CN102321176A

CN102321176A - 一种制备胱抑素c配对单克隆抗体的方法

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Publication number: CN102321176A
Application number: CN201110254775A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Beijing Leadman Biochemistry Co Ltd
Current assignee: Beijing Leadman Biochemistry Co Ltd
Priority date: 2011-08-31
Filing date: 2011-08-31
Publication date: 2012-01-18
Anticipated expiration: 2031-08-31
Also published as: CN102321176B

Abstract

本发明涉及蛋白质工程领域，具体涉及一种制备CysC配对单克隆抗体的方法，包括：将能够产生胱抑素C抗体的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合后，筛选与胱抑素C具有特异性结合的杂交瘤细胞，制备产单克隆抗体的细胞，完成第1次细胞融合，进一步纯化出单抗，选1个单抗标记辣根过氧化物酶；然后实施第2次小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合；在酶标板上完成胱抑素C抗原包被，将第2次细胞融合得到的杂交瘤细胞培养上清加到酶标板孔中，并设空白对照孔，随后将上述辣根过氧化物酶标记的单抗加到酶标板孔中，37℃温育30分钟，每孔加入底物进行显色，用硫酸终止反应后，测量450nm下的吸光值；选取无抑制的孔作为配对单抗。

Description

一种制备胱抑素C配对单克隆抗体的方法

技术领域

本发明涉及蛋白质工程领域，具体涉及一种制备CysC配对单克隆抗体的方法。

背景技术

胱抑素C(Cystatin C，CysC)即半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白C，分子量13kD，是一种低分子量蛋白质，可由机体所有核细胞产生，产率恒定，循环中的CysC仅经肾小球滤过而被清除。因此，CysC是一种反映肾小球滤过率(GRF)变化的理想的内源性标志物(张耀祖.血清CysC作为肾小球滤过率指标在慢性肾功能衰竭中的意义.现代检验医学杂志，2005，20(6)：72-73.)，其血清浓度测定是优于传统的血尿素、尿酸、肌酐和内生肌酐清除率测定的新的肾功能评价指标。2002年FDA网上公布了26个在检验医学有重大突破的全新检测项目，血清CysC测定便是其中之一。但目前临床试验室测定CysC均为需要昂贵特殊仪器和试剂盒的方法，制约了其推广应用。颗粒增强透射免疫比浊分析法(PETIA)是可以应用于全自动生化分析仪的常用方法(郑瑾，李倩，吴蓉，康向东.PETIA法检测血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C方法学评价.检验医学，2010，25(3)：233-235.)。颗粒增强透射免疫比浊分析法(PETIA)检测CysC的原理是将两种或两种以上能同时与CysC结合的单克隆抗体交联到胶乳颗粒上，这种交联有特异性抗体的胶乳与样本中的CysC结合，聚集成分子量较大的网状结构，形成浊度，根据浊度与CysC的浓度在一定范围内呈正相关的特性，根据校准曲线可以得出待测样品中CysC的浓度。这种检测方法需要CysC标准抗原和抗体。

CysC在体液中的含量很低，天然提取纯化的CysC极难获得，现在主要通过体外表达的方法制备CysC抗原，用于校准品和抗体的制备。由于CysC抗原分子量小，抗原表位比较集中，要得到针对CysC抗原的不同表位且相互不干扰的单抗(即配对单抗)很困难。

现有技术中单抗制备方法首先获得尽可能多的单抗细胞株，分别制备纯化的CysC单抗，进行标记，然后通过双抗体夹心ELISA法从中筛选配对的单抗。这种方法工作量大，筛选范围相对较窄，由于CysC是一种分子量很小的抗原，通过该方法很难得到配对单抗。

发明内容

为了提高获得配对单抗的几率，本发明提供一种CysC抗原及其单克隆抗体的制备方法，该抗原和抗体可以用于血清CysC的检测。

本发明建立的一种与现有技术不同的CysC配对单抗制备方法，包括以下步骤：

将能够产生胱抑素C抗体的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合后，筛选与胱抑素C具有特异性结合的杂交瘤细胞，制备产单克隆抗体的细胞，完成第1次细胞融合，进一步纯化出单抗，选1个单抗标记辣根过氧化物酶；

