CN110603053A

CN110603053A - 重组衣原体活化的b细胞平台及其使用方法

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Publication number: CN110603053A
Application number: CN201880020410.9A
Authority: CN
Inventors: 托马斯·切尔佩斯; 鲁道夫·D·维赛迪·米格尔; 纳蒂维达德·鲁伊斯
Original assignee: Ohio national innovation foundation
Current assignee: Ohio national innovation foundation; Ohio State Innovation Foundation
Priority date: 2017-03-23
Filing date: 2018-03-23
Publication date: 2019-12-20
Also published as: WO2018175875A1; EP3600401A1; US20210106668A1; CA3057318A1; AU2018237338A1; JP2020513836A

Abstract

本文公开了重组衣原体活化的B细胞(CAB)平台、疫苗及其使用方法。本发明公开了一种增强B细胞群的方法，所述方法包括在适于增强所述B细胞群的条件下使所述B细胞暴露于衍生自衣原体属物种(Chlamydia spp.)的重组多肽，使得所述B细胞发生扩增和分化，并且所述B细胞暴露于或交联至抗原。本发明还公开了使用衍生自衣原体属物种(Chlamydia spp.)的重组多肽作为诱导对无关抗原的增强的体液免疫(例如，对HIV抗原的体液免疫)的佐剂的方法。本发明还公开了制备所述CAB以及用所述CAB治疗对其有需要的受试者的方法。

Description

重组衣原体活化的B细胞平台及其使用方法

相关申请的交叉引用

本专利申请要求于2017年3月23日提交的美国临时申请号62/475,413的优先权，其全文以引用方式并入本文。

背景技术

树突状细胞(DC)被认为是强效的抗原递呈细胞(APC)和针对感染性疾病和癌症的预防性免疫的有效诱导物。这些特性已经引起了将DC用作细胞疫苗方面的强烈关注；尤其是外周血单核细胞分化形成的DC。然而，使用DC的临床试验仅显示出非常低的总体临床反应率，突出了改善基于DC的疫苗的需要。对这些细胞疗法成功的具体限制在于可由单核细胞产生的DC数量有限，因为DC不能离体扩增，使得难以产生大量这些细胞以用于长期的多施用方案。此外，DC在冷冻保存后在其主要免疫应答的能力方面具有显著程度的可变性。这些限制变得尤其重要，因为更大的DC数量和治疗已显示引起更强烈的抗肿瘤免疫并改善临床反应。

B细胞代表大量有效的APC，并且可能是DC的唯一自体同源APC替代物，其可离体产生以用于免疫治疗目的。虽然已经描述了B细胞在体内诱导T细胞耐受或甚至阻断抗肿瘤免疫应答，但是这些报道限于缺乏辅助和共刺激分子的重要表达的静息B细胞。通过细胞表达CD40L与细胞因子或Toll样受体(TLR)配体结合而活化变成为有效APC的B细胞同样不诱导最佳B细胞活化或需要使用细胞系。这些限制使它们不适用于临床应用。

活化的B细胞具有增强的MHC和共刺激分子表达，并且表现出极大改善的抗原递呈能力以完全活化幼稚和记忆T细胞。同样重要的是，活化的B细胞通过分泌趋化因子募集T细胞并迁移至次级淋巴器官；关键要求是有效抗肿瘤免疫应答的体内诱导。因为B细胞易于离体获得，所以它们是用于免疫治疗应用的具有吸引力的自体APC来源。此外，活化的B细胞表达MHC I类和II类分子，因此可与广泛范围的抗原一起使用。因此，本领域需要一种增加B细胞的活化和增殖的实际方法，以提供靶向多种类型的肿瘤和感染性疾病的细胞疫苗。

发明内容

本文公开了使用衣原体活化的B细胞作为免疫疗法的细胞疫苗平台以及使用该平台的方法。本文公开了引起强烈B细胞活化的沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)主要外膜蛋白(MOMP)的重组型式。这些重组蛋白可用于产生衣原体活化的B细胞(CAB)，其可用作基于衣原体的疫苗中的免疫原。这些重组蛋白也可用于增加产量以及抗体对其他无关抗原的亲和力。

具体地讲，本文公开了用于产生活化的抗原递呈细胞(APC)的平台，其中该平台包括：多肽或糖多肽，该多肽或糖多肽包括衣原体属物种(Chlamydia spp.)的天然存在的主要外膜蛋白(MOMP)的衍生物，其中该天然存在的MOMP被修饰为使得MOMP的至少一个半胱氨酸残基被不同的氨基酸取代；B细胞群；以及抗原，其中该抗原不衍生自衣原体属物种(Chlamydia spp.)。本发明还公开了使用本文所述的平台产生的疫苗。还描述了由本文所述的平台产生的衣原体活化的B细胞。

本文公开了一种用于由受试者产生活化的、抗原递呈的衣原体活化的B细胞的方法，该方法包括：用质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)，其中该质粒包括编码衣原体的主要外膜(MOMP)蛋白的核酸和大肠杆菌OmpA或其他大肠杆菌蛋白的野生型或改变的信号序列，其中大肠杆菌随后产生重组MOMP；使受试者的B细胞暴露于重组MOMP；以及使B细胞暴露于期望的抗原，其中该抗原不衍生自衣原体属物种(Chlamydia spp.)，从而获得活化的抗原递呈的衣原体活化的B细胞(CAB)。

本文公开了一种治疗对其有需要的受试者的方法，该方法包括：从受试者获得B细胞；使B细胞暴露于包括衣原体属物种(Chlamydia spp.)的天然存在的主要外膜蛋白(MOMP)的衍生物的多肽，其中该天然存在的MOMP被修饰为使得MOMP的至少一个半胱氨酸残基被不同的氨基酸取代；使B细胞暴露于抗原，其中该抗原不衍生自衣原体属物种(Chlamydia spp.)，从而获得活化的抗原递呈的衣原体活化的B细胞(CAB)；以及用该活化的抗原递呈的衣原体活化的B细胞治疗受试者。

本发明还公开了包括抗原和多肽的疫苗，其中该抗原不衍生自衣原体属物种(Chlamydia spp.)，该多肽包括衣原体属物种(Chlamydia spp.)的天然存在的主要外膜蛋白(MOMP)的衍生物，其中该天然存在的MOMP被修饰为使得MOMP的至少一个半胱氨酸残基被不同的氨基酸取代。

在附图和下面的具体实施方式中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据下面的具体实施方式和附图以及权利要求，本发明的其他特征、目标和优点将显而易见。

附图说明

图1示出了表达重组沙眼衣原体MOMP的大肠杆菌K-12菌株的产生的示意图。在其外膜上呈现MOMP的工程化大肠杆菌菌株的构建通过在大肠杆菌K-12中表达质粒编码的沙眼衣原体ompA(ompA_Ct)来实现。

图2示出了指示重组沙眼衣原体MOMP在大肠杆菌K-12中经历的加工和组装的图。外膜蛋白(OMP)必须被运输、加工并组装成β-桶状。信号序列(SS)将原蛋白靶向Sec易位子，其跨内膜(IM)易位蛋白。信号肽酶裂解SS，并且成熟蛋白质在周质伴侣和β-桶装配机(Bam复合物)的帮助下被靶向并组装成β-桶状构象。

图3示出了表明大肠杆菌OmpA信号序列(SS_EC)的使用如何允许重组沙眼衣原体MOMP(Ct-MOMP)在外膜中的充分转运和折叠的示意图。

图4A至图4E示出了携带pET23/42ChOmpA质粒的大肠杆菌菌株中MOMP的产生。可通过添加L-鼠李糖在菌株NR4424[基因型KRX(pET23/42ChOmpA)](图A和图B)中诱导MOMP的产生(图C)。在室温(～20℃，RT)或30℃下在超级肉汤(TB)中生长3小时或过夜(O/N)导致重组Ct-MOMP的产生。可在用考马斯蓝(图D)或抗MOMP抗血清(图E)染色的凝胶中检测Ct-MOMP。用箭头标记对应于Ct-MOMP的条带。还测试了来自对照菌株NR4432[基因型KRX(pET23/42)]的样本，其携带缺乏Ct-MOMP编码基因的载体对照。

图5A至图5B示出了当与TLR1/2激动剂组合时，在大肠杆菌中过表达的沙眼衣原体MOMP体外诱导人B细胞增殖的能力。使来自人PBMC的通过阴性免疫磁性选择分离的荧光标记B细胞和CD4⁺T细胞暴露于用载体KRX(pET23/42)(仅载体)或KRX(pET23/42ChOmpA)(MOMP)转染的灭活的大肠杆菌，或保持未刺激。如所指出的，荧光标记的B细胞和CD4⁺T细胞也在Pam3CSK4(TLR1/2激动剂)存在下暴露于相同的条件。4天后进行增殖B细胞的流式细胞术分析。(A)代表性点图示出了响应于大肠杆菌过表达MOMP的人B细胞的增殖。(B)在TLR1/2激动剂的存在下细胞暴露于两种灭活大肠杆菌菌株的归一化B细胞增殖的倍数增加。

具体实施方式

定义

本文所用的冠词“a”和“an”是指冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个)。以举例的方式，“要素”是指一个要素或多于一个要素。

当涉及可测量的值，诸如数量、持续时间等时，本文所用的“约”旨在涵盖距指定值的±20％或±10％，更优选地±5％，甚至更优选地±1％以及还更优选地±0.1％的变化，因为此类变量适合于执行所公开的方法。

术语“抗原组合物”是指包含刺激免疫系统并引起宿主或受试者的免疫应答的物质的组合物。

术语“引发免疫应答”是指响应于刺激(诸如抗原)在体内刺激免疫细胞。免疫应答由细胞免疫应答(例如T细胞和巨噬细胞刺激)和体液免疫应答(例如，B细胞和补体刺激和抗体产生)组成。可使用本领域熟知的技术测量免疫应答，包括但不限于抗体免疫测定法、增殖测定法等。

“预防性”治疗是向不表现出疾病病征或仅表现出疾病的早期病征的受试者施用以用于降低发展病变的风险的目的的治疗。本文所公开的疫苗可作为预防性治疗给予，以减少发展病变的可能性或如果发展则使病变的严重性最小化。

“治疗性”治疗是向表现出病变的病征或症状的受试者施用，以用于减少或消除那些病征或症状的目的的治疗。病征或症状可以是生物化学、细胞、组织学、功能性、主观或客观的。

术语“灭活”在本文用于描述微生物体，诸如衣原体属物种(Chlamydia spp.)(包括沙眼衣原体(C.trachomatis)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)和鼠嗜衣原体(C.muridarum))，这在本领域中也被称为“杀死的”或者“死亡的”微生物体。失活细菌是不具有感染特性的全细菌，并且由“活”细菌产生，不考虑该细菌先前是否以任何方式减弱。

多肽的“片段”是指比全长多肽或蛋白质表达产物小的多肽的任何部分。在一个方面，片段是全长多肽的缺失类似物，其中一个或多个氨基酸残基已从全长多肽移除。因此，“片段”是下文所述的缺失类似物的子集。

如本文所用，术语“抗体”是指可结合抗原上的特定表位，通常具有高度特异性和亲和力的免疫球蛋白分子。抗体可以是来源于天然来源或来自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。抗体可由本文所述的疫苗产生，并且可以多种形式存在，其包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、细胞内抗体(intracellularantibodies(intrabodies))、Fv、Fab和F(ab)2、以及单链抗体(scFv)、重链抗体，诸如骆驼科抗体、合成抗体、嵌合抗体和人源化抗体(Harlow等人，1999，Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY；Harlow等人，1989，Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y.；Houston等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人，1988，Science 242:423-426)。

当在生物体、组织、细胞或其组分的上下文中使用时，术语“异常”是指与显示“正常”(预期)相应特性的那些生物体、组织、细胞或其组分在至少一个可观察或可检测特征方面(例如，年龄、治疗、当日时间等)不同的那些生物体、组织、细胞或其组分。对于一个细胞或组织类型是正常或预期的特性对于不同的细胞或组织类型可能是异常的。

如本文所用，“减轻”疾病是指降低疾病或病症的至少一种病征或症状的频率或严重性。

如本文所用，“有效量”意指提供治疗或预防有益效果的量。

如本文所用，“免疫测定”是指使用能够特异性结合靶分子的抗体以检测并定量靶分子的任何结合测定。

如本文所用，“说明材料”包括出版物、记录、图表、或任何其他表达媒介，其可用于传达试剂盒中的本发明的化合物、组合物、方法、平台或体系用于操作本文所述方法的实用性。本发明的试剂盒的说明材料可例如附接到包含本发明的经鉴定化合物、组合物、平台或递送体系的容器，或连同包含本发明的经鉴定化合物、组合物、方法组件、平台或体系的容器一起装运。另选地，说明材料可与容器分开装运，使得说明材料和化合物由接收者配合使用。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两种氨基酸，并且不限于可构成蛋白质序列或肽序列的最大氨基酸数。多肽包括任何肽或蛋白质，其包含通过肽键彼此接合的两个或更多个氨基酸。如本文所用，术语是指短链，其也通常在本领域中被称为例如肽、低聚肽和低聚物，并且指长链，其一般在本领域中被称为蛋白质，所述蛋白质具有许多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源多肽、低聚肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽、或它们的组合。还包括糖肽，其是含有与构成肽的氨基酸残基的侧链共价连接的碳水化合物部分(聚糖)的肽。

