JP2016514713A - クラミジア種(Chlamydiasp.)に対するワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
a)クラミジア種(Chlamydia sp.)の血清型に発現される同じ外膜タンパク質の1つ又は複数の表面露出断片を含むアミノ酸配列;及び
b)a)に定義したのと同じ配列か、又はa)の血清型とは異なるクラミジア種(Chlamydia sp.)の血清型に発現される前記外膜タンパク質の変異型由来の対応する表面露出断片の何れかである2つ以上の別のアミノ酸配列
を含むポリペプチドを開示する。
i)アミノ酸配列EWQASLALSYRLNMFTPYIGVKWSRASFDADTIRIAQPK(配列番号21)、又は
ii)i)のアミノ酸配列のサブ配列であって、1つ又は複数のアミノ酸残基を含むサブ配列
の何れかによって、N末端側でさらにフランキング/伸長することができる。
iii)アミノ酸配列DTMQIVSLQLNKMKSRKSCGIAVGTTIVDA(配列番号22)、
iv)iv)のアミノ酸配列のサブ配列であって、1つ又は複数のアミノ酸残基を含むサブ配列、
又はこれらと80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
によって、さらにフランキング/伸長することができる。
xx1−VD4−xx2(式I)
に定義されるアミノ酸配列を含み、
式中、
VD4は、配列番号15〜20又はこれらと少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、
xx1は、
i)アミノ酸配列
EWQASLALSYRLNMFTPYIGVKWSRASFDADTIRIAQPK(配列番号21)、又は
ii)i)のアミノ酸配列のサブ配列であって、1〜38個のアミノ酸残基を含み、i)のアミノ酸配列においてC末端のKで開始するサブ配列
から構成され、
xx2は、
iii)アミノ酸配列
DTMQIVSLQLNKMKSRKSCGIAVGTTIVDA(配列番号22)
v)iii)のアミノ酸配列のサブ配列であって、1〜29個のアミノ酸残基を含み、iii)のアミノ酸配列においてN末端のDで開始するサブ配列
から構成される。
vi)アミノ酸配列SMRVGYYGDFVFDRVLKTDVNKEFQMG(配列番号7)、又は
vii)v)のアミノ酸配列のサブ配列であって、1つ又は複数のアミノ酸残基を含むサブ配列
の何れかによって、N末端側でさらにフランキング/伸長することができる。
viii)アミノ酸配列NPAYGRHMQDAEMFTNAACMALNIWD(配列番号8)、
ix)x)のアミノ酸配列のサブ配列であって、1つ又は複数のアミノ酸残基を含むサブ配列、
又はこれらと80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
によって、さらにフランキング/伸長することができる。
yy1−VD1−yy2(式II)
に定義されるアミノ酸配列も含み、
式中、
VD1は、配列番号1〜6又はこれらと少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列から独立に選択され、
yy1は、
v)アミノ酸配列DAISMRVGYYGDFVFDRVLKTDVNKEFQMG(配列番号7)、又は
vi)v)のアミノ酸配列のサブ配列であって、1〜30個のアミノ酸残基を含み、v)のアミノ酸配列においてC末端のGで開始するサブ配列
から構成され、
yy2は、
vii)アミノ酸配列NPAYGRHMQDAEMFTNAA(配列番号8)、又は
viii)vii)のアミノ酸配列のサブ配列であって、1〜18個のアミノ酸残基を含み、vii)のアミノ酸配列においてN末端のNで開始するサブ配列
から構成される。
zz1−VD2−zz2(式III)
qq1−VD3−qq2(式IV)
に定義されるアミノ酸配列をそれぞれ含むMOMPの可変ドメイン2(VD2)及び/又は可変ドメイン3(VD3)をさらに含み、
式中、
VD2は、配列番号29〜34又はこれらと少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列から独立に選択され、
zz1は、
ix)アミノ酸配列TLGATSGYLKGNSASFNLVGLFG(配列番号35)、又は
x)ix)のアミノ酸配列のサブ配列であって、1〜23個のアミノ酸残基を含み、ix)のアミノ酸配列においてC末端のGで開始するサブ配列
から構成され、
zz2は、
xi)アミノ酸配列VVELYTDTTFAWSVGARAALWE(配列番号36)、又は
xii)xi)のアミノ酸配列のサブ配列であって、1〜22個のアミノ酸残基を含み、xi)のアミノ酸配列においてN末端のVで開始するサブ配列
から構成され、
また、上記式において、
VD3は、配列番号37〜42又はこれらと少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列から独立に選択され、
qq1は、
xiii)アミノ酸配列
ATLGASFQYAQSKPKVEELNVLCNAAEFTINKPKGYVG(配列番号43)、又は
xiv)xiii)のアミノ酸配列のサブ配列であって、1〜22個のアミノ酸残基を含み、xiii)のアミノ酸配列においてC末端のGで開始するサブ配列
から構成され、
qq2は、
xv)アミノ酸配列TGTKDASIDYHEWQASLALSYRLNMFTPYIGVKWS(配列番号44)、又は
xvi)xv)のアミノ酸配列のサブ配列であって、1〜35個のアミノ酸残基を含み、xv)のアミノ酸配列においてN末端のTで開始するサブ配列
から構成される。
a)異種免疫反復配列を投与することを含む実験セットアップで試験したとき、10−3以下の50%中和力価で、クラミジア・トラコマチス(C.trachomatis)血清亜型Dをin vitroで中和する能力;
b)異種免疫反復配列を投与することを含むマウスモデルで試験したとき、感染から7日後に、マウスの少なくとも50%において、クラミジア・トラコマチス(C.trachomatis)血清亜型Dをin vivoで中和する能力;
c)異種免疫反復配列を投与したとき、免疫応答をクラミジア・トラコマチス(C.trachomatis)の複数の血清亜型にin vitroで拡大する能力。
La1−Aa2−Aa1−Aa3−La2
のように定義されるアミノ酸配列として表すことができ、
上記式中、
Aa1は、アミノ酸配列TTLNPTIAG(全ての血清亜型について保存されている)から構成され;Aa2は、以下:SATAIFDT(血清亜型D及びE由来)、LVTPVVDI(血清型亜F)、LAKPVVDI(血清亜型G)及びLAEAILDV(血清亜型Ia及びJ)からなる群から選択される。
外膜タンパク質
クラミジア種(Chlamydia sp.)の外膜タンパク質は、2%Sarkosylなどのデタージェントで、インタクトな精製済み基本小体(elementary body)を処理した後、超遠心分離(100,000gで1時間)に付すことによって単離することができ、これにより、細胞質ゾル成分を含む上清と、以前記載されている70外膜タンパク質を含有するペレットが得られる。次に、外膜タンパク質を、標準的タンパク質技術、例えば、SDS−PAGE後の質量分析により同定することができる。