然后实施第2次小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合；

在酶标板上完成胱抑素C抗原包被，将第2次细胞融合得到的杂交瘤细胞培养上清加到酶标板孔中，并设空白对照孔，随后将上述辣根过氧化物酶标记的单抗加到酶标板孔中，37℃温育30分钟，每孔加入底物进行显色，用硫酸终止反应后，测量450nm下的吸光值；

选取无抑制的孔作为配对单抗。

胱抑素C采用原核表达纯化的方法制备。

更进一步的，本发明的制备胱抑素C配对单克隆抗体的方法，包括：通过两次细胞融合实验筛选配对单抗，第1次融合实验筛选强阳性细胞株(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，保藏日期2011年8月30日保藏编号CGMCC NO.5191分类命名：杂交瘤细胞)(1-2株)，纯化出单抗，选1株进行辣根过氧化物酶(HRP)标记；第2次融合实验采用间接ELISA法和CysC抗体竞争ELISA法筛选，筛选与第1次融合得到的单抗之间没有竞争抑制作用的阳性细胞株(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，保藏日期2011年8月30日保藏编号CGMCC NO.5192分类命名：杂交瘤细胞)(1-2株)，这样的细胞株就是与先获得的细胞株配对的单抗细胞株。该方法筛选对象是一次融合实验的所有阳性孔，筛选范围达到极限，大大提高了获得配对细胞株的几率。

更具体的，本发明通过两次细胞融合实验筛选配对单抗，包括：首先采用原核表达纯化的方法制备CysC抗原，用表达纯化的CysC抗原免疫Balb/c小鼠，完成3-4次免疫后进行第1次融合实验，本次融合实验筛选1-2株阳性细胞株，制备腹水，纯化出单抗，选1个单抗(记为，单抗1)用辣根过氧化物酶(HRP)进行标记；然后实施第2次融合实验，第2次融合实验的杂交瘤细胞培养上清采用间接ELISA法和HRP标记CysC单抗1(HRP-单抗1)竞争ELISA法进行筛选，筛选与第1次融合得到的单抗之间没有竞争抑制作用的阳性细胞株(1-2株)，这样的细胞株识别的抗原表位与单抗1所识别的抗原表位之间不存在相互干扰，这种通过两次融合实验结合抗体竞争ELISA获得的2个细胞株就是与CysC单抗1配对的单抗细胞株，最后通过双抗体夹心ELISA法对配对细胞株做进一步验证。该方法筛选对象是第2次融合实验的所有阳性孔，筛选范围达到极限，大大提高了获得配对细胞的几率。

本发明的技术路线可以用附图1的流程图加以阐明。

本发明提供的方法与现有技术中的方法表现出以下具体优势(见表1)，本发明在减轻工作量的前提下有效扩大了筛选范围，使获得配对细胞株的几率得到提高。

表1本发明与现有技术的比较

比较内容	现有技术	本发明的技术	本发明技术的优缺点
				克隆化细胞数量	尽可能多，按20株计算(据可操作性)	2-4株	大大减少工作量
腹水制备与纯化	20株细胞	2-4株	大大减少工作量
				单抗HRP标记	20株细胞	1株，筛选用	大大减少工作量
筛选范围	20株细胞	所有阳性孔	提高了筛选几率
				融合次数	1次	2次	多做1次融合

附图说明

图1：本发明的技术流程简图

图2：CysC在大肠杆菌中的表达、纯化结果。M：Marker

图3：双抗夹心ELISA结果图

图4：表达载体pET28a(+)简图

图5：带有NcoI和XhoI酶切位点的CysC基因序列。斜体部分为添加的NcoI和XhoI酶切位点。

具体实施方式

1、实验材料

1)表达载体：pET28a(+)购自(Novagen公司)；结构简图如图4所示，也可参见Novagen公司提供的产品说明书。

2)表达宿主菌：大肠杆菌BL21(DE3)，购于北京天根生物技术有限公司；

3)酵母粉和蛋白胨：均为Oxoid公司产品；

4)CysC基因由上海旭冠生物科技有限公司合成；带有NcoI和XhoI酶切位点的CysC基因序列如SEQ ID NO：1所示(图5)，斜体部分为添加的NcoI和XhoI酶切位点。

