ES2539232T3 - Métodos para reducir el nivel de una o más impurezas en una muestra durante la purificación de proteínas - Google Patents

Métodos para reducir el nivel de una o más impurezas en una muestra durante la purificación de proteínas Download PDF

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Abstract

Un método para reducir el nivel de una o más impurezas asociadas con una proteína de interés en una muestra, comprendiendo el método las etapas de: (i) poner en contacto una muestra que comprende una proteína de interés y una o más impurezas con una o más columnas de cromatografía que contienen medios de afinidad, medios AEX, medios CEX, medios HIC o medios de modo mixto, en condiciones tales que la proteína de interés se une al medio en la una o más columnas de cromatografía; (ii) obtener un eluato de la muestra que comprende la proteína de interés; (iii) poner en contacto el eluato de (ii) en modo de flujo pasante con uno de: (a) un material carbonoso; y (b) una combinación de un material carbonoso y uno o más de medios de afinidad, medios CEX, medios AEX, medios de modo mixto y medios HIC; y (iv) obtener la muestra de flujo pasante de (iii) que comprende la proteína de interés en donde la muestra en (iv) comprende un nivel menor de una o más impurezas con relación al nivel de una o más impurezas en el eluato en (ii).

Description

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plantas (véase, por ejemplo, Price, Am. J. Botany, 33: 45-54 (1946); Corbett, Virology, 15:8-15 (1961); McLeana et al., Virology, 31: 585-591 (1967).
De acuerdo con esto, en general, se ha informado que el carbón activado se une de forma no específica a moléculas en disolución (por ejemplo, impurezas en una muestra de agua).
La presente invención está basada, al menos en parte, en el hallazgo sorprendente e inesperado de que el carbón activado puede eliminar de forma selectiva poblaciones de impurezas proteicas y ADN, haciéndolo por tanto útil en la purificación de proteínas producidas mediante la expresión recombinante en células.
Como se demuestra en los ejemplos en la presente memoria, el carbón activado se puede usar para la eliminación selectiva de impurezas de proteínas de células hospedantes (HCP) y ADN durante los procesos de purificación de proteínas sin afectar de forma significativa al rendimiento de la proteína diana. Además como se demuestra en los Ejemplos indicados en la presente memoria, cuando se usa carbón activado en un proceso de purificación de proteínas en un modo de flujo pasante, bien solo o en mezcla con uno o más medios de cromatografía de diversos tipos, ello resulta en una reducción significativa del nivel de una o más impurezas en la muestra que contiene proteínas así como en la reducción de la carga de columnas de cromatografía corriente abajo. Además, en algunos casos, el carbón activado disminuye el número de etapas que se pueden usar en un proceso de purificación, reduciendo por lo tanto el coste global de operación y ahorrando tiempo. Además, como se muestra en los Ejemplos indicados en la presente memoria, el carbón activado se puede usar antes o después de la etapa de captura, reduciendo así el nivel de una o más impurezas en una muestra que contiene la proteína de interés.
En algunas realizaciones descritas en la presente memoria, el carbón activado se usa en una etapa de purificación de flujo pasante de un proceso global para purificar una molécula diana, donde el proceso global así como la etapa de purificación de flujo pasante se realizan de forma continua.
Para que la presente descripción se pueda entender más fácilmente, primero se definen algunos términos. A través de la descripción detallada se indican definiciones adicionales.
I. Definiciones
El término "material carbonoso," como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier sustancia compuesta de carbono o que contiene carbono. En algunas realizaciones, el material carbonoso usado en los métodos según la invención reivindicada es carbón activado. En algunas realizaciones, el carbón activado comprende carbón vegetal activado. En algunas realizaciones, el carbón activado se incorpora en un medio celulósico.
El término "carbón activo" o "carbón activado," como se usa de forma intercambiable en la presente memoria, se refiere a un material carbonoso que se ha sometido a un proceso para mejorar su estructura porosa. Los carbonos activados son sólidos porosos con áreas superficiales muy elevadas. Se pueden derivar de una variedad de fuentes que incluyen carbón, madera, cáscara de coco, cáscaras de frutos con cáscara y turba. El carbón activado se puede producir a partir de estos materiales usando activación física que implica calentar en una atmósfera controlada o activación química que utiliza ácidos fuertes, bases, u oxidantes. Los procesos de activación producen una estructura porosa con áreas superficiales muy elevadas que proporcionan carbón activado con alas capacidades para la eliminación de impurezas. Los procesos de activación se pueden modificar para controlar la acidez de la superficie.
Los procesos típicos de activación implican someter una fuente de carbono, tal como desechos de resina, carbón, carbón de coque, coque de petróleo, lignitos, materiales poliméricos y materiales lignocelulósicos que incluyen pulpa y papel, residuos de la producción de pulpa, madera (como virutas de madera, serrín, harina de madera), cáscaras de frutos con cáscara como cáscara de almendra y cáscara de coco), granos y semillas de frutas (como huesos de cereza y aceitunas) a un proceso térmico (por ejemplo, con un gas oxidante) o a un proceso químico (por ejemplo, con ácido fosfórico o sales metálicas tales como cloruro de zinc). Una activación química ejemplar de carbono masado en madera con ácido fosfórico (H3PO4) se describe en la patente de EE.UU. No. Re. 31.093, que daba como resultado en una mejora de las capacidades de adsorción de gas y decolorantes del carbono. También, la patente de EE.UU. No. 5.162.286 enseña la activación con ácido fosfórico de un material basado en madera que es particularmente denso y que tiene un contenido de lignina relativamente alto (30%), tal como cáscara de frutos con cáscara, huesos y granos. La activación con ácido fosfórico de material lignocelulósico también se discute en la Patente de EE.UU. No. 5.204.310, como una etapa para preparar carbonos de actividad elevada y densidad elevada.
En contraste a la mayoría de los otros materiales adsorbentes, se cree que el carbón activado interactúa con moléculas que usan fuerzas de van der Waals o de dispersión de London relativamente débiles. Los productos de carbón activado típicamente comerciales presentan un área superficial de al menos 300 m2/g, medido mediante el método Brunauer-Emmett-Teller ("BET") basado en la adsorción de nitrógeno, que es un método bien conocido en la técnica.
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Aunque el carbón activo o activado se ha empleado previamente en procesos para purificar líquidos y gases, no se ha empleado previamente en procesos para purificar una proteína expresada recombinantemente a partir de una o más impurezas proteicas.
El término "inmunoglobulina," "Ig" o "IgG" o "anticuerpo" (usado de forma intercambiable en la presente memoria) se refiere a una proteína que tiene una estructura básica de cadena de cuatro polipéptidos que consiste en dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, estando estabilizadas dichas cadenas, por ejemplo, mediante enlaces disulfuro intercadena, que tienen la habilidad de unirse al antígeno específicamente. El término "inmonoglobulina de cadena-sencilla," "o anticuerpo de cadena-sencilla" (usado de forma intercambiable en la presente memoria) se refiere a una proteína que tiene una estructura de cadena de dos polipéptidos que consiste en una cadena ligera y una cadena pesada, estando estabilizadas dichas cadenas, por ejemplo, mediante ligantes peptídicos intercadena, que tienen la habilidad de unirse al antígeno específicamente. El término "dominio" se refiere a una región globular de un polipéptido de cadena ligera o pesada que comprende bucles peptídicos (por ejemplo, que comprende de 3 a 4 bucles peptídicos) estabilizados, por ejemplo, por enlaces disulfuro intracadena y/o lámina β-plegada. Los dominios además son referidos en la presente memoria como "constantes" o "variables", basado en la falta relativa de variación de secuencia dentro de los dominios de diversos miembros de clase en el caso de un dominio "constante", o la variación significativa dentro de los dominios de diversos miembros de clase en el caso de un dominio "variable". "Dominios" de anticuerpo o de polipéptido a menudo se refieren en la técnica de forma intercambiable como "regiones" de anticuerpo o de polipéptido. Los dominios "constantes" de cadenas ligeras de anticuerpo se refieren de forma intercambiable como "regiones constantes de cadena ligera", "dominios constantes de cadena ligera", regiones "CL" o dominios "CL". Los dominios "constantes" de cadenas pesadas de anticuerpo se refieren de forma intercambiable como "regiones constantes de cadena pesada", "dominios constantes de cadena pesada", regiones "CH" o dominios "CH". Los dominios "variables" de cadenas ligeras de anticuerpo se refieren de forma intercambiable como "regiones variables de cadena ligera", "dominios variables de cadena ligera", regiones "VL" o dominios "VL". Los dominios "variables" de cadenas pesadas de anticuerpo se refieren de forma intercambiable como "regiones variables de cadena pesada", "dominios variables de cadena pesada", regiones "VH"
o dominios "VH".