細菌表面露出又は外膜タンパク質は、膜貫通タンパク質、分泌及びリポタンパク質、並びにアンカーを欠く表面タンパク質を含む。インタクトな細菌上の表面露出領域は、抗体に接触可能である。タンパク質の表面露出領域(「サーフェソーム(surfaceome)」を同定する方法は、例えば、インタクトな細菌の膜タンパク質のビオチン化の後、ストレプトアビジンを用いてビオチン標識画分を単離するステップを含む。次に、単離したタンパク質を質量分析により同定することができる。別の手法は、プロテアーゼ、例えば、トリプシンでインタクトな細菌を処理(「シェービング(shaving)」)して、表面露出ペプチドを切断した後、放出されたペプチドを収集して、質量分析による同定に付すものである。
本明細書に提供する外膜タンパク質の変異型は、クラミジア種(Chlamydia sp.)の様々な血清型由来の同じ遺伝子によってコードされるタンパク質を表す。変異型タンパク質は、参照ポリペプチドと有意な相同性を有する。
本出願に関連して、タンパク質の「アイソフォーム」は、同じタンパク質のいくつかの異なる形態の何れか、例えば、同じ機能を有するが、異なる遺伝子によりコード化され、その配列に小さな相違を有し得るタンパク質、又は単一のヌクレオチド多型、mRNAの差次的スプライシング、若しくは翻訳後修飾の何れかから生成するタンパク質として理解される。異なる血清型の細菌は、特定のタンパク質の異なるアイソフォームを有することができる。
「クラミジア(Chlamydia)種」という用語は、動物又はヒトにおいてクラミジア(Chlamydia)感染症を引き起こすことができる細菌として理解される。例として、クラミジア・トラコマチス(C.trachomatis)、肺炎クラミジア(C.pneumoniae)及びクラミジア・ムリダルム(C.muridarum)がある。また、動物においては、クラミジア種(Chlamydia sp.)によるいくつかの感染症が知られており、例えば、ブタに感染するクラミジア・スイス(Chlamydia Suis)、及び小型反芻動物(ヒツジ及びヤギ)の流産を引き起こすヒツジ流行性流産クラミジア(Chlamydiaphila abortus)などがある。
MOMP可変領域に対する特異的モノクローナル抗体の反応性及びその詳細な配列分析に基づき、Ctは、15の異なる血清変異型に区分することができ、これらの血清変異型のうち、A、B、Ba及びCは、トラコーマを引き起こし、D〜Kは、性行為感染症(STD)、L1〜L3は、性病性リンパ肉芽腫を引き起こし、MoPn(クラミジア・ムリダルム(C.muridarum))はマウスに感染する。血清変異型は、同じ意味で、血清型亜型又は血清型と記述される場合もある。
免疫反復配列は、抗原の免疫原性部分又は断片を含む1つ又は複数のアミノ酸配列の反復単位として理解される。反復される単位は、反復される1つ又は複数のVD領域として表すことができ、これらは任意選択で、前述のように、伸長することができ、例えば、3つの反復単位を含む4つの例が挙げられる:VD4−VD4−VD4、VD4−VD1−VD4−VD1−VD4−VD1、VD4D−VD4D−VD4D、VD4D−VD4F−VD4G、VD4D−VD3E−VD4D−VD3E−VD4D−VD3E。
1つの血清変異型のみに由来する抗原の免疫原性部分又は断片を含む1つ又は複数のアミノ酸配列の反復単位(図4)。
異なる血清変異型に由来する同じ抗原をコード化する免疫原性部分又は断片を含む1つ又は複数のアミノ酸配列の反復単位(図4)。
ワクチン接種に用いられるタンパク質が、攻撃に用いられる血清変異型とは異なる細菌血清変異型に由来する、状況を指す。
ワクチン接種に用いられるタンパク質が、攻撃に用いられる血清変異型と同じ細菌血清変異型に由来する、状況を指す。
Ctの主要外膜タンパク質(MOMP)は、Ctの発生周期の全段階中に発現され、クラミジア(Chlamydia)外膜の全タンパク質の約60%を占める。MOMPは、4つの高可変ドメイン(VD1−4又はVS1−4)により分断される保存ドメインに区分することができる59(図1)。
アミノ酸91〜105に対応し、Ct由来のMOMPにおいて高可変領域を構成する、Baer et al(1988)36により定義されるMOMPの可変ドメイン1(VD1)(それぞれ、SvD、E、F、F、Ia及びJ由来の配列番号1〜6VD1)。伸長VD1領域(VD1ext)は、配列番号57〜115に対応し、Ct由来のMOMPにおいて高保存領域によりフランキングされる前記高可変領域を構成する(それぞれ、SvD、E、F、F、Ia及びJ由来の配列番号9〜14VD1ext)(図3)。
アミノ酸309〜338に対応し、Ct由来のMOMP中の高可変領域を構成する、Baer et al(1988)36により定義されるMOMPの可変ドメイン4(それぞれ、SvD、E、F、F、Ia及びJ由来の配列番号15〜20のVD)。伸長VD4領域(VD4ext)は、配列番号282〜349に対応し、Ct由来のMOMP中の高保存領域によってフランキングされる前記高可変領域を構成する(それぞれ、SvD、E、F、F、Ia及びJ由来の配列番号23〜28のVD4ext)。
本発明において「直線化」という用語は、完全長タンパク質、オリゴペプチド、短いペプチド及びそれらの断片を含む、任意の長さのアミノ酸鎖を指し、この場合、前記アミノ酸システインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成するのを妨げるために、セリンで置換されている。
本発明で使用する中和エピトープは、抗体が結合する抗原決定基を規定し、感染の状況において、例えば、細菌の感染症及び疾患を定着する上で重要な宿主細胞と細菌の相互作用を阻止して、細菌のクリアランスを促進することにより、クラミジア(Chlamydia)負荷の感染力を低減するアミノ酸配列を意図する。
中和は、細菌が、感染症を定着させる、又は疾患若しくはその症状を引き起こす効率若しくは能力の低下、クラミジア(Chlamydia)EB形成の阻害などの細菌の任意の生物活性を包含する。
前述したように中和抗体に結合する抗体。
本発明において「ポリペプチド」という用語は、その通常の意味を有するものとする。すなわち、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結される、任意の長さのアミノ酸鎖であり、完全長タンパク質、オリゴペプチド、短いペプチド及びこれらの断片などを含む。
「IFN−γ」という用語は、インターフェロン−ガンマであると理解される。IFN−γの測定は、免疫学的T細胞応答の指標として用いられる。
本明細書の全体を通して、文脈から別の意味に解釈すべき場合を除き、「含む(comprise)」という用語、又は「含む(comprises)」若しくは「含んでいる(comprising)」などの変形は、記載された要素若しくは整数、又は要素若しくは整数の群の包含を意味するが、何れか他の要素若しくは整数、又は要素若しくは整数の群の除外を意味するわけではないことは理解されよう。
本発明の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、B細胞又はT細胞のエピトープなどのポリペプチドの免疫原性部分又は断片を含む。
免疫原性ポリペプチドは、現在又は過去にクラミジア(Chlamydia)に感染した生物学的サンプル又は個体において免疫応答を誘導するポリペプチドとして定義される。