“疾病”是动物的健康状况，其中动物不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有改善则动物的健康持续恶化。相比之下，动物的“病症”是其中动物能够维持体内平衡，但其中动物的健康状况比其没有病症时可能的健康状态较不利的健康状况。如果不及时治疗，病症并不一定会导致动物的健康状况进一步下降。

术语“受试者”是指为施用或治疗的目标的任意个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以是人类患者或兽医患者。术语“患者”是指接受临床医生(例如内科医生)治疗的受试者。

如本文所用，术语“治疗”或“治疗方案”是指用于减轻或改变病症或疾病状态的那些活性物质，例如旨使用药理学、外科、饮食和/或其他技术减少或消除疾病或病症的至少一种病征或症状的治疗过程。治疗方案可包括一种或多种药物的处方剂量或手术。治疗通常将是有益的并且减少或消除病症或疾病状态的至少一种病征或症状，但在一些情况下，治疗的效果将具有不可取的作用或副作用。治疗效果也将受到受试者的生理状态的影响，例如年龄、性别、遗传学、体重、其他疾病状况等。

术语“治疗有效量”是指研究者、兽医、医学博士或其它临床医生们正在探索的将引发组织、系统或者受试者的生物学或者医学应答的目标化合物的量。术语“治疗有效量”包括当施用时，足以防止足以防止所治疗的病症或疾病的一种或多种病征或症状发展或在一定程度上缓解的化合物的量。治疗有效量将根据化合物、疾病及其严重性和待治疗的受试者的年龄、体重等而有所不同。

“治疗”疾病作为术语用于本文，意指减少受试者经历的疾病或病症的至少一种病征或症状的频率或严重性。

除非特别指明，否则如本文所用，术语“细胞”是指单个细胞、细胞系、原代培养物或衍生自此类细胞的培养物。“培养物”是指包含相同或不同类型的分离细胞的组合物。细胞系是一种特定类型的细胞的培养物，其可无限期地复制，因此使得细胞系“永生”。细胞培养物可以是在诸如琼脂的培养基上生长的细胞群。原代细胞培养物是来自细胞或直接取自活生物体的培养物，其不是永生的。

术语“生物样品”是指组织(例如，组织活检)、器官、细胞(包括保持在培养物中的细胞)、细胞裂解物(或裂解物级分)、来源于细胞或细胞物质的生物分子(例如，多肽或核酸)或来自受试者的体液。体液的非限制性示例包括血液、尿液、血浆、血清、泪液、淋巴液、胆汁、脑脊液、间质液、水性或玻璃体液、初乳、痰、羊水、唾液、肛门和阴道分泌物、汗液、精液、渗出液、流出物和滑液。

以单数或复数形式使用的术语“肿瘤细胞”或“癌细胞”是指经历恶性转化的细胞，所述恶性转化使得它们对宿主生物体是病理性的。通过成熟的技术，具体地讲组织学检查，可容易地将原发性癌细胞(即，从恶性转化位点附近获得的细胞)与非癌细胞区分开。如本文所用，癌细胞的定义不仅包括原发性癌细胞，而且包括来源于癌细胞祖先的任何细胞。这包括转移的癌细胞，以及来源于癌细胞的体外培养物和细胞系。术语“肿瘤相关的抗原”或“TAA”用于本文是指由肿瘤细胞以比相同组织类型的非肿瘤细胞更高的频率或密度表达的分子或复合物。肿瘤相关的抗原可以是不由宿主正常表达的抗原；其可能是由宿主正常表达的分子的突变、截短、错误折叠或以其他方式异常表现；其可与正常表达但以异常高水平表达的分子相同；或者其可在异常的环境或背景中表达。肿瘤相关的抗原可为例如蛋白质或蛋白质片段、复合碳水化合物、神经节苷脂、半抗原、核酸、或这些或其他生物分子的任何组合。特定肿瘤相关的抗原的存在或特征的知识不是本发明的实践所必需的。

术语“B细胞”是指B淋巴细胞。B细胞前体位于其中产生未成熟的B细胞的骨髓中。B细胞发育通过若干阶段进行，每个阶段代表抗体基因座处的基因组含量的变化。在基因组重链可变区中，存在三个片段V、D和J，其在被称为VDJ重排的过程中随机重组，以在每个B细胞的免疫球蛋白中产生独特的可变区。轻链可变区进行类似的重排，不同的是仅涉及两个片段，V和J。在完全重排后，B细胞到达骨髓中的IgM⁺未成熟阶段。这些未成熟的B细胞在其表面上呈现膜结合的IgM，即BCR，并且迁移到脾脏，在这里它们被称为过渡B细胞。这些细胞中的一些分化成成熟的B淋巴细胞。在它们的表面上表达BCR的成熟的B细胞使血液和淋巴系统循环，从而起到免疫监视的作用。它们不产生可溶性抗体，直至它们完全活化。每个B细胞具有将与一个特定抗原结合的独特受体蛋白质。一旦B细胞遇到其抗原并且接收来自T辅助细胞的附加信号，则其可进一步分化成表达和分泌可溶性抗体或记忆B细胞的浆B细胞。

术语“B细胞”也可指在其表面上呈递完全重排的(即成熟的)B细胞受体(BCR)的任何B淋巴细胞。例如，B细胞可以是未成熟或成熟的B细胞，并且优选是幼稚B细胞，即未暴露于被所述B细胞的表面上的BCR特异性识别的抗原的B细胞。B细胞可以是记忆B细胞，优选IgG⁺记忆B细胞。术语“B细胞”还可是指B细胞的混合物。B细胞的混合物可意指混合物中的B细胞具有不同的抗原特异性，即产生识别多种抗原的抗体或完全重排的BCR。同样关于抗原特异性，单个B细胞的抗体或BCR通常是相同的。

术语“B细胞分泌抗体”优选地是指浆B细胞。术语“在其表面上携带BCR的B细胞”优选是指在其浆膜上表达BCR(优选完全重排的BCR)的B细胞。在这种情况下，“BCR”优选地不意指单个BCR，但优选地意指具有相同抗原的多个BCR。

术语“部分”是指级分。一部分优选意指整个实体的至少20％、至少30％、优选至少40％、更优选至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、甚至更优选至少80％、并且最优选至少90％。术语“大部分”优选是指整个实体的至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、甚至更优选至少80％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％、并且最优选至少99％。

术语“克隆扩增”是指其中特定实体繁殖的过程。在本发明的上下文中，术语优选在免疫应答的上下文中使用，其中淋巴细胞(优选地B淋巴细胞)受抗原刺激、增殖，并且扩增识别所述抗原的特定淋巴细胞。优选地，克隆扩增导致淋巴细胞分化，优选地分化成产生和分泌抗体的淋巴细胞。分泌抗体的B淋巴细胞为例如浆B细胞。

术语“抗原”涉及包含免疫应答待针对其产生的表位的试剂。术语“抗原”具体包括蛋白质、肽、多糖、脂质、核酸(特别是RNA和DNA)以及核苷酸。术语“抗原”还包括作为次要物质的衍生抗原，其仅通过转化(例如，在分子中间，由主体蛋白完成)变成抗原性和致敏性，以及缀合抗原，其通过人工结合原子基团(例如，异氰酸酯、重氮盐)表现出新的组成特异性。在一个优选的实施方案中，抗原是肿瘤抗原，即可来源于细胞质、细胞表面和细胞核的肿瘤细胞的组分，具体地讲优选在细胞内大量产生的那些抗原，或作为肿瘤细胞上的表面抗原。示例为癌胚抗原、α1-胎蛋白、异铁蛋白和胎儿磺基糖蛋白、α2-H-铁蛋白和γ-胎蛋白以及各种病毒性肿瘤抗原。在另一个实施方案中，抗原是病毒抗原，诸如病毒核糖核蛋白或者包膜蛋白。具体地讲，抗原或其肽应当通过B细胞受体或免疫球蛋白分子(诸如抗体)来识别。优选地，如果被B细胞受体识别，则抗原能够在适当共刺激信号的存在下，诱导携带BCR的B细胞的多克隆/克隆扩增特异性识别抗原并将此类B细胞分化成分泌B细胞的抗体。抗原可以存在于重复组织中，即抗原包含多于一种、优选至少2种、至少3种、至少4种、最多至6种、10种、12种或更多种免疫应答待针对其产生或者抗体待针对其产生的试剂或表位。此类重复抗原优选地能够结合到具有相同特异性的多于一种抗体。换句话讲，此类重复抗原包含多于一种表位，优选地相同的表位，并且因此能够“交联”针对所述表位的抗体。多于一种试剂或表位可共价或非共价连接，其中共价连接可通过任何化学基团，诸如通过肽键来连接。抗原可以是融合分子，所述融合分子包含抗原肽的重复或包含具有共同表位的不同抗原肽。在一个优选的实施方案中，所述抗原肽通过肽接头连接。

范围：在整个本公开中，本发明的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简短起见，并且不应被解释为对本发明范围的不灵活的限制。因此，应当认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及在该范围内的单个数值。例如，应当认为范围诸如1至6的描述已经具体地公开了子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围宽度如何，这都适用。

根据本文教导的方法，向受试者施用有效量的试剂。术语有效量和有效剂量可互换使用。术语有效量被定义为产生期望的生理应答所需的任何量。用于施用试剂的有效量和时间表可凭经验确定，并且进行此类测定在本领域技术的范围内。用于施用的剂量范围为足够大以产生影响(例如，减少或延迟)疾病或病症的一种或多种症状的期望效果的那些。剂量不应大到引起显著不良副作用，诸如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随年龄、状况、性别、疾病类型、疾病或病症的程度、施用途径或该方案中是否包括其他药物而变化，并且可由本领域技术人员确定。在任何禁忌症的情况下，个体医师可以调整剂量。剂量可以变化，并且可在一天或几天内每天施用一次或多次剂量施用。对于给定类别的药物产品，可以在文献中找到关于适当剂量的指导。

如本文所用，术语“治疗”(treatment、treat或treating)是指降低疾病或状况的作用或者疾病或状况的症状的方法。因此，在本发明所公开的方法中，治疗可指已造成的疾病或状况的严重性或者该疾病或状况的症状降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。例如，与对照相比，如果受试者的疾病的一种或多种症状降低10％，则治疗病症的方法被认为是治疗。因此，与天然或控制水平相比，降低程度可以是介于10％和100％之间的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或任何百分比的降低程度。应当理解，治疗不一定是指治愈或完全消除疾病、状况、或者该疾病或状况的症状。

如本文所用，术语“预防(prevent、preventing和prevention)疾病或病症”是指在受试者开始表现出疾病或病症的一种或多种症状之前或几乎在受试者开始表现出疾病或症状的一种或多种症状的同一时间发生的动作，例如，施用治疗剂，该动作抑制或延迟疾病或病症的一种或多种症状的发作或恶化。如本文所用，提及减少、降低或抑制包括与对照水平相比，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的变化。此类术语可包括但不一定包括完全消除。

一般信息

本文公开了使用衣原体活化的B细胞作为免疫疗法的细胞疫苗平台以及使用该平台的方法。本文公开了引起强烈B细胞活化的沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)主要外膜蛋白(MOMP)的重组型式。这些重组蛋白可用于产生衣原体活化的B细胞(CAB)。平台、疫苗和使用CAB的方法(诸如可见于PCT专利申请WO/2016/1320667中的那些)以引用方式并入本文。

本文公开了一种体液疫苗，该体液疫苗使用重组型式的沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)与一种或多种与衣原体无关的抗原的组合，以提高抗体的产量和抗体对这些抗原的亲和力。

具体地讲，已工程化大肠杆菌(Escherichia coli)菌株以产生MOMP的衍生物。在一个示例中，天然MOMP源于沙眼衣原体菌株L2/434(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分别公开了天然MOMP的核酸和氨基酸序列)。然而，需注意，可根据本文所述的方法使用任何衣原体外膜蛋白。例如，可提供MOMP衍生物，其中MOMP是天然的，但其中它还包括来自大肠杆菌的野生型或改变的信号序列。编码大肠杆菌信号序列的核酸可见于SEQ ID NO:5中，并且其对应的多肽(或糖多肽)可见于SEQ ID NO:6中。这些信号序列可与任何MOMP或MOMP衍生物一起使用。编码与大肠杆菌信号序列融合的MOMP的核酸的示例可见于SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:9中，其中对应的氨基酸序列可见于SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10中。