Las inmunoglobulinas o anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden existir en forma monomérica
o polimérica, por ejemplo, los anticuerpos IgM que existen en forma pentamérica y/o los anticuerpos IgA que existen en forma monomérica, dimérica o multimérica. Las inmunoglobulinas o anticuerpos pueden también incluir anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpo siempre que retengan, o se modifiquen para comprender, un dominio de unión específica a ligando. El término "fragmento" o "fragmento funcional" de un anticuerpo se refiere a una parte o porción de un anticuerpo o cadena de anticuerpo que comprende menos restos de aminoácido que una cadena de anticuerpo o anticuerpo completo o intacto. Los fragmentos se pueden obtener a través de tratamiento químico o enzimático de una cadena de anticuerpo o anticuerpo completo o intacto. Los fragmentos también se pueden obtener por medios recombinantes. Cuando se producen de forma recombinante, los fragmentos se pueden expresar solos o como parte de una proteína más grande llamada una proteína de fusión. Fragmentos ejemplares incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fc y/o Fv. Proteínas de fusión ejemplares incluyen proteínas de fusión Fc.
En una realización particular, los métodos de acuerdo con la invención reivindicada se usan para purificar un fragmento de un anticuerpo que es un fragmento que contiene una región Fc.
El término "región Fc" y "proteína que contiene una región Fc" significa que la proteína contiene regiones o dominios constantes de cadena ligera y/o pesada (regiones CH y CL como se han definido previamente) de una inmunoglobulina. Las proteínas que contienen una "región Fc" pueden poseer las funciones efectoras de un dominio constante de inmunoglobulina. Una "región Fc" tal como las regiones CH2/CH3, se pueden unir selectivamente a ligandos de afinidad tales como la Proteína A o variantes funcionales de la misma. En algunas realizaciones, una proteína que contiene una región Fc se une específicamente a la Proteína A o un derivado, variante o fragmento funcional de la misma. En otras realizaciones, una proteína que contiene una región Fc se une específicamente a la Proteína G o Proteína L, o derivados, variantes o fragmentos funcionales de la misma.
Como se ha discutido anteriormente, en algunas realizaciones, una proteína diana es una proteína que contiene una región Fc, por ejemplo, una inmunoglobulina. En algunas realizaciones, una proteína que contiene una región Fc es una proteína recombinante que incluye la región Fc de una inmunoglobulina condensada a otro polipéptido o fragmento del mismo.
Generalmente, una inmunoglobulina o anticuerpo se dirige frente a un "antígeno" de interés. Preferiblemente, el antígeno es un polipéptido biológicamente importante y la administración del anticuerpo a un mamífero que padece una enfermedad o trastorno puede aportar un beneficio terapéutico a ese mamífero.
El término " anticuerpo monoclonal " o "Mab," como se usa de forma intercambiable en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales en la población son idénticos excepto para las mutaciones que se producen de forma natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos frente a un sitio antigénico único. Además, en contraste a las preparaciones de
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anticuerpo convencionales (policlonales) que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige frente a un determinante único sobre el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar como que requiere la producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para usarse de acuerdo con la presente invención se pueden obtener por el método hibridoma descrito primero por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), o se puede obtener mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. No. 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991).
Los anticuerpos monoclonales además incluyen anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena ligera y/o pesada es idéntica a u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico a u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (Patente de EE.UU. No. 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).
El término "región hipervariable" cuando se usa en la presente memoria se refiere a los restos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de una unión a antígeno. La región hipervariable comprende restos de aminoácido de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (es decir los restos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o aquellos restos de un "bucle hipervariable" (es decir los restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) and 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Los restos "marco" o "FR" son aquellos restos de dominio variable distintos de los restos de región hipervariable como se define en la presente memoria.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son anticuerpos quiméricos que contienen la secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de regiones hipervariables del receptor están reemplazados por restos de regiones hipervariables de una especie no humana (anticuerpo donante) tales como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región de marco Fv (FR) de la inmunoglobulina humana están reemplazados por los restos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para mejorar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede comprender al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
Los términos "polinucleótido" y "molécula de ácido nucleico," usados en la presente memoria de forma intercambiable, se refieren a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, bien ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Estos términos incluyen un ADN de una única hebra, de doble hebra o de triple hebra, ADN genómico, cADN, ARN, ADN-ARN híbrido, o un polímero que comprende las bases purina y pirimidina, u otras bases nucleótidas naturales, química o bioquímicamente modificadas, no naturales o derivatizadas. El esqueleto del polinucleótido puede comprender azúcares y grupos fosfato (como se pueden encontrar típicamente en ARN o ADN), o grupos fosfato o azúcares modificados o sustituidos. Además, se puede obtener un polinucleótido de doble hebra a partir del producto de síntesis química del polinucleótido de cadena sencilla bien sintetizando la hebra complementaria y reasociando las hebras en condiciones apropiadas, o mediante síntesis de la hebra complementaria de novo usando una ADN polimerasa con un cebador apropiado. Una molécula de ácido nucleico puede tomar diferentes formas, por ejemplo, un gen o fragmento de gen, uno o más exones, uno o más intrones, mARN, cADN, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. A polinucleótido puede comprenden nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos ligantes tales como fluororribosa y tioato, y ramificaciones de nucleótidos. Como se usa en la presente memoria, "ADN" o "secuencia nucleótida" incluye no solo las bases A, T, C, y G, sino que también incluye cualquiera de sus análogos o formas modificadas de estas bases, tales como nucleótidos metilados, modificaciones internucleótidas tales como uniones no cargadas y tioatos, uso de análogos de azúcares y estructuras de esqueleto alternativas y/o modificadas, tales como poliamidas
El término "disolución," "composición" o "muestra," como se usa en la presente memoria, se refiere a una mezcla de una proteína de interés o proteína diana (por ejemplo, una proteína que contiene una región Fc tal como un
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anticuerpo) y una o más impurezas. En algunas realizaciones, la muestra se somete a una etapa de clarificación antes de someterse a los métodos según la invención reivindicada. En algunas realizaciones, la muestra comprende alimentación de cultivo celular, por ejemplo, alimentación de un cultivo celular mamífero (por ejemplo, células CHO). Sin embargo, las muestras también abarcan sistemas de expresión no mamíferos usados para producir una proteína de interés.
El término "sistemas de expresión no mamíferos" como se usa en la presente memoria se refiere a todas las células u organismos huésped empleados para generar proteínas terapéuticas, donde las células u organismos huésped son de origen no mamífero. Ejemplos no limitantes de sistemas de expresión no mamíferos son E. coli y Pichia pastoris.
El término "especie activa UV" como se usa en la presente memoria, se refiere a la composición de la fracción de flujo pasante de un cultivo celular clarificado después de someter al cultivo a una columna analítica de Proteína A, monitorizado por un espectrómetro UV. En algunas realizaciones, el espectrofotómetro UV monitoriza la fracción a 280 nm. Esta fracción generalmente consiste en impurezas tales como tintes (tales como indicadores de pH), proteínas de células huésped, ADN y otros componentes de medios de cultivo celular que necesitan eliminarse de la fracción, que también contiene la proteína de interés (por ejemplo, un anticuerpo). El pico de impurezas de flujo pasante se integra manualmente o mediante un algoritmo predeterminado y se usa para cuantificar el nivel total de impurezas.
Como se usa en la presente memoria, el término "polipéptido" se refiere generalmente a péptidos y proteínas que tienen más de aproximadamente diez aminoácidos. Los términos "proteína de interés" y "proteína diana," como se unas de forma intercambiable en la presente memoria, se refieren a una proteína o polipéptido, que incluyen, pero no se limitan a, una proteína que contiene una región Fc tal como un anticuerpo que se va a purificar mediante un método de la invención, de una o más impurezas.
Polipéptidos ejemplares incluyen, por ejemplo, renina; una hormona del crecimiento, que incluye la hormona del crecimiento humana y la hormona del crecimiento bovina; factor de liberación de la hormona del crecimiento; hormona paratiroide; hormona estimulante tiroide; lipoproteínas; α-1-antitripsina; cadena α de insulina cadena β de insulina proinsulina; hormona estimulantes del folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores coagulantes tales como el factor VIIIC, factor IX, factor tisular, y el factor von Willebrands; factores anti-coagulantes tales como la Proteína C; factor natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador plasminógeno, tal como uroquinasa u orina humana o activador del plasminógeno de tipo tisular (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyético; factor de necrosis tumoral -α y -β; encefalinasa; RANTES (célula T normal expresada, segregada y regulada en activación, del inglés regulated on activation normally T-cell expressed and secreted); proteína inflamatoria macrófaga humana (MIP-1-α); una albúmina de suero tal como albúmina de suero humano; sustancia inhibidora Mulleriana; cadena α de relaxina; cadena β de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como β-lactamasa; ADNasa; IgE; un antígeno citotóxico asociado con linfocito T (CTLA) (por ejemplo, CTLA-4); inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; Proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como factor neurotrófico derivado del hueso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5, o -6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6), o un factor del crecimiento del nervio, tal como NGF-β.; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento fibroblástico tal como αFGF y βFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-β, que incluye TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, o TGFβ5; factor de crecimiento de tipo insulina I y -II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebro), proteínas de unión al factor de crecimiento de tipo insulina (IGFBPs); proteínas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD19 CD20, CD34, y CD40; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón tal como interferón-α, -β, y -γ; factores estimulantes de colonia (CSFs), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF, y G-CSF; interleuquinas (ILs), por ejemplo, IL-1 a IL-10; superoxido dismutasa; receptores de células T; proteínas de membrana superficiales; factor acelerante del decaimiento; antígeno viral tal como, por ejemplo, una porción de la envoltura de SIDA; proteínas de transporte; receptores de asentamiento; diriginas; proteínas reguladoras; integrinas tales como CD11a, CD11b, CD11c, CD 18, una ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado a tumor tal como el receptor HER2, HER3 o HER4; y fragmentos y/o variantes de cualquiera de los polipéptidos anteriormente listados. Además, una proteína o polipéptido de la invención es un anticuerpo, fragmento o variante del mismo, que se une específicamente a cualquiera del os polipéptidos anteriormente listados.