融合タンパク質は、共有結合により互いに連結した2つ又は複数のポリペプチドと理解される。融合タンパク質は、ポリペプチドの優れた特徴を備えて生産することができる。例えば、組み換えにより生産する場合、融合タンパク質の輸送を促進する融合パートナー(例えば、シグナルペプチド)、融合タンパク質の精製を促進する融合パートナー(例えば、hisタグ)、融合タンパク質の免疫原性を増強する融合パートナーはすべて興味深い候補である。免疫原性を増強するために、融合パートナーは、クラミジア・トラコマチス(C.trachomatis)由来の別のポリペプチド、例えば、ポリペプチド、ポリペプチド断片又は少なくとも1つのT細胞エピトープ若しくはB細胞エピトープであってもよい。
医薬組成物は、任意のワクチン(治療及び予防の両方)又は任意の診断試薬として定義される。
本発明の別の部分は、融合タンパク質又は本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含むワクチンに関する。こうしたワクチン組成物の最適な機能を確実にするために、免疫学的及び薬学的に許容される担体、ビヒクル若しくはアジュバントを含むことが好ましい。
本発明はまた、D.Lowry(Lowry et al 1999)により例示される文献に記載されているように、治療ワクチンとして使用するための、本発明のポリペプチド又は核酸の使用にも関する。治療的特性を有する抗原は、ワクチンとして投与したとき、実験動物におけるCt感染症の重症度を軽減するか、又は過去の感染の再活性化を阻止するその能力に基づいてみいだすことができる。治療ワクチンに用いる組成物は、前述したように、ワクチン用に調製することができる。
クラミジア・トラコマチス(C.trachomatis)の培養
Ct血清亜型D、E及びFをHela229細胞において増殖させた(ATCC、Rockville,MD,USA)。5%ウシ胎児血清(Gibco BRL;熱不活性化)、1%v/vHepes、1%v/vL−グルタミン、1%v/vピルビン酸塩及び10μg/mlゲンタマイシンを含有するRPMI 1640(Gibco BRL,Grand Island,NY,USA)培地中で、細胞を培養した。6ウェルプレート中のHela229細胞の半密集単層を、0.3ml SPG緩衝液/ウェル中のCt血清亜型E又はFの、細胞当たり1.5封入体形成単位で感染させた。プレートを、Heraeus Multifuge 3Sにより750gで1時間遠心分離した後、プレートロッカー上で、35℃で2時間インキュベートした。2時間後、5%グルコース及び1μg/mlシクロヘキシミドを補充した2mlの培地をウェル毎に添加し、加湿空気中5%CO2の雰囲気において37℃で72時間さらにインキュベートした。
感染から72時間後にクラミジア(Chlamydia)を回収した。セルスクレイパーを用いて、細胞をウェルから取り出し、35.000g及び4℃で30分遠心分離した。ペレットをHBSS中に再懸濁させ、氷上で音波処理した後、500g及び4℃で15分遠心分離した。上澄みを回収し、氷上に取っておき、前と同じ量までペレットを再懸濁させ、音波処理及び遠心分離を繰り返した。2つの上清をプールし、30000g及び4℃で30分間遠心分離した後、注射器を用いて、ペレットをSPG緩衝液(3ml/プレート)に再懸濁させた。短時間の音波処理後、懸濁液を30%ジアトリゾエート溶液(76mlのH2O中50gのメグルミンジアトリゾエート、7.7gのナトリウムジアトリゾエート)上に穏やかに重ねた後、40,000gで30分間遠心分離した。遠心分離後、ペレットをSPG緩衝液中に再懸濁させた後、−70℃で保存した。McCoy細胞上での滴定により、バッチのIFUを定量し、BCAによりバッチの濃度を決定した。
クラミジア・トラコマチス(C.trachomatis)血清亜型D、E、F及びGのゲノムは一般に入手可能である(NCBI−GenBank)。全て、大腸菌(E.coli)タンパク質発現系へのクローニングのために合成により得られた、クラミジア・トラコマチス(C.trachomatis)抗原及び融合物をコードする遺伝子(DNA2.0)。pET411ベクターは、ヒスチジンアフィニティタグを用いた、大腸菌(E.coli)における組み換えクラミジア・トラコマチス(C.trachomatis)タンパク質の発現に使用した。細菌宿主は、BL21−STAR(商標)であった。対数期OD600〜0.5に到達するまで、大腸菌(E.coli)を37℃で増殖させてから、タンパク質発現を4時間にわたって誘導した後、細胞を遠心分離(6,000gで15分間)により回収した。ベンゾナーゼ、rLysozyme及びプロテアーゼ阻害剤カクテルI(Calbiochem)を含有するBugbuster(Novagen)を用いて、大腸菌(E.coli)を単離した。封入体を遠心分離(10,000gで10分間)により分離した。ペレットを、50mM NaH2PO4、0.4M NaCl、8M尿素、10mMイミダゾール、pH7.5中に溶解させてから、HisTrap HPカラム(Amersham Biosciences)上にロードした後、50〜500mMイミダゾールの勾配を適用することによって、結合タンパク質を溶離した。抗原及び融合物の等電点に応じて、これらをイオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。BCAタンパク質アッセイ(Pierce)により、タンパク質濃度を決定した。
8〜12週齢のメスB6C3F1マウスをHarlan Laboratoriesから取得した。動物は、標準的な環境条件下で収容し、標準的飼料及び水を不断給餌した。マウスの使用は、デンマーク法務省(Danish Ministry of Justice)(Lov om dyreforsog,jvf lovbekendelser nr.726 af9.1993年9月)、及び動物保護委員会により規定される規則に従う。実験の詳細な説明は、本出願人が開催する地域倫理審査委員会(regional ethical review board)に提出し、承認された(2012−15−2934−00100)。
マウスは、14日おきに3回免疫した。ポリペプチドをCAF01中で乳化させた後、皮下(sc)及び鼻内(i.n.)経路により同時に投与した。両ルートにより投与されたワクチンは、250ugのDDA及び100ugのTDB中で乳化させた5ugのペプチド(前掲参照)から構成された。負の対照として、ペプチドを含まないDDA/TDBを単独で注射した。
血液リンパ球及び脾細胞を精製した。血液リンパ球は、各群の8匹からプールし、脾細胞は、個別に(n=4)培養し、培養は、5×10−5 M 2−メルカプトエタノール、1mMグルタミン、1%ピルビン酸塩、1%ペニシリン−ストレプトマイシン、1%HEPES及び10%ウシ胎児血清(FCS)(Invitrogen,Denmark)を補充した200μlの量のRPMI−1640に2×105細胞/ウェルを含有する丸底マイクロプレート(Nunc,Denmark)において3回繰り返した。1〜10μg/mlの個別の抗原又はVD1及びVD4ペプチドプール(各々2μg/mlのペプチド)で細胞を再刺激した。細胞生存能の正の対照及び負の対照として、それぞれConcanavalin A(5μg/ml)又は培地による刺激。5%CO2中で、37℃で72時間のインキュベーション後、上清を回収し、使用まで−20℃で保存した。分泌したIFN−γの量を酵素免疫吸着測定法(ELISA)により決定した。