5)SP 2/0骨髓瘤细胞购自上海生化所细胞中心并由本公司研发部保存；

6)Balb/c小鼠购自中国医学科学院实验动物中心。

7)胎牛血清：购自杭州四季青公司；

8)DMEM培养基、HAT(次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸腺嘧啶核苷)和HT(次黄嘌呤/胸腺嘧啶核苷)：均为Invitrogen公司产品；

9)50％PEG₁₄₅₀溶液：为Sigma公司产品；

10)其他药品均为分析纯等级。

2.1CysC的表达与纯化

CysC基因由上海旭冠生物科技发展有限公司合成，插入在该公司自己构建的克隆载体上，基因的5’和3’端分别带有NcoI和XhoI限制性酶切位点，将带有CysC基因的质粒用NcoI和XhoI进行双酶切，插入用相同方法酶切处理的表达载体pET28a(+)上，转化表达宿主细胞。宿主细胞可以使用常用的大肠杆菌宿主细胞，例如E.coli BL21(DE3)或其他的E.coli感受态细胞，优选为E.coli BL21(DE3)。

用菌落PCR的方法挑选阳性克隆子，具体方法为：

正向引物(CysC-F)：CCATGGGCAGCAGCCCGGGCA(SEQ ID NO：2)，反向引物(CysC-R)：CTCGAGCGCATCCTGGCAGGT(SEQ ID NO：3)；

PCR反应体系为：dNTPs(宝生物(Takara)公司产品)4μl；10×PCR缓冲液(Takara公司产品)5μl；CysC-F引物1μl；CysC-R引物1μl；Taq DNA聚合酶(5U/μl，Takara公司产品)0.5μl，加灭菌去离子水至50μl，用灭菌牙签挑取待检菌落在PCR反应液中沾一下作为模板。

PCR的反应条件为：94℃保持2.5分钟，然后进行30个循环(94℃0.5min；50℃0.5min； 72℃0.5min)；最后72℃延伸5min，得到基因扩增产物。

将得到的扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测是否出现分子量在360bp左右的条带。将得到的阳性克隆子在LB培养基中培养至OD₆₀₀到0.8左右，加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mM进行诱导表达。诱导表达后的菌液进行细胞破碎。对于细胞破碎，可以采用常规的细胞破碎方法，例如在8000-12000转/分的条件下离心5-10分钟，弃上清，沉淀用原菌液1/5-1/10体积的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，在冰水浴中用超声破碎仪对菌体进行超声破碎，8000-12000转/分的条件下离心5-10分钟，上清用0.22um滤膜过滤，经过滤膜过滤后，用镍柱进行亲和纯化，优选GE Healthcare Life Sciences(通用电气医疗集团生命科学部)的HisTrap预装柱(HisTrap FF crude 5ml)进行纯化，按纯化柱填料产品说明书提供的方法进行纯化。结果如图2所示。

2.2Balb/c小鼠的免疫

选取4-6只6-8周龄雌性Balb/c小鼠用上述大肠杆菌表达的CysC抗原进行免疫。在细胞融合前进行4次免疫。

首免：取0.5mg/ml浓度的CysC抗原与等体积弗氏完全佐剂(Sigma，10ml/瓶)乳化后注射到小鼠颈背部皮下，每只小鼠注射0.2ml；

二免：首免3周后取0.5mg/ml浓度的CysC抗原与等体积弗氏不完全佐剂乳化后注射到小鼠颈背部皮下和腹腔，每只小鼠注射0.2ml；小鼠二免后一周，用毛细玻璃管从眼内框采集血样，分离血清用间接ELISA法测定小鼠抗体产生情况(如2.3中所述)。