Los términos "contaminante," "impureza," y "desecho," tal como se usan de forma intercambiable en la presente memoria, se refieren a cualquier molécula extraña o inaceptable, que incluye una macromolécula biológica tal como una ADN, un ARN, una o más proteínas celulares huésped (HCP), endotoxinas, lípidos, y uno o más aditivos que pueden estar presentes en una muestra que contiene la proteína diana que se va a separar de una o más de las moléculas extrañas o inaceptables usando un proceso de la presente invención. Adicionalmente, tal contaminante puede incluir un reactivo que se usa o se genera en una etapa que puede producirse antes del proceso de purificación, tal como proteína A lixiviada en los casos en los que se emplea una etapa de cromatografía de afinidad de proteína A.
Los términos "proteína celular de ovario de hámster chino" y "CHOP" se usan de forma intercambiable en la presente memoria para referirse a una mezcla de proteínas celulares hospedantes ("HCP") derivadas de un cultivo
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celular de ovario de hámster chino ("CHO"). El HCP o CHOP está presente generalmente presente como una impureza en un lisato o medio de cultivo celular (por ejemplo, un fluido de cultivo celular recolectado ("HCCF")) que comprende una proteína de interés tal como un anticuerpo o inmunoadhesina expresada en una célula CHO). La cantidad de CHOP presente en una mezcla que comprende una proteína de interés proporciona una media del grado de pureza para la proteína de interés. HCP o CHOP incluye, pero no se limita a, una proteína de interés expresada por la célula huésped, tal como la célula huésped CHO. Típicamente, la cantidad de CHOP en una mezcla proteica se expresa en partes por millón con relación a la cantidad de la proteína de interés en la mezcla. Se entiende que cuando la célula huésped es otro tipo de célula, por ejemplo, una célula de mamífero aparte de CHO, una E. coli, una levadura, una célula de insecto o una célula vegetal, HCP se refiere a las proteínas, distintas de la proteína diana, encontradas en un lisado de la célula huésped.
El término "partes por millón" o "ppm" se usan de forma intercambiable en la presente memoria para referirse a una medida de pureza de una proteína diana purificadas mediante un método de la invención. Las unidades ppm se refieren a la cantidad de HCP o CHOP en nanogramos/miligramos de proteína de interés o en miligramos/mililitro (es decir, CHOP ppm=(CHOP ng/ml)/(proteína de interés mg/ml), cuando las proteínas están en disolución).
Los términos "purificar," "separar," o "aislar," como se usan de forma intercambiable en la presente memoria, se refieren a aumentar el grado de pureza de una polipéptido o proteína de interés de una proteína diana de una composición o muestra que comprende la proteína de interés y una o más impurezas. Típicamente, el grado de pureza de la proteína de interés aumenta mediante eliminación (completa o parcial) de al menos una impureza de la composición. Una "etapa de purificación" puede ser parte de un proceso global de purificación que da como resultado una composición o muestra "homogénea", que se usa en la presente memoria para referirse a un composición o muestra que comprende menor que 100 ppm HCP en una composición que comprende la proteína de interés, alternativamente menor que 90 ppm, menor que 80 ppm, menor que 70 ppm, menor que 60 ppm, menor que 50 ppm, menor que 40 ppm, menor que 30 ppm, menor que 20 ppm, menor que 10 ppm, menor que 5 ppm, o menor que 3 ppm de HCP.
El término "fase proteica," como se usa en la presente memoria, se refiere a la parte de una muestra donde la concentración de la proteína diana ha aumentado sustancialmente con relación a la concentración inicial de la proteína diana en la muestra. El proceso de concentración puede implicar la adsorción de proteína sobre un soporte sólido poroso o no poroso; adsorción de proteína en una interfaz líquido-aire o líquido-gas; adsorción de proteína en la interfaz entre dos líquidos inmiscibles o parcialmente miscibles; precipitación de proteína como un componente puro o como un resultado de formación compleja con uno o más moléculas o polímeros diferentes; o usando cristalización de proteínas.
El término "fase líquida" como se usa en la presente memoria, se refiere a esa parte de una muestra donde la concentración de proteína diana se ha reducido sustancialmente en comparación con la concentración inicial de proteína en la muestra. La fase líquida se puede crear en el mismo momento que la fase proteica definida anteriormente.
Los términos "proceso de flujo pasante", "modo de flujo pasante" y "cromatografía de flujo pasante", como se usan de forma intercambiable en la presente memoria, se refieren a una técnica de separación de producto en la se prevé que al menos un producto en una muestra fluya a través de una resina o un medio cromatográfico, mientras que al menos un componente potencial se une a la resina o al medio cromatográfico.
La muestra que se pretende hacer fluir a través se refiere generalmente como la "fase móvil." El "modo de flujo pasante" es generalmente una operación isocrática (es decir, un proceso cromatográfico durante el cual la composición de la fase móvil no cambia). El medio usado para el flujo pasante normalmente se pre-equilibra con la misma disolución tampón que contiene la molécula de proteína diana. Después de la purificación, el medio se puede sobrealimentar con una cantidad adicional del mismo tampón para aumentar la recuperación de producto. En algunas realizaciones, la fase móvil del "modo de flujo pasante" es una alimentación de cultivo celular que contiene el producto de interés. En algunos casos, el pH o conductividad de la alimentación se ajusta para maximizar la eliminación de impurezas usando el proceso de flujo pasante.
En algunas realizaciones según el método reivindicado y como se describe en los Ejemplos indicados en la presente memoria, los métodos emplean una etapa de intercambio aniónico que se realiza en un modo de flujo pasante.
Los términos "modo de elución y unión" y "proceso de elución y unión," como se usan de forma intercambiable en la presente memoria, se refieren a una técnica de separación de producto en la que al menos un producto contenido en una muestra se une a una resina o medio cromatográfico y se eluye a continuación.
El término "cromatografía" se refiere a cualquier clase de técnica que separa un analito de interés (por ejemplo, una proteína que contiene una región Fc tal como una inmunoglobulina) de otras moléculas presentes en una mezcla donde el analito de interés se separa de otras moléculas como un resultado de diferencias en las velocidades a las que las moléculas individuales de la mezcla migran a través de un medio estacionario bajo la influencia de una fase móvil, o en procesos de elución y unión.
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Los medios cromatográficos usados para la captura se eligen del grupo que comprende resina porosa, membrana, monolito, materiales porosos tejidos o no tejidos.
El aislamiento no cromatográfico de la proteína diana se puede realizar mediante una o más de las etapas siguientes: adsorción de proteína sobre un soporte sólido poroso o no poroso; adsorción de proteína en una interfaz líquido-aire o líquido-gas; adsorción de proteína en la interfaz entre dos líquidos inmiscibles o parcialmente miscibles; precipitación de proteína como un componente puro o como un resultado de formación compleja con uno
o más moléculas o polímeros diferentes; o usando cristalización de proteínas.
El término "intercambio iónico" y "cromatografía de intercambio iónico" se refieren al proceso cromatográfico en el que un soluto o analito de interés (por ejemplo, una proteína diana que contiene una región Fc) en una mezcla interactúa con un compuesto cargado unido mediante, por ejemplo, unión covalente, a un material de intercambio iónico de fase sólida tal que el soluto o el analito de interés interactúa de forma no específica con el compuesto cargado más o menos que las impurezas o contaminantes solubles en la mezcla. Los solutos contaminantes en la mezcla se eluyen desde una columna del material de intercambio iónico más rápido o más espacio que el soluto de interés o están unido a o excluidos de la resina con relación al soluto de interés. "Cromatografía de intercambio iónico" incluye específicamente cromatografía de intercambio catiónico, de intercambio aniónico, y de intercambio iónico de modo mixto. Por ejemplo, la cromatografía de intercambio catiónico puede unir la molécula diana (por ejemplo, una proteína diana que contiene una región Fc) seguido de elución (cromatografía de unión y elución de intercambio catiónico o "CIEX") o puede predominantemente unir las impurezas mientras la molécula diana "fluye a través" de la columna (cromatografía de flujo pasante de intercambio catiónico FT-CIEX). La cromatografía de intercambio aniónico puede unir la molécula diana (por ejemplo, una proteína diana que contiene una región Fc) seguido de elución o puede predominantemente unir las impurezas mientras la molécula diana "fluye a través" de la columna. En algunas realizaciones y como se muestra en los Ejemplos de la presente memoria, la etapa cromatográfica de intercambio aniónico se realiza en un modo de flujo pasante. En una realización particular, la etapa cromatográfica de intercambio aniónico emplea el uso de un medio de sorción poroso que comprende un sustrato poroso y un revestimiento poroso sobre el sustrato, donde el revestimiento comprende uno o más copolímeros o aminas primarias poliméricas del mismo.