最後のワクチン接種から様々な時点で、マウスから採血し、血清を遠心分離により単離した。血清を、Ct表面(SvD、SvE及びSvF)に対する、SvE VD4単量体に対する、並びにSvD、SvE及びSvFのVD4領域にまたがるペプチド(表4及び5)に対する反応性について、ELISAにより試験した。手短には、プレートを炭酸塩緩衝液中の4℃の抗原(1〜10ug/ml)で一晩被覆し、BSAでブロックした後、洗浄した。次に、プレートを、前希釈したサンプルと一緒に4℃で一晩インキュベートし、洗浄した後、ペルオキシダーゼ結合二次抗体と一緒に1時間インキュベートした。TMB基質とのインキュベーションにより反応物を視覚化してから、反応を硫酸で停止し、450nmで読み取りをした。SvD(SvE)(表6)及びSvF(表7)のVD4領域にまたがる9量体オーバーラップペプチドパネルに対するELISA反応性を調べた際、微細な変更を実施した。手短には、プレートをストレプトアビジンで処理してから、ビオチニル化ペプチドで被覆し、脱脂粉乳を用いて室温で2時間ブロックした後、洗浄した。次に、プレートを、前希釈した(1:100)血清サンプルと一緒に室温で2時間インキュベートし、洗浄した後、ペルオキシダーゼ結合二次抗体と一緒に1時間インキュベートした。TMB基質とのインキュベーションにより反応物を視覚化してから、反応を硫酸で停止し、450nmで読み取りをした。
5%ウシ胎児血清(Gibco BRL;熱で不活性化)、1%v/vHepes、1%v/vL−グルタミン、1%v/vピロビン酸塩及び10μg/mlゲンタマイシンで補充したRPMI1640培地中で、96ウェル平底マイクロプレートにおいて、HaK細胞を密集まで増殖させた。
Ct血清亜型D攻撃の10日及び3日前に、2.5mgのメドロキシプロゲステロンアセタト(Medroxyprogesteronacetat)(Depo−Provera;Pfizer)の注射により、発情周期を合わせた。最終ワクチン接種から6週間後に、10μlのSPG緩衝液中の4〜8×105IFUのCt血清亜型Dで、マウスをi.vag攻撃した。感染から3、7、10及び14日後、膣スワブを取得した。スワブを、0.6mlのSPG緩衝液中でガラスビーズと一緒にボルテックスした後、−80℃で分析まで保存した。17に記載されているように、感染負荷を決定した。手短には、McCoy細胞単層を滴定量のスワブ懸濁液で、2回繰り返して感染させた。プレートを750×gで、RTにて1時間遠心分離した後、35℃で2時間のインキュベーションを実施した。続いて、感染培地を新鮮な培地に取り換え、細胞を37℃で30時間インキュベートした。本発明者らの研究室で作製したポリクローナルウサギ抗CT681血清、続いてFITC結合ブタ抗ウサギ免疫Ig(Dako,Glostrup,Denmark)で染色することにより、封入体を視覚化した。バックグラウンド染色は、ヨウ化プロピジウム(Invitrogen,Taastrup,Denmark)で実施した。各ウェルについて少なくとも20の個別の視野を観察する蛍光顕微鏡検査により、封入体を数え上げた。
モノクローナル抗マウスCD4(クローンGK1.5)及び抗マウスCD8(クローンYTS156及びYTS169、Sephen Gobboldから無償提供)78,79を、HiTrapタンパク質G HPカラム(GE−Healthcare Life Sciences,Denmark)を用いて、本発明者らの研究室で作製したハイブリドーマ上清から精製した。精製済みIgGをPBSに対して透析し、0.22umを通してろ過した後、タンパク質濃度をOD280nmにより決定した。感染日から−7、−4、−1及び+2及び+6日に、250〜300μgの精製済み抗CD4又は抗CD8抗体の混合物の4回の注射により、マウスからCD4+又はCD8+T細胞を欠失させた。FITC結合抗CD4抗体(クローンRM4−4)及びPE−結合抗CD8抗体(クローン53−6)(BD Biosicence,Denmark)を用いて、感染から1日後に、PBMCでのFACS分析により、CD4+及び抗CD8+T細胞の欠失を確認した。
クラミジア(Chlamydia)血清亜型Dストックを滴定した後、8×104IFU/μlまで希釈し、異種VD4免疫反復SvD−SvE−SvF(CTH89)で免疫したマウスから単離した血清と混合した。Ct血清亜型D攻撃の10及び3日前に、2.5mgのメドロキシプロゲステロンアセタト(Medroxyprogesteronacetat)(Depo−Provera;Pfizer)の注射により、発情周期を合わせた。10μlの前記混合物(4×105IFUのCt血清亜型D)で、マウスをi.vag攻撃した。感染から3、7及び10日後、膣スワブを取得した。
GraphPad Prism 4を用いて統計的解析を実施した。クラスカル・ワリス(Kruskal−Wallis)、次にダンポストテスト(Dunn’s post test)又はマン・ホイットニー(Mann−Whitney)を用いて、膣クラミジア(Chlamydia)負荷の中央値を解析した。
序論
この場合、本発明者らは、血清亜型Eの伸長VD4断片を含むポリペプチド単位(配列については、図2を参照)(SvE VD4ext)を選択した。これらのドメインに対する免疫応答を増強するために、本発明者らは、SvE VD4ext単位が、反復して提示される、組み換えポリペプチドを設計した。本構築物の反復形態が、単量体形態と比較して、抗体応答を増強することができるかどうかを調べるために、本発明者らは、これらの単位が、単一単位として、又は反復方式の何れかで提示される組み換えポリペプチドを設計した。血清亜型E(SvE)の場合、単量体(SvE VD4ext)*1(CTH181)、伸長VD4単位の4免疫反復配列(SvE VD4ext)*4(CTH527)及び8免疫反復配列(SvE VD4ext)*8(CTH526)を構築した。これらの免疫反復構築物は、アジュバントCAF01を用いて製剤化した後、マウスをワクチン接種するのに用いた。各マウスは、2×5μgのペプチドでワクチン接種し、従って、VD4の量は同じである。構築物の免疫原性を、SvE VD4ext、SvE VD4extを包含するペプチド、及びクラミジア(Chlamydia)の細菌表面に対して、ELISAにより試験した。
群当たり6匹のマウスに、14日の間隔を置いて2回免疫した。ワクチン(2×5μg)をCAF01中で乳化した後、sc.及びi.n経路により同時に投与した。最後のワクチン接種から特定の時点で、血液を採取して、SvE由来の伸長VD4に対する、及びSvEの細菌表面に対する、抗体レベルをELISAにより測定した。単一VD4ext単位によるワクチン接種(単量体VD4ext、CTH181)は、(SvE VD4ext)*4の4VD4ext反復配列から構成される相同性免疫反復により誘導されるレベルと比較して、低いレベルのVD4ext特異的抗体を誘導した(図5A)。(SvE VD4ext)*4で免疫した後に認められるより高い抗体応答は、(SvE VD4ext)*1で免疫したマウスから単離した血清と比較して、より強度の細菌表面の認識をもたらした(図5B)。伸長VD4領域にまたがる10aaオーバーラップを有する20量体ペプチドに対する応答もまた、1:500血清希釈度で試験したとき、単量体VD4ext単位で免疫したマウスの群と比較して、増強され、(VD4ext)*4相同性免疫反復配列群に、より広範なエピトープ認識パターンをもたらした(図5C)。単量体構築物で免疫した群では、応答は、TTLNPTIAGエピトープを含有する中央領域に排他的にターゲティングされるのに対し、そのエピトープの上流及び下流の両方で相同性免疫反復配列に暴露される複数のB細胞エピトープによる免疫は、様々なエピトープの多様なエピトープ認識パターンをもたらした。本発明者らは、引き続き、8(SvE VD4ext)*8(CTH526、配列番号30)の免疫反復配列が、4(SvE VD4ext)*4より免疫原性であるかどうかを調べた。2つの構築物は、伸長VD4単位及びSvEの細菌表面に対して同様のレベルの抗体を誘導した。
