CN108395476A - 胃蛋白酶原i配对单克隆抗体的制备方法 - Google Patents

胃蛋白酶原i配对单克隆抗体的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108395476A
CN108395476A CN201810050247.2A CN201810050247A CN108395476A CN 108395476 A CN108395476 A CN 108395476A CN 201810050247 A CN201810050247 A CN 201810050247A CN 108395476 A CN108395476 A CN 108395476A
Authority
CN
China
Prior art keywords
monoclonal antibody
antibody
pepsinogen
mouse
cell strain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810050247.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108395476B (zh
Inventor
张晓杰
熊宁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Leadman Biochemistry Co ltd
Original Assignee
Beijing Leadman Biochemistry Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Leadman Biochemistry Co ltd filed Critical Beijing Leadman Biochemistry Co ltd
Priority to CN201810050247.2A priority Critical patent/CN108395476B/zh
Publication of CN108395476A publication Critical patent/CN108395476A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108395476B publication Critical patent/CN108395476B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种胃蛋白酶原I配对单克隆抗体的制备方法。本发明所述胃蛋白酶原I配对单克隆抗体的制备方法，包括：(1)将胃蛋白酶原I蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠，选取血清抗体效价高的免疫小鼠进行细胞融合，筛选高效价的阳性细胞株，制备腹水，纯化得到单克隆抗体；(2)将胃蛋白酶原I蛋白与步骤(1)得到的单克隆抗体混合制备抗原‑单抗免疫复合物免疫BALB/c小鼠，选取血清抗体效价高的小鼠进行细胞融合，筛选与步骤(1)所述单克隆抗体之间没有竞争抑制作用的阳性细胞株，纯化所分泌的单克隆抗体，即得到与步骤(1)所述单克隆抗体配对的单克隆抗体。本发明方法有效提高了获得胃蛋白酶原I抗原的配对单抗的几率。

Description

胃蛋白酶原I配对单克隆抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及一种胃蛋白酶原(PG)I配对单克隆抗体的制备方法，本发明还涉及所述方法制备得到的胃蛋白酶原I的配对单克隆抗体及其杂交瘤细胞株，属于胃蛋白酶原I配对单克隆抗体的制备领域。
背景技术
胃蛋白酶原(PG)是胃蛋白酶的前体，根据其生化性质和免疫原性将其分成2个亚群，1-5组分的免疫原性相同，称为胃蛋白酶原I，主要由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌；组分6和7被称为胃蛋白酶原II，除由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌外，贲门腺和胃窦的幽门腺的黏液颈细胞以及十二指肠上段也能产生胃蛋白酶原II。
血清PG水平反映了不同部位胃粘膜的形态和功能：PG I是检测胃泌酸腺细胞功能的指针，胃酸分泌增多PG I升高，分泌减少或胃粘膜腺体萎缩PG I降低；PG II与胃底粘膜病变的相关性较大(相对于胃窦粘膜)，其升高与胃底腺管萎缩、胃上皮化生或假幽门腺化生、异型增值有关；PG I/II比值进行性降低与胃粘膜萎缩进展相关。因此，联合测定PG I和PG II比值可起到胃底腺粘膜“血清学活检”的作用。
胃蛋白酶原Ⅰ/Ⅱ检测试剂盒用于检测血清或者血浆中的胃蛋白酶原Ⅰ/Ⅱ的含量，具有简便、快速的优势，避免了X-射线对人体的侵害和胃镜的不便。
PG I免疫检测试剂盒开发的难点在于寻找合适的配对抗体，PG I单抗的初期研究显示，采用传统免疫与筛选方法获得PG I配对单抗的概率低。传统单抗制备方法首先获得尽可能多的单抗细胞株，分别制备纯化的PG I单抗，进行标记，然后通过双抗体夹心ELISA法从中筛选配对的单抗。这种方法工作量大，筛选范围相对较窄。因此，建立一种与传统方法不同的PG I配对单抗制备方法，提高获得PG I配对单抗的几率，具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种胃蛋白酶原I配对单克隆抗体的制备方法，该方法通过两次细胞融合实验筛选配对单抗；