El término "cromatografía de modo mixto" o " cromatografía multi-modal" como se usa en la presente memoria, se refiere a un proceso que emplea una fase cromatográfica estacionaria que lleva al menos dos tipos distintos de grupos funcionales, cada uno capaz de interactuar con una molécula de interés. Un ejemplo de modo cromatográfico de modo mixto es Capto™ Adhere (GE Healthcare), que es una resina de modo mixto AEX. La cromatografía de modo mixto emplea generalmente un ligando con más de un modo de interacción con impurezas y/o una proteína diana. El ligando incluye típicamente típicamente al menos dos sitios diferentes pero cooperativos que interactúan con la sustancia que se va a unir. Por ejemplo, uno de estos sitios puede tener una interacción de tipo carga-carga con la sustancia de interés, mientras que el otro sitio puede tener una interacción de tipo aceptor-donante y/o interacciones hidrofóbicas y/o hidrofílicas con la sustancia de interés. Los tipos de interacción electrónica aceptordonante incluyen enlace de hidrógeno, π-π, catión-π, transferencia de carga, dipolo-dipolo e interacciones de dipolo inducidas. Generalmente, en base a las diferencias de la suma de interacciones, se pueden separar una proteína diana y una o más impurezas en un intervalo de condiciones.
El término "cromatografía de interacción hidrofóbica" o "HIC," como se usa en la presente memoria, se refiere a un proceso para separar moléculas basado en su hidrofobicidad, es decir, su capacidad de adsorber superficies hidrofóbicas de disoluciones acuosas. HIC se diferencia normalmente de la cromatografía de Fase Inversa (RP) por resinas HIC especialmente diseñadas que tienen típicamente una hidrofobicidad o densidad menor de los ligandos hidrofóbicos en comparación a las resinas RP.
La cromatografía HIC típicamente depende de las diferencias de grupos hidrofóbicos sobre la superficie de las moléculas de soluto. Estos grupos hidrofóbicos tienden a unirse a los grupos hidrofóbicos sobre la superficie de una matriz insoluble. Debido a que HIC emplea un ambiente más polar, menos desnaturalizante que la cromatografía de fase inversa está siendo más popular para la purificación de proteínas, a menudo en combinación con cromatografía de intercambio iónico o de filtración de gel.
Los términos "resina de intercambio iónico," "medio de intercambio iónico" y "material de intercambio iónico" se refieren a una fase sólida que está cargada negativamente (es decir, una resina de intercambio catiónico) o cargada positivamente (es decir, una resina de intercambio aniónico). La carga puede proporcionarse adjuntando uno o más ligandos cargados a la fase sólida, por ejemplo mediante unión covalente o revestimiento no covalente o adsorción. Alternativamente, o en adición, la carga puede ser una propiedad inherente de la fase sólida.
Los términos "CEX," "medio de intercambio catiónico," "resina de intercambio catiónico" y "material de intercambio catiónico," como se usa en la presente memoria, ser refieren a una fase sólida que está cargada negativamente, y que así tiene cationes libres para intercambio con cationes en una disolución acuosa que pasa sobre o a través de la fase sólida. Un ligando cargado negativamente unido a la fase sólida para formar la resina de intercambio catiónico puede, por ejemplo, ser un carboxilato o sulfonato. Las resinas de intercambio catiónico comercialmente disponibles incluyen carboxi-metilcelulosa, sulfopropilo (SP) inmovilizado sobre agarosa (por ejemplo, SP-SEPHAROSE FAST
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FLOW™ o SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE™, de Pharmacia) y sulfonilo inmovilizado sobre agarosa (por ejemplo S-SEPHAROSE FAST FLOW™ de Pharmacia).
Los términos "medio de modo mixto", "resina de modo mixto" y "resina de intercambio iónico de modo mixto," como se usa en la presente memoria, se refieren a una fase sólida que está modificada de forma covalente con restos catiónicos, aniónicos e hidrofóbicos. Una resina de intercambio iónico de modo mixto comercialmente disponible es BAKERBOND ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) que contiene grupos de intercambio catiónico débiles, una concentración baja de grupos de intercambio aniónico y ligandos hidrofóbicos unidos a una matriz de soporte de fase sólida de gel de sílice.
El término "medio HIC" o "resina HIC" o "material HIC," como se usa en la presente memoria, se refiere a material cromatográfico usado para la separación HIC. El medio HIC se deriva normalmente de resina porosa cromatográfica modificada con ligandos hidrofóbicos tales como grupos aromáticos o alifáticos cortos. Ejemplos de medios HIC incluyen Butyl Sepharose y Phenyl Sepharose FF, ambos comercialmente disponibles en GE Healthcare. Ejemplos adicionales de resinas HIC comercialmente disponibles incluyen Fractogel® Phenyl y Fractogel® Propyl (MERCK KGA, Darmstadt, Alemania), Butyl Sepharose® y Phenyl Sepharose® (GE HEALTHCARE).
Los términos "AEX," "medios de intercambio aniónico," "una resina de intercambio aniónico" y "material de intercambio aniónico," como se usan en la presente memoria, se refieren a una fase sólida que está cargada positivamente, por ejemplo que tiene uno o más ligandos cargados positivamente, tales como grupos amino primarios, secundarios, terciarios o cuaternarios, unidos a ellos. Una resina de intercambio aniónico comercialmente disponible incluye DEAE cellulose, QAE SEPHADEX™ y FAST Q SEPHAROSE™ (PHARMACIA).
Los términos "Proteína A" y "ProA" se usan de forma intercambiable en la presente memoria y abarcan la Proteína A recuperada de una fuente nativa de la misma, la Proteína A producida sintéticamente (por ejemplo, mediante síntesis peptídica o mediante técnicas recombinantes), y variantes de las mismas que retienen la capacidad de unirse a proteínas que tienen una región CH2/CH3, tal como una región Fc. La Proteína A se puede adquirir comercialmente de Repligen, GE Healthcare y Lonza. La Proteína A se inmoviliza generalmente sobre un material de soporte de fase sólida. El término "ProA" también se refiere a una columna o resina de cromatografía de afinidad que contiene una matriz de soporte cromatográfico sólido al que está unido de forma covalente la Proteína A.
Un derivado funcional, fragmento o variante de la Proteína A usado en los métodos según la presente invención, se puede caracterizar por una constante de unión de al menos K=10-8 M, y preferiblemente K=10-9 M, para la región Fc del ratón IgG2a o IgG1 humana. Una interacción que cumple con ese valor para la constante de unión se denomina "unión de elevada afinidad" en el presente contexto. Preferiblemente, tal derivado funcional o variante de la Proteína A comprende al menos parte de un dominio de unión a IgG funcional de la Proteína A de tipo salvaje, seleccionado de los dominios naturales E, D, A, B, C o mutantes obtenidos por ingeniería genética de los mismos que tienen funcionalidad de unión a IgG retenida.
Una "Proteína A contaminante" según la presente invención es cualquier tipo de progenie de unión a IgG, funcional, de una Proteína A o un derivado funcional de la misma como se define anteriormente, que se obtiene después de eluir el anticuerpo unido de una columna cromatográfica de afinidad de Proteína A. Tal especie de Proteína A contaminante puede ser el resultado por ejemplo de la hidrólisis de enlaces peptídicos, lo que es muy probable que ocurra mediante la acción enzimática, en particular en la fabricación industrial. La cromatografía de Proteína A se aplica como una etapa temprana en el procesado corriente abajo cuando la disolución de producto recién preparado, purificada en bruto, todavía conserva una actividad proteasa considerable. Las células que mueren en el caldo de cultivo celular o las células afectadas en la centrifugación inicial o las etapas de filtración es probable que tengan proteasas libres; con propósito regulatorio, normalmente no se consigue la suplementación del caldo de cultivo celular con inhibidores de proteasa antes o en durante el procesado corriente abajo, en contraste con la práctica de la investigación bioquímica. Ejemplos son cloruro de fenilmetil-sulfonilo (PMSF) o ácido e-caproico. Tales agentes químicos son indeseables como aditivos en la producción de agentes biofarmacéuticos. También es posible que los derivados funcionales recombinantes o fragmentos de Proteína A sean menos resistentes a la proteasa que la Proteína A de tipo salvaje, dependiendo de la estructura terciaria del pliegue de la proteína. Los segmentos de aminoácidos que se unen a dominios de IgG individuales se pueden exponer una vez que el número total de dominios de unión se ha reducido. Los contactos entre dominios pueden contribuir posiblemente a la estabilidad del plegamiento del dominio. También puede ser que la unión del anticuerpo por la Proteína A o dichos derivados funcionales de la misma ejerza influencia o facilite la susceptibilidad a la acción de la proteasa, debido a cambios conformacionales inducidos en la unión del anticuerpo.
La "unión" de una molécula a una resina cromatográfica significa exponer la molécula a la resina cromatográfica en condiciones apropiadas (pH/conductividad) de forma tal que la molécula se inmoviliza de forma reversible en o sobre la resina cromatográfica en virtud de interacciones ligando -proteína. Los ejemplos no limitantes incluyen interacciones iónicas entre las molécula y un grupo cargado o grupos cargados del material de intercambio iónico y una interacción bioespecífica entre la Proteína A y una inmunoglobulina.
