ES2900757T3 - Plataformas de células B activadas por clamidia y procedimientos de las mismas - Google Patents

Abstract

Una plataforma in vitro o ex vivo para crear una vacuna basada en células contra un antígeno de interés, donde la plataforma comprende: a. una población de células B activadas por Clamidia (CAB), que han sido expuestas a bacterias del género Clamidia y b. el antígeno de interés, donde el antígeno de interés no se deriva de un género Clamidia; donde el antígeno de interés está expuesto y/o reticulado a las CAB.

Description

DESCRIPCIÓN

Plataformas de células B activadas por clamidia y procedimientos de las mismas

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense núm. 62/114.349, presentada el 10 de febrero de 2015, y la solicitud provisional estadounidense núm. 62/247.827, presentada el 29 de octubre de 2015.

ANTECEDENTES

Las células dendríticas (DC) se consideran células presentadoras de antígenos (APC) potentes y son inductores efectivos de la inmunidad protectora contra las enfermedades infecciosas y el cáncer. Estas han suscitado un gran interés en el uso de las DC como vacunas celulares; especialmente las DC diferenciadas de los monocitos en sangre periférica. Sin embargo, los ensayos clínicos que utilizan DC solo han demostrado tasas muy bajas de respuesta clínica general, lo que destaca la necesidad de mejorar las vacunas basadas en DC. Las restricciones particulares para el éxito de estas terapias celulares han sido el número limitado de DC que se pueden producir a partir de monocitos, ya que las DC no se pueden expandir ex vivo, lo que dificulta la generación de un gran número de estas células para su uso en múltiples protocolos de administración a largo plazo. Además, las DC tienen un grado significativo de variabilidad en su capacidad para preparar respuestas inmunitarias después de la criopreservación. Estas limitaciones se vuelven especialmente importantes porque se ha demostrado que un mayor número de DC y tratamientos provocan una inmunidad antitumoral más sólida y mejoran las respuestas clínicas.

Las células B representan un gran conjunto de APC potentes y probablemente sean las únicas APC autólogas alternativas a las DC que se pueden generar ex vivo con fines inmunoterapéuticos. Si bien se ha descrito que las células B inducen la tolerancia de las células T o aun que bloquean las respuestas inmunitarias antitumorales in vivo, estos informes se limitaron a las células B en reposo que carecen de una expresión importante de moléculas accesorias y coestimuladoras. Por otro lado, las células B pueden activarse para convertirse en APC efectivas mediante células que expresan DC40L en combinación con citocinas o ligandos del receptor tipo Toll (TLR); sin embargo, estas estrategias no indujeron la activación óptima de las células B (ligandos TLR) o requirieron el uso de líneas celulares (DC40L), y estas limitaciones las vuelven inadecuadas para la aplicación clínica.

Las células B activadas han mejorado la expresión de moléculas coestimuladoras y de MHC, y exhiben una capacidad de presentación de antígenos muy mejorada para activar completamente las células T vírgenes y de memoria También es importante que las células B activadas puedan reclutar células T a través de la secreción de quimiocinas y migrar a órganos linfoides secundarios; requisitos críticos parala inducción in vivo de respuestas inmunitarias antitumorales efectivas. Debido a que las células B pueden obtenerse fácilmente ex vivo, representan una fuente atractiva de APC autólogas para aplicaciones inmunoterapéuticas. Además, las células B activadas expresan MHC de clase I y II y, por lo tanto, se pueden usar con una amplia gama de antígenos. Por lo tanto, en la técnica se necesita un procedimiento práctico que induzca la activación y proliferación de células B para proporcionar una vacuna celular que se dirija a múltiples tipos de tumores y enfermedades infecciosas.

Esta solicitud se basa en el trabajo anterior sobre la estimulación inmunitaria, incluida la que demuestra que las bacterias del género Clamidia inducen la proliferación y la diferenciación de linfocitos de la sangre periférica humana y los linfocitos B de bazo murino de células que forman placa in vitro e inducen una amplia respuesta de anticuerpos (Bard & Levitt, 'Chlamydia trachomatis stimulates human peripheral blood B lymphocytes to proliferate and secrete polyclonal immunoglobulins in vitro', Infect Immun. 1984 Jan;43(1):84-92; Levitt, Danen, & Bard, 'Both species of chlamydia and two biovars of chlamydia trachomatis stimulate mouse B lymphocytes' J Immunol. 1 de junio de 1986;136(11):4249-54). Toussi y Massari demostraron que las porinas clamidiales exhiben actividad adyuvante dependiente de TLR2/TLR1 y pueden estimular la activación y proliferación de APC (Toussi & Massari, 'Immune Adjuvant Effect of Molecularly-defined Toll-Like Receptor Ligands', Vaccines (Basilea). Junio de 2014; 2 (2): 323—353) y que las proteínas principales de la membrana externa (MOMP) de Chlamydia trachomatisinducen la activación celular y la secreción de citocinas a través de la señalización de TLR2, donde TLR1 actúa como correceptor (Massari y col., 'Toll-like receptor 2-dependent activity of native major outer membrane protein proteosomes of Chlamydia trachomatis', Infect Immun. Enero de 2013;81(1):303-10. doi: 10.1128/IAI.01062-12). El documento WO 2013/049941 describe el uso de un adyuvante de ácido palmítico para la estimulación de TLR2.Ingvarsson y col.,'Antigen-specific activation of B cells in vitro after recruitment of T cell help with superantigen', Immunotechnology. Mayo de 1995;1(1):29-39. doi: 10.1016/1380-2933(95)00003- describe el uso de s Ea para ayudar a la activación dependiente de células T de células B, después de su exposición a anti-Ig.

RESUMEN

En esta solicitud, se describe una plataforma in vitro o ex vivo para crear una vacuna a base de células contra un antígeno de interés, donde la plataforma comprende: a) una población de células B activadas por Clamidia («CAB»), que se han expuesto a bacterias del género Clamidia enteras inactivadas (incluidas C. trachomatis, C. psittaci y C. muridarum); y b) el antígeno de interés, donde el antígeno no deriva del género Clamidia (incluidas C. trachomatis, C.

psittaci y C. muridarum); donde el antígeno de interés está expuesto y/o reticulado a las CAB.

También se describe un procedimiento para producir una vacuna contra un antígeno de interés, el procedimiento comprende: a) poner en contacto una población de células B con bacterias del género Clamidia enteras inactivadas (incluidas C. trachomatis, C. psittaci y C. muridarum) para proporcionar así las células presentadoras de antígenos activadas (APC); b) poner en contacto dichas APC activadas con un antígeno de interés, donde el antígeno no deriva del género C. (incluidas C. trachomatis, C. psittaci y C. muridarum); c) proporcionando así una vacuna que comprende APC activadas puestas en contacto con el antígeno de interés.

También se describe una vacuna que comprende APC activadas que se pueden obtener según el procedimiento anterior.

Cualquier realización o aspecto que quede fuera de las reivindicaciones se proporciona como descripción únicamente.

En un aspecto de la descripción, se proporciona un procedimiento para tratar a un sujeto que lo necesita, el procedimiento comprende: a) obtener células B del sujeto; b) exponer las células B de la etapa a) al género Clamidia (incluidas C. trachomatis, C. psittaci y C. muridarum), o una de sus proteínas, péptidos o fragmentos de activación; c) exponer las células B de la etapa b) a un antígeno, donde el antígeno no deriva del género Clamidia (incluidas C. trachomatis, C. psittaci y C. muridarum), o una de sus proteínas, péptidos o fragmentos, u obteniendo así células B activadas por Clamidia presentadoras de antígeno (CAB); y d) tratar el sujeto con las células B activadas por Clamidia presentadoras de antígeno activadas de la etapa c).

Los detalles de una o más realizaciones de la invención se establecen en los dibujos adjuntos y la descripción que se encuentra más adelante. Otras características, objetivos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y a partir de las reivindicaciones.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra un esquema de C.trachomatis que activa células B de ratón, macaco y humano. También se han generado CAB en perros y gatos.

La Figura 2 muestra un esquema que representa el diseño experimental utilizado para demostrar que las CAB pueden cebar de forma cruzada antígenos solubles y activar células T DC8 específicas de antígeno. El receptor de células T (TCR) para ratones OT-I transgénicos es específico para la ovoalbúmina (OVA), y estas células se adquirieron del bazo, se marcaron con un marcador fluorescente para determinar la proliferación celular y a continuación se transfirieron a ratones de tipo salvaje 1 día antes del tratamiento de los ratones de tipo salvaje con CAB cargados con OVA. La proliferación de las células OT-I se evaluó después de tres días mediante citometría de flujo.

La Figura 3 muestra que las CAB pueden cebar de forma cruzada células T DC8 específicas de antígenoin vivo de una manera dependiente de la dosis.

La Figura 4 muestra que las CAB humanas promueven la proliferación robusta de células T alogénicas vírgenes de células T DC4 y DC8 vírgenes humanas después de 7 días en cocultivo. Se utilizó citometría de flujo para evaluar la capacidad de las CAB para inducir la proliferación de células T.

La Figura 5 muestra macacos rhesus tratados/'^ vivocon CAB cargadas con antígeno específico en los puntos de tiempo indicados. A continuación, se utilizaron PBMC de estos animales para evaluar las respuestas de células T específicas de antígeno. Los tratamientos con CAB aumentaron en gran medida la secreción de interferón-gamma por parte de las células T. Además, no hubo efectos adversos discernibles de estos tratamientos.

La figura 6 muestra que los ratones C57BL/6J se vacunaron con CAB descargados (CAB) o CAB cargados con péptidos específicos de melanoma B16 (Trp-2 y gp100) (es decir, CAB-B16). A continuación, los ratones se trataron intravenosamente con 200.000 células B16-F10. 18 días después, se enumeraron los nódulos tumorales en los pulmones. El panel de la izquierda muestra el número de nódulos tumorales de pulmón en ratones tratados con CAB sin carga o con CAB-B 16; el panel derecho muestra resultados representativos de ambos grupos de ratones tratados.

