KR20210118815A

KR20210118815A - 활성탄 재료를 사용하는 공정을 포함하는 항체 정제 방법

Info

Publication number: KR20210118815A
Application number: KR1020217018647A
Authority: KR
Inventors: 유미코 마스다; 유카 오기노; 고타 이노우에; 겐타 이즈미; 지에 무토
Original assignee: 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority date: 2019-01-23
Filing date: 2020-01-22
Publication date: 2021-10-01
Also published as: WO2020153390A1; US20220098235A1; EP3916001A1; EP3916001A4; AU2020213017A1; TW202045527A; CA3127174A1; JPWO2020153390A1; SG11202107192VA; CN113302197A

Abstract

항체의 정제에 있어서 제조 비용을 저감시키고, 정제 기간을 단축시키는 데다가, 상기 용액에 포함되는 불순물을 효율적으로 제거하여, 항체를 인간 치료용으로서 사용하기에 충분한 순도까지 확실하게 정제하는 방법의 제공. 활성탄 재료에 의해, 혼재하는 불순물의 양 또는 종류에 상관없이 안정적으로 고순도로 정제되고, 더욱 확실히 높은 바이러스 클리어런스능을 달성할 수 있는 것을 알아내어, CHO 세포를 사용한 항체 의약품의 정제 공정에 있어서 바이러스 클리어런스능을 갖는 AEX 크로마토그래피 공정의 대체로서 활성탄 재료에 의한 처리를 가능하게 하였다. 이로써 종래의 정제 방법과 비교하여, 인간 치료용으로서 사용하기에 충분한 순도까지, 게다가 제조 비용을 저감시키고, 단순하고 효율적으로 항체를 정제할 수 있다.

Description

활성탄 재료를 사용하는 공정을 포함하는 항체 정제 방법

본 발명은, 항체를 고순도로 정제하는 방법에 관련된 것이다.

최근, 의약품으로서의 모노클로널 항체에 대한 주목·기대가 현저하다. 항체는, 표적 항원에 대하여 특이적으로 결합하는 점에서, 높은 약효와 적은 부작용이 기대되고, 특히 항암제로서 주목받고 있다.

대부분의 항체 의약품은 CHO 세포를 숙주로 한 생산계에 의해 제조되고 있는데 (비특허문헌 1), 배양 상청에는, 목적 물질인 항체 외에, 숙주 세포 유래 불순물 (단백질, DNA 등), 목적 물질 유래 불순물 (응집체, 유연 (類緣) 물질 등), 및 바이러스형 입자가 함유되어 있다. 숙주 세포 유래 단백질 (Host cell protein ; HCP) 은, 인간에 대하여 이종 단백질로서 인식되어 항원성을 나타낼 뿐만 아니라, 조 (造) 종양성 리스크도 존재하는 것이 알려져 있다. 또, 숙주 세포 유래 DNA 에도 조종양성의 우려가 있다. 목적 물질 유래 불순물인 응집체는, 면역원성의 원인이 될 가능성이 있고, 단편체 및 목적 단백질의 번역 후 수식체에는 안전성이나 약효에 악영향을 미칠 우려가 있다. 추가로, 내재성 바이러스 및 내재성 바이러스 유래의 DNA 에는 감염성의 우려도 있다. 또, 외래성 바이러스의 혼입에 대한 대책도 필요하다. 대부분의 경우, 세포 기재 (예를 들어 주로 생산에 사용되는 CHO 세포), 배지 원재료, 조제 배지로부터의 외래성 바이러스 혼입 리스크의 회피에 다양한 연구를 집중시켜, 각종 in vitro 바이러스 시험, in vivo 바이러스 시험 등에서 제조 공정에 혼입될 가능성이 있는 대표적 바이러스의 혼입을 부정하는 것이 중요해진다. 또한, 대표적 모델 바이러스의 정제 프로세스에 있어서의 감쇠율 및 제거 성능을 평가함으로써, 최종적으로 얻어지는 원약 중의 바이러스 혼입 리스크를 한없이 저감시켜, 안전한 의약품의 제조를 실시하는 것이 필요하다. 그 때문에, 정제 프로세스에 있어서는, 목적 물질인 항체를 고수율로 회수하는 것에 추가하여, 불순물을 양호한 재현성으로 효과적으로 제거할 수 있는 정제 방법으로서 완성시키는 것이 필요하다.

항체의 정제 방법은, 상기 목적을 위해, 복수의 크로마토그래피를 포함하는 공정을 조합하여 구축된다. 일반적으로는, 프로테인 A 를 비롯한 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 세라믹하이드록시아파타이트 크로마토그래피 등이 사용된다. 이들 크로마토그래피는, 목적 물질과 불순물의 전하, 소수성의 정도, 혹은 분자 사이즈, 또는 목적 물질과 고정화된 리간드 사이의 특이적 결합 작용에 기초하여, 숙주 세포 유래 불순물, 목적 물질 유래 불순물, 침출 프로테인 A, 바이러스형 입자 등을 효율적으로 분리하여, 제거할 수 있다.

특히, 항체 정제법의 일반적인 크로마토그래피 수법으로서, 프로테인 A 크로마토그래피, 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피 및 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피의 3 스텝을 조합하여 항체를 고순도로 정제하는 예가 많이 보고되어 있다. 이들 크로마토그래피는, 일반적으로 결합/용출 (B/E) 모드 또는 플로 스루 (F/T) 모드를 사용하여 실시된다. 그 중에서도, 프로테인 A 크로마토그래피 및 CEX 크로마토그래피에 있어서는, 목적 물질인 항체를 수지 등에 흡착시킨 후, 적절한 조건에서 불순물과의 분리를 실시하는 B/E 모드가 범용되고, 상기 불순물 중 내재성 바이러스를 포함하는 바이러스의 제거능 이외에는 고도로 목적 물질을 정제하는 것을 가능하게 하였다. 그러나, B/E 모드에서는 목적 물질을 수지 등에 흡착시키기 때문에, 대량의 수지 및 대형의 칼럼이 필요해져, 제조 비용이 비싼 한 원인이 되고 있었다.

한편으로, 기술의 진전과 함께 최근 CEX 크로마토그래피에서는, 오버로드 모드를 포함하는 F/T 모드에 의한 정제 수법의 예가 보고되어 있다. 목적 물질과 비교하여 혼입량이 적은 불순물을 수지 등에 흡착시킨 상태에서 목적 물질인 항체를 패스 스루시킴으로써, 칼럼의 소형화와 작업 공정의 간소화, 효율화를 실현하고, 그 결과, 크로마토그래피 수지의 사용량의 저감에 의한 비용 삭감도 달성할 수 있을 가능성이 시사되어 있다. 실제로, 지금까지의 B/E 모드에서는 고성능 수지를 사용하였다고 하더라도 100 g/ℓ 수지 이하에서의 사용 조건이었던 반면, F/T 모드에서는 그 10 배량인 1000 g/ℓ 수지를 초과하는 조건에 의해서도 목적 물질의 정제에 이용할 수 있다. 즉, 1/10 이하의 수지 용량으로 동등한 정제 성능을 끌어낼 수 있는 점에서, 칼럼의 소형화, 저비용화로 이어질 것이 기대된다. 이와 같은 칼럼의 소형화는, 사용 버퍼량의 삭감 및 각종 탱크 용량의 사이즈 다운으로도 이어져, 작업 부하의 대폭 저감에 의한 제조 효율화에 기여한다고 보고되어 있다 (특허문헌 1, 비특허문헌 2 및 비특허문헌 3). 그러나, 고효율 정제 공정으로서 기대되는 CEX 크로마토그래피의 F/T 모드는, 혼재하는 불순물을 소량의 수지 등에 흡착시켜 분리 제거하는 점에서, B/E 모드와 비교하여, 혼재하는 불순물의 양 혹은 종류에 따라 분리능이 영향을 받는 것이 과제였다.

또한 최근, 배양 공정에 있어서의 생산성의 향상에 의해, 많은 생성물이 크로마토그래피 칼럼에 로드되어, 크로마토그래피 칼럼에 대한 부담이 증가하고 있다. 이에 대하여, 고효율 정제 공정으로서 기대되는 AEX 크로마토그래피 및 CEX 크로마토그래피의 F/T 모드에 활성탄 재료를 조합함으로써, HCP 를 포함하는 복수의 불순물이 저감되고, 결과적으로 크로마토그래피 칼럼의 사용 기간을 연장시키는 것이 보고되어 있다 (특허문헌 2).

그러나, 이들 보고는, 일반적인 숙주 세포 유래 불순물 (단백질, DNA) 및 목적 물질 유래 불순물 (응집체, 유연 물질 등) 을 제거할 수 있을 가능성에만 한정되어 있어, 본래의 정제 프로세스로서 요망되는 숙주 세포 유래 불순물 및 목적 물질 유래 불순물의 보다 확실한 제거, 그리고 내재성 및 외래성 바이러스의 보다 확실하고 또한 저렴한 제거를 실현하는 구체적인 정제 프로세스가 요망되고 있었다.

국제공개 제WO2011/150110호 국제공개 제WO2013/028330호

Reichert, J. (2012). Marketed therapeutic antibodies compendium. MABs 4 : 3, 413-415. Brown, A., Bill, J., Tully, T., Radhamohan, A., & Dowd, C. (2010). Overloading ion-exchange membranes as a purification step for monoclonal antibodies. Biotechnol. Appl. Biochem., 56 : 59-70. Liu, H.F., McCooey, B., Duarte, T., Myers, D.E., Hudson, T., Amanullah, A., van Reis, R., & Kelley, B.D. (2011). Exploration of overloaded cation exchange chromatography for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. A., 1218, 6943-6952.

고효율 정제 공정으로서 기대되는 CEX 크로마토그래피의 F/T 모드에서는, B/E 모드와 비교하여, 혼재하는 불순물의 양이나 종류가 분리능에 영향을 주는 것이 과제였다. 또, AEX 크로마토그래피 및 CEX 크로마토그래피의 F/T 모드에 활성탄 재료를 조합한 항체 정제 방법은, 크로마토그래피 칼럼의 사용 기간을 연장시킬 수는 있지만, 정제 스텝수가 많은 것이 과제였다. 즉, 프로테인 A 크로마토그래피, AEX 크로마토그래피 및 CEX 크로마토그래피의 3 스텝의 크로마토그래피에 추가하여, 활성탄 재료에 의한 처리를 실시하는 점에서, 정제 스텝수가 많고, 그것에 의해 제조 비용이 비싸지고, 또 정제 기간이 길어진다. 또, 저비용화를 목표로 한 정제 프로세스의 공정 간략화에 있어서는, 숙주 세포 유래 불순물 및 목적 물질 유래 불순물의 제거능의 저하 뿐만 아니라, 내재성 및 외래성 바이러스 클리어런스능의 저하가 우려된다. 따라서, 보다 확실한 불순물의 제거, 특히 내재성, 외래성 바이러스 클리어런스는 중요한 과제이다. 상기 과제의 해결은 저비용 또한 고효율의 항체 의약품의 제조 방법의 제공 뿐만 아니라, 고품질의 항체 의약품의 안정 공급으로 이어지고, 결과적으로 환자의 안전성의 확보가 달성되기 때문에, 산업상 매우 중요하다.

본원 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 종래의 정제 방법과 동등한 품질을 유지하는 데다가, 정제의 스텝수를 저감시키는 효율적인 정제 방법을 알아냈다. 즉, CEX 크로마토그래피의 F/T 모드에 활성탄 재료에 의한 처리를 조합함으로써, 활성탄 재료에 의해 불순물이 저감되고, 저렴하게 이용할 수 있을 것이 기대되는 한편으로 혼재하는 불순물의 양 또는 종류에 따라 분리능이 저하되는 것이 과제였던 CEX 크로마토그래피의 F/T 모드에 있어서, 안정적으로 또한 고순도로 목적 항체 의약품 등을 정제할 수 있는 것을 알아냈다. 또, 본원 발명자들은, 활성탄 재료에 의해 바이러스가 확실히 제거되는 것을 알아내어, CHO 세포를 사용한 항체 의약품의 정제 공정에 있어서 높은 바이러스 클리어런스능을 갖는 AEX 크로마토그래피 공정의 기능을 보완하고, 결과적으로 AEX 크로마토그래피 공정의 생략을 가능하게 하는 제조 프로세스를 구축하였다. 즉, 본원 발명자들은, 프로테인 A 크로마토그래피 및 CEX 크로마토그래피의 F/T 모드의 2 스텝의 크로마토그래피에 활성탄 재료에 의한 처리를 조합한 효율적인 정제 방법을 알아내어, 종래의 정제 방법과 비교하여 정제 스텝수 및 제조 비용을 저감시키고, 항체를 인간 치료 용도에 충분한 품질까지 효율적으로 정제하는 것을 가능하게 하여, 본 발명을 완성시켰다.

즉 본 발명은 이하와 같다.

[1] 항체를 하나 또는 복수의 불순물을 포함하는 조성물로부터 정제하기 위한 수법으로서,

a1. 항체를 함유하는 세포 배양 상청을 준비하고,

b1. 상기 세포 배양 상청을 어피니티 크로마토그래피 수지에 의해 처리하여, 항체를 포함하는 어피니티 크로마토그래피 풀액을 얻고,

c1. 상기 어피니티 크로마토그래피 풀액에 있어서 바이러스를 불활화하여, 바이러스 불활화액을 얻고,

d1. 상기 바이러스 불활화액을 활성탄 재료에 의해 처리하여, 활성탄 재료 풀액을 얻고,

e1. 상기 활성탄 재료 풀액을 양이온 교환 재료에 의해 처리하여, 양이온 교환 재료 풀액을 얻는다

의 a1. 내지 e1. 의 공정을 포함하는 방법.