El término "tampón de lavado" o "tampón de equilibrado" se usa de forma intercambiable en la presente memoria, se refiere a un tampón usado para lavar o reequilibrar la resina cromatográfica antes de eluir la molécula de polipéptido
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diseño etc. En algunas realizaciones descritas en la presente memoria, uno o más mezcladores estáticos se usan en los procesos descritos en la presente memoria, por ejemplo, entre una etapa de cromatografía AEX y una etapa de cromatografía CEX.
Esta invención se ilustra además mediante los ejemplos siguientes.
II. Mariales carbonosos ejemplares para Uso en los Métodos Reivindicados
En los métodos según la presente invención, algunos materiales carbonosos tales como carbón activado, se usan en la purificación de proteínas. El carbón activado se puede describir como un sólido poroso con un área superficial muy elevada. En algunas realizaciones, el carbón activado comprende carbón vegetal activado. El carbón activado puede derivarse de una variedad de fuentes que incluyen, pero no se limitan a, carbón, madera, cáscara de coco, cáscara de nuez y turba. El carbón activado se puede producir a partir de estos materiales mediante activación física que implica calentar en una atmósfera controlada o mediante activación química que utiliza ácidos fuertes, bases, u oxidantes. Los procesos de activación producen una estructura porosa con un área superficial elevada que proporciona al carbón activado una capacidad mayor para la eliminación de impurezas. Los procesos de activación se pueden modificar para controlar la acidez de la superficie.
El carbón activado está disponible en una amplia variedad de fuentes comerciales y viene en una cantidad de calidades y formatos. Algunos de los proveedores comerciales de carbón activado incluyen compañías como MeadWestVaco Corp., Richmond, VA, EE.UU; Norit Americas Inc., Marshall, TX, EE.UU.; Calgon Carbon Corp., Pittsburgh, PA, EE.UU..
Dos de los principales formatos de carbón activado son el polvo y granular. El carbón activado en polvo contiene partículas pequeñas y normalmente menores que 1 mm de diámetro, y se usa lo más común para la purificación de líquidos. El carbón activado granular tiene un tamaño de partícula mayor y por consiguiente un área superficial menor, así que se prefiere para uso en la purificación de gas donde la velocidad de difusión es mayor.
Una consideración importante para la seguridad con el uso de carbón activado es aplicaciones de consumo (tales como la purificación de agua, alimentos, bebidas y de productos farmacéuticos) es la reducción y control de compuestos extraíbles. El carbón activado previsto para aplicaciones de agua potable y contacto alimentario se obtiene normalmente de acuerdo con la norma de seguridad ANSI/NSF Standard 61 que cubre todos los aditivos indirectos del agua. También, el método de ensayo D6385 de la norma ASTM describe la determinación del contenido extraíble de ácido en el carbón activado mediante cenizas y se podría usar para estudiar y minimizar el nivel de extraíbles del carbón activado.
Está disponible un intervalo de tipos de carbón activado para diversas aplicaciones. Por ejemplo, MeadWestVaco Corp. suministra al menos doce tipos de carbón activado en polvo que pueden varias por su capacidad, acidez superficial, accesibilidad de los poros a moléculas diana y aplicación pretendida. Generalmente es deseable maximizar la capacidad del carbón activado de eliminar impurezas.
En algunas realizaciones descritas en la presente memoria, el carbón activado se incorpora en un medio celulósico.
III. Procesos de Purificación de Flujo Continuo Convencionales
La mayoría de los procesos de purificación de flujo pasante convencionales se basan claramente en diferentes interacciones superficiales entre la proteína diana de interés y la impureza que se va a eliminar. Por ejemplo, la purificación convencional de flujo pasante AEX de anticuerpos monoclonales se basa en el hecho de que el punto isoeléctrico de la mayoría de los anticuerpos es mayor que otras proteínas y ácidos nucleicos y está normalmente por encima de 7.Por lo tanto, los procesos AEX de purificación de flujo pasante se llevan a cabo a un pH que es menor que el pI del anticuerpo que se va a purificar con el fin de asegurarse de que la fase estacionaria y el anticuerpo tienen la misma carga y por lo tanto el anticuerpo fluye a través del medio sin unirse de forma significativa a la superficie. Por otro lado, muchas impurezas proteicas, ácidos nucleicos, y endotoxinas tienen un pI más bajo que un anticuerpo, que es por lo general por debajo de 7, y en consecuencia, se unen a la superficie de un medio de AEX
Como la mayoría de los procesos de cromatografía de intercambio iónico, la purificación de flujo pasante AEX es generalmente sensible a la conductividad de la disolución y es generalmente menos eficaz a mayor salinidad. En un típico proceso de purificación de un anticuerpo monoclonal, la purificación de flujo pasante AEX, a veces referida como la "etapa de pulido," sigue una o más etapas de cromatografía en columna de unir y eluir.
A continuación se muestran dos modelos de procesos comúnmente más utilizados:
1) captura de Proteína A → purificación y concentración de unir y eluir CEX → Dilución → flujo pasante AEX
2) captura de Proteína A → flujo pasante AEX → purificación y concentración de unir y eluir CEX
Además de estos modelos de proceso empleados comúnmente, a veces se emplean otros esquemas de purificación, incluyendo la captura de CEX y el uso de resinas inorgánicas de unir y eluir de modo mixto (tales como
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Hidroxiapatita Cerámica, CHT)En general, el objetivo de la purificación de flujo pasante es eliminar niveles de trazas de impurezas, mientras que la mayor parte de la purificación se realiza usando etapas de unir y eluir. Sin embargo, un cambio del uso principalmente de etapas de unir y eluir a un proceso de purificación de flujo pasante puede ser una solución muy rentable que ahorra tiempo, reactivos, así como costes operativos. Por consiguiente, los procesos descritos en la presente memoria proporcionan una solución viable a los procesos convencionales en que son más rentables y reducen la fabricación global y los costes operativos.
En algunas realizaciones descritas en la presente memoria, se proporcionan procesos de purificación de flujo pasantes mejorados, que permiten que la purificación de flujo pasante se realice de una manera continua.
IV. Uso de Material Carbonoso en Procesos de Purificación
Como se ha discutido anteriormente, la presente invención proporciona procedimientos de purificación de nuevos y mejorados que emplean carbón activado. El carbón activado puede ser añadido directamente a una etapa de purificación y, posteriormente, se puede eliminar por sedimentación o filtración, o haciendo pasar una disolución o gas a través de un dispositivo que contiene carbón activado. El carbón activado o bien puede ser rellenado independientemente en un dispositivo adecuado o se puede mezclar con otros materiales que mejoren sus propiedades mecánicas, flujo, o separación. Por ejemplo, el carbón activado puede incorporarse en un medio fibroso que contiene celulosa dejado en húmedo, y luego sellado dentro de un dispositivo desechable tal como Millistak + ® Pod CR disponible de Millipore Corporation, o Seitz® AKS Filter Media disponible de Pall Corporation, Port Washington, NY, EE.UU.. Otro formato de carbón activado es un bloque de carbón activado, donde el carbón activado se incorpora en un monolito poroso presionando junto con polvo termoplástico. La forma granular del carbón activado también se puede rellenar en columnas, similar al medio cromatográfico, o puede rellenarse en un dispositivo adecuado. En general se acepta que activa el medio de carbón activado se utiliza para la decoloración, la eliminación de pequeñas impurezas de moléculas, etc. Por ejemplo, hay varias calidades de medios de carbón activado disponibles de Pall Corporation, que pueden ser seleccionados en base al peso molecular de impurezas diana. Están disponibles tres intervalos de pesos moleculares: 200-400, 400-1,000, y 400-1,500 Dalton, siendo el último el más grande. Sin embargo, ninguno de los medios de carbón activado comercialmente disponibles se han descrito para la eliminación selectiva de impurezas mucho más grandes de muestras biológicas, que van desde
2.000 a 200.000 Dalton de peso molecular.
La presente invención se basa, al menos en parte, en el sorprendente descubrimiento de que el carbón activado es capaz de unirse selectivamente a impurezas indeseables (por ejemplo, HCP y ADN), mientras que al mismo tiempo muestra una unión insignificante a una proteína diana.
Esta invención también se reconoce el hecho de que, similar a todo el material de adsorción, la capacidad de adsorción del carbón activado no es ilimitada. Por ejemplo, en el caso de alimentación CHO-S, el carbón activado ha mostrado que elimina eficazmente tanto HCP y ADN cuando estas especies estaban presentes a concentraciones que se observaron en alimentaciones representativas como se muestra en el Ejemplo 1.Sin embargo, la adición de ADN a un nivel inusualmente alto se encontró que suprimía la eficacia de eliminación de HCP del carbón activado como se muestra en el Ejemplo 2.
