JP2013173747A - 陽イオン交換クロマトグラフィーによる抗体の精製 - Google Patents

陽イオン交換クロマトグラフィーによる抗体の精製 Download PDF

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デボラ アン オコナー，
Aurelia Safta
オーリーリア サフタ，
Mandakini Sharma
マンダキニ シャルマ，
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Abstract

【課題】抗体と少なくとも一の汚染物質を含有する組成物から抗体を精製する方法の提供。
【解決手段】増加した伝導率を有する溶出バッファーを使用して所望の抗体を溶出する前に、高ｐＨの洗浄工程が使用されて汚染物質が除去される、陽イオン交換クロマトグラフィーにより抗体を精製する方法であって、（ａ）陽イオン交換材料に組成物をロードし、（ｂ）（ａ）の組成物のｐＨよりも高いｐＨで第一洗浄バッファーを用いて陽イオン交換材料を洗浄し、（ｃ）第一洗浄バッファーのｐＨより低いｐＨで第二洗浄バッファーを用いて陽イオン交換材料を洗浄し、（ｄ）第二洗浄バッファーよりも実質的に高い伝導率で溶出バッファーを用いて陽イオン交換材料から抗体を溶出させる方法。
【選択図】なし

Description

関連出願
この出願は、その開示の全体が全ての目的に対して出典明示によりここに援用される２００７年１０月３０日出願の米国仮特許出願第６０／９８３８２５号の優先権を主張する。
(発明の分野)
この発明は一般にタンパク質の精製に関する。特に、本発明は、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用し、抗体と少なくとも一の汚染物質を含有する組成物から抗体を精製する方法に関し、ここで、増加した伝導率を有する溶出バッファーを使用して所望の抗体を溶出する前に、高ｐＨの洗浄工程が使用されて汚染物質が除去される。
(関連技術の記述)
タンパク質の大規模で経済的な精製は、バイオテクロノジー産業にとってますます重要な問題となっている。一般に、タンパク質は、そのタンパク質の遺伝子を含む組換え型プラスミドの挿入により対象となるタンパク質を産生するように操作された真核細胞又は原核細胞株を用いて、細胞培養によって産生される。典型的に使用される細胞株は生きている生物体であるので、それには、通常は動物の血清の調製物から供給される増殖因子、アミノ酸、糖を含む複合増殖培地を与えなければならない。細胞に与えた化合物の混合物から、また細胞自体の副生成物から所望のタンパク質を、ヒトの治療用として使うために十分な純度で分離することは、大変な挑戦である。
細胞片からタンパク質を精製する手順は、最初はタンパク質の発現部位に依存する。細胞から周囲の増殖培地中へ直接分泌せしめられるタンパク質があり；細胞内で生産されるタンパク質もある。後者のタンパク質の場合、精製プロセスの最初の工程は、機械的剪断、浸透圧ショック、あるいは酵素処理を含む様々な方法により行うことができる細胞の溶解を含む。このような破壊は、細胞の全内容物をホモジネート中へ放出し、加えて、その微小なサイズのために取り除くことが難しい細胞内断片を作り出す。これらは一般に分画遠心法又は濾過法で取り除かれる。小規模ではあるが、細胞の自然死やタンパク質産生工程の過程での細胞内宿主細胞タンパク質の放出のために直接分泌されるタンパク質の場合にも同じ問題が生じる。
対象タンパク質を含む精製液が一旦得られれば、細胞によって産生される他のタンパク質からの分離は、通常、異なるクロマトグラフィー法の組合せを用いて試みられる。これらの技術は、その電荷、疎水性の程度、又は大きさに基づいてタンパク質混合物を分離する。幾つかの異なるクロマトグラフィー用樹脂を、これらのそれぞれの技術に使用することができ、関与する特定のタンパク質にこれらの分離スキームを正確に適合化することが可能である。これらそれぞれの分離法の本質は、タンパク質を、異なる速度で長いカラムを流下させ、それらがカラムを更に流下するにつれて増加する物理的分離を達成するか、又は、分離媒体に選択的に付着するようにし、ついで異なる溶媒によって差次的に溶出させるかのいずれかである。場合によっては、不純物が特異的にカラムに付着し、対象のタンパク質が付着しない場合、つまり、対象のタンパク質が「フロースルー」中に存在する場合に、所望のタンパク質が不純物から分離される。
イオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質の精製に一般的に使用されているクロマトグラフィー技術である。周囲バッファーのイオン強度が低い場合、イオン交換クロマトグラフィーにおいて、溶質表面上の荷電パッチはクロマトグラフィーマトリックスに結合している反対の電荷に誘引される。一般的には、イオン交換マトリックスの荷電部位に対して溶質と競合するバッファーのイオン強度(すなわち、伝導率)を増加させることによって溶出させる。ｐＨを変化させ、よって溶質の荷電を変えることは、溶質の溶出を達成するための別の方法である。伝導率又はｐＨにおける変化は、徐々に(勾配溶出)又は段階的(段階溶出)でありうる。過去では、これらの変化は漸進的である；すなわち、ｐＨ又は伝導率は、一方向に増加し又は減少する。
米国特許第６３３９１４２号、同第６４１７３５５号、同第６４８９４４７号、及び同第７０７４４０４号(Baseyら)には、ポリペプチドを精製するためのイオン交換クロマトグラフィーが記載されている。米国特許第６１２７５２６号、同第６３３３３９８号、及び同第６７９７８１４号(Blank, G.)には、プロテインＡクロマトグラフィーによる、精製されたタンパク質、例えば抗ＨＥＲ２抗体が記載されている。イオン交換クロマトグラフィーによる、抗体等のタンパク質を精製する方法は、米国特許出願第２００４／００８２０４７号に記載されている。
米国特許第５１１０９１３号は、第一のｐＨ４．６でイオン交換樹脂に抗体を結合させ、第２のｐＨ５．５で洗浄し、ｐＨ６．５で抗体を溶出させることにより、水溶液において抗体を精製することに言及しており、ここでこれら３つの工程の溶液のイオン強度は一定のままである。Zhangらは、Ｑメンブレン、ヒト抗体のアニオン交換クロマトグラフィーについて言及している(Zhangら 「Q Membrane Chromatography Application for Human Antibody Purification Process」, BioProduction提供のPoster, 2004年10月26-27. ミュンヘン, 独国)。タンパク質精製に関する他の文献には：Barnthouseら J. Biotech. 66: 125-136(1998)；Blankら Bioseparation 10: 65-71(2001)；Follman及びFahrner J. Chromatog. 1024: 79-85(2004)；Iyerら BioPharm 15(1):14-16, 18, 20, 53(2002)；米国特許第２００４／００８２０４７Ａ１号；欧州特許出願公開第３３３５７４号；欧州特許第４６０４２６Ｂ１号；欧州特許出願公開第５５６０８３号；国際公開第８９／０５１５７号；国際公開第９２／２２６５３号；国際公開第９３／０６２１７号；国際公開第９５／２２３８９号；国際公開第９６／３３２０８号；国際公開第９６／４０８８３号；米国特許第４７５３８９４号；米国特許第４９６６８５１号；米国特許第５１１０９１３号；米国特許第５１１２９５１号；米国特許第５１１５１０１号；米国特許第５１１８７９６号；米国特許第５１６９７７４号；米国特許第５１９６３２３号；米国特許第５２５６７６９号；米国特許第５２７９８２３号；米国特許第５４２９７４６号；米国特許第５４５１６６２号；米国特許第５５２５３３８号；米国特許第５６７７１７１号；米国特許第６００５０８１号；米国特許第６０５４５６１号；米国特許第６１２７５２６号；米国特許第６２６７９５８号；米国特許第６３３９１４２号；米国特許第６４１７３３５号；米国特許第６４８９４４７号；Adachiら, Journal of Chromatography. A. 763(1-2):57-63(1997年2月28日)；Gagnon, P., Purification Tools for Monoclonal Antibodies, Tucson:Validated Biosystems, Inc., Chapter 4, pps. 57-86(1996)；Grafら, Bioseparation 4(1):7-20(1994年2月)；Mhatreら, Journal of Chromatography A 707(2):225-231(1995年7月21日); Neidhardtら, Journal of Chromatography 590(2):255-261(1992)；Protein Purification Applications - A Practical Approach, Harris and Angal, IRL Press pps. 151-156(1995)；Soferら Handbook of Process Chromatography: A Guide to Optimization, Scale-up, and Validation, San Diego:Academic Press pps. 65-80(1997)；Tishchenkoら, Journal of Chromatography B 706(1):157-166(1998年2月27日)が含まれる。