本发明的目的之二是提供所述方法制备得到的胃蛋白酶原I的配对单克隆抗体及其杂交瘤细胞株，以及它们在制备PG I定量检测试剂盒中的应用。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明首先公开了一种胃蛋白酶原I配对单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将胃蛋白酶原I蛋白(PG I)作为抗原，免疫BALB/c小鼠，选取血清抗体效价高的免疫小鼠进行细胞融合，筛选一株高效价的阳性细胞株，制备腹水，纯化，得到单克隆抗体；
(2)将胃蛋白酶原I蛋白与步骤(1)得到的单克隆抗体混合制备抗原-单抗免疫复合物作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，选取血清抗体效价高的免疫小鼠进行细胞融合，筛选与步骤(1)得到的单克隆抗体之间没有竞争抑制作用的阳性细胞株，纯化所述阳性细胞株分泌的单克隆抗体，即得到与步骤(1)所述单克隆抗体配对的单克隆抗体。
其中，本发明所述胃蛋白酶原I蛋白(PG I)，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。本发明用酵母表达并纯化的胃蛋白酶原I蛋白进行免疫。
步骤(1)将胃蛋白酶原I蛋白采用常规方法免疫BALB/c小鼠，共进行3-5次免疫，首次免疫用抗原与弗氏完全佐剂乳化后免疫，后几次加强免疫用抗原与弗氏不完全佐剂乳化后进行免疫；每两次免疫之间间隔14-35天，优选为21天；第3次免疫后7-14天用不加佐剂的抗原进行一次冲击免疫。其中，第1-3次免疫的免疫剂量依次为50ug/只、25ug/只和12ug/只，冲击免疫的免疫剂量为80ug/只。作为参考，具体的免疫方案见表1。本发明将OD值为阴性对照两倍以上时抗体的最高稀释倍数定为该抗体的效价；血清效价达到10-5以上即可选取效价较高的小鼠进行细胞融合实验。
步骤(1)所述细胞融合是将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合；其中所述骨髓瘤细胞优选为SP2/0。细胞融合方法为本领域技术人员所熟知。
步骤(1)所述筛选是通过间接ELISA筛选与PG I具有特异性结合的阳性细胞株。所述间接ELISA以PG I抗原包被酶标板，以羊抗鼠-HRP为酶标二抗。步骤(1)选取一株高效价的阳性细胞株进行小鼠腹水的制备，经小鼠腹水纯化后获得的单克隆抗体用于步骤(2)的免疫。所述腹水的制备为将阳性细胞株注入小鼠腹腔中，阳性细胞株在小鼠腹腔中繁殖，大量分泌抗人PG I抗体，收集腹水，即得。
步骤(2)所述免疫BALB/c小鼠，共进行3-5次免疫，首次免疫用弗氏完全佐剂乳化后免疫，后几次加强免疫用弗氏不完全佐剂乳化后进行免疫；每两次免疫之间间隔14-35天，优选为21天；第3次免疫后7-14天用不加佐剂的抗原进行一次冲击免疫。其中，第1-3次免疫的免疫剂量依次为50ug/只、25ug/只和12ug/只，冲击免疫的免疫剂量为80ug/只。作为参考，具体的免疫方案见表2。
步骤(2)按质量比计，所述抗原-单抗免疫复合物中，胃蛋白酶原I蛋白：步骤(1)得到的单克隆抗体＝1：2。
步骤(2)所述细胞融合的方法与步骤(1)所述细胞融合的方法相同。步骤(2)采用间接ELISA法筛选阳性细胞株，然后对所述阳性细胞株通过胃蛋白酶原I抗体竞争ELISA法筛选与步骤(1)得到的单克隆抗体之间没有竞争抑制作用的阳性细胞株；其中，所述胃蛋白酶原I抗体竞争ELISA法，将胃蛋白酶原I抗原包被酶标板，采用辣根过氧化物酶(HRP) 标记的步骤(1)所述单克隆抗体为酶标记单抗，进行抗体竞争ELISA(具体方法请参见中国发明专利CN 102321176A)。本发明对细胞融合实验得到的所有阳性细胞株进行筛选，筛选范围达到极限，大大提高了获得配对细胞的几率。
本发明步骤(1)或步骤(2)单克隆抗体的纯化可以通过本领域常用的辛酸-硫酸铵沉淀法、Protein G亲和层析法或免疫球蛋白的其他纯化方法。
本发明通过两次细胞融合实验筛选配对单抗。第1次融合将PG I抗原采用常规免疫得到的高效价小鼠，经过细胞融合与亚克隆筛选，筛选出1株强阳性高表达细胞株，制备腹水，纯化出单抗；第2次融合采用PG I抗原和第1次融合得到的PG I单抗混合制备抗原-单抗免疫复合物免疫小鼠，免疫复合物中抗原的形态与游离的抗原存在差异，暴露出来的表位能很好的模拟两种单抗夹心结合抗原(双抗夹心法)时抗原的真实结构，经免疫复合物免疫后，小鼠脾细胞库中分泌配对抗体的细胞数量会得到富集，从而大大提高获得与第1次融合所获细胞配对单抗细胞的几率。另外，在融合板筛选时本发明采用竞争法进行筛选，筛选对象是一次融合实验的所有阳性孔，筛选范围达到极限，再次提高了获得配对细胞的几率。
本发明进一步公开了所述制备方法制备得到的步骤(1)所述单克隆抗体PG I7A4。
本发明还公开了一株分泌所述单克隆抗体PG I 7A4的杂交瘤细胞株。
本发明将分泌所述单克隆抗体PG I 7A4的杂交瘤细胞株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.15282；分类命名为：胃蛋白酶原I单克隆抗体杂交瘤细胞株。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2018年1月04日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明进一步公开了所述制备方法制备得到的与步骤(1)所述单克隆抗体配对的单克隆抗体PG I-4F4。
本发明还公开了一株分泌所述单克隆抗体PG I-4F4的杂交瘤细胞株。
本发明将分泌所述单克隆抗体PG I-4F4的杂交瘤细胞株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.15281；分类命名为：胃蛋白酶原I单克隆抗体杂交瘤细胞株。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2018年1月04日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明通过双抗体夹心ELISA证实，单克隆抗体PG I-7A4与PG I-4F4能够配对。