El carbón activado también puede ser altamente beneficioso en la eliminación de los componentes potenciales de medios de cultivo celular que pueden estar presentes en la disolución de la proteína diana, tanto antes como después de la etapa de captura de la proteína diana. Los componentes típicos de medios de cultivo celular incluyen tensioactivos (por ejemplo, Pluronic® F68), insulina, antibióticos, metotrexato, y antiespumante. Debido a un riesgo de que algunos de estos componentes sean trasladados a una proteína diana purificada, es ventajoso incorporar una etapa en un tren de purificación de proteínas que sea capaz de eliminar estos componentes. El carbón activado se puede usar en un proceso de purificación para eliminar tales componentes, como además es evidenciado por los Ejemplos de la presente memoria.
Los siguientes son ejemplos de procesos de purificación de proteínas que incorporan carbón activado como una o más etapas intermedias, que se muestra mediante subrayado en la siguiente Tabla I siguiente. Se entiende que pueden ser utilizadas muchas variaciones de estos procesos.
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TABLA I
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Etapa 1 imagen11 Etapa 2 Etapa 3 Etapa 4 Etapa 5
Proceso A
Proporciona de Cultivo Clarificado Fluido Celular Carbon activado flujo pasante unir y eluir con medio de Afinidad unir y eluir con medio CEX Medio AEX flujo pasante
Proceso B
Proporciona de Cultivo Clarificado Fluido Celular unir y eluir con medio de Afinidad Carbon activado flujo pasante unir y eluir con medio CEX Medio AEX flujo pasante
Proceso C
Proporciona de Cultivo Clarificado Fluido Celular unir y eluir con medio de Afinidad unir y eluir con medio CEX Carbon activado flujo pasante Medio AEX flujo pasante
Proceso D
Proporciona de Cultivo Clarificado Fluido Celular unir y eluir con medio de Afinidad unir y eluir con medio CEX Medio AEX flujo pasante Carbon activado flujo pasante
Proceso E
Proporciona de Cultivo Clarificado Fluido Celular unir y eluir con medio de Afinidad Carbon activado flujo pasante Medio AEX flujo pasante imagen12
Proceso F
Proporciona de Cultivo Clarificado Fluido Celular unir y eluir con medio CEX Carbon activado flujo pasante Medio AEX flujo pasante imagen13
Proceso G
Proporciona de Cultivo Clarificado Fluido Celular unir y eluir con medio de Afinidad Carbon activado flujo pasante Medio AEX flujo pasante Medio CEX flujo pasante
En general, en la tabla anterior, la etapa de unir y eluir con medio de Afinidad, y/o de unir y eluir con medio CEX se puede operar en cualquiera de tres modos: (1) el modo discontinuo, donde el medio se carga con la proteína diana,
5 la carga se para, el medio se lava y se eluye y se recoge el conjunto de fracciones; (2) modo semicontinuo, donde la carga se realiza de forma continua, mientras que la elución es intermitente (por ejemplo, en el caso de cromatografía multicolumna continua); y (3) modo totalmente continuo, donde tanto la carga como la elución se realizan de forma continua.
En algunas realizaciones, uno o más procesos descritos en la Tabla anterior, se puede realizar una etapa de
10 inactivación de virus después de la etapa de unir y eluir y antes de someter el eluato a una etapa de purificación de flujo pasante, como se describe en la presente memoria.
Se entiende que los procesos descritos en la presente memoria y en la Tabla anterior puede emplear además etapas adicionales, así como etapas para el cambio de las condiciones de la disolución en línea o a través de un tanque de compensación. En algunas realizaciones descritas en la presente memoria, un proceso incluye las etapas
15 siguientes: clarificación; unir y eluir con medio de afinidad de Proteína A; inactivación de virus en línea; purificación de flujo pasante como se indica a continuación: Carbón activado seguido de medio AEX de flujo pasante seguido de un cambio de disolución usando un mezclador estático y/o tanque de compensación en línea, seguido del medio CEX de flujo pasante seguido de filtración de virus; y formulación.
V. Ensayo de Niveles Reducidos de Una o Más Impurezas
20 La presente invención proporciona procesos para reducir el nivel de una o más impurezas presentes en una muestra que contiene una proteína de interés. Las impurezas típicas contenidas en una muestra proteica derivada de una fuente biológica incluyen proteínas de células huésped (HCP) y ácidos nucleicos (ADN). Cuando una célula huésped es Ovario de Hámster Chino (CHO), la HCP se denomina comúnmente como CHO HCP o CHOP. Los métodos inmunológicos que usan anticuerpos a HCP tales como Western Blot y ELISA se usan convencionalmente para la
25 detección de tales impurezas. Los ensayos inmunoenzimétricos de placa de microtitulación (ELISA) se emplean también de forma rutinaria para proporcionar una alta sensibilidad de análisis. Tales ensayos son sencillos de usar, objetivos, y herramientas poderosas para medir el nivel de una o más impurezas durante procesos de purificación.
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Q FastFlow, era inesperado ver que el carbón activado eliminaba el ADN con una capacidad similar. Todos los otros materiales eliminaban ADN en un menor grado.
Los datos de este ejemplo demuestran que el carbón activado, así como los materiales con intercambio catiónico, intercambio aniónico y grupos funcionales de interacción hidrofóbica, pueden eliminar impurezas (HCP, ADN y especies activas UV) a diversos grados sin pérdida de rendimiento significativa en modo de flujo pasante a partir de una alimentación CHO.
Ejemplo 2. Capacidad de eliminación de impurezas en flujo pasante
En un experimento significativo, se evaluó la cantidad de impurezas eliminada por diferentes materiales por unidad de volumen. El nivel de ADN en la alimentación CHO-S aumentó durante la adición de ADN de esperma de arenque comercialmente disponible para entender el efecto de la competición de adsorción entre ADN y HCP. Los materiales que se evaluaron para la eliminación de impurezas se listan en la Tabla III a continuación.
Tabla III
Material
Acrónimo Descripción Vendedor/Catálogo
Carbón activado
AC Carbón activado MeadWestVaco RGC 80
SP sepharose FastFlow
SP FF resina de cromatografía de intercambio catiónico (CIEX), matriz de base agarosa GE Healthcare, Cat# 170729-01
ProRes™-S
ProRes™-S
resina de cromatografía de intercambio catiónico (CIEX), matriz de base polimérica Millipore Corporation
Q sepharose FastFlow
Q FF resina de cromatografía de intercambio aniónico (CIEX), matriz de base agarosa GE Healthcare, Cat# 170510-01
Cada uno de los materiales listados en la Tabla III (1 ml) se rellenaron en una columna Omnifit (0,66 cm d.i.). Las columnas se equilibraron con 5 CV PBS, se cargaron con 100 CV de alimentación CHO-S clarificada nula sin tratar con la adición de IgG policlonal y ADN de esperma de arenque y se lavaron con 20 volúmenes de columna de PBS sobre un BioCad (APPLIED BIOSYSTEMS, Palo Alto, CA). Las fracciones de eluyente de flujo pasante durante la etapa de carga se recogieron cada 10 volúmenes de columna. Las fracciones de eluyente de flujo pasante y las alimentaciones correspondientes se ensayaron para el rendimiento IgG, especies activas UV, eliminación de HCP y ADN usando los mismos métodos que los descritos en el Ejemplo 1.
Como se representa en la Figura 5, todos los materiales evaluados no mostraban una pérdida significativa de rendimiento IgG en la carga de 100 volúmenes de columna de alimentación. Como se representa en la Figura 6, el carbón activado eliminó la mayor parte de las especies activas UV a través de los 100 CV. El material de intercambio aniónico también eliminó especies activas UV en algún grado a través de los 100 CV. Además, como se representa en la Figura 7, la capacidad de eliminación de HCP por una resina de intercambio aniónico, Q FastFlow, era limitada, ya que se derrumbaba desde las fracciones tempranas. Sin embargo, los materiales de intercambio catiónico, Q FastFlow y ProRes™-S, eliminaron una cantidad significativa de HCP a través de 100 volúmenes de columna. Con la elevada concentración de ADN (es decir, unos 195 µg/mL adicionales) es este experimento específico, el carbón activado eliminó menos HCP en comparación a con las alimentaciones sin el ADN añadido. Por ejemplo, en un experimento similar con la alimentación CHO-S nula original son la adición de ADN, el carbón activado eliminó cerca de 20% HCP a través de los 100 CV (datos no mostrados). Esto demostró algún grado de competición de ADN y HCP por la adsorción al carbón activado. Además, como se representa en la Figura 8, todos los materiales eliminaron ADN en algún grado.
Los datos de este ejemplo demuestran que el carbón activado, así como los materiales con intercambio catiónico, intercambio aniónico y grupos funcionales de interacción hidrofóbica, pueden eliminar impurezas (HCP, ADN y especies activas UV) a diversos grados sobre 100 volúmenes de columna, sin pérdida de rendimiento significativa en modo de flujo pasante a partir de una alimentación de células CHO.
Ejemplo 3. Efecto de combinaciones de diferentes materiales en la eliminación de impurezas
En otro experimento, se evaluaron para la eliminación de impurezas diferentes combinaciones de materiales, mostrados en el diagrama de flujos representado en la Figura 9. Se dejó que los materiales (1 ml) se asentasen y se rellenaron en una columna de cromatografía de 5 ml desechable. Las columnas se equilibraron con 5 CV de PBS, se cargaron con 20 CV de alimentación y se lavaron con 5 CV de PBS.