La Figura 7 muestra que CAB prepara las respuestas de CTL endógenas con fuerte actividad antitumoral. El tratamiento con CAB específicas de OVA antes de la inyección subcutánea del tumor E.G7-OVA puede prevenir el desarrollo del tumor.

La Figura 8 muestra que CAB prepara las respuestas de CTL endógenas con fuerte actividad antitviral. Los CAB cargados con el epítopo inmunodominante de HSV-1 (gB498-505) antes del desafío ocular letal con HSV-2 rescataron a los animales de una infección letal.

La Figura 9 muestra las CAB cargadas con OVA que controlan el tumor establecido temprano al promover la inmunidad CTL. Los tratamientos con CAB no se administraron hasta que comenzaron 5 días después de la inyección del tumor.

Como se muestra, los tratamientos con CAB específicas de antígeno restringieron significativamente el desarrollo de tumores, y este efecto se anuló cuando se trató a los ratones con un anticuerpo que agotó las células T DC8 endógenas. Las flechas azules indican tratamientos de CAB.

La Figura 10 muestra las CAB cargadas con OVA que controlan los tumores establecidos tempranamente. Esto acompaña los resultados del crecimiento del tumor a lo largo del tiempo como se muestra en la Figura 9.

La Figura 11 muestra que aGC aumenta la efectividad terapéutica de CAB. Las CAB se cargaron con aGC antes de la inyección en un esfuerzo por optimizar la eficacia de las CAB. Debido a que se trataron CAB y no ratones con aGC, esto evitó la toxicidad asociada con la administración de aGCin vivo. Las flechas azules indican tratamientos de CAB.

La Figura 12 muestra que la reticulación del péptido inmunodominante de OVA (SIINFEKL) a CAB aumenta la consistencia de su eficacia terapéutica. La reticulación de longitud cero se realiza usando 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) -carbodiimida soluble en agua. Las flechas azules indican tratamientos de CAB.

La Figura 13 muestra un ejemplo de reticulación de un antígeno (OVA) a CAB. El pico del lado izquierdo indica las CAB que se sometieron a una reticulación simulada, mientras que el pico del lado derecho indica las CAB que se reticularon con OVA. La detección de OVA reticulada en la superficie celular de CAB se realizó con un anticuerpo monoclonal anti-OVA.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Definiciones

Los artículos «un» y «una» se utilizan en esta solicitud para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, «un elemento» significa un elemento o más de un elemento.

El término «aproximadamente» tal como se usa en esta solicitud cuando se hace referencia a un valor medible tal como una cantidad, un porcentaje o similares, significa que abarca variaciones de ±20% o ±10%, más preferiblemente de ±5%, aun más preferiblemente de ±1% y más preferiblemente aún de ±0,1% con respecto a valor especificado, según sean adecuadas dichas variaciones para llevar a cabo los procedimientos descritos.

El término «composición antigénica» se refiere a una composición que comprende material que estimula el sistema inmunitario y provoca una respuesta inmunitaria en un huésped o un sujeto.

El término «provocar una respuesta inmunitaria» se refiere a la estimulación de células inmunitarias in vivo en respuesta a un estímulo, como un antígeno. La respuesta inmunitaria consiste en la respuesta inmunitaria celular, por ejemplo, estimulación de células T y macrófagos, y respuesta inmunitaria humoral, por ejemplo, estimulación de células B y complemento y producción de anticuerpos. La respuesta inmunitaria se puede medir usando técnicas conocidas en la técnica, que incluyen, de modo no taxativo, inmunoensayos de anticuerpos, ensayos de proliferación y otros.

El término «vacuna» como se usa en esta solicitud se refiere a una composición como se describe en esta solicitud que es útil para establecer inmunidad en el sujeto. Se contempla que la vacuna comprenda un vehículo y/o un adyuvante farmacéuticamente aceptabla. Se contempla que las vacunas sean profilácticas o terapéuticas.

Un tratamiento «profiláctico» es un tratamiento administrado a un sujeto que no exhibe signos de una enfermedad o exhibe solo signos tempranos a los efectos de disminuir el riesgo de desarrollar la patología. Las vacunas descritas en esta solicitud se pueden administrar como tratamiento profiláctico para reducir la probabilidad de desarrollar una patología o para minimizar la gravedad de la patología, si se desarrolla.

Un tratamiento «terapéutico» es un tratamiento administrado a un sujeto que presenta signos o síntomas de patología con el fin de disminuir o eliminar esos signos o síntomas. Los signos o síntomas pueden ser bioquímicos, celulares, histológicos, funcionales, subjetivos u objetivos.

El término «inactivado» se utiliza en esta solicitud para describir un microorganismo, tal como el género Clamidia (incluidos C. trachomatis, C. psittaci y C. muridarum), que también se conoce en la técnica como un microorganismo «inactivado» o «muerto». Una bacteria inactivada es una bacteria completa sin propiedades infecciosas y se produce a partir de una bacteria «viva», independientemente de si la bacteria se ha atenuado previamente de alguna manera.

Un «fragmento» de un polipéptido se refiere a cualquier porción del polipéptido más pequeña que el polipéptido de longitud completa o el producto de expresión de la proteína. Los fragmentos son, en un aspecto, análogos de deleción del polipéptido de longitud completa donde uno o más residuos de aminoácidos se han eliminado del extremo amínico y/o el extremo carboxi del polipéptido de longitud completa. Por consiguiente, los «fragmentos» son un subconjunto de análogos de deleción que se describen a continuación.

El término «anticuerpo», como se usa en esta solicitud, se refiere a una molécula de inmunoglobulina que puede unirse específicamente a un epítopo específico en un antígeno. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales o de fuentes recombinantes y pueden ser porciones inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos se pueden producir a partir de las vacunas descritas en esta solicitud, y pueden existir en una variedad de formas que incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos intracelulares ("intracuerpos"), Fv, Fab y F (ab) 2, así como anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos de cadena pesada, como anticuerpos de camélidos, anticuerpos sintéticos, anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados (Harlow y col.., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow y col.., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY.; Houston y col., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85:5879-5883; Bird y col.., 1988, Science 242:423-426).

El término «anormal» cuando se usa en el contexto de organismos, tejidos, células o componentes de los mismos, se refiere a aquellos organismos, tejidos, células o componentes de los mismos que difieren en al menos una característica observable o detectable (p. ej., edad, tratamiento, hora del día, etc.) de aquellos organismos, tejidos, células o componentes de los mismos que muestran la característica respectiva «normal» (esperada). Las características que son normales o esperadas para una célula o tipo de tejido pueden ser anormales para una célula o tipo de tejido diferente.

Como se usa en esta solicitud, «aliviar» una enfermedad significa reducir la frecuencia o gravedad de al menos un signo o síntoma de una enfermedad o trastorno.

Una «cantidad efectiva», como se usa en esta solicitud, significa una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico o profiláctico.

Como se usa en esta solicitud, un «inmunoensayo» se refiere a cualquier ensayo de unión que usa un anticuerpo capaz de unirse específicamente a una molécula diana para detectar y cuantificar la molécula diana.

Como se usa en esta solicitud, un «material instructivo» incluye una publicación, una grabación, un diagrama o cualquier otro medio de expresión que pueda usarse para comunicar la utilidad de un compuesto, composición, procedimiento, plataforma o sistema de la invención en el kit para practicar los procedimientos descritos en esta solicitud. El material instructivo del kit de la invención puede, por ejemplo, fijarse a un contenedor que contiene el compuesto, composición, plataforma o sistema de entrega identificados de la invención o enviarse junto con un contenedor que contiene el compuesto, composición, componentes del procedimiento, plataforma o sistema de la invención identificados. Alternativamente, el material instructivo puede enviarse por separado del contenedor con la intención de que el destinatario utilice el material instructivo y el compuesto de manera cooperativa.

Como se usa en esta solicitud, «polipéptido», «péptido» y «proteína» se usan de manera intercambiable y se refieren a un compuesto que se compone de residuos de aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. Una proteína o péptido debe contener al menos dos aminoácidos, y no se impone ninguna limitación al número máximo de aminoácidos que puede comprender la secuencia de una proteína o péptido. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprenda dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Como se usa en esta solicitud, el término se refiere tanto a cadenas cortas, que también se denominan comúnmente en la técnica como péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, y a cadenas más largas, que generalmente se denominan en la técnica proteínas, de las cuales hay muchos tipos. Los «polipéptidos» incluyen, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Los polipéptidos incluyen péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos o una combinación de los mismos.

Una «enfermedad» es un estado de salud de un animal donde el animal no puede mantener la homeostasis y donde si la enfermedad no mejora, entonces la salud del animal continúa deteriorándose. Por el contrario, un «trastorno» en un animal es un estado de salud en el que el animal es capaz de mantener la homeostasis, pero en el que el estado de salud del animal es menos favorable de lo que sería en ausencia del trastorno. Si no se trata, un trastorno no necesariamente causa una disminución adicional en el estado de salud del animal.

El término «sujeto» se refiere a cualquier individuo que sea la diana de la administración o el tratamiento. El sujeto puede ser un vertebrado, por ejemplo, un mamífero. Por tanto, el sujeto puede ser un paciente humano o veterinario. El término «paciente» se refiere a un sujeto bajo el tratamiento de un médico, por ejemplo, un doctor.

Como se usa en esta solicitud, las expresiones «terapia» o «régimen terapéutico» se refieren a aquellas actividades realizadas para aliviar o alterar un trastorno o cuadro clínico, por ejemplo, un curso de tratamiento destinado a reducir o eliminar al menos un signo o síntoma de una enfermedad o trastorno mediante el uso de técnicas farmacológicas, quirúrgicas, alimentarias y/o de otro tipo. Un régimen terapéutico puede incluir una dosis prescrita de uno o más fármacos o cirugía. En la mayoría de los casos, las terapias serán beneficiosas y reducirán o eliminarán al menos un signo o síntoma del trastorno o cuadro clínico, pero en algunos casos el efecto de una terapia tendrá efectos secundarios o no deseables. El efecto de la terapia también se verá afectado por el estado fisiológico del sujeto, por ejemplo, edad, sexo, genética, peso, otras enfermedades, etc.