本发明进一步公开了所述单克隆抗体PG I 7A4或单克隆抗体PG I-4F4在制备胃蛋白酶原I定量检测试剂盒中的应用。所述试剂盒能够用于检测血清或者血浆中的胃蛋白酶原Ⅰ的含量。
本发明还公开了分泌所述单克隆抗体PG I 7A4的杂交瘤细胞株或分泌所述单克隆抗体PG I-4F4的杂交瘤细胞株在制备胃蛋白酶原I定量检测试剂盒中的应用。
本发明还公开了一种用于胃蛋白酶原I含量检测的双抗夹心ELISA试剂盒，包括：包被包被抗体的固相载体、检测抗体、洗涤液、底物溶液和终止液；其中，所述检测抗体为辣根过氧化物酶标记的所述单克隆抗体PG I 7A4，所述包被抗体为所述的单克隆抗体PG I-4F4。
本发明制备的配对克隆抗体PG I-4F4与PG I-7A4所建立的双抗夹心ELISA法，在检测10000ng/ml、3333.3ng/ml、1111.1ng/ml、370.4ng/ml、123.5ng/ml、41.2ng/ml、13.7ng/ml以及0ng/ml等梯度稀释的PG I校准品抗原时线性好，可以应用到ELISA法、化学发光法或乳胶增强免疫比浊等免疫检测方法中，检测血清中PG I的含量，具有较好的应用潜力。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明建立了一种与传统方法不同的PG I配对单抗制备方法，通过两次细胞融合实验筛选配对单抗，第1次融合选取常规抗原免疫获得的高效价小鼠进行细胞融合，筛选强阳性高表达细胞株制备腹水，纯化获得的单克隆抗体用于后期的免疫工作；第2次融合，将第1次融合得到的单克隆抗体与PG I抗原混合制备抗原-单抗免疫复合物作为免疫原免疫小鼠，选取血清高效价小鼠进行细胞融合，采用间接ELISA法和PG I抗体竞争ELISA法筛选与第1次融合得到的单抗之间没有竞争抑制作用的阳性细胞株，这类阳性细胞株分泌的抗体就能与免疫复合物中的单抗进行配对。本发明方法在减轻工作量的前提下，有效扩大了筛选范围，提高了获得PG I抗原的配对单抗的几率，可以应用到其他抗原配对单抗的研发中。
附图说明
图1为双抗夹心ELISA实验结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细描述。
应当明确，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1PG I配对单克隆抗体的制备方法
1、实验材料
SP 2/0购自上海生化所细胞中心并由本公司研发部保存；
Balb/c小鼠购自上海维通利华实验动物中心；
胎牛血清：杭州四季青公司产品；
DMEM、HAT和HT：均为Invitrogen公司产品；
50％PEG1450溶液：为Sigma公司产品；
其他药品均为分析纯等级。
2、实验方法
2.1Balb/c小鼠的免疫
选取4-6只6-8周龄雌性Balb/c小鼠，用酵母表达的PG I抗原进行免疫。
PG I氨基酸序列(NP_001073276)为SEQ ID No.1所示。
(1)第一次融合免疫小鼠：用酵母表达并纯化的PG I蛋白免疫BALB/c小鼠，共进行3-5次免疫，首次免疫用抗原与弗氏完全佐剂乳化后免疫，后几次加强免疫用抗原与弗氏不完全佐剂乳化后进行免疫。每两次免疫之间间隔14-35天(优选21天)，第3次免疫后7-14天用不加佐剂的抗原进行一次冲击免疫。具体的免疫方案见表1。
表1第一次融合小鼠免疫程序与方法
(2)第二次融合免疫小鼠：用酵母表达并纯化的PG I蛋白和第一次融合得到的单抗7A4共同免疫BALB/c小鼠，1：2的比例进行3-5次免疫，首次免疫用弗氏完全佐剂乳化后免疫，后几次加强免疫用弗氏不完全佐剂乳化后进行免疫。每两次免疫之间间隔14-35天(优选21天)，第3次免疫后7-14天用不加佐剂的抗原进行一次冲击免疫。具体的免疫方案见表2。
表2第二次融合小鼠免疫程序与方法
2.2小鼠血清抗体效价检测
采用间接ELISA对免疫小鼠血清效价进行测定，用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液将PGI抗原稀释到1ug/ml，每孔100ul加到酶标板中，4℃冰箱放置过夜，使抗原吸附到酶标板中，用吐温-20磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤酶标板1次，洗掉未与酶标板结合的抗原，完成抗原包被。将采集到的小鼠血清从1/300开始用PBST作1/3系列稀释并设立1孔稀释液对照，共做8孔，将稀释好的抗血清按每孔100ul加到包被好的酶标板，37℃温育60分钟，用PBST洗板1次。用PBST将羊抗小鼠-HRP稀释至说明书提供的工作浓度，每孔100ul加到酶标板，37℃温育30分钟，用PBST洗板3次。每孔加入100ul过氧化氢脲-四甲基联苯胺底物(H2O2-TMB)作为底物进行显色，用浓硫酸终止反应后，测量450nm下的吸光值。本发明将OD值为阴性对照两倍以上时抗体的最高稀释倍数定为该抗体的效价。血清效价达到10-5以上即可选取效价较高的小鼠进行细胞融合实验。
2.3单克隆抗体细胞融合与筛选
1)骨髓瘤细胞的准备：在细胞融合前7天复苏骨髓瘤细胞SP2/0，保证细胞在融合时正处于对数生长期，活力最好。