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Típicamente, el día después de la clarificación, el cultivo celular filtrado de forma estéril clarificado se cargó en la columna de Proteína A a un tiempo de permanencia de al menos 5 minutos (es decir, un caudal de 500 -600 mL min-1). La columna se cargó para asegurar que no se excedía la capacidad máxima de la columna, que se definió como 30 g de MAb I por litro de medio.
Después de la carga de la columna, la columna se limpió con PBS al mismo tiempo de permanencia hasta que las trazas UV alcanzaron la línea e base, típicamente en tres CV. Después se lavó la columna con acetato de sodio 20 mM con NaCl 0,5 M a pH 6 durante al menos tres CV, pero no más de cinco CV. A continuación se eluyó el producto usando una etapa de cambio a ácido acético 20 mM pH 3,0, donde la captura del pico de elución se realizó manualmente para reducir la dilución del pico de elución. Se dejó que el eluato incubase a temperatura ambiente (20-25 °C) durante al menos 30 minutos hasta un máximo de 1,5 horas. Después de la incubación, el pH de la mezcla de fracciones de elución se titró a pH 5 ± 0,2 usando base Tris 2 M a pH 10 o mayor. El pH de partida de la mezcla de fracciones de elución era típicamente próximo a 4,0 y requería menor que 5 % en volumen de adición de la disolución base Tris. Durante la titración de la mezcla de fracciones de elución se observó un precipitado visible. La eliminación de los precipitados se realizó usando un Millipore Millistak+® X0HC POD escala lab antes de la filtración en condiciones estériles de mezcla de fracciones de elución, donde al menos se requirieron dos vainas (POD) de 0,027 m2 para clarificar los precipitados de la mezcla de fracciones de elución completa. Después de la filtración profunda, el eluato se filtró en condiciones estériles usando unidades de filtro Millipore Express Plus Stericup y se almacenó a 4 °C hasta su uso.
Ejemplo 6. Preparación de una alimentación MAb capturada representativa basada en no-afinidad (intercambio catiónico) para evaluar el comportamiento del carbón activado para la purificación de MAb
Un anticuerpo monoclinal parcialmente purificado, referido como MAb I, se produjo usando una línea de cultivo CHO para uso como una alimentación de anticuerpo monoclonal capturada de no-afinidad representativa (intercambio catiónico) para evaluar el comportamiento del carbón activado para purificar proteínas. SE obtuvo un fluido clarificado de cultivo celular MAb I como se ha discutido en el Ejemplo 5. El fluido de cultivo celular se filtró a través de una serie de dos filtros, D0HC y X0HC a una turbidez final de < 10 NTU, y posteriormente se filtró de forma estéril con un filtro de cápsula Millipore Express® SHC.
Se rellenó una columna de laboratorio de 22 cm ID glass Vantage® de Millipore Corporation, Billerica, MA, EE.UU. con el medio de intercambio catiónico (CEX) Fractogel® SO3-(M). La columna se rellenó usando PBS sobre un Äkta® Explorer 100 (GE HEALTHCARE, Uppsala, Suecia) con velocidades lineales superficiales de aproximadamente 1000 cm h-1 . La caída de presión a través de la columna se mantuvo por debajo de tres bar durando el rellenado y todos los ensayos de la columna posteriores. La compresión del lecho de la columna fue de aproximadamente 15 % con un volumen de lecho relleno de 75 mL. La eficacia de rellenado de la columna se midió usando una inyección de pulso de 500 µL de Tris 25 mM, NaCl 1M, acetona al 3 % (v/v) a pH 6,9 a una velocidad lineal superficial de 100 cm h-1 usando PBS como el tampón de ensayo. Se calculó la altura equivalente a un plato teórico (HETP) usando el pico de acetona usando métodos estándar después de contar el volumen muerto del sistema y se calculó como 0,053 cm con una asimetría del pico de 1,3, indicando que la columna estaba rellenada suficientemente. El pico de NaCl mostraba un nivel mayor de asimetría del pico, pero esto es probable que esté relacionado con la interacción de los iones salinos con el medio y no una representación de la eficacia de la columna.
Antes del primer uso de la columna, se realizó un ensayo en blanco completo sin una carga proteica para reducir y/o eliminar cualquier interacción relacionada con la disolución con el medio base. Antes de la carga, la columna se equilibró con acetato de sodio 20 mM pH 5 durante al menos cinco CV. La columna se cargó con un cultivo celular clarificado que contenía MAb I que tenía el pH disminuido a pH 5 usando ácido acético glacial. Cuando se disminuyó el pH del cultivo celular, se observaron a menudo precipitados y se eliminaron usando una combinación de centrifugado y filtración profunda usando un Millipore Millistak+® X0HC POC escala lab.
La disolución de carga se filtró en condiciones estériles antes de cargarla usando unidades de filtro Millipore Express Plus Stericup. La carga filtrada en condiciones estériles se cargó en la columna usando un tiempo de permanencia de 10 min en un esfuerzo de maximizar la capacidad de la columna (aproximadamente 45 g MAb I por L de medio), al mismo tiempo que se minimizaba la caída de presión a través de la columna. Después de la carga, la columna se lavó con tampón de equilibrado para cinco CV. La columna se lavó después con tampón de acetato de sodio 20 mM, NaCl 0,1 M NaCl pH 5,0 para cinco CV. La elución del a columna se realizó con un cambio de etapa a acetato de sodio 20 mM, NaCl 0,25 M pH 6,0 para al menos cinco CV. El eluato se fraccionó y las fracciones de pico se reunieron y almacenaron a 4 °C para otro uso. Entonces, se lavó la columna con acetato de sodio 20 mM, NaCl 1 M pH 6,0 para eliminar las proteínas fuertemente unidas, que se determinó que eran principalmente proteínas de células huésped (HCP). Entonces, la columna se lavó con NaOH 0,5 N para cinco CV a un caudal menor equivalente a un tiempo de permanencia de 30 minutos. A continuación se lavó la columna con cinco CV del tampón de equilibrado y se almacenó a temperatura ambiente (20-25 °C) para un uso futuro.
Ejemplo 7. Evaluación de diversos adsorbentes por tratamiento de flujo pasante de un eluato MAb capturado por afinidad
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Tabla IV
adsorbente de flujo pasante
MAb (mg/m L) I Recuperación MAb I HCP (ng/mL) HCP (ppm) LRV HCP de Proteína (ng/mL) A Proteína A (ppm)
Sin tratar (control)
7,18 imagen17 ND 869 121 ND imagen18 4.61 imagen19 0,62
Carbón activado
6,88 imagen20 96% 112 16 0,87 imagen21 ND imagen22 ND
ChromaSorb
5,92 imagen23 82% 320 54 0,35 imagen24 ND imagen25 ND
HiTrap SP FF
6,09 imagen26 85% 364 60 0,31 imagen27 2,95 imagen28 0,48
HiTrap CM FF
6,28 imagen29 87% 463 74 0,22 imagen30 2,72 imagen31 0,43
HiTrap Phenyl FF
6,89 imagen32 96% 385 56 0,33 imagen33 3,21 imagen34 0,47
HiTrap Butyl FF
7,21 imagen35 100% 563 78 0,19 imagen36 4,25 imagen37 0,59
ND -No detectado NA -No aplicable
Ejemplo 8. El tratamiento de empapado estático de un eluato capturado por afinidad de un MAb con carbónactivado y/o medio de intercambio aniónico
El carbón activado solo y en combinación con un medio de intercambio aniónico se examinó para la eliminación de impurezas de un eluato de anticuerpo monoclonal capturado por afinidad (Proteína A) para demostrar un método único e inesperadamente eficaz para la eliminación de impurezas.
Se preparó un eluato capturado por afinidad parcialmente purificado MAb I (Proteína A) según el Ejemplo 5. El eluato de MAb I se ajustó de aproximadamente pH 5 a pH 7 con base Tris (2 M) y se filtró a través de una unidad de filtro de 0,22 micras Millipore Express Plus Stericup. La disolución es referida en la presente memoria como el eluato Proteína A MAb I.
En la presente memoria se usan intercambiablemente carbón activado RGC y RGC Nuchar de forma intercambiable y se refieren a la calidad de carbón activado en polvo obtenido de MeadWestVaco Corporation, Richmond, VA, EE.UU.. En un experimento representativo, una porción circular de 7 mm (5 µL) de la membrana ChromaSorb™ y/o 10 mg de carbón activado RGC Nuchar se añadieron a un tubo centrífugo de 1,5 mL con tampón Tris-HCl, 25 mM, pH 7 para equilibrar el medio adsorbente. Los tubos se centrifugaron y el tampón de equilibrado sobrenadante se eliminó. Posteriormente, se añadió un volumen de 1 mL del eluato de Proteína A MAb I a un tubo centrífugo de 1,5 mL que contenía el(los) adsorbente(s) equilibrado(s). Se dejó que el medio adsorbente y el eluato interactuasen durante 18 horas a temperatura ambiente con rotación suave. Los tubos se sometieron a centrifugado y las disoluciones de sobrenadante se analizaron con relación a la concentración de proteína de célula huésped (HCP) e IgG.
