i ponovno preklapanje različitih proizvoda kako bi se postigla nativna proteinska struktura je bilo izuzetno izazovno i nije pogodno za proizvodnju vakcine velikih razmera<58>. Zbog toga, iako očigledno sa potencijalom vakcine, MOMP u punoj veličini do sada nije bio izvodljiv kandidat za vakcinu i stoga je učinjeno nekoliko pokušaja da se konstruiše vakcina na osnovu odabranih epitopa (poput visoko konzerviranog TTLNPTIAG u VD4<36, 59>) ili na osnovu odabranih regiona bogatih u neutralizovanju ciljnih epitopa (kao VD) iz MOMP (WO9406827, US6384206)<60, 61 62, 63 64 51, 65 66>.

[0009] Poseban fokus je bio na VD1, VD2 i VD4 jer se pokazalo da neutralizovanje monoklonalnih antitela korišćenih za serotipizaciju mapira za ove regione. Ovi VD regioni su ciljani antitelima tokom prirodne infekcije i u skladu sa tim, ovi regioni su prirodno bili u fokusu pokušaja razvijanja imuno-dijagnostika. Na primer, Mygind et al. je konstruisao različite poliantigene koji sadrže VD regione od različitih serovarijanata u potrazi za dijagnostičkim alatom zasnovanom na ELISA<67>. Ova analiza je otkrila da je povećanjem broja serovarijanata i uključivanjem TTLNPTIAG određenog za vrste u jedan rekombinantni poliantigen, bilo moguće povećati specifičnost i senzitivnost testa u poređenju sa testom zasnovanim na jednom serovarijantnom antigenu.

[0010] Uglavnom je VD4 privlačio interesovanje kao imunogen jer se pokazalo da ovaj region sadrži visoko konzerviran epitop TTLNPTIAG specifičan za vrste ugrađen u varijabilni region. Važnije, ovaj konzervirani epitop u VD4 regionu može izazvati široko unakrsno-reaktivni imuni odgovor, koji je u stanju da neutralizuje višestruke serovare, među kojima preovlađuju D, E i F (slika 2). Peptidi koji predstavljaju VD4 region ili konzervirani epitop dobijen iz ovog regiona su korišćeni za imunizaciju ili sami, kao himerni peptidi fuzionisani za druge regione kao VD1 ili pomešani sa T ćelijskim epitopima kako bi se potencirao odgovor antitela<60, 68 51, 65 64 69>. Svi ovi konstrukti su generisali antitela sa određenim funkcionalnim sposobnostima neutralizovanja infekcije in vitro ali generalno ove strategije trpe od niske imunogenosti i titri se nisu preveli u in vivo zaštitnu efikasnost protiv genitalnog hlamidijalnog izazova.

[0011] Razlozi nedostatka zaštite prilikom korišćenja ovih konstrukata zasnovanih na peptidima mogu biti brojni; uključujući način primene, tip izazvanog imunog odgovora, dozni izazov, ali najverovatnije odražavaju da molekul vakcine nije dovoljno imunogen da bi se koristio kao vakcina. Strategija zasnovana na VD4 takođe trpi od ograničenja što su, sa izuzetkom TTLNPTIAG epitopa, ovi fragmenti, kao što je pomenuto u prethodnom tekstu, visoko specifični za jednu ili dve serovarijante i vakcina bi shodno tome morala biti sačinjena od nekoliko komponenti kako bi se pokrili najčešće serovarijante koje izazivaju ljudske bolesti.

[0012] U WO2012172042 je prethodno otkriveno da bi B ćelijski epitopi unutar VD regiona, spojeni sa definisanim T-ćelijskim epitopima (Th1 i Th2) iz nevarijabilnih domena MOMP, mogli funkcionisati kao poli-epitopska vakcina protiv Chlamydia psitattci serovar D kod pilića; u primerima opisuju kombinaciju do tri B-ćelijska epitopa dobijena iz VD regiona iz različitih varijabilnih domena iste serovarijante zajedno sa nekoliko T-ćelijskih epitopa. Upotreba ponavljača varijabilnog domena površinski izloženog regiona MOMP i korišćenje različitih serovarijanti nije predloženo i iz tog razloga nisu dobijeni visoki titri i širok odgovor protiv različitih serovarijanti.

[0013] Wen Xu et al. (2010), Vakcina 29(15), stranice 2672-2678 i WO 2012/172042 oba otkrivaju MOMP multi-epitopske konstrukte, koji ne uključuju bilo koje ponavljanj0065 površinski izloženih fragmenata.

[0014] Mygin P et al. (2000), J Med Microbiol 49(5), stranice 457-465, otkrivaju MOMP multi-epitopske konstrukte koji sadrže ponavljanja obrasca površinski izloženih MOMP fragmenata, primenjenih in vitro.

[0015] Cilj predmetnog pronalaska je da se pripreme rekombinantni fuzioni molekuli koji su sposobni za generisanje visoko titrovanog neutralizujućeg antitelnog odgovora koji je protektivan od različitih Ct serovara in vivo. Naš pronalazak dalje opisuje kombinaciju ovih fragmenata koji promovišu antitela sa Ct antigenima koji su ciljni za T-ćelije sa ciljem da se obezbedi vakcina koja aktivira oba kraka imunog sistema.

Rezime pronalaska

[0016] Predmetni pronalazak otkriva efikasnu vakcinu protiv patogena, na primer Chlamydia trachomatis (Ct), koja inkorporira ponavljače površinski izloženih fragmenata Ct antigena (homologni imuno-ponavljači) radi maksimalnih odgovora antitela. U jednoj izvedbi pronalaska, ovi površinski izloženi fragmenti su produženi kako bi pokrili flankujući region površinski izloženih fragmenata koji mogu sadržati T ćelijske epitope. Jedan primer je definisani veliki fragment koji predstavlja produženu verziju VD1 ili VD4 regiona iz Ct MOMP antigena i u imuno-ponavljačkom formatu pruža visoke nivoe površinskog vezivanja i neutralizujućih antitela protiv Ct. U drugoj važnoj izvedbi imuno-ponavljačka tehnologija je korišćena kako bi se dobili visoki titri i širok odgovor protiv različitih serovarijanti fuzijom fragmenata koji sadrže varijable B i T ćelijskih epitopa iz različitih serovarijanti (heterologni imuno-ponavljači). U sledećoj izvedbi našeg pronalaska ova površinski izloženi ponavljači su rekombinantno fuzionisani sa fragmentima drugih površinski izloženih antigena kao što su PMP ili OMP. Konačno, naš pronalazak otkriva kombinacije ovih imuno-ponavljajućih konstrukata sa snažnim T ćelijskim antigenima, kao što su MOMP(CT681), CT043 ili CT004 iz Ct koji zajedno formiraju veoma efikasnu vakcinu protiv različitih infektivnih stadijuma Ct infekcije.

Detaljno otkriće pronalaska

[0017] Pronalazak otkriva polipeptid, za upotrebu kao lek, koji sadrži

a) aminokiselinsku sekvencu koja sadrži jedan ili više površinski izloženih fragmenata istog spoljnomembranskog proteina eksprimiranog u serotipu hlamidije sp.; i

b) dve ili više dodatnih aminokiselinskih sekvenci koja je ili ista sekvenca kao što je definisano pod a) ili su odgovarajući površinski izloženi fragmenti iz varijante pomenutog spoljnomembranskog proteina eksprimiranog u serotipu hlamidije sp., koji je različit od serotipa pod a) pri čemu spoljnomembranski protein je MOMP iz bilo kog serotipa i pri čemu polipeptid sadrži jedan ili više varijabilnih domena 1, 2, 3, 4 iz MOMP.

[0018] Pronalazak stoga otkriva polipeptide koji sadrže imuno-ponavljače, što je 3 ili više kao 4 ili više ponavljača aminokiselinske sekvence koja sadrži imunogeni deo površinski izloženog regiona spoljnomembranskog proteina hlamidije sp. Otuda se pronalazak može opisati kao polipeptid za upotrebu kao farmaceutik koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži jedan ili više površinski izloženih fragmenata istog spoljnomembranskog proteina eksprimiranog u serotipu hlamidije sp. i dve ili više kao tri ili više dodatnih aminokiselinskih sekvenci koje su ili ista sekvenca kao što je definisano pod a) ili su odgovarajući površinski izloženi fragmenti iz varijante pomenutog spoljnomembranskog proteina eksprimiranog u serotipu hlamidije sp., koji je različit od serotipa pod a) za upotrebu kao farmaceutik.

[0019] U poželjnoj izvedbi polipeptid sadrži 3 ili više različitih aminokiselinskih sekvenci, gde pomenute aminokiselinske sekvence svaka sadrži jedan ili više površinski izloženih fragmenata iz različitih varijanti ili izotipova istog spoljnomembranskog proteina koji varira u različitim hlamidija sp. serotipovima, pomenute aminokiselinske sekvence dobijene iz različitih hlamidija sp. serotipova (heterologni imuno-ponavljači u našoj terminologiji), ali pronalazak takođe otkriva polipeptid koji sadrži 3 ili više ponavljanja aminokiselinske sekvence, gde pomenuta aminokiselinska sekvenca sadrži jedan ili više površinski izloženih fragmenata istog spoljnomembranskog proteina koji varira u različitim hlamidija sp. serotipovima, pomenuta aminokiselinska sekvenca dobijena iz istog hlamidija sp serotipa (homologni imuno-ponavljači u našoj terminologiji).

[0020] Protein spoljne membrane je glavni protein spoljne membrane (MOMP) iz bilo kog hlamidija sp. serotipa a površinski izložen fragment je odabran iz varijabilnog domena 1 (VD1), varijabilnog domena 2 (VD2), varijabilnog domena 3 (VD3) ili varijabilnog domena 4 (VD4) MOMP. Površinski izložen fragment može opciono biti linearizovan supstitucijom cisteina u aminokiselinskoj sekvenci radi sprečavanja disulfidnih veza.

[0021] Poželjna izvedba pronalaska su polipeptidi, za upotrebu kao farmaceutici, koji sadrže imuno-ponavljače sa 3 ili više ponavljanja varijabilnog domena 4 (VD4) MOMP iz bilo kog od serovara D, E, F, G, la i J Chlamydia trachomatis, gde se svaki varijabilni domen sastoji od aminokiselinske sekvence, koja odgovara poziciji aminokiselinskih ostataka brojeva 309-338 u aminokiselinskoj sekvenci MOMP Chlamydia trachomatis serovara D (SvD) (SEK ID BR: 68) i gde su varijabilni domeni u imunoponavljaču nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od VD4 serovara D, VD4 serovara E, VD4 serovara F, VD4 serovara G, VD4 serovara la i VD4 serovara J Chlamydia trachomatis ili ima 80% sekventne identičnosti sa tim.

[0022] Aminokiselinska sekvenca VD4 iz serovara D, E, F, G, Ia i J odgovara sekvencionim identifikacionim brojevima 15-20 respektivno. Svaki varijabilni domen može dodatno biti flankovan/produžen na N-terminalnoj strani sa ili

i) aminokiselinskom sekvencom EWQASLALSYRLNMFTPYIGVKWSRASFDADTIRIAQPK (SEK ID BR 21) ili

ii) podsekvencom aminokiselinske sekvence pod i) pomenuta podsekvenca sadrži 1 ili više aminokiselinskih ostataka, na C-terminalnoj strani varijabilni domen može dodatno biti flankovan/produžen sa

iii) aminokiselinskom sekvencom DTMQIVSLQLNKMKSRKSCGIAVGTTIVDA (SEK ID BR 22)

iv) podsekvencom aminokiselinske sekvence pod iv) pomenuta podsekvenca sadrži 1 ili više aminokiselinskih ostataka,

ili aminokiselinskom sekvencom koja ima barem 80% sekventne identičnosti sa njima.

[0023] Stoga poželjna izvedba može biti opisana kao polipeptidi koji sadrže 2-8 različitih aminokiselinskih sekvenci dobijenih iz MOMP iz Chlamydia trachomatis koja sadrži aminokiselinsku sekvencu definisanu u formuli I:

xx1-VD4-xx2(formula I)

pri čemu

VD4 je nezavisno odabran od sekvencionih identifikacionih brojeva 15-20 ili aminokiselinske sekvence koja ima barem 80% sekventne identičnosti sa njima,

i

xx1se sastoji od

i) aminokiselinske sekvence

EWQASLALSYRLNMFTPYIGVKWSRASFDADTIRIAQPK (SEK ID BR 21) ili

ii) podsekvence aminokiselinske sekvence pod i) pomenuta podsekvenca sadrži 1-38 aminokiselinskih ostataka, počevši sa C-terminal K u aminokiselinskoj sekvenci pod i) i

xx2se sastoji od

iii) aminokiselinske sekvence DTMQIVSLQLNKMKSRKSCGIAVGTTIVDA (SEK ID BR 22)

v) podsekvence aminokiselinske sekvence pod iii) pomenuta podsekvenca sadrži 1-29 aminokiselinskih ostataka, počevši sa N-terminal D u aminokiselinskoj sekvenci pod iii).

[0024] Primeri fuzionih proteina koji sadrže imuno-ponavljače VD4 MOMP su naznačeni sekvencionim identifikacionim brojevima 49-59.

[0025] U sledećoj izvedbi pronalaska polipeptid za upotrebu kao farmaceutik dodatno sadrži imuno-ponavljače 3 ili više varijabilnih domena 1 (VD1) MOMP od bilo kog od serovara D, E, F, G, la i J Chlamydia trachomatis, svaki varijabilni domen se sastoji od aminokiselinske sekvence, koja odgovara poziciji aminokiselinskih ostataka brojeva 91-105 u aminokiselinskoj sekvenci MOMP Chlamydia trachomatis serovara D (SvD) (SEK ID BR: 68) i nezavisno je odabran iz grupe koja se sastoji od VD1 serovara D, VD1 serovara E, VD1 serovara F, VD1 serovara G, VD1 serovara la i VD1 serovara J Chlamydia trachomatis ili ima 80% sekventne identičnosti sa njima.