2)细胞融合：冲击免疫后3天进行融合。在融合前一天，取6-8周龄的BALB/c小鼠拉颈处死，无菌操作取腹腔巨噬细胞作为饲养细胞铺6块96孔培养板。一天后，取免疫小鼠的脾脏获得脾细胞，并收集体外培养骨髓瘤细胞，骨髓瘤细胞优选SP2/0。用DMEM基础培养基洗涤细胞2-3次，将脾细胞与瘤细胞按5-10:1的比例混合，再离心洗涤一次，去上清，充分分散沉淀物，向沉淀物中加入0.8-1.2ml 50％的PEG1450，边加边轻轻搅拌，45秒内加完，将混合细胞轻轻吸入吸管，再缓缓滴入离心管中，待细胞全部滴完后，用DMEM培养基终止PEG的作用。离心弃上清后细胞用合适体积的HAT培养基重悬，将融合细胞按100u1/孔加入至铺好饲养细胞的96孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO2浓度的二氧化碳培养箱中进行培养。从第6-7天，每孔补加一滴HT培养基。
3)阳性细胞株筛选：本发明用间接ELISA实验，筛选与PG I具有特异性结合的杂交瘤细胞株。
间接ELISA的具体步骤为：1.包被酶标板：用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液将抗原稀释至1ug/ml，每孔100ul加到96孔酶标板中，4℃过夜包被酶标板，用0.15M pH7.4含0.05％吐温-20磷酸盐缓冲液(PBST)洗板1次。2.加培养上清样品：每个培养孔80ul，加到包被孔中，37℃温育60分钟，用PBST洗板1次。3.加酶标二抗：每孔加入1:5000稀释的羊抗鼠-HRP100ul，37℃温育30分钟，用PBST洗板3次。4.加底物显色：每孔加入H2O2-TMB底物，避光显色5分钟，每孔加50ul 2M硫酸终止反应，于酶标仪中测定450nm的吸光值。对ELISA检测呈阳性的培养孔，补液培养两天后，进行复检。
4)克隆化与保存：选择吸光值高的阳性细胞株，采用公知的有限稀释法进行克隆，共进行3次克隆，第3次克隆后培养孔阳性率为100％，共获得15株杂交瘤细胞，将单克隆的杂交瘤细胞从96孔培养板转到24孔板中进行扩大培养，等快长满孔底时，吸尽培养基，每孔加0.5-1ml细胞冻存液重悬细胞，采用公知的梯度降温法冻存细胞，细胞分别冻存在-80℃冰箱或液氮中。
第二次细胞融合与第一次细胞融合筛选的不同之处在于，采用间接ELISA法筛选出阳性细胞，之后对这些阳性细胞株通过PG I抗体竞争ELISA法(请参见中国发明专利CN102321176A)筛选，筛选出与抗体7A4配对的抗体。
2.4抗体竞争ELISA法筛选配对孔
1)单抗腹水制备与纯化
用常规培养液培养上述的杂交瘤细胞，可生产单克隆抗体。培养基可以是体积比为5％-10％胎牛血清的DMEM或RPMI-1640培养液，CO2浓度为5％，培养至培养基由红色变为黄色，取培养上清，采用离心的方法去除细胞与细胞碎片，用0.45um或0.22um孔径的微孔滤膜对离心后的上清进行过滤，滤液即为抗人PG I的单克隆抗体。也可以采用同系小鼠体内诱生法大量生产单克隆抗体，将一定杂交瘤细胞注入小鼠腹腔中，在注射前两周，将0.5ml石蜡油注射入小鼠腹腔。这样杂交瘤细胞就在小鼠腹腔中繁殖，大量分泌抗人PG I抗体，1-2周后一次或多次收集腹水，离心除去固体成分，其上清液即含有抗人PG I的单克隆抗体。通过辛酸-硫酸铵沉淀法、Protein G亲和层析法或免疫球蛋白的其他纯化方法进一步纯化抗人PG I的单克隆抗体。
2)单抗标记辣根过氧化物酶(HRP)
采用文献报道的过碘酸钠法将纯化的单克隆抗体标记上HRP。具体的步骤：称取4mg HRP溶于1ml去离子水中，加0.2ml 0.1M过碘酸钠，室温搅拌20分钟，加0.2ml 0.2M乙二醇，继续搅拌30分钟，加8mg纯化抗体，混匀，装入透析袋，室温下在0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液中透析4小时，加0.1ml 4mg/ml硼氢化钠，2-8℃静置2小时，用PBS透析过夜即可使用。
3)抗体竞争ELISA法操作步骤
(1)包被：PGI抗原1ug/ml，4℃孵育16h。PBST洗板1次，晾干备用。
(2)加一抗：将细胞培养上清50ul和标记的单抗7A4-HRP 50ul共同孵育于包被的板子上，37℃孵育0.5h后，PBST洗板3次。
(3)显色：TMB底物显色，100ul/孔，显色5min
(4)终止反应读数：每孔加入50ul 2M硫酸终止显色反应，OD450nm读数。
2.5配对单抗的筛选结果
在制备PG I配对单抗的过程中，本发明先后进行了4次融合实验，前3次是按现有方法筛选配对单抗：第1次融合得到12株阳性细胞，第2次11株，第3次13株，经过大量的腹水制备、纯化、标记与配对实验，结果均未得到配对的单抗细胞株，前3次实验所得到的36株细胞之间也未找到配对细胞株。第4次融合实验，本发明采用了所述的抗体竞争ELISA筛选法，用第1次融合得到的强阳性单抗PG I 7A4标记上HRP后进行抗体竞争ELISA实验，对第4次融合实验的48个阳性孔进行第2轮筛选，得到了一株与PG I-7A4单抗无抑制的细胞株PG I-4F4。双抗体夹心ELISA进一步证实PG I-7A4与PG I-4F4能够配对。具体的配对实验统计结果见表3。
表3现有方案与本发明方案筛选PG I配对单抗实验结果比较
2.6单克隆抗体夹心ELISA
用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液将单抗PG I-4F4稀释到1-10ug/ml(优选5ug/ml)，每孔100ul加到酶标板中，4℃冰箱放置过夜，使抗体吸附到酶标板中，用吐温-20磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤酶标板1次，洗掉未与酶标板结合的抗体，完成抗体包被。将PG I校准品(酵母表达)用PBST作1/3系列稀释并设立1孔稀释液对照，共设8个浓度，分别为10000ng/ml，3333.3ng/ml，1111.1ng/ml，370.4ng/ml，123.5ng/ml，41.2ng/ml，13.7ng/ml，0ng/ml；