La expresión «cantidad terapéuticamente efectiva» hace referencia a la cantidad del compuesto objeto que provocará la respuesta médica o biológica de un tejido, sistema o sujeto que busca el investigador, veterinario, médico u otro profesional de la salud. El término «cantidad terapéuticamente efectiva» incluye la cantidad de un compuesto que, cuando se administra, es suficiente para prevenir el desarrollo, o aliviar hasta cierto punto, de uno o más de los signos o síntomas del trastorno o enfermedad que se está tratando. La «cantidad terapéuticamente efectiva» variará en función del compuesto, la enfermedad y su gravedad, y la edad, el peso, etc. del sujeto que será tratado.

«Tratar» una enfermedad como se usa el término en esta solicitud, significa reducir la frecuencia o gravedad de al menos un signo o síntoma de una enfermedad o trastorno experimentado por un sujeto.

El término «célula», tal como se usa en esta solicitud, se refiere a células individuales, líneas celulares, cultivo primario, o cultivos derivados de tales células, a menos que se indique específicamente. Un «cultivo» se refiere a una composición que comprende células aisladas del mismo tipo o de un tipo diferente. Una línea celular es un cultivo de un tipo particular de célula que puede reproducirse indefinidamente, lo que hace que la línea celular sea «inmortal». Un cultivo celular puede ser una población de células cultivadas en un medio como agar. Un cultivo primario de células es un cultivo de una célula o tomado directamente de un organismo vivo, que no está inmortalizado.

La expresión «muestra biológica» se refiere a un tejido (por ejemplo, biopsia de tejido), órgano, célula (incluida una célula mantenida en cultivo), lisado celular (o fracción de lisado), biomolécula derivada de una célula o material celular (por ejemplo, un polipéptido o ácido nucleico), o fluido corporal de un sujeto. Los ejemplos no limitantes de fluidos corporales incluyen sangre, orina, plasma, suero, lágrimas, linfa, bilis, líquido cefalorraquídeo, líquido intersticial, humor acuoso o vítreo, calostro, esputo, líquido amniótico, saliva, secreciones anales y vaginales, transpiración, semen, trasudado, exudado y líquido sinovial.

Los términos «célula tumoral» o «célula cancerosa», utilizados en forma singular o plural, se refieren a células que han sufrido una transformación maligna que las convierte en patológicas para el organismo hospedador. Las células cancerosas primarias (es decir, las células obtenidas cerca del sitio de transformación maligna) se pueden distinguir fácilmente de las células no cancerosas mediante técnicas bien establecidas, particularmente examen histológico. La definición de una célula cancerosa, como se usa en esta solicitud, incluye no solo una célula cancerosa primaria, sino cualquier célula derivada de un ancestro de la célula cancerosa. Esto incluye células cancerosas metastatizadas y cultivos in vitro y líneas celulares derivadas de células cancerosas. El término «antígeno asociado a tumor» o «TAA» se usa en esta solicitud para referirse a una molécula o complejo que es expresado con una frecuencia o densidad más alta por las células tumorales que por las células no tumorales del mismo tipo de tejido. Los antígenos asociados a tumores pueden ser antígenos que el hospedador no expresa normalmente; pueden ser manifestaciones mutadas, truncadas, mal plegadas o anormales de las moléculas normalmente expresadas por el hospedador; pueden ser idénticas a las moléculas que se expresan normalmente pero que se expresan a niveles anormalmente altos; o pueden expresarse en un contexto o medio que es anormal. Los antígenos asociados a tumores pueden ser, por ejemplo, proteínas o fragmentos de proteínas, carbohidratos complejos, gangliósidos, haptenos, ácidos nucleicos o cualquier combinación de estas u otras moléculas biológicas. El conocimiento de la existencia o las características de un antígeno asociado a un tumor particular no es necesario para la práctica de la invención.

La expresión «célula B» se refiere a un linfocito B. Los precursores de las células B residen en la médula ósea donde se producen las células B inmaduras. El desarrollo de las células B se produce a través de varias etapas, cada etapa representa un cambio en el contenido del genoma en los loci de anticuerpos. En la región variable de la cadena pesada genómica hay tres segmentos, V, D y J, que se recombinan al azar, en un procedimiento llamado reordenación de VDJ para producir una región variable única en la inmunoglobulina de cada célula B. Se producen reordenaciones similares para la región variable de la cadena ligera excepto que solo hay dos segmentos implicados, V y J. Después de la reordenación completa, la célula B alcanza la etapa inmadura de IgM en la médula ósea. Estas células B inmaduras presentan una IgM unida a la membrana, es decir, BCR, en su superficie y migran al bazo, donde se denominan células B de transición. Algunas de estas células se diferencian en linfocitos B maduros. Las células B maduras que expresan BCR en su superficie circulan por la sangre y el sistema linfático desempeñando la función de vigilancia inmunitaria. No producen anticuerpos solubles hasta que se activan por completo. Cada célula B tiene una proteína receptora única que se unirá a un antígeno en particular. Una vez que una célula B encuentra su antígeno y recibe una señal adicional de una célula T cooperadora, puede diferenciarse aún más en una célula B plasmática que expresa y secreta anticuerpos solubles, o una célula B de memoria.

El término «célula B» también puede referirse a cualquier linfocito B que presente un receptor de células B (BCR) completamente reordenado, es decir, maduro, en su superficie. Por ejemplo, una célula B puede ser una célula B madura o inmadura y es preferiblemente una célula B virgen, es decir, una célula B que no ha sido expuesta al antígeno específicamente reconocido por el BCR en la superficie de dicha célula B. Las células B pueden ser células B de memoria, preferiblemente células B de memoria IgG . La expresión «células B» también puede referirse a una mezcla de células B. Una mezcla de células B puede significar que las células B en la mezcla tienen diferentes especificidades de antígeno, es decir, producen anticuerpos o BCR completamente reorganizados que reconocen una variedad de antígenos. Los anticuerpos o BCR de una sola célula B suelen ser idénticos, también con respecto a la especificidad del antígeno.

La expresión "células B que secretan anticuerpos" se refiere preferiblemente a células B plasmáticas. La expresión «células B que portan un BCR en su superficie» se refiere preferiblemente a células B que expresan un BCR, preferiblemente un BCR completamente reordenado, en su membrana plasmática. En este contexto, «un BCR» preferiblemente no significa un solo BCR, sino que preferiblemente significa una multitud de BCR que tienen el mismo antígeno.

El término «porción» se refiere a una fracción. Una porción significa preferiblemente al menos 20%, al menos 30%, preferiblemente al menos 40%, preferiblemente al menos 50%, más preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 70%, aun más preferiblemente al menos 80%, y lo más preferiblemente al menos el 90% de toda la entidad. El término «porción sustancial» se refiere preferiblemente a al menos 50%, más preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 70%, aun más preferiblemente al menos 80%, aun más preferiblemente al menos 90%, aun más preferiblemente al menos 95%, y lo más preferiblemente al menos el 99% de toda la entidad.

El término «expansión clonal» se refiere a un procedimiento donde se multiplica una entidad específica. En el contexto de la presente invención, el término se usa preferiblemente en el contexto de una respuesta inmunitaria en la que los linfocitos, preferiblemente los linfocitos B, son estimulados por un antígeno, proliferan y el linfocito específico que reconoce dicho antígeno se amplifica. Preferiblemente, la expansión clonal conduce a la diferenciación de los linfocitos, preferiblemente en linfocitos que producen y secretan anticuerpos. Los linfocitos B que secretan anticuerpos son, por ejemplo, células B plasmáticas.

El término «antígeno» se refiere a un agente que comprende un epítopo contra el cual se va a generar una respuesta inmunitaria. El término «antígeno» incluye, en particular, proteínas, péptidos, polisacáridos, lípidos, ácidos nucleicos, especialmente ARN y ADN, y nucleótidos. El término «antígeno» también incluye antígenos derivatizados como sustancia secundaria que se vuelve antigénica - y sensibilizante - solo a través de la transformación (p. ej., de forma intermedia en la molécula, al completarse con proteína corporal), y antígenos conjugados que, mediante la incorporación artificial de grupos atómicos (p. ej., isocianatos, sales de diazonio), presentan una nueva especificidad constitutiva. En una realización preferida, el antígeno es un antígeno tumoral, es decir, un constituyente de células cancerosas que puede derivar del citoplasma, la superficie celular y el núcleo celular, en particular aquellos antígenos que se producen, preferiblemente en gran cantidad, intracelularmente o como antígenos de superficie en células tumorales. Son ejemplos el antígeno carcinoembrionario, una 1-fetoproteína, isoferritina y sulfoglucoproteína fetal, una a2-H-ferroproteína y Y-fetoproteína y varios antígenos tumorales virales. En una realización adicional, el antígeno es un antígeno viral tal como ribonucleoproteínas virales o proteínas de la envoltura. En particular, el antígeno o péptidos del mismo deberían ser reconocibles por un receptor de células B o una molécula de inmunoglobulina tal como un anticuerpo. Preferiblemente, el antígeno, si es reconocido por un receptor de células B, es capaz de inducir en presencia de señales coestimuladoras apropiadas, la expansión clonal de la célula B que porta el BCR que reconoce específicamente el antígeno y la diferenciación de tales células B en células B secretoras de anticuerpos. Un antígeno puede presentarse en una organización repetitiva, es decir, el antígeno comprende más de uno, preferiblemente al menos 2, al menos 3, al menos 4, hasta 6, 10, 12 o más agentes o epítopos contra los cuales se produce una respuesta inmunitaria o contra los que se producirán los anticuerpos. Tal antígeno repetitivo preferiblemente es capaz de unirse a más de un anticuerpo de la misma especificidad. En otras palabras, tal antígeno repetitivo comprende más de un epítopo, preferiblemente un epítopo idéntico, y por tanto es capaz de «reticular» los anticuerpos dirigidos a dicho epítopo. Los más de un agente o epítopos pueden estar unidos covalentemente o no covalentemente, donde un enlace covalente puede ser por cualquier agrupación química tal como enlaces peptídicos. Un antígeno puede ser una molécula de fusión que comprende una repetición de un péptido antigénico o que comprende diferentes péptidos antigénicos que tienen un epítopo común. En una realización preferida, dichos péptidos antigénicos están conectados mediante conectores peptídicos.