[0026] Aminokiselinska sekvenca VD1 iz serovara D, E, F,G, la i J odgovara sekvencionim identifikacionim brojevima 1-6 respektivno. Svaki varijabilni domen može dodatno biti flankovan/produžen na N-terminalnoj strani sa ili

vi) aminokiselinskom sekvencom SMRVGYYGDFVFDRVLKTDVNKEFQMG (SEK ID BR 7)

vii) podsekvencom aminokiselinske sekvence pod v) pomenuta podsekvenca sadrži 1 ili više aminokiselinskih ostataka.

[0027] Na C-terminalnoj strani varijabilni domen može dodatno biti flankovan/produžen sa

viii) aminokiselinskom sekvencom NPAYGRHMQDAEMFTNAACMALNIWD (SEK ID BR 8)

ix) podsekvencom aminokiselinske sekvence pod x) pomenuta podsekvenca sadrži 1 ili više aminokiselinskih ostataka;

[0028] Ili aminokiselinska sekvenca koja ima barem 80% sekventne identičnosti sa njima.

[0029] Stoga sledeća poželjna izvedba može biti opisana kao polipeptidi, za upotrebu kao farmaceutik, koji sadrže 2-8 različitih aminokiselinskih sekvenci dobijenih iz MOMP iz Chlamydia trachomatis koja sadrži aminokiselinsku sekvencu definisanu u formuli I i dodatno sadrži aminokiselinsku sekvencu definisanu u formuli II:

yy1-VD1-yy2(formula II)

pri čemu

VD1 je nezavisno odabran od sekvencionih identifikacionih brojeva 1-6 ili aminokiselinske sekvence koja ima barem 80% sekventne identičnosti sa njima,

i

yy1se sastoji od

v) aminokiselinske sekvence DAISMRVGYYGDFVFDRVLKTDVNKEFQMG (SEK ID BR 7) ili

vi) podsekvence aminokiselinske sekvence pod v) pomenuta podsekvenca sadrži 1-30 aminokiselinskih ostataka, počevši sa C-terminal G u aminokiselinskoj sekvenci pod v) i

yy2se sastoji od

vii) aminokiselinske sekvence NPAYGRHMQDAEMFTNAA (SEK ID BR 8) ili

viii) podsekvence aminokiselinske sekvence pod vii) pomenuta podsekvenca sadrži 1-18 aminokiselinskih ostataka, počevši sa N-terminal N u aminokiselinskoj sekvenci pod vii).

[0030] Primeri polipeptida koji sadrže imuno-ponavljače VD1 su naznačeni sekvencionim identifikacionim brojevima 9-14 i 45-48.

[0031] Sledeće izvedbe pronalaska dodatno obuhvataju fragment koji sadrži varijabilne domene 2 (VD2) i/ili varijabilne domene 3 (VD3) MOMP respektivno koji sadrže aminokiselinsku sekvencu definisanu u formuli III i/ili formuli IV:

zz1-VD2-zz2(formula III)

qq1-VD3-qq2(formula IV)

pri čemu

VD2 je nezavisno odabran od sekvencionih identifikacionih brojeva 29-34 ili aminokiselinske sekvence koja ima barem 80% sekventne identičnosti sa njima,

i

zz1se sastoji od

ix) aminokiselinske sekvence TLGATSGYLKGNSASFNLVGLFG (SEK ID BR 35) ili

x) podsekvence aminokiselinske sekvence pod ix) pomenuta podsekvenca sadrži 1-23 aminokiselinska ostatka, počevši sa C-terminal G u aminokiselinskoj sekvenci pod ix) i

zz2se sastoji od

xi) aminokiselinske sekvence WELYTDTTFAWSVGARAALWE (SEK ID BR 36) ili

xii) podsekvence aminokiselinske sekvence pod xi) pomenuta podsekvenca sadrži 1-22 aminokiselinska ostatka, počevši sa N-terminal V u aminokiselinskoj sekvenci pod xi).

I pri čemu

VD3 je nezavisno odabrano od sekvencionih identifikacionih brojeva 37-42 ili aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 80% sekventne identičnosti sa njima,

i

qq1se sastoji od

xiii) aminokiselinske sekvence ATLGASFQYAQSKPKVEELNVLCNAAEFTINKPKGYVG (SEK ID BR 43) ili

xiv) podsekvence aminokiselinske sekvence pod xiii) pomenuta podsekvenca sadrži 1-22 aminokiselinska ostatka, počevši sa C-terminal G u aminokiselinskoj sekvenci pod xiii)

i

qq2se sastoji od

xv) aminokiselinske sekvence TGTKDASIDYHEWQASLALSYRLNMFTPYIGVKWS (SEK ID BR 44) ili

xvi) podsekvence aminokiselinske sekvence pod xv) pomenuta podsekvenca sadrži 1-35 aminokiselinskih ostataka, počevši sa N-terminal T u aminokiselinskoj sekvenci pod xv).

[0032] Imuno-ponavljači mogu biti heterologni, to je gde je varijabilni domen dobijen iz različitih serotipova ili mogu biti homologni, to je gde je varijabilni domen dobijen iz jednog serotipa. Poželjan broj ponavljanja je 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 ponavljanja.

[0033] Dalje, imuno-ponavljači u polipeptidima mogu biti linearizovani, tj. da su ostaci cisteina zamenjeni sa serinom.

[0034] Polipeptidi koji sadrže imuno-ponavljače mogu dodatno sadržati funkcionalnu grupu koja olakšava izvoz polipeptida whens proizvedenih rekombinantno (na primer, signalni peptidi), funkcionalna grupa koja olakšava prečišćavanje polipeptida (na primer, his-tags) i/ili funkcionalna grupa koja poboljšava imunogenost (na primer, T ćelijski antigen). T ćelijski cilj može biti odabran od Ct antigena kao što su CT043, CT004, CT414, CT681 ili njihov deo. Primeri takvih fuzionih proteina su označeni sekvencionim identifikacionim brojevima 60-67.

[0035] Polipeptid za upotrebu kao farmaceutik u skladu sa pronalaskom može imati sledeća funkcionalna svojstva:

a) neutralizovanje C. trachomatis serovara D in vitro sa 50% neutralizacionim titrom od 10<-3>ili manje, kada se testira u eksperimentalnoj postavci koja obuhvata administriranje heterolognih imuno-ponavljača;

b) neutralizovanje C. trachomatis serovara D in vivo kod najmanje 50% miševa 7. dana nakon infekcije kada se testira u mišjem modelu koji obuhvata administriranje heterolognih imuno-ponavljača

c) proširivanje imunog odgovora na više serovara C. trachomatis in vitro kada se administriraju heterologni imuno-ponavljači.

[0036] Predmetna aplikacija takođe otkriva nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide opisane u prethodnom tekstu.

[0037] Otkriveni polipeptidi ili nukleinske kiseline su korišćene za pripremu farmaceutske kompozicije kao što je vakcina. Vakcina može dodatno sadržati farmakološki prihvatljiv nosač (virus poput čestica), ekscipijent, ađuvans (na primer, DDA/TDB ili alum) ili imuni modulator. Farmaceutska kompozicija može biti korišćena za profilaktičku ili terapeutsku upotrebu protiv Chlamydia sp. infekcija, uključujući infekcije sa Chlamydia trachomatis ili C.pneumoniae.

[0038] Metod za sprečavanje, tretiranje i/ili smanjivanje incidencije Chlamydia sp. infekcija, uključujući infekcije sa Chlamydia trachomatis or C.pneumoniae, primenom ove farmaceutske kompozicije je takođe otkriven.

[0039] Pronalazak će u nastavku biti detaljno opisan i ilustrovan primerima.

[0040] Imuno-ponavljač iz površinski izloženog regiona može biti od istog serotipa (homologni imuno-ponavljači) ili predstavljati fragmente koji sadrže varijabilne epitope i dobijeni su iz različitih serotipa (heterologni imuno-ponavljač). U poželjnoj izvedbi imuno-ponavljači sadrže prodruženi fragment koji sadrži i varijabilni i konzervirani region koji je poznat kao bogat T ćelijskim epitopima.

[0041] Preferirani površinski izloženi region spoljnomembranskog proteina je odabran od VD1, VD2, VD3 i VD4

iz MOMP.

[0042] Aminokiselinske sekvence korišćene za izgradnju imuno-ponavljača opisanih u primerima su odabrane iz tabela 1, 2 i 3.

[0043] Varijabilni domen VD4 MOMP može biti opisan kao aminokiselinske sekvence kao što je definisano:

La1-Aa2-Aa1-Aa3-La2 pri čemu

Aa1 se sastoji od aminokiselinske sekvence TTLNPTIAG (koja je konzervirana za sve serovare);

Aa2 je odabrano iz grupe koja se sastoji od: SATAIFDT (iz serovara D i E), LVTPVVDI (iz serovara F), LAKPVVDI (iz serovara G) i LAEAILDV (iz serovara la i J).

[0044] Kada je Aa2 sekvenca iz serovara D ili E, tada je Aa3 odabrana iz sekvenci postavljenim u AGDVKTGAEGQLG (iz serovara D) i AGDVKASAEGQLG (serovar E).

[0045] Kada je Aa2 sekvenca iz serovara F, tada Aa3 je sekvenca CGSVAGANTEGQIS (iz serovara F).

[0046] Kada je Aa2 sekvenca iz serovara G, tada Aa3 je sekvenca CGSWAANSEGQIS (iz serovara G).

[0047] Kada je Aa2 sekvenca iz serovara Ia ili J), tada Aa3 je izabrana KGTVVSSAENELA (iz serovara la)

i KGTVVASGSENDLA (iz serovara J).

[0048] Varijabilni domen VD4 MOMP je prikazan na slici 2. Imuno-ponavljači preferirano dodatno sadrže ekstenzije sa obe strane koje su takođe prikazane na slici 2.

[0049] N-terminalna strana VD4 domena može biti flankovana ili produžena jednom ili više aminokiselina iz konzerviranijeg i T ćelijskim epitopom bogatijeg La1, pri čemu La1 je deo VD4 MOMP koji je ugrađen u membranu i ima aminokiselinsku sekvencu EWQASLALSYRLNMFTPYIGVKWSRASFDADTIRIAQPK ili aminokiselinsku sekvencu koja ima 80% sekventne identičnosti sa njom.

[0050] C-terminalna strana VD4 domena može biti na odgovarajući način flankovana ili produžena sa jednom ili više aminokiselina iz konzerviranijeg i T ćelijskim epitopom bogatijeg La2, pri čemu La2 je deo VD4 MOMP koji je ugrađen u membranu na C-terminalnoj strani i ima aminokiselinsku sekvencu DTMQIVSLQLNKMKSRKSCGIAVGTTIVDA ili aminokiselinsku sekvencu koja ima 80% sekventne identičnosti sa njom.

[0051] Slična ilustracija (videti sliku 1) može opisati imuno-ponavljače koji sadrže varijabilni domen 1 (VD1) iz MOMP sa varijabilnim domenima (Aa2-Aa1-Aa3) različitih serovara su date sa sekvencionim identifikacionim brojevima 1-6 u tabeli 1. Odgovarajuće N-terminalne i C-terminalne ekstenzije (La1 i La2) imaju respektivne aminokiselinske sekvence SMRVGYYGDFVFDRVLKTDVNKEFQMG (La1) i NPAYGRHMQDAEMFTNAACMALNIWD (La2) koje su date u tabeli 2 sa sekvencionim identifikacionim brojevima 7-8.

[0052] Imuno-ponavljači koji sadrže VD2 i VD3 mogu na sličan način biti zaključeni sa slike 1 i tabele 1.

[0053] Stoga primeri iz prethodnog teksta La1-Aa2-Aa1-Aa3-La2 definišu jednu od imuno-ponavljajućih jedinica. Ukoliko se dodatno, na primer, VD1 doda VD4 jedinici, to može biti opisano kao dodavanje još jedne sekvence da bi se napravila veća imuno-ponavljajuća jedinica. Stoga, polipeptid za korišćenje pronalaska sadrži 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 ponavljanja imunoponavljajućih jedinica.

Definicije

Proteini spoljne membrane

[0054] Spoljna membrana hlamidije sp. može biti izolovana tretiranjem netaknutih, prečišćenih elementarnih tela deterdžentom kao što je 2% Sarkosil a zatim ultracentrigacijom (100.000 g tokom jednog sata) što će dovesti do supernatanta sa citosolnim komponentama i peletom koji sadrži spoljnu membranu kako je prethodno opisano<70>. Spoljnomembranski proteini se zatim mogu identifikovati standardnim proteinskim tehnikama, na primer, masenom spektrometrijom nakon SDS-PAGE.

Površinski izloženi fragmenti ili regioni

[0055] Bakterijska površina ili membranski proteini sadrže transmembranske proteine, sekretorne i lipoproteine, bezsidrene površinske proteine. Površinski izloženi regioni na netaknutoj bakteriji su pristupačni antitelima. Metodi za identifikovanje površinski izloženih regiona proteina (“surfaceome” obuhvataju na primer, biotinilaciju membranskih proteina u netaknutoj bakteriji, nakon čega sledi izolacija frakcije označene biotinom korišćenjem streptavidina. Izolovani proteini mogu zatim biti identifikovani masenom spektrometrijom. Sledeći pristup je da se netaknuta bakterija tretira sa proteazom, na primer, tripsinom (“brijanje”) za cepanje površinski izloženih peptida, a zatim prikupljanje oslobođenih peptida radi identifikacije masenom spektrometrijom.

Varijante

[0056] Varijante ovde datih spoljnomembranskih proteina opisuju proteine kodirane istim genom iz različitih serotipova hlamidije sp. Varijantni protein deli značajnu homologiju sa referentnim polipeptidom.

Izoforma proteina

[0057] U kontekstu predmetne aplikacije “izoforma” proteina podrazumeva bilo koju od nekoliko različitih formi istog proteina, na primer, protein koji ima istu funkciju ali koji je kodiran različitim genom i može imati male razlike u svojoj sekvenci ili nastaje od, ili pojedinačnih nukleotidnih polimorfizama, diferencijalnog spajanja mRNK, ili posttranslacionih modifikacija. Različiti serotipovi bakterije mogu imati različite izoforme određenih proteina.