[2] 항체를 하나 또는 복수의 불순물을 포함하는 조성물로부터 정제하기 위한 수법으로서,

a2. 항체를 함유하는 세포 배양 상청을 준비하고,

b2. 상기 세포 배양 상청을 어피니티 크로마토그래피 수지에 의해 처리하여, 항체를 포함하는 어피니티 크로마토그래피 풀액을 얻고,

c2. 상기 어피니티 크로마토그래피 풀액에 있어서 바이러스를 불활화하여, 바이러스 불활화액을 얻고,

d2. 상기 바이러스 불활화액을 뎁스 필터에 의해 처리하여, 뎁스 필터 여과 풀액을 얻고,

e2. 상기 뎁스 필터 여과 풀액을 활성탄 재료에 의해 처리하여, 활성탄 재료 풀액을 얻고,

f2. 상기 활성탄 재료 풀액을 양이온 교환 재료에 의해 처리하여, 양이온 교환 재료 풀액을 얻는다

의 a2. 내지 f2. 의 공정을 포함하는 [1] 에 기재된 방법.

[3] 어피니티 크로마토그래피 수지가 프로테인 A 수지인 [1] 또는 [2] 에 기재된 방법.

[4] 프로테인 A 수지가, KanCapA, KanCapA3G, MabSelect SuRe, MabSelect SuRe pcc, MabSelect PrismA, 또는 Amsphere A3 인 [3] 에 기재된 방법.

[5] 바이러스 불활화가, 산, 계면 활성제, 화학 물질, 핵산 가교제, 자외선, 감마선 및 열에 의한 처리로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나인, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[6] 바이러스 불활화가, 어피니티 크로마토그래피 풀액의 pH 를 3 ∼ 4 로 저하시키는 것을 포함하는 [5] 에 기재된 방법.

[7] 바이러스 불활화 중에, 어피니티 크로마토그래피 풀액을 60 ∼ 120 분간 인큐베이트하는 [6] 에 기재된 방법.

[8] 바이러스 불활화 중에, 어피니티 크로마토그래피 풀액을 15 ∼ 30 ℃ 에서 인큐베이트하는 [6] 또는 [7] 에 기재된 방법.

[9] 활성탄 재료에 로드하는 용액, 활성탄 재료의 평형화 버퍼 및 세정 버퍼의 pH 가, 4.5 ∼ 7.5 인 [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[10] 활성탄 재료에 로드하는 용액, 활성탄 재료의 평형화 버퍼 및 세정 버퍼의 pH 가, 4.5 ∼ 5.5 인 [9] 에 기재된 방법.

[11] 활성탄 재료에 로드하는 용액, 활성탄 재료의 평형화 버퍼 및 세정 버퍼의 전기 전도도가, 2 ∼ 10 mS/㎝ 인 [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[12] 활성탄 재료에 로드하는 용액, 활성탄 재료의 평형화 버퍼 및 세정 버퍼의 전기 전도도가, 2 ∼ 5 mS/㎝ 인 [11] 에 기재된 방법.

[13] 활성탄 재료에 의한 처리가, 활성탄 재료를 포함하는 필터를 사용하여 실시되는, [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[14] 필터가, Millistak＋ Pod CR40, Zeta Plus 활성탄 흡착 뎁스 필터, 또는 SUPRAcap 50 Seitz AKS filter 인 [13] 에 기재된 방법.

[15] 양이온 교환 재료에 대하여, 활성탄 재료 풀액이, 그 양이온 교환 재료의 흡착 용량을 초과하여 로드되는 [1] 내지 [14] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[16] 양이온 교환 재료에 대한 활성탄 재료 풀액의 로딩 밀도가, 500 ∼ 2000 g/ℓ 인 [15] 에 기재된 방법.

[17] 양이온 교환 재료에 대한 활성탄 재료 풀액의 로딩 밀도가 1000 ∼ 1500 g/ℓ 인 [16] 에 기재된 방법.

[18] 양이온 교환 재료가, 수지, 모놀리스 칼럼, 또는 막인 [1] 내지 [17] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[19] 양이온 교환 재료의 관능기가, 술포프로필, 술포에틸, 술포이소부틸, 또는 카르복실인 [18] 에 기재된 방법.

[20] 양이온 교환 재료가, POROS XS, Eshmuno CPX, Eshmuno CP-FT, 또는 CaptoS ImpAct 인 [19] 에 기재된 방법.

[21] 양이온 교환 재료에 로드하는 용액의 pH 가, 4 ∼ 6 인 [1] 내지 [20] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[22] 양이온 교환 재료에 로드하는 용액의 pH 가, 4.5 ∼ 5.5 인 [21] 에 기재된 방법.

[23] 양이온 교환 재료에 로드하는 용액의 전기 전도도가, 3 ∼ 7 mS/㎝ 인 [1] 내지 [22] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[24] 양이온 교환 재료에 로드하는 용액의 전기 전도도가, 3 ∼ 5 mS/㎝ 인 [23] 에 기재된 방법.

[25] 양이온 교환 재료 풀액을, 추가로 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 의해 처리하여, 풀액을 얻는 [1] 내지 [24] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[26] 소수성 상호 작용 크로마토그래피가, 플로 스루 모드인 [25] 에 기재된 방법.

[27] 소수성 상호 작용 크로마토그래피가, 수지 또는 막을 사용하여 실시되는 [26] 에 기재된 방법.

[28] 소수성 상호 작용 크로마토그래피 수지 또는 막이, 페닐 (Phenyl) 기, 벤질 (Benzyl) 기 또는 헥실 (Hexyl) 기를 갖는 [27] 에 기재된 방법.

[29] 소수성 상호 작용 크로마토그래피 재료가, POROS Benzyl Ultra, POROS Benzyl, Hexyl-650C, Phenyl Sepharose 6 Fast Flow, Phenyl Sepharose High Performance, Sartobind Phenyl 또는 ReadyToProcess Adsorber Phenyl 인 [28] 에 기재된 방법.

[30] 활성탄 재료 풀액을, 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 의해 처리하여, 풀액을 얻고, 추가로 양이온 교환 재료에 의해 처리하여, 풀액을 얻는 [1] 내지 [14] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[31] 소수성 상호 작용 크로마토그래피가, 플로 스루 모드인 [30] 에 기재된 방법.

[32] 소수성 상호 작용 크로마토그래피가, 수지 또는 막을 사용하여 실시되는 [31] 에 기재된 방법.

[33] 소수성 상호 작용 크로마토그래피 수지 또는 막이, 페닐 (Phenyl) 기, 벤질 (Benzyl) 기 또는 헥실 (Hexyl) 기를 갖는 [32] 에 기재된 방법.

[34] 소수성 상호 작용 크로마토그래피 재료가, POROS Benzyl Ultra, POROS Benzyl, Hexyl-650C, Phenyl Sepharose 6 Fast Flow, Phenyl Sepharose High Performance, Sartobind Phenyl 또는 ReadyToProcess Adsorber Phenyl 인 [33] 에 기재된 방법.

[35] 양이온 교환 재료에 대하여, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 풀액이, 그 양이온 교환 재료의 흡착 용량을 초과하여 로드되는 [30] 내지 [34] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[36] 양이온 교환 재료에 대한 소수성 상호 작용 크로마토그래피 풀액의 로딩 밀도가, 500 ∼ 2000 g/ℓ 인 [35] 에 기재된 방법.

[37] 양이온 교환 재료에 대한 소수성 상호 작용 크로마토그래피 풀액의 로딩 밀도가 1000 ∼ 1500 g/ℓ 인 [36] 에 기재된 방법.

[38] 양이온 교환 재료가, 수지, 모놀리스 칼럼, 또는 막인 [30] 내지 [37] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[39] 양이온 교환 재료의 관능기가, 술포프로필, 술포에틸, 술포이소부틸, 또는 카르복실인 [38] 에 기재된 방법.

[40] 양이온 교환 재료가, POROS XS, Eshmuno CPX, Eshmuno CP-FT, 또는 CaptoS ImpAct 인 [39] 에 기재된 방법.

[41] 양이온 교환 재료에 로드하는 용액의 pH 가, 4 ∼ 6 인 [30] 내지 [40] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[42] 양이온 교환 재료에 로드하는 용액의 pH 가, 4.5 ∼ 5.5 인 [41] 에 기재된 방법.

[43] 양이온 교환 재료에 로드하는 용액의 전기 전도도가, 3 ∼ 7 mS/㎝ 인 [30] 내지 [42] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[44] 양이온 교환 재료에 로드하는 용액의 전기 전도도가, 3 ∼ 5 mS/㎝ 인 [43] 에 기재된 방법.

[45] 적어도 하나의 불순물이, 숙주 세포 유래 단백질 (Host cell protein ; HCP), 포스포리파아제 B 유사 단백질 2 (phospholipase B-like 2, PLBL2), 바이러스, 바이러스형 입자, 고분자량체 (high molecular weight species ; HMWS), 저분자량체 (low molecular weight species ; LMWS), 배지 성분, 침출 프로테인 A 및/또는 DNA 로 이루어지는 군에서 선택되는 [1] 내지 [44] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[46] 공정이 연속적인 [1] 내지 [45] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[47] [1] 내지 [46] 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 정제된 항체.

[48] 항체를 하나 또는 복수의 불순물을 포함하는 조성물로부터 정제하기 위한 수법으로서,

a1. 항체를 함유하는 세포 배양 상청을 준비하고,

d1. 상기 바이러스 불활화액을 활성탄 재료에 의해 처리하여, 활성탄 재료 풀액을 얻는다

의 a1. 내지 d1. 의 공정을 포함하고, 공정 d1 을 실시함으로써 PLBL2 클리어런스능이 향상되는, 방법.

[49] 항체를 하나 또는 복수의 불순물을 포함하는 조성물로부터 정제하기 위한 수법으로서,

a2. 항체를 함유하는 세포 배양 상청을 준비하고,

e2. 상기 뎁스 필터 여과 풀액을 활성탄 재료에 의해 처리하여, 활성탄 재료 풀액을 얻는다

의 a2. 내지 e2. 의 공정을 포함하고, 공정 e2 를 실시함으로써 PLBL2 클리어런스능이 향상되는, 방법.

[50] 항체를 하나 또는 복수의 불순물을 포함하는 조성물로부터 정제하기 위한 수법으로서,

a1. 항체를 함유하는 세포 배양 상청을 준비하고,

의 a1. 내지 e1. 의 공정을 포함하고, 공정 d1 을 실시함으로써 PLBL2 클리어런스능이 향상되는, 방법.

[51] 항체를 하나 또는 복수의 불순물을 포함하는 조성물로부터 정제하기 위한 수법으로서,

a2. 항체를 함유하는 세포 배양 상청을 준비하고,

의 a2. 내지 f2. 의 공정을 포함하고, 공정 e2 를 실시함으로써 PLBL2 클리어런스능이 향상되는, 방법.

본원 발명자들은, 종래까지의 항체 정제 프로세스에 활성탄 재료에 의한 처리를 추가함으로써, 후단의 정제 공정에 대한 불순물 부하를 저감시키고, 혼재하는 불순물의 양 또는 종류에 상관없이, 항체를 안정적으로 목표로 하는 순도로까지 정제할 수 있는 것을 알아냈다. 또한, 본원 발명자들은, 활성탄 재료에 의한 처리로 높은 바이러스 클리어런스능을 달성할 수 있는 것을 알아내어, CHO 세포를 사용한 항체 의약품의 정제 공정에 있어서 바이러스 클리어런스능을 갖는 AEX 크로마토그래피 공정의 기능을 보완하고, 결과적으로 AEX 크로마토그래피의 생략을 가능하게 하는 제조 프로세스를 구축하였다. 이로써 종래의 정제 방법과 비교하여 정제 스텝수 및 제조 비용을 저감시키고, 인간 치료에 사용하기에 충분한 순도까지 효율적으로 항체를 정제할 수 있었다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

1. 정의

본 명세서에 있어서,「항체」라는 용어는, 모노클로널 항체, 폴리클로널 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 적어도 2 개의 인택트한 항체로 형성되는 다중 특이성 항체 (이중 특이성 항체), Fc 융합 단백질, 및 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편 등을 의미한다. 또한, 본 발명을 적용 가능한 항체는, 그 항체가 특이적으로 결합하는 항원에 의해 한정되는 것은 아니다. 또, 본 발명을 적용 가능한 항체는, 그 항체의 아미노산 서열에 의해 한정되는 것도 아니다.

본 명세서에 있어서,「결합/용출 (B/E) 모드」라는 용어는, 시료 중에 포함되는 적어도 1 개의 생성물이 크로마토그래피 수지 또는 매체에 결합하고, 그 후 용출되는 생성물 분리 기술을 의미한다.

본 명세서에 있어서,「플로 스루 (F/T) 모드」라는 용어는, 시료 중의 적어도 1 개의 생성물이 크로마토그래피 수지 또는 매체를 통과하며 유동하는 것을 의도하지만, 적어도 1 개의 잠재적인 성분이 크로마토그래피 수지 또는 매체에 결합하는 생성물 분리 기술을 의미한다.

본 명세서에 있어서,「오버로드 모드」라는 용어는, 칼럼 등의 흡착 용량을 초과하여 로드하는 것을 의도하며, 목적 물질과 불순물의 흡착량의 강도의 차를 이용한 생성물 분리 기술을 의미한다. 본 명세서에 있어서는, 양이온 교환 재료에 대하여, 항체 조 (粗) 정제물이, 그 양이온 교환 재료의 흡착 용량을 초과하여 로드된다. 양이온 교환 재료에 대한 항체 조정제물의 흡착 용량은, 양이온 교환 재료 1 ℓ 당 약 100 g 의 단백질량이다. 오버로드 모드에 있어서의 로딩 밀도는, 양이온 교환 재료 1 ℓ 당 150 ∼ 4000 g 의 단백질량이지만, 바람직한 로딩 밀도는 500 ∼ 2000 g/ℓ 의 범위이고, 더욱 바람직한 로딩 밀도는 1000 ∼ 1500 g/ℓ 의 범위이다.

본 명세서에 있어서,「어피니티 크로마토그래피」라는 용어는, 표적 단백질 (예를 들어, 목적으로 하는 Fc 영역을 함유하는 단백질 또는 항체) 이, 표적 단백질에 특이적인 리간드에 특이적으로 결합되는 단백질 분리 기술을 가리킨다. 항체를 정제하는 경우에는, 그러한 리간드는, 프로테인 A 혹은 프로테인 G 또는 그 기능적 변이체이며, 이것은 크로마토그래피 고상 재료에 공유 결합하고, 항체 용액이 크로마토그래피 고상 재료와 접촉할 때에 용액 중의 항체와 결합한다.