Intervalos: a través de esta descripción, varios aspectos de la invención pueden presentarse en un formato de intervalos. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalos se proporciona como tal con fines de conveniencia y brevedad y no debe considerarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. Por consiguiente, la descripción de un intervalo debe considerarse como que tiene todos los subintervalos posibles específicamente descritos, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 debe considerarse que ha descrito subintervalos de forma específica tal como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3, 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

Según los procedimientos reseñados en esta solicitud, se administra al sujeto una cantidad efectiva del agente. Los términos cantidad efectiva y dosificación efectiva se usan de forma indistinta. El término cantidad efectiva se define como cualquier cantidad necesaria para producir una respuesta fisiológica deseada. Las cantidades y programas efectivos para administrar el agente pueden determinarse empíricamente, y la realización de tales determinaciones está dentro del conocimiento de la técnica. Los intervalos de dosificación para la administración son lo suficientemente grandes como para producir el efecto deseado en el que se ven afectados uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno (por ejemplo, reducidos o retardados). La dosificación no debería ser tan grande como para provocar efectos secundarios adversos considerables, tales como reacciones cruzadas no deseadas, reacciones anafilácticas y similares. Generalmente, la dosificación variará según la edad, el estado, el sexo, el tipo de enfermedad, la extensión de la enfermedad o el trastorno, la vía de administración o si se incluyen otros fármacos en el régimen, y puede ser determinada por un experto en la técnica. La dosificación puede ser ajustada por el médico en caso de cualquier contraindicación. Las dosificaciones pueden variar y pueden administrarse en una o más administraciones de dosis diarias, durante uno o varios días. En la bibliografía hay una orientación con respecto a las dosificaciones adecuadas para clases determinadas de productos farmacéuticos.

Tal como se usa en esta solicitud, los términos tratamiento, tratar o que trata, se refieren a un procedimiento para reducir los efectos de una enfermedad o afección o síntoma de la enfermedad o afección. Por lo tanto, en el procedimiento descrito, el tratamiento se puede referir a un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % de reducción en la gravedad de una enfermedad o afección establecida o síntoma de la enfermedad o afección. Por ejemplo, un procedimiento para tratar una enfermedad se considera tratamiento si hay un 10 % de reducción de uno o más síntomas de la enfermedad en un sujeto en comparación con el control. Por lo tanto, la reducción puede ser del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o cualquier porcentaje entre un 10 % y 100 %, en comparación con niveles naturales o de control. Se entiende que el tratamiento no se refiere necesariamente a una cura o erradicación completa de la enfermedad, la afección o los síntomas de la enfermedad o afección.

Como se usa en esta solicitud, los términos prevenir, previniendo y prevenir una enfermedad o trastorno se refieren a una acción, por ejemplo, la administración de un agente terapéutico, que ocurre antes o aproximadamente al mismo tiempo que un sujeto comienza a mostrar uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno, que inhibe o retrasa la aparición o exacerbación de uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno. Tal como se usa en la presente, las referencias a la disminución, reducción o inhibición incluyen un cambio de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o mayor en comparación a un nivel de control. Tales términos pueden incluir, pero no necesariamente incluyen, la eliminación completa.

General

En esta solicitud, se describe una plataforma novedosa para generar rápida y fácilmente un gran número de células presentadoras de antígenos (APC) activadas, como las células B activadas, para su uso como vacuna celular que induce y potencia las respuestas inmunitarias contra tumores y patógenos. Es importante destacar que la funcionalidad de estas células no se ve afectada por el almacenamiento en frío a largo plazo. Usando esta plataforma, las células B de animales (p. ej., ratón, gato, perros y macacos rhesus) y humanas obtenidas de sangre periférica u órganos linfoides secundarios pueden activarse y expandirse in vitropara infusión en el donante original usando una variedad de protocolos de administración. Las células B pueden obtenerse y usarse en el mismo individuo (autólogas), o las células B pueden obtenerse de un individuo y usarse en otro individuo (alogénicas). Estas células pueden activarsein vitromediante el cultivo de células mononucleares de sangre periférica o preparaciones de células de órganos linfoides completos en presencia delisados o cuerpos elementales de Chlamydia trachomatisinactivados, lo que induce su activación y proliferación, que se potencian aún más con factores adicionales, como las citocinas. El número de células B activadas se puede expandir muchas veces desde el número inicial de células B. Por ejemplo, el número de células B activadas se puede ampliar en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 veces o más en comparación con un control. Se muestra aquí que estas células son APC eficientes, capaces de procesar antígenos proteicos extraños, presentar péptidos inmunogénicos y estimular células T DC4 y DC8 alogénicas, vírgenes, así como células T DC8 vírgenes y específicas de antígenos de memoria. Además, los antígenos se pueden cargar mediante reticulación con las CAB para aumentar su capacidad terapéutica.

La expansión del número de APC eficientes disponibles para cargar con antígenos conscientes hace que el procedimiento de producción de vacunas celulares autólogas sea más efectivo, ya que la administración in vivo de estas células B activadas prepara respuestas robustas de células T DC8 , capaces de rechazar tumores y controlar la infección viral. Por lo tanto, se ha desarrollado una plataforma de vacuna celular para su uso en inmunoterapia de tumores y enfermedades infecciosas. Esta plataforma y el procedimiento asociado son menos invasivos, costosos y laboriosos que otras opciones de vacunas celulares disponibles actualmente.

Chlamydia trachomatis tiene la capacidad única de inducir la activación policlonal selectiva de las células B en reposo, que se obtiene fácilmente de sangre periférica u órganos linfoides secundarios (p. ej., ganglios linfáticos), así como de una amplia variedad de mamíferos (ratones, gatos, perros, macacos rhesus y humanos). Los cuerpos elementales (EB) inactivados de Chlamydia trachomatis o sus lisados son capaces de activar las células B en reposo obtenidas de la sangre periférica o de los órganos linfoides secundarios e inducir su proliferación. Esto permite que su número se expanda en cantidades significativas, que se mejoran aún más por factores adicionales, como las citocinas. Esto hace que su posterior selección inmunomagnética sea bastante eficiente. Estas células B activadas (CAB) de Chlamydia trachomatis-expresan altos niveles de moléculas coestimuladoras, y son capaces de adquirir proteínas solubles y procesarlas de manera más eficiente que las células B en reposo. Estos requisitos permiten que las CAB generadas puedan presentar antígenos a las células T. Las CAB generadas se pueden usar para infusión autóloga o alogénica utilizando varios protocolos de administración, debido a la capacidad de la plataforma para generar un gran número de APC y la posibilidad de que las CAB se criopreserven y aún mantengan su funcionalidad completa como APC.

También se describe el uso de CAB para inducir células T específicas de antígeno contra tumores y patógenos intracelulares para inmunoterapia activa o pasiva, inmunomonitoreo y propósitos de investigación. Más específicamente, aquí se describen CAB humanas, murinas y de macacos rhesus que tienen la capacidad de realizar funciones como APC eficientes, capaces de procesar antígenos proteicos extraños, presentar péptidos inmunogénicos y estimular las células T DC4 y DC8 alogénicas vírgenes, así como las células T DC8 vírgenes y de memoria específicas de antígeno. Estas propiedades permiten que las CAB preparen las respuestas de las células Tin vivo, incluidas las deseables en el tratamiento del cáncer.

Las CAB producidas en las condiciones descritas en esta solicitud (como las descritas en el Ejemplo 1) se pueden combinar con cualquier antígeno o combinación de antígenos deseados, así como con péptidos inmunogénicos, mediante una variedad de técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Las CAB se pueden administrar por vía intravenosa al sujeto, por ejemplo. La magnitud de la proliferación y activación de las células T depende del número de APC para administrar. Debido al gran número de células que se pueden obtener con los procedimientos descritos en esta solicitud, las respuestas de las células T inducidas por la administración repetida de un gran número de CAB son mayores que las inducidas por la preparación actualmente disponible de DC, debido a su número limitado. Por ejemplo, las CAB descritas en esta solicitud pueden pulsarse con antígenos tumorales afines o péptidos específicos del tumor e inducir respuestas de células T DC8 específicas del tumor, capaces de rechazar las correspondientes provocaciones tumorales en modelos murinos.

Como resultado del procedimiento descrito para activar las células B, las CAB se pueden usar en una amplia gama de enfoques para presentar un antígeno deseado, como un antígeno asociado a un tumor a las células T. Las CAB humanas son APC muy eficientes y estimulan las células T DC4 y DC8 vírgenes alogénicas humanas. También pueden sensibilizar células T autólogas vírgenes y de memoria específicas para antígenos virales y tumorales en animales y seres humanos. Además, en ratones, estas respuestas de células T son capaces de rescatar de infecciones virales letales y de hacer retroceder tumores establecidos.

Plataforma de células B activadas por Chlamydia trachomatis

Aquí se describe una plataforma para crear APC activadas, donde la plataforma comprende: Chlamydia trachomatis, o una de sus proteínas activadoras, péptidos o fragmentos; una población de células B; y un antígeno En un ejemplo, el antígeno de la célula presentadora de antígeno no se deriva del género Chlamydia (incluidas C.trachomatis, C. psittaci y C. muridarum),o de una de sus proteínas, péptidos o fragmentos. También se describe una célula B activada por Clamidia (CAB) producida por los procedimientos descritos en esta solicitud.