本文还公开了其中一个或多个半胱氨酸残基被替代氨基酸取代的MOMP。例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个半胱氨酸残基可被另一种氨基酸取代。在一个示例中，所有半胱氨酸残基可被另一种氨基酸取代。在一个示例中，半胱氨酸残基中的一者或多者可被丝氨酸取代。取代半胱氨酸残基可改善MOMP的表达。

本文所公开的MOMP衍生物可例如组装在工程化大肠杆菌菌株的外膜中。正确折叠的重组MOMP可显示出活化哺乳动物B细胞的能力，可用作衣原体疫苗中的免疫原，并且可用作体液疫苗中的佐剂。

在一个示例中，大肠杆菌菌株携带编码MOMP衍生物的pET23/42衍生质粒。这些衍生物由重组基因编码，所述重组基因被设计用于优化MOMP在外膜的转运和组装。为了优化MOMP靶向内膜Sec易位子并加工成成熟形式，这些基因的5'末端可编码大肠杆菌ompA基因的信号序列。如本文所述，该5'末端可与编码成熟野生型或无半胱氨酸的MOMP的衣原体ompA基因的密码子优化部分框内融合。

整个MOMP蛋白或其片段可与本文所述的方法和平台一起使用。本领域技术人员可容易地鉴定负责哺乳动物B细胞活化的衣原体蛋白片段，以及例如基于CAB的疫苗所需的精确表位。本文所述的方法和平台可与此类片段一起使用。此外，表达MOMP衍生物和纯化的重组MOMP蛋白的完整大肠杆菌细胞可在有或没有进一步加工的情况下用于上述应用。

本文所公开的核酸还可包括纯化标签。例如，添加His6标签或His8标签可用于允许纯化融合蛋白(即嵌合体)。例如，为了从宿主大肠杆菌菌株的外膜中纯化折叠的蛋白，可在OmpA_Ec的信号序列与成熟的MOMP_Ct序列(含Cys和无Cys的型式)之间的连接处添加标签。例如，所得的成熟MOMP衍生物可在其N-末端含有标签。为了从宿主大肠杆菌菌株的细胞质(包涵体)中纯化未折叠的蛋白，编码信号序列的序列可用起始密码子之后是标签取代。未折叠的成熟MOMP衍生物将在其N-末端含有标签，并且可在使用标准的公开方法纯化后重折叠。

本文还公开了MOMP的抗原片段。例如，本文公开了包括使用MOMP或其抗原片段的若干方法和平台。本领域的技术人员将会知道，MOMP的整个序列不需要与本文所公开的方法和平台一起使用，而是可使用MOMP的表现出允许其与方法和平台一起使用的特性的任何部分。例如，美国专利申请号US 2014/0275478A1(全文以引用方式并入本文)公开了沙眼衣原体(Ct)的表面暴露片段及其重复序列，以用于最大化针对其自身或无关抗原(如果用作佐剂)的抗体应答。这些表面暴露片段可延伸以覆盖可含有T细胞表位的表面暴露片段的侧翼区。一个示例是代表来自Ct MOMP抗原的VD1或VD4区域的延伸型式并且以免疫重复形式提供针对Ct的高水平表面结合和中和抗体的限定大片段。这些表面暴露重复序列可与其他表面暴露抗原(诸如PMP或OMP)的片段重组融合。活性片段还可用于诱导针对与衣原体无关的抗原的抗体。

关于本文所公开的序列，在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，“相同的”或百分比“同一性”是指两个或更多个相同或具有指定百分比的氨基酸残基或相同核苷酸(例如，在比较窗口或指定区域上进行比较并对齐以获得最大的对应关系时，在指定区域上约60％的同一性，优选61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)的序列或子序列，如使用具有下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动比对和目视检查所测量的(参见例如NCBI网站等)。然后这些序列被认为“基本上相同”。该定义还涉及或可应用于测试序列的互补序列。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。如下所述，优选的算法可考虑间隙等。优选地，在长度为至少约10个氨基酸或20个核苷酸的区域或更优选长度为10-50个氨基酸或20-50个核苷酸的区域上存在同一性。如本文所用，百分比(％)氨基酸序列同一性被定义为在比对序列并引入间隙(如果需要)以实现最大百分比序列同一性后候选序列中氨基酸与参考序列中氨基酸相同的百分比。用于确定百分比序列同一性的目的的比对可以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公开可用的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法可通过已知方法确定。

对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，然后将测试序列与该参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标并指定序列算法程序参数。优选地，可使用默认程序参数，或可指定替代参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。

适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个示例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别在Altschul等人，(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402以及Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中有所描述。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。该算法涉及首先通过在查询序列中识别长度为W的短字词来识别高评分序列对(HSP)，该查询序列在与数据库序列中具有相同长度的字词比对时匹配或满足一些正值阈值分数T。T被称为邻域字词评分阈值(Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410)。这些初始邻域字词命中充当发起搜索的种子，以查找包含它们的更长的HSP。字词命中在每个序列的两个方向上延伸，以尽可能地增加累积比对分数。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积分数。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积分数。在以下情况下停止字词命中在每个方向上的延伸：累积比对分数从其最大实现值下降数量X；由于一个或多个负评分残基比对的积累，累积评分变为零或低于零；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用以下默认值：字词长度(W)为11，期望值(E)或10，M＝5，N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下默认值：字词长度为3，并且期望值(E)为10以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4以及两条链的比较。

BLAST算法还对两个序列之间的相似性执行统计分析(参见例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。BLAST算法提供的相似性的一种度量是最小和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小和概率小于约0.2，更优选地小于约0.01，则认为该核酸与参考序列相似。

本文还公开了用于识别负责B细胞活化的结构域的MOMP的变化：编码MOMP_Ct变体的质粒的定点诱变(例如含有Cys的标签型式、不含Cys的标签型式)可用于改变成熟MOMP_Ct衍生物的序列以便识别负责B细胞活化的结构域。

因此，本文公开了用于产生活化的抗原递呈细胞(APC)的平台，其中该平台包括：多肽或糖多肽，该多肽或糖多肽包括衣原体属物种(Chlamydia spp.)的天然存在的主要外膜蛋白(MOMP)的衍生物，其中该天然存在的MOMP被修饰为使得MOMP的至少一个半胱氨酸残基被不同的氨基酸取代；B细胞群；以及抗原，其中该抗原不衍生自衣原体属物种(Chlamydia spp.)。本发明还公开了使用本文所述的平台产生的疫苗。还描述了由本文所述的平台产生的衣原体活化的B细胞。

本文公开了一种用于由受试者产生活化的、抗原递呈的衣原体活化的B细胞的方法，该方法包括：用质粒转化大肠杆菌，其中该质粒包括编码衣原体的主要外膜(MOMP)蛋白的核酸和大肠杆菌OmpA或其他大肠杆菌蛋白的野生型或改变的信号序列，其中大肠杆菌随后产生重组MOMP；使受试者的B细胞暴露于重组MOMP；以及使B细胞暴露于期望的抗原，其中该抗原不衍生自衣原体属物种(Chlamydia spp.)，从而获得活化的抗原递呈的衣原体活化的B细胞(CAB)。

在上述方法中还公开了以下步骤：其中在使B细胞暴露于包括衣原体属物种(Chlamydia spp.)的主要外膜蛋白(MOMP)的衍生物的多肽后，其中该天然存在的MOMP被修饰为使得MOMP的至少一个半胱氨酸残基被不同的氨基酸取代；添加将蛋白质、肽、核酸、脂质、碳水化合物或其片段交联至所述CAB的步骤，其中所述蛋白质、肽、核酸、脂质、碳水化合物或其片段是抗原性的。

该方法还包括以下步骤：其中使B细胞暴露于包括衣原体属物种(Chlamydiaspp.)的天然存在的主要外膜蛋白(MOMP)的衍生物的多肽后，其中天然存在的MOMP被修饰为使得MOMP的至少一个半胱氨酸残基被不同的氨基酸取代；添加将蛋白质、肽、核酸、脂质、碳水化合物或其片段交联至所述CAB的步骤，其中所述蛋白质、肽、核酸、脂质、碳水化合物或其片段是抗原。

本发明还公开了包括抗原和多肽的疫苗，该多肽包括衣原体属物种(Chlamydiaspp.)的天然存在的主要外膜蛋白(MOMP)的衍生物或其片段，其中该天然存在的MOMP被修饰为使得MOMP的至少一个半胱氨酸残基被不同的氨基酸取代。

抗原和衣原体属物种(Chlamydia spp.)的蛋白质、肽、或碳水化合物或全灭活衣原体或其片段可被化学缀合至抗原以用作佐剂。另选地，抗原和衣原体属物种(Chlamydiaspp.)的蛋白质、肽、或碳水化合物或全灭活衣原体或其片段可简单地混合而不缀合。也可使用纳米颗粒，其中纳米颗粒涂覆有衣原体属物种(Chlamydia spp.)的蛋白质、肽、或碳水化合物或者全灭活衣原体。衣原体属物种(Chlamydia spp.)的蛋白质、肽、或碳水化合物或全灭活衣原体属物种(Chlamydia spp.)可在经由纳米颗粒施用之前与抗原缀合或仅与抗原混合(未化学结合)。

所谓“抗原不衍生自衣原体属物种(Chlamydia spp.)”是指该抗原不是从衣原体属物种(Chlamydia spp.)获得的蛋白质、肽、碳水化合物、核酸或它们中的任一者的片段。换言之，该抗原衍生自衣原体之外的来源(诸如另一种感染剂)或衍生自肿瘤。例如，该抗原可与衣原体的蛋白或核酸共享小于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％的同源性。

衣原体属物种(Chlamydia spp.)的蛋白质、肽、或碳水化合物(或者其片段)可以是能够引发期望的免疫应答的任何功能片段。在本文所公开的疫苗和方法中使用的衣原体属物种(Chlamydia spp.)(包括沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体和鼠嗜衣原体)可以是活的、灭活的，或者可以是来自衣原体属物种(Chlamydia spp.)(包括沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体和鼠嗜衣原体)的蛋白质、碳水化合物或者片段。衣原体属物种(Chlamydia spp.)可为已知物种的变体，并且仍然保留赋予本文所公开的效果的功能。例如，可使用整个细菌(活细菌不感染白细胞，并且不能在含有抗生素的培养基中存活)。或者，可以使用灭活的全细菌(X射线或者γ射线照射)或者由整个细菌产生的裂解物。在另一个实施方案中，可使用特异性蛋白、碳水化合物或者其片段。例如，可使用沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)或者其片段。在另一个示例中，可使用灭活沙眼衣原体原体(EB)或网状体(RB)。本领域的技术人员可容易地决定衣原体属物种(Chlamydia spp.)的哪些蛋白质、肽、或碳水化合物或其片段可用于赋予期望的效果。

可使用来自任何疾病、病症或者状况的任何抗原。示例性抗原包括但不限于细菌、病毒、寄生虫、过敏原、自身抗原和肿瘤相关抗原。如果使用基于DNA的疫苗，则抗原通常将由所施用的DNA构建体的序列编码。另外，如果抗原作为缀合物施用，则抗原通常将是包含在所施用的缀合物中的蛋白。具体地讲，抗原可包括蛋白抗原、肽、全灭活生物体等。

单一抗原可与本文所公开的疫苗和方法一起使用，或者多个抗原可一起使用。示例包括在相同疫苗中使用的2种、3种、4种或者更多种抗原，这些抗原或者同时施用，或者在彼此的特定时间范围内施用。

在一个方面中，抗原选自或来源自由下列组成的组：轮状病毒、口蹄疫病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、HlNl、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、Hl 0N7、人副流感2型、单纯疱疹病毒、EB病毒、兔热病、大天花(天花)、病毒性出血性发热、鼠疫耶尔森菌(鼠疫)、水痘病毒、猪疱疹病毒1、李斯特氏菌、巨细胞病毒、狂犬病病毒、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、犬瘟热病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎、猫白血病病毒、呼肠孤病毒、呼吸道合胞病毒、拉沙热病毒、多瘤病毒、犬细小病毒、乳头瘤病毒、蜱传脑炎病毒、牛瘟病毒、人鼻病毒物种、肠道病毒物种、门戈病毒、副粘病毒、禽传染性支气管炎病毒、人T-细胞白血病淋巴瘤病毒1、人免疫缺陷病毒-1、人免疫缺陷病毒-2、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、帕罗病毒B19、腺病毒、风疹病毒、黄热病毒、登革热病毒、牛呼吸道合胞体病毒、冠状病毒、百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)、支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)、流产布鲁氏菌(Brucella abortis)、马尔他布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、绵羊布鲁氏菌(Brucella ovis)、布鲁氏菌属(Brucella)物种、大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌属(Salmonella)物种、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、链球菌(Streptococci)、霍乱弧菌(Vibriocholera)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、志贺氏菌(Shigella)、假单胞菌(Pseudomonas)、肺结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(卡介苗)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、肺炎球菌(Pneumococci)、葡萄球菌(Staphylococci)、肠杆菌属(Enterobacter)物种、Rochalimaia henselae、溶血性巴氏杆菌(Pasterurellahaemolytica)、多杀性巴氏杆菌(Pasterurella multocida)、梅毒螺旋体(Treponemapallidum)、嗜血杆菌属(Haemophilus)物种、牛生殖道支原体(Mycoplasmabovigenitalium)、肺炎支原体(Mycoplasma pulmonis)、支原体属(Mycoplasma)物种、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、嗜肺性军团杆菌(Legionalla pneumophila)、肉毒杆菌(Colstridium botulinum)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia entercolitica)、立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)、立克次氏体伤寒杆菌(Rickettsia typhi)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowsaekii)、恰菲埃利希氏体(Ehrlichia chaffeensis)、无形体吞噬细胞(Anaplasma phagocytophilum)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、血吸虫、锥虫、利什曼原虫物种、丝状线虫、毛滴虫病、肉孢子虫病、牛带绦虫、猪带绦虫、利什曼原虫、弓形虫、旋毛虫、球虫、柔嫩艾美球虫(Eimeriatenella)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、白色念珠菌(Candida albican)、烟曲霉(Apergillus fumigatus)、球孢子菌病、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、疟疾环子孢子蛋白、疟疾裂殖子蛋白、锥虫表面抗原蛋白、百日咳、甲病毒、腺病毒、白喉类毒素、破伤风类毒素、脑膜炎球菌外膜蛋白、链球菌M蛋白、流感血凝素、癌症抗原、肿瘤抗原、毒素、外毒素、神经毒素、细胞因子、细胞因子受体、单核因子、单核因子受体、植物花粉、动物皮屑和尘螨。其他抗原包括与自身免疫病症、炎性病症、过敏、哮喘和移植排斥相关的抗原。