本発明者らは、血清亜型E由来の伸長VD4単位の免疫反復で免疫することによって、力価(図5A及びB)、並びに伸長VD4単位に対して指令される応答の範囲(図5C)の両方として測定される抗体応答を大幅に増強することができ、細菌表面対して強力な反応性をもたらすことができる。反復単位の数を4から8に増加することによる抗体力価及び中和力価の増大は認められなかった。
本発明者らは、SvD、SvE,SvF及びSvG由来の伸長VD4単位から構成される異種免疫反復配列(CTH518)による免疫が、強力な免疫原性を維持すると共に、SvF(SvF VD4ext)*4由来の伸長VD4単位から構成される相同性免疫反復配列(CTH529)による免疫と比較して、複数の血清亜型の表面を認識する、より広範な抗体応答を誘導することができるかどうかを調べた。これらの免疫反復構築物は、アジュバントCAF01で製剤化して、マウスをワクチン接種するのに用いた。上記構築物の免疫原性は、血清亜型D、E及びFの細菌表面に対してELISAにより試験した。
異種免疫反復配列は、SvF由来の相同性免疫反復配列について認められた応答と同じ高レベルで、血清亜型F株の表面を認識する抗体応答を促進した。しかし、4つの血清亜型(SvD、SvE,SvF、SvG)由来の伸長VD4領域を含有する異種免疫反復配列での免疫によって、本発明者らは、血清亜型F由来の相同性免疫反復配列と比較して、D及びE血清亜型に対する顕著に増加した力価を観測した。
異種伸長VD4の免疫反復配列から構成される構築物による免疫は、異種免疫反復配列の顕著な免疫原性を維持しながら、複数の血清亜型(D、E及びF)の表面を認識する、より広範な応答を誘導した。
本発明者らは、血清亜型E(SvEextVD4)*4(CTH527)、SvF(SvFextVD4)*4反復単位(CTH524)及びA8−VD4ペプチド由来の伸長VD4領域から構成される相同性免疫反復配列による免疫と比較して、SvD、SvE、SvF由来の伸長VD4ドメインからなる異種免疫反復配列(CTH89)による免疫後の免疫応答の特異性を調べた。これらの構築物は、アジュバントCAF01で製剤化して、マウスをワクチン接種するのに用いた。構築物の免疫原性は、D、E及びFのVD4領域にまたがるペプチドパネル(長さ9及び20AA)に対してELISAにより試験した(表4〜7)。血清(6〜8匹のマウス)を試験し、バックグラウンドを上回るが、OD=1.0に満たない応答は、白いボックスで、1.0を超える応答は、塗りつぶしたボックスで示す。ボックスの長さは抗体により認識された区域を示す。
全ての構築物が、可変ドメイン(VD)内に位置するVD4extの保存TTLNPTIAG部分に対する高い抗体応答を誘導した。一般に、相同性免疫反復配列により生成された抗体は、その代表的相同性VD4ext領域を認識するのに優れていたが、これらの構築物を、異なる血清亜型由来のVD4extを包含するペプチドに対して試験したところ、そのエピトープ認識は、例えば、構築物(SvFextVD4)*4で免疫した動物からの血清による血清亜型E VD4領域の認識(逆の場合も同じ)のように、限定された(図7B及びC)。異種免疫反復配列(CTH89)による免疫後に生成された抗体は、相同性免疫反復配列及びA8−VD4で免疫した動物からの血清より、はるかに広範なエピトープレパトアを認識した(7A、B、C及びD)。この構築物は、相同性免疫反復配列での免疫により達成されたものと同レベル(又はより高レベル)で、血清亜型E及びFの両方を包含するエピトープレパトアをカバーすることができた。
異種伸長VD4の免疫反復配列による免疫は、VD4領域の保存及び血清亜型特異的部分の両方を認識する、広範な応答を誘導したが、これは、より広範な中和エピトープのレパトアに変換される。
VD4反復単位によるワクチン接種後に認められた早期防御の原因であるエフェクター機構を調べるために、CTH89でワクチン接種したマウスから、攻撃の前に、T細胞を欠失させた後、欠失及び非欠失マウスにおいて早期防御を誘導する能力を比較した。
群当たり8匹のマウスを、14日おきに3回免疫した。ワクチン(2×5μg)をCAF01中で乳化した後、sc.及びi.n経路により同時に投与した。最後のワクチン接種から特定の時点で、マウスから採血して、クラミジア(Chlamydia)に対する抗体応答、中和力価、並びにT細胞欠失有り無しの場合のin vivo防御を測定した。T細胞サブセットの欠失は、CTH89に対するT細胞応答を排除した(図8A)。CTH89は、血清亜型Dの表面を認識する(図8C)強力な抗体応答を誘導し(図8B)、約1:103の50%中和力価で、細菌をin vitroで中和することができた(図8D)。しかし、本発明者らは、T細胞欠失マウスでの攻撃から3日後に有意な防御を認めた(図8E)が、これは、クラミジア(Chlamydia)に対する早期防御において、VD4単位を認識する抗体応答のin vivoでの役割を示唆している。最後に、本発明者らは、CTH89血清が、SvDで得られたレベルの非常に高い50%中和力価で、SvE及びSvF感染を中和することもできたことを立証した(図8D)。
免疫反復配列は、血清亜型Dによる膣攻撃に対するT細胞非依存性早期防御を生み出すが、これは、VD4特異的抗体のin vivoでの役割を示唆するものである。
序論
in vitro中和を、in vivoでの血清により媒介される防御作用に変換することができるかどうかを調べるために、本発明者らは、続いて、CTH89免疫後に生成された抗体が、ナイーブマウスからの血清と比較して、in vivoで感染を中和/阻害することができるかどうかを調べた。
SvD細菌を、CTH89免疫マウスから単離した血清又はナイーブマウスから単離した血清と混合した。次に、デプロプロベラ(Depro−Provera)処理マウスを4×105細菌で感染させた。CTH89血清をコーティングしたSvDで感染させたマウスは、ナイーブ血清をコーティングしたSVDで攻撃したマウスと比較して、細菌感染を効率的に制御した。7及び10目日に、対照群のそれぞれ2及び3匹に対し、8匹のマウスのうち6匹が浄化された(図9)。
異種VD4免疫反復配列による免疫後に生成された血清は、ナイーブマウスから単離された血清と比較して、SvDによるマウスの感染を効率的に阻止する。
序論
MOMPは、体液性及び細胞性免疫応答の両方の標的であるが、中和抗体の生成及び感染の防御において再生ネイティブMOMPは比較的成功している54,56にもかかわらず、組み換えMOMP(rMOMP)を基材とする実験的ワクチンは失敗している。本発明者らは、全ての可変ドメインを含む、アミノ酸56〜349の組み換えMOMP(CTH521)を設計した。また、本発明者らは、血清亜型D、E、F及びGの伸長VD4断片を含有するポリペプチド単位(MOMPのVD4可変ドメイン及び隣接する保存フランキング領域を包含する)(CTH518)も選択した。最後に、CTH521をCTH518と融合させたハイブリッド(CT522)も構築した(図10)。
群当たり8匹のマウスを、14日おきに3回免疫した。ワクチンをCAF01中で乳化した後、sc.(5μg)及びi.n.(5μg)経路により同時に投与した。ワクチン接種後に、血液サンプルを採取して、VD4ext単位、組み換えMOMPに対する抗体、及び細菌表面に対する抗体を測定した。CT522及びCT518による免疫後に生成された抗体は、CT521免疫後に単離した血清と比較して、はるかに高いレベルで、VD4領域(図10A)及び細菌表面(図10C)を認識した。さらに、CTH518及びCTH522由来の抗体は、同じレベルで、また、CT521よりはるかに高いレベルで、SvD感染を中和することができた(図10D)。
組み換えMOMPと異種伸長VD4の免疫反復配列との融合により、免疫反復配列単独と同じ機能性抗体を誘発する分子が得られる。
序論
本発明者らは、次に、別のVD領域を伸長VD4領域に融合させて、中和抗体を誘導する能力を依然として維持できるかどうかを調べた。従って、VD1領域の伸長形態を伸長VD4領域に結合した構築物を設計した。本発明者らは、SvD由来のVD1及びVD4の伸長単位からなる相同性単位(CTH87)と、異なる血清亜型(D、E及びF;CTH88)由来のVD1及びVD4の伸長単位からなる異種免疫反復配列の両方を作製した。
群当たり12匹のマウスを、14日おきに3回免疫した。ワクチンをCAF01中で乳化した後、sc.(5μg)及びi.n.(5μg)経路により同時に投与した。CTH87で免疫したマウスからの抗体は、SvD、SvE及びSvFの何れの細菌表面も認識し(図11A);最も高い力価は、相同性SvD株に対して、最も低い力価は、最も遠位のSvFに対して得られた。異種VD1ext−VD4ext単位の免疫反復配列での免疫の結果、単量体構築物と比較し、細菌の表面に対して有意に高いレベルの抗体が生成されるとともに、応答の範囲が広がり、これによって、力価が、SvD及びSvEに対して6から12倍、SvFに対してほぼ25倍増加した(図11A)。1:2000の中和力価を有する異種VD1−VD4免疫反復配列構築物と比較して、血清亜型D由来の単量体VD1ext−VD4ext構築物で免疫した動物からの血清は、ごくわずかな中和力価しか呈示しなかったことから、in vitro中和アッセイにおいて感染を中和するこれらの抗体の能力は、さらに向上した(図11B)。最後に、異種VD1ext−VD4ext免疫反復配列構築物によるワクチン接種は、膣攻撃モデルにおいてSvD攻撃から非常に効率的に防御した(図11C)。
本発明者らは、血清亜型D、E及びF由来の異種VD1ext−VD4ext単位の免疫反復配列での免疫により、これら3つの免疫変異体全ての細菌表面に対して指令される抗体応答を大幅に増強できることを立証した。重要なことには、本発明者らは、異種免疫反復配列でのワクチン接種によって、血清亜型F表面認識のより高い選択的増大(血清亜型D及びEの6〜12倍に対して25倍)が認められることも明らかにし、これは、異種免疫反復配列が、共有エピトープに対してだけではなく、血清亜型F特異的エピトープに対しても抗体レベルを増大することを示唆している。本発明者らは、ScD由来の単一VD1−VD4単位(CTH87)と比較して、異種VD1−VD4の免疫反復配列(CTH88)で誘導された抗体は、早期in vivo防御をもたらすin vitro中和力価を生み出したことを立証した(図11C)。
序論
クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)に対する効率的な防御免疫応答において、CMI成分が必要であることは一般に認識されているため、本発明者らは、次に、異種免疫反復配列を、ワクチンの可能性を有するT細胞抗原に融合できるかどうかを調べた。本発明者らの目的は、Ctに対する早期抗体媒介性防御と、残留生物の効率的CMI媒介クリアランスの両方を提供することであった。CT043と、CT414及びCT681の一部から構成される構築物を異種VD1−VD4の免疫反復配列(CTH91)に融合した。
群当たり12匹のマウスを、14日おきに3回免疫した。ワクチン(2×5μg)をCAF01中で乳化した後、sc.及びi.n経路により同時に投与した。最後のワクチン接種から特定の時点で、マウスから採血して、抗体応答及び中和力価を測定した。CTH91及びCTH88による免疫後に生成された抗体は、同様のレベルでVD4ext領域を認識し(図12A)、両群から単離した血清は、SvD感染を中和することができた(図12B)。CTH88で免疫したマウスと比較して、CTH91に対するT細胞応答は、CT414及びCT043の何れの認識についても、より強力であった(図12C)。このT及びB細胞応答によって、両群の感染から3日後、有意な防御が起こったが、感染から7及び10日後では、融合したT及びB細胞標的(CTH91)でワクチン接種した群は、CTH88と比較して、より高レベルの防御を誘導した(図12D)。
本発明者らは、T細胞抗原を反復VD領域と融合させて、早期防御を誘導する能力を依然として維持することができた。さらに、これらの構築物は、残留生物の効率的なCMI媒介性クリアランスを誘導し、感染から7日後に高レベルの防御を達成した。
序論
次に、本発明者らは、免疫反復配列を、ワクチンの可能性を有するT細胞抗原に融合して、Ctに対する早期抗体媒介性防御と、残留生物の効率的なCMI媒介性クリアランスの両方を依然としてもたらすことができるかどうかを調べた。従って、本発明者らは、CT043と、CT414の一部及びCT681から構成される強力なT細胞ハイブリッド(CTH93)をCTH89と混合して(図13A)、SvD細菌をin vitroで中和するとともに、膣攻撃に対する早期防御を誘導する能力を依然として維持することができるかどうかを調べた。
群当たり12匹のマウスを、14日おきに3回免疫した。ワクチン(2×5μg)をCAF01中で乳化した後、皮下(sc)及び鼻内(i.n)経路により同時に投与した(図13)。CTH89又はCTH89とCTH93との混合物による免疫後に生成された抗体は、VD4領域を強度に認識し(図13B)、同様の50%中和力価で細菌を中和した(図13C)。T細胞抗原融合物(CTH93、図13D)による免疫後、この分子も、MOMP(CT681)を含有するため、同じ中和エピトープを含む可能性もあるが、はるかに低いレベルのVD4認識及び中和が観測された。また、この分子がもたらしたTTLNPTIAGエピトープの認識も非常に低かった(データは示していない)。このことは、以前報告されているように、中和抗体の誘導のためのワクチン抗原としての、フルサイズ組み換えMOMPの限界をはっきりと示している。CTH89並びにCTH89及びCTH93ワクチンのカクテルは何れも、感染から3日後に防御を誘導した(図13E)。これは、感染から3日後に有意な防御を全く誘導しなかったCTH93でワクチン接種したマウスとは対照的であった。感染から7日後に、強力なT細胞標的(CTH93)を含むワクチンは何れも、有意なレベルの防御を誘導した(図13D及びE)。