Vrste hlamidije

[0058] Pod izrazom “vrste hlamidije” se podrazumeva bakterija koja može da izazove hlamidijsku infekciju kod životinje ili kod čoveka. Primeri takvih su C. trachomatis, C. pneumoniae i C. muridarum. Takođe kod životinja, poznato je nekoliko infekcija sa Chlamydia sp., na primer, Chlamydia Suis koja inficira svinje, i Chlamydiaphila abortus koja izaziva podbačaj kod sitnih preživara (ovce i koze).

Serovarijante, serovari ili serotipovi

[0059] Na osnovu reaktivnosti specifičnih monoklonalnih antitela protiv i detaljne sekventne analize MOMP varijabilnih regiona Ct može biti podeljeno u 15 različitih serovarijanti a od ovih serovarijanti A, B, Ba i C izazivaju trahom, D – K izazivaju seksualno prenosivu bolest (STD), L1 – L3 izazivaju limfogranuloma venereum, i MoPn (C. muridarum) inficira miševe. Serovarijante su ponekada pomenute kao serovari ili serotipovi sa istim značenjem.

Imuno-ponavljači

[0060] Pod imuno-ponavljačima se podrazumeva: repetitivne jedinice jedne ili više aminokiselinskih sekvenci koje sadrže imunogeni deo ili fragment antigena. Jedinice koje su ponavljane mogu biti opisane kao jedan ili više VD regiona, koji opciono mogu biti produženi kao što je opisano u prethodnom tekstu, koje su ponavljane, na primer, 4 primera sa tri ponavljanja VD4-VD4-VD4, VD4-VD1-VD4-VD1-VD4-VD1, VD4D-VD4D- VD4D, VD4D- VD4F- VD4G, VD4D- VD3E- VD4D- VD3E- VD4D- VD3E.

Homologni imuno-ponavljač

[0061] Repetitivne jedinice jedne ili više aminokiselinskih sekvenci sadrže imunogeni deo ili fragment antigena iz samo jedne serovarijante (slika 4).

Heterologni imuno-ponavljač

[0062] Repetitivne jedinice jedne ili više aminokiselinskih sekvenci sadrže imunogeni deo ili fragment koji kodira isti antigen dobijen iz različitih serovarijanti (slika 4).

Heterologni izazov

[0063] Odnosi se na situaciju kada je protein korišćen za vakcinaciju dobijen iz različite bakterijske serovarijante u odnosu na serovarijantu korišćenu za izazov.

Homologni izazov

[0064] Odnosi se na situaciju kada je protein korišćen za vakcinaciju dobijen iz iste bakterijske serovarijante kao serovarijanta korišćena za izazov.

MOMP

[0065] Glavni spoljnomembranski protein (MOMP) iz Ct, je eksprimiran tokom svih faza razvojnog životnog ciklusa Ct i konstituiše približno 60% ukupnog proteinskog sadržaja spoljne membrane hlamidije. MOMP može biti podeljen na konzervirane domene prekinute sa četiri visoko varijabilna domena (VD1-4 ili VS1-4)<59>(slika 1).

VD1

[0066] Varijabilni domen 1 (VD1) MOMP kao što je definisano od strane Baehr et al (1988)<36>koji odgovara aminokiselinama 91-105 i čini visoko varijabilni region u MOMP iz Ct (sekventni brojevi 1-6 VD1 iz SvD, E, F, G, la i J respektivno). Produžen VD1 region (VD1<ext>) odgovara aminokiselinama 57-115 i čini pomenuti visoko varijabilni region flankovan sa visoko konzerviranim regionima u MOMP iz Ct (sekventni brojevi 9-14 VD1<ext>iz SvD, E, F, G, la i J respektivno) (slika 3).

VD4

[0067] Varijabilni domen 4 MOMP kao što je definisao Baehr et al (1988)<36>koji odgovara aminokiselinama 309-338 i čini visoko varijabilni region u MOMP iz Ct (sekventni brojevi 15-20 VD4 iz SvD, E, F, G, la i J respektivno). Produžen VD4 region (VD4<ext>) odgovara aminokiselinama 282-349 i čini pomenuti visoko varijabilni region flankovan sa visoko konzerviranim regionima u MOMP iz Ct (sekventni brojevi 23-28 VD4<ext>iz SvD, E F, G, la i J respektivno).

Linearizovano

[0068] Izraz “linearizovano” se u predmetnom pronalasku odnosi na aminokiselinski lanac bilo koje dužine, uključujući protein pune dužine, oligopeptide, kratke peptide i njihove fragmente, pri čemu je aminokiselinski cistein susptituisan sa serinom kako bi se sprečili cisteinski ostaci da formiraju disulfidne veze.

Neutralizujući epitop

[0069] Neutralizujući epitop kao što je ovde korišćeno je nameravana aminokiselinska sekvenca koja definiše antigenu determinantu koja je vezana antitelom i, u kontekstu infekcije, smanjuje infektivnost hlamidijalnog opterećenja, na primer, blokiranjem bakterijske interakcije sa ćelijama domaćina, što je važno za uspostavljanje bakterijske infekcije i bolesti, ublažavajući bakterijski klirens.

Neutralizacija

[0070] Neutralizacija obuhvata bilo koju biološku aktivnost bakterije, uključujući redukciju efikasnosti ili mogućnosti bakterije da uspostavi infekciju ili izazove bolest ili simptome bolesti, inhibicijom formacije hlamidijalne EB.

Neutralizujuća antitela

[0071] Antitela koja vezuju neutralizujući epitop kao što je opisano u prethodnom tekstu.

Polipeptidi

[0072] Izraz “polipeptid” u predmetnom pronalasku treba da ima svoje uobičajeno značenje. To je aminokiselinski lanac bilo koje dužine, uključujući protein pune dužine, oligopeptide, kratke peptide i njihove fragmente, pri čemu aminokiselinski ostaci su povezani kovalentnim peptidnim vezama.

IFN-γ

[0073] Pod pojmom "IFN-γ" se podrazumeva interferon-gama. Merenje IFN-γ je korišćeno kao indikacija imunološkog T-ćelijskog odgovora.

Sastojci

[0074] U ovoj specifikaciji, osim ukoliko kontekst zahteva drugačije, izraz “sadrži”, ili njegove varijacije kao što su “obuhvata”, će podrazumevati da implicira inkluziju navedenog elementa ili celog broja ili grupe elemenata ili celih brojeva ali ne ekskluziju bilo kog drugog elementa ili celog broja ili grupe elemenata ili celih brojeva.

Imunogeni deo ili fragment

[0075] U preferiranoj izvedbi pronalaska, polipeptid sadrži imunogeni deo ili fragment polipeptida, kao što je epitop za B-ćeliju ili T-ćeliju.

[0076] Imunogeni deo ili fragment polipeptida je deo polipeptida, koji izaziva imuni odgovor kod životinje ili ljudskog bića, i/ili biološki uzorak utvrđen putem bilo kog od bioloških testova koji su opisani u ovom tekstu. Imunogeni deo ili fragment polipeptida može biti T-ćelijski epitop ili B-ćelijski epitop. Imunogeni delovi ili fragmenti se mogu odnositi na jedan ili nekoliko relativno malih delova polipeptida, oni mogu biti raštrkani po polipeptidnoj sekvenci ili smešteni u određenim delovima polipeptida. Za nekoliko polipeptidnih epitopa je čak dokazano da su raštrkani po polipeptidu koji pokriva celu sekvencu<71>.

[0077] Kako bi se identifikovali relevantni T-ćelijski epitopi koji su prepoznati tokom imunog odgovora, moguće je koristiti metod “grube sile”: Obzirom da su T-ćelijski epitopi linearni, delecioni mutanti polipeptida će, ukoliko su konstruisani sistematski, otkriti koji su regioni polipeptida esencijalni kod prepoznavanja imuniteta, na primer, podvrgavajući te delecione mutante, na primer, IFN-γ testu koji je opisan u ovom tekstu. Drugi postupak koristi preklapajuće oligopeptide za detekciju epitopa MHC II klase, poželjno sintetičkih, koji imaju dužinu od, na primer, 20 aminokiselinskih ostataka dobijenih iz polipeptida. Ovi peptidi mogu biti testirani u biološkim testovima (na primer, IFN-γ test kao što je opisano u ovom tekstu) i neki od njih će dati pozitivan odgovor (a time biti imunogeni) kao dokaz prisustva T ćelijskog epitopa u peptidu. Kod detekcije epitopa MHC I klase moguće je predvideti peptide koji će vezati<72>a zatim proizvesti ove peptide sintetički i testirati ih u relevantnim biološkim testovima, na primer, IFN-γ test kao što je opisano u ovom tekstu. Peptidi preferirano imaju dužinu od, na primer, 8 do 11 aminokiselinskih ostataka dobijenih iz polipeptida. B-ćelijski epitopi mogu biti utvrđeni analiziranjem B ćelijskog prepoznavanja za preklapajuće peptide koji pokrivaju polipeptid od interesa kao što je, na primer, opisano u Harboe et al<73>.

Imunogeno

[0078] Imunogeni polipeptid je definisan kao polipeptid koji indukuje imuni odgovor u biološkom uzorku ili pojedincu trenutno ili prethodno inficiranom sa hlamidijom.

Fuzioni proteini

[0079] Pod fuzionim proteinom se podrazumeva dva ili više polipeptida povezanih kovalentno. Fuzioni proteini se mogu proizvesti sa superiornim karakteristikama polipeptida. Na primer, fuzioni partneri koji olakšavaju izvoz fuzionog proteina kada je proizveden rekombinantno (na primer, signalni peptidi), fuzioni partneri koji olakšavaju prečišćavanje fuzionog proteina (na primer, his-tags), i fuzioni proteini koji poboljšavaju imunogenost fuzionog proteina predstavljaju svi zanimljive mogućnosti. Fuzioni partner može, kako bi poboljšao imunogenost, biti drugi polipeptid dobijen iz C. trachomatis, kao što je polipeptid, polipeptidni fragment ili barem jedan T-ćelijski epitop ili B-ćelijski epitop.

Farmaceutska kompozicija

[0080] Farmaceutska kompozicija je definisana kao bilo koja vakcina (terapeutska ili profilaktička) ili bilo koji dijagnostički reagens.

Vakcina, protein

[0081] Drugi deo pronalaska se tiče vakcinske kompozicije koja sadrži fuzioni protein ili nukleinsku kiselinu koja kodira pomenuti fuzioni protein otkriven pronalaskom. Kako bi se osigurale optimalne performanse takve vakcinske kompozicije poželjno je da sadrži imunološki i farmaceutski prihvatljiv nosač, nosilac ili ađuvans.

[0082] Efektivna vakcina, pri čemu fuzioni protein pronalaska za upotrebu je prepoznat od strane sisara uključujući ljudsko biće, će smanjiti bakterijsko opterećenje u ciljnim organima, produžiti vreme preživljavanja i/ili smanjiti gubitak mase nakon izazova sa virulentnom hlamidijalnom bakterijom, u poređenju sa nevakcinisanim pojedincima.

[0083] Pogodni nosači su odabrani iz grupe koja se sastoji od polimera za koji je polipeptid(i) vezan hidrofobnom nekovalentnom interakcijom, kao što je plastika, na primer, polistiren, ili polimer za koji je polipeptid(i) kovalentno vezan, kao što je polisaharid, ili polipeptid, na primer, albumin goveđeg seruma, ovalbumin ili otvor limpet hemocijanin. Pogodni nosači su odabrani iz grupe koja se sastoji od razblaživača i agensa za suspendovanje. Ađuvans je poželjno odabran iz grupe koja se sastoji od dimetildioktadecilamonijum bromida (DDA), Quil A, poli I:C, aluminijum hidroksida, Freundovog nekompletnog ađuvansa, IFNγ, IL-2, IL-12, monofosforil lipida A (MPL), trehaloza dimikolata (TDM), trehaloza Dibefenata (TDB) i muramil dipeptida (MDP), monomicolil glicerola (MMG) ili njihovih kombinacija. Preferirana kombinacija je katjonski lipozom kao što je DDA spojen sa TDB i/ili poli I:C.

[0084] Priprema vakcina koje sadrže peptidne sekvence kao aktivne sastojke je generalno dobro shvaćena u struci, kao što je ilustrovano u patentima Sjedinjenih Država 4.608.251; 4.601.903; 4.599.231 i 4.599.230, svi ovde inkorporirani referencom.

Terapeutska vakcina

[0085] Pronalazak se takođe odnosi na polipeptid ili nukleinsku kiselinu pronalaska za upotrebu kao terapeutske vakcine kao što je opisano u literaturi ilustrovano od strane D. Lowry (Lowry et al 1999). Antigeni sa terapeutskim svojstvima mogu biti identifikovani na osnovu njihove sposobnosti da umanje ozbiljnost Ct infekcije kod eksperimentalnih životinja ili spreče reaktivaciju prethodne infekcije, kada se primene kao vakcina. Kompozicija korišćena za terapeutske vakcine može biti pripremljena kao što je opisano u prethodnom tekstu za vakcine.

[0086] Predmetni pronalazak opisuje novu visoko imunogene vakcinske antigene sa širokim neutralizujućim kapacitetom na osnovu antitela koji štiti protiv različitih serovarijanti Chlamydia trachomatis. Mi demonstriramo da repetitivne jedinice definisanih fragmenata iz MOMP antigena pružaju visoko imunogene molekule koje nazivamo imuno-ponavljačima. Vakcinacija sa homolognim imuno-ponavljačima koji sadrže VD4 produžene fragmente (pokriva VD4 varijabilni domen MOMP i susedne kozervirane flankujuće regione) u različitim ađuvansima pruža veoma visoke antitelne titre i dokazujemo da su ovi konstrukti mnogo efikasniji u odnosu na imunizovanje sa pojedinačnim jedinicama VD4 produženog fragmenta. Pojačano dejstvo se može uočiti i kao izrazito povećani titar, povećano antitelno ciljanje površine bakterije, povećan neutralizujući kapacitet, povećan i proširen T ćelijski odgovor i pojačana zaštita od izazova sa homolognim sojem. Mi dalje pokazujemo da tehnologija imunogponavljanja može biti korišćena takođe kako bi se poboljšala zaštita i neutralizacija od drugih serovarijanti konstruisanjem heterolognih imuno-ponavljača baziranih na VD4 produženim fragmentima iz različitih serovarijanti kao što su serovari D, E, F i G (slika 3).

Tabela 1. Opis sekvenci korišćenih u konstruisanju imuno-ponavljača

[0087] Heterologni imuno-ponavljači su bili visoko imunogeni ali su uz to i povećavali širinu odgovora antitela što je bilo povezano sa širom finom specifičnošću odgovora antitela (izmereno peptidnim skeniranjima) koja cilja raznovrsniji repertoar linearnih epitopa unutar VD4 regiona u odnosu na homologne imuno-ponavljače. Takođe smo demonstrirali da visoko imunogeni heterologni imuno-ponavljači mogu biti bazirani na čak većim fragmentima koji inkorporiraju fuzije produženih fragmenata VD1 i VD4 i potvrđujemo da je kod životinjskih modela promovisana zaštita od strane ovih heterolognih imuno-ponavljača posredovana uglavnom putem antitela. Kako postoji opšte prepoznata potreba za jakom CMI komponentom (na primer, T-ćelijski epitop) u efikasnom zaštitnom imunom odgovoru protiv Ct, takođe smo demonstrirali da potpunim širenjem VD4 regiona N-terminalno kako bi uključili region bogat T ćelijom, da možemo generisati imuno-ponavljače koji kombinuju mogućnost za generisanje visoko titrovanih neutralizujućih antitela sa snažnim T ćelijskim odgovorom uklanjajući rezidualnu infekciju u jednom konstruktu. Takođe smo demonstrirali da imuno-ponavljači mogu biti fuzionisani sa ili pomešani sa T-ćelijskim antigenima sa vakcinskim potencijalom i da ova kombinacija pruža ranu zaštitu posredovanu antitelima protiv Ct kao i efikasno uklanjanje rezidualnih organizama posredstvom CMI.

[0088] MOMP je važan zaštitni antigen sa opšte prepoznatim potencijalom kod Ct vakcina. Ipak, MOMP antigen je veoma komplikovan antigen za ciljanje vakcinama iz razloga što ima kompleksnu strukturu sa brojnim unutrašnjim disulfidnim vezama i gde je važne neutralizujuće epitope izuzetno teško izložiti u rekombinantnim molekulima. Uz to, MOMP antigen je veoma promenljiv i predstavlja osnovu za većinu serovarijancije koja se nalazi u različitim sojevima koji izazivaju ljudsku bolest. Bilo koja vakcina zasnovana na netaknutom MOMP bi stoga morala da inkorporira određen broj različitih verzija molekula (najmanje 4-5) kako bi pokrila glavne sojeve koji prouzrokuju bolest kod ljudi. Kao što je opisano u prethodnom tekstu, MOMP antigen sadrži 4 varijabilna regiona (VD1-4) od kojih konkretno VD1 i VD4 sadrže važne neutralizujuće epitope ali vakcine zasnovane na fragmentima koji predstavljaju ove regione do sada nisu imale uspeha da indukuju dovoljno visoke titre funkcionalnih antitela da bi stvorili bilo kakvo in vivo dejstvo u studijama životnjskog izazova<51 74>.

[0089] Imuno-ponavljajuća tehnologija predmetnog pronalaska rešava problem: Ponavljanjem važnih varijabilnih VD1 i/ili VD4 regiona flankovanih konzerviranim sekvencama iz MOMP antigena dobili smo imunogene koji promovišu izuzetne nivoe funkcionalnih antitela. Iznenađujuće, takođe smo pokazali da poboljšana imunogenost može čak biti dostignuta kod heterolognih imuno-ponavljajućih konstrukata koji koriste varijabilne regione iz različitih serovara ispresecane između konzerviranih fragmenata i da ova strategija proizvodi široko neutralizujuć odgovor antitela koji štiti od različitih serovarijanti. Štaviše, tehnologija imuno ponavljanja pruža veliki broj relevantnih T-ćelijskih epitopa koji promovišu T ćelije sa direktnom efektorskom funkcijom kao i sposobnost promovisanja ubrzanih opozivnih odgovora ka susednim B ćelijskim epitopima.

[0090] Naš pronalazak stoga predstavlja iskorak u razvoju efikasne Ct vakcine sa širokim odgovorom i sposobnošću za neutralizovanje različitih serovara.

[0091] Dobro je poznato da su antigeni sa velikim brojem ponavljanja i organizovanom strukturom optimalni za aktivaciju B-ćelijskog receptora (BCR), što dovodi do povećanog humoralnog odgovora i smanjene zavisnosti od pomoći T ćelije. To je prvobitno prijavljeno sa antigenima na bazi prirodnog polisaharida iz različitih patogena (pneumokokni polisaharid i salmonela polimerizovani flagelin) gde je pretpostavljeno da repetitivna priroda antigena pokreće nekoliko BCR simultano time smanjujući ukupni prag aktivacije što pokreće proizvodnju antitela iz B ćelija plazme bez potrebe za prethodnom pomoći T ćelije. Takvi antigeni se nazivaju tip 2 T-ćelijski nezavisni B-ćelijski antigeni i u veštačkim sistemima se pokazalo da zavise od velikog broja ponavljanja (obično minimum 12-16<75>), koja konstituišu minimalni epitop i usko su locirana. To se jasno razlikuje od naše tehnologije ponavljanja gde su veliki fragmenti (69 aminokiselina, Mw > 7 kDa) ponavljani i ti fragmenti sadrže i B-ćelijske i T-ćelijske epitope<76>.

[0092] Za razliku od prethodnih zapažanja<75>, primećujemo povećanje od samo 4 ponavljanja koje dalje nije poboljšano za 8 ponavljanja. Važno, ponavljanje konzervirane sekvence sa ubačenim hipervarijabilnim domenima pojačava odgovore ne samo za ponavljani konzervirani element već važnije i na varijabilne umetke. Molekularni mehanizam koji stoji iza ove iznenađujuće amplifikacije nije u potpunosti jasan ali se najverovatnije odnosi na činjenicu da su mnogi važni epitopi locirani u preklopu između varijabilnih i konzerviranih regiona što stoga može omogućiti simultano aktiviranje različitih BCR koji svi dele neku rekogniciju konzerviranog dela epitopa. Iako mehanizam nije u potpunosti jasan praktična konsekvenca je da tehnologija heterolognog imuno-ponavljača omogućuje sintezu multivalentnih imunogena koji promovišu generisanje diverznog antitelnog odgovora koji cilja različite serovarijante.

[0093] Naši imuno-ponavljajući konstrukti pružaju antigene izuzetne imunogenosti u poređenju sa prethodnim pokušajima korišćenja varijabilnih domena iz Ct MOMP. Sve prethodne vakcine zasnovane na VD MOMP, uprkos generisanju antitela sa nekim funkcionalnim mogućnostima, nisu uspele da generišu titre koji su se preveli u in vivo zaštitu od genitalnog hlamidijalnog izazova<51, 65 64>. Konkretno strategija heterolognog imuno-ponavljanja rešava veoma fundamentalni problem viđen kod mnogih patogena a to je kako promovisati diverzne antitelne odgovore ka diverznim i varijabilnim antigenima.

Tabela 2. Imuno- onavl ači

Tabela 3. Primeri imuno-ponavljača fuzionisanih sa T-ćelijskim antigenima

Tabela 4. Preklapajući peptidi VD4 iz serovara E

Tabela 5. Preklapajući peptidi VD4 iz serovara F

Tabela 6. Preklapajući peptidi VD4 iz serovara D

Tabela 7. Preklapajući peptidi VD4 iz serovara F

Tabela 8. CT681 sekvence aminokiseline

[0094] Nukleinska kiselina koja kodira gore pomenute fuzione proteine, može biti korišćena za postizanje in vivo ekspresije imunogenih polipeptida, tj. nukleinska kiselina može biti korišćena u takozvanim DNK vakcinama kao što je razmotreno u Ulmer et al 1993 i obuhvaćeno referencom.

[0095] U konstrukciji i pripremi plazmidnog DNK koji kodira fuzioni polipeptid koji se koristi definisan za DNK vakcinaciju može se koristiti soj domaćina, kao što je E. coli. Plazmidna DNK se zatim može pripremiti iz prekonoćnih kultura soja domaćina koji nosi plazmid od interesa, i prečistiti korišćenjem, na primer, Qiagen Giga – plazmidni kolona komplet (Qiagen, Santa Clarita, CA, USA) uključujući korak uklanjanja endotoksina. Od suštinskog značaja je da plazmidna DNK koja se koristi za DNK vakcinaciju ne sadrži endotoksin.

[0096] Stoga, pronalazak se takođe odnosi na vakcinu koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid koji je korišćen u pronalasku, vakcina utiče na in vivo ekspresiju imunogenog polipetida kod životinje, uključujući čoveka, nad kome je vakcina primenjena, količina eksprimiranog polipeptida efikasna za pružanje suštinski povećanje rezistencije na infekcije izazvane virulentnom bakterijom kod životinje, uključujući čoveka.

[0097] Efikasnost takve DNK vakcine se može povećati administriranjem gena koji kodira ekspresioni proizvod zajedno sa DNK fragmentom koji kodira polipeptid koji ima mogućnost modulisanja imunog odgovora.

[0098] Jedna mogućnost za efikasno aktiviranje celularnog imunog odgovora se može postići eksprimiranjem relevantnog imunogenog polipeptida u nepatogenom mikroorganizmu ili virusu. Dobro poznati primeri takvih mikroorganizama su Mycobacterium bovis BCG, salmonela i pseudomona a primeri virusa su vakcinija virus i adenovirus.

[0099] Takođe je otkriveno poboljšanje trenutno dostupne BCG vakcine, pri čemu je jedna ili više kopija DNK sekvence koja kodira jedan ili više fuzionih polipeptida, kao što je definisano u prethodnom tekstu, inkorporirano u genom mikroorganizma na način koji omogućava mikroorganizmu da eksprimira i sekretuje fuzioni polipeptid. Inkorporacija više od jedne kopije sekvence nukleinske kiseline je razmatrana kako bi se poboljšao imuni odgovor.

[0100] Druga mogućnost je da se integriše DNK koja kodira fuzioni polipeptid korišćen u pronalasku u oslabljen virus kao što je vakcinija virus ili adenovirus (Rolph et al 1997). Rekombinantni vakcinija virus može da uđe unutar citoplazme ili nukleusa inficirane ćelije domaćina i fuzioni polipeptid od interesa može stoga indukovati imuni odgovor, koji je predviđen da indukuje zaštitu od TB.

[0101] Iako su DNK vakcine razvijene pre više od 16 godina, klinička ispitivanja koja prethode I i II fazi kod ljudi su retka. Dve veterinarske DNK vakcine su ipak licencirane; jedna za virus Zapadnog Nila (kod konja) i druga za virus infektivne hematopoetske nekroze kod lososa. Ovo pokazuje da DNK vakcine mogu imati dobra zaštitna dejstva i da nove DNK vakcine nisu ograničene veličinom životinje ili vrste. Veliki uspeh sa DNK vakcinama primećen kod murinskog modela za prvu generaciju DNK vakcina se ipak nije dobro preneo na ljude; istraživači su nedavno pokazali nivoe zaštitnih antitela jednom dozom genskog pištolja koji je primenio HA DNK vakcinu nad čovekom.

[0102] “Imunizacija nukleinske kiseline” ili opšte preferiran naziv “DNK vakcine” je inokulacija antigena koji kodira DNK ili RNK kao ekspresione kasete ili ekspresioni vektori ili inkorporirano u virusne vektore sa svrhom indukovanja imuniteta na genski proizvod. Stoga, u našoj definiciji DNK vakcina uključujemo sve tipove sistema isporuke antigena koji kodira DNK ili RNK. Vakcinski gen može biti u formi cirkularnog plazmida ili linearne ekspresione kasete sa samo ključnim karakteristikama neophodnim za ekspresiju (promotor, vakcinski gen i poliadenilacioni signal). Sistemi isporuke mogu najčešće biti gola DNK u puferu sa ili bez ađuvansa, DNK kuplovana za nanočestice i/ili formulisana u ađuvans koji sadrži jedinjenja ili ubačena u žive virusne ili bakterijske vektore kao što je adenovirus, virus povezan sa adeno, alfavirus, poksvirusi, herpes virus itd. DNK vakcine obećavaju mnogo obzirom da evociraju i humoralni i ćelijski posredovan imunitet, bez istih opasnosti povezanih sa živim virusnim vakcinama. Za razliku od živih atenuiranih virusnih vakcina DNK vakcine mogu biti isporučene istom ili različitom tkivu ili ćelijama u odnosu na živi virus koji se mora vezivati za specifične receptore. Proizvodnja antigena u njihovom nativnom obliku poboljšava prezentaciju antigena imunom sistemu domaćina. Za razliku od živih atenuiranih vakcina, DNK vakcine nisu zarazne i ne mogu se vratiti u virulentnost.

[0103] DNK vakcine nude mnoge prednosti nad konvencionalnim vakcinama. Mogu biti proizvedene u velikim količinama za kratko vreme, ukidajući potrebu za razmnožavanjem u jajima, isplative su, obnovljive i krajnji proizvod ne zahteva hladne uslove skladištenja, zato što DNK stabilna i otporna na ekstreme temperature. Sve trenutno licencirane neaktivirane vakcine su efikasne u indukovanju humoralnih antitelnih odgovora ali samo žive atenuirane virusne vakcine efikasno indukuju i citotoksični celularni odgovor. DNK vakcine takođe imaju ovu sposobnost i indukovani odgovor stoga može bolje oponašati prirodni odgovor na virusnu infekciju u odnosu na neaktivirane vakcine u pogledu specifičnosti i izotipova antitela.

[0104] DNK vakcine indukuju imuni odgovor koji je uporediv sa dobijenim odgovorom od prirodne virusne infekcije aktiviranjem i humoralnog i ćelijski posredovanog imuniteta. Širok odgovor na DNK vakcine je rezultat kodiranih gena koji su eksprimirani transfektovanom ćelijom domaćina, indukujući i Th1 i Th2 imune odgovore. Proizvodnja antigena u njihovom nativnom obliku poboljšava prezentaciju antigena imunom sistemu domaćina.