본 명세서에 있어서,「뎁스 필터」라는 용어는, 항체 용액으로부터 입자를 제거할 목적으로 사용되는, 점차 감소하는 공경을 갖는 연속적으로 배치된 일련의 필터를 의미한다. 뎁스 필터의 삼차원 매트릭스는 항체 용액이 통과하는 미로상 경로를 형성하고, 그 매트릭스의 깊이 전체에 걸쳐서 랜덤하게 입자를 흡착하여 기계적으로 포착한다. 다양한 뎁스 필터는, 감겨진 면, 폴리프로필렌, 레이온셀룰로오스, 유리 섬유, 소결 금속, 자기, 규조토 또는 다른 공지 성분으로 구성된다.

본 명세서에 있어서,「양이온 교환 재료」또는「CEX (; cation exchange) 재료」라는 용어는 호환적으로 사용되며, 부 (負) 로 하전되고, 이렇게 하여, 고상 상을 또는 고상 중을 통과한 수성 용액 중의 양이온과의 교환을 위한 유리 양이온을 갖는 고상을 의미한다.

본 명세서에 있어서,「음이온 교환 재료」또는「AEX (; anion exchange) 재료」라는 용어는 호환적으로 사용되며, 고상에 결합한, 제 1 급, 제 2 급, 제 3 급 또는 제 4 급 아미노기 등의 하나 또는 복수의 정 (正) 으로 하전된 리간드를 갖는, 정으로 하전된 고상을 의미한다.

본 명세서에 있어서,「소수성 상호 작용 크로마토그래피」또는「HIC (; Hydrophobic Interaction Chromatography)」라는 용어는, 분자의 소수성, 즉, 수성 용액으로부터 소수성 표면에 흡착되는 분자의 능력에 기초하여 분자를 분리하기 위한 프로세스를 의미한다. 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 전형적으로는, 용질 분자의 표면 상의 소수성기의 차이에 의존한다. 이들 소수성기는, 불용성 매트릭스의 표면 상의 소수성기에 결합하는 경향을 갖는다. HIC 는 역상 액체 크로마토그래피보다 극성이 높고, 변성이 적은 환경을 사용하기 때문에, 종종 이온 교환 또는 겔 여과 크로마토그래피와 조합함으로써, 항체 정제에 있어서 일반적으로 사용된다.

본 명세서에 있어서,「활성탄 재료」라는 용어는, 탄소로 구성된 또는 탄소를 함유하는 임의의 물질, 활성탄을 의미한다. 「활성탄 (activated carbon)」은, 그 세공 구조를 강화하기 위해 처리된 탄소질 재료를 의미한다. 활성탄은, 매우 높은 표면적을 갖는 다공질의 고체이다. 이것들은 석탄, 목재, 야자 껍질, 나무 열매의 껍질, 이탄 (泥炭) 을 비롯한 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있다. 활성탄은, 제어된 환경하에서의 가열을 수반하는 물리적인 활성화, 또는 강산, 염기, 또는 산화제를 사용하는 화학적 활성화를 사용하여, 이들 재료로부터 제조할 수 있다. 활성화 방법은, 높은 불순물 클리어런스능을 활성탄에 부여하기 위한 높은 표면적을 갖는 다공질 구조를 만들어 낸다. 대부분의 다른 흡착 재료와는 대조적으로, 활성탄은, 비교적 약한 반데르발스 힘을 사용하여 분자와 상호 작용을 하는 것으로 생각되고 있다. 본 발명의 정제 방법에 사용되는 활성탄으로는, 1 종류의 활성탄을 단독으로 사용해도 되고, 2 종류 이상의 활성탄을 단독으로 또는 혼합하여 사용해도 된다.

본 명세서에 있어서,「연속적」이라는 용어는, 직접 연결된 각 재료 간에서 연속적인 흐름을 가능하게 하는 어떠한 다른 기구를 갖는 것을 의미한다. 즉, 1 개의 프로세스 스텝으로부터의 출력이, 개입없이 프로세스 중의 다음의 프로세스 스텝으로 직접 유동하는 2 개 이상의 프로세스 스텝 (또는 단위 조작) 을 포함하고, 2 개 이상의 프로세스 스텝을 그 기간의 적어도 일부에 대해 동시에 실시할 수 있는, 목적 물질을 정제하기 위한 프로세스를 의미한다.

본 명세서에 있어서,「제거」,「저감」,「클리어런스」라는 용어는 호환적으로 사용되며, 정제되어야 할 항체를 포함하는 시료 중의 1 개 이상의 불순물량을 저하시키는 것을 의미한다.

본 명세서에 있어서,「정제」,「순도를 높이는 것」이라는 용어는 호환적으로 사용되며, 시료로부터 1 개 이상의 불순물을 제거함으로써, 시료 중의 1 개 이상의 불순물에 대한 표적 항체의 비를 증가시키는 것을 의미한다.

본 명세서에 있어서,「전기 전도도」라는 용어는, 2 개의 전극 간에 전류를 전도하는 수용액의 능력을 의미한다. 용액 중에서, 전류는 이온 수송에 의해 흐른다. 따라서, 수용액 중에 존재하는 이온의 양이 증가하면 용액은 보다 높은 전기 전도도를 갖게 된다. 전기 전도도는, 전기 전도도 측정기를 사용하여 측정할 수 있고, 전기 전도도의 측정 단위는 1 센티미터당의 밀리지멘스 (mS/㎝ 또는 mS) 이다. 용액의 전기 전도도는, 그 중의 이온의 농도를 변화시킴으로써 변경할 수 있다. 예를 들어, 용액 중의 완충액의 농도 및/또는 염의 농도는, 원하는 전기 전도도를 달성하기 위해 변경할 수 있다. 바람직하게는, 다양한 완충액의 염 농도는 원하는 전기 전도도를 달성하도록 수정된다.

본 명세서에 있어서,「획분」라는 용어는, 예를 들어 활성탄 재료에 시료를 부하하는 공정에 있어서, 표적 항체를 포함하는 시료를 제공한 후에 수집된 소용량의 액체를 의미한다.

본 명세서에 있어서,「HCP ; host cell protein」이라는 용어는, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 배양액으로부터 유도된 숙주 세포 유래 단백질의 혼합물을 의미한다. HCP 는 일반적으로는 CHO 세포 중에서 발현된 항체 등의 목적으로 하는 단백질을 포함하는 세포 배양액 중에 불순물로서 존재한다.

본 명세서에 있어서「HMWS ; high molecular weight species」라는 용어는, 분자량이 상이한 항체 변이체 중, 단량체보다 고분자량 영역측에 용출되는 것을 의미한다.

본 명세서에 있어서「LMWS ; low molecular weight species」라는 용어는, 분자량이 상이한 항체 변이체 중, 단량체보다 저분자량 영역측에 용출되는 것을 의미한다.

본 명세서에 있어서,「바이러스」라는 용어는, 살아 있는 세포의 내부에서만 복제할 수 있는 소형의 감염체 또는 입자를 의미한다. 이것들은 일반적으로, 단백질의 캡시드의 내측에 봉입된 핵산 (RNA 또는 DNA), 및 경우에 따라 지질 엔벨로프로 구성된다.

본 명세서에 있어서,「바이러스형 입자」라는 용어는, 전자 현미경하에서 형태적으로 이미 알려진 바이러스와의 관련성이 엿보이는 구조체를 의미한다.

본 명세서에 있어서,「레트로바이러스」라는 용어는, 역전사된 DNA 중간체를 통하여 감염된 세포의 게놈 DNA 에 그 유전 정보를 통합하는 것이 가능한 RNA 바이러스를 의미한다.

본 명세서에 있어서,「레트로바이러스형 입자」라는 용어는, 그 게놈 중에 레트로바이러스 유래의 DNA 의 부분을 갖는 세포에 의해 생성된 입자를 의미한다. 이들 입자는 레트로바이러스와 유사하지만 대부분의 경우, 비감염성이다. 본 명세서의 실시예에서 사용되는 마우스 백혈병 바이러스 (MLV) 는, 모델 레트로바이러스 또는 레트로바이러스형 입자를 나타낸다.

본 명세서에 있어서,「파보바이러스」라는 용어는, 5000 뉴클레오티드의 평균 게놈 사이즈 및 18 내지 26 ㎚ 의 직경을 갖는, 직사슬, 비세그먼트화 1 본쇄 DNA 비엔벨로프 바이러스를 가리킨다. 본 명세서에 기재되어 있는 방법에 있어서 사용되는 전형적인 파보바이러스는 마우스 미소 바이러스 (MMV) 이다.

본 명세서에 있어서,「대수 제거값」또는「LRV」라는 용어는, 이미 알려진 양의 불순물을 칼럼, 필터 등에 통과시켰을 때에 칼럼, 필터 등에 의한 불순물의 제거 능력을 나타내는 값이다. Cf 가 피드액 중의 불순물의 농도이고, Cp 가 칼럼, 필터를 통과한 후의 불순물의 농도일 때, LRV ＝ log(Cf) － log(Cp) 이다.

본 명세서에 있어서,「배지 성분」으로는, 혈청, 성장 인자 (인슐린 등), 또는 항생 물질 등을 들 수 있다.

2. F/T 모드 CEX 크로마토그래피에 의한 HCP 의 제거

특허문헌 1, 비특허문헌 2 및 비특허문헌 3 에 개시되는 선행 기술에 따라서, 프로테인 A 크로마토그래피, AEX 크로마토그래피에 계속해서, F/T 모드 CEX 크로마토그래피로 항체 배양액을 정제한 결과, 항체종 (숙주 세포, 혹은 배양 방법의 차이에 따른 혼재하는 불순물의 양이나 종류의 차이를 포함한다) 에 따라서는 HCP 를 충분히 제거할 수 없는 예가 있는 것을 알 수 있었다. 프로테인 A 크로마토그래피, AEX 크로마토그래피에 계속해서, F/T 모드 CEX 크로마토그래피로 이루어지는 프로세스는, 비용, 노력 및 작업 시간의 면에서는 우수하였지만, 불순물, 특히 HCP 의 제거라는 점에서 효과가 안정적이지 않은 것이 밝혀졌다.

HCP 는 다양한 기구를 통하여 면역원성을 유도할 가능성이 있는 것이 널리 알려져 있다. 실제로, 소마트로핀의 바이오 후속품의 임상 시험에 있어서, HCP 의 잔류에 의해 환자의 전부에게서 항 HCP 항체가 산생되고, 환자의 최대 60 ％ 에게서 비중화 항소마트로핀 항체가 산생된 보고가 있다 (M. Pavlovic et al., Horm. Res. 69 : 14-21 (2008)). HCP 를 추가로 제거함으로써 항소마트로핀 항체는 다른 성장 호르몬 항체에서 보고되어 있는 정도로 개선되었다. 또, CHO 세포로 산생시킨 재조합 제 IX 인자의 임상 시험에 있어서, 항 HCP 항체가 상당한 높은 비율로 산생되고, 유해 사상은 보고되지 않았지만 규제 당국으로부터 보류 명령을 받은 것이 보고되어 있다 (https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/BloodBloodProducts/ApprovedProducts/LicensedProductsBLAs/FractionatedPlasmaProducts/UCM448429.pdf

Food and Drug Administration

STATISTICAL REVIEW AND EVALUATION BLA FINAL, Product Name : IB1001, Indication (s) : Control and prevention of bleeding episodes and perioperative management in patients with hemophilia B, CBER Receipt Date : Apr 6 2012

또는 https://www.news-medical.net/news/20120710/Inspiration-receives-FDA-clinical-hold-order-for-IB1001-phase-III-studies-on-hemophilia-B.aspx

News-Medical.net - An AZoNetwork Site

Inspiration receives FDA clinical hold order for IB1001 phase III studies on hemophilia B, Jul 10 2012).

안전성에 관련된 유해 사상이 보고되는 경우는 물론, 안전성에 관련된 유해 사상이 보고되지 않은 경우에도 규제 당국은 잠재적 리스크의 가능성을 고려하여, 잔류하는 HCP 를 더욱 저감시킨 후, 임상 시험을 실시하도록 지시할 가능성이 있다. 또한 최근, 잔류하는 HCP (리포프로테인리파아제) 에 의해 제제 중의 폴리소르베이트가 분해되어, 의약품의 안정성에 영향을 준 예가 보고되어 있고 (T Hall et al., J. Chromatogr. A 105 : 1633-1642 (2016)), 의약품의 안정성의 면에서도 정제 공정에서 적절히 HCP 를 제거하는 것이 중요하다.

HCP 의 잔류에 의한 안전성 및 안정성에 대한 영향에 대해서는, 숙주 세포의 종류나 잔류하는 HCP 의 종류에 추가하여, 제품의 용법·용량에 따라서도 상이한 것으로 생각된다. 따라서 HCP 의 잔류 허용값에 대해서는, 제조 공정, 최대 투여량, 투여 부위, 투여 빈도 등을 고려하여, 제품마다 적절한 값을 설정할 필요는 있지만, 제조 공정에서 가능한 한 저감시킬 것이 요망된다.

이상의 점에서, CEX 크로마토그래피로서 F/T 모드를 사용한 정제 플로에 있어서도 HCP 를 비롯한 불순물을 저감시킬 수 있는, 항체종에 상관없는 범용적인 방법이 요망되었다.

3. 활성탄 재료의 적용에 의한 불순물의 제거

본원 발명자들은, 제조 비용을 저감시키는 데다가 항체를 확실하게 고순도로 정제하는 방법을 특정하는 것을 목표로 하여, 종래의 정제 공정에 활성탄 재료에 의한 처리를 추가함으로써, 항체종에 상관없이 고순도로 정제할 수 있는 것을 알아냈다.