本発明者らは、in vitro中和及び血清亜型D攻撃に対するin vivo保護の喪失なしに、異種VD4反復配列を強力なT細胞抗原と混合することができた。さらに、B及びT細胞標的の混合物は、残留生物の効率的なCMI媒介クリアランスを誘導し、感染から7日後に高レベルの防御をもたらした。
序論
異種免疫反復配列に対する高い抗体応答が、CAF01を用いてワクチンを投与したときだけに認められるのかどうかを調べるために、本発明者らは、CAF01又はミョウバン中のCTH527(SvE VD4ext)*4による免疫後に抗体応答及び免疫力価を比較した。
何れのアジュバント系も、CTH527と一緒に投与したとき、SvEの表面に対する高い抗体応答を誘導し、両群からの抗体は、SvEをin vitroで中和することができた(図14)。
序論
本発明者らは、次に、CTH518構築物(CTH518配列番号53)と比較して、短い長さのVD4領域から構成される異種免疫反復配列構築物(CTH285配列番号69及びCTH286配列番号70)を比較した(図15A)。
群当たり4匹のマウスを、14日おきに3回免疫した。ワクチンをCAF01中で乳化した後、皮下(sc、5μg)及び鼻内(i.n、5μg)経路により同時に投与した。群当たり4匹のマウスからの脾細胞を単離し、VD4ext領域を呈示するオーバーラップペプチドに対するT細胞応答(図15B)と、血清亜型D及びF感染を中和する血清の能力(図15C)を調べた。様々な血清亜型からのVD4ext領域が、38aa短縮されたCTH285によるワクチン接種後に、はるかに低いレベルのVD4T細胞認識、及び中和が認められた。これに対し、CTH286(各VD4ext領域は、24aa短縮)は、同様のレベルのT細胞応答を誘導し、血清亜型D感染を中和する、CTH518と同じ能力を有した。
本発明者らは、VD4ext領域の長さを38aa短縮することにより、T細胞応答と血清亜型D及びF感染を中和する能力の両方が低減されることを立証した。
序論
本発明者らは、次に、VD4ext領域の長さを伸長することにより、免疫配列構築物に対するT細胞応答を増強することができるかどうかを調べた。2つの構築物CTH69(配列番号47)及びCTH72(配列番号48)を設計した。CTH69は、CTH88と類似しているが、SvD、SvE及びSvF由来のVD4ext領域を、N末端側で12aaだけ伸長した(図16B)。CTH72はまた、SvG、SvIa及びSvJ由来のVD1及びVD4ext領域も含有した。
マウスを14日おきに3回免疫した。ワクチンをCAF01中で乳化した後、皮下(sc、5μg)及び鼻内(i.n、5μg)経路により同時に投与した。免疫に用いた抗原に対するT細胞応答、及び様々な血清亜型由来のVD1及びVD4領域を呈示するペプチドプールに対するT細胞応答を調べた(図16)。VD4ext領域を伸長すると、CTH88で得られたT細胞応答(<20.000pg/ml)と比較して、有意な、より高いT細胞応答(>40.000pg/ml)を誘導した(図16B)。重要なことには、伸長した構築物は何れも、血清亜型D感染を依然としてin vitroで中和することができた(図16C)。ワクチンの防御効果を比較すると、CTH69及びCTH72は、感染から7日後に有意なレベルの防御を誘導し、その理由は、恐らく、CTH88と比較して、これらのワクチンにより誘導されたより強力なT細胞応答によって説明することができよう(図16D)。
VD4ext領域の伸長は、感染から7日後に防御の増強をもたらすCTH88と比較して、T細胞応答を増強した。
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Claims (29)
- a)クラミジア種(Chlamydia sp.)の血清型に発現される同じ外膜タンパク質の1つ又は複数の表面露出断片を含むアミノ酸配列;及び
b)a)に定義したのと同じ配列か、又はa)の前記血清型とは異なるクラミジア種(Chlamydia sp.)の血清型に発現される前記外膜タンパク質の変異型由来の対応する表面露出断片の何れかである2つ以上の別のアミノ酸配列
を含むことを特徴とするポリペプチド。 - 請求項1に記載のポリポリペプチドにおいて、3つ以上の異なるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が各々、様々なクラミジア種(Chlamydia sp.)血清型によって異なる、同じ外膜タンパク質の様々な変異型からの1つ又は複数の表面露出断片を含み、前記アミノ酸配列が、同じクラミジア種(Chlamydia sp.)血清型に由来することを特徴とするポリペプチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドにおいて、アミノ酸配列の3回以上の反復を含み、前記アミノ酸配列が、様々なクラミジア種(Chlamydia sp.)血清型によって異なる、同じ外膜タンパク質の1つ又は複数の表面露出断片を含み、前記アミノ酸配列が、同じクラミジア種(Chlamydia sp.)血清型に由来することを特徴とするポリペプチド。
- 請求項1乃至3の何れか1項に記載のポリペプチドにおいて、前記外膜タンパク質が、任意の血清型由来のMOMPであることを特徴とするポリペプチド。
- 請求項4に記載のポリペプチドにおいて、前記外膜タンパク質が、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)又は肺炎クラミジア(C.pneumoniae)の血清型D、E、F、G、Ia若しくはJ由来のMOMPであることを特徴とするポリペプチド。
- 請求項4又は5に記載のポリペプチドにおいて、MOMPの可変ドメイン1、2、3、4の1つ又は複数を含むことを特徴とするポリペプチド。
- 請求項6に記載のポリペプチドにおいて、前記アミノ酸配列が、任意選択で直線化されることを特徴とするポリペプチド。
- 請求項6又は7に記載のポリペプチドにおいて、MOMPの前記可変ドメイン4(VD4)を含む前記アミノ酸配列が、互いに隣接して配置されるか、又はリンカーで隔てられることを特徴とするポリペプチド。
- 請求項8に記載のポリペプチドにおいて、式I:
xx1−VD4−xx2(式I)
(式中、
VD4は、配列番号15〜20又はこれらと少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列から独立に選択され、
xx1は、
i)アミノ酸配列
EWQASLALSYRLNMFTPYIGVKWSRASFDADTIRIAQPK(配列番号21)、又は
ii)i)の前記アミノ酸配列のサブ配列であって、1〜38個のアミノ酸残基を含み、i)の前記アミノ酸配列においてC末端のKで開始するサブ配列
から構成され、
xx2は、
iii)アミノ酸配列
DTMQIVSLQLNKMKSRKSCGIAVGTTIVDA(配列番号22)、又は
vi)iii)の前記アミノ酸配列のサブ配列であって、1〜29個のアミノ酸残基を含み、iii)の前記アミノ酸配列においてN末端のDで開始するサブ配列
から構成される)
で定義されるアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチド。 - 請求項8又は9に記載のポリペプチドにおいて、前記配列が、配列番号23〜28、49〜59から選択されることを特徴とするポリペプチド。