[0105] Dva najčešća tipa administracije DNK vakcine su injekcija fiziološkog rastvora gole DNK i DNK inokulacije genskim pištoljem (DNK obložena na čvrstim zlatnim kuglicama administrirano sa pritiskom helijuma). Salinske intramuskularne injekcije DNK preferencijalno generišu Th1 IgG2a odgovor dok isporuka genskog pištolja teži da inicira još Th2 IgG1 odgovora. Intramuskularno ubrizgani plazmidi su u opasnosti od degradiranja ekstracelularnim deoksiribonukleazama, pa ipak, indukovani dogovori su često dugotrajniji u odnosu na one indukovane metodom genskog pištolja. Vakcinacija isporukom DNK genskim pištoljem, u epidermis, se dokazala kao najefikasniji metod imunizacije, verovatno iz razloga što koža sadrži sve neophodne tipove ćelija, uključujući ćelije koje predstavljaju profesionalni antigen (APC), za izazivanje i humoralnih i citotoksičnih celularnih imunih odgovora (langerhani i dendritičke ćelije). Potpuna zaštita od smrtonosne doze virusa gripa je dobijena sa samo 1 mg DNK kod miševa. Standardni DNK vakcinski vektor se sastoji od gena interesa kloniranog u bakterijski plazmid projektovan za optimalnu ekspresiju u eukariotskim ćelijama. Esencijalne karakteristike uključuju; poreklo replikacije koje omogućava proizvodnju u bakteriji, bakterijski antibiotski gen rezistencije koji omogućava plazmidnu selekciju u bakterijskoj kulturi, snažan konstitutivni promotor za optimalnu ekspresiju u ćelijama sisara (promotori dobijeni iz citomegalovirusa (CMV) ili simijan virusa pružaju najveću gensku ekspresiju), poliadenilaciona sekvenca za stabilizaciju mRNK transkripta, kao što je goveđi hormon rasta (BHG) ili poliadenilacija simijan virusa, i višestruko mesto kloniranja za inserciju gena antigena. Sekvenca introna A značajno poboljšava ekspresiju gena. Mnogi bakterijski DNK vakcinski vektori sadrže nemetilirane citidinfosfatguanozin (CpG) dinukleotidne motive koji mogu izazvati snažne urođene imune odgovore kod domaćina. Poslednjih godina postojalo je nekoliko pristupa za poboljšavanje i prilagođavanje imunog odgovora na DNK vakcinske konstrukte (druga generacija DNK vakcina). Na primer, korišćeni su dicistronski vektori ili višestruki geneksprimirajući plazmidi kako bi se eksprimirala dva gena istovremeno. Projektovani su specifični promotori koji ograničavaju gensku ekspresiju na određena tkiva, i citokinski/antigenski fuzioni geni su konstruisani kako bi poboljšali imuno odgovore. Pored toga, geni mogu biti kodon optimizovan za optimalnu ekspresiju gena kod domaćina i naïve vodeće sekvence mogu biti supstituisane optimizovanim vođama koji povećavaju translacionu efikasnost.

[0106] Administracija DNK vakcine može biti putem fiziološkog rastvora ili puferovana salinska injekcija gole DNK ili RNK, ili injekcija DNK plazmida ili linearni gen koji eksprimira DNK fragmente kuplovane za čestice, ili inokulisana genskim pištoljem ili isporučena virusnim vektorom (virus kao čestica) kao što je adenovirus, modifikovan vakcinija virus ankara (MVA), vakcinija, virus povezan sa adeno (AAV), alfavirus itd.

Legenda slika:

[0107]

Slika 1. Model MOMP (serovar D, soj: D/B-120) membranske topologije prilagođen od Findlay et al<77>. VD1, VD2, VD3 i VD4 su označeni crnim linijama u AA sekvenci a kod linearnog modela MOMP je prikazan isprekidano sa 5 konstantnih segmenata (CS).

Slika 2. Poravnavanje aminokiselinske sekvence Ct MOMP VD4<ext>za serovare D, E, F, G, la i J. Sekvenca serovara D se koristi kao prototip, a konzervirane aminokiseline kod drugih serovara su prikazane kao „.“. Varijabilni domen VD4 prema Baehr et al (PNAS, 1988)<36>je osenčen sivim a konzervirani epitop TTLNPTIAG je uokviren.

Slika 3. Model MOMP (serovar D, soj: D/B-120) membranske topologije prilagođen od Findlay et al. VD1ext i VD4ext opisani u ovom pronalasku su prikazani kao osenčeni na slici.

Slika 4. Ilustracija i dizajn homolognih i heterolognih imuno-ponavljanja. Imuno-ponavljači su fuzioni proteini, na primer, iz četiri VD4<ext>regiona, bilo da je iz istog serovara, homologni imuno-ponavljači, ili iz različitih serovara, heterologni imunoponavljači. Varijabilni VD4 region unutar svakog VD4<ext>regiona je ilustrovan kao izbačen.

Slika 5. Pojačani i prošireni imuno odgovori nakon imunizacije sa homolognim imuno-ponavljačima VD4<ext>u poređenju sa monomernom VD4<ext>jedinicom.

Slika 6. Konstrukt sastavljen od heterolognih imuno-ponavljača iz SvD, E, F i G je indukovao snažniji odgovor za više serovara u poređenju sa homolognim imuno-ponavljačima iz SvF.

Slika 7. Fina specifičnost odgovora antitela nakon imunizacije sa heterolognim imuno-ponavljačem produženih VD4 jedinica iz SvD, E i F(CTH89) u poređenju sa konstruktima sastavljenim od homolognog imuno-ponavljača iz (SvE<ext>VD4)∗4 i iz (SvF<ext>VD4)∗4.

Slika 8. Imunizacija sa heterolognim imuno-ponavljačima produženih VD4 iz SvD, SvE i SvF (CTH89) generiše ranu T-ćelijsku nezavisnu zaštitu nakon SvD izazova.

Slika 9. In vivo neutralizacija sa CTH89 specifičnim serumom.

Slika 10. Kuplovanje heterolognih imuno-ponavljača za rekombinantni MOMP.

Slika 11. Vakcinacija sa heterolognim imuno-ponavljačima VD1-VD4 regiona iz SvD, SvE i SvF (CTH88) u poređenju sa vakcinacijom sa jednom VD1-VD4 jedinicom iz SvD (CTH87).

Slika 12. Kuplovanje T-ćelijskih antigena za imuno-ponavljače VD4

Slika 13. Imunizacija sa koktelom heterolognog VD4 imuno-ponavljača i fuzioni molekul T-ćelijskog antigena.

Slika 14. Poređenje CAF01 i alum kao sistema isporuke ađuvansa.

Slika 15. Vakcinacija sa heterolognim imuno-ponavljačima sastavljenim od umanjene dužine VD4<ext>regiona iz SvD, SvE, SvF i SvG.

Slika 16. Vakcinacija i heterologni imuno-ponavljači sastavljeni od produženih VD4<ext>regiona iz SvD, SvE, SvF, SvG, Svla i SvJ.

Materijal i metode

Kultivacija C. trachomatis

[0108] Ct serovara D, E i F je propagiran u hela 229 ćelijama (ATCC, Rockville, MD, USA). Ćelije su kultivisane u RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) medijumu koji sadrži 5% fetalnog telećeg seruma (Gibco BRL; toplotno inaktiviranog), 1% v/v hepesa, 1% v/v L-glutamina, 1% v/v pirovata i 10 mg/ml gentamicina. Polusjedinjeni monoomotači hela 229 ćelija na ploči sa 6 posuda su inficirani sa 1,5 inkluzije koja formira jedinicu po ćeliji Ct serovara E ili F u 0,3 ml SPG-pufer/otvor. Ploče su centrifugirane sat vremena u Heraeus Multifuge 3S pri 750g i inkubirane na postolju ploče tokom 2 sata na 35 °C. Nakon 2 sata dodato je 2 ml kultivacionog medijuma obogaćenog sa 5% glukoze i 1 mg/ml cikloheksimidina po posudi i ćelije su dalje inkubirane tokom 72 sata na 37 °C u atmosferi od 5% CO2na vlažnom vazduhu.

Prikupljanje Ct

[0109] Hlamidija je sakupljena 72 sata nakon infekcije. Ćelije su izvađene iz posuda sa ćelijskim strugačem i centrifugirane 30 minuta pri 35.000 g i 4°C. Peleti su ponovo suspendovani u HBSS, sonikovani na ledu centrifugirani pri 500g i 4°C tokom 15 minuta. Supernatant je prikupljen i sačuvan na ledu a pelet je ponovo suspendovan na istu zapreminu kao ranije i ponovljena je sonikacija i centrifugacija. Dva supernatanta su sjedinjena i centrifugirana 30 minuta pri 30000g i 4°C a pelet je ponovo suspendovan sa iglom i špricom u SPG puferu (3 ml/ploča). Nakon kratke sonikacije suspenzija je nežno nasložena preko 30% diatrizoat rastvora (50g meglumin diatrizoat, 7,7g natrijum diatrizoat u 76ml H2O) i centrifugirana pri 40,000g tokom 30 minuta. Nakon centrifugacije pelet je ponovo suspendovan u SPG puferu i skladišten na -70 °C. IFU serije su kvantifikovani titracijom na McCoy ćelijama i koncentracija serije je utvrđena sa BCA.

Antigenske i fuzione pripremne metode

[0110] Genom C. trachomatis serovara D, E, F i G je javno dostupan (NCBI - GenBank). Geni koji kodiraju za C. trachomatis antigene i fuzije su svi dobijeni sintetički za kloniranje u E.coli ekspresionom sistemu bakterijskog proteina (DNK2.0). pET411 vektor je korišćen za ekspresiju rekombinantnog C. trachomatis proteina u E. coli sa oznakom afiniteta histidina. Bakterijski domaćin je bio BL21-STAR™. E. coli je uzgajana na 37°C kako bi dostigla logaritamsku fazu OD600 ∼ 0,5 a proteinska ekspresija je indukovana tokom 4 sata i ćelije su prikupljene centrifugacijom (6.000 g tokom 15 minuta). E. coli su lizirane upotrebom Bugbuster (Novagen) koje sadrži benzonazu, rLizozim i proteazni inhibitor koktel I (Calbiochem). Inkluziona tela su izolovana centrifugacijom (10.000 g tokom 10 minuta). Peleti su rastvoreni u 50 mM NaH2PO4, 0,4M NaCl, 8M urea, 10mM imidazol pH 7,5 i postavljeni na HisTrap HP kolonu (Amersham Biosciences) a vezani proteini su eluirani primenom gradijenta od 50 do 500mM imidazola. U zavisnosti od izoelektrične tačke antigena i fuzija oni su dalje prečišćeni hromatografijom jonske razmene. Proteinske koncentracije su određene BCA proteinskim testom (Pierce).

Životinje

[0111] Ženke B6C3F1 miševa, 8-12 nedelja starosti, su dobijene od Harlan laboratorija. Životinje su bile smeštene pod uobičajenim uslovima životne sredine i obezbeđena im je standardna hrana i voda ad libitum. Korišćenje miševa je vođena postavljenim regulacijama od strane danskog Ministarstva pravde (Lov om dyreforsøg, jvf lovbekendelser nr. 726 af 9. September 1993), i komiteta za zaštitu životinja. Podnet je i odobren detaljan opis eksperimenata od strane regionalnog odbora za etički pregled (2012-15-2934-00100) održanog od strane aplikanta.

Imunizacija

[0112] Miševi su imunizovani 3 puta sa 14 dana razmaka između imunizacija. Polipeptidi su emulgovani u CAF01 i primenjeni simultano subkutanim (sc) i intranazalnim (i.n.) putem. Vakcine date na oba načina su se sastojale od 5 ug peptida (videti iznad) emulgovanog u 250ug DDA i 100ug TDB. Kao negativna kontrola, ubrizgan je sam DDA/TDB, bez peptida.

Celularni odgovori specifični za hlamidiju

[0113] Limfociti u krvi ili splenociti su prečišćeni. Limfociti u krvi su sjedinjeni od 8 miševa u svakoj grupi a splenociti su kultivisani pojedinačno (n=4) i kultivisani u tri primerka u mikrotiter pločama sa okruglim dnom (Nunc, Denmark) koje sadrže 2 x 10<5>ćelija/posuda u zapremini od 200 ml RPMI-1640 dopunjeno sa 5 x 10-5M 2-merkaptoetanola, 1 mM glutamina, 1% piruvata, 1% penicilin-streptomicina, 1% HEPES i 10% fetalnog telećeg seruma (FCS) (Invitrogen, Denmark). Ćelije su ponovo stimulisane sa pojedinačnim antigenima u 1-10 mg/ml ili VD1 i VD4 peptidnim bazenima (2 mg/ml svaki peptid). Stimulacija sa konkanavalinom A (5 mg/ml) ili medijumom kao pozitivna kontrola za ćelijsku vijabilnost i negativna kontrola, respektivno. Nakon 72 sata inkubacije na 37°C u 5% CO2, supernatanti su prikupljeni i skladišteni na -20°C pre upotrebe. Količine sekretovanog IFN-γ su utvrđene enzimskim imunosorbentnim testom (ELISA).

Serumska antitela

[0114] U različitim vremenskim tačkama nakon vakcinacije miševima je uzeta krv i serum izolovan centrifugacijom. Serum je testiran sa ELISA na reaktivnost protiv Ct površine (SvD, SvE i SvF), protiv SvE VD4 monomera, i protiv peptida (tabela 4&5) koji obuhvataju VD4 region SvD, SvE i SvF. Ukratko, ploče su obložene antigenom (1 do 10 ug/ml) na 4 °C u karbonatnom puferu preko noći, blokirane sa BSA i isprane. Ploče su zatim inkubirane sa prethodno razblaženim uzorcima na 4 °C preko noći, isprane i inkubirane sa sekundarnim antitelom konjugovanim sa peroksidazom tokom 1 sata. Reakcije su vizualizovane inkubacijom sa TMB supstratom i reakcija je stopirana sa sumpornom kiselinom i očitana na 450 nm. Kada je ispitivana reaktivnost ELISA sa 9mer preklapajućim peptidnim panelom koji obuhvata VD4 region SvD (SvE) (tabela 6) i SvF (tabela 7), izvršene su male promene. Ukratko, ploče su tretirane sa streptavidinom i obložene sa biotinilovanim peptidima, blokirane tokom 2 sata na sobnoj temperaturi sa obranim mlekom u prahu i isprane. Ploče su zatim inkubirane sa prethodno razblaženim (1:100) uzorcima seruma tokom 2 sata na sobnoj temperaturi, isprane i inkubirane sa sekundarnim antitelom konjugovanim sa peroksidazom tokom 1 sata. Reakcije su vizualizovane inkubacijom sa TMB supstratom i reakcija je zaustavljena sa sumpornom kiselinom i očitana pri 450 nm.

Test neutralizacije

[0115] HaK ćelije su uzgajane do spajanja u mikrotiternim pločama ravnog dna sa 96 posuda u RPMI 1640 medijumu dopunjenom sa 5% fetalnog telećeg seruma (Gibco BRL; toplotno inaktivirano), 1% v/v hepesa, 1% v/v L-glutamina, 1% v/v pirovata i 10 mg/ml gentamicina.

[0116] Zalihe hlamidije su prethodno titrovane i razblažene do 3 x 106 IFU/ml za SvE, 2 x 10<6>IFU/ml za SvD i 5 x 10<6>IFU/ml za SvF. Serum (sjedinjen) izolovan iz vakcinisanih miševa je toplotno inaktiviran na 56°C tokom pola sata, razblažen 2-4 puta i 4-5 puta titriran.80 ml bakterijske suspenzije je pomešano sa 80 ml seruma (+/- 20 mg/ml peptida) i inkubirano 30 minuta na 37°C na lagano ljuljajućoj platformi i 50 ml suspenzije je zatim inokulisano u prethodno pripremljene HaK ćelije u duplikatima. Da bi se ovo uradilo, medijum je uklonjen iz HaK monoomotača i dodato je 100 ml gore pomenutog medijuma dopunjenog sa 0,5% glukoze i 10 mg/ml cikloheksamidina, a zatim 50 ml serum/bakterija suspenzije. Ploče su inkubirane na 35°C na platformi koja se polako ljulja, zatim je uklonjen inokulum i dodato je 100 ml gore pomenutog medijuma obogaćenog sa 0,5% glukoze i 10 mg/ml cikloheksimidina. Ploče su zatim inkubirane tokom 24 sata na 37°C u atmosferi od 5% CO2na vlažnom vazduhu. Nakon inkubacije medijum je uklonjen a monoslojevi su fiksirani sa 96% etanola tokom 10 minuta. Inkluzije su vizualizovane bojanjem sa poliklonalnim zečjim anti-CT755 serumom napravljenim u našoj laboratoriji, a zatim FITC-konjugovanim svinjskim antizečjim imunoglobulinom (Dako). Pozadinsko bojanje je urađeno sa propidijum jodidom (Invitrogen).

Vaginalni izazov i vaginalno hlamidijalno opterećenje

[0117] Deset i 3 dana pre Ct serovar D izazova, ciklus estrusa je sinhronizovan injekcijom 2,5 mg medroksiprogesteronacetata (Depo-Provera; Pfizer). Šest nedelja nakon završne vakcinacije miševi su izazvani i. vag. sa 4-8 x 10<5>IFU Ct serovara D u 10 ml SPG pufera. Vaginalni brisevi su uzimani 3, 7, 10 i 14 dana nakon infekcije. Brisevi su vorteksovani sa staklenim perlama u 0,6 ml SPG pufera i čuvane na -80°C do analize. Infektivno opterećenje je utvrđeno kao što je opisano u in<17>. Ukratko, McCoy ćelijski monoslojevi su inficirani titrovanom zapreminom suspenzije brisa u duplikatima. Ploče su centrifugirane na 750 x g tokom 1 sata na sobnoj temperaturi praćeno sa inkubacijom na 35°C tokom 2 sata. Infekcioni medijum je zatim zamenjen sa svežim medijumom i ćelije su inkubirane na 37°C tokom 30 sati. Inkluzije su vizualizovane bojanjem sa poliklonalnim zečjim anti-CT681 serumom napravljenim u našoj laboratoriji, a zatim FITC konjugovanim svinjskim anti-zečjim Ig (DAKO, Glostrup, Denmark). Pozadinsko bojanje je urađeno propidijum jodidom (Invitrogen, Taastrup, Denmark). Inkluzije su nabrojane fluorescentnom mikroskopijom posmatranjem najmanje 20 pojedinačnih vidnih polja za svaku posudu.

Deplecija CD4<+>i CD8<+>T-ćelija

[0118] Monoklonalni anti-mišji CD4 (klon GK1.5) i anti-mišji CD8 (klon YTS156 i YTS169 poklon od Stephen Cobbold)<78, 79>je prečišćen od supernatanata hibridoma napravljenih u našoj laboratoriji, korišćenjem HiTrap proteinskih G HP kolona (GEHealthcare Life Sciences, Denmark). Prečišćen IgG je dijalizovan protiv PBS, filtriran kroz 0,22um filter i proteinska koncentracija je određena sa OD 280nm. Miševi su depletirani CD4+ ili CD8+ T-ćelija sa 4 injekcije od 250-300mg prečišćenog anti-CD4 ili mešavine anti-CD8 antitela 7, 4. i 1. dana pre i 2. i 6. dana nakon dana infekcije. CD4+ i CD8+ T ćelijske deplecije su verifikovane FACS analizom na PBMC prvog dana nakon infekcije korišćenjem FITC konjugovanog anti-CD4 antitela (klon RM4-4) i PE-konjugovanog anti-CD8 antitela (klon 53-6) (BD Biosciences, Denmark).

In vivo deplecija

[0119] Zaliha serovara D hlamidije je prethodno titrovana i razblažena na 8 x 10<4>IFU/ml, pomešana 1:1 sa serumom izolovanim iz miševa imunizovanih sa heterolognim VD4 imno-ponavljačem SvD-SvE-SvF (CTH89). Deset i 3 dana pre Ct serovar D izazova, ciklus estrusa je sinhronizovan injekcijom od 2,5 mg medroksiprogesteronacetata (Depo-Provera; Pfizer). Miševi su izazvani i.vag. sa 10 ml gore pomenute mešavine (4 x 10<5>IFU Ct serovara D). Vaginalni brisovi su uzeti 3, 7 i 10 dana nakon infekcije.

Statistička analiza

[0120] Statistička analiza je izvršena korišćenjem GraphPad Prism 4. Medijani vaginalnog hlamidijalnog opterećenja su analizirani koriščenjem Kruskall-Wallis a zatim sa Dunn’s post test ili Mann-Whitney.

Primer 1: Pojačani imuno odgovori nakon imunizacije sa homolognim imuno-ponavljačima VD4<ext>u poređenju sa monomernom VD4<ext>jedinicom.

Uvod

[0121] Ovde smo odabrali polipeptidne jedinice koje sadrže produžene VD4 fragmente serovara E (za sekvencu videti sliku 2) (SvE VD4<ext>). Kako bi pojačali imuno odgovor protiv ovih domena dizajnirali smo rekombinantne polipeptide gde je SvEVD4<ext>jedinica predstavljena na repetitivni način. Kako bi istražili da li repetitivna forma konstrukta može pojačati odgovor antitela u poređenju sa monomernom formom, dizajnirali smo rekombinantne polipeptide gde su jedinice predstavljene ili kao jedna jedinica ili na repetitivni način. Za serovar E (SvE), konstruisan je monomerni (SvE VD4<ext>)∗1 (CTH181), četiri imuno-ponavljača (SvE VD4<ext>)∗4 (CTH527) i osam imuno-ponavljača (SvE VD4<ext>)∗8 (CTH526) produžene VD4 jedinice. Ovi homologni imunoponavljajući konstrukti su formulisani u ađuvansu CAF01 i korišćeni za vakcinaciju miševa; svaki miš je vakcinisan sa 2x5 mg peptida tako da je količina VD4 bila ista. Imunogenost konstrukta je proučavana pomoću ELISA protiv SvE VD4<ext>, peptida koji pokrivaju SvE VD4<ext>i bakterijske površine hlamidije.

Rezultati

[0122] Šest miševa/grupa je imunizovano 2 puta sa razmakom od 14 dana između imunizacija. Vakcine (2x5 mg) su emulgirane u CAF01 i administrirane simultano subkutanim i intranazalnim putevima. U određenim vremenskim tačkama nakon poslednje vakcinacije uzeta je krv i nivoi antitela protiv produžene VD4 jedinice iz SvE i protiv bakterijske površine SvE su izmereni pomoću ELISA. Vakcinacija sa jednom VD4<ext>jedinicom (monomerni VD4<ext>, CTH181) je indukovala niže nivoe VD4<ext>specifičnih antitela u poređenju sa nivoom indukovanim nakon imunizacije sa homolognim imuno-ponavljačima sastavljenim od 4 VD4<ext>ponavljanja (SvE VD4<ext>)∗4 (slika 5A). Veći odgovor antitela koji je viđen nakon imunizovanja sa (SvE VD4<ext>)∗4 je doveo do jače rekognicije bakterijske površine u poređenju sa serumom izolovanim iz (VD4<ext>)∗1 imunizovanih miševa (slika 5B). Odgovor do 20mer peptida sa 10aa preklapanjem koji obuhvata produženi VD4 region (tabela 4) je takođe pojačan što je imalo za rezultat širi obrazac rekogniciije epitopa u (VD4<ext>)∗4 homolognim immuno-ponavljačkim groupama u poređenju sa grupom miševa koji su imunizovani sa monomernom VD4<ext>jedinicom kada je testirano u 1:500 serumskoj diluciji (slika 5C). Kod grupe imunizovane sa monomernim konstruktom odgovor je bio ekskluzivno ciljan na centralni region koji sadrži TTLNPTIAG epitop dok je imunizacija sa homolognim imuno-ponavljačem izložila nekoliko B-ćelijskih epitopa i uzvodno i nizvodno od tog epitopa što je imalo za rezultat diverzni obrazac rekognicije epitopa od različitih epitopa. Nastavili smo ispitivajući da li su imuno-ponavljači 8 (SvE VD4<ext>)∗8 (CTH526, sekvencioni broj 30) bili više imunogeni u odnosu na imuno-ponavljače 4 (SvE VD4<ext>)∗4. Dva konstrukta su indukovala slične nivoe antitela protiv produžene VD4 jedinice i protiv bakterijske površine SvE.

Zaključak

[0123] Demonstrirali smo da imunizovanjem sa imuno-ponavljačima produženih VD4 jedinica iz serovara E možemo znatno poboljšati odgovor antitela, mereno i kao titar (slika 5A&B) i kao širina odgovora (slika 5C), usmeren protiv produžene VD4 jedinice što dovodi do snažne reaktivnosti ka bakterijskoj površini. Nismo otkrili poboljšane antitelne i neutralizacione titre povećanjem broja ponavljanja sa 4 na 8.

Primer 2: Konstrukt sastavljen od heterolognih imuno-ponavljača iz SvD, E, F i G (CTH518) je indukovao snažniji odgovor višestrukim serovarima u poređenju sa homolognim imuno-ponavljačima iz SvF.

Uvod

[0124] Ispitivali smo da li je imunizacija sa heterolognim imuno-ponavljačem sastavljenim od produženih VD4 jedinica iz SvD, SvE, SvF i SvG (CTH518), održala snažnu imunogenost i mogla da indukuje širi antitelni odgovor rekognizujući površinu više serovara u poređenju sa imunizacijom sa homolognim imuno-ponavljačem sastavljenim od produženih VD4 jedinica iz SvF (SvF VD4<ext>)∗4, (CTH529). Ovi imuno-ponavljajući konstrukti su bili formulisani u ađuvansu CAF01 i upotrebljeni za vakcinaciju miševa. Imunogenost konstrukata je proučavana pomoću ELISA protiv bakterijske površine serovar D, E i F.

Rezultati

[0125] Heterologni imuno-ponavljači su promovisali odgovor antitela koji je rekognizovao površinu soja serovara F na istom visokom nivou kao odgovor koji je viđen sa homolognim imuno-ponavljačem iz SvF. Ipak, imunizacijom sa heterolognim imunoponavljačem koji sadrži produžene VD4 regione iz četiri serotipa (SvD, SvE, SvF, SvG) uočili smo značajno povećan titar za D i E serovarijante u poređenju sa homolognim imuno-ponavljačem iz serovara F (slika 6).

Zaključak

[0126] Imunizovanje sa konstruktom sastavljenim od imuno-ponavljača heterolognih produženih VD4 je indukovalo širi odgovor rekognizujući površinu više serovara (D, E i F) uz održavanje izražene imunogenosti homolognog imuno-ponavljača.

Primer 3: Specifičnost odgovora antitela nakon imunizacije sa heterolognim imuno-ponavljačem produženih VD4 jedinica iz serovara D, E i F (CTH89) u poređenju sa konstruktima sastavljenim od homolognog imuno-ponavljača iz (SvE<ext>VD4)∗4, (SvF<ext>VD4)∗4 i prethodno objavljenim A8-VD4 peptidom<65>.

Uvod

[0127] Ispitivali smo specifičnost imuno odgovora nakon imunizacije sa heterolognim ponavljačem produženih VD4 domena iz SvD, SvE, SvF (CTH89) u poređenju sa imunizacijom homolognim imuno-ponavljačima sastavljenim od produženih VD4 ponavljača iz serovara E (SvE<ext>VD4)∗4 (CTH527), SvF (SvF<ext>VD4)∗4 ponavljanja (CTH524) i A8-VD4 peptida. Ovi konstrukti su formulisani u ađuvansu CAF01 i korišćeni za vakcinaciju miševa. Imunogenost konstrukata je proučavana pomoću ELISA protiv peptidnog panela (9 i 20 AA dugog) koji obuhvata VD4 region D, E i F (tabele 4-7). Serum (iz 6 do 8 miševa) je testiran i odgovor iznad pozadine ali ispod OD=1,0 je označen otvorenim okvirom, odgovori iznad 1,0 su označeni ispunjenim okvirom. Dužina okvira označava oblast prepoznatu antitelima.

Rezultati

[0128] Svi konstrukti su indukovali visoke odgovore antitela ka konzerviranom TTLNPTIAG delu VD4<ext>, lociranom u varijabilnom domenu (VD). Uopšteno antitela generisana homolognim imuno-ponavljačima su bila superiornija u rekognizovanju njihovog reprezentativnog homolognog VD4<ext>regiona, dok je bilo očigledno da kad su ovi konstrukti testirani protiv peptida koji pokrivaju VD4<ext>iz različitog serovara njihov repertoar rekognicije epitopa je bio ograničen, na primer, rekognicija serovara E VD4 regiona serumom iz životinja imunizovanih sa konstruktom (SvF<ext>VD4)∗4 (slika 7A i C) (i obrnuto) (slika 7B i C). Antitela generisana nakon imunizacije sa heterolognim imuno-ponavljačima (CTH89), su rekognizovala mnogo širi repertoar epitopa nego serum iz životinja imunizovanih sa homolognim imuno-ponavljačima i A8-VD4 (7A, B, C i D). Ovaj konstrukt je bio u mogućnosti da pokrije repertoar epitopa koji pokriva serovare E i F na nivou (ili bolje) u odnosu na to što je postignuto imunizovanjem sa homolognim imuno-ponavljačima.

[0129] Kako bi se demonstriralo da li je 17 AA peptid koji predstavlja centralni VD4 peptid FDTTTLNPTIAGAGDVK bio u mogućnosti da se nadmeće sa C. trachomatis organizmima za CTH89 specifično antitelno vezivanje, sproveden je kompetitivni neutralizacioni test. Različite koncentracije CTH89 i A8-VD4 specifičnog seruma su pomešane sa peptidom u koncentraciji od 20 mg/ml (slika 7D). Rezultati pokazuju da, za razliku od A8-VD4 specifičnog seruma, peptid ne može u potpunosti eliminisati neutrališući kapacitet CTH89 specifičnog seruma, što ukazuje da ovaj serum cilja širi repertoar neutralizujućih epitopa.

Zaključak

[0130] Imunizovanje sa imuno-ponavljačima heterolognih produženih VD4 je indukovalo širok odgovor rekognizujući i konzervirane i određene delove serovara VD4 regiona, translatujući u širi repertoar neutralizujućih epitopa.

Primer 4: Imunizacija sa heterolognim imuno-ponavljačima produženih VD4 iz SvD, SvE i SvF (CTH89) generiše ranu T ćelijsku nezavisnu zaštitu nakon SvD izazova.

Uvod

[0131] Kako bi se proučio efektorski mehanizam koji je odgovoran za ranu zaštitu viđenu nakon vakcinacije sa VD4 repetitivnim jedinicama, miševi vakcinisani sa CTH89 su T ćelijski depletirani pre izazova i kapacitet za indukovanje rane zaštite je poređen kod depletiranih i nedepletiranih miševa.

Rezultati

[0132] Osam miševa/grupa je imunizovano 3 puta sa 14 dana razmaka između imunizacija. Vakcina (2x5 mg) je emulgirana u CAF01 i primenjena simultano subkutanim i intranazalnim putevima. U određenim vremenskim tačkama nakon poslednje vakcinacije miševima je uzeta krv i izmereni su odgovori antitela na hlamidiju, neutralizacioni titar i in vivo zaštita sa i bez T ćelijske deplecije. Deplecija T ćelijskog podskupa je eliminisala T ćelijski odgovor na CTH89 (slika 8A). CTH89 je indukovalo snažan odgovor antitela (slika 8B) koji je rekognizovao površinu serovara D (slika 8C) i bio u mogućnosti da neutralizuje bakteriju in vitro sa 50% neutralizacionog titara od oko 1: 10<3>(slika 8D). Međutim, i dalje smo pronašli značajnu zaštitu trećeg dana nakon izazova u T ćelijski depletiranim miševima (slika 8E) što ukazuje na in vivo ulogu antitela koja rekognizuju VD4 jedinicu u ranoj zaštiti od hlamidije. Konačno demonstrirali smo da je CTH89 serum takođe bio u mogućnosti da neutralizuje SvE i SvF infekciju sa veoma visokim 50% neutralizacionim titrima na nivou dobijenom sa SvD (slika 8D).

Zaključci

[0133] Imuno-ponavljači generišu T ćelijski nezavisnu ranu zaštitu od vaginalnog izazova sa serovarom D što ukazuje na in vivo ulogu VD4 specifičnih antitela

Primer 5: In vivo neutralizacija sa CTH89 specifilčnim serumom.

Uvod

[0134] Kako bi ispitali da li in vitro neutralizacija može biti translatovana u zaštitni efekat posredovan serumom in vivo, sledeće smo ispitali da li bi SvD bakterija obložena sa antitelima generisanim nakon CTH89 imunizacije mogla da neutralizuje/inhibira infekciju in vivo u poređenju sa serumom iz naivnih miševa.

Rezultati

[0135] SvD bakterije su pomešane sa serumom izolovanim iz CTH89 imunizovanih miševa ili serumom izolovanim iz naivnih miševa. Depro-provera tretirani miševi su zatim inficirani sa 4 x 10<5>bakterije. Miševi inficirani sa SvD obloženim sa CTH89 serumom su efikasno kontrolisali bakterijsku replikaciju u poređenju sa miševima izazvanim sa SvD obloženim sa sa naivnim serumom. Šest od 8 miševa je bilo čisto 7. i 10. dana u poređenju sa 2 i 3 respektivno, u kontrolnoj grupi (slika 9).

Zaključak

[0136] Serum generisan nakon imunizacije sa heterolognim VD4 imuno-ponavljačem je efikasno blokirao infekciju miševa sa SvD u poređenju sa serumom izolovanim iz navinih miševa.

Primer 6: Fuzija rekombinantnog MOMP sa imuno-ponavljačima heterolognih produženih VD4.

Uvod

[0137] MOMP je cilj i za humoralne i za celularne imuno odgovore ali uprkos relativnom uspehu ponovnih nativnih MOMP vakcina u generisanju neutralizujućih antitela i zaštiti od infekcije<54,56>, eksperimentalne vakcine bazirane na rekombinantnom MOMP (rMOMP) su doživele neuspeh. Dizajnirali smo rekombinantni MOMP u opsegu od aminokiseline 56 do 349, uključujući sve varijabilne domene (CTH521). Takođe smo odabrali polipeptidne jedinice koje sadrže produžene VD4 fragmente (pokrivanje VD4 varijabilnog domena MOMP i susednih konzerviranih flankujućih regiona) serovara D, E, F i G (CT518). Konačno je konstruisan hibrid gde je CTH521 fuzionisan za CTH518 (CT522)(slika 10).

Rezultati

[0138] Osam miševa/grupa su imunizovani 3 puta sa 14 dana razmaka između imunizacija. Vakcine su emulgirane u CAF01 i administrirane simultano subkutanim (5 mg) i intranazalnim (5 mg) putem. Nakon vakcinacije uzeti su uzorci krvi i izmerena su antitela protiv VD4<ext>jedinice, rekombinantni MOMP i protiv bakterijske površine. Antitela generisana nakon imunizacije sa CT522 i CT518 su rekognizovala VD4 region (slika 10A) i bakterijsku površinu (slika 10C) na mnogo višem nivou u poređenju sa serumom izolovanim nakon CT521 imunizacije. Štaviše antitela iz CTH518 i CTH522 su mogla da neutralizuju SvD infekciju na istom nivou i mnogo višem u odnosu na CTH521 (slika 10D).

Zaključak

[0139] Fuzija rekombinantnog MOMP sa imuno-ponavljačima heterolognih produženih VD4 ima za rezultat molekul koji izaziva isti funkcionalni odogvor antitela kao sam imuno-ponavljač.

Primer 7: Vakcinacija sa heterolognim imuno-ponavljačima VD1<ext>-VD4<ext>regiona iz SvD, SvE i SvF (CTH88) u poređenju sa vakcinacijom sa jednom VD1-VD4 jedinicom iz SvD (CTH87).

Uvod

[0140] Sledeće smo ispitivali da li je moguće fuzionisati drugi VD region za produženi VD4 region a i dalje održati kapacitet indukovanja neutralizujućih antitela. Stoga konstrukti su dizajnirani koji su produžena verzija VD1 regiona je kuplovan za produžen VD4 region. Napravili smo i homolognu jedinicu sastavljenu od produžene jedinice VD1 i VD4 iz SvD (CTH87) i heterologni imuno-ponavljač sastavljen od produženih jedinica VD1 i VD4 iz različitih serovara (D, E i F; CTH88).

Rezultati

[0141] 12 miševa/grupa su imunizovani 3 puta sa 14 dana razmaka između imunizacija. Vakcine su emulgirane u CAF01 i administrirane simultano subkutanim (5 mg) i intranazalnim (5 mg) putem. Antitela iz miševa imunizovanih sa CTH87 su rekognizovala bakterijsku površinu iz SvD, SvE i SvF (slika 11A); sa najvišim titrima uočenim protiv homolognog SvD soja a najmanjim titrima protiv najudaljenijeg SvF. Imunizovanje sa imuno-ponavljačima heterolognih VD1<ext>-VD4<ext>jedinica je rezultiralo značajno višim nivoima antitela protiv površine bakterije u poređenju sa monomernim konstruktom i širenjem odgovora što je dovelo do povećanja titra 6-12 puta protiv SvD i SvE i skoro 25 puta protiv SvF (slika 11A). Kapacitet ovih antitela za neutralizovanje infekcije u in vitro testu neutralizacije je čak još više poboljšan obzirom da je serum iz životinja imunizovanih sa monomernim VD1<ext>-VD4<ext>konstruktom iz serovara D imao samo minimalan kapacitet neutralizovanja u poređenju sa heterolognim VD1-VD4 imuno-ponavljačkim konstruktom sa neutralizacionim titrom od 1:2000 (slika 11B). Konačno (did), vakcinacija sa heterolognim VD1<ext>-VD4<ext>imuno-ponavljačkim konstruktom veoma efikasno štiti od SvD izazova kod modela vaginalnog izazova (slika 11C).

Zaključak

[0142] Demonstrirali smo da imunizovanjem sa imuno-ponavljačima heterolognih VD1<ext>-VD4<ext>jedinica iz serovara D, E i F, možemo značajno pojačati odgovor antitela usmeren protiv bakterijske površine sve tri serovarijante. Važnije, takođe smo pokazali da vakcinacijom sa heterolognim imuno-ponavljačem, uočavamo selektivno veće povećanje površinske rekognicije serovara F (25 puta u odnosu na 6-12 puta za serovar D i E), što ukazuje da heterologni imuno-ponavljači ne samo da povećavaju nivoe antitela protiv deljenih epitopa već takođe i protiv specifičnih epitopa serovara F. Pokazali smo da su antitela indukovana imuno-ponavljačima heterolognih VD1-VD4 (CTH88) generisala in vitro neutralizujuće titre što je dovelo do rane in vivo zaštite u poređenju sa jednom VD1-VD4 jedinicom iz SvD (CTH87)(slika 11C).

Primer 8: Kuplovanje T ćelijskih antigena za imuno-ponavljače VD4.

Uvod

[0143] Obzirom da postoji opšte prepoznata potreba za CMI komponentom u efikasnom protektivnom imuno odgovoru protiv Chlamydia trachomatis, sledeće smo ispitivali da li heterologni imuno-ponavljači mogu biti fuzionisani za T ćelijske antigene sa vakcinskim potencijalom. Naš cilj je bio da obezbedimo ranu antitelno posredovanu zaštitu protiv Ct kao i efikasan CMI klirens rezidualnih organizama. Konstrukti sastavljeni od CT043, i dela CT414 i CT681 su fuzionisani za imuno-ponavljače heterolognih VD1-VD4 (CTH91).

Rezultati

[0144] 12 miševa/grupa je imunizovano 3 puta sa 14 dana razmaka između imunizacija. Vakcine (2x5 mg) su emulgirane u CAF01 i administrirane subkutanim i intranazalnim putem. U različitim vremenskim tačkama nakon poslednje vakcinacije miševima je uzeta krv i izmereni su odgovori antitela i neutralizacioni titri. Antitela generisana nakon imunizacije sa CTH91 i CTH88 su rekognizovala VD4<ext>region na sličnim nivoima (slika 12A) i serum izolovan iz obe grupe je mogao da neutralizuje SvD infekciju (slika 12B). U poređenju sa CTH88 imunizovanim miševima T ćelijski odgovor na CTH91 je bio jači sa rekognicijom oba CT414 i CT043 (slika 12C). Ovaj T i B ćelijski odgovor je doveo do značajne zaštite 3. dana nakon infekcije kod obe grupe, ali 7. i 10. dana nakon infekcije grupa vakcinisana sa fuzionisanim T i B ćelijskim ciljem (CTH91) je indukovala više nivoe zaštite u poređenju sa CTH88 (slika 12D).

Zaključak

[0145] Bili smo u mogućnosti da fuzionišemo T ćelijske antigene sa repetitivnim VD regionima a da održimo kapacitet indukovanja rane zaštite i, štaviše, ovi konstrukti su indukovali efikasni CMI klirens rezidualnih organizama što je dovelo do visokih nivoa zaštite 7. dana nakon infekcije.

Primer 9: Imunizacija sa koktelom heterolognog VD4 imuno-ponavljača i fuzioni molekul T ćelijskog antigena.

Uvod

[0146] Sledeće smo ispitivali da li imuno-ponavljači mogu biti pomešani sa T ćelijskim antigenima sa vakcinskim potencijalom a i dalje pružati ranu antitelno posredovanu zaštitu protiv Ct kao i efikasni CMI klirens rezidualnih organizama. Stoga smo ispitivali da li možemo pomešati snažan T ćelijski hibrid sastavljen od CT043, dela CT414 i CT681 (CTH93) sa CTH89 (slika 13A) a i dalje održati kapacitet neutralizovanja SvD bakterije in vitro i indukovanja rane zaštite protiv vaginalnog izazova.