ここで、本発明は、高ｐＨの洗浄工程を使用し、所望の抗体産物を溶出する前に汚染物質を除去する、抗体の陽イオン交換クロマトグラフィーの改善した方法に関する。本方法により、特にチャイニーズハムスター卵巣タンパク質(ＣＨＯＰ)汚染物質の除去が改善される。
第一の態様では、本発明は、抗体と少なくとも一の汚染物質を含有する組成物から抗体を精製する方法を提供するもので、ここで、本方法は、
(ａ)陽イオン交換材料に組成物をロードし、ここで組成物は第一のｐＨにあり；
(ｂ)(ａ)の組成物のｐＨよりも高いｐＨで第一洗浄バッファーを用いて陽イオン交換材料を洗浄し、ここで第一洗浄バッファーのｐＨは約６．８〜約９．０であり；
(ｃ)第一洗浄バッファーのｐＨより低いｐＨで第二洗浄バッファーを用いて陽イオン交換材料を洗浄し；
(ｄ)第二洗浄バッファーよりも実質的に高い伝導率で溶出バッファーを用いて陽イオン交換材料から抗体を溶出させる
逐次工程を含む。
好ましくは、抗体は、リツキシマブ等、ヒトＣＤ２０に結合するか、又はベバシズマブ等、血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)に結合する。
好ましい一実施態様では、本発明は、ヒトＣＤ２０に結合する抗体を、該抗体と、チャイニーズハムスター卵巣タンパク質(ＣＨＯＰ)、浸出プロテインＡ、ＤＮＡ、及び凝集ＣＤ２０抗体からなる群から選択される一又は複数の汚染物質を含有する組成物から精製する方法に関し、該方法は、
(ａ)陽イオン交換材料に組成物をロードし、ここで組成物は約４．０〜約６．０のｐＨであり；
(ｂ)約６．８〜約９．０のｐＨで第一洗浄バッファーを用いて陽イオン交換材料を洗浄し；
(ｃ)約５．０〜約６．０のｐＨで第二洗浄バッファーを用いて陽イオン交換材料を洗浄し；さらに
(ｄ)約５．０〜約６．０のｐＨ、及び約１０〜約１００ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する溶出バッファーを用いて陽イオン交換材料から抗体を溶出させる
逐次工程を含む。好ましくは、ＣＤ２０抗体はリツキシマブである。
他の好ましい実施態様では、本発明は、ヒト血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)に結合する抗体を、該抗体と、細胞培養培地成分、ガラマイシン(garamycin)、チャイニーズハムスター卵巣タンパク質(ＣＨＯＰ)、ＤＮＡ、ウイルス性汚染物質、及び凝集ＶＥＧＦ抗体からなる群から選択される一又は複数の汚染物質を含有する組成物から精製する方法に関し、該方法は、
(ａ)陽イオン交換材料に組成物をロードし、ここで組成物は約４．０〜約６．０のｐＨであり；
(ｂ)約６．８〜約８．０のｐＨで第一洗浄バッファーを用いて陽イオン交換材料を洗浄し；
(ｃ)約５．０〜約６．０のｐＨで第二洗浄バッファーを用いて陽イオン交換材料を洗浄し；さらに
(ｄ)約５．０〜約６．０のｐＨ及び約１０〜約１００ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する溶出バッファーを用いて陽イオン交換材料から抗体を溶出させる
逐次工程を含む。好ましくは、ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブである。
また本発明は、約７．８のｐＨで、約２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するバッファーにリツキシマブを含有してなる組成物に関する。
さらに本発明は、約７．０のｐＨで、約２５ｍＭのＭＯＰＳを含有するバッファーにベバシズマブを含有してなる組成物を提供する。