具体地讲，本文公开了一种用于施用HIV-1包膜糖蛋白(Env)和衣原体的疫苗策略，其促进HIV-特异性抗体的加快亲和力成熟和具有HIV-特异性中和活性的抗体的开发两者。

已经作出了很大努力来开发Env，其具有引发具有广泛HIV-1中和活性的有效抗体应答必需的免疫原性特性。然而，由于对病毒刺突上的保守Ab决定簇的构象和聚糖屏蔽，HIV-1是高度中和抗性的病毒。因此，引发广泛中和抗体(其与Env上的更易访问的表位区域结合较差)非常具有挑战性，并且需要选择性靶向特异性子决定簇和使用增强和/或加快亲和力成熟的强力佐剂。如上文所指出的，衣原体具有很强的能力以用作增加与HIV-1或其他微生物病原体相关的抗原的亲和力成熟的佐剂。

本发明公开了一种包括抗原和多肽的试剂盒，该多肽包括衣原体属物种(Chlamydia spp.)的天然存在的主要外膜蛋白(MOMP)的衍生物或其抗原片段，其中该天然存在的MOMP被修饰为使得MOMP的至少一个半胱氨酸残基被不同的氨基酸取代，其中该抗原不衍生自衣原体属物种(Chlamydia spp.)。

本发明还公开了一种预防受试者的疾病或感染的方法，该方法包括向受试者施用抗原，其中该抗原是衣原体属物种(Chlamydia spp.)的天然存在的主要外膜蛋白(MOMP)的衍生物，其中该天然存在的MOMP被修饰为使得MOMP的至少一个半胱氨酸残基被不同的氨基酸取代；从而预防受试者的疾病或感染。

使用该平台，从外周血或次级淋巴器官获得的动物(例如，小鼠、猫、狗和恒河猴)和人B细胞可在体外活化和扩增，以使用多种施用方案输注到受体中。B细胞可从同一个体获得并用于同一个体(自体)，或者B细胞可从一个个体获得并用于另一个体(异体)。这些细胞可通过如下方式体外活化：在本文所公开的重组MOMP肽的存在下培养外周血单核细胞或全淋巴器官细胞制剂，从而诱导它们的活化和增殖，这通过另外的因素诸如细胞因子进一步增强。活化B细胞的数量可以从B细胞的初始数量扩增许多倍。例如，与对照相比，活化B细胞的数量可扩增2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20倍或更多。本文显示这些细胞是有效的APC，能够加工外来蛋白抗原、递呈免疫原性肽并刺激同种异体的幼稚CD4⁺和CD8⁺T细胞以及幼稚和记忆抗原特异性CD8⁺T细胞。另外，可通过与CAB交联来加载抗原以增加其治疗能力。

扩增可用于加载同源抗原的有效APC的数量使得生产自体细胞疫苗的过程更有效，因为体内施用这些活化的B细胞引发强烈的CD8⁺T细胞应答，能够抑制肿瘤并控制病毒感染。因此，已开发出用于针对肿瘤和感染性疾病的免疫疗法的细胞疫苗平台。该平台和相关联的方法与当前可用的其他细胞疫苗选项相比具有更小的侵入性、成本和劳动密集性。

根据本文所公开的条件制备的CAB可通过本领域技术人员已知的多种技术与任何期望的抗原或抗原的组合、以及免疫原性肽进行组合。例如，CAB可静脉内施用于受试者。T细胞增殖和活化的量级取决于施用的APC数。由于可通过本文所公开的方法获得大量细胞，因此由重复施用大量CAB诱导的T细胞应答大于由当前可用的DC制剂诱导的T细胞应答，因为它们的数量有限。例如，本文所公开的CAB可用同源肿瘤抗原或肿瘤特异性肽脉冲并诱导肿瘤特异性CD8⁺T细胞应答，能够在鼠肿瘤攻击模型中抑制相应的肿瘤。

作为本发明所公开的活化B细胞的方法的结果，CAB可用于多种方法中以向T细胞递呈期望的抗原，诸如肿瘤相关抗原。人CAB是非常有效的APC，并且刺激人同种异体的幼稚CD4⁺和CD8⁺T细胞的增殖。它们还可以在人类和其他哺乳动物中引发对病毒和肿瘤抗原具有特异性的自体同源幼稚和记忆T细胞。此外，在小鼠中，这些T细胞应答能够拯救致死性病毒感染并使已建立的肿瘤消退。

本文所用的初始B细胞可得自多种来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、来自感染部位的组织、脾组织和肿瘤。本领域中可得的任何数量的B细胞系可与本文所公开的平台和方法一起使用。在本文所述方法的某些实施方案中，B细胞可使用技术人员已知的任何数量的技术由从受试者收集的血液单元获得，诸如FICOLL^TM(可用于制备高密度溶液的蔗糖和表氯醇的共聚物)分离。

MOMP可衍生自任何衣原体属物种(Chlamydia spp.)(包括例如沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体和鼠嗜衣原体)。除MOMP外，其他蛋白也可用于增强CAB的形成。例如，沙眼衣原体多态性膜蛋白(例如PmpA、PmpB、PmpC、PmpD、PmpE、PmpF、PmpG、PmpH、PmpI)；衣原体蛋白与以下相关：死亡域(CADD)；衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)；主要外膜蛋白和富含半胱氨酸的蛋白(例如OmcA和OmcB)；沙眼衣原体70-kDa热激蛋白；PulD/YscC；PorB；CTL0887；CTL0541；OprB；OMP85；CTL0645；Pal；Ef-Tu/TufA；GroEL；CopD；DnaK/HSP70；CTL0255；Hc1；CTL0850；和RpoB。本发明还公开了衣原体组分，可使用如Heinz等人，(Comprehensive in silico Prediction and Analysis of Chlamydial Outer MembraneProteins Reflects Evolution and Lifestyle of the Chlamydiae.BMCGenomics.2009Dec 29；10:634)中可见的那些。

来自大量疾病、病症或状况的免疫原性抗原可与本文所述的平台一起使用。示例性抗原包括但不限于细菌、病毒、寄生虫、过敏原、自身抗原和肿瘤相关抗原。如果使用基于DNA的疫苗，则抗原通常将由所施用的DNA构建体的序列编码。另外，如果抗原作为缀合物施用，则抗原通常将是包含在所施用的缀合物中的蛋白。具体地讲，抗原可包括蛋白抗原、肽、全灭活生物体等。

可以使用的抗原的具体示例包括但不限于来自甲型、乙型、丙型或丁型肝炎的抗原、流感病毒、李斯特氏菌属、肉毒杆菌、肺结核、兔热病毒、重型天花病毒(天花)、病毒性出血热、鼠疫耶尔森菌(鼠疫)、HIV、疱疹、乳头瘤病毒以及其他与感染剂相关的抗原。其他抗原包括与自身免疫病症、炎性病症、过敏、哮喘和移植排斥相关的抗原。负载抗原的CAB可单独施用或与其他治疗剂(诸如CD40激动剂或TLR配体，特别是抗CD40激动剂抗体)联合施用，以用作治疗疾病状况的治疗性或预防性疫苗。又如，本文所公开的CAB平台可与检查点抑制剂结合使用。检查点抑制剂技术的示例可见于WO1999015157A2、WO2015016718A1和WO2010149394A1，所述专利文献以其全文关于检查点抑制剂的公开内容并入本文。本文还讨论了其他组合疗法。

在一个实施方案中，抗原可包括肿瘤相关的抗原。可治疗的肿瘤的示例包括以下肿瘤：胰腺肿瘤，诸如胰腺导管腺癌；肺肿瘤，诸如小细胞和大细胞腺癌、鳞状上皮细胞癌和支气管肺泡癌；结肠肿瘤，诸如上皮腺癌及其癌细胞转移；和肝癌，诸如肝细胞瘤和胆管癌。还包括乳腺肿瘤，诸如导管腺癌和小叶腺癌；妇科肿瘤，诸如子宫颈的鳞状和腺癌、子宫和卵巢上皮腺癌；前列腺肿瘤，诸如前列腺腺癌；膀胱肿瘤，诸如移行性鳞状细胞癌；RES系统的肿瘤，诸如结节性或弥漫性B或T细胞淋巴瘤、浆细胞瘤和急性或慢性白血病；皮肤肿瘤，诸如恶性黑素瘤；以及软组织肿瘤，诸如软组织肉瘤和平滑肌肉瘤。所特别关注的是脑部肿瘤，诸如星形细胞瘤、少突胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、和原发性神经外胚层肿瘤。此类别中包括神经胶质瘤、胶质母细胞瘤和胶质肉瘤。

具体地讲，以下抗原相与以下类型的癌症相关，并且可用于表1中所公开的平台和方法：

表1：癌症和相关抗原

个体的免疫状态可为以下中的任何一种：相对于存在于所述组合物中的某些肿瘤相关抗原，个体可能是无免疫的，在此情况下，可以给予组合物以引发或促进抗肿瘤应答的成熟。个体目前可能不表达抗肿瘤免疫，但可具有免疫记忆，具体地讲与疫苗中包含的肿瘤相关的抗原有关的T细胞记忆，在这种情况下，可给予组合物以刺激记忆应答。个体还可对疫苗中包含的肿瘤相关的抗原具有主动免疫(体液免疫或细胞免疫中的任一者，或上述两者)，在这种情况下，可给予组合物以保持、促进或使应答成熟，或募集免疫系统的其他臂。受试者应当至少部分地具有免疫活性，使得疫苗可诱导内源性T细胞应答。

在另一个实施方案中，抗原可包含感染剂。可使用本文所公开的平台和方法治疗的感染剂的示例包括但不限于流感病毒、呼吸道合胞体病毒(RSV)、人乳头瘤病毒(HPV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人T-淋巴细胞病毒1型、人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、细胞巨化病毒和其他疱疹病毒科。其他示例包括单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、沙门氏菌、肺结核分枝杆菌、疟原虫属(Plasmodium sp.)(疟疾)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)和克氏锥虫(Trypanosomacruzi)。具体地讲，已经显示CAB可用于免疫小鼠并保护它们免受HSV-2(疱疹病毒科)的眼部感染，这在小鼠中是致命的感染。

本文所公开的CAB可同时或依次暴露于多于一种抗原或与多于一种抗原交联。例如，本文所公开的CAB可同时或依次暴露于2、3、4、5、6或更多种抗原，或负载有不同单一抗原的CAB可组合在一起施用。

与未暴露于衣原体属物种(Chlamydia spp.)(包括沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体和鼠嗜衣原体)或其蛋白质或片段的B细胞群相比，本文所公开的CAB可显著扩增。如本文所用，B细胞的扩增包括刺激细胞增殖以及预防细胞的凋亡或其他死亡。如本文所用，“培养”和“温育”用于指示细胞在细胞培养基中维持一段时间，所述细胞培养基具有适当的添加剂(饲养细胞、细胞因子、激动剂、其他刺激分子或培养基，其可包含缓冲液、盐、糖、血清或各种其他组分)。本领域的技术人员将理解，可改变培养或温育时间以允许适当的扩增，调节单个亚组的不同的细胞密度或频率，并允许研究者适时使用细胞。因此，精确的培养长度可由本领域技术人员根据经验确定。