Las células B originales utilizadas en esta solicitud pueden obtenerse de varias fuentes, incluidas células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de los ganglios linfáticos, sangre del cordón, tejido de un sitio de infección, tejido del bazo y tumores. Se puede usar cualquier número de líneas de células B disponibles en la técnica con las plataformas y procedimientos descritos en esta solicitud. En ciertas realizaciones de los procedimientos descritos en esta solicitud, las células B se pueden obtener a partir de una unidad de sangre extraída de un sujeto utilizando cualquier número de técnicas conocidas por el experto en la materia, como separación con FICOLL ™ (copolímeros de sacarosa y epiclorhidrina que pueden usarse para preparar soluciones de alta densidad).

El género Clamidia (incluidas C. trachomatis, C. psittaci y C. muridarum) usado en la plataforma y los procedimientos descritos en esta solicitud pueden ser vivos, inactivados o pueden ser una proteína o un fragmento del género Clamidia (incluidas C. trachomatis, C. psittaci y C. muridarum)

El género Clamidia puede ser una variante del género conocida y aún conservar la función de impartir el efecto descrito en esta solicitud. Por ejemplo, se pueden utilizar las bacterias completas. Las bacterias vivas no infectan a los leucocitos y no pueden sobrevivir en un medio de cultivo que contenga antibióticos. Alternativamente, se pueden usar bacterias enteras inactivadas (irradiadas con rayos X o gamma), o el lisado generado a partir de la bacteria entera.

Pueden usarse proteínas específicas o sus fragmentos que se han identificado como capaces de activar las CAB. Por proteína «activadora», sus péptidos o fragmentos se entiende que la proteína, sus péptido o fragmentos son capaces de crear células presentadoras de antígeno (APC) activadas. Un experto en la técnica puede identificar fácilmente qué proteínas, péptidos o sus fragmentos deClamidiason capaces de producir el resultado deseado.

Los ejemplos de tales componentes que pueden mediar el efecto en las células B incluyen, sin limitación, proteína de membrana externa principal (MOMP); proteínas de membrana polimórfica de Chlamydia trachomatis (p. ej. PmpA, PmpB, PmpC, PmpD, PmpE, PmpF, PmpG, PmpH, PmpI); proteína de Clamidia que se asocia con dominios de muerte (CADD); factor de actividad tipo proteasa de Clamidia (CPAf ); proteína de la membrana externa principal y proteínas ricas en cisteína (p. ej., OmcA y OmcB); proteína de choque térmico 70-kDa de Chlamydia trachomatis; PulD/YscC; PorB; CTL0887; CTL0541; OprB; OMP85; CTL0645; Pal; Ef-Tu/TufA; GroEL; CopD; DnaK/HSP70; CTL0255; Hc1; CTL0850; y RpoB. Se describen además los componentes de Chlamydiae que se encuentran enHeinz y col. (Comprehensive in silico Prediction and Analysis of Chlamydial Outer Membrane Proteins Reflects Evolution and Lifestyle of the Chlamydiae. BMC Genomics. 2009 dic 29;10:634).

Se puede usar una proteína de membrana exterior principal (MOMP) de Chlamydia trachomatis o un uno de sus fragmentos. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente qué fragmento, proteína o variante de Clamidia puede usarse para impartir el efecto deseado.

Se puede usar cualquier antígeno de cualquier enfermedad, trastorno o afección. Los antígenos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, bacterianos, virales, parasitarios, alérgenos, autoantígenos y antígenos asociados a tumores. Si se usa una vacuna basada en ADN, el antígeno estará codificado típicamente por una secuencia de la construcción de ADN administrada. Alternativamente, si el antígeno se administra como un conjugado, el antígeno será típicamente una proteína comprendida en el conjugado administrado. Particularmente, el antígeno puede incluir antígenos proteicos, péptidos, organismos inactivados completos y similares.

Los ejemplos específicos de antígenos que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, antígenos de hepatitis A, B, C o D, virus de la influenza, Listeria, Clostridium botulinum, tuberculosis, tularemia, Variola major (viruela), fiebres hemorrágicas virales, Yersinia. pestis (plaga), VIH, herpes, virus del papiloma y otros antígenos asociados con agentes infecciosos. Otros antígenos incluyen antígenos asociados con enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias, alergia, asma y rechazo de trasplantes. Una CAB cargada con antígeno se puede administrar sola o en conjunción con otros agentes terapéuticos, tales como un agonista de DC40 o TLR en particular, un anticuerpo DC40, para su uso como vacuna terapéutica o profiláctica para tratar un cuadro clínico o para suprimir la inmunidad. En otro ejemplo, la plataforma CAB descrita en esta solicitud puede usarse junto con inhibidores de puntos de control. Se pueden encontrar ejemplos de tecnología de inhibidores de puntos de control en los documentos WO1999015157A2, WO2015016718A1yWO2010149394A1. También se comentan aquí otras terapias de combinación.

En una realización, el antígeno puede comprender un antígeno relacionado con el tumor. Los ejemplos de tumores que pueden tratarse incluyen los siguientes: tumores pancreáticos, tales como adenocarinomas ductales pancreáticos; tumores de pulmón, tales como adenocarcinomas de células pequeñas y grandes, carcinoma de células escamosas y carcinoma broncoalveolar; tumores de colon, como adenocarcinoma epitelial y sus metástasis; y tumores de hígado, como hepatoma y colangiocarcinoma. También se incluyen los tumores de mama, como el adenocarcinoma ductal y lobular; tumores ginecológicos, tales como adenocarcinoma escamoso y del cuello uterino y adenocarcinoma epitelial uterino y ovárico; tumores de próstata, como adenocarcinoma de próstata; tumores de vejiga, como carcinoma de células escamosas de transición; tumores del sistema RES, tales como linfoma nodular o difuso de células B o T, plasmocitoma y leucemia aguda o crónica; tumores de piel, como melanoma maligno; y tumores de tejidos blandos, tales como sarcoma de tejidos blandos y leiomiosarcoma. Son de especial interés los tumores cerebrales, como el astrocitoma, el oligodendroglioma, el ependimoma, los meduloblastomas y el tumor ectodérmico neural primitivo. Se incluyen en esta categoría los gliomas, glioblastomas y gliosarcomas.

Específicamente, los siguientes antígenos están asociados con los siguientes tipos de cáncer y pueden usarse en las plataformas y procedimientos descritos en la Tablal:

Tabla 1: Cánceres antí enos asociados

El estado inmunitario del individuo puede ser cualquiera de los siguientes: el individuo puede no haber recibido tratamiento inmunitario previo con respecto a ciertos antígenos asociados a tumores presentes en la composición, en cuyo caso las composiciones pueden administrarse para iniciar o promover la maduración de una respuesta antitumoral. Es posible que el individuo no exprese actualmente inmunidad antitumoral, pero puede tener memoria inmunitaria, particularmente memoria de células T relacionada con un antígeno asociado al tumor comprendido en la vacuna, en cuyo caso las composiciones pueden administrarse para estimular una respuesta de memoria. El individuo también puede tener inmunidad activa (inmunidad humoral o celular, o ambas) a un antígeno asociado a un tumor comprendido en la vacuna, en cuyo caso las composiciones pueden administrarse para mantener, reforzar o madurar la respuesta, o reclutar otras partes del sistema ¡nmunitario. El sujeto debe ser al menos parcialmente inmunocompetente, de modo que la vacuna pueda inducir respuestas de células T endógenas.

En otra realización, el antígeno puede comprender un agente infeccioso. Los ejemplos de agentes infecciosos que pueden tratarse utilizando las plataformas y procedimientos descritos en esta solicitud incluyen, entre otros, virus de la influenza, virus sincitial respiratorio (RSV), virus del papiloma humano (HPV), virus de la hepatitis B (HBV), virus de la hepatitis C (HVC), virus linfotrópico T humano tipo 1, virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH), virus de Epstein-Barr (VEB), citomegalovirus y otros herpesviridae. Otros ejemplos incluyen las especies Listeria monocytogenes, Salmonella, Mycobacterium tuberculosis, Plasmodium. (Malaria), Toxoplasma gondii y Trypanosoma cruzi.Específicamente, se ha demostrado que las CAB pueden usarse para inmunizar ratones y protegerlos contra la infección ocular con HSV-2 (Herpesviridae), que en ratones es una infección letal.

Las CAB descritas en esta solicitud pueden exponerse o reticularse a más de un antígeno de forma simultánea o secuencial. Por ejemplo, las CAB descritas en esta solicitud pueden exponerse a 2, 3, 4, 5, 6 o más antígenos de forma simultánea o secuencial, o las CAB cargadas con diferentes antígenos individuales pueden combinarse juntos para su administración.

Las CAB descritas en esta solicitud pueden expandirse significativamente en comparación con una poblacion de células B no expuestas al género Clamidia (incluido C. trachomatis, C. psittaci y C. muridarum) o una proteína o sus fragmentos. Como se usa en esta solicitud, la expansión de las células B incluye la estimulación de la proliferación de las células así como la prevención de la apoptosis u otra muerte de las células. Como se usa en esta solicitud, «cultivo» e «incubación» se usan para indicar que las células se mantienen en el medio de cultivo celular durante un período de tiempo con los aditivos apropiados (células alimentadoras, citocinas, agonistas, otras moléculas estimulantes o medios, que pueden incluir tampones, sales, azúcares, suero u otros componentes varios). Los expertos en la técnica apreciarán que el tiempo de cultivo o incubación se puede variar para permitir una expansión adecuada, para ajustar las diferentes densidades o frecuencias celulares de subconjuntos individuales y para permitir que un investigador cronometre adecuadamente el uso de las células. Por tanto, un experto en la técnica puede determinar empíricamente la longitud de cultivo precisa.