将稀释好的校准品按每孔100ul加到包被好的酶标板，37℃温育30分钟，用PBST洗板1次。用PBST将酶标记单抗PG I 7A4-HRP稀释工作浓度，每孔100ul加到酶标板，37℃温育30分钟，用PBST洗板2次。每孔加入100ul过氧化氢脲-四甲基联苯胺底物(H2O2-TMB)作为底物进行显色，用硫酸终止反应后，测量450nm下的吸光值，用Excel软件绘制曲线图。
双抗夹心ELISA实验表明，PG I-4F4与PG I-7A4能配对，配对建立的双抗夹心ELISA法在检测10000ng/ml，3333.3ng/ml，1111.1ng/ml，370.4ng/ml，123.5ng/ml，41.2ng/ml，13.7ng/ml，0ng/ml l等梯度稀释的PG I校准品抗原时线性好(图1)，具有较好的应用潜力。
本发明将分泌所述单克隆抗体PG I 7A4的杂交瘤细胞株提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.15282。本发明将分泌所述单克隆抗体PG I-4F4的杂交瘤细胞株提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.15281。
2.7本发明技术与现有技术的比较
本发明通过两次细胞融合实验筛选配对单抗：第1次融合实验筛选1-2株阳性细胞株，制备腹水，纯化出单抗，选1株进行辣根过氧化物酶(HRP)标记；第2次融合在免疫实验时，采用抗原加上第一次融合得到的单抗共同作为免疫原来免疫小鼠，选取一只血清高效价小鼠进行细胞融合，通过间接ELISA法和PG I抗体竞争ELISA法进行筛选，筛选与第1次融合得到的单抗之间没有竞争抑制作用的阳性细胞株(1-2株)，这样的细胞株就是与先获得的细胞株配对的单抗细胞株。该方法筛选对象是1次融合实验的所有阳性孔，筛选范围达到极限，大大提高了获得配对细胞的几率。
本发明技术与现有技术相比的具体优势见表4。
表4本发明技术与现有技术的比较
由表4可知，本发明技术在减轻工作量的前提下有效扩大了筛选范围，使获得配对细胞株的几率得到提高。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京利德曼生化股份有限公司
<120> 胃蛋白酶原I配对单克隆抗体的制备方法
<130> 20171116
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 326
<212> PRT
<213> artifical sequence
<400> 1
Val Asp Glu Gln Pro Leu Glu Asn Tyr Leu Asp Met Glu Tyr Phe Gly
1 5 10 15
Thr Ile Gly Ile Gly Thr Pro Ala Gln Asp Phe Thr Val Val Phe Asp
20 25 30
Thr Gly Ser Ser Asn Leu Trp Val Pro Ser Val Tyr Cys Ser Ser Leu
35 40 45
Ala Cys Thr Asn His Asn Arg Phe Asn Pro Glu Asp Ser Ser Thr Tyr
50 55 60
Gln Ser Thr Ser Glu Thr Val Ser Ile Thr Tyr Gly Thr Gly Ser Met
65 70 75 80
Thr Gly Ile Leu Gly Tyr Asp Thr Val Gln Val Gly Gly Ile Ser Asp
85 90 95
Thr Asn Gln Ile Phe Gly Leu Ser Glu Thr Glu Pro Gly Ser Phe Leu
100 105 110
Tyr Tyr Ala Pro Phe Asp Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Pro Ser Ile
115 120 125
Ser Ser Ser Gly Ala Thr Pro Val Phe Asp Asn Ile Trp Asn Gln Gly
130 135 140
Leu Val Ser Gln Asp Leu Phe Ser Val Tyr Leu Ser Ala Asp Asp Gln
145 150 155 160
Ser Gly Ser Val Val Ile Phe Gly Gly Ile Asp Ser Ser Tyr Tyr Thr
165 170 175
Gly Ser Leu Asn Trp Val Pro Val Thr Val Glu Gly Tyr Trp Gln Ile
180 185 190
Thr Val Asp Ser Ile Thr Met Asn Gly Glu Ala Ile Ala Cys Ala Glu
195 200 205
Gly Cys Gln Ala Ile Val Asp Thr Gly Thr Ser Leu Leu Thr Gly Pro
210 215 220
Thr Ser Pro Ile Ala Asn Ile Gln Ser Asp Ile Gly Ala Ser Glu Asn
225 230 235 240
Ser Asp Gly Asp Met Val Val Ser Cys Ser Ala Ile Ser Ser Leu Pro
245 250 255
Asp Ile Val Phe Thr Ile Asn Gly Val Gln Tyr Pro Val Pro Pro Ser
260 265 270
Ala Tyr Ile Leu Gln Ser Glu Gly Ser Cys Ile Ser Gly Phe Gln Gly
275 280 285
Met Asn Leu Pro Thr Glu Ser Gly Glu Leu Trp Ile Leu Gly Asp Val