与非活性或静息B细胞相比，CAB可具有增加的主要组织相容性复合物(MHC)和/或共刺激分子表达水平。例如，与非活性B细胞或未暴露于衣原体属物种(Chlamydia spp.)(包括沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体和鼠嗜衣原体)或其蛋白或片段的B细胞相比，CAB的MHC和/或共刺激分子表达水平可高1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、50％、60％、70％、90％、100％。与非活性B细胞或未暴露于衣原体属物种(Chlamydiaspp.)(包括沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体和鼠嗜衣原体)或其蛋白或片段的B细胞相比，CAB的MHC和共刺激分子表达水平可高2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多倍。

与非活性B细胞相比，CAB可具有改善的递呈抗原和活化T细胞的能力。所谓“改善的能力”是指与未暴露于衣原体属物种(Chlamydia spp.)(包括沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体和鼠嗜衣原体)或其蛋白或片段的细胞群相比它们递呈抗原和活化T细胞的能力高1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、50％、60％、70％、90％或100％。与未暴露于衣原体属物种(Chlamydia spp.)(包括沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体和鼠嗜衣原体)或其蛋白或片段的细胞群相比，CAB递呈抗原和活化T细胞的能力可高2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多倍。

与非活性B细胞或未暴露于衣原体属物种(Chlamydia spp.)(包括沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体和鼠嗜衣原体)或其蛋白或片段的B细胞相比，CAB可以更高的速率迁移至次级淋巴器官。例如，与未暴露于衣原体属物种(Chlamydia spp.)(包括沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体和鼠嗜衣原体)或其蛋白或片段的细胞群相比，CAB的迁移速率可快1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、50％、60％、70％、90％或100％。与未暴露于衣原体属物种(Chlamydia spp.)(包括沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体和鼠嗜衣原体)或其蛋白或片段的细胞群相比，CAB可以2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多倍的速率迁移。

CAB可分泌细胞因子，以大于非活性B细胞的速率增强T细胞募集。例如，与未暴露于衣原体属物种(Chlamydia spp.)(包括沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体和鼠嗜衣原体)或其蛋白或片段的细胞群相比，CAB募集T细胞增强的速率可高1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、50％、60％、70％、90％或100％。与未暴露于衣原体属物种(Chlamydia spp.)(包括沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体和鼠嗜衣原体)或其蛋白或片段的细胞群相比，CAB以2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多倍的速率增强T细胞募集。

本文所公开的CAB可通过使它们与B细胞活化因子(例如，已知活化和/或分化B细胞的多种细胞因子、生长因子或细胞系中的任何一种(参见例如Fluckiger等人，Blood1998 92:4509-4520；Luo等人，Blood 2009 1 13:1422-1431))接触而进一步增强其活性。这些因子可选自但不限于IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34和IL-35、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-δ、C型趋化因子XCL1和XCL2、C-C型趋化因子和CXC型趋化因子以及TNF超家族成员(例如，TNF-α、4-1BB配体、B细胞活化因子(BLyS)、FAS配体、sCD40L(包括sCD40L的多聚体型式；例如，组氨酸标记的可溶性重组CD40L与抗多组氨酸mAb结合以将多个sCD40L分子组合在一起)、淋巴毒素、OX40L、RANKL、TRAIL)、CpG和其他Toll样受体激动剂。

在一个实施方案中，具体地讲，CAB可在饲养细胞上接触或培养。在其他实施方案中，本文所述的培养系统在不存在饲养细胞的情况下进行，从而提供优于本领域已知的需要饲养细胞的其他系统的优点。在可使用饲养细胞的情况下，饲养细胞是基质细胞系，诸如鼠基质细胞系S17或MS5。在另一个实施方案中，纯化的CD19⁺细胞可在存在表达CD40-配体的成纤维细胞存在下，在存在B细胞活化细胞因子诸如IL-10和IL-4的情况下进行培养。CD40L也可被提供为结合至表面诸如组织培养板或小珠。在另一个实施方案中，纯化的B细胞可在存在或不存在饲养细胞的情况下，与CD40L在存在一种或多种细胞因子或选自IL-10、IL-4、IL-7、p-ODN、CpG DNA、IL-2、IL-15、IL6、IFN-α和IFN-δ的因子的情况下一起培养。

在另一个实施方案中，B细胞活化因子可通过转染到B细胞或其他饲养细胞中来提供，诸如PCT/US2000/030426中所公开的，其全文以引用方式并入本文以用于其关于CD40L和B细胞的教导。在这种情况下，可使用一种或多种促进B细胞分化成抗体分泌细胞的因子和/或一种或多种促进抗体产生细胞的寿命的因子。此类因子包括例如Blimp-1、TRF4、抗凋亡因子如Bcl-xl或Bcl5、或CD40受体的组成型活性突变体。此外，促进下游信号分子诸如TNF受体相关因子(TRAF)表达的因子也可用于B细胞的活化/分化。就这一点而言，TNF受体超家族的细胞活化、细胞存活和抗凋亡功能主要由TRAF1-6介导(参见例如R.H.Arch等人，Genes Dev.12(1998),pp.2821-2830)。TRAF信号传导的下游效应子包括NF-κB和AP-1家族中的转录因子，其可开启涉及细胞和免疫功能的各个方面的基因。此外，NF-κB和AP-1的活化已显示出通过抗凋亡基因的转录提供细胞保护免于凋亡。

平台可全部或部分地离体或在体内进行。“离体”是指在自然条件改变最小的情况下，在生物体外的人工环境中，在细胞或组织内或上进行的方法。相比之下，术语“体内”是指在处于其正常的完整状态的活生物体内进行的方法，而“体外”方法使用已经从其常见生物环境中分离的生物体的组分进行。例如，细胞可体内暴露于灭活的衣原体属物种(Chlamydia spp.)(包括沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体和鼠嗜衣原体)或其肽或其片段，或离体暴露于活的或灭活的衣原体属物种(Chlamydia spp.)(包括沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体和鼠嗜衣原体)或其肽，其方法在本文中有更详细的描述。将扩增的B细胞暴露于或交联到抗原，使得其因此而分化。同样，这可在体内或离体进行。例如，抗原可直接注入受试者中，或者可在体外(离体)使受试者的B细胞暴露于或交联到经修饰的抗原，然后，使扩增的分化B细胞返回至受试者。CAB可用于例如直接体内施用、离体体细胞疗法、体内可植入装置和离体体外装置。

正在治疗的受试者可具有多种疾病或病症。可使用本文所公开的方法治疗可使用活化的B细胞体内诱导抗原特异性应答来治疗的任何疾病或病症。例如，可使用这些方法治疗感染病和癌症。

本发明还公开了包含本文所公开的衣原体活化的B细胞的疫苗。本文公开了用于离体免疫的基于细胞的疫苗，以及用于体内免疫以引发针对抗原的免疫应答的组合物和方法。在一个实施方案中，本发明公开了患有表达肿瘤特异性抗原的一类癌症的受试者。这可导致患者的治疗结果改善，例如通过表达肿瘤-特异性抗原的癌细胞或实体肿瘤的生长的减缓或者减少，或者通过癌细胞总数或者总肿瘤负荷的减少来验证。在相关实施方案中，患者已被诊断为患有与特异性抗原(例如，病毒抗原)的表达相关的病毒、细菌、真菌或者其他类型的感染。这种疫苗可导致患者的改善的治疗结果，如由患者体内致病感染剂的生长减慢和/或通常与特异性感染性疾病相关的可检测症状的减少或消除来证明。

当制备用于施用的疫苗时，其可与药学上可接受的载体、稀释剂或者赋形剂组合以形成药物制剂或者单位剂型。此类制剂中的总活性成分按该制剂的重量计占0.1％至99.9％。“药学上可接受的”物质是与制剂的其它成分相容并且对其接受者无害的载体、稀释剂、赋形剂和/或盐。用于施用的活性成分可作为粉末或者作为颗粒存在；作为溶液、悬浮液或者乳液存在。

表达载体、转导的细胞、多核苷酸和多肽(活性成分)可以通过使活性成分在生物体内与试剂的作用部位接触的任何方法来配制和施用以治疗各种疾病状态。它们可通过适用于与药物联合使用的任何常规方法施用，作为单独的治疗活性成分或与治疗活性成分的组合施用。其可单独施用，但通常与基于所选的施用途径和标准药物实践所选的药物载体一起施用。

一般来讲，水、合适的油、盐水、右旋糖水溶液(葡萄糖)和相关的糖溶液以及二醇诸如丙二醇或聚乙二醇是用于肠胃外溶液的合适载体。用于肠胃外施用的溶液包含活性成分、合适的稳定剂以及如果需要，缓冲物质。抗氧化剂诸如硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸(单独或组合的)是合适的稳定剂。还使用柠檬酸及其盐以及乙二胺四乙酸钠(EDTA)。此外，肠胃外溶液可包含防腐剂，诸如苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯代丁醇。适宜的药物载体描述于Remington's Pharmaceutical Sciences(本领域的标准参考文献)中。

另外，可采用标准的药物方法来控制作用的持续时间。这些是本领域熟知的，并且包括控制释放制剂，并且可包括合适的大分子，例如聚合物、聚酯、聚氨基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或者硫酸鱼精蛋白。可调节大分子的浓度以及掺入的方法以便控制释放。另外，试剂可掺入聚合物材料的颗粒中，诸如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯-乙酸乙烯酯共聚物。除了掺入外，这些试剂还可用于在微胶囊中捕集化合物。

包含本文所公开的治疗剂的药物制剂可通过本领域已知的程序使用熟知且容易获得的成分来制备。还可将治疗剂配制为适用于肠胃外施用的溶液，例如通过肌内、皮下或静脉注射途径。治疗剂的药物制剂还可采用水溶液或无水溶液或分散体的形式，或者作为另外一种选择，乳液或悬浮液的形式。

给定的剂量是实现所期望的治疗应答的“有效”量，无论是刺激免疫应答，还是治疗如本公开别处所定义的癌症。对于本发明的药物组合物，有效剂量通常落在约10⁵至10¹¹个细胞的范围内。优选地，使用约10⁶至10¹⁰个细胞；更优选地，使用约1×10⁷至2×10⁹个细胞。当组合使用以实现所期望的效果时的多重剂量均落在有效量的定义范围内。剂量可以每天给予多次，或者每天给予一次，或者每隔一天给予一次，或者每隔三天给予一次等。可给予额外的剂量(诸如每月或者每周)，直至达到期望的效果。此后，具体地当免疫或者临床益处出现减退时，可根据需要给予额外的加强或者维持剂量。

细胞疫苗的各种组分以“有效组合”存在，这意指有足够量的每种组分以使疫苗有效。可使用任何数量的组成细胞或其他组分，只要疫苗作为整体有效即可。这也将取决于用于制备疫苗的方法。

药物组合物可以在与在受试者中产生免疫应答或治疗癌症有关的其他疗法之后、之前、代替其、或与其组合给予。例如，受试者可预先或与外科手术去填充、化疗、放疗、检查点抑制剂和其他形式的免疫疗法和过继转移同时进行治疗。在使用此类方式的情况下，它们优选地以不干扰本文公开的组合物的免疫原性的方式或时间使用。受试者还可施用另一种疫苗或其他组合物以便刺激免疫应答。此类另选的组合物可包括肿瘤抗原疫苗、编码肿瘤抗原的核酸疫苗、抗独特型疫苗和其他类型的细胞疫苗，包括表达细胞因子的肿瘤细胞系。

本文公开了组合疗法，其包括将本文所述的细胞疫苗组合与旨在提供抗肿瘤免疫应答的另一策略结合施用。在一种组合疗法中，在用包含本文所公开的加载有抗原的CAB的组合物在远离肿瘤的位点处进行治疗之前、期间或之后，给予受试者受刺激的同种异体淋巴细胞的肿瘤内植入物。在另一种组合疗法中，在用本文所公开的负载抗原的CAB治疗之前、期间或之后，用另选的细胞疫苗组合物在远离肿瘤的位点处治疗受试者。在另一种组合疗法中，给予受试者检查点抑制剂。在整个治疗过程中采用多种不同的组合物或者施用模式时，选择每个治疗元素的顺序和时间以优化该疗法的免疫刺激或者抗肿瘤效果。

如本领域技术人员将知道的，本发明方法中可使用多种培养基中的任一种(参见例如，Current Protocols in Cell culture，2000-2009，John Wiley&Sons,Inc.)。在一个实施方案中，用于本文所述方法中的培养基包括但不限于改性的Dulbecco培养基(其具有或不具有胎牛血清或其他适当的血清)。示例性培养基还包括但不限于，IMDM、RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20。在另一实施方案中，培养基可包含表面活性剂、抗体、人血浆蛋白粉或还原剂(例如N-乙酰基-半胱氨酸、2-巯基乙醇)、或一种或多种抗生素。在一些实施方案中，也可使用IL-2、IL-6、IL-10、可溶CD40L和交联增强剂。B细胞可在条件下培养并持续足以实现期望的活化的时间段。在某些实施方案中，B细胞在条件下培养并持续足够的时间段，使得根据需要活化10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％的B细胞。