HCP 는, 이종 단백질로서 인간에 대하여 항원성을 나타낼 수 있는 것, 또 포유 동물 세포 유래 단백질에는 조종양성 리스크가 존재하는 것, 나아가서는 의약품 중의 폴리소르베이트 분해에 의한 안정성에 대한 관점에서, 충분히 낮은 레벨까지 정제 공정에서 제거할 필요가 있는 것은 전술한 바와 같다. 또, 포스포리파아제 B 유사 단백질 2 (phospholipase B-like 2, PLBL2) 는 HCP 의 1 종이지만, 항체와의 상호 작용에 의해 잔류하는 히치하이크 HCP 로서 보고되어 있다 (B. Tran et al., J. Chromatogr. A 1438 : 31-38 (2016)). 또한, 항체 제제 중에 대한 PLBL2 의 잔류에 의해, 레브리키주맙의 임상 시험에 있어서 항햄스터 PLBL2 항체가 고빈도로 발생한 보고가 있다 (국제공개 제WO2015/038888호). 항햄스터 PLBL2 항체의 발생에 대한 임상적 중요성은 알려져 있지 않아, 레브리키주맙의 임상 시험에서 항햄스터 PLBL2 항체가 고빈도로 발생해도 안전성 이벤트와 상관되지 않았다. 그러나, 여전히 반복 투여에 의한 장기 노출이 알레르기 또는 과민증의 환자 집단에 있어서, 아나필락시스, 과민증과 같은 바람직하지 않은 영향을 증대시킬 우려가 있기 때문에, 제제 중의 PLBL2 는 가능한 한 저감시키는 것이 바람직한 것으로 생각된다.

이들 요구에 대하여, 활성탄 재료에 의한 처리를 추가함으로써, CEX 크로마토그래피에 대한 이들 불순물 부하가 저감되고, 그 결과, HCP 를 충분히 낮은 레벨까지 제거할 수 있었다. 또, 항체와의 상호 작용에 의해 잔류하는 히치하이크 HCP 인 PLBL2 는 일반적인 정제 방법으로는 저감시키기 어렵기 때문에, 활성탄 재료에 의해 로드액의 약 50 ％ 가 저감되는 것, 즉 활성탄 재료에 의해 PLBL2 의 대수 제거값 (LRV) 0.27 이 얻어지는 것에는 큰 의의가 있다.

또한, 활성탄 재료에 의해 목적 물질 유래 불순물인 HMWS 및 LMWS 가 저감되었다. 활성탄 재료에 의한 HMWS 의 저감에 의해, CEX 크로마토그래피에 대한 부하를 줄이는 것이 가능해지고, 결과적으로 최종 정제물 중의 HMWS 량을 안정적으로 저감시킬 수 있게 되었다. 또, LMWS 는 일반적인 정제 방법으로는 저감시키기 어렵기 때문에, 활성탄 재료에 의한 최종 정제물의 순도 향상에 대한 기여가 크다.

이것들에 추가하여, 활성탄 재료에 로드하는 항체 용액의 pH 를 조절함으로써 바이러스 클리어런스능을 향상시켰다. 활성탄 재료에 의해 레트로바이러스 및/또는 레트로바이러스형 입자, 혹은 항체 용액에 의해 한정적이기는 하지만 파보바이러스를 제거할 수 있을 가능성이 있는 것이 개시되어 있지만 (국제공개 제WO2015/005961호), 용액 pH 는 7.0 의 조건이다. 한편, 본 발명에서는 pH 5.0 의 조건에서 바이러스를 제거할 수 있는 것을 알아냈으며, 또한 pH 5.0 의 조건에 있어서의 바이러스 클리어런스능은 이미 보고된 조건보다 양호한 것을 나타냈다.

일반적인 항체의 정제법에서는 프로테인 A 크로마토그래피, 저 pH 에 의한 바이러스 불활화 처리를 실시하고 있고, 불활화 후에 pH 5.0 부근으로 중화되는 경우가 있다. 또 후단의 CEX 크로마토그래피에서는 pH 5.0 부근의 조건에서 실시되는 예가 많은 점에서, 이들 공정 사이에 활성탄 재료에 의한 처리를 실시할 때, 특별한 pH 조정이나 희석 조작 등을 실시하지 않고 활성탄 재료에 의한 처리를 할 수 있는 것은, 제조 작업을 단순화하는 것에 크게 기여한다. 또한, 항체에 따라서는 pH 변화에 의해 불안정화되는 경우가 있는 점에서, pH 조정하지 않고 활성탄 처리를 할 수 있는 것은, 항체의 안정성의 유지에도 크게 기여하는 것으로 생각된다.

CHO 세포를 사용한 항체 의약품의 정제 공정에 있어서, 일반적으로 AEX 크로마토그래피 공정은 바이러스 클리어런스능을 갖는 것이 알려져 있지만, 활성탄 재료가 AEX 크로마토그래피와 동등한 바이러스 클리어런스능을 갖는 것이 밝혀진 점에서, AEX 크로마토그래피 공정의 대체로서 활성탄 재료에 의한 처리가 가능해지고, 이로써, AEX 크로마토그래피를 생략할 수 있을 가능성이 시사되었다. AEX 크로마토그래피를 비롯한 크로마토그래피는 그 작업성이 번잡하고, 흡착 필터로서 활성탄 재료를 사용함으로써, 작업성이 번잡한 크로마토그래피를 생략할 수 있어, 보다 단순하고 효율적인 프로세스가 될 수 있다. 또, 고가의 AEX 수지나 Membrane Adsorber 등을 저렴한 활성탄 흡착 필터로 함으로써, 러닝 코스트의 대폭적인 저감이 달성된다. 또한, 고액의 크로마토그래피 장치가 불필요하고, 저렴한 필터 유닛으로 치환되는 점에서, 제조 설비의 초기 투자의 저감에도 크게 기여할 수 있는 것으로 생각된다.

4. 본 발명에서 채용되는 정제 공정

본 명세서에 있어서는, 항체를 하나 또는 복수의 불순물을 포함하는 조성물로부터 정제하기 위한 수법으로서,

a1. 항체를 함유하는 세포 배양 상청을 준비하고,

의 a1. 내지 e1. 의 공정을 포함하는 방법 (이하, 개량 방법 2) 을 제공한다.

b1. 공정에 있어서의 어피니티 크로마토그래피 수지의 바람직한 예로서, 프로테인 A 수지를 들 수 있다. 채용 가능한 프로테인 A 수지로서, 프로테인 A 수지가, KanCapA (KANEKA), KanCapA3G (KANEKA), MabSelect SuRe (GE Healthcare Life Science), MabSelect SuRe pcc (GE Healthcare Life Science), MabSelect PrismA (GE Healthcare Life Science), 또는 Amsphere A3 (JSR Life Sciences) 을 들 수 있지만, 이들 수지에 한정되는 것은 아니다.

c1. 의 공정에 있어서의 바이러스 불활화에 대해서는, 산, 계면 활성제, 화학 물질, 핵산 가교제, 자외선, 감마선 및 열에 의한 처리로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 방법을 들 수 있다. 바이러스 불활화 처리로서 산처리가 선택되는 경우의 바람직한 pH 의 범위는, 어피니티 크로마토그래피 풀액의 pH 를 3 ∼ 4 로 저하시키는 처리이고, 바이러스 불활화 처리로서 더욱 바람직한 pH 는 3.5 이다. 이 경우의 바람직한 처리 시간은 60 ∼ 120 분이고, 바람직한 처리 온도는 15 ∼ 30 ℃ 이다.

d1. 의 공정에 있어서의 활성탄 재료는, 크로마토그래피 칼럼 중에 충전된다. 다른 실시형태에 있어서, 활성탄 재료는 필터 타입이고, 디스포저블 형식의 Millistak＋ (등록 상표) Pod 등의 밀폐 일회용 디바이스 중에 충전된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 활성탄 재료는 카트리지 또는 캡슐 중에 충전된다. 필터 타입의 대부분은, 셀룰로오스 매트릭스 등의 강도가 있는 구조의 여과재에 활성탄 재료가 혼합된다.

시판되는 활성탄 필터의 예로서, Millistak＋ (등록 상표) Pod CR40 (Merck Millipore), Zeta Plus 활성탄 흡착 뎁스 필터 (3M), SUPRAcap 50 Seitz (등록 상표) AKS filter (PALL) 를 들 수 있지만, 이들 활성탄 재료에 한정되는 것은 아니다. 몇 가지의 실시형태에 있어서, 활성탄 필터는 셀룰로오스 매트릭스 중에 활성탄 재료를 유지한 구조를 갖는다. d1. 의 공정에 있어서의 활성탄 재료에 로드하는 용액, 활성탄 재료의 평형화 버퍼 및 세정 버퍼의 바람직한 pH 는 4.5 ∼ 7.5 이고, 보다 바람직한 pH 는 4.5 ∼ 5.5 이고, 더욱 바람직한 pH 는 5.0 이다. 또, d1. 의 공정의 활성탄 재료에 로드하는 용액, 활성탄 재료의 평형화 버퍼 및 세정 버퍼의 바람직한 전기 전도도는 2 ∼ 10 mS/㎝ 이고, 보다 바람직한 전기 전도도는 2 ∼ 5 mS/㎝ 이다.

e1. 의 공정에 있어서의 양이온 교환 재료는, 수지, 모놀리스 칼럼, 또는 막중 어느 하나가 선택된다. 양이온 교환 재료의 관능기는, 술포프로필, 술포에틸, 술포이소부틸, 또는 카르복실이다. 시판되는 양이온 교환 재료의 예로는, POROSXS (Thermo Fisher Scientific), Eshmuno (등록 상표) CPX (Merck Millipore), Eshmuno (등록 상표) CP-FT (Merck Millipore), 또는 Capto S ImpAct (GE Healthcare Life Science) 를 들 수 있지만, 이들 양이온 교환 재료에 한정되는 것은 아니다.

e1. 의 공정에 있어서는, d1. 의 공정에서 얻어진 활성탄 재료 풀액이 양이온 교환 재료의 흡착 용량을 초과하여 로드된다. 로딩 밀도는, 양이온 교환 재료 1 ℓ 당 150 ∼ 4000 g 의 단백질량의 범위에서 선택 가능하지만, 바람직한 로딩 밀도는 500 ∼ 2000 g/ℓ 의 범위이고, 더욱 바람직한 로딩 밀도는 1000 ∼ 1500 g/ℓ 의 범위이다. 로드되는 활성탄 재료 풀액의 바람직한 pH 는 pH 4 ∼ 6 이고, 보다 바람직한 pH 는 4.5 ∼ 5.5 이고, 더욱 바람직한 pH 는 5.0 이다. 또, e1. 의 공정의 양이온 교환 재료에 로드하는 용액의 바람직한 전기 전도도는 3 ∼ 7 mS/㎝ 이고, 보다 바람직한 전기 전도도는 3 ∼ 5 mS/㎝ 이다.

상기 개량 방법 2 에 있어서는, a1. 내지 e1. 의 각 공정의 전후에 1 종류 이상의 임의의 공정이 추가되어 있어도 된다.

예를 들어, 개량 방법 2 에 있어서는, c1. 의 공정과 d1. 의 공정 사이에 뎁스 필터에 의한 처리가 추가되어 있어도 된다. 뎁스 필터는, 흡착 작용과 통상적인 다공성 여과재에 의한 기계적 여과 작용의 2 측면에서, 대개 1 ㎛ 를 초과하는 사이즈의 입자를 포착할 수 있는 필터이며, 셀룰로오스 매트릭스와 규조토 등의 여과재로 이루어진다. 무수한 긴 유로를 갖는 두께가 있는 여과재에 의해, 필터 내부에서 대상물을 트랩할 수 있는 특징을 갖는다. 뎁스 필터는, Millistak＋ (등록 상표) Pod 등의 밀폐 일회용 디바이스 중에 충전된다. 시판되는 뎁스 필터의 예로는, Millistak＋ (등록 상표) A1HC, D0HC, X0HC 를 들 수 있지만, 이들 뎁스 필터에 한정되는 것은 아니다.

뎁스 필터를 추가한 구체적인 예로서, 항체를 하나 또는 복수의 불순물을 포함하는 조성물로부터 정제하기 위한 수법으로서,

a2. 항체를 함유하는 세포 배양 상청을 준비하고,

의 a2. 내지 f2. 의 공정을 포함하는 것으로 이루어지는, 개량 방법 2 의 c1. 의 공정과 d1. 의 공정 사이에 뎁스 필터에 의한 처리가 추가된 방법 (이하, 개량 방법 1) 을 제공한다.

또, 상기 개량 방법 2 의 c1. 의 공정과 d1. 의 공정 사이, 또는 상기 개량 방법 1 의 d2. 의 공정과 e2. 공정 사이에 음이온 교환 재료에 의한 처리가 추가되어 있어도 된다. 음이온 교환 재료는, 수지, 모놀리스 칼럼, 또는 막 중 어느 하나가 선택되는데, 막의 경우에는 Q 막을 선택할 수 있다. 통상적으로, 음이온 교환 재료는 F/T 모드로 사용된다. 시판되는 음이온 교환 재료의 예로는, NatriFlo (등록 상표) HD-Q, Mustang (등록 상표) Q, 또는 Sartobind (등록 상표) Q 를 들 수 있지만, 이들 음이온 교환 재료에 한정되는 것은 아니다.

상기 개량 방법 2 의 e1. 의 공정 또는 상기 개량 방법 1 의 f2. 의 공정에서 얻어진 양이온 교환 재료 풀액을, 추가로 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 의해 처리하여 풀액을 얻어도 된다 (이하, 개량 방법 3). 또, 상기 개량 방법 2 의 d1. 의 공정 또는 상기 개량 방법 1 의 e2. 의 공정에서 얻어진 활성탄 재료 풀액을, 추가로 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 의해 처리하여 소수성 상호 작용 크로마토그래피 풀액을 얻고, 추가로 양이온 교환 재료에 의해 처리하여 양이온 교환 재료 풀액을 얻어도 된다 (이하, 개량 방법 4). 상기 소수성 상호 작용 크로마토그래피는, 바람직하게는 F/T 모드이다. 또, 상기 소수성 상호 작용 크로마토그래피는, 페닐기, 벤질기 혹은 헥실기를 갖는 수지 또는 막을 사용하여 실시된다. 시판되는 소수성 상호 작용 크로마토그래피 재료의 예로는, Phenyl Sepharose High Performance (GE Healthcare Life Science), Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare Life Science), Sartobind (등록 상표) Phenyl (sartorius), ReadyToProcess Adsorber Phenyl (GE Healthcare Life Science), POROS Benzyl Ultra (Thermo Fisher Scientific), POROS Benzyl (Thermo Fisher Scientific), Hexyl-650C (토소) 를 들 수 있지만, 이들 소수성 상호 작용 크로마토그래피 재료에 한정되는 것은 아니다.