290 295 300
Phe Ile Arg Gln Tyr Phe Thr Val Phe Asp Arg Ala Asn Asn Gln Val
305 310 315 320
Gly Leu Ala Pro Val Ala
325

Claims (10)

1.一种胃蛋白酶原I配对单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将胃蛋白酶原I蛋白作为抗原，免疫BALB/c小鼠，选取血清抗体效价高的免疫小鼠进行细胞融合，筛选一株高效价的阳性细胞株，制备腹水，纯化，得到单克隆抗体；
(2)将胃蛋白酶原I蛋白与步骤(1)得到的单克隆抗体混合制备抗原-单抗免疫复合物作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，选取血清抗体效价高的免疫小鼠进行细胞融合，筛选与步骤(1)得到的单克隆抗体之间没有竞争抑制作用的阳性细胞株，纯化所述阳性细胞株分泌的单克隆抗体，即得到与步骤(1)所述单克隆抗体配对的单克隆抗体。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)或步骤(2)所述免疫BALB/c小鼠为进行3-5次免疫；
步骤(1)或步骤(2)所述细胞融合是将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合；其中所述骨髓瘤细胞优选为骨髓瘤细胞SP2/0。
3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)按质量比计，所述抗原-单抗免疫复合物中，胃蛋白酶原I蛋白：步骤(1)得到的单克隆抗体＝1：2。
4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)采用间接ELISA法筛选阳性细胞株，然后对所述阳性细胞株通过胃蛋白酶原I抗体竞争ELISA法筛选与步骤(1)得到的单克隆抗体之间没有竞争抑制作用的阳性细胞株；
其中，所述胃蛋白酶原I抗体竞争ELISA法采用辣根过氧化物酶标记的步骤(1)所述单克隆抗体作为酶标记单抗。
5.权利要求1所述制备方法制备得到的单克隆抗体，其特征在于：步骤(1)得到的单克隆抗体为单克隆抗体PG I 7A4；
步骤(2)得到的与步骤(1)所述单克隆抗体配对的单克隆抗体为单克隆抗体PG I-4F4。
6.一株分泌权利要求5所述单克隆抗体PG I 7A4的杂交瘤细胞株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No.15282。
7.一株分泌权利要求5所述单克隆抗体PG I-4F4的杂交瘤细胞株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No.15281。
8.权利要求5所述的单克隆抗体在制备胃蛋白酶原I定量检测试剂盒中的应用。
9.权利要求6或7所述的杂交瘤细胞株在制备胃蛋白酶原I定量检测试剂盒中的应用。
10.一种用于胃蛋白酶原I含量检测的双抗夹心ELISA试剂盒，包括：包被包被抗体的固相载体、检测抗体、洗涤液、底物溶液和终止液；其特征在于：所述检测抗体为辣根过氧化物酶标记的权利要求5所述单克隆抗体PG I 7A4，所述包被抗体为权利要求5所述的单克隆抗体PG I-4F4。
CN201810050247.2A 2018-01-18 2018-01-18 胃蛋白酶原i配对单克隆抗体的制备方法 Active CN108395476B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810050247.2A CN108395476B (zh) 2018-01-18 2018-01-18 胃蛋白酶原i配对单克隆抗体的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810050247.2A CN108395476B (zh) 2018-01-18 2018-01-18 胃蛋白酶原i配对单克隆抗体的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108395476A true CN108395476A (zh) 2018-08-14
CN108395476B CN108395476B (zh) 2021-06-15

Family

ID=63094787

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810050247.2A Active CN108395476B (zh) 2018-01-18 2018-01-18 胃蛋白酶原i配对单克隆抗体的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108395476B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113121693A (zh) * 2019-12-30 2021-07-16 东莞市朋志生物科技有限公司 具有与hpg i结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白及引物组合物、制备方法和应用
CN113121694A (zh) * 2019-12-30 2021-07-16 东莞市朋志生物科技有限公司 具有与hpg i结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白及其制备方法和应用
CN114591436A (zh) * 2020-12-07 2022-06-07 生物岛实验室 胃蛋白酶原i的特异性抗体及其制备方法与应用