在一个示例中，可通过使用阴性免疫磁性选择系统或RosetteSep^TM系统来生成CAB，以耗尽除了来自PBMC或全血的CD4⁺T细胞和B细胞之外的所有细胞类型。所选择的细胞在衣原体属物种(Chlamydia spp.)和IL-2的存在下培养(其中每1-5天(优选每2-3天)细胞传代，其补充含有衣原体属物种(Chlamydia spp.)和IL-2的培养基)，直至产生足够数量的CAB以与本文的方法一起使用。在收获以供使用时，可使用CD4⁺T细胞频率的流式细胞术评估来确定是否需要进一步的免疫磁性选择以进一步耗尽CD4⁺T细胞。

B细胞活化的诱导可通过诸如³H-胸腺嘧啶核苷掺入(其测量与细胞增殖相关的DNA合成)的技术或通过使用荧光标记物(诸如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)的流式细胞术测定法来测量。为了最佳测量B细胞增殖，可将IL-2或IL-4以适当的浓度添加到培养基中。另选地，B细胞活化可作为免疫球蛋白分泌的函数进行测量。

在培养适当的时间段之后，诸如2,3,4,5,6,7,8,9或更多天(通常约3天)后，可添加附加体积的培养基。在培养过程中可在不同的时间从单个培养物中收获上清液，并对IgM和lgG1进行定量，如Noelle等人，(1991)J.Immunol.146:1 1 18-1 124中所述。在另一个实施方案中，酶联免疫吸附测定(ELISA)可用于测量IgM或其他抗体同种型。在某些实施方案中，可使用可商购获得的抗体(诸如山羊抗人IgG)作为捕获抗体进行IgG测定，然后使用多种合适的检测试剂(诸如生物素酰化山羊抗人Ig、链霉亲和素碱性磷酸酶和底物)中的任一种进行检测。

在一个示例中，不同的大肠杆菌菌株可用于蛋白质生产。例如，可使用CD43(DE3)/pLysS(PubMed上的参考文献号8757792)，并且它可用IPTG诱导Ct-MOMP表达。

在pET23/42ChOmpA上编码的Ct-MOMP的信号序列也可被改变以增加跨内膜的易位。策略包括将当前信号序列(来自天然大肠杆菌OmpA)替换为另一种大肠杆菌蛋白的信号序列并通过位点特异性突变改变现有序列。本文公开了MOMP或其抗原片段与本领域技术人员已知的可增加跨内膜易位的任何信号序列的用途。

本文还公开了通过引入增加其生产的质粒或染色体突变来增加产生Ct-MOMP的大肠杆菌菌株中的周质伴侣蛋白(诸如SurA)和折叠因子(Bam复合物)的生产的方法。这些因素是本领域技术人员已知的，并且易于获得。它们可包括如文献中所述的增加它们的表达的突变。

本发明还公开了通过在产生Ct-MOMP的大肠杆菌菌株中缺失编码天然外膜蛋白的基因来限制对折叠因子的竞争的方法。可使用标准的遗传学方法。

已经描述了本发明的多个实施方案。然而应当理解，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可以作出各种修改。相应地，其他实施方案在以下权利要求书的范围内。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与所公开的发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中引述的出版物及其中引述的材料明确地以引用方式并入。

本领域的技术人员将认识到或能够使用不超过常规的实验来探知本文所述发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在由以下权利要求书涵盖。

序列

SEQ ID NO:1：编码来自沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)菌株L2/434的MOMP的天然ompA基因的DNA序列(基因库：DQ064295.1)

下划线＝编码MOMP的信号序列的序列

其余部分＝编码成熟MOMP的序列

SEQ ID NO:2：来自沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)菌株L2/434的天然MOMP的蛋白质序列(基因库：ABB51013.1)

下划线＝对应于MOMP的信号序列的序列

其余部分＝对应于成熟MOMP的序列

SEQ ID NO:3：编码来自沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)菌株L2/434的MOMP的密码子优化的ompA基因的DNA序列。

下划线＝编码MOMP的信号序列的序列

其余部分＝编码成熟MOMP的序列

SEQ ID NO:4：编码来自沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)菌株L2/434的成熟MOMP的密码子优化的ompA基因的DNA序列。

SEQ ID NO:5：来自大肠杆菌(Escherichia coli)ompA基因的编码外膜蛋白OmpA的信号序列的DNA序列。

序列衍生自来自大肠杆菌(E.coli)菌株的基因组中的ompA基因，基因座标签b0957。K-12亚株MG1655(基因库：U00096.3)

SEQ ID NO:6：对应于大肠杆菌外膜蛋白OmpA的信号序列的蛋白质序列(来自基因库：AAC74043.1)。

SEQ ID NO:7：编码与沙眼衣原体成熟MOMP融合的大肠杆菌OmpA的信号序列的杂合基因(ompA_Ec-Ct)的DNA序列。

编码来自大肠杆菌OmpA(ompA基因)的信号序列的DNA序列标有下划线。编码MOMP的成熟部分的DNA序列衍生自密码子优化的等位基因，并且没有加下划线。

SEQ ID NO:8：编码与沙眼衣原体成熟MOMP融合的大肠杆菌OmpA的信号序列的杂合蛋白OmpA_Ec-MOMP_Ct的蛋白质序列。

(信号序列加下划线，其余部分是成熟的MOMP)。

SEQ ID NO:9：编码与沙眼衣原体成熟无Cys的MOMP融合的大肠杆菌OmpA的信号序列的杂合基因(ompAΔcys_Ec-Ct)的序列(信号序列加下划线，其余部分为成熟的无Cys的MOMP)。

来自SEQ ID NO:7的序列被改变以用9个Cys密码子(TGC)取代Ser密码子(TCT)。

SEQ ID NO:10：编码与沙眼衣原体成熟无Cys的MOMP融合的大肠杆菌OmpA的信号序列的杂合蛋白基因OmpA_Ec-MOMPΔCys_Ct(ompAΔcys_Ec-Ct)的序列(下划线＝信号序列，其余部分＝无Cys的MOMP)。

SEQ ID NO:11：沙眼衣原体成熟无Cys的MOMP

序列表

<110> 俄亥俄州创新基金会

<120> 重组衣原体活化的B细胞平台及其使用方法

<130> 10336-293WO1

<160> 11

<170> PatentIn 3.5版本

<210> 1

<211> 1185

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 1

atgaaaaaac tcttgaaatc ggtattagtg tttgccgctt tgagttctgc ttcctccttg 60

caagctctgc ctgtggggaa tcctgctgaa ccaagcctta tgatcgacgg aattctatgg 120

gaaggtttcg gcggagatcc ttgcgatcct tgcaccactt ggtgtgacgc tatcagcatg 180

cgtatgggtt actatggtga ctttgttttc gaccgtgttt tgcaaacaga tgtgaataaa 240

gaattccaaa tgggtgccaa gcctacaact gctacaggca atgctgcagc tccatccact 300

tgtacagcaa gagagaatcc tgcttacggc cgacatatgc aggatgctga gatgtttaca 360

aatgctgctt acatggcatt gaatatttgg gatcgttttg atgtattctg tacattagga 420

gccaccagtg gatatcttaa aggaaattca gcatctttca acttagttgg cttattcgga 480

gataatgaga accatgctac agtttcagat agtaagcttg taccaaatat gagcttagat 540

caatctgttg ttgagttgta tacagatact acttttgctt ggagtgctgg agctcgtgca 600

gctttgtggg aatgtggatg cgcgacttta ggcgcttctt tccaatacgc tcaatccaag 660

cctaaagtcg aagaattaaa cgttctctgt aacgcagctg agtttactat caataagcct 720

aaaggatatg tagggcaaga attccctctt gatcttaaag caggaacaga tggtgtgaca 780

ggaactaagg atgcctctat tgattaccat gaatggcaag caagtttagc tctctcttac 840

agactgaata tgttcactcc ctacattgga gttaaatggt ctcgagcaag ttttgatgca 900

gacacgattc gtattgctca gccgaagtca gctacaactg tctttgatgt taccactctg 960

aacccaacta ttgctggagc tggcgatgtg aaagctagcg cagagggtca gctcggagat 1020

accatgcaaa tcgtttcctt gcaattgaac aagatgaaat ctagaaaatc ttgcggtatt 1080

gcagtaggaa caactattgt ggatgcagac aaatacgcag ttacagttga gactcgcttg 1140

atcgatgaga gagctgctca cgtaaatgca caattccgct tctaa 1185

<210> 2

<211> 394

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 2

Met Lys Lys Leu Leu Lys Ser Val Leu Val Phe Ala Ala Leu Ser Ser

1 5 10 15

Ala Ser Ser Leu Gln Ala Leu Pro Val Gly Asn Pro Ala Glu Pro Ser

20 25 30

Leu Met Ile Asp Gly Ile Leu Trp Glu Gly Phe Gly Gly Asp Pro Cys

35 40 45

Asp Pro Cys Thr Thr Trp Cys Asp Ala Ile Ser Met Arg Met Gly Tyr

50 55 60

Tyr Gly Asp Phe Val Phe Asp Arg Val Leu Gln Thr Asp Val Asn Lys

65 70 75 80

Glu Phe Gln Met Gly Ala Lys Pro Thr Thr Ala Thr Gly Asn Ala Ala

85 90 95

Ala Pro Ser Thr Cys Thr Ala Arg Glu Asn Pro Ala Tyr Gly Arg His

100 105 110

Met Gln Asp Ala Glu Met Phe Thr Asn Ala Ala Tyr Met Ala Leu Asn

115 120 125

Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala Thr Ser Gly

130 135 140

Tyr Leu Lys Gly Asn Ser Ala Ser Phe Asn Leu Val Gly Leu Phe Gly

145 150 155 160

Asp Asn Glu Asn His Ala Thr Val Ser Asp Ser Lys Leu Val Pro Asn

165 170 175

Met Ser Leu Asp Gln Ser Val Val Glu Leu Tyr Thr Asp Thr Thr Phe

180 185 190

Ala Trp Ser Ala Gly Ala Arg Ala Ala Leu Trp Glu Cys Gly Cys Ala

195 200 205

Thr Leu Gly Ala Ser Phe Gln Tyr Ala Gln Ser Lys Pro Lys Val Glu

210 215 220

Glu Leu Asn Val Leu Cys Asn Ala Ala Glu Phe Thr Ile Asn Lys Pro

225 230 235 240

Lys Gly Tyr Val Gly Gln Glu Phe Pro Leu Asp Leu Lys Ala Gly Thr

245 250 255

Asp Gly Val Thr Gly Thr Lys Asp Ala Ser Ile Asp Tyr His Glu Trp

260 265 270

Gln Ala Ser Leu Ala Leu Ser Tyr Arg Leu Asn Met Phe Thr Pro Tyr

275 280 285

Ile Gly Val Lys Trp Ser Arg Ala Ser Phe Asp Ala Asp Thr Ile Arg

290 295 300

Ile Ala Gln Pro Lys Ser Ala Thr Thr Val Phe Asp Val Thr Thr Leu

305 310 315 320

Asn Pro Thr Ile Ala Gly Ala Gly Asp Val Lys Ala Ser Ala Glu Gly

325 330 335

Gln Leu Gly Asp Thr Met Gln Ile Val Ser Leu Gln Leu Asn Lys Met

340 345 350

Lys Ser Arg Lys Ser Cys Gly Ile Ala Val Gly Thr Thr Ile Val Asp

355 360 365

Ala Asp Lys Tyr Ala Val Thr Val Glu Thr Arg Leu Ile Asp Glu Arg

370 375 380

Ala Ala His Val Asn Ala Gln Phe Arg Phe

385 390

<210> 3

<211> 1185

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 3

atgaaaaaac tgctgaaatc tgttctggtt ttcgcggcgc tgtcttctgc gtcttctctg 60

caggcgctgc cggttggtaa cccggcggaa ccgtctctga tgatcgacgg tatcctgtgg 120

gaaggtttcg gtggtgaccc gtgcgacccg tgcaccacct ggtgcgacgc gatctctatg 180

cgtatgggtt actacggtga cttcgttttc gaccgtgttc tgcagaccga cgttaacaaa 240

gaattccaga tgggtgcgaa accgaccacc gcgaccggta acgcggcggc gccgtctacc 300

tgcaccgcgc gtgaaaaccc ggcgtacggt cgtcacatgc aggacgcgga aatgttcacc 360

aacgcggcgt acatggcgct gaacatctgg gaccgtttcg acgttttctg caccctgggt 420

gcgacctctg gttacctgaa aggtaactct gcgtctttca acctggttgg tctgttcggt 480

gacaacgaaa accacgcgac cgtttctgac tctaaactgg ttccgaacat gtctctggac 540

cagtctgttg ttgaactgta caccgacacc accttcgcgt ggtctgcggg tgcgcgtgcg 600

gcgctgtggg aatgcggttg cgcgaccctg ggtgcgtctt tccagtacgc gcagtctaaa 660

ccgaaagttg aagaactgaa cgttctgtgc aacgcggcgg aattcaccat caacaaaccg 720

aaaggttacg ttggtcagga attcccgctg gacctgaaag cgggtaccga cggtgttacc 780

ggtaccaaag acgcgtctat cgactaccac gaatggcagg cgtctctggc gctgtcttac 840

cgtctgaaca tgttcacccc gtacatcggt gttaaatggt ctcgtgcgtc tttcgacgcg 900

gacaccatcc gtatcgcgca gccgaaatct gcgaccaccg ttttcgacgt taccaccctg 960

aacccgacca tcgcgggtgc gggtgacgtt aaagcgtctg cggaaggtca gctgggtgac 1020

accatgcaga tcgtttctct gcagctgaac aaaatgaaat ctcgtaaatc ttgcggtatc 1080

gcggttggta ccaccatcgt tgacgcggac aaatacgcgg ttaccgttga aacccgtctg 1140

atcgacgaac gtgcggcgca cgttaacgcg cagttccgtt tctaa 1185

<210> 4

<211> 1119

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 4

ctgccggttg gtaacccggc ggaaccgtct ctgatgatcg acggtatcct gtgggaaggt 60

ttcggtggtg acccgtgcga cccgtgcacc acctggtgcg acgcgatctc tatgcgtatg 120

ggttactacg gtgacttcgt tttcgaccgt gttctgcaga ccgacgttaa caaagaattc 180

cagatgggtg cgaaaccgac caccgcgacc ggtaacgcgg cggcgccgtc tacctgcacc 240

gcgcgtgaaa acccggcgta cggtcgtcac atgcaggacg cggaaatgtt caccaacgcg 300

gcgtacatgg cgctgaacat ctgggaccgt ttcgacgttt tctgcaccct gggtgcgacc 360

tctggttacc tgaaaggtaa ctctgcgtct ttcaacctgg ttggtctgtt cggtgacaac 420

gaaaaccacg cgaccgtttc tgactctaaa ctggttccga acatgtctct ggaccagtct 480

gttgttgaac tgtacaccga caccaccttc gcgtggtctg cgggtgcgcg tgcggcgctg 540

tgggaatgcg gttgcgcgac cctgggtgcg tctttccagt acgcgcagtc taaaccgaaa 600

gttgaagaac tgaacgttct gtgcaacgcg gcggaattca ccatcaacaa accgaaaggt 660

tacgttggtc aggaattccc gctggacctg aaagcgggta ccgacggtgt taccggtacc 720

aaagacgcgt ctatcgacta ccacgaatgg caggcgtctc tggcgctgtc ttaccgtctg 780

aacatgttca ccccgtacat cggtgttaaa tggtctcgtg cgtctttcga cgcggacacc 840

atccgtatcg cgcagccgaa atctgcgacc accgttttcg acgttaccac cctgaacccg 900

accatcgcgg gtgcgggtga cgttaaagcg tctgcggaag gtcagctggg tgacaccatg 960

cagatcgttt ctctgcagct gaacaaaatg aaatctcgta aatcttgcgg tatcgcggtt 1020

ggtaccacca tcgttgacgc ggacaaatac gcggttaccg ttgaaacccg tctgatcgac 1080

gaacgtgcgg cgcacgttaa cgcgcagttc cgtttctaa 1119

<210> 5

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 5

atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag 60

gcc 63

<210> 6

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 6

Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala

1 5 10 15

Thr Val Ala Gln Ala

20

<210> 7

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 7

atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag 60

gccctgccgg ttggtaaccc ggcggaaccg tctctgatga tcgacggtat cctgtgggaa 120

ggtttcggtg gtgacccgtg cgacccgtgc accacctggt gcgacgcgat ctctatgcgt 180

atgggttact acggtgactt cgttttcgac cgtgttctgc agaccgacgt taacaaagaa 240

ttccagatgg gtgcgaaacc gaccaccgcg accggtaacg cggcggcgcc gtctacctgc 300

accgcgcgtg aaaacccggc gtacggtcgt cacatgcagg acgcggaaat gttcaccaac 360

gcggcgtaca tggcgctgaa catctgggac cgtttcgacg ttttctgcac cctgggtgcg 420

acctctggtt acctgaaagg taactctgcg tctttcaacc tggttggtct gttcggtgac 480

aacgaaaacc acgcgaccgt ttctgactct aaactggttc cgaacatgtc tctggaccag 540

tctgttgttg aactgtacac cgacaccacc ttcgcgtggt ctgcgggtgc gcgtgcggcg 600

ctgtgggaat gcggttgcgc gaccctgggt gcgtctttcc agtacgcgca gtctaaaccg 660

aaagttgaag aactgaacgt tctgtgcaac gcggcggaat tcaccatcaa caaaccgaaa 720

ggttacgttg gtcaggaatt cccgctggac ctgaaagcgg gtaccgacgg tgttaccggt 780

accaaagacg cgtctatcga ctaccacgaa tggcaggcgt ctctggcgct gtcttaccgt 840

ctgaacatgt tcaccccgta catcggtgtt aaatggtctc gtgcgtcttt cgacgcggac 900

accatccgta tcgcgcagcc gaaatctgcg accaccgttt tcgacgttac caccctgaac 960

ccgaccatcg cgggtgcggg tgacgttaaa gcgtctgcgg aaggtcagct gggtgacacc 1020

atgcagatcg tttctctgca gctgaacaaa atgaaatctc gtaaatcttg cggtatcgcg 1080

gttggtacca ccatcgttga cgcggacaaa tacgcggtta ccgttgaaac ccgtctgatc 1140

gacgaacgtg cggcgcacgt taacgcgcag ttccgtttct aa 1182

<210> 8

<211> 393

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 8

Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala

1 5 10 15

Thr Val Ala Gln Ala Leu Pro Val Gly Asn Pro Ala Glu Pro Ser Leu

20 25 30

Met Ile Asp Gly Ile Leu Trp Glu Gly Phe Gly Gly Asp Pro Cys Asp

35 40 45

Pro Cys Thr Thr Trp Cys Asp Ala Ile Ser Met Arg Met Gly Tyr Tyr

50 55 60

Gly Asp Phe Val Phe Asp Arg Val Leu Gln Thr Asp Val Asn Lys Glu

65 70 75 80

Phe Gln Met Gly Ala Lys Pro Thr Thr Ala Thr Gly Asn Ala Ala Ala

85 90 95

Pro Ser Thr Cys Thr Ala Arg Glu Asn Pro Ala Tyr Gly Arg His Met

100 105 110

Gln Asp Ala Glu Met Phe Thr Asn Ala Ala Tyr Met Ala Leu Asn Ile

115 120 125

Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala Thr Ser Gly Tyr

130 135 140

Leu Lys Gly Asn Ser Ala Ser Phe Asn Leu Val Gly Leu Phe Gly Asp

145 150 155 160

Asn Glu Asn His Ala Thr Val Ser Asp Ser Lys Leu Val Pro Asn Met

165 170 175

Ser Leu Asp Gln Ser Val Val Glu Leu Tyr Thr Asp Thr Thr Phe Ala

180 185 190

Trp Ser Ala Gly Ala Arg Ala Ala Leu Trp Glu Cys Gly Cys Ala Thr

195 200 205

Leu Gly Ala Ser Phe Gln Tyr Ala Gln Ser Lys Pro Lys Val Glu Glu

210 215 220

Leu Asn Val Leu Cys Asn Ala Ala Glu Phe Thr Ile Asn Lys Pro Lys

225 230 235 240

Gly Tyr Val Gly Gln Glu Phe Pro Leu Asp Leu Lys Ala Gly Thr Asp

245 250 255

Gly Val Thr Gly Thr Lys Asp Ala Ser Ile Asp Tyr His Glu Trp Gln

260 265 270

Ala Ser Leu Ala Leu Ser Tyr Arg Leu Asn Met Phe Thr Pro Tyr Ile

275 280 285

Gly Val Lys Trp Ser Arg Ala Ser Phe Asp Ala Asp Thr Ile Arg Ile

290 295 300

Ala Gln Pro Lys Ser Ala Thr Thr Val Phe Asp Val Thr Thr Leu Asn

305 310 315 320

Pro Thr Ile Ala Gly Ala Gly Asp Val Lys Ala Ser Ala Glu Gly Gln

325 330 335

Leu Gly Asp Thr Met Gln Ile Val Ser Leu Gln Leu Asn Lys Met Lys

340 345 350

Ser Arg Lys Ser Cys Gly Ile Ala Val Gly Thr Thr Ile Val Asp Ala

355 360 365

Asp Lys Tyr Ala Val Thr Val Glu Thr Arg Leu Ile Asp Glu Arg Ala

370 375 380

Ala His Val Asn Ala Gln Phe Arg Phe

385 390

<210> 9

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 9

atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag 60

gccctgccgg ttggtaaccc ggcggaaccg tctctgatga tcgacggtat cctgtgggaa 120

ggtttcggtg gtgacccgtc tgacccgtct accacctggt ctgacgcgat ctctatgcgt 180

atgggttact acggtgactt cgttttcgac cgtgttctgc agaccgacgt taacaaagaa 240

ttccagatgg gtgcgaaacc gaccaccgcg accggtaacg cggcggcgcc gtctacctct 300

accgcgcgtg aaaacccggc gtacggtcgt cacatgcagg acgcggaaat gttcaccaac 360

gcggcgtaca tggcgctgaa catctgggac cgtttcgacg ttttctctac cctgggtgcg 420

acctctggtt acctgaaagg taactctgcg tctttcaacc tggttggtct gttcggtgac 480

aacgaaaacc acgcgaccgt ttctgactct aaactggttc cgaacatgtc tctggaccag 540

tctgttgttg aactgtacac cgacaccacc ttcgcgtggt ctgcgggtgc gcgtgcggcg 600

ctgtgggaat ctggttctgc gaccctgggt gcgtctttcc agtacgcgca gtctaaaccg 660

aaagttgaag aactgaacgt tctgtctaac gcggcggaat tcaccatcaa caaaccgaaa 720

ggttacgttg gtcaggaatt cccgctggac ctgaaagcgg gtaccgacgg tgttaccggt 780

accaaagacg cgtctatcga ctaccacgaa tggcaggcgt ctctggcgct gtcttaccgt 840

ctgaacatgt tcaccccgta catcggtgtt aaatggtctc gtgcgtcttt cgacgcggac 900

accatccgta tcgcgcagcc gaaatctgcg accaccgttt tcgacgttac caccctgaac 960

ccgaccatcg cgggtgcggg tgacgttaaa gcgtctgcgg aaggtcagct gggtgacacc 1020

atgcagatcg tttctctgca gctgaacaaa atgaaatctc gtaaatcttc tggtatcgcg 1080

gttggtacca ccatcgttga cgcggacaaa tacgcggtta ccgttgaaac ccgtctgatc 1140

gacgaacgtg cggcgcacgt taacgcgcag ttccgtttct aa 1182

<210> 10

<211> 393

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 10

Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala

1 5 10 15

Thr Val Ala Gln Ala Leu Pro Val Gly Asn Pro Ala Glu Pro Ser Leu

20 25 30

Met Ile Asp Gly Ile Leu Trp Glu Gly Phe Gly Gly Asp Pro Ser Asp

35 40 45

Pro Ser Thr Thr Trp Ser Asp Ala Ile Ser Met Arg Met Gly Tyr Tyr

50 55 60

Gly Asp Phe Val Phe Asp Arg Val Leu Gln Thr Asp Val Asn Lys Glu

65 70 75 80

Phe Gln Met Gly Ala Lys Pro Thr Thr Ala Thr Gly Asn Ala Ala Ala

85 90 95

Pro Ser Thr Ser Thr Ala Arg Glu Asn Pro Ala Tyr Gly Arg His Met

100 105 110

Gln Asp Ala Glu Met Phe Thr Asn Ala Ala Tyr Met Ala Leu Asn Ile

115 120 125

Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Ser Thr Leu Gly Ala Thr Ser Gly Tyr