여기에 기재되어 있는 어느 방법의 몇 가지의 실시형태에 있어서는, 정제된 항체를 회수하는 것을 추가로 포함한다. 몇 가지의 실시형태에서는, 정제 항체는, 여기에 기재되어 있는 어느 정제 공정으로부터 회수된다.

상기 공정에 의해, HCP, PLBL2, 바이러스, 바이러스형 입자, HMWS, LMWS, 배지 성분, 침출 프로테인 A 및 DNA 에서 선택되는 적어도 하나의 불순물이 제거된다.

실시예

본 발명을 이하의 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 일반 방법

본 실시예에서는, 실시예 2 이후에 나타내는 실시예에서 공통적으로 사용하는 일반적인 방법에 대해 설명한다.

1) 항체 농도 측정

항체 농도는, PA ID Sensor Cartridge (2.1 ㎜ × 3 ㎜, Applied Biosystems) 칼럼을 사용한 HPLC 법에 의해 측정하였다.

2) HCP 측정

Cygnus Technologies 사의 third-generation CHO host cell protein 키트 혹은 BioGENES 사의 CHO|360 HCP ELISA 키트를 사용하여, 효소 결합 면역 흡착법 (ELISA) 에 의해 측정하였다. 얻어진 HCP 농도를 항체 농도로 나눠, ng HCP/㎎ 항체로 환산하였다.

실시예 2 ∼ 5 에서는, Cygnus Technologies 사의 third-generation CHO host cell protein 키트를, 실시예 6 ∼ 8 에서는, BioGENES 사의 CHO|360 HCP ELISA 키트를 사용하였다.

3) PLBL2 측정

Immunology Consultants Laboratory, INC. 의 햄스터 포스포리파아제 B 유사 단백질 (Hamster Phospholipase B-Like 2, PLBL2) ELISA 키트를 사용하여, 효소 결합 면역 흡착법 (ELISA) 에 의해 측정하였다. 얻어진 PLBL2 농도를 항체 농도로 나눠, ng PLBL2/㎎ 항체로 환산하였다. 또한 각 정제 공정에서의 PLBL2 클리어런스능 (대수 제거값, Log Reduction Value ; LRV) 을, 이하의 계산에 의해 산출하였다. Cf 가 피드액 중의 PLBL2 의 농도이고, Cp 가 칼럼, 필터를 통과한 후의 PLBL2 의 농도일 때, LRV ＝ log(Cf) － log(Cp) 로 하였다.

4) 고분자량체 (HMWS), 저분자량체 (LMWS) 및 Monomer (단량체) 함량

TSK gel G3000SWXL column (5 ㎛, 7.8 ㎜ × 300 ㎜, Tosoh) 또는 ACQUITY UPLC Protein BEH SEC column (1.7 ㎛, 4.6 ㎜ × 300 ㎜, Waters) 을 사용한 HPLC 법에 의해 측정하였다. 이동상은, 0.4 M 염화나트륨을 함유하는 0.1 M 인산 완충액을 사용하였다.

5) 프로테인 A 측정

Cygnus Technologies 사의 프로테인 A ELISA 키트를 사용하여, 효소 결합 면역 흡착법 (ELISA) 에 의해 측정하였다. 얻어진 프로테인 A 농도를 결과 비교를 위해 항체 농도로 나눠, ng 프로테인 A/㎎ 항체로 환산하였다.

6) 바이러스 역가 측정 및 바이러스 클리어런스능 (대수 제거값, Log Reduction Value ; LRV) 의 산출

바이러스 역가는, 바이러스에 감염되면 세포의 형상이 변화하는 현상 (세포 변성) 을 이용한, 50 ％ 의 세포에 감염되는 바이러스량을 측정하는 방법 (조직 배양 감염성 시험 ; TCID₅₀) 에 의해 측정하였다. 대상 바이러스로는, 마우스 백혈병 바이러스 (MLV), 마우스 미소 바이러스 (MMV), 가성 광견병 바이러스 (PRV), 레오바이러스 3 형 (Reo3) 으로 하였다. 또 지시 세포로서, PG4 세포 (MLV 의 지시 세포), 324K 세포 혹은 A9 세포 (MMV 의 지시 세포), Vero 세포 (PRV 의 지시 세포), L-929 세포 (Reo3 의 지시 세포) 를 사용하였다. 바이러스 클리어런스 시험 전에는, 완충액이나 샘플이 지시 세포에 바람직하지 않은 영향을 미치고 있지 않은지를 조사하기 위해, 바이러스 역가 측정법에 대한 독성 작용 또는 간섭 작용을 평가하였다. 바이러스 클리어런스능 (대수 제거값, LRV) 을, 이하의 계산에 의해 산출하였다. Cf 가 피드액 중의 바이러스의 농도이고, Cp 가 칼럼, 필터를 통과한 후의 바이러스의 농도일 때, LRV ＝ log(Cf) － log(Cp) 로 하였다.

7) DNA 측정

CHO 에 특이적인 프라이머, 프로브를 사용한 qPCR 법에 의해 측정하였다. 얻어진 DNA 농도를 항체 농도로 나눠, pg DNA/㎎ 항체로 환산하였다.

실시예 2. CEX 크로마토그래피 공정을 F/T 모드로 정제한 참고예 (Mab A)

본 실시예는, 이하의 표 1 에 나타내는 정제 플로에 있어서의 Mab A 로 불리는 모노클로널 항체의 불순물 클리어런스에 대해 설명한다.

1) 재료 및 방법

Mab A 를 산생한 CHO 세포 배양액에 대해, 뎁스 필터 여과에 의해 세포를 제거하고, 청징화하여 세포 배양 상청을 얻었다. 세포 배양 상청을, KanCapA 수지를 사용한 프로테인 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 20 mM 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5) 로 칼럼을 평형화한 후, 배양 상청을 로드하고, 그 후, 1 M 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5), 계속해서 20 mM 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5) 로 세정을 실시하였다. 아세트산 버퍼 (pH 3.6) 로 Mab A 를 칼럼으로부터 용출시켰다. 280 ㎜ 의 흡광도를 모니터링하여, Mab A 를 포함하는 획분을 취득하였다 (어피니티 크로마토그래피 풀액). 어피니티 크로마토그래피 풀액에 염산을 첨가하여 pH 를 3.5 로 조정하고, 1 시간 바이러스 불활화 처리를 실시하였다. 그 공정은 실온에서 실시하였다. 1 시간의 바이러스 불활화 처리 후, 트리스 수용액을 사용하여 pH 5.0 으로 중화시켰다. 중화액을, 미리 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 세정한 뎁스 필터 (Millistak (등록 상표) Pod A1HC) 에 로드하고, 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하여, Mab A 를 회수하였다. 계속해서, 0.2 ㎛ 의 필터로 여과하여, 보존하였다 (뎁스 필터 여과 풀액). 뎁스 필터 여과 풀액을 트리스 수용액으로 pH 7.5 로 조정하여, AEX 재료 로드액으로 하였다. 미리 1 M 염화나트륨을 포함하는 트리스 버퍼 (pH 7.5), 계속해서 트리스 버퍼 (pH 7.5) 로 평형화한 AEX Membrane Adsorber (NatriFlo (등록 상표) HD-Q) 에 AEX 재료 로드액을 통액시키고, 계속해서 트리스 버퍼 (pH 7.5) 로 세정함으로써 Mab A 를 회수하였다. 회수액은 아세트산을 사용하여 pH 5.0 으로 조정한 후, 0.2 ㎛ 의 필터로 여과하여, AEX 재료 풀액으로서 보존하였다. 미리 1 M 염화나트륨을 포함하는 아세트산 버퍼 (pH 5.0), 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 평형화한 POROS XS 를 충전한 CEX 칼럼에 AEX 재료 풀액을 통액시켰다. CEX 칼럼에 대한 로딩 밀도는 2000 g/ℓ 수지 이하로 설정하였다. 로드 후, 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하였다. 280 ㎜ 의 흡광도를 모니터링하여, Mab A 를 포함하는 획분을 취득하여, F/T 모드에 의한 CEX 재료 풀액으로 하였다.

2) 결과

CEX 크로마토그래피 공정의 F/T 모드에 의한 Mab A 회수율은, 92 ％ 였다. 불순물 클리어런스의 결과 (표 2) 를 나타낸다.

실시예 3. 활성탄 재료에 의한 불순물 클리어런스 (Mab A, Mab B, Mab C, Mab D)

본 실시예는, 이하의 표 3 에 나타내는 정제 플로에 있어서의 Mab A, Mab B, Mab C, 또는 Mab D 로 불리는 복수의 항체의 활성탄 재료에 의한 불순물 클리어런스에 대해 설명한다. 또한, Mab A, Mab B, Mab C, 또는 Mab D 의 아미노산 서열 및 결합하는 항원은, 각각 상이하다.

1) 활성탄 재료에 있어서의 불순물 클리어런스 (바이러스 이외)

활성탄 재료로서 Millistak＋ (등록 상표) Pod CR40 을 사용하여, Mab B 및 Mab A 에 대해, 항체 회수율 및 불순물 클리어런스의 평가를 실시하였다. 실시예 2 에 나타내는 방법에 준하여 얻어진 Mab B 및 Mab A 의 뎁스 필터 여과 풀액을 활성탄 필터에 대한 로드액 (활성탄 재료 로드액) 으로서 사용하였다. 단, 활성탄 필터에서의 HCP 의 클리어런스능을 평가하기 쉽게 하기 위해, Mab B 에 대해서는 프로테인 A 크로마토그래피에 있어서, 배양 상청을 로드 후의 1 M 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5) 에 의한 세정은 실시하지 않았다. 활성탄 필터는 미리 취급 설명서에 따라서 적절한 세정을 실시한 후, 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 평형화하였다. 또한, 평형화 이후의 유속은, 109 LMH 로 설정하였다. 평형화 후, 활성탄 재료 로드액을 Mab B 에서는 약 300 ℓ/㎡ 로, Mab A 에서는 약 117 ℓ/㎡ 로 부하하고, 통액 후, 아세트산 버퍼로 Mab B 및 Mab A 를 회수하였다 (활성탄 재료 풀액).

각 항체에 대한 정제 조건 (표 4), 항체 회수율 (표 5), HCP 클리어런스 (표 6), PLBL2 클리어런스 (표 7), 및 HMWS, LMWS 클리어런스 (표 8) 를 나타낸다. 어느 항체에서도, 활성탄 필터 여과에 의해 HCP, PLBL2 가 저감되었다. 또한 HMWS 및 LMWS 가 저감되고, 단량체 함량의 향상이 확인되었다. 특히 HCP 에 관하여 활성탄 필터 여과에 의해 대폭 저감되었다 (실시예 2 에서는, AEX 크로마토그래피 처리의 전후에 있어서 HCP 제거의 정도가 낮고, CEX 크로마토그래피에 대한 HCP 의 부하가 저감되어 있지 않다). 또한, 항체와의 상호 작용에 의해, 일반적인 항체 정제 플로에서는 잘 저감되지 않는 히치하이크 HCP 로서 보고가 있는 PLBL2 에 대해서도 (국제공개 제WO2015/038888호), 활성탄 필터 여과로 저감되는 것이 밝혀졌다. 히치하이크 HCP 인 PLBL2 는 일반적인 정제 방법으로는 저감시키기 어렵기 때문에, 활성탄 재료에 의해 로드액의 약 50 ％ 가 저감되는 것, 즉 활성탄 재료에 의해 PLBL2 의 대수 제거값 (LRV) 0.27 이 얻어지는 것에는 큰 의의가 있다.

2) 활성탄 재료에 있어서의 바이러스 클리어런스

활성탄 재료로서 Millistak＋ (등록 상표) Pod CR40 을 사용하여, 바이러스 클리어런스를 평가하였다. Mab B, Mab C, 및 Mab D 에 대한 스파이크 시험에 의해 바이러스 클리어런스능을 확인하였다. 스파이크 대상 바이러스로는, CHO 세포를 사용한 항체 의약품의 바이러스 클리어런스 시험에서 일반적으로 사용되고 있는 4 바이러스 (MLV, MMV, Reo3 및 PRV) 로 하였다. 활성탄 필터 여과에 의한 바이러스 클리어런스능에 영향을 미칠 가능성이 있는 인자로서, 유속, pH 및 항체 종류를 들고, 그것들의 영향을 확인하는 시험을 계획하였다. 실시예 2 에 나타내는 방법에 준하여 얻어진 Mab B, Mab C, 및 Mab D 의 뎁스 필터 여과 풀액을 활성탄 필터에 대한 로드액 (활성탄 재료 로드액) 으로서 사용하였다 (pH 5.0). 또한, pH 7.5 의 조건의 로드액에 대해서는, 트리스 수용액에 의해 pH 를 7.5 로 조정하였다. 활성탄 필터는 미리 취급 설명서에 따라서 적절한 세정을 실시한 후, 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 혹은 트리스 버퍼 (pH 7.5) 로 평형화하였다. 또한, 평형화 이후의 유속은, 109 LMH 혹은 54.5 LMH 로 설정하였다. 평형화 후, 활성탄 재료 로드를 약 55 ℓ/㎡ 혹은 약 110 ℓ/㎡ 로 부하하고, 통액 후, 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 혹은 트리스 버퍼 (pH 7.5) 로 Mab B, Mab C, 및 Mab D 를 회수하고 (활성탄 재료 풀액), 활성탄 재료 로드액 및 활성탄 재료 풀액의 바이러스 역가로부터 바이러스 대수 제거값 (LRV) 을 산출하였다 (표 9). 이 결과, 활성탄 필터는 4 종의 바이러스에 대하여 클리어런스능을 갖는 것이 판명되었다. 바이러스 클리어런스능은, 유속, 공존하는 항체종, 및 부하량에 의해 영향을 받지 않고, CHO 세포를 사용한 항체 의약품의 바이러스 클리어런스 시험에서 사용하는 4 종의 바이러스에 대해 LRV 가 모두 ＞＝ 4 로 높은 클리어런스능을 갖고 있었다. 한편, MLV 의 평가에 있어서 pH 5.0 및 7.5 에서 바이러스 클리어런스능을 비교한 결과, pH 7.5 에서 LRV 가 저하되어 있는 것을 알 수 있어, pH 가 활성탄 재료에 있어서의 바이러스 클리어런스에 영향을 주는 중요 파라미터인 것이 밝혀졌다.