CN114835815A (zh) * 2022-06-07 2022-08-02 宁波赛珀生物技术有限公司 一种抗胃蛋白酶原i的单克隆抗体及其制备方法和应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004025248A2 (en) * 2002-09-11 2004-03-25 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Antibody pair screening methods
CN1825117A (zh) * 2006-01-28 2006-08-30 中国人民解放军第四军医大学 标签蛋白或含标签的融合蛋白的定量检测方法
US20090269345A1 (en) * 2005-12-23 2009-10-29 Rong Fan CLN248 Antibody Compositions and Methods of Use
CN102087279A (zh) * 2010-03-11 2011-06-08 北京美康生物技术研究中心 一种联合诊断胃病或评价胃癌风险的酶联免疫吸附试剂盒
CN102321176A (zh) * 2011-08-31 2012-01-18 北京利德曼生化股份有限公司 一种制备胱抑素c配对单克隆抗体的方法
CN103995127A (zh) * 2013-10-16 2014-08-20 无锡宜偌维盛生物技术有限公司 一种pgi和pgii联合检测试剂盒
CN104020289A (zh) * 2014-06-23 2014-09-03 宁波艾科生物科技有限公司 一种筛选抗原不同结合位点的单克隆抗体的方法
CN107022527A (zh) * 2017-03-24 2017-08-08 菲鹏生物股份有限公司 可分泌抗c反应蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞、c反应蛋白检测试剂及其制备方法和应用
CN107267465A (zh) * 2017-07-13 2017-10-20 江南大学 一株降钙素原单克隆抗体杂交瘤细胞株cs12‑1及其应用

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004025248A2 (en) * 2002-09-11 2004-03-25 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Antibody pair screening methods
AU2003259861A8 (en) * 2002-09-11 2004-04-30 Kimberly Clark Co Antibody pair screening methods
US20090269345A1 (en) * 2005-12-23 2009-10-29 Rong Fan CLN248 Antibody Compositions and Methods of Use
CN1825117A (zh) * 2006-01-28 2006-08-30 中国人民解放军第四军医大学 标签蛋白或含标签的融合蛋白的定量检测方法
CN102087279A (zh) * 2010-03-11 2011-06-08 北京美康生物技术研究中心 一种联合诊断胃病或评价胃癌风险的酶联免疫吸附试剂盒
CN102321176A (zh) * 2011-08-31 2012-01-18 北京利德曼生化股份有限公司 一种制备胱抑素c配对单克隆抗体的方法
CN103995127A (zh) * 2013-10-16 2014-08-20 无锡宜偌维盛生物技术有限公司 一种pgi和pgii联合检测试剂盒
CN104020289A (zh) * 2014-06-23 2014-09-03 宁波艾科生物科技有限公司 一种筛选抗原不同结合位点的单克隆抗体的方法
CN107022527A (zh) * 2017-03-24 2017-08-08 菲鹏生物股份有限公司 可分泌抗c反应蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞、c反应蛋白检测试剂及其制备方法和应用
CN107267465A (zh) * 2017-07-13 2017-10-20 江南大学 一株降钙素原单克隆抗体杂交瘤细胞株cs12‑1及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MICHAEL E. BEMBENEK等: "Determination of complementary antibody pairs using protein A capture with the AlphaScreen assay format", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 *
QI-WEN LI等: "Preparation and characterization of anti-GP73 monoclonal antibodies and development of double-antibody sandwich ELISA", 《ASIAN PACIFIC JOURNAL OF CANCER PREVENTION》 *
张小兵等: "单克隆抗体与多克隆抗体配对ELISA方法比较", 《生物技术通报》 *
王北宁等: "胃蛋白酶原Ⅰ、Ⅱ的酶免疫分析", 《标记免疫分析与临床》 *