130 135 140

Leu Lys Gly Asn Ser Ala Ser Phe Asn Leu Val Gly Leu Phe Gly Asp

145 150 155 160

Asn Glu Asn His Ala Thr Val Ser Asp Ser Lys Leu Val Pro Asn Met

165 170 175

Ser Leu Asp Gln Ser Val Val Glu Leu Tyr Thr Asp Thr Thr Phe Ala

180 185 190

Trp Ser Ala Gly Ala Arg Ala Ala Leu Trp Glu Ser Gly Ser Ala Thr

195 200 205

Leu Gly Ala Ser Phe Gln Tyr Ala Gln Ser Lys Pro Lys Val Glu Glu

210 215 220

Leu Asn Val Leu Ser Asn Ala Ala Glu Phe Thr Ile Asn Lys Pro Lys

225 230 235 240

Gly Tyr Val Gly Gln Glu Phe Pro Leu Asp Leu Lys Ala Gly Thr Asp

245 250 255

Gly Val Thr Gly Thr Lys Asp Ala Ser Ile Asp Tyr His Glu Trp Gln

260 265 270

Ala Ser Leu Ala Leu Ser Tyr Arg Leu Asn Met Phe Thr Pro Tyr Ile

275 280 285

Gly Val Lys Trp Ser Arg Ala Ser Phe Asp Ala Asp Thr Ile Arg Ile

290 295 300

Ala Gln Pro Lys Ser Ala Thr Thr Val Phe Asp Val Thr Thr Leu Asn

305 310 315 320

Pro Thr Ile Ala Gly Ala Gly Asp Val Lys Ala Ser Ala Glu Gly Gln

325 330 335

Leu Gly Asp Thr Met Gln Ile Val Ser Leu Gln Leu Asn Lys Met Lys

340 345 350

Ser Arg Lys Ser Ser Gly Ile Ala Val Gly Thr Thr Ile Val Asp Ala

355 360 365

Asp Lys Tyr Ala Val Thr Val Glu Thr Arg Leu Ile Asp Glu Arg Ala

370 375 380

Ala His Val Asn Ala Gln Phe Arg Phe

385 390

<210> 11

<211> 372

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 11

Leu Pro Val Gly Asn Pro Ala Glu Pro Ser Leu Met Ile Asp Gly Ile

1 5 10 15

Leu Trp Glu Gly Phe Gly Gly Asp Pro Ser Asp Pro Ser Thr Thr Trp

20 25 30

Ser Asp Ala Ile Ser Met Arg Met Gly Tyr Tyr Gly Asp Phe Val Phe

35 40 45

Asp Arg Val Leu Gln Thr Asp Val Asn Lys Glu Phe Gln Met Gly Ala

50 55 60

Lys Pro Thr Thr Ala Thr Gly Asn Ala Ala Ala Pro Ser Thr Ser Thr

65 70 75 80

Ala Arg Glu Asn Pro Ala Tyr Gly Arg His Met Gln Asp Ala Glu Met

85 90 95

Phe Thr Asn Ala Ala Tyr Met Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp

100 105 110

Val Phe Ser Thr Leu Gly Ala Thr Ser Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser

115 120 125

Ala Ser Phe Asn Leu Val Gly Leu Phe Gly Asp Asn Glu Asn His Ala

130 135 140

Thr Val Ser Asp Ser Lys Leu Val Pro Asn Met Ser Leu Asp Gln Ser

145 150 155 160

Val Val Glu Leu Tyr Thr Asp Thr Thr Phe Ala Trp Ser Ala Gly Ala

165 170 175

Arg Ala Ala Leu Trp Glu Ser Gly Ser Ala Thr Leu Gly Ala Ser Phe

180 185 190

Gln Tyr Ala Gln Ser Lys Pro Lys Val Glu Glu Leu Asn Val Leu Ser

195 200 205

Asn Ala Ala Glu Phe Thr Ile Asn Lys Pro Lys Gly Tyr Val Gly Gln

210 215 220

Glu Phe Pro Leu Asp Leu Lys Ala Gly Thr Asp Gly Val Thr Gly Thr

225 230 235 240

Lys Asp Ala Ser Ile Asp Tyr His Glu Trp Gln Ala Ser Leu Ala Leu

245 250 255

Ser Tyr Arg Leu Asn Met Phe Thr Pro Tyr Ile Gly Val Lys Trp Ser

260 265 270

Arg Ala Ser Phe Asp Ala Asp Thr Ile Arg Ile Ala Gln Pro Lys Ser

275 280 285

Ala Thr Thr Val Phe Asp Val Thr Thr Leu Asn Pro Thr Ile Ala Gly

290 295 300

Ala Gly Asp Val Lys Ala Ser Ala Glu Gly Gln Leu Gly Asp Thr Met

305 310 315 320

Gln Ile Val Ser Leu Gln Leu Asn Lys Met Lys Ser Arg Lys Ser Ser

325 330 335

Gly Ile Ala Val Gly Thr Thr Ile Val Asp Ala Asp Lys Tyr Ala Val

340 345 350

Thr Val Glu Thr Arg Leu Ile Asp Glu Arg Ala Ala His Val Asn Ala

355 360 365

Gln Phe Arg Phe

370

Claims

1.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包括编码衣原体属(Chlamydia)物种的主要外膜蛋白(MOMP)的核苷酸序列，其中编码所述MOMP的所述核苷酸序列与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9具有至少90％的同一性。

2.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包括编码衣原体属物种的主要外膜蛋白(MOMP)的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9。

3.一种分离的衣原体属物种的MOMP多肽或糖多肽，其中所述多肽或糖多肽包括与SEQID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11具有至少90％的同一性的氨基酸序列。

4.一种分离的衣原体属物种的MOMP多肽或糖多肽，其中所述多肽或糖多肽包括SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11。

5.根据权利要求1或2所述的分离的核酸，其中所述核酸还包括编码纯化标签的核酸。

6.根据权利要求5所述的分离的核酸，其中所述纯化标签是His标签。

7.根据权利要求6所述的多肽或糖多肽，其中所述多肽或糖多肽还包括纯化标签。

8.根据权利要求7所述的分离的核酸，其中所述纯化标签是His标签。

9.一种用于产生活化的抗原递呈细胞(APC)的平台，其中所述平台包括：

a.多肽或糖多肽，所述多肽或糖多肽包括衣原体属物种(Chlamydia spp.)的天然存在的主要外膜蛋白(MOMP)的衍生物或其抗原片段，其中所述天然存在的MOMP被修饰为使得MOMP的至少一个半胱氨酸残基被不同的氨基酸取代；

b.B细胞群；以及

c.抗原，其中所述抗原不衍生自衣原体属物种(Chlamydia spp.)。

10.根据权利要求9所述的平台，其中所述多肽包括具有衣原体衍生的MOMP的不是天然存在的信号序列。

11.根据权利要求10所述的平台，其中所述信号序列衍生自大肠杆菌(Escherichiacoli)。

12.根据权利要求11所述的平台，其中所述信号序列与包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少90％的同一性。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的平台，其中MOMP衍生自沙眼衣原体(C.trachomatis)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)、肺炎衣原体(C.pneumoniae)或鼠嗜衣原体(C.muridarum)或另一种衣原体属物种(Chlamydia spp.)，并且被修饰为用不同的氨基酸取代至少一个半胱氨酸残基。

14.根据权利要求9至13中任一项所述的平台，其中所述至少一个半胱氨酸残基已被丝氨酸残基取代。

15.根据权利要求9至14中任一项所述的平台，其中MOMP的抗原片段包括MOMP的一个或多个表面暴露片段。

16.一种使用根据权利要求9所述的平台产生的疫苗。

17.一种由根据权利要求9所述的平台产生的衣原体活化的B细胞。

18.一种用于在受试者中产生活化的抗原递呈的衣原体活化的B细胞的方法，所述方法包括：

a.用质粒转化细胞，其中所述质粒包括编码主要外膜(MOMP)蛋白的衍生物或其抗原片段的核酸以及信号序列，从而产生重组MOMP；

b.使所述受试者的B细胞暴露于步骤a)的所述重组MOMP；

c.使步骤b)的所述B细胞暴露于期望的抗原，其中所述抗原不衍生自衣原体属物种(Chlamydia spp.)，从而获得活化的抗原递呈的衣原体活化的B细胞(CAB)。

19.根据权利要求18所述的方法，其中用质粒转化的所述细胞是大肠杆菌。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述信号序列是大肠杆菌OmpA。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述信号序列包括SEQ ID NO:5。

22.根据权利要求18至21中任一项所述的方法，其中MOMP衍生自沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体或鼠嗜衣原体或另一种衣原体属物种(Chlamydia spp.)，并且被修饰为用不同的氨基酸取代至少一个半胱氨酸。

23.根据权利要求18至22中任一项所述的方法，其中天然存在的MOMP的所有半胱氨酸残基均被丝氨酸残基取代。

24.根据权利要求23所述的方法，其中在使来自步骤a)的所述B细胞暴露于包括MOMP的多肽之后，其中所述天然存在的MOMP被修饰为使得MOMP的至少一个半胱氨酸残基被不同的氨基酸取代；添加将蛋白质、肽、核酸、脂质、碳水化合物或其片段交联至所述CAB的步骤，其中所述蛋白质、肽、核酸、脂质、碳水化合物或其片段是抗原性的。

25.根据权利要求18至24中任一项所述的方法，其中MOMP的所述抗原片段包括MOMP的一个或多个表面暴露片段。

26.一种由根据权利要求18至25中任一项所述的方法产生的衣原体活化的B细胞。

27.一种治疗对其有需要的受试者的方法，所述方法包括：

a.从所述受试者获得B细胞；

d.使来自步骤a)的所述B细胞暴露于多肽，所述多肽包括衣原体属物种(Chlamydiaspp.)的天然存在的主要外膜蛋白(MOMP)的衍生物或其抗原片段；

b.使步骤b)的所述B细胞暴露于抗原，其中所述抗原不衍生自衣原体属物种(Chlamydia spp.)，从而获得活化的抗原递呈的衣原体活化的B细胞(CAB)；以及

c.用步骤c)的所述活化的抗原递呈的衣原体活化的B细胞治疗所述受试者。

28.根据权利要求27所述的方法，其中天然存在的MOMP的所述衍生物被修饰为使得天然存在的MOMP的至少一个半胱氨酸残基被不同的氨基酸取代。

29.根据权利要求27或28所述的方法，其中MOMP衍生自沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体或鼠嗜衣原体或另一种衣原体属物种(Chlamydia spp.)，并且被修饰为用丝氨酸残基取代至少一个半胱氨酸残基。

30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，其中所述天然存在的MOMP的所有半胱氨酸残基均被丝氨酸残基取代。

31.根据权利要求30所述的方法，其中在使来自步骤a)的所述B细胞暴露于包括衣原体属物种(Chlamydia spp.)的天然存在的主要外膜蛋白(MOMP)的衍生物的多肽之后，其中所述天然存在的MOMP被修饰为使得MOMP的至少一个半胱氨酸残基被不同的氨基酸取代；添加将蛋白质、肽、核酸、脂质、碳水化合物或其片段交联至所述CAB的步骤，其中所述蛋白质、肽、核酸、脂质、碳水化合物或其片段是抗原。

32.根据权利要求27至31中任一项所述的方法，其中MOMP的所述抗原片段包括MOMP的一个或多个表面暴露片段。

33.一种疫苗，所述疫苗包括抗原和多肽，所述多肽包括衣原体属物种(Chlamydiaspp.)的天然存在的主要外膜蛋白(MOMP)的衍生物或其抗原片段，其中所述天然存在的MOMP被修饰为使得MOMP的至少一个半胱氨酸残基被不同的氨基酸取代，并且其中所述抗原不衍生自衣原体属物种(Chlamydia spp.)。

34.根据权利要求33所述的疫苗，其中MOMP衍生自沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体或鼠嗜衣原体，并且被修饰为用丝氨酸残基取代至少一个半胱氨酸残基。

35.根据权利要求34所述的疫苗，其中所述多肽的所有半胱氨酸残基均被丝氨酸残基取代。

36.根据权利要求33至35中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗包括多于一种抗原。

37.根据权利要求36所述的疫苗，其中所述疫苗包括多于两种抗原。

38.根据权利要求33至37中任一项所述的疫苗，其中所述抗原包括感染剂。

39.根据权利要求38所述的疫苗，其中所述感染剂为病毒。

40.根据权利要求39所述的疫苗，其中所述病毒感染剂为HIV。

41.根据权利要求33至37中任一项所述的疫苗，其中所述抗原包括肿瘤相关抗原。

42.根据权利要求33至41中任一项所述的疫苗，其中与由单独抗原诱导的体液免疫应答相比，所述疫苗增加特异性体液免疫(例如，抗体亲和力成熟或抗体与同源抗原结合的强度)。

43.一种试剂盒，所述试剂盒包括抗原和多肽，所述多肽包括衣原体属物种(Chlamydiaspp.)的天然存在的主要外膜蛋白(MOMP)的衍生物或其抗原片段，其中所述天然存在的MOMP被修饰为使得MOMP的至少一个半胱氨酸残基被不同的氨基酸取代，其中所述抗原不衍生自衣原体属物种(Chlamydia spp.)。

44.一种预防受试者的疾病或感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用加载抗原的CAB，其中用于活化所述B细胞的所述抗原是衣原体属物种(Chlamydia spp.)的天然存在的主要外膜蛋白(MOMP)的衍生物或抗原片段，其中所述天然存在的MOMP被修饰为使得MOMP的至少一个半胱氨酸残基被不同的氨基酸取代；从而预防所述受试者的疾病或感染。

45.根据权利要求44所述的方法，其中MOMP衍生自沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体或鼠嗜衣原体。

46.根据权利要求44或45所述的方法，其中MOMP被修饰为用丝氨酸残基取代至少一个半胱氨酸残基。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述多肽的所有半胱氨酸残基均被丝氨酸残基取代。