실시예 4. 개량 방법 1 에 의한 정제예 (Mab A, Mab C)

본 실시예는, 이하의 표 10 에 나타내는 정제 플로에 있어서의 Mab A 또는 Mab C 로 불리는 모노클로널 항체의 불순물 클리어런스에 대해 설명한다.

1) 재료 및 방법

Mab A 를 산생한 CHO 세포 배양액에 대해, 뎁스 필터 여과에 의해 세포를 제거하고, 청징화하였다. 세포 배양 상청을, KanCapA 수지를 사용한 프로테인 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 20 mM 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5) 로 칼럼을 평형화한 후, 배양 상청을 로드하고, 그 후, 1 M 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5), 계속해서 20 mM 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5) 로 세정을 실시하였다. 아세트산 버퍼 (pH 3.6) 로 Mab A 를 칼럼으로부터 용출시켰다. 280 ㎜ 의 흡광도를 모니터링하여, Mab A 를 포함하는 획분을 취득하였다 (어피니티 크로마토그래피 풀액). 어피니티 크로마토그래피 풀액에 염산을 첨가하여 pH 를 3.5 로 조정하고, 1 시간 바이러스 불활화 처리를 실시하였다. 그 공정은 실온에서 실시하였다. 1 시간의 바이러스 불활화 처리 후, 트리스 수용액을 사용하여 pH 5.0 으로 중화시키고, 0.2 ㎛ 의 필터로 여과하여, 보존하였다 (바이러스 불활화액). 바이러스 불활화액을, 미리 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 세정한 뎁스 필터 (Millistak＋ (등록 상표) Pod A1HC) 에 약 109 ℓ/㎡ 로 부하하고, 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하여, Mab A 를 회수하였다 (뎁스 필터 여과 풀액).

뎁스 필터 여과 풀액을 미리 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 세정한 활성탄 필터 (Millistak＋ (등록 상표) Pod CR40) 에 117 ℓ/㎡ 로 부하하고, 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하여, Mab A 를 회수하였다. 계속해서, 0.2 ㎛ 의 필터로 여과하여, 보존하였다 (활성탄 재료 풀액). 미리 1 M 염화나트륨을 포함하는 아세트산 버퍼 (pH 5.0), 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 평형화한 POROS XS 를 충전한 CEX 칼럼에 활성탄 재료 풀액을 통액시켰다. CEX 칼럼에 대한 로딩 밀도는 약 2000 g/ℓ 수지로 하였다. 로드 후, 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하였다. 280 ㎜ 의 흡광도를 모니터링하여, Mab A 를 포함하는 획분을 취득하여, F/T 모드에 의한 CEX 재료 풀액으로 하였다.

실시예 3 에서 조제한 Mab C 의 어피니티 크로마토그래피 풀액, 뎁스 필터 여과 풀액 및 활성탄 재료 풀액을 사용하여, 바이러스 클리어런스를 평가하였다. 스파이크 대상 바이러스로는, CHO 세포를 사용한 항체 의약품의 바이러스 클리어런스 시험에서 일반적으로 사용되고 있는 4 바이러스 (MLV, MMV, Reo3 및 PRV) 로 하였다. 바이러스 역가로부터 바이러스 대수 제거값 (LRV) 을 산출하였다.

2) 결과

개량 방법 1 에 있어서의 Mab A 회수율, 및 불순물 클리어런스의 결과를 표 11 및 표 12 에 나타낸다. 또, Mab C 에 대해, 개량 방법 1 에 있어서의 바이러스 클리어런스능을 갖는 공정의 정제 공정 총 클리어런스를 표 13 에 나타낸다.

개량 방법 1 에 있어서의 Mab A 의 회수율은 양호하였다. HMWS 및 LMWS 가 제거되고, 높은 단량체 함량의 항체가 얻어졌다. HCP 함량은 적절히 저감되었다. PLBL2 함량에 대해서도, 저감시킬 수 있었다. 또, DNA 에 대해서도 정량 한계 미만까지 제거되어 있는 것이 확인되었다.

개량 방법 1 에 있어서의 Mab C 의 바이러스 클리어런스능을 갖는 공정의 정제 공정 총 클리어런스도 양호한 결과를 나타냈다.

활성탄 재료에 의한 처리와 조합함으로써, 고순도로 정제할 수 있는 것, 또한 활성탄 재료에 의한 처리로 바이러스가 제거되는 것을 알아냈기 때문에, 실시예 2 에 나타내는 방법으로부터 AEX 크로마토그래피를 활성탄 재료로 치환하는 것이 가능해졌다. 제조 비용에 대해서는, CEX 크로마토그래피를 일반적으로 사용되고 있는 B/E 모드로부터 F/T 모드로 함으로써, 수지에 대한 로딩 밀도가 약 100 g/ℓ 수지로부터 약 2000 g/ℓ 수지로 증대되어, 고가의 CEX 수지 비용을 약 1/20 로 하는 것이 가능해졌다. 또, 고가의 AEX 수지나 막을 저렴한 활성탄 재료로 함으로써 제조 비용 저감이 달성되었다. 또한 AEX 크로마토그래피를 삭제하고, 필터 카트리지 타입의 뎁스 필터에 계속해서 동일 타입의 활성탄 필터를 사용함으로써, 제조일수도 1 일 단축시킬 수 있었다. 대부분의 의약품 메이커에게 있어서 제조의 효율화는 필수이며, 연간의 제조 로트수를 최대화함으로써 제조의 효율화가 도모되고 있는 점에서, 제조일수를 1 일 단축시킬 수 있는 것에는 큰 의의가 있다.

그 개량 방법에 의해, 인간 치료용으로서 사용하기에 충분한 순도까지, 게다가 제조 비용을 저감시키고, 제조 기간을 단축시켜, 효율적으로 항체를 정제하는 것이 가능해졌다.

실시예 5. 개량 방법 2 에 의한 정제예 (Mab A, Mab D)

본 실시예는, 실시예 4 의 표 10 의 정제 플로로부터 뎁스 필터 여과를 생략 한, 이하의 표 14 에 나타내는 정제 플로에 있어서의 Mab A 및 Mab D 로 불리는 모노클로널 항체의 불순물 클리어런스에 대해 설명한다. 또한, Mab D 의 아미노산 서열 및 결합하는 항원은, Mab A, Mab B 또는 Mab C 와는 상이하다.

1) 재료 및 방법

1)-1) Mab A 의 경우

Mab A 를 산생한 CHO 세포 배양액에 대해, 뎁스 필터 여과에 의해 세포를 제거하고, 청징화하였다. 세포 배양 상청을, KanCapA 수지를 사용한 프로테인 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 20 mM 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5) 로 칼럼을 평형화한 후, 배양 상청을 로드하고, 그 후, 1 M 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5), 계속해서 20 mM 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5) 로 세정을 실시하였다. 아세트산 버퍼 (pH 3.6) 로 Mab A 를 칼럼으로부터 용출시켰다. 280 ㎜ 의 흡광도를 모니터링하여, 각 항체를 포함하는 획분을 취득하였다 (어피니티 크로마토그래피 풀액). 어피니티 크로마토그래피 풀액에 염산을 첨가하여 pH 를 3.5 로 조정하고, 1 시간 바이러스 불활화 처리를 실시하였다. 그 공정은 실온에서 실시하였다. 1 시간의 바이러스 불활화 처리 후, 트리스 수용액을 사용하여 pH 5.0 으로 중화시키고, 0.2 ㎛ 의 필터로 여과하여, 보존하였다 (바이러스 불활화액). 바이러스 불활화액을 미리 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 세정한 활성탄 필터 (Millistak＋ (등록 상표) Pod CR40) 에 70 ℓ/㎡ 로 부하하고, 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하여, 각 항체를 회수하였다. 계속해서, 0.2 ㎛ 의 필터로 여과하여, 보존하였다 (활성탄 재료 풀액). 미리 1 M 염화나트륨을 포함하는 아세트산 버퍼 (pH 5.0), 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 평형화한 POROS XS 를 충전한 CEX 칼럼에 활성탄 재료 풀액을 통액시켰다. CEX 칼럼에 대한 로딩 밀도는 약 2000 g/ℓ 수지로 설정하였다. 로드 후, 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하였다. 280 ㎜ 의 흡광도를 모니터링하여, 각 항체를 포함하는 획분을 취득하고, 계속해서 0.2 ㎛ 의 필터로 여과하여 F/T 모드에 의한 CEX 재료 풀액으로 하였다.

1)-2) Mab D 의 경우

Mab D 를 산생한 CHO 세포 배양액에 대해, 뎁스 필터 여과에 의해 세포를 제거하고, 청징화하였다. 세포 배양 상청을, KanCapA 수지를 사용한 프로테인 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 20 mM 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5) 로 칼럼을 평형화한 후, 배양 상청을 로드하고, 그 후, 1 M 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5), 계속해서 20 mM 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5) 로 세정을 실시하였다. 아세트산 버퍼 (pH 3.6) 로 Mab D 를 칼럼으로부터 용출시켰다. 280 ㎜ 의 흡광도를 모니터링하여, 각 항체를 포함하는 획분을 취득하였다 (어피니티 크로마토그래피 풀액). 어피니티 크로마토그래피 풀액에 염산을 첨가하여 pH 를 3.4 로 조정하고, 1 시간 바이러스 불활화 처리를 실시하였다. 그 공정은 실온에서 실시하였다. 1 시간의 바이러스 불활화 처리 후, 트리스 수용액을 사용하여 pH 5.0 으로 중화시키고, 보존하였다 (바이러스 불활화액). 바이러스 불활화액을 미리 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 세정한 활성탄 필터 (Millistak＋ (등록 상표) Pod CR40) 에 178 ℓ/㎡ 로 부하하고, 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하여, 각 항체를 회수하였다. 계속해서, 0.2 ㎛ 의 필터로 여과하여, 보존하였다 (활성탄 재료 풀액). 미리 1 M 염화나트륨을 포함하는 아세트산 버퍼 (pH 5.0), 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 평형화한 POROS XS 를 충전한 CEX 칼럼에 활성탄 재료 풀액을 통액시켰다. CEX 칼럼에 대한 로딩 밀도는 약 1500 g/ℓ 수지로 설정하였다. 로드 후, 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하였다. 280 ㎜ 의 흡광도를 모니터링하여, 각 항체를 포함하는 획분을 취득하고, 계속해서 0.2 ㎛ 의 필터로 여과하여 F/T 모드에 의한 CEX 재료 풀액으로 하였다.

2) 결과

개량 방법 2 에 있어서의 Mab A 회수율, 및 불순물 클리어런스의 결과를 표 15 및 표 16 에, Mab D 회수율, 및 불순물 클리어런스의 결과를 표 17 및 표 18 에 나타낸다. 또한, 개량 방법 2 에 있어서의 바이러스 클리어런스능을 갖는 공정의 정제 공정 총 클리어런스에 대해서는, 실시예 4 의 표 13 과 대상 공정이 동일하기 때문에, 동등한 클리어런스를 기대할 수 있다.

Mab A 및 Mab D 모두, 개량 방법 2 에 있어서의 회수율은 양호하였다. 또, HMWS 및 LMWS 가 제거되고, 높은 단량체 함량의 항체가 얻어졌다. HCP 함량에 대해서도, Mab D 에서 충분히 제거되었다. 또, DNA 에 대해서도 정량 한계 미만까지 제거되어 있는 것이 확인되었다. 또한, PLBL2 및 침출 프로테인 A 의 함량도 저감시킬 수 있었다. 이상의 결과로부터, 항체에 따라서는 그 정제 방법에 의해 뎁스 필터 여과를 실시하지 않아도 고순도로 정제할 수 있는 것이 밝혀졌다.

실시예 6. 개량 방법 3 에 의한 정제예 (Mab F, Mab G)

본 실시예는, 실시예 4 의 표 10 의 정제 플로에 있어서의 양이온 교환 크로마토그래피 후에 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 추가한, 이하의 표 19 에 나타내는 정제 플로에 의한 항체의 불순물 클리어런스를 예시한다. 또한, 본 실시예에서 사용되는 Mab E, Mab F 및 Mab G 의 아미노산 서열 및 결합하는 항원은, 각각 상이하고, Mab A, Mab B, Mab C 또는 Mab D 와도 상이하다.

1) 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 있어서의 바이러스 클리어런스 (Mab E)

본 실시예는, 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 있어서의 Mab E 로 불리는 모노클로널 항체의 바이러스 클리어런스에 대해 설명한다. POROS Benzyl Ultra HIC 수지를 사용하여, Mab E 에 대한 MLV, MMV 의 스파이크 시험에 의해, 바이러스 클리어런스를 평가하였다.

Mab E 를 산생한 CHO 세포 배양액에 대해, 뎁스 필터 여과에 의해 세포를 제거하고, 청징화하였다. 세포 배양 상청을, KanCapA 수지를 사용한 프로테인 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 20 mM 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5) 로 칼럼을 평형화한 후, 배양 상청을 로드하고, 그 후, 1 M 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5), 계속해서 20 mM 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5) 로 세정을 실시하였다. 아세트산 버퍼 (pH 3.6) 로 Mab E 를 칼럼으로부터 용출시켰다. 280 ㎜ 의 흡광도를 모니터링하여, Mab E 를 포함하는 획분을 취득하였다 (어피니티 크로마토그래피 풀액). 어피니티 크로마토그래피 풀액에 염산을 첨가하여 pH 를 3.4 로 조정하고, 1 시간 바이러스 불활화 처리를 실시하였다. 그 공정은 실온에서 실시하였다. 1 시간의 바이러스 불활화 처리 후, 트리스 수용액을 사용하여 pH 5.0 으로 중화시켰다 (바이러스 불활화액). 바이러스 불활화액을, 미리 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 세정한 뎁스 필터 (Millistak＋ (등록 상표) Pod A1HC) 에 114 ℓ/㎡ 로 부하하고, 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하여, Mab E 를 회수하였다 (뎁스 필터 여과 풀액). 뎁스 필터 여과 풀액을, 미리 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 세정한 활성탄 필터 (Millistak＋ (등록 상표) Pod CR40) 에 129 ℓ/㎡ 로 부하하고, 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하고, 0.2 ㎛ 의 필터로 여과하여, 보존하였다 (활성탄 재료 풀액). 미리 주사용수, 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 평형화한 POROS Benzyl Ultra 를 충전한 HIC 칼럼에 활성탄 재료 풀액을 통액시켰다. HIC 칼럼에 대한 로딩 밀도는 약 1000 g/ℓ 수지로 하였다. 로드 후, 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하였다. 280 ㎜ 의 흡광도를 모니터링하여, Mab E 를 포함하는 획분을 취득하여, F/T 모드에 의한 HIC 재료 풀액으로 하였다. 로드액 및 풀액의 바이러스 역가로부터 바이러스 대수 제거값 (LRV) 을 산출하였다 (표 20). 이 결과, 소수성 상호 작용 크로마토그래피는 클리어런스능을 갖는 것이 판명되었다.

2) 개량 방법 3 에 의한 불순물 클리어런스 (Mab F)

본 실시예는, 표 19 에 나타내는 정제 플로에 있어서의 Mab F 로 불리는 모노클로널 항체의 불순물 클리어런스에 대해 설명한다.

Mab F 를 산생한 CHO 세포 배양액에 대해, 뎁스 필터 여과에 의해 세포를 제거하고, 청징화하였다. 세포 배양 상청을, KanCapA 수지를 사용한 프로테인 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 20 mM 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5) 로 칼럼을 평형화한 후, 배양 상청을 로드하고, 그 후, 1 M 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5), 계속해서 20 mM 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5) 로 세정을 실시하였다. 아세트산 버퍼 (pH 3.6) 로 Mab F 를 칼럼으로부터 용출시켰다. 280 ㎜ 의 흡광도를 모니터링하여, Mab F 를 포함하는 획분을 취득하였다 (어피니티 크로마토그래피 풀액). 어피니티 크로마토그래피 풀액에 염산을 첨가하여 pH 를 3.7 로 조정하고, 1 시간 바이러스 불활화 처리를 실시하였다. 그 공정은 실온에서 실시하였다. 1 시간의 바이러스 불활화 처리 후, 트리스 수용액을 사용하여 pH 5.0 으로 중화시켰다 (바이러스 불활화액). 바이러스 불활화액을, 미리 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 세정한 뎁스 필터 (Millistak＋ (등록 상표) Pod A1HC) 에 약 900 g/㎡ 로 부하하고, 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하여, Mab F 를 회수하였다 (뎁스 필터 여과 풀액). 뎁스 필터 여과 풀액을, 미리 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 세정한 활성탄 필터 (Millistak＋ (등록 상표) Pod CR40) 에 약 800 g/㎡ 로 부하하고, 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하고, 0.2 ㎛ 의 필터로 여과하여, 보존하였다 (활성탄 재료 풀액). 미리 1 M 염화나트륨을 포함하는 아세트산 버퍼 (pH 5.0), 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 평형화한 POROS XS 를 충전한 CEX 칼럼에 활성탄 재료 풀액을 통액시켰다. CEX 칼럼에 대한 로딩 밀도는 약 1300 g/ℓ 수지로 설정하였다. 로드 후, 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하였다. 280 ㎜ 의 흡광도를 모니터링하여, Mab F 를 포함하는 획분을 취득하고, 계속해서 0.2 ㎛ 의 필터로 여과하여 F/T 모드에 의한 CEX 재료 풀액으로 하였다. 미리 주사용수, 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 평형화한 POROS Benzyl Ultra 를 충전한 HIC 칼럼에 CEX 재료 풀액을 통액시켰다. HIC 칼럼에 대한 로딩 밀도는 약 300 g/ℓ 수지로 하였다. 로드 후, 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하였다. 280 ㎜ 의 흡광도를 모니터링하여, Mab F 를 포함하는 획분을 취득하여, F/T 모드에 의한 HIC 재료 풀액으로 하였다.

개량 방법 3 에 있어서의 불순물 클리어런스의 결과를 표 21 에 나타낸다. 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 의해 단량체 함량은 증가하였다. 양이온 교환 크로마토그래피 후에 잔류한 HCP 및 PLBL2 는, 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 의해 제거되고, 특히 PLBL2 는 정량 한계 미만까지 제거되었다.

3) 개량 방법 3 에 의한 불순물 클리어런스 (Mab G)

본 실시예는, 표 19 에 나타내는 정제 플로에 있어서의 Mab G 로 불리는 모노클로널 항체의 불순물 클리어런스에 대해 설명한다.

Mab G 를 산생한 CHO 세포 배양액에 대해, 뎁스 필터 여과에 의해 세포를 제거하고, 청징화하였다. 세포 배양 상청을, KanCapA 수지를 사용한 프로테인 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 20 mM 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5) 로 칼럼을 평형화한 후, 배양 상청을 로드하고, 그 후, 1 M 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5), 계속해서 20 mM 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5) 로 세정을 실시하였다. 아세트산 버퍼 (pH 3.6) 로 Mab G 를 칼럼으로부터 용출시켰다. 280 ㎜ 의 흡광도를 모니터링하여, Mab G 를 포함하는 획분을 취득하였다 (어피니티 크로마토그래피 풀액). 어피니티 크로마토그래피 풀액에 염산을 첨가하여 pH 를 3.7 로 조정하고, 1 시간 바이러스 불활화 처리를 실시하였다. 그 공정은 실온에서 실시하였다. 1 시간의 바이러스 불활화 처리 후, 트리스 수용액을 사용하여 pH 5.0 으로 중화시켰다 (바이러스 불활화액). 바이러스 불활화액을, 미리 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 세정한 뎁스 필터 (Millistak＋ (등록 상표) Pod A1HC) 에 약 800 g/㎡ 로 부하하고, 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하여, Mab G 를 회수하였다 (뎁스 필터 여과 풀액). 뎁스 필터 여과 풀액을, 미리 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 세정한 활성탄 필터 (Millistak＋ (등록 상표) Pod CR40) 에 약 700 g/㎡ 로 부하하고, 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하고, 0.2 ㎛ 의 필터로 여과하여, 보존하였다 (활성탄 재료 풀액). 미리 1 M 염화나트륨을 포함하는 아세트산 버퍼 (pH 5.0), 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 평형화한 POROS XS 를 충전한 CEX 칼럼에 활성탄 재료 풀액을 통액시켰다. CEX 칼럼에 대한 로딩 밀도는 약 1500 g/ℓ 수지로 설정하였다. 로드 후, 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하였다. 280 ㎜ 의 흡광도를 모니터링하여, Mab G 를 포함하는 획분을 취득하고, 계속해서 0.2 ㎛ 의 필터로 여과하여 F/T 모드에 의한 CEX 재료 풀액으로 하였다. 미리 주사용수, 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 평형화한 POROS Benzyl Ultra 를 충전한 HIC 칼럼에 CEX 재료 풀액을 통액시켰다. HIC 칼럼에 대한 로딩 밀도는 약 300 g/ℓ 수지로 하였다. 로드 후, 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하였다. 280 ㎜ 의 흡광도를 모니터링하여, Mab G 를 포함하는 획분을 취득하여, F/T 모드에 의한 HIC 재료 풀액으로 하였다.

개량 방법 3 에 있어서의 불순물 클리어런스의 결과를 표 22 에 나타낸다. 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 의해 단량체 함량은 증가하였다. 양이온 교환 크로마토그래피 후에 잔류한 HCP 및 PLBL2 는, 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 의해 제거되고, 특히 PLBL2 는 정량 한계 부근까지 제거되었다.

실시예 7. 개량 방법 4 에 의한 정제예 (Mab F, Mab G)

본 실시예는, 실시예 4 의 표 10 의 정제 플로에 있어서의 양이온 교환 크로마토그래피 전에 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 추가한, 이하의 표 23 에 나타내는 정제 플로에 의한 항체의 불순물 클리어런스를 예시한다.

1) 개량 방법 4 에 의한 불순물 클리어런스 (Mab F)

본 실시예는, 표 23 에 나타내는 정제 플로에 있어서의 Mab F 로 불리는 모노클로널 항체의 불순물 클리어런스에 대해 설명한다.

Mab F 를 산생한 CHO 세포 배양액에 대해, 뎁스 필터 여과에 의해 세포를 제거하고, 청징화하였다. 세포 배양 상청을, KanCapA 수지를 사용한 프로테인 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 20 mM 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5) 로 칼럼을 평형화한 후, 배양 상청을 로드하고, 그 후, 1 M 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5), 계속해서 20 mM 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5) 로 세정을 실시하였다. 아세트산 버퍼 (pH 3.6) 로 Mab F 를 칼럼으로부터 용출시켰다. 280 ㎜ 의 흡광도를 모니터링하여, Mab F 를 포함하는 획분을 취득하였다 (어피니티 크로마토그래피 풀액). 어피니티 크로마토그래피 풀액에 염산을 첨가하여 pH 를 3.7 로 조정하고, 1 시간 바이러스 불활화 처리를 실시하였다. 그 공정은 실온에서 실시하였다. 1 시간의 바이러스 불활화 처리 후, 트리스 수용액을 사용하여 pH 5.0 으로 중화시켰다 (바이러스 불활화액). 바이러스 불활화액을, 미리 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 세정한 뎁스 필터 (Millistak＋ (등록 상표) Pod A1HC) 에 약 900 g/㎡ 로 부하하고, 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하여, Mab F 를 회수하였다 (뎁스 필터 여과 풀액). 뎁스 필터 여과 풀액을, 미리 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 세정한 활성탄 필터 (Millistak＋ (등록 상표) Pod CR40) 에 약 800 g/㎡ 로 부하하고, 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하고, 0.2 ㎛ 의 필터로 여과하여, 보존하였다 (활성탄 재료 풀액). 미리 주사용수, 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 평형화한 POROS Benzyl Ultra 를 충전한 HIC 칼럼에 활성탄 재료 풀액을 통액시켰다. HIC 칼럼에 대한 로딩 밀도는 약 300 g/ℓ 수지로 하였다. 로드 후, 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하였다. 280 ㎜ 의 흡광도를 모니터링하여, Mab F 를 포함하는 획분을 취득하여, F/T 모드에 의한 HIC 재료 풀액으로 하였다. 미리 1 M 염화나트륨을 포함하는 아세트산 버퍼 (pH 5.0), 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 평형화한 POROS XS 를 충전한 CEX 칼럼에 HIC 재료 풀액을 통액시켰다. CEX 칼럼에 대한 로딩 밀도는 약 1300 g/ℓ 수지로 설정하였다. 로드 후, 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하였다. 280 ㎜ 의 흡광도를 모니터링하여, Mab F 를 포함하는 획분을 취득하고, 계속해서 0.2 ㎛ 의 필터로 여과하여 F/T 모드에 의한 CEX 재료 풀액으로 하였다.

개량 방법 4 에 있어서의 불순물 클리어런스의 결과를 표 24 에 나타낸다. 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 의해 단량체 함량은 증가하였다. 활성탄 재료 풀액에 잔류한 HCP 및 PLBL2 는, 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 의해 제거되고, 특히 PLBL2 는 정량 한계 부근까지 제거되었다.

2) 개량 방법 4 에 의한 불순물 클리어런스 (Mab G)

본 실시예는, 표 23 에 나타내는 정제 플로에 있어서의 Mab G 로 불리는 모노클로널 항체의 불순물 클리어런스에 대해 설명한다.

Mab G 를 산생한 CHO 세포 배양액에 대해, 뎁스 필터 여과에 의해 세포를 제거하고, 청징화하였다. 세포 배양 상청을, KanCapA 수지를 사용한 프로테인 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 20 mM 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5) 로 칼럼을 평형화한 후, 배양 상청을 로드하고, 그 후, 1 M 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5), 계속해서 20 mM 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5) 로 세정을 실시하였다. 아세트산 버퍼 (pH 3.6) 로 Mab G 를 칼럼으로부터 용출시켰다. 280 ㎜ 의 흡광도를 모니터링하여, Mab G 를 포함하는 획분을 취득하였다 (어피니티 크로마토그래피 풀액). 어피니티 크로마토그래피 풀액에 염산을 첨가하여 pH 를 3.7 로 조정하고, 1 시간 바이러스 불활화 처리를 실시하였다. 그 공정은 실온에서 실시하였다. 1 시간의 바이러스 불활화 처리 후, 트리스 수용액을 사용하여 pH 5.0 으로 중화시켰다 (바이러스 불활화액). 바이러스 불활화액을, 미리 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 세정한 뎁스 필터 (Millistak＋ (등록 상표) Pod A1HC) 에 약 800 g/㎡ 로 부하하고, 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하여, Mab G 를 회수하였다 (뎁스 필터 여과 풀액). 뎁스 필터 여과 풀액을, 미리 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 세정한 활성탄 필터 (Millistak＋ (등록 상표) Pod CR40) 에 약 700 g/㎡ 로 부하하고, 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하고, 0.2 ㎛ 의 필터로 여과하여, 보존하였다 (활성탄 재료 풀액). 미리 주사용수, 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 평형화한 POROS Benzyl Ultra 를 충전한 HIC 칼럼에 활성탄 재료 풀액을 통액시켰다. HIC 칼럼에 대한 로딩 밀도는 약 300 g/ℓ 수지로 하였다. 로드 후, 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하였다. 280 ㎜ 의 흡광도를 모니터링하여, Mab G 를 포함하는 획분을 취득하여, F/T 모드에 의한 HIC 재료 풀액으로 하였다. 미리 1 M 염화나트륨을 포함하는 아세트산 버퍼 (pH 5.0), 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 평형화한 POROS XS 를 충전한 CEX 칼럼에 HIC 재료 풀액을 통액시켰다. CEX 칼럼에 대한 로딩 밀도는 약 1300 g/ℓ 수지로 설정하였다. 로드 후, 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하였다. 280 ㎜ 의 흡광도를 모니터링하여, Mab G 를 포함하는 획분을 취득하고, 계속해서 0.2 ㎛ 의 필터로 여과하여 F/T 모드에 의한 CEX 재료 풀액으로 하였다.