図１Ａ及び図１Ｂは、リツキシマブ抗体の重鎖(配列番号：１)及び軽鎖(配列番号：２)のアミノ酸配列を提供する。それぞれの可変領域における、各クレームワーク領域(ＦＲ１-４)及び各ＣＤＲ領域(ＣＤＲ１-３)は同一であり、ヒトガンマ１重鎖定常配列及びヒトカッパ軽鎖定常配列である。可変重(ＶＨ)領域は配列番号：３に存在する。可変軽(ＶＬ)領域は配列番号：４に存在する。ＣＤＲについての配列識別子は：ＣＤＲ Ｈ１(配列番号：５)、ＣＤＲ Ｈ２(配列番号：６)、ＣＤＲ Ｈ３(配列番号：７)、ＣＤＲＬ１(配列番号：８)、ＣＤＲ Ｌ２(配列番号：９)、及びＣＤＲ Ｌ３(配列番号：１０)である。 図１Ａ及び図１Ｂは、リツキシマブ抗体の重鎖(配列番号：１)及び軽鎖(配列番号：２)のアミノ酸配列を提供する。それぞれの可変領域における、各クレームワーク領域(ＦＲ１-４)及び各ＣＤＲ領域(ＣＤＲ１-３)は同一であり、ヒトガンマ１重鎖定常配列及びヒトカッパ軽鎖定常配列である。可変重(ＶＨ)領域は配列番号：３に存在する。可変軽(ＶＬ)領域は配列番号：４に存在する。ＣＤＲについての配列識別子は：ＣＤＲ Ｈ１(配列番号：５)、ＣＤＲ Ｈ２(配列番号：６)、ＣＤＲ Ｈ３(配列番号：７)、ＣＤＲＬ１(配列番号：８)、ＣＤＲ Ｌ２(配列番号：９)、及びＣＤＲ Ｌ３(配列番号：１０)である。 図１Ａ及び図１Ｂは、リツキシマブ抗体の重鎖(配列番号：１)及び軽鎖(配列番号：２)のアミノ酸配列を提供する。それぞれの可変領域における、各クレームワーク領域(ＦＲ１-４)及び各ＣＤＲ領域(ＣＤＲ１-３)は同一であり、ヒトガンマ１重鎖定常配列及びヒトカッパ軽鎖定常配列である。可変重(ＶＨ)領域は配列番号：３に存在する。可変軽(ＶＬ)領域は配列番号：４に存在する。ＣＤＲについての配列識別子は：ＣＤＲ Ｈ１(配列番号：５)、ＣＤＲ Ｈ２(配列番号：６)、ＣＤＲ Ｈ３(配列番号：７)、ＣＤＲＬ１(配列番号：８)、ＣＤＲ Ｌ２(配列番号：９)、及びＣＤＲ Ｌ３(配列番号：１０)である。 図２Ａ及び図２Ｂは、ベバシズマブ抗体の重鎖(配列番号：１１)及び軽鎖(配列番号：１２)のアミノ酸配列を提供する。各可変領域の末端は‖で示す。可変重(ＶＨ)領域は配列番号：１３に存在する。可変軽(ＶＬ)領域は配列番号：１４に存在する。各可変領域における３つのＣＤＲそれぞれに下線を付する。ＣＤＲについての配列識別子は：ＣＤＲ Ｈ１(配列番号：１５)、ＣＤＲ Ｈ２(配列番号：１６)、ＣＤＲ Ｈ３(配列番号：１７)、ＣＤＲ Ｌ１(配列番号：１８)、ＣＤＲ Ｌ２(配列番号：１９)、及びＣＤＲ Ｌ３(配列番号：２０)である。 図３は、元の方法と比較して、改善されたリツキシマブ法の陽イオン交換クロマトグラフィー方法による、宿主細胞タンパク質除去の対照比較を提供する。優れたＣＨＯＰ除去が新規方法により達成された。
定義：
ここで、「約」なる用語で前置きされた数的範囲又は量は、正確な範囲又は正確な数量を明示的に含む。
ここで精製される「組成物」は、関心ある抗体と一又は複数の汚染物質を含有する。組成物は「部分的に精製」(すなわち、一又は複数の精製工程が施されている)されてもよく、又は抗体を産生する宿主細胞又は生物体から直接得てもよい(例えば、組成物は、収集された細胞培養液を含んでいてもよい)。
ここで使用される場合、「ポリペプチド」とは、一般的に約１０以上のアミノ酸を有するペプチド及びタンパク質を意味する。好ましくは、ポリペプチドは哺乳動物タンパク質であり、例えばレニン；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α-１-アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；濾胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、及びフォン・ウィルブランド因子などの凝固因子；プロテインＣ等の抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；プラスミノーゲン活性化剤、例えばウロキナーゼ又はヒト尿素又は組織型プラスミノーゲンアクチベータ(ｔ-ＰＡ)；ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子；腫瘍壊死因子-α及びβ；エンケファリン分解酵素；ＲＡＮＴＥＳ(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)；ヒトマクロファージ炎症タンパク質(ＭＩＰ-１-α)；ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン；ミューラー阻害物質；リラキシンＡ-鎖；リラキシンＢ-鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β-ラクタマーゼ等の微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ-４等の細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