Las CAB pueden tener un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y/o niveles de expresión de moléculas coestimuladoras superiores en comparación con las células B inactivas o en reposo. Por ejemplo, las CAB pueden tener 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 60, 70, 90, 100% más de MHC y/o nivel de expresión de moléculas coestimuladoras en comparación con las células B inactivas, o con las células B que no se han visto expuestas al género Clamidia (incluidas C. trachomatis, C. psittaci y C. muridarum) o una proteína o uno de sus fragmentos. Las CAB pueden tener 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más veces más de MHC y nivel de expresión de molécula coestimuladora en comparación con las células B inactivas o con las células B que no han sido expuestas al género Clamidia (incluidas C. trachomatis, C. psittaci y C. muridarum)o una proteína o uno de sus fragmentos.

Las CAB pueden tener una capacidad mejorada para presentar antígeno y activar las células T en comparación con las células B inactivas. Por «capacidad mejorada» se entiende que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 60, 70, 90 o 100 % más de capacidad para presentar antígeno y activar células T en comparación con una población de células que no han sido expuestas al género Clamidia (incluidas C.trachomatis, C. psittaci y C. muridarum) o una proteína o uno de sus fragmentos. Las CAB pueden tener 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más de capacidad para presentar antígeno y activar las células T en comparación con una población de células que no han sido expuestas al género Clamidia (incluidas C.trachomatis, C. psittaci y C. muridarum)o una proteína o uno de sus fragmentos.

Las CAB pueden migrar a los órganos linfoides secundarios a una tasa mayor que las células B inactivas, o las células B que no han sido expuestas al género Clamidia (incluidas C. trachomatis, C. psittaci y C. muridarum) o una proteína o uno de sus fragmentos. Por ejemplo, las CAB pueden migrar a una velocidad de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 60, 70, 90 o 100% más rápido en comparación con una población de células que no han estado expuestas al género Clamidia (incluidas C. trachomatis, C. psittaci y C. muridarum)o una proteína o uno de sus fragmentos. Las CAB pueden migrar a una tasa que es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más veces en comparación con una población de células que no han sido expuestas al género Clamidia (incluidas C.trachomatis, C. psittaci y C. muridarum) o una proteína o uno de sus fragmentos.

Las CAB pueden secretar citocinas para mejorar el reclutamiento de células T a una tasa mayor que las células B inactivas. Por ejemplo, las CAB pueden reclutar realce T-celular a una tasa mayor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 60, 70, 90, o 100% en comparación con una población de células que no han sido expuestas al género Clamidia (incluidas C. trachomatis, C. psittaci y C. muridarum) o una proteína o un uno de sus fragmentos. Las CAB mejoran el reclutamiento de células T a una tasa de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más veces en comparación con una población de células que no han sido expuestas al género Clamidia (incluidas C.trachomatis, C.

psittaci y C. muridarum) o una proteína o uno de sus fragmentos.

Las CAB descritas en esta solicitud pueden realzar además su actividad al poner en contacto con un factor de activación de células B, p. ej., cualquiera de una variedad de citocinas, factores de crecimiento o líneas celulares que se sabe que activan y/o diferencian células B (véase, por ejemplo, Fluckiger, y col. Blood 199892: 4509-4520; Luo, y col., Blood 2009 113: 1422-1431). Tales factores pueden seleccionarse del grupo que consiste, de modo no taxativo, en IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL- 9, IL-10, IL-1 1, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL -34 e IL-35, IFN-y, IFN-a, IFN-p, IFN-6, quimiocinas de tipo C XCL1 y XCL2, quimiocinas de tipo C-C y quimiocinas de tipo CXC, y miembros de la superfamilia de TNF {p. ej., TNF-a, ligando 4-1 BB, factor de activación de células B (BLyS), ligando FAS, sDC40L (incluidas las versiones multiméricas de sDC40L; por ejemplo, DC40L recombinante soluble marcado con histidina en combinación con mAb anti-poli-histidina para agrupar múltiples moléculas sDC40L juntas), linfotoxina, OX40L, RANKL, TRAIL), CpG y otros agonistas del receptor tipo Toll (p. ej., CpG).

En particular, las CAB pueden ponerse en contacto o cultivarse en células alimentadoras. En otros casos, el sistema de cultivo aquí descrito se lleva a cabo en ausencia de células alimentadoras, proporcionando ventajas sobre otros sistemas conocidos en la técnica que requieren células alimentadoras. Cuando se pueden usar células alimentadoras, las células alimentadoras son una línea celular estromal, por ejemplo, las líneas celulares estromales murinas S17 o MS5. En un caso adicional, las células DC19 purificadas pueden cultivarse en presencia de fibroblastos que expresan el ligando DC40 en presencia de citocinas del factor activador de células B tales como IL-10 e IL-4. El DC40L también se puede proporcionar unido a una superficie tal como una placa de cultivo de tejidos o una microesfera. En otro caso, las células B purificadas pueden cultivarse en presencia o ausencia de células alimentadoras, con DC40L en presencia de una o más citocinas o factores seleccionados de IL-10, IL-4, IL-7, p-ODN, ADN CpG, IL-2, IL-15, IL6, IFN-a e IFN-6.

Los factores de activación de las células B se pueden proporcionar mediante la transfección en la célula B u otra célula alimentadora, como se describe en el documento PCT/US2000/030426. En este contexto, uno o más factores que promueven la diferenciación de la célula B en una célula secretora de anticuerpos y/o se pueden usar uno o más factores que promueven la longevidad de la célula productora de anticuerpos. Tales factores incluyen, por ejemplo, Blimp-1, TRF4, factores antiapoptóticos como Bcl-xl o Bcl5, o mutantes constitutivamente activos del receptor DC40. Además, los factores que promueven la expresión de moléculas de señalización secuencia abajo, como los factores asociados al receptor de TNF (TRAF), también pueden usarse en la activación/diferenciación de las células B. A este respecto, la activación celular, la supervivencia celular y las funciones antiapoptóticas de la superfamilia del receptor de TNF están mediadas principalmente por TRAF1 -6 (véase, por ejemplo, RH Arch, y col., Genes Dev. 12 (1998), págs. 2821 - 2830). Los efectores secuencia abajo de la señalización de TRAF incluyen factores de transcripción en la familia NF-kB y AP-1 que pueden activar genes implicados en varios aspectos de las funciones celulares e inmunitarias. Además, se ha demostrado que la activación de NF-kB y AP-1 proporciona protección a las células frente a la apoptosis mediante la transcripción de genes antiapoptóticos.

La plataforma puede realizarse tanto ex vivo como in vivo, total o parcialmente. «Ex vivo» se refiere a procedimientos realizados dentro o sobre células o tejidos en un entorno artificial fuera de un organismo con una alteración mínima de las condiciones naturales. Por el contrario, la expresión «in vivo» se refiere a un procedimiento que se lleva a cabo dentro de organismos vivos en su estado normal e intacto, mientras que un procedimiento «in vitro» se lleva a cabo utilizando componentes de un organismo que han sido aislados de su contexto biológico habitual. Por ejemplo, las células pueden exponerse al género Clamidia inactivado (incluidas C. trachomatis, C. psittaci y C. muridarum) o péptido o uno de sus fragmentos in vivo, o a un género Clamidia vivo o inactivado (incluidas C. trachomatis, C. psittaci y C. muridarum) o péptido de la misma ex vivo, cuyo procedimiento se describe más detalladamente en esta solicitud. A continuación, las células B expandidas se exponen o se reticulan con un antígeno para que puedan diferenciarse en consecuencia. Nuevamente, esto puede realizarse in vivo o ex vivo. Por ejemplo, el antígeno puede inyectarse directamente en un sujeto, o las células B del sujeto pueden exponerse o reticularse con el antígeno modificado in vitro (ex vivo), con las células B diferenciadas expandidas devueltas a continuación al sujeto. Los CAB se pueden usar, por ejemplo, en la administración in vivo directa, terapia somática ex vivo, dispositivos implantables in vivo y dispositivos extracorpóreos ex vivo.

Vacunas y procedimientos de tratamiento

También se describe en esta solicitud un procedimiento para tratar a un sujeto que lo necesita, el procedimiento comprende: a) obtener células B del sujeto; b) exponer las células B de la etapa a) a Chlamydia trachomatis, o una proteína activante, péptido o uno de sus fragmentos; c) exponer las células B de la etapa b) a un antígeno, donde el antígeno no deriva del género Clamidia (incluidas C. trachomatis, C. psittaci y C. muridarum), o de una proteína, péptido o fragmento de los mismos, obteniéndose de ese modo células B activadas por Clamidia presentadoras de antígeno activadas (CAB); y d) tratar el sujeto con las células B activadas por Clamidia presentadoras de antígeno activadas de la etapa c).

El sujeto que está siendo tratado puede tener una variedad de enfermedades o trastornos. Cualquier enfermedad o trastorno que pueda tratarse usando células B activadas puede tratarse usando los procedimientos descritos en esta solicitud. Por ejemplo, las enfermedades infecciosas y el cáncer pueden tratarse utilizando estos procedimientos.

También se describe una vacuna que comprende las células B activadas por Clamidia descritas en esta solicitud. En el presente documento se describe una vacuna basada en células para la inmunización ex vivo, así como composiciones y procedimientos para la inmunización in vivo para provocar una respuesta inmunitaria dirigida contra un antígeno. En un escenario, se describe un sujeto con un tipo de cáncer que expresa un antígeno específico de tumor. Esto puede dar como resultado un mejor resultado terapéutico para el paciente, evidenciado por, por ejemplo, una desaceleración o disminución del crecimiento de las células cancerosas o un tumor sólido que expresa el antígeno específico del tumor, o una reducción en el número total de células cancerosas o carga tumoral total. En un escenario relacionado, se ha diagnosticado que el paciente tiene una infección viral, bacteriana, fúngica o de otro tipo, que está asociada con la expresión de un antígeno particular, por ejemplo, un antígeno viral. Esta vacuna puede dar como resultado un resultado terapéutico mejorado para el paciente, como lo demuestra una desaceleración en el crecimiento del agente infeccioso causante dentro del paciente y/o una disminución o eliminación de los síntomas detectables típicamente asociados con la enfermedad infecciosa particular.