El análisis HCP se realizó usando un kit ELISA comercialmente disponible de Cygnus Technologies, Southport, NC, EE.UU., número de catálogo F550, siguiendo el protocolo del fabricante del kit. La concentración IgG se midió usando un sistema Agilent HPLC equipado con una columna analítica de Proteína A Poros® A. Los resultados de uno de tales experimentos se resumen en la Tabla V.
Los resultados muestran que el carbón activado solo y en combinación con un medio de intercambio aniónico era inesperadamente eficaz para la eliminación de impurezas de la disolución de anticuerpo monoclonal. La combinación de carbón activado y el medio de intercambio aniónico (ChromaSorb) eliminó la mayor cantidad de impurezas con una reducción del valor de reducción del log (LRV) de proteína de célula huésped (HCP) de 1,43. El carbón activado y el medio de intercambio aniónico individuales tenían LRV de HCP de 1,21 y 0.36 respectivamente. El carbón activado solo y en combinación con un medio de intercambio aniónico tenían ambos expelentes recuperaciones del producto de anticuerpo monoclonal de95% y 95% respectivamente.
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comercialmente disponibles que incluyen aminas primarias (ChomaSorb™) y aminas cuaternarias (Sartobind Q, Mustang Q, HiTrap Q FF). La combinación de carbón activado era altamente eficaz en combinación con químicas de intercambio aniónico comercialmente disponibles que se soportaron en una membrana (ChomaSorb, Sartobind Q, Mustang Q) y en una resina (HiTrap Q FF).
Tabla X
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MAb I (mg/mL) recuperación de MAb I HCP (ng/mL) HCP (ppm) LRV de HCP
Medio AEX
AEX solo AEX despuésA.C. AEX solo AEX despuésA.C. AEX solo AEX despuésA.C. AEX solo AEX despuésA.C. un AEX AEX despuésA.C.
no medio AEX
ND 8,82 ND 96% 5,701 738 618 84 ND 0,91
ChromaSorb
9,20 8,89 100% 96% 3,660 70 398 8 0,23 1,93
Sartobind Q
9,26 8,99 100% 97% 4,103 98 443 11 0,19 1,80
Mustang Q
9,17 8,86 99% 96% 4,001 120 436 14 0,19 1,70
Q Fast Flow
9,20 8,76 100% 95% 4,245 81 462 9 0,17 1,86
NA -No aplicable

Ejemplo 14. Tratamiento de flujo pasante de un eluato capturado por afinidad de MAb I con carbón activado seguido de medios de intercambio aniónico con medios de intercambio aniónico seguidos de carbón activado
El orden de carbón activado y medio de intercambio aniónico para la eliminación de impurezas por flujo pasante de un eluato de anticuerpo monoclonal capturado por afinidad (Proteína A) se examinó para demostrar que el orden de los dos adsorbentes ejercía inesperadamente influencia sobre su eficacia. El experimento ilustra que la colocación del carbón activado antes del medio de intercambio aniónico es importante para maximizar la capacidad de la combinación de adsorbentes para eliminar las impurezas de disoluciones proteicas.
Se preparó un eluato capturado por afinidad parcialmente purificado MAb I (Proteína A) según el Ejemplo 5. El eluato de MAb I se ajustó de aproximadamente pH 5 a pH 7 con base Tris (2 M) y se filtró a través de una unidad de filtro de 0,22 micras Millipore Express Plus Stericup. La disolución es referida en la presente memoria como el eluato Proteína A MAb I.
Las columnas de cromatografía Omnifit (diámetro de 10 mm, longitud de 100 mm) se cargaron con 250 mg de carbón activado HD Nuchar en suspensión en agua para proporcionar un volumen de columna rellena de 1 mL. Las columnas se equilibraron con disolución tampón (tampón Tris-HCl, 25 mM, pH 7). Un dispositivo de membrana de 0,2 mL ChromaSorb, fabricado como se describe anteriormente en el Ejemplo 7, también se equilibró con disolución tampón (tampón Tris-HCl, 25 mM, pH 7). Se ensamblaron dos trenes de flujo pasante. El primero tenía la columna de carbón activado seguida del dispositivo de membrana ChromaSorb, mientras que el segundo tenía el orden inverso con el dispositivo de membrana ChromaSorb seguido de la columna de carbón activado. 96 mL del eluato de Proteína A MAb I se hicieron pasar a través de cada montaje a un caudal de 0,25 mL/min. Después de pasar a través de los trenes de purificación, las disoluciones se analizaron con relación a la concentración de proteína de la célula huésped (HCP) e IgG. El análisis HCP se realizó usando un kit ELISA comercialmente disponible de Cygnus Technologies, Southport, NC, EE.UU., número de catálogo F550, siguiente el protocolo del fabricante del kit. La concentración IgG se midió usando un sistema Agilent HPLC equipado con una columna analítica de Proteína A Poros® A. Los resultados se resumen en la Tabla XI.
Los resultados muestran el resultado inesperado de que el orden del carbón activado y un medio de intercambio aniónico (ChromaSorb) aes importante para la eficacia de la purificación de flujo pasante de un eluato capturado por afinidad (Proteína A). El valor de reducción del log (LRV) de la proteína de la célula huésped (HCP) era 1,87 cuando se colocaba el carbón activado en frente del medio de intercambio aniónico. El LRV de HCP se redujo a 1,38 cuando el medio de intercambio aniónico se colocó en frente del carbón activado. El orden el carbón activado y el medio de intercambio aniónico no tenía influencia en la recuperación del anticuerpo, que era del 97% para ambos órdenes de
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Tabla XV
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MAb I (mg/mL) imagen49 HCP (ng/mL) HCP (ppm) LRV de HCP
sal añadida
antes A.C. Después A.C. recuperación de MAb I antes A.C. Después A.C. antes A.C. Después A.C.
solo agua (control)
7,33 6,86 94% 987 76 135 11 1,08
Tris
6,99 6,68 96% 1,194 119 171 18 0,98
Cloruro sódico
6,58 6,33 96% 1,151 111 175 17 1,00
sulfato de amonio
6,93 6,66 96% 1,359 177 196 27 0,87
fosfato de disodio
6,92 6,59 95% 1,293 153 187 23 0,90
citrato de sodio
6,53 6,03 92% 1,351 241 207 40 0,71
EDTA
6,71 6,39 95% 1,304 293 194 46 0,63
MES
6,90 6,54 94% 1,110 132 161 20 0,90

Ejemplo 19. Purificación por flujo pasante de eluato de Proteína A a pH 5 y pH 7
Se examinó el carbón activado en una aplicación de flujo pasante para la eliminación de impurezas de un eluato de
5 anticuerpo monoclonal capturado por afinidad (Proteína A) a dos condiciones de pH diferentes para demostrar que el carbón activado proporciona un método único e inesperadamente eficaz para la eliminación por flujo pasante de impurezas a diferentes condiciones de pH de la disolución. La investigación ilustra que este método es general y se puede aplicar a la purificación de proteínas en diferentes condiciones de pH.
Se preparó un eluato capturado por afinidad parcialmente purificado MAb I (Proteína A) según el Ejemplo 5. La 10 disolución es referida en la presente memoria como el eluato Proteína A MAb I pH5.
Una parte del eluato de MAb I preparado según el Ejemplo 5 se ajustó de aproximadamente pH 5 a pH 7 con base Tris (2 M) y se filtró a través de una unidad de filtro de 0,22 micras Millipore Express Plus Stericup. La disolución es referida en la presente memoria como el eluato Proteína A MAb I pH5.
Las columnas de cromatografía Omnifit (diámetro de 15 mm, longitud de 100 mm) se cargaron con 1,25 g de carbón
15 activado HD Nuchar en suspensión en agua para proporcionar un volumen de columna rellena de 5 mL. Las columnas se equilibraron con disolución tampón (tampón Tris-HCl, 25 mM, pH 7). A continuación se hacen pasar a través de la columna activada 500 mL del eluato de Proteína A MAb I de pH 5 o el eluato de Proteína A MAb I de pH 7 a un caudal de 1,25 mL/min. Después de pasar a través de los trenes de purificación, las disoluciones se analizaron con respecto a la concentración de proteína de la célula huésped (HCP) e IgG. El análisis HCP se realizó
20 usando un kit ELISA comercialmente disponible de Cygnus Technologies, Southport, NC, EE.UU., (número de catálogo F550), siguiendo las instrucciones del fabricante del kit. La concentración IgG se midió usando un sistema Agilent HPLC equipado con una columna analítica de Proteína A Poros® A. Los resultados se resumen en la Tabla
XVI.
Los resultados muestran que la purificación por flujo pasante de eluato de anticuerpo monoclonal capturado por
25 afinidad (Proteína A) con carbón activado era inesperadamente eficaz para la eliminación de impurezas tanto a pH 5 como a pH 7.El carbón activado eliminaba impurezas con valores de reducción del log (LRV) de proteína de la célula huésped (HCP) de 0,85 a pH 5 y 1,15 a pH 7. El carbón activado también tenía excelentes recuperaciones del anticuerpo monoclonal con 97% a pH 5 y 101% a pH 7. Estos resultados sugieren que se pueden usar diversos tipos diferentes de carbón activado para la eliminación de impurezas de disoluciones proteicas a diferentes condiciones
30 de pH.
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