三免：二免3周后，取0.5mg/ml浓度的CysC抗原与等体积弗氏不完全佐剂乳化后注射到小鼠颈背部皮下和腹腔，每只小鼠注射0.2ml。

四免：融合前3天再腹腔注射抗原(不加佐剂)进行一次加强免疫。

2.3血清抗体效价检测

采用如下间接ELISA法对免疫小鼠血清效价进行测定。

用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液将CysC抗原稀释到0.1-10ug/ml范围内，优选1ug/ml，每孔100ul加到酶标板中，4℃冰箱放置过夜，使抗原吸附到酶标板中，用含0.05％吐温-20pH7.4 磷酸盐缓冲液(PBS-T)洗涤酶标板1次，洗掉未与酶标板结合的抗原，完成抗原包被。

将采集到的小鼠血清从1/100(10^-2)开始用PBS-T作1/10系列稀释并设立1孔稀释液对照，共做8孔，即10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、0，稀释好的抗血清按每孔100ul加到上述包被好抗原的酶标板，37℃温育30分钟，用PBS-T洗板1次。用PBS-T将羊抗鼠-HRP(辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG，中杉金桥公司产品，1ml/支)稀释至说明书推荐的工作浓度，每孔100ul加到酶标板，37℃温育30分钟，用PBS-T洗板2次。每孔加入100ul显色底物[5.37g/L的一水柠檬酸(C₆H₈O₇.H₂O)、19.38g/L的Na₂HPO₄.12H₂O、50mg/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、25mg/L的过氧化氢脲(H₂O₂)和5％N，N-二甲基甲酰胺(V/V)]，进行显色，用2M硫酸终止反应后，测量450nm下的吸光值。我们将OD值为阴性对照两倍以上时抗体的最高稀释倍数定为该抗体的效价。血清效价达到10^-5以上即可选取效价较高的小鼠进行细胞融合实验。

2.4单克隆抗体细胞融合方法

根据血清抗体效价测定结果，优选抗体效价较高的小鼠进行细胞融合实验。

在最后一次免疫接种CysC抗原2-5天(优选3天)后收集小鼠脾细胞，将这些组织中产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合后，筛选与CysC具有特异性结合的杂交瘤，从而制备产单克隆抗体的细胞。

上述融合可以按照公知的方法进行，例如如下方法：将脾细胞与瘤细胞按5-10∶1的比例混合，离心去上清后，向沉淀物中加入0.5-1ml(优选0.85ml)融合促进试剂，然后用20-40ml(优选30ml)DMEM培养基终止融合促进试剂的作用。离心弃上清后细胞用合适体积(40ml-100ml)的HAT培养基重悬，制成融合细胞，融合细胞在培养杂交瘤的孔格中进行培养。

对于骨髓瘤细胞可以使用公知的骨髓瘤细胞，例如SP2/0-Ag14(SP2/0)、P3/X63-Ag8(X63)、P3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)、P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)等小鼠来源的细胞系，其中优选为SP2/0。融合促进试剂可以为聚乙二醇1450(PEG₁₄₅₀)、聚乙二醇4000(PEG₄₀₀₀)等，优选为PEG₁₄₅₀。

单克隆抗体的选择可以根据已知的方法进行。一般地是在添加有HAT的用于动物细胞的细胞培养基中进行的。用于选择与培养的培养基例如：体积比为5％-20％胎牛血清的DMEM或RPMI-1640培养基。细胞一般在5-10％CO₂气体的环境中于36.5℃-37.5℃，培养10-15天。

2.5单克隆抗体的筛选方法

2.5.1间接ELISA法筛选阳性孔

在CysC单抗制备过程中，融合板或克隆板细胞(在单抗制备过程中按实验阶段细胞可以分为融合实验阶段和克隆化阶段，相应培养物的细胞板分别称为融合板和克隆板)培养8-14天后(优选10天)，采用间接ELISA法对单克隆抗体细胞培养上清进行测定。例如：

用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液将CysC抗原稀释到0.1-10ug/ml(优选1ug/ml)，每孔100ul加到酶标板中，4℃冰箱放置过夜，使抗原吸附到酶标板中，用吐温-20磷酸盐缓冲液(PBS-T)洗涤酶标板1次，洗掉未与酶标板结合的抗原，完成抗原包被。

从每个培养孔中取出100ul上清加到包被好的酶标板，37℃温育30分钟，用PBS-T洗板1次。用PBS-T将羊抗鼠-HRP稀释至说明书提供的工作浓度，每孔100ul加到酶标板，37℃温育30分钟，用PBS-T洗板2次。每孔加入100ul底物进行显色，用2M硫酸终止反应后，测量450nm下的吸光值。选取吸光值在1.0以上的培养孔定为阳性孔，其中吸光值在2.0以上的孔定为强阳性孔。第1次融合实验得到1株强阳性细胞株编号为CysC 1H2C7。

2.5.2抗体竞争ELISA法筛选配对孔

1)单抗腹水制备与纯化

选取个体偏大一点的雌性Balb/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡，每只小鼠注射0.5ml。7-21天(优选15天)后腹腔注射0.5-1×10⁶个单抗杂交瘤细胞(CysC 1H2C7)，等小鼠腹部隆起后采集腹水。用GE公司的Protein G预装柱(HiTrap Protein G HP 1ml)亲和纯化腹水中的单抗，具体方法参见纯化柱产品说明书。

2)单抗标记辣根过氧化物酶(HRP)

采用文献报道的过碘酸钠法(郭春祥、郭锡凉.介绍一种简单、快速、高效的辣根过氧化物酶标记抗体的过碘酸钠法.上海免疫学杂志，1983，3(2)：97-100.)将纯化的单克隆抗体(CysC 1H2C7)标记上HRP。具体的步骤例如：称取4mg HRP溶于1ml去离子水中，加0.2ml0.1M过碘酸钠，室温搅拌20分钟，加0.2ml 0.2M乙二醇，继续搅拌30分钟，加8mg上述纯化抗体，混匀，装入透析袋，室温下在0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液中透析4小时，加0.1ml4mg/ml硼氢化钠，2-8℃静置2小时，用磷酸盐缓冲液(PBS)透析过夜即可使用。最后得到的酶标记单抗定为CysC 1H2C7-HRP。

3)抗体竞争ELISA法

第2次融合(本发明中所有的细胞融合实验方法均一样，即按“2.4单克隆抗体细胞融合实验”方法进行细胞融合)实验的细胞培养8-14天后，采用抗体竞争ELISA法对培养上清进行测定。例如，用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液将CysC抗原稀释到0.1-10ug/ml(优选1ug/ml)，每孔100ul加到酶标板中，4℃冰箱放置过夜，使抗原吸附到酶标板中，用PBS-T洗涤酶标板1次，洗掉未与酶标板结合的抗原，完成抗原包被。

在酶标板中加入第2次细胞融合实验得到的杂交瘤培养上清50ul，同时设立4-8个对照孔(每孔加50ul PBS-T)，然后再将酶标记单抗CysC 1H2C7-HRP用PBS-T做1∶5000-10000(优选1∶5000)稀释，每孔加50ul到酶标板中，37℃温育30分钟，用PBS-T洗板2次。每孔加入100ul底物进行显色，用2M硫酸终止反应后，测量450nm下的吸光值。计算竞争抑制率：抑制率＝[1-OD_上清孔/OD_对照孔]×100％。选取无抑制的孔作为配对单抗。第2次融合实验得到1株抑制率为-5％(无抑制)且为强阳性细胞株，该细胞株即为CysC 1H2C7的配对单抗细胞株，我们将其编为CysC 2B9。

2.6单克隆抗体的克隆化

筛选到的阳性孔应该及时进行克隆化，克隆化方法可以参考单克隆抗体制备方法相关的书籍，如《单克隆抗体技术手册》(南京大学出版社，1991)，周宗安(等译)，一般采用有限稀释法和软琼脂法。单抗制备过程中要进行多次克隆化，直到出现100％阳性孔。

2.7单克隆抗体夹心ELISA测试

用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液将第2次融合实验筛选到的单抗CysC 2B9，稀释到1-10ug/ml(优选4ug/ml)，每孔100ul加到酶标板中，4℃冰箱放置过夜，使抗原吸附到酶标板中，用吐温-20磷酸盐缓冲液(PBS-T)洗涤酶标板1次，洗掉未与酶标板结合的抗原，完成单抗CysC 2B9包被。

将CysC高值校准品(北京利德曼生化股份有限公司，浓度8mg/L，1ml/支)先用PBS-T作1/100稀释，然后再做1/2系列稀释并设立1孔稀释液对照，共设6个浓度，分别为8ug/dl、4ug/dl、2ug/dl、1ug/dl、0.5ug/dl和0ug/dl(微克每分升)，稀释好的校准品按每孔100ul加到包被好的酶标板，37℃温育30分钟，用PBS-T洗板2次。用PBS-T将酶标记单抗CysC 1C7-HRP做1∶5000-10000(优选1∶5000)稀释，每孔100ul加到酶标板，37℃温育30分钟，用PBS-T洗板2次。每孔加入100ul底物进行显色，用2M硫酸终止反应后，测量450nm下的吸光值，用Excel软件绘制曲线图(图3)。

3实验数据和结果

3.1CysC抗原的表达与纯化

本发明在大肠杆菌中成功表达了CysC抗原，用透析复性的方法得到了可溶性的蛋白，纯化蛋白SDS-PAGE电泳显示，蛋白纯度在90％以上，分子量较小，电泳显示的表观分子量在15kD左右，与理论分子量13kD基本相符。(见图2)

3.2配对单抗的筛选结果

在制备CysC配对单抗的过程中我们先后进行了6次融合实验。

前3次是按现有技术方法筛选配对单抗(对照例)：第1次融合得到20株阳性细胞，第2次12株，第3次10株，经过大量的腹水制备、纯化、标记与配对实验，结果均未得到配对的单抗细胞株，前3次实验所得到的42株细胞之间也未找到配对细胞株。

第4-6次融合实验(本发明实施例)，我们采用了本发明所述的抗体竞争ELISA筛选法，用第1次融合得到的强阳性单抗CysC 1H2C7标记上HRP后进行抗体竞争ELISA实验，对第4-6次融合实验的每次98个阳性孔进行第2轮筛选，每次得到了一株与CysC 1H2C7单抗无抑制的细胞株，如CysC 2B9。双抗体夹心ELISA进一步证实CysC 1H2C7与CysC 2B9能够配对。

具体的配对实验统计结果见表2。

表2现有技术与本发明方案筛选CysC配对单抗实验结果比较

3.3双抗夹心ELISA结果

双抗夹心ELISA实验表明，CysC 1H2C7与CysC 2B9能配对，配对建立的双抗夹心ELISA法在检测8ug/dl、4ug/dl、2ug/dl、1ug/dl、0.5ug/dl和0ug/dl等梯度稀释的CysC校准品抗原时线性好，具有较好的应用潜力。(见图3)

实验结论

1、采用本发明的方法可以提高获得CysC抗原的配对单抗的几率，该技术可以应用到其他分子量较小抗原配对单抗的研发工作中。

2、本发明制备的配对单抗CysC 1H2C7与CysC 2B9具有较好的应用潜力，建立的双抗夹心ELISA法在检测8ug/dl、4ug/dl、2ug/dl、1ug/dl、0.5ug/dl和0ug/dl等梯度稀释的CysC校准品抗原时线性好。可以应用到ELISA法、化学发光法或乳胶增强免疫比浊等免疫检测方法中，检测血清中CysC的含量。

序列表

Claims

1.一种制备胱抑素C配对单克隆抗体的方法，其特征在于包括以下步骤：

然后实施第2次小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合；

选取无抑制的孔作为配对单抗。

2.一种如权利要求1的方法，其特征在于：其中胱抑素C采用原核表达纯化的方法制备。