Rezultati

[0147] 12 miševa/grupa je imunizovana 3 puta sa 14 dana razmaka između imunizacija. Vakcina (2x5 mg) je emulgirana u CAF01 i administrirana simultano subkutanim (sc) i intranazalnim (i.n) putem (slika 13). Antitela generisana nakon imunizacije sa CTH89 ili smeše CTH89 i CTH93 su snažno rekognizovala VD4 regione (slika 13B) i neutralizovala bakteriju sa sličnih 50% neutralizacionih titra (slika 13C). Viđeni su dosta redukovani nivoi VD4 rekognicije i neutralizacije nakon vakcinacije sa T ćelijskom antigenskom fuzijom (CTH93, slika 13D) iako su ovi molekuli takođe sadržali MOMP (CT681) i stoga potencijalno iste neutralizujuće epitope. Ovaj molekul je takođe dao veoma niske nivoe rekognicije TTLNPTIAG epitopa (podaci nisu prikazani). Ovo jasno naglašava ograničenje rekombinantnog MOMP pune veličine kao vakcinskog antigena za indukciju neutralizujućih antitela kao što je prethodno prijavljeno. Obe CTH89 i koktel CTH89 i CTH93 vakcine su indukovale zaštitu 3. dana nakon infekcije (slika 13E). To je bilo za razliku od CTH93 vakcinisanih miševa koji nisu indukovali značajnu zaštitu 3. dana nakon infekcije. 7. dana nakon infekcije obe vakcine uključujući snažan T ćelijski cilj (CTH93) su indukovale značajan nivo zaštite (slike 13D&E).

Zaključci

[0148] Pomešali smo heterologne VD4 ponavljače sa snažnim T ćelijskim antigenima bez gubitka in vitro neutralizacije i rane in vivo zaštite od serovar D izazova. Štaviše, mešavina B i T ćelijskih ciljeva je indukovala efikasan CMI klirens rezidualnih organizama što je dovelo do visokih nivoa zaštite 7. dana nakon infekcije.

Primer 10: Testiranje dejstva različitih ađuvansnih sistema.

Uvod

[0149] Kako bi ispitali da li je visok odgovor antitela protiv heterolognih imuno-ponavljača viđen samo kada je vakcina administrirana u CAF01 – uporedili smo odgovor antitela i neutralizacioni titar nakon imunizovanja sa CTH527 (SvE VD4<ext>)∗4 u CAF01 ili alum.

Rezultati

[0150] Oba ađuvansna sistema su indukovala visok odgovor antitela protiv površine SvE kada su administrirana zajedno sa CTH527, i antitela iz obe grupe su neutralizovala SvE in vitro (slika 14).

Primer 11: Vakcinacija sa heterolognim imuno-ponavljačima sastavljenim od redukovane dužine VD4<ext>regiona iz SvD, SvE, SvF i SvG.

Uvod

[0151] Sledeće smo uporedili heterologne imuno-ponavljačke konstrukte sastavljene od redukovane dužine VD4 regiona (CTH285 SEK ID BR 69 i CTH286 SEK ID BR 70) sa CTH518 konstruktom (CTH518 SEK ID BR 53)(slika 15A).

Rezultati

[0152] 4 miša/grupa su imunizovana 3 puta sa 14 dana razmaka između imunizacija. Vakcine su emulgirane u CAF01 i administrirane simultano subkutanim (sc, 5mg) i intranazalnim (i.n, 5mg) putem. Splenociti iz 4 miša/grupa su izolovani i ispitivani su T ćelijski odgovori na preklapajuće peptide koji predstavljaju VD4<ext>region (slika 15B) i kapacitet seruma za neutralizovanje serovar D i F infekcije (slika 15C). Viđeni su dosta redukovani nivoi VD4 T ćelijske rekognicije i neutralizacije nakon vakcinacije sa CTH285 gde su VD4<ext>regioni iz različitih serovara redukovani sa 38 aa. CTH286 sa druge strane (svaki VD4<ext>region redukovan sa 24 aa) je indukovalo slične nivoe T ćelijskih odgovora i imalo je isti kapacitet neutralizovanja serovar D infekcije kao CTH518.

Zaključak

[0153] Pokazali smo da smo redukovanjem dužine VD4<ext>regiona sa 38 aa redukovali i T ćelijske odgovore i kapacitet neutralizovanja serovar D i F infekcije.

Primer 12: Vakcinacija sa heterolognim imuno-ponavljačima sastavljenim od produženih VD4<ext>regiona iz SvD, SvE, SvF, SvG, Svla i SvJ.

Uvod

[0154] Sledeće smo ispitivali da li bi povećavanjem dužine VD4<ext>regiona mogli pojačati T ćelijski odgovor na imunoponavljačke konstrukte. Dizajnirali smo dva konstrukta: CTH69 (SEK ID BR 47) i CTH72 (SEK ID BR 48). CTH69 je bilo sličan sa CTH88 ali su VD4<ext>regioni iz SvD, SvE i SvF produženi sa 12aa N-terminalno (slika 16B). CTH72 je takođe sadržao VD1 i VD4<ext>regione iz SvG, Svla i SvJ.

Rezultati

[0155] Miševi su imunizovani 3 puta sa 14 dana razmaka između imunizacija. Vakcine su emulgirane u CAF01 i administrirane simultano subkutanim (sc, 5mg) i intranazalnim (i.n, 5mg) putem. Ispitivani su T ćelijski odgovori na antigen korišćen za imunizaciju i peptidne baze koje predstavljaju VD1 i VD4 regione iz različitih serovara (slika 16). Produžavanje VD4<ext>regiona je indukovalo značajno veći T ćelijski odgovor (> 40.000 pg/ml) u poređenju sa T ćelijskim odgovorom dobijenim sa CTH88 (< 20.000 pg/ml) (slika 16B). Važnije, oba produžena konstrukta i dalje mogu da neutralizuju serovar D infekciju in vitro (slika 16C). Upoređujući zaštitnu efikasnost vakcina, CTH69 i CTH72 su indukovale značajan nivo zaštite 7. dana nakon infekcije što bi moglo biti objašnjeno snažnijim T ćelijskim odgovorom indukovanim sa ovim vakcinama u poređenju sa CTH88 (slika 16D). Zaključak

[0156] Produžavanje VD4<ext>regiona je pojačalo T ćelijski odgovor u poređenju sa CTH88 što je dovelo do pojačane zaštite 7. dana nakon infekcije.

Claims (21)

Patentni zahtevi

1. Polipeptid, za upotrebu kao farmaceutik, obuhvatajući:

a) aminokiselinsku sekvencu koja sadrži jedan ili više površinski izloženih fragmenata istog spoljnomembranskog proteina eksprimiranog u serotipu Chlamydia sp.; i

b) dve ili više dodatnih aminokiselinskih sekvenci što je ili ista sekvenca kao što je definisano pod a) ili su odgovarajući površinski izloženi fragmenti iz varijante pomenutog spoljnomembranskog proteina eksprimiranog u serotipu Chlamydia sp., koji je različit od serotipa pod a);

pri čemu je spoljnomembranski protein MOMP iz bilo kog serotipa i pri čemu polipeptid sadrži jedan ili više varijabilnih domena 1, 2, 3, 4 iz MOMP.

2. Polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, koji sadrži 3 ili više različitih aminokiselinskih sekvenci, gde pomenute aminokiselinske sekvence svaka sadrži jedan ili više površinski izloženih fragmenata iz različitih varijanti istog MOMP koji varira kod različitih Chlamydia sp. serotipova, a pomenute aminokiselinske sekvence su dobijene iz različitih Chlamydia sp. serotipova.

3. Polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, koji sadrži 3 ili više ponavljanja aminokiselinske sekvence, gde pomenuta aminokiselinska sekvenca sadrži jedan ili više površinski izloženih fragmenata istog MOMP koji varira kod različith Chlamydia sp. serotipova, pomenute aminokiselinske sekvence su dobijene iz istog Chlamydia sp. serotipa.

4. Polipeptid za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je spoljnomembranski protein je MOMP iz serotipova D, E, F, G, Ia ili J od Chlamydia trachomatis.

5. Polipeptid za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde su aminokiselinske sekvence linearizovane.

6. Polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 4 ili 5, pri čemu su aminokiselinske sekvence, koje sadrže varijabilne domene 4 (VD4) iz MOMP, postavljene jedna do druge ili su razmaknute sa veznikom.

7. Polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu definisanu u formuli I:

xx1-VD4-xx2(formula I)

pri čemu

VD4 je nezavisno odabran od sekvenci ID BR. 15-20 ili aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 80% sekvencione identičnosti sa ovima

i

xx1se sastoji od

i) aminokiselinske sekvence EWQASLALSYRLNMFTPYIGVKWSRASFDADTIRIAQPK (SEK ID. BR.21) ili

ii) podsekvence aminokiselinske sekvence pod i) pomenuta podsekvenca sadrži 1-38 aminokiselinskih ostataka, počevši sa C-terminal K u aminokiselinskoj sekvenci pod i)

i

xx2se sastoji od

iii) aminokiselinske sekvence DTMQIVSLQLNKMKSRKSCGIAVGTTIVDA (SEK ID BR 22) ili

iv) podsekvence aminokiselinske sekvence pod iii) pomenuta podsekvenca sadrži 1-29 aminokiselinskih ostataka, počevši sa N-terminal D u aminokiselinskoj sekvenci pod iii).

8. Polipeptid za upotrebu prema bilo kod od prethodnih patentnih zahteva, dodatno sobuhvatajući fragment koji sadrži varijabilne domene 1 (VD1) iz MOMP i pri čemu su aminokiselinske sekvence koje sadrže VD1 iz MOMP postavljene jedna do druge ili su razmaknute veznikom.

9. Polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu definisanu u formuli II:

yy1-VD1-yy2(formula II)

pri čemu

VD1 je nezavisno odabran od SEK ID BR. 1-6 ili aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 80% sekvencione identičnosti sa njima

i

yy1se sastoji od

v) aminokiselinske sekvence DAISMRVGYYGDFVFDRVLKTDVNKEFQMG (SEK ID BR 7) ili

vi) podsekvence aminokiselinske sekvence pod v) pomenuta podsekvenca sadrži 1-30 aminokiselinskih ostataka, počevši sa C-terminal G u aminokiselinskoj sekvenci pod v)

i

yy2se sastoji od

vii) aminokiselinske sekvence NPAYGRHMQDAEMFTNAA (SEK ID BR 8) ili

viii) podsekvence aminiokiselinske sekvence pod vii) pomenuta podsekvenca sadrži 1-18 aminokiselinskih ostataka, počevši sa N-terminal N u aminokiselinskoj sekvenci pod vii).

10. Polipeptid za upotrebu prema patentnim zahtevima od 6 do 11, gde su pomenute sekvence odabrane od SEK ID BR 9-14, 23-28, 45-59 ili 69-70.

11. Polipeptid za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, dodatno obuhvatajući fragment koji sadrži varijabine domene 2 (VD2) iz MOMP i pri čemu su aminokiselinske sekvence koje sadrže VD2 iz MOMP postavljene jedna do druge ili su razmaknute veznikom.

12. Polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 11 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu definisanu u formuli III:

zz1-VD2-zz2(formula III)

pri čemu

VD2 je nezavisno odabran od SEK. ID BR. 29-34 ili aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 80% sekvencione identičnosti sa njima,

i

zz1se sastoji od

ix) aminokiselinske sekvence TLGATSGYLKGNSASFNLVGLFG (SEK ID BR 35) ili

x) podsekvence aminokiselinske sekvence pod ix) pomenuta podsekvenca sadrži 1-23 aminokiselinska ostatka, počevši sa C-terminal G u aminokiselinskoj sekvenci pod ix)

i

zz2se sastoji od

xi) aminokiselinske sekvence VVELYTDTTFAWSVGARAALWE (SEK ID BR 36) ili

xii) podsekvence aminokiselinske sekvence pod xi) pomenuta podsekvenca sadrži 1-22 aminokiselinska ostatka, počevši sa N-terminal V u aminokiselinskoj sekvenci pod xi).

13. Polipeptid za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, dodatno sadrži fragment koji sadrži varijabilne domene 3 (VD3) iz MOMP i pri čemu su aminokiselinske sekvence koje sadrže VD3 iz MOMP postavljene jedna do druge ili su razmaknute sa povezivačem.

14. Polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 13 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu definisanu u formuli IV:

qq1-VD3-qq2(formula IV)

pri čemu

VD3 je nezavisno odabran od SEK ID BR 37-42 ili aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 80% sekvencione identičnosti sa njima,

i

qq1se sastoji od

xiii) aminokiselinske sekvence ATLGASFQYAQSKPKVEELNVLCNAAEFTINKPKGYVG (SEK ID BR 43) ili

xiv) podsekvence aminokiselinske sekvence pod xiii) pomenuta podsekvenca sadrži 1-22 aminokiselinska ostatka, počevši sa C-terminal G u aminokiselinskoj sekvenci pod xiii)

i

qq2se sastoji od

xv) aminokiselinske sekvence TGTKDASIDYHEWQASLALSYRLNMFTPYIGVKWS (SEK ID BR 44) ili xvi) podsekvence aminokiselinske sekvence pod xv) pomenuta podsekvenca sadrži 1-35 aminokiselinskih ostataka, počevši sa N-terminal T u aminokiselinskoj sekvenci pod xv).

15. Polipeptid za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, dodatno obuhvatajući funkcionalnu grupu koja olakšava izlaz polipeptida kada je proizveden rekombinantno (na primer, signalni peptidi), i funkcionalna grupa koja olakšava prečišćavanje fuzionog proteina (na primer, his-tag-ova) i/ili funkcionalna grupa koja pojačava imunogenost (na primer, T-ćelijski antigen), pri čemu je pojačivač imunogenosti dodatna T-ćelijska meta koji je odabran od Ct antigena kao što su CT043, CT004,CT414, CT681 ili njihov deo.

16. Polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 15, gde su pomenute sekvenca izabrana od SEK ID BR 60-68.

17. Polipeptid kao što je definisano u bilo kom od prethodnih patentnih zahteva za upotrebu u tretmanu ili profilaksi protiv Chlamydia sp. infekcija, uključujući infekcije sa Chlamydia trachomatis ili C. pneumoniae.

18. Farmaceutska kompozicija koja sadrži polipeptid kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1-16 ili nukleinsku kiselinu koja kodira pomenuti polipeptid, dodatno sadrži ađuvans ili imuni modulator.

19. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 18 pri čemu ađuvans je DDA/TDB ili alum.

20. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 18, pri čemu nosač je virus poput čestice.

21. Farmaecutska kompozicija prema patentnim zahtevima od 18 do 20, za profilaktičku ili terapeutsku upotrebu protiv Chlamydia sp. infekcija, uključujući infekcije sa Chlamydia trachomatis ili C. pneumoniae.