詹炉停等: "复合前列腺特异性抗原的单克隆抗体制备及化学发光法免疫定量检测试剂研究", 《中国免疫学杂志》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113121693A (zh) * 2019-12-30 2021-07-16 东莞市朋志生物科技有限公司 具有与hpg i结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白及引物组合物、制备方法和应用
CN113121694A (zh) * 2019-12-30 2021-07-16 东莞市朋志生物科技有限公司 具有与hpg i结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白及其制备方法和应用
CN114591436A (zh) * 2020-12-07 2022-06-07 生物岛实验室 胃蛋白酶原i的特异性抗体及其制备方法与应用
CN114591436B (zh) * 2020-12-07 2022-12-02 生物岛实验室 胃蛋白酶原i的特异性抗体及其制备方法与应用
CN114835815A (zh) * 2022-06-07 2022-08-02 宁波赛珀生物技术有限公司 一种抗胃蛋白酶原i的单克隆抗体及其制备方法和应用
CN114835815B (zh) * 2022-06-07 2023-06-30 宁波赛珀生物技术有限公司 一种抗胃蛋白酶原i的单克隆抗体及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN108395476B (zh) 2021-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108395476A (zh) 胃蛋白酶原i配对单克隆抗体的制备方法
CN105087497B (zh) 杂交瘤细胞株zjeb8-01、抗埃博拉病毒gp蛋白单克隆抗体及其制备和应用
CN111793128B (zh) 抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的单克隆抗体及其应用
Kawamura et al. A sensitive enzyme-linked immunosorbent assay of ochratoxin A based on monoclonal antibodies
CN110894217A (zh) 一种牛冠状病毒嵌合抗原以及检测牛冠状病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡
CN105112375B (zh) 杂交瘤细胞株zjed0-02、抗埃博拉病毒gp蛋白单克隆抗体及其制备和应用
CN111748032B (zh) 抗新型冠状病毒的抗体和使用该抗体的免疫检测
CN112175072B (zh) 抗h5亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体zju5-01及其应用
CN109678950A (zh) spink1抗原、能够特异性结合spink1的抗体及其功能片段及其应用和产品
CN106596976B (zh) .人c-反应蛋白胶体金定量检测卡
CN110144006B (zh) 抗h7n9禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体zju79-02及其应用
CN107266576A (zh) 一种1‑氨基环丙烷‑1‑羧酸氧化酶的单克隆抗体及其应用
Gumpf, DJ, Zheng, G. Moreno, P. and Diaz Production and evaluation of specific monoclonal antibodies to citrus tristeza virus strains
Min et al. Production and characterization of monoclonal antibody and its recombinant single chain variable fragment specific for a food-born mycotoxin, fumonisin B 1
CN112851803A (zh) 抗h10亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体zju10-01及其应用
CN113583119A (zh) 抗金黄色葡萄球菌的纳米抗体Nb56、应用及试剂盒
US5665559A (en) Production of monoclonal antibodies to bacteroides gingivalis by hybridoma BGII, VF9/2D
CN104830805B (zh) 抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体杂交瘤及其单克隆抗体与应用
CN116239697B (zh) 一种抗小鼠IgG的兔单克隆抗体及其应用
CN114426576B (zh) 抗h3n2流感病毒核蛋白单克隆抗体zju-np-a3及其在检测中的应用
CN108642017A (zh) 一株能稳定分泌抗芋螺毒素的单克隆抗体细胞株及应用
CN115856296B (zh) 抗志贺氏菌的单克隆抗体及其检测中的应用
CN114316039B (zh) 一种快速检测病毒的试剂盒及其制备方法
Jian-Shu et al. Preparation of chloramphenicol artificial immunogen and monoclonal antibodies
WO2024067151A1 (zh) 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant