CN105039261B - 百日咳杆菌fha抗原单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及百日咳杆菌FHA抗原的单克隆抗体及其应用，属于生物制品制备领域。本发明的单克隆抗体是由能够稳定分泌百日咳杆菌FHA抗原单抗的杂交瘤细胞株分泌获得，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC No.10589。本发明的单克隆抗体效价高、特异性好，可以应用于百日咳杆菌疫苗生产过程中的质量监测以及成品疫苗中FHA组份含量的酶联免疫检测与制备百日咳杆菌FHA抗原酶联免疫检测试剂或酶联免疫检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品及制备领域，具体涉及百日咳杆菌FHA抗原单克隆抗体及其应用。
背景技术
百日咳是由百日咳杆菌(Bordetella Pertussis)引起的严重急性呼吸道传染病，主要感染5岁以下儿童，对于未免疫或未完成基础免疫程序的儿童，百日咳仍是导致其死亡的主要原因。百日咳是可以通过疫苗预防的传染病，全球自20世纪50-60年代广泛使用全细胞百日咳疫苗(WP)以来，尤其是1974年全球实施扩大免疫规划(EPI)后，百日咳的流行得到有效控制，发病率和死亡率明显下降。但是，接种全细胞百日咳疫苗(WP)可能产生一定的不良反应，比如严重的神经系统并发症等，严重的甚至导致死亡。1981年日本首先研制成功无细胞百日咳疫苗(AP)，含有百日咳毒素和丝状血凝素，替代了百日咳全菌体；其不良反应明显低于WP，目前AP与白喉和破伤风疫苗组成的联合疫苗DTaP已成为许多国家儿童联合免疫的基础。现已通过美国食品药品管理局(FDA)批准的三联DTaP联合疫苗主要有：赛诺菲巴斯德公司(Sanofi Pasteus,SP)的TripediaTM和DaptacelTM，葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline，GSK)的InfanrixTM。
百日咳杆菌的抗原组份主要包含百日咳毒素(Pertussis Toxin，PT)、丝状血清素(Filamentous Hemagglutinin，FHA)、凝集原(Agglutinogen，Agg)2,3和百日咳黏着素(Pertactin，PRN)，在无细胞百日咳疫苗中主要包含上述组分，其中PT和FHA属于主要组份。
目前《中华人民共和国药典》2010年版三部中对于含有无细胞百日咳成分的联合疫苗中有效抗原(FHA等)的鉴别实验，主要是通过酶联免疫吸附实验(ELISA)，而具有高度特异性的FHA单克隆抗体可以大大提高实验的准确性和可靠性；同时药典中对于百日咳抗原含量的测定主要包括蛋白氮含量测定、SDS-PAGE纯度测定以及效价测定。其中，蛋白氮含量测定以及SDS-PAGE法测定不是特异性检测方法，无法特异性区分PT、FHA、PRN，在三种组分混合的百日咳疫苗以及DTaP疫苗中，上述方法无法用于FHA成分的检测，而效价实验步骤复杂、过程较长且需要大量实验动物，不利于疫苗生产过程中对于各个步骤FHA含量的监测，也违背WHO关于减少动物使用量的原则。因此使用高度特异性的FHA单克隆抗体采用ELISA法对于百日咳FHA纯化各个步骤样品以及百日咳类疫苗成品中FHA抗原含量进行检测，将大大提高检测的准确性、特异性和工作效率，降低试验的时间成本和资金成本。目前存在的FHA单抗都是将纯化后抗原免疫小鼠，制备杂交瘤细胞，该方法制备的单抗经过多步纯化过程，蛋白变性后复性等步骤可能导致蛋白空间构象变化，免疫原性遭到部分破坏，致使以其为免疫原制备得到的单抗仅能够识别该空间构象已发生变化的抗原，而无法识别全真抗原(原始抗原)。
发明内容
本发明的目的是突破目前DTaP疫苗生产过程各个步骤以及成品中对于FHA抗原含量检测方法特异性差、检测效率低的缺点，提供一种效价高、均一度高、具有良好特异性、稳定性的低成本的百日咳杆菌FHA抗原单克隆抗体，实现降低成本、提高百日咳疫苗生产过程中质控的准确性和效率的目标。
为了达到上述目的，本发明提供一种百日咳杆菌FHA抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.10589。
所述杂交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCCNo.10589，保藏日期2015年5月4日，分类命名为：百日咳杆菌FHA抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株。
本发明提供了所述杂交瘤细胞株在制备检测百日咳杆菌FHA抗原试剂盒中的应用或在制备检测百日咳杆菌FHA抗体试剂盒中的应用。
本发明还提供了由上述杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。
具体而言，本发明采用小鼠骨髓瘤细胞杂交瘤技术制备抗百日咳杆菌FHA抗原单克隆抗体，步骤如下：
(1)制备百日咳杆菌发酵液。
(2)动物免疫：收集菌体，研磨，然后将研磨后的百日咳杆菌菌体与弗氏佐剂等比例混合并乳化；乳化后0.2μg/只腹腔免疫小鼠。
(3)加强免疫；首次免疫后2周，对小鼠进行2次加强免疫，剂量和佐剂用量同上。免疫后采用间接酶联免疫法检测抗体效价，如果抗体效价大于103，则进行研磨抗原的腹腔冲击，0.2μg/只，否则继续加强免疫。
(4)取腹腔冲击3天后的免疫后小鼠的脾脏，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按1:10～10:1的比例混合，于37℃水浴滴加50％PEG4000进行细胞融合；然后缓慢加入无血清培养基2ml洗涤2次融合后的细胞，再加入完全培养基2ml重悬，将细胞悬液100μl/孔加入到细胞培养板培养，培养后添加HAT培养液2ml。
(5)杂交瘤细胞长到瓶底的50％以上时，ELISA法检测细胞上清中的抗体效价。筛选出特异性针对百日咳杆菌FHA抗原的、高效价的杂交瘤细胞株，扩大培养建库，冻存，并将该杂交瘤细胞株进行生物保藏。
(6)将冻存的工作种子库细胞复苏，培养到细胞覆盖瓶底的50％以上时摇下细胞，计数，腹腔免疫小鼠，制备腹水。
本发明还提供包含上述单克隆抗体的试剂盒。
所述试剂盒中，所述单克隆抗体经生物标记或化学标记。
进一步地，所述单克隆抗体经酶标记。
进一步地，所述单克隆抗体经辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记。
所述试剂盒中，所述单克隆抗体可以不经过生物标记或化学标记，而是通过添加生物标记或化学标记的抗鼠二抗进行试验。
进一步地，所述抗鼠二抗经酶标记。
进一步地，所述抗鼠二抗经辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记。
所述试剂盒中，单克隆抗体可以用于包被。
进一步地，所述试剂盒添加生物标记或化学标记的夹心抗体。
进一步地，所述试剂盒也可以添加夹心抗体后，再加入生物标记或化学标记的抗夹心抗体的二抗。
所述的试剂盒用于百日咳杆菌FHA抗原的检测。
本发明提供了杂交瘤细胞株CGMCC No.10589分泌的单克隆抗体在制备检测百日咳杆菌抗原试剂盒中的应用。
进一步地，所述百日咳杆菌抗原为百日咳杆菌PHA抗原。
本发明提供了杂交瘤细胞株CGMCC No.10589分泌的单克隆抗体在制备检测百日咳杆菌抗体试剂盒中的应用。
进一步地，所述百日咳杆菌抗体为百日咳杆菌PHA抗体。
本发明提供了杂交瘤细胞株CGMCC No.10589分泌的单克隆抗体在制备预防或治疗百日咳杆菌感染药物中的应用。
一种治疗或预防百日咳杆菌感染引起的疾病的药物，其含有本发明所述的单克隆抗体。
保藏编号为CGMCC No.10589的杂交瘤细胞株或其分泌产生的百日咳FHA抗原单克隆抗体在制备百日咳疫苗中的应用。
本发明提供了所述单克隆抗体在百日咳疫苗质量检测中的应用。
本发明还提供所述单克隆抗体在检测百日咳杆菌FHA抗原含量中的应用。
本发明具有以下优点和效果：
1、本发明采用百日咳全菌体作为免疫原进行免疫，保证抗原决定簇的完整性和的高免疫原性，筛选得到了能够稳定分泌特异性针对百日咳杆菌FHA抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
2、本发明的百日咳杆菌FHA抗原单克隆抗体腹水，具有较高的效价，效价高于108，同时具有较好的特异性，可以用于FHA抗原纯化过程中各个工序段含有FHA组分样品中FHA抗原含量的检测，也可用于DTaP疫苗成品以及其他混合成分中的FHA抗原含量的测定。同时，该单抗可以用于灵敏度更高的双抗体夹心ELISA检测方法，检测各种含有FHA抗原的样品中FHA抗原的含量，大大提高疫苗生产过程中质控的特异性和效率，降低实验成本。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用试剂、培养基、菌株、细胞等均为市售商品。
实施例1免疫原制备与动物免疫
(1)采用包姜培养基，发酵百日咳杆菌58003菌株(来源于中国医学细菌保藏管理中心)的菌体。
(2)发酵后，在发酵菌体中加入甲醛溶液至终浓度为0.5％进行杀菌。
(3)4000rpm以上离心10分钟以上，弃掉上清，收集菌体，菌体采用PBS/0.5％甲醛吹悬。
(4)研磨菌体，研磨后用PBS/0.5％甲醛重悬稀释。
(5)将上述重悬菌体与弗氏完全佐剂等体积混合，形成的乳化物于0天、14天、28天免疫BALB/c小鼠，0.2ml/只。
(6)末次免疫后一周采血检测抗体效价，若高于103，在采血1周后采用乳化物0.2μg/只进行腹腔冲击，3天后取小鼠脾脏，进行细胞融合。
实施例2细胞融合
(1)细胞融合前两周复苏培养SP2/0细胞株，融合前3天扩大培养，融合前1天将RPMI 1640细胞培养液(Gibco)去除，重新添加培养液。
(2)小鼠腹腔冲击3天后处死，按照常规方法制备小鼠脾细胞悬液。
(3)根据计数结果将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0分别加入适量不完全IMDM培养液(Gibco)，SP2/0细胞晃动混匀，脾细胞用移液管吹打均匀。
(4)将脾细胞与SP2/0细胞按1:1混合于一支50ml离心管中，混匀。
(5)加不完全IMDM培养液至50ml，离心5分钟，将上清尽量倒净，可用移液枪将管口液体吸净。
(6)轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀，离心管置37℃水浴，准备融合。
(7)将37℃保温的50％的PEG40001ml，用滴管缓慢滴入离心管，边滴边转动离心管，使细胞保存在混匀状态。
(8)静置90s，立即在3分钟内缓慢加入15ml无血清的IMDM培养基(Gibco)(37℃)，尽可能不搅动细胞。
(9)离心5分钟，弃去上清。
(10)加入IMDM完全培养液(Gibco)，轻轻混匀，将混悬液分别加至96孔细胞培养板中，每孔100μl。
(11)将培养板置37℃，5％CO2培养箱内培养。
(12)融合第2天，添加HAT培养液(IMDM中添加1×的HAT)，每孔100μl。
(13)每3天换一次HAT培养液，连续两周观察杂交瘤是否出现，两周后换用HT培养基(IMDM中添加1×的HT)，观察融合细胞的生长状况。
(14)杂交瘤细胞的筛选：脾细胞融合后第七天开始观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清进行抗体ELISA检测。将阳性孔细胞转入24孔板扩大培养，及时做亚克隆。
通过3次的亚克隆得到可以稳定分泌抗体的细胞系，将该杂交瘤细胞株进行保藏，保藏号CGMCC NO.10589；保藏时间：2015年5月4日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，分类命名为百日咳杆菌FHA抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株。
实施例3杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)
(1)杂交瘤细胞计数，用含20％血清的HT培养基稀释杂交瘤细胞。
(2)稀释的杂交瘤细胞加入96孔板培养，每孔100μl。
(3)37℃、5％CO2湿润培养8天，待出现肉眼可见的克隆，及时检测抗体活性。在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。
(4)将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养，然后转移至25或者175细胞瓶扩增。
(5)扩增后尽快冻存细胞株，编号，保存于液氮中。
实施例4单抗细胞株腹水制备与检测
(1)按照常规方法将本发明冻存的杂交瘤细胞进行复苏，培养，镜下观察细胞生长状况，待细胞覆盖25ml的细胞培养瓶瓶底50％以上时即可进行接种；按照常规方法腹腔接种BALB/c雌性小鼠，定期收集腹水。
(2)FHA抗原单抗腹水鉴定：采用间接ELISA法检测抗体的效价和
特异性。结果详见实施例6中表1数据。
实施例5抗体亚型检测
将FHA抗原采用0.01M PBS稀释到3μg/ml，100μl/孔包被酶标板2-8℃过夜，然后采用Sigma公司ISO2-1KT鼠单抗分型试剂按照单抗亚类试剂说明书进行试验，最后加入HRP标记的兔抗羊二抗进行单克隆抗体亚类鉴定。结果显示本发明单抗为IgG(IgG1)型。
实施例6抗体效价检测
将FHA抗原采用0.01M PBS稀释(3μg/ml)后每孔100μl包被酶标板4℃过夜，第二天洗板封闭，然后加入102、103、104、105、106、107、108稀释的FHA单克隆抗体腹水，细胞株编号为FHA-B5，命名为SinoFHA，该株细胞是送往中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏的细胞株；检测腹水的抗体效价，由表1可见，在1：108稀释度下，FHA-B5单抗的OD值高于阴性腹水对照OD值的2.1倍，因此该腹水效价>108结果见表1。
表1抗体效价检测结果
实施例7间接ELISA法抗体特异性检测
分别用PRN抗原3μg/ml和PT抗原3μg/ml包被酶标板过夜，检测本发明FHA单克隆抗体腹水FHA-B5的抗体特异性，试验流程同实施例5。结果表明本发明的FHA-B5单克隆抗体腹水与上述两种抗原均无交叉反应(抗体效价检测均小于102)。本实验酶标二抗使用的是HRP标记羊抗小鼠IgG。结果见表2、3。
表2间接ELISA法抗体特异性检测结果(PRN包被)
表3间接ELISA法抗体特异性检测结果(PT包被)
实施例8抗体亲和力试验
将本发明的杂交瘤细胞株分泌的单抗FHA-B5纯化后检测蛋白质含量，采用0.1至10μg/mlFHA抗原横向包被酶标板，100μl/孔，4℃包被过夜。第二天洗板后封闭2小时，拍干待用。将纯化抗体2倍梯度稀释，纵向加入包被后的酶标板，采用间接ELISA法检测抗原抗体反应的OD值。以各抗原浓度曲线平台期的OD值计为100％，计算50％OD值，考察50％OD值所对应点的单抗浓度[Ab]t，再根据亲和常数计算公式可以得到本发明单抗的亲和常数为3.3×109M-1。
实施例9单克隆细胞株稳定性试验
分别在3个月和6个月后，从液氮中取出冻存的FHA-B5杂交瘤细胞株进行复苏、扩大培养后，制备腹水，进行间接ELISA检测抗体效价，以前期制备的腹水为对照同时进行检测。结果本发明的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体腹水效价达到106以上，与前期腹水效价无差异，表明细胞保藏后制备的腹水的效价未下降。因此单克隆细胞株分泌抗体的活性没有降低，稳定性良好。
实施例10双抗体夹心ELISA法应用
使用纯化后的FHA单抗采用0.05M CB(pH9.6)稀释后作为包被抗体、然后加入FHA抗原参考品，同时将待检测的已知浓度的FHA蛋白标准品采用0.01M PBS稀释至ELISA标准曲线范围以内的高中低三个已知浓度，将参考品和样品每孔100μl加入到包被后的酶标板中。37℃反应60分钟后洗板，然后加入兔抗FHA多抗作，进行双抗体夹心ELISA实验，然后加入羊抗兔HRP(加入抗原反应后也可以加入HRP标记的兔抗FHA多抗)检测已知各个浓度FHA蛋白标准品中的FHA抗原的含量，结果见表4。
表4双抗体夹心ELISA初步结果
由表4可见，双抗加心ELISA检测FHA抗原标准品的回收率均介于80％-120％，满足质量标准的要求，可以用于样品中的百日咳杆菌FHA抗原含量的检测。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.百日咳杆菌FHA抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.10589。
2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。
3.权利要求1所述杂交瘤细胞株在制备检测百日咳杆菌FHA抗原试剂盒中的应用。
4.含有权利要求2所述单克隆抗体的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体经生物标记或化学标记。
6.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测百日咳杆菌FHA抗原试剂盒中的应用。
7.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测百日咳杆菌FHA抗体试剂盒中的应用。
8.权利要求2所述的单克隆抗体在制备预防或治疗百日咳杆菌感染药物中的应用。
9.一种治疗或预防百日咳杆菌感染引起的疾病的药物，其特征在于，含有权利要求2所述的单克隆抗体。
10.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体在制备百日咳疫苗中的应用。
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