Cuando se prepara la vacuna para su administración, se puede combinar con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable para formar una formulación farmacéutica o una forma de dosificación unitaria. El total de ingredientes activos en tales formulaciones incluye de 0,1 a 99,9% en peso de la formulación. Una sustancia «farmacéuticamente aceptable» es un vehículo, diluyente, excipiente y/o sal que es compatible con los otros ingredientes de la formulación, y no es perjudicial para su receptor. El ingrediente activo para la administración puede estar presente en forma de polvo o en forma de gránulos; como una solución, una suspensión o una emulsión.

Los vectores de expresión, células transducidas, polinucleótidos y polipéptidos (ingredientes activos) se pueden formular y administrar para tratar una variedad de cuadros clínicos por cualquier medio que produzca contacto del ingrediente activo con el sitio de acción del agente en el cuerpo del organismo. . Pueden administrarse por cualquier medio convencional disponible para su uso junto con productos farmacéuticos, ya sea como ingredientes activos terapéuticos individuales o en una combinación de ingredientes activos terapéuticos. Pueden administrarse solos, pero generalmente se administran con un vehículo farmacéutico seleccionado con base en la vía de administración elegida y la práctica farmacéutica estándar.

En general, el agua, el aceite adecuado, la solución salina, la dextrosa acuosa (glucosa) y las soluciones de azúcares relacionados y los glicoles como el propilenglicol o los polietilenglicoles son vehículos adecuados para las soluciones parenterales. Las soluciones para administración parenteral contienen el ingrediente activo, agentes estabilizantes adecuados y, si es necesario, sustancias tampón. Los agentes antioxidantes como el bisulfato de sodio, el sulfito de sodio o el ácido ascórbico, solos o combinados, son agentes estabilizantes adecuados. También se utilizan el ácido cítrico y sus sales y el ácido etilendiaminotetraacético sódico (EDTA). Además, las soluciones parenterales pueden contener conservantes tales como cloruro de benzalconio, metil- o propil-parabeno y clorobutanol. Los vehículos farmacéuticos adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia estándar en este campo.

Además, se pueden emplear procedimientos farmacéuticos estándar para controlar la duración de la acción. Estos son bien conocidos en la técnica e incluyen preparaciones de liberación controlada y pueden incluir macromoléculas apropiadas, por ejemplo polímeros, poliésteres, poliaminoácidos, polivinilo, pirrolidona, etilenvinilacetato, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o sulfato de protamina. La concentración de macromoléculas, así como los procedimientos de incorporación, se pueden ajustar para controlar la liberación. Además, el agente puede incorporarse en partículas de materiales poliméricos tales como poliésteres, poliaminoácidos, hidrogeles, poli (ácido láctico) o copolímeros de etilenvinilacetato. Además de incorporarse, estos agentes también pueden usarse para atrapar el compuesto en microcápsulas.

Las formulaciones farmacéuticas que contienen los agentes terapéuticos descritos en esta solicitud se pueden preparar mediante procedimientos conocidos en la técnica utilizando ingredientes conocidos y que se pueden obtener fácilmente. Los agentes terapéuticos también pueden formularse como soluciones apropiadas para la administración parenteral, por ejemplo, por vía intramuscular, subcutánea o intravenosa. Las formulaciones farmacéuticas de los vectores de la invención también pueden adoptar la forma de una solución o dispersión acuosa o anhidra, o alternativamente la forma de una emulsión o suspensión.

La dosis administrada es una cantidad «efectiva» para producir una respuesta terapéutica deseada, ya sea la estimulación de una respuesta inmunitaria o el tratamiento del cáncer como se define en otra parte de este documento Para las composiciones farmacéuticas de esta invención, las dosis efectivas caen típicamente dentro del rango de aproximadamente 105a 1011células. Preferiblemente, se utilizan entre aproximadamente 106y 101° células;más preferiblemente se utilizan entre aproximadamente 1 x 107y 2 x 109 células. Cuando se usan múltiples dosis en combinación para lograr un efecto deseado, cada una cae dentro de la definición de una cantidad efectiva. Las dosis se pueden administrar varias veces al día, o todos los días, o cada dos días, o cada tres días, etc. Se pueden administrar dosis adicionales, como una vez al mes o semanalmente, hasta que se logre el efecto deseado. Posteriormente, y particularmente cuando el beneficio inmunológico o clínico parece disminuir, se pueden administrar dosis de refuerzo o de mantenimiento adicionales según se requiera.

Los diversos componentes de la vacuna celular están presentes en una «combinación efectiva», lo que significa que hay cantidades suficientes de cada uno de los componentes para que la vacuna sea eficaz. Puede usarse cualquier número de células componentes u otros constituyentes, siempre que la vacuna sea efectiva en su conjunto. Esto también dependerá del procedimiento utilizado para preparar la vacuna.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar después, antes, en lugar de, o en combinación con, otras terapias relacionadas con la generación de una respuesta inmunitaria o el tratamiento del cáncer en el sujeto. Por ejemplo, el sujeto puede ser tratado previa o simultáneamente mediante citorreducción quirúrgica, quimioterapia, radioterapia, inhibidores de puntos de control y otras formas de inmunoterapia y transferencia adoptiva. Cuando se usan tales modalidades, se emplean preferiblemente de una manera o en un momento que no interfiera con la inmunogenicidad de las composiciones descritas en esta solicitud. Al sujeto también se le puede haber administrado otra vacuna u otra composición para estimular una respuesta inmunitaria. Tales composiciones alternativas pueden incluir vacunas de antígenos tumorales, vacunas de ácido nucleico que codifican antígenos tumorales, vacunas antiidiotípicas y otros tipos de vacunas celulares, incluidas líneas de células tumorales que expresan citocinas.

En esta solicitud, se describen terapias de combinación, que comprenden la administración de una combinación de vacuna celular descrita en esta solicitud junto con otra estrategia destinada a proporcionar una respuesta inmunológica antitumoral. En una terapia de combinación, el sujeto recibe un implante intratumoral de linfocitos alogénicos estimulados, ya sea antes, durante o después del tratamiento en un sitio distante del tumor con una composición que comprende las CAB cargados con antígeno descritos en esta solicitud. En otra terapia de combinación, el sujeto se trata en sitios distantes del tumor con una composición de vacuna celular alternativa, ya sea antes, durante o después del tratamiento con las CAB cargados con antígeno descritos en esta solicitud. En otra terapia de combinación, el sujeto recibe inhibidores de puntos de control. Cuando se emplean una pluralidad de diferentes composiciones o modos de administración a lo largo del curso de la terapia, el orden y el momento de cada elemento de tratamiento se elige para optimizar el efecto inmunoestimulador o antitumoral.

Métodos de producción

En esta solicitud, se describe un procedimiento para producir células B activadas por Clamidia presentadoras de antígeno activadas en un sujeto, el procedimiento comprende: a) obtener células B de un sujeto; b) exponer las células B de la etapa a) a Chlamydia trachomatis, o una proteína activadora, péptido, o uno de sus fragmentos; y c) exponer las células B de la etapa b) a un antígeno deseado, donde el antígeno no deriva del género Clamidia (incluidas C. trachomatis, C. psittaci y C. muridarum) a de una proteína, péptido o uno de sus fragmentos, obteniendo de ese modo células B activadas por Clamidia presentadoras de antígeno activadas (CABs).

Cualquiera de una variedad de medios de cultivo se puede utilizar en los presentes procedimientos como sería conocido por el experto (véase, por ejemplo,Current Protocols in Cell Culture, 2000-2009 por John Wiley & Sons, Inc.). En un caso, los medios para usar en los procedimientos descritos en esta solicitud incluyen, de modo no taxativo, medio Dulbecco modificado (con o sin suero fetal bovino u otro suero apropiado). Los medios ilustrativos también incluyen, de modo no taxativo, IMDM, RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 y X-Vivo 20. En otros casos, el medio puede comprender un tensioactivo, un anticuerpo, plasmanato o un agente reductor (por ejemplo, N-acetilcisteína, 2-mercaptoetanol) o uno o más antibióticos. En algunos casos, también se pueden usar IL-2, IL-6, IL-10, DC40L soluble y un potenciador de reticulación. Las células B se pueden cultivar en condiciones y durante períodos de tiempo suficientes para lograr la activación deseada. En ciertos casos, las células B se cultivan en condiciones y durante períodos de tiempo suficientes para que 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o aun el 100% de las células B se activen según se desee.

En un ejemplo, las CAB se pueden generar utilizando un sistema de selección inmunomagnético negativo o un sistema RosetteSep ™ para agotar todos los tipos de células excepto las células DC4+ T y las células B de PBMC o sangre entera. Las células seleccionadas se cultivan en presencia del género Clamidia e IL-2 (con pases celulares cada 1-5 días (preferiblemente cada 2-3 días) que repone los medios que contienen el género Clamidia e IL-2), hasta que se produzcan cantidades adecuadas de CAB para su uso con los procedimientos en esta solicitud. En el momento de la recolección para su uso, la evaluación citométrica de flujo de frecuencia de células T CD4+ se puede usar para determinar si se necesita selección inmunomagnética adicional para el agotamiento adicional de células T CD4+.

La inducción de la activación de células B puede medirse mediante técnicas como la incorporación de 3H-timidina, que mide la síntesis de ADN asociada con la proliferación celular, o mediante ensayos de flujo citométrico que usan marcadores fluorescentes tales como succinimidil éster de carboxifluoresceína. Para una medición óptima de la proliferación de células B, se puede añadir IL-2 o IL-4 al medio de cultivo en concentraciones apropiadas. Alternativamente, la activación de las células B puede medirse en función de la secreción de inmunoglobulina.

Después del cultivo durante un período de tiempo apropiado, tal como de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más días, generalmente alrededor de 3 días, se puede agregar un volumen adicional de medio de cultivo. El sobrenadante de cultivos individuales puede recogerse en varios momentos durante el cultivo y cuantificarse para IgM e IgG1 como se describe enNoelle y col.., (1991) J. Immunol. 146:1 118-1 124. En otros casos, puede usarse un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA) para medir IgM u otro isotipo de anticuerpo. En ciertos casos, las determinaciones de IgG pueden realizarse usando anticuerpos disponibles comercialmente tales como IgG antihumana de cabra, como anticuerpo de captura, seguido de detección usando cualquiera de una variedad de reactivos de detección apropiados tales como Ig antihumana de cabra biotinilada, fosfatasa alcalina de estreptavidina y sustrato.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Procedimientos de producción y uso de células B activadas porclamidia

Las células B que se utilizarán con los procedimientos y la plataforma descritos en esta solicitud se pueden obtener de una amplia variedad de fuentes que incluyen células mononucleares de sangre periférica, así como órganos linfoides primarios y secundarios, como médula ósea y ganglios linfáticos, respectivamente. En los seres humanos, por ejemplo, las células B comprenden aproximadamente del 1 al 15% del total de leucocitos de sangre periférica, del 20 al 25% de células de los ganglios linfáticos y hasta el 50% de esplenocitos. Si se desea, la frecuencia de células B se puede expandir in vivo, mediante la administración de citocinas apropiadas y factores de crecimiento de reclutamiento, por ejemplo, IL-4, GM-CSF e IL-3, al paciente antes de obtener sangre periférica. Las células mononucleares se obtienen de estos tejidos, por ejemplo, de sangre periférica mediante el uso de centrifugación a través de un gradiente de densidad, mientras que las células de los ganglios linfáticos se pueden aislar, por ejemplo, de las amígdalas intactas picando el tejido, seguido de un esfuerzo para obtener una sola suspensión celular. Preferiblemente, las células mononucleares se obtienen de sangre periférica. La cantidad puede variar, pero inicialmente se pueden extraer aproximadamente 500 ml de sangre de un paciente (esto se puede repetir cada ocho semanas, por ejemplo). Las células mononucleares no separadas de la sangre periférica u órganos linfoides en suspensiones unicelulares se cultivan en medio RPMI 1640 complementado con FBS que contiene piruvato, L-glutamina, aminoácidos no esenciales y antibióticos adicionales o en medios sin suero (por ejemplo, X-VIVO ™ 20) complementado con antibióticos. Para generar CAB, las células mononucleares a granel se pueden cultivar con C. trachomatis EB inactivado, purificado como entienden los expertos en la técnica, o lisados de C. trachomatis EB, generados usando el reactivo de extracción de proteínas BugBuster® disponible comercialmente. Todos los géneros Clamidia probados (incluidas C. trachomatis [cepas oculogenitales tales como D y E, así como las cepas lymphogranuloma venereum tales como L2], C. psittaci y C. muridarum), muestran la misma efectividad para activar células B de mamífero en reposo. Las células se cultivan con C. trachomatis en medio completo sin manipulación adicional ni suplementación con citocinas. Después de 3 días de cultivo, las células totales pueden crioconservarse para su uso posterior o cultivarse durante 4 a 6 días después de la adición inicial de C. trachomatis, si se proporciona un medio caliente fresco el día 3 (no es necesario proporcionar C. trachomatis adicional EB en este punto), para uso inmediato. El uso de estas condiciones da como resultado la proliferación y activación de las células B, sin proliferación de las células T. Curiosamente, cuando las células estimuladas con C. trachomatis enteras se criopreservan después de 3 días y a continuación se descongelan y se ponen en cultivo nuevamente con medio tibio fresco, las CAB comienzan a proliferar nuevamente durante la noche.

Mediante la selección apropiada del antígeno y la APC, se pueden promover las respuestas inmunitarias deseadas Las CAB frescas o crioconservadas pueden pulsarse con el antígeno deseado un día antes de su uso si se va a usar un antígeno de proteína entera (incluidos los lisados celulares) o unas pocas horas antes del uso si se va a usar un péptido. Alternativamente, la transfección de los antígenos deseados se puede realizar mediante transfección de ARN o infección de CAB con vectores virales (por ejemplo, vectores adenovirales o retrovirales). Por otro lado, las CAB pueden aumentar aún más su actividad de APC mediante la adición de varios factores administrados, ya sea por separado o de forma concomitante, como la carga o reticulación de las CAB con glucoesfingolípidos activadores de células NKT de tipo I (por ejemplo, alfa-galactosilceramida), fosfolípidos activadores de células NKT de tipo II o lisofosfolípidos (por ejemplo, lisofosfatidiletanolamina), y/o bifosfonatos activadores de células T gammadelta (por ejemplo, ácido zoledrónico) además del antígeno de interés. La transfección y la infección con el vector también se pueden usar para inducir la expresión por las CAB de una variedad de citocinas, factores coestimuladores u otras proteínas, incluidos los agentes anticancerígenos, con el fin de aumentar su actividad in vivo.

Después de la carga de antígeno y cualquier otra manipulación deseada, se puede preparar CAB para su uso. Si se utilizan células mononucleares de sangre periférica (PBMC) como fuente de células mononucleares, es necesaria la separación inmunomagnética de las células antes de su uso, ya que las CAB solo representarán hasta el 50% de la población celular obtenida después de 4-6 días de cultivo. Se puede utilizar un kit de enriquecimiento de células B humanas EasySep ™ personalizado sin agotamiento de DC2 y DC43 para este propósito, con el cual >95% de CAB se obtiene sin células T, monocitos o DC detectables. Sin embargo, debería ser adecuado cualquier sistema de selección inmunomagnético similar disponible comercialmente. Si se usaran órganos linfoides como fuente de células mononucleares, la alta frecuencia inicial de células B (25-50% del total de células) y la fuerte estimulación que reciben de C. trachomatis hacen que los cultivos >95% de CAB después de 4-6 días, sin necesidad de purificación adicional de CAB antes de su uso. A partir de entonces, las CAB autólogas generadas se pueden administrar al paciente seleccionado utilizando protocolos de administración múltiple. Las CAB se pueden administrar al paciente por cualquier medio adecuado, incluso, por ejemplo, infusión intravenosa, inyección en bolo y administración dirigida en el sitio a través de un catéter u otros medios. Debido a su facilidad para la criopreservación, las CAB se pueden administrar inmediatamente después de la producción o potencialmente varios años después si se desea.

Ejemplo 2: Métodos para conjugar antígenos con células B activadas porClamidia

Las CAB se produjeron como se indica en el Ejemplo 1. Las CAB frescas o crioconservadas se pueden conjugar o reticular con el antígeno deseado (proteína o péptido) justo antes de la administración al sujeto. La conjugación o reticulación se puede realizar, por ejemplo, usando el reticulante de longitud cero l-etil-3- (3-dimetilaminoprop1) -carbodiimida (EDAC). Las CAB se lavan con PBS (pH 6,0) y se resuspenden a 2 * 108/ml, a continuación se agrega EDAC a la suspensión celular, seguido de la adición del antígeno (proteína o péptido) a una concentración adecuada, se mezcla completamente y se incuba durante 1 hora a 4 ° C. Después de la incubación, las células reticuladas con antígeno se lavan con PBS (pH 7,4) y pueden someterse a un procesamiento adicional o pueden prepararse para su administración. Este procedimiento se puede realizar independientemente del origen de las CAB (autólogas o alogénicas). Es posible utilizar otros tipos de reticulantes dependiendo de la naturaleza del antígeno (proteína, péptido, ácido nucleico, lípido o carbohidrato) y la compatibilidad del reticulante con células de mamíferos vivos. La figura 12 muestra el uso de reticulantes.

Las CAB pueden aumentar aún más su actividad de APC mediante la adición de varios factores administrados, ya sea por separado o de forma concomitante con la reticulación de antígenos, como la carga o reticulación de las c A b con glucoesfingolípidos activadores de células NKT de tipo I (por ejemplo, alfa-galactosilceramida), fosfolípidos activadores de células NKT de tipo II o lisofosfolípidos (por ejemplo, lisofosfatidiletanolamina), y/o bifosfonatos activadores de células T gammadelta (por ejemplo, ácido zoledrónico) además del antígeno de interés. La transfección y la infección con el vector también se pueden usar para inducir la expresión por las CAB de una variedad de citocinas, factores coestimuladores u otras proteínas, incluidos los agentes anticancerígenos, con el fin de aumentar su actividad in vivo.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en esta solicitud tienen el mismo significado según lo entiende comúnmente el experto en la técnica a la que pertenece la presente invención.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Una plataforma in vitro o ex vivo para crear una vacuna basada en células contra un antígeno de interés, donde la plataforma comprende:

a. una población de células B activadas por Clamidia (CAB), que han sido expuestas a bacterias del género Clamidia y

b. el antígeno de interés, donde el antígeno de interés no se deriva de un género Clamidia;

donde el antígeno de interés está expuesto y/o reticulado a las CAB.

2. Una plataforma según la reivindicación 1, donde el género Clamidia comprende C. trachomatis, C. psittaci o C. muridarum.

3. Una plataforma según la reivindicación 1, donde la plataforma comprende más de un antígeno.

4. Una plataforma según la reivindicación 3, donde la plataforma comprende más de dos antígenos.

5. Una plataforma según la reivindicación 1, donde el antígeno de la etapa b) comprende un antígeno relacionado con un tumor.

6. Una plataforma según la reivindicación 1, donde el antígeno de la etapa b) comprende un agente infeccioso.

7. Un procedimiento in vitro para elaborar una vacuna contra un antígeno de interés, comprendiendo el procedimiento: a. poner en contacto una población de células B con bacterias del género Clamidia enteras para así proporcionar células B activadas por Clamidia (CAB) y

b. poner en contacto dichas CAB activadas con un antígeno de interés, donde el antígeno no se deriva de un género Clamidia;

c. proporcionar así una vacuna que comprende CAB activadas en contacto con el antígeno de interés.8

8. Una vacuna que comprende CAB activadas que se pueden obtener según el procedimiento de la reivindicación 7.