- 請求項1乃至10の何れか1項に記載のポリペプチドにおいて、MOMPの前記可変ドメイン1(VD1)を含む断片をさらに含み、MOMPのVD1を含む前記アミノ酸配列が、互いに隣接して配置されるか、又はリンカーで隔てられることを特徴とするポリペプチド。
- 請求項11に記載のポリペプチドにおいて、式II:
yy1−VD1−yy2(式II)
(式中、
VD1は、配列番号1〜6又はこれらと少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列から独立に選択され、
yy1は、
v)アミノ酸配列
DAISMRVGYYGDFVFDRVLKTDVNKEFQMG 配列番号7)、又は
vi)v)の前記アミノ酸配列のサブ配列であって、1〜30個のアミノ酸残基を含み、v)の前記アミノ酸配列においてC末端のGで開始するサブ配列
から構成され、
yy2は、
vii)アミノ酸配列NPAYGRHMQDAEMFTNAA(配列番号8)、又は
viii)vii)の前記アミノ酸配列のサブ配列であって、1〜18個のアミノ酸残基を含み、vii)の前記アミノ酸配列においてN末端のNで開始するサブ配列
から構成される)
で定義されるアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチド。 - 請求項11又は12に記載のポリペプチドにおいて、前記配列が、配列番号9〜14、45〜48から選択されることを特徴とするポリペプチド。
- 請求項1乃至13の何れか1項に記載のポリペプチドにおいて、MOMPの前記可変ドメイン2(VD2)を含む断片をさらに含み、前記アミノ酸配列が、互いに隣接して配置されるか、又はリンカーで隔てられることを特徴とするポリペプチド。
- 請求項14に記載のポリペプチドにおいて、式III:
zz1−VD2−zz2(式III)
(式中、
VD2は、配列番号29〜34又はこれらと少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列から独立に選択され、
zz1は、
ix)アミノ酸配列TLGATSGYLKGNSASFNLVGLFG(配列番号35)、又は
x)ix)の前記アミノ酸配列のサブ配列であって、1〜23個のアミノ酸残基を含み、ix)の前記アミノ酸配列においてC末端のGで開始するサブ配列
から構成され、
zz2は、
xi)アミノ酸配列VVELYTDTTFAWSVGARAALWE(配列番号36)、又は
xii)xi)の前記アミノ酸配列のサブ配列であって、1〜22個のアミノ酸残基を含み、xi)の前記アミノ酸配列においてN末端のVで開始するサブ配列
から構成される)
で定義されるアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチド。 - 請求項1乃至15の何れか1項に記載のポリペプチドにおいて、MOMPの前記可変ドメイン3(VD3)を含む断片をさらに含み、MOMPのVD3を含む前記アミノ酸配列が、互いに隣接して配置されるか、又はリンカーで隔てられることを特徴とするポリペプチド。
- 請求項16に記載のポリペプチドにおいて、式IV:
qq1−VD3−qq2(式IV)
(式中、
VD3は、配列番号37〜42又はこれらと少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列から独立に選択され、
qq1は、
xiii)アミノ酸配列
ATLGASFQYAQSKPKVEELNVLCNAAEFTINKPKGYVG(配列番号43)、又は
xiv)xiii)の前記アミノ酸配列のサブ配列であって、1〜22個のアミノ酸残基を含み、xiii)の前記アミノ酸配列においてC末端のGで開始するサブ配列
から構成され、
qq2は、
xv)アミノ酸配列
TGTKDASIDYHEWQASLALSYRLNMFTPYIGVKWS(配列番号44)、又は
xvi)xv)の前記アミノ酸配列のサブ配列であって、1〜35個のアミノ酸残基を含み、xv)の前記アミノ酸配列においてN末端のTで開始するサブ配列
から構成される)
で定義されるアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチド。 - 請求項1乃至17の何れか1項に記載のポリペプチドにおいて、組み換えにより生成された場合に前記ポリペプチドの輸送を促進する部分(例えば、シグナルペプチド)、前記融合タンパク質の精製を容易にする部分(例えば、hisタグ)及び/又は免疫原性を増強する部分(例えば、T細胞抗原)をさらに含むことを特徴とするポリペプチド。
- 請求項18に記載のポリペプチドにおいて、免疫原性のエンハンサーが、CT043、CT004、CT414、CT681又はその部分などのCt抗原から選択される別のT細胞標的であることを特徴とするポリペプチド。
- 請求項19に記載のポリペプチドにおいて、前記配列が、配列番号60〜68から選択されることを特徴とするポリペプチド。
- 請求項1乃至20の何れか1項に記載のポリペプチドにおいて、前記ポリペプチドが、
a)異種免疫反復配列を投与することを含む実験セットアップで試験したとき、10−3以下の50%中和力価で、クラミジア・トラコマチス(C.trachomatis)血清亜型Dをin vitroで中和する能力、
b)異種免疫反復配列を投与することを含むマウスモデルで試験したとき、感染から7日後に、マウスの少なくとも50%において、クラミジア・トラコマチス(C.trachomatis)血清亜型Dをin vivoで中和する能力、
c)異種免疫反復配列を投与したとき、免疫応答をクラミジア・トラコマチス(C.trachomatis)の複数の血清亜型にin vitroで拡大する能力
を有することを特徴とするポリペプチド。 - 請求項1乃至21の何れか1項に記載のポリペプチドをコード化することを特徴とする核酸。
- 請求項1乃至21の何れか1項に記載のポリペプチド又は請求項22に記載の核酸を含むことを特徴とする医薬組成物。
- 請求項23に記載の医薬組成物において、化合物が、ワクチンであることを特徴とする医薬組成物。
- 請求項24に記載の医薬組成物において、薬理的に許容される担体、賦形剤、アジュバント又は免疫モジュレータをさらに含むことを特徴とする医薬組成物。
- 請求項25に記載の医薬組成物において、前記アジュバントが、DDA/TDB又はミョウバンであることを特徴とする医薬組成物。
- 請求項25に記載の医薬組成物において、前記担体が、ウイルス様粒子であることを特徴とする医薬組成物。
- 請求項23乃至27に記載の医薬組成物において、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)又は肺炎クラミジア(C.pneumoniae)による感染症などのクラミジア種(Chlamydia sp.)感染症に対する予防又は治療に使用するためのものであることを特徴とする医薬組成物。
- クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)及び肺炎クラミジア(C.pneumoniae)による感染症などのクラミジア種(Chlamydia sp.)感染症を予防、治療及び/又はその発生数を低減するための方法において、請求項28に記載の医薬組成物を投与するステップを含むことを特徴とする方法。
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