原(ＣＴＬＡ)；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)；ホルモン又は増殖因子のレセプター；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)、ニューロトロフィン-３、-４、-５又は-６(ＮＴ-３、ＮＴ-４、ＮＴ-５、又はＮＴ-６)、又は神経増殖因子、例えばＮＧＦ-β；血小板誘導増殖因子(ＰＤＧＦ)；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ等の線維芽細胞増殖因子；上皮増殖因子(ＥＧＦ)；ＴＧＦ-α、及びＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４、又はＴＧＦ-β５を含む、ＴＧＦ-β等のトランスフォーミング増殖因子(ＴＧＦ)；インスリン様増殖因子-Ｉ及び-ＩＩ(ＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦ-ＩＩ)；ｄｅｓ(１-３)-ＩＧＦ-Ｉ(脳ＩＧＦ-Ｉ)、インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９及びＣＤ２０等のＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質(ＢＭＰ)；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、例えば、Ｍ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦ、及びＧ-ＣＳＦ；インターロイキン(ＩＬ)、例えば、ＩＬ-１ないしＩＬ-１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス性抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ-４及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター；及び上に列挙したポリペプチド並びに抗体の何れかの断片及び／又は変異体、例えば上に列挙したポリペプチドの何れかに結合する抗体断片が含まれる。 好ましいポリペプチドは、例えばリツキシマブ等、ヒトＣＤ２０に結合する無傷抗体又は抗体断片；又は例えばベバシズマブ等、ヒト血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)に結合する無傷抗体又は抗体断片である。
「汚染物質」は所望される抗体産物とは異なる物質である。汚染物質には、限定されるものではないが、宿主細胞物質、例えばチャイニーズハムスター卵巣タンパク質(ＣＨＯＰ)；浸出プロテインＡ；核酸；所望する抗体の変異体、断片、凝集体又は誘導体；他のポリペプチド；エンドトキシン；ウイルス性汚染物質；細胞培養培地成分(例えば、ガラマイシン；ゲンタマイシン(登録商標))等が含まれる。
「陽イオン交換材料」なる表現は、負に荷電している固相であって、固相上又は固相中を通過する水溶液中の陽イオンと交換される遊離の陽イオンを有する固相を意味する。荷電は、固相に一又は複数の荷電リガンドを例えば共有結合により付着させることにより得られうる。別法として、又は加えて、荷電は、固相に固有の性質であってもよい(例えば全体的に負に荷電しているシリカの場合のように)。商業的に入手可能な陽イオン交換材料には、カルボキシ-メチル-セルロース、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ ＡＢＸＴＭ、アガロースに固定されたスルホプロピル(ＳＰ)(例えば、GE HealthcareのSP-SEPHAROSE FAST FLOWＴＭ、SP-SEPHAROSE FAST FLOW XLＴＭ、又はSP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCEＴＭ)、ＣＡＰＴＯ ＳＴＭ(GE Healthcare)、ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ−ＳＯ３ＴＭ、ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ−ＳＥ ＨＩＣＡＰＴＭ、及びＦＲＡＣＴＯＰＲＥＰＴＭ(EMD Merck)、アガロースに固定されたスルホニル(例えば、GE HealthcareのS-SEPHAROSE FAST FLOWＴＭ)、及びＳＵＰＥＲ ＳＰＴＭ(Tosoh Biosciences)が含まれる。ここで、好ましい陽イオン交換材料は、スルホプロピル基で官能化されたポリヒドロキシル化ポリマーで被覆された、架橋ポリ(スチレン-ジビニルベンゼン)フロースルー粒子(固相)(例えば、POROS 50 HS(登録商標)クロマトグラフィー樹脂)を含む。
「固相」とは、一又は複数の荷電リガンドが付着可能な非水性マトリックスを意味する。固相は、精製カラム(限定されるものではないが、拡張ベッド(expanded bed)及び充填ベッドカラムを含む)、離散粒子の不連続相、メンブレン、又はフィルター等であってよい。固相を形成する物質の具体例には、多糖類(例えば、アガロース及びセルロース)及び他の機械的に安定しているマトリックス、例えばシリカ(例えば制御されたポアガラス)、ポリ(スチレン-ジビニルベンゼン)、ポリアクリルアミド、セラミック粒子、及び上述した任意のものの誘導体が含まれる。
ここで「ロード物」なる用語は、陽イオン交換材料にロードされる組成物を意味する。好ましくは、陽イオン交換材料は、精製される組成物がロードされる前に、平衡化バッファーで平衡にされる。
「バッファー」は、 酸-塩基のコンジュゲート成分の作用によるｐＨの変化に抗する溶液である。例えば所望するバッファーのｐＨに応じて使用可能な種々のバッファーは、Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., Calbiochem Corporation編(1975)に記載されている。
「平衡化バッファー」は、関心ある抗体と、一又は複数の汚染物質を含有する組成物を、陽イオン交換材料にロードする前に、陽イオン交換材料を平衡にするために使用されるバッファーである。ここで好ましくは、平衡化バッファーのｐＨは約５．０〜約６．０の範囲にあり、好ましくは約５．５である。ここで好ましくは、平衡化バッファーの伝導率は、約１〜約８ｍＳ／ｃｍ、好ましくは約４〜約８ｍＳ／ｃｍ、最も好ましくは約５〜約８ｍＳ／ｃｍの範囲にある。場合によっては、平衡化バッファーは塩、例えば約４０ｍＭ〜約８０ｍＭ量のＮａＣｌ、好ましくは約６０ｍＭのＮａＣｌを含有する。
「洗浄バッファー」なる用語は、ここでは、組成物のロード後、かつ関心あるタンパク質の溶出前に、陽イオン交換材料上を通過させるバッファーを意味するために使用される。洗浄バッファーは、所望の抗体産物を実質的に溶出させることなく、陽イオン交換材料から一又は複数の汚染物質を除去するために供給され得る。ここでの発明の好ましい実施態様では、「第一洗浄バッファー」と「第二洗浄バッファー」が使用される。
ここで、「第一洗浄バッファー」なる表現は、ロード及び／又は平衡化バッファーのｐＨと比較して、高いｐＨを有する洗浄バッファーを意味する。第一洗浄バッファーは、そこから関心ある抗体産物を実質的に溶出させることなく、陽イオン交換材料から一又は複数の汚染物質を溶出させるために、ここで使用されうる。「第一」なる用語は、ローディングバッファーと第一洗浄バッファーの間で一又は複数の付加的な洗浄又は他のバッファーを使用することを除外していると解釈すべきではない。好ましくは、ここでの第一洗浄バッファーのｐＨは、約６．８〜約９．０、好ましくは約７．０〜約８．０、最も好ましくは約７．０〜約７．８のｐＨ範囲にある。好ましくは、ここでの第一洗浄バッファーの伝導率は、約０．０１〜約５ｍＳ／ｃｍ、好ましくは約０．１〜約３ｍＳ／ｃｍ、最も好ましくは約０．２〜約２ｍＳ／ｃｍの範囲にある。場合によっては、第一洗浄バッファーは塩(例えばＮａＣｌ)を実質的に含有しない。
この出願の目的に対して「第二洗浄バッファー」なる表現は、関心ある抗体を溶出させる陽イオン交換材料を準備するために、第一洗浄バッファーの後に使用される洗浄バッファーを意味する。「第二」なる用語は、第一洗浄バッファーと第二洗浄バッファーの間で一又は複数の付加的な洗浄又は他のバッファーを使用することを除外していると解釈すべきではない。好ましくは、ここでの第二洗浄バッファーのｐＨは、約５．０〜約６．０の範囲、好ましくは約５．５、最も好ましくは５．５である。好ましくは、ここでの第二洗浄バッファーの伝導率は、約０．０１〜約５ｍＳ／ｃｍ、好ましくは約０．１〜約３ｍＳ／ｃｍ、最も好ましくは約０．５〜約３．０ｍＳ／ｃｍの範囲にある。
「溶出バッファー」は、固相から関心ある抗体を溶出させるために使用される。ここで、溶出バッファーは、所望の抗体産物が陽イオン交換材料から溶出されるように、第二洗浄バッファーよりも実質的に高い伝導率を有する。好ましくは、溶出バッファーの伝導率は、ローディングバッファー及び先