개량 방법 4 에 있어서의 불순물 클리어런스의 결과를 표 25 에 나타낸다. 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 의해 단량체 함량은 증가하였다. 활성탄 재료 풀액에 잔류한 HCP 및 PLBL2 는, 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 의해 제거되고, 특히 PLBL2 는 정량 한계 부근까지 제거되었다.

실시예 8. 활성탄 재료에 의한 불순물 클리어런스 (Mab A)

본 실시예는, 이하의 표 26 에 나타내는 정제 플로에 있어서의 Mab A 로 불리는 모노클로널 항체의 활성탄 재료에 의한 불순물 클리어런스에 대해 설명한다.

1) 재료 및 방법

Mab A 를 산생한 CHO 세포 배양액에 대해, 뎁스 필터 여과에 의해 세포를 제거하고, 청징화하였다. 세포 배양 상청을, KanCapA 수지를 사용한 프로테인 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 20 mM 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5) 로 칼럼을 평형화한 후, 배양 상청을 로드하고, 그 후, 1 M 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5), 계속해서 20 mM 염화나트륨을 포함하는 인산 버퍼 (pH 7.5) 로 세정을 실시하였다. 아세트산 버퍼 (pH 3.6) 로 Mab A 를 칼럼으로부터 용출시켰다. 280 ㎜ 의 흡광도를 모니터링하여, Mab A 를 포함하는 획분을 취득하였다 (어피니티 크로마토그래피 풀액). 어피니티 크로마토그래피 풀액에 염산을 첨가하여 pH 를 3.5 로 조정하고, 1 시간 바이러스 불활화 처리를 실시하였다. 그 공정은 실온에서 실시하였다. 1 시간의 바이러스 불활화 처리 후, 트리스 수용액을 사용하여 pH 5.0 으로 중화시켰다 (바이러스 불활화액). 바이러스 불활화액을, 미리 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 세정한 뎁스 필터 (Millistak＋ (등록 상표) Pod A1HC) 에 124 ℓ/㎡ 로 부하하고, 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 압출을 실시하여, Mab A 를 회수하였다 (뎁스 필터 여과 풀액). 뎁스 필터 여과 풀액을 염산 또는 트리스 수용액에 의해 pH 4.5, pH 5.0, pH 5.5, pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0, pH 7.5 로 조정하고, 0.2 ㎛ 의 필터로 여과하여, 보존하였다 (pH 조정 활성탄 재료 로드액). 뎁스 필터 여과 풀액을 한외 여과·다이아필트레이션에 의해 전기 전도도 2 mS/㎝, 4 mS/㎝, 5 mS/㎝, 6 mS/㎝, 8 mS/㎝, 10 mS/㎝ 로 조정하고, 0.2 ㎛ 의 필터로 여과하여, 보존하였다 (전기 전도도 조정 활성탄 재료 로드액).

pH 조정 활성탄 재료 로드액을 미리 로드액과 동일한 pH 의 아세트산 버퍼 (pH 4.5, pH 5.0, pH 5.5, pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0, pH 7.5) 로 각각 세정한 활성탄 필터 (Millistak＋ (등록 상표) Pod CR40) 에 60 ℓ/㎡ 또는 100 ℓ/㎡ 로 부하하고, 계속해서 로드액과 동일한 pH 의 아세트산 버퍼 (pH 4.5, pH 5.0, pH 5.5, pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0, pH 7.5) 로 각각 압출을 실시하여, Mab A 를 회수하여 pH 조정 활성탄 재료 풀액으로 하였다. 전기 전도도 조정 활성탄 재료 로드액을 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 각각 세정한 활성탄 필터 (Millistak＋ (등록 상표) Pod CR40) 에 60 ℓ/㎡ 로 부하하고, 계속해서 아세트산 버퍼 (pH 5.0) 로 각각 압출을 실시하여, Mab A 를 회수하여 전기 전도도 조정 활성탄 재료 풀액으로 하였다.

2) 결과

표 26 에 나타내는 정제 플로 중 부하량 60 ℓ/㎡ 의 활성탄 필터 여과에 있어서의 불순물 클리어런스의 결과를 표 27 및 표 28 에 나타낸다. pH 및 전기 전도도에 의해 HCP 제거율은 큰 영향을 받지 않았다. PLBL2 는 pH 가 낮을수록, 또는 전기 전도도가 낮을수록 제거율이 커지는 경향이 있었다. 침출 프로테인 A 는 pH 가 낮을수록, 제거율이 커지는 경향이 있었다. MLV 및 MMV 는 pH 가 낮을수록, 또는 전기 전도도가 낮을수록 제거율이 커지는 경향이 있었다. 표 26 에 나타내는 정제 플로로 얻어지는 활성탄 재료 로드액의 pH 및 전기 전도도의 조건은, 활성탄 필터 여과에 있어서 높은 불순물 제거율을 나타내는 조건인 것이 확인되었다.

산업상 이용가능성

본 발명의 항체 정제법에 의해, 정제 기간을 단축시키는 데다가 불순물을 효율적으로 제거하여, 항체를 인간 치료용으로서 사용하기에 충분한 순도까지 정제하고, 또한 제조 비용을 저감시키는 것이 가능해졌다.

Claims

항체를 하나 또는 복수의 불순물을 포함하는 조성물로부터 정제하기 위한 수법으로서,
a1. 항체를 함유하는 세포 배양 상청을 준비하고,
b1. 상기 세포 배양 상청을 어피니티 크로마토그래피 수지에 의해 처리하여, 항체를 포함하는 어피니티 크로마토그래피 풀액을 얻고,
c1. 상기 어피니티 크로마토그래피 풀액에 있어서 바이러스를 불활화하여, 바이러스 불활화액을 얻고,
d1. 상기 바이러스 불활화액을 활성탄 재료에 의해 처리하여, 활성탄 재료 풀액을 얻고,
e1. 상기 활성탄 재료 풀액을 양이온 교환 재료에 의해 처리하여, 양이온 교환 재료 풀액을 얻는다
의 a1. 내지 e1. 의 공정을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,
항체를 하나 또는 복수의 불순물을 포함하는 조성물로부터 정제하기 위한 수법으로서,
a2. 항체를 함유하는 세포 배양 상청을 준비하고,
b2. 상기 세포 배양 상청을 어피니티 크로마토그래피 수지에 의해 처리하여, 항체를 포함하는 어피니티 크로마토그래피 풀액을 얻고,
c2. 상기 어피니티 크로마토그래피 풀액에 있어서 바이러스를 불활화하여, 바이러스 불활화액을 얻고,
d2. 상기 바이러스 불활화액을 뎁스 필터에 의해 처리하여, 뎁스 필터 여과 풀액을 얻고,
e2. 상기 뎁스 필터 여과 풀액을 활성탄 재료에 의해 처리하여, 활성탄 재료 풀액을 얻고,
f2. 상기 활성탄 재료 풀액을 양이온 교환 재료에 의해 처리하여, 양이온 교환 재료 풀액을 얻는다
의 a2. 내지 f2. 의 공정을 포함하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
어피니티 크로마토그래피 수지가 프로테인 A 수지인 방법.
제 3 항에 있어서,
프로테인 A 수지가, KanCapA, KanCapA3G, MabSelect SuRe, MabSelect SuRe pcc, MabSelect PrismA, 또는 Amsphere A3 인 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
바이러스 불활화가, 산, 계면 활성제, 화학 물질, 핵산 가교제, 자외선, 감마선 및 열에 의한 처리로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나인 방법.
제 5 항에 있어서,
바이러스 불활화가, 어피니티 크로마토그래피 풀액의 pH 를 3 ∼ 4 로 저하시키는 것을 포함하는 방법.
제 6 항에 있어서,
바이러스 불활화 중에, 어피니티 크로마토그래피 풀액을 60 ∼ 120 분간 인큐베이트하는 방법.
제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
바이러스 불활화 중에, 어피니티 크로마토그래피 풀액을 15 ∼ 30 ℃ 에서 인큐베이트하는 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
활성탄 재료에 로드하는 용액, 활성탄 재료의 평형화 버퍼 및 세정 버퍼의 pH 가, 4.5 ∼ 7.5 인 방법.
제 9 항에 있어서,
활성탄 재료에 로드하는 용액, 활성탄 재료의 평형화 버퍼 및 세정 버퍼의 pH 가, 4.5 ∼ 5.5 인 방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
활성탄 재료에 로드하는 용액, 활성탄 재료의 평형화 버퍼 및 세정 버퍼의 전기 전도도가, 2 ∼ 10 mS/㎝ 인 방법.
제 11 항에 있어서,
활성탄 재료에 로드하는 용액, 활성탄 재료의 평형화 버퍼 및 세정 버퍼의 전기 전도도가, 2 ∼ 5 mS/㎝ 인 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
활성탄 재료에 의한 처리가, 활성탄 재료를 포함하는 필터를 사용하여 실시되는 방법.
제 13 항에 있어서,
필터가, Millistak＋ Pod CR40, Zeta Plus 활성탄 흡착 뎁스 필터, 또는 SUPRAcap 50 Seitz AKS filter 인 방법.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
양이온 교환 재료에 대하여, 활성탄 재료 풀액이, 그 양이온 교환 재료의 흡착 용량을 초과하여 로드되는 방법.
제 15 항에 있어서,
양이온 교환 재료에 대한 활성탄 재료 풀액의 로딩 밀도가, 500 ∼ 2000 g/ℓ 인 방법.
제 16 항에 있어서,
양이온 교환 재료에 대한 활성탄 재료 풀액의 로딩 밀도가 1000 ∼ 1500 g/ℓ 인 방법.
제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
양이온 교환 재료가, 수지, 모놀리스 칼럼, 또는 막인 방법.
제 18 항에 있어서,
양이온 교환 재료의 관능기가, 술포프로필, 술포에틸, 술포이소부틸, 또는 카르복실인 방법.
제 19 항에 있어서,
양이온 교환 재료가, POROS XS, Eshmuno CPX, Eshmuno CP-FT, 또는 CaptoS ImpAct 인 방법.
제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
양이온 교환 재료에 로드하는 용액의 pH 가, 4 ∼ 6 인 방법.
제 21 항에 있어서,
양이온 교환 재료에 로드하는 용액의 pH 가, 4.5 ∼ 5.5 인 방법.
제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
양이온 교환 재료에 로드하는 용액의 전기 전도도가, 3 ∼ 7 mS/㎝ 인 방법.
제 23 항에 있어서,
양이온 교환 재료에 로드하는 용액의 전기 전도도가, 3 ∼ 5 mS/㎝ 인 방법.
제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
양이온 교환 재료 풀액을, 추가로 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 의해 처리하여, 풀액을 얻는 방법.
제 25 항에 있어서,
소수성 상호 작용 크로마토그래피가, 플로 스루 모드인 방법.
제 26 항에 있어서,
소수성 상호 작용 크로마토그래피가, 수지 또는 막을 사용하여 실시되는 방법.
제 27 항에 있어서,
소수성 상호 작용 크로마토그래피 수지 또는 막이, 페닐기, 벤질기 또는 헥실기를 갖는 방법.
제 28 항에 있어서,
소수성 상호 작용 크로마토그래피 재료가, POROS Benzyl Ultra, POROS Benzyl, Hexyl-650C, Phenyl Sepharose 6 Fast Flow, Phenyl Sepharose High Performance, Sartobind Phenyl 또는 ReadyToProcess Adsorber Phenyl 인 방법.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
활성탄 재료 풀액을, 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 의해 처리하여, 풀액을 얻고, 추가로 양이온 교환 재료에 의해 처리하여, 풀액을 얻는 방법.
제 30 항에 있어서,
소수성 상호 작용 크로마토그래피가, 플로 스루 모드인 방법.
제 31 항에 있어서,
소수성 상호 작용 크로마토그래피가, 수지 또는 막을 사용하여 실시되는 방법.
제 32 항에 있어서,
소수성 상호 작용 크로마토그래피 수지 또는 막이, 페닐기, 벤질기 또는 헥실기를 갖는 방법.
제 33 항에 있어서,
소수성 상호 작용 크로마토그래피 재료가, POROS Benzyl Ultra, POROS Benzyl, Hexyl-650C, Phenyl Sepharose 6 Fast Flow, Phenyl Sepharose High Performance, Sartobind Phenyl 또는 ReadyToProcess Adsorber Phenyl 인 방법.
제 30 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
양이온 교환 재료에 대하여, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 풀액이, 그 양이온 교환 재료의 흡착 용량을 초과하여 로드되는 방법.
제 35 항에 있어서,
양이온 교환 재료에 대한 소수성 상호 작용 크로마토그래피 풀액의 로딩 밀도가, 500 ∼ 2000 g/ℓ 인 방법.
제 36 항에 있어서,
양이온 교환 재료에 대한 소수성 상호 작용 크로마토그래피 풀액의 로딩 밀도가 1000 ∼ 1500 g/ℓ 인 방법.
제 30 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
양이온 교환 재료가, 수지, 모놀리스 칼럼, 또는 막인 방법.
제 38 항에 있어서,
양이온 교환 재료의 관능기가, 술포프로필, 술포에틸, 술포이소부틸, 또는 카르복실인 방법.
제 39 항에 있어서,
양이온 교환 재료가, POROS XS, Eshmuno CPX, Eshmuno CP-FT, 또는 CaptoS ImpAct 인 방법.
제 30 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
양이온 교환 재료에 로드하는 용액의 pH 가, 4 ∼ 6 인 방법.
제 41 항에 있어서,
양이온 교환 재료에 로드하는 용액의 pH 가, 4.5 ∼ 5.5 인 방법.
제 30 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서,
양이온 교환 재료에 로드하는 용액의 전기 전도도가, 3 ∼ 7 mS/㎝ 인 방법.
제 43 항에 있어서,
양이온 교환 재료에 로드하는 용액의 전기 전도도가, 3 ∼ 5 mS/㎝ 인 방법.
제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 불순물이, 숙주 세포 유래 단백질 (Host cell protein ; HCP), 포스포리파아제 B 유사 단백질 2 (phospholipase B-like 2, PLBL2), 바이러스, 바이러스형 입자, 고분자량체 (high molecular weight species ; HMWS), 저분자량체 (low molecular weight species ; LMWS), 배지 성분, 침출 프로테인 A 및/또는 DNA 로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
제 1 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서,
공정이 연속적인 방법.
제 1 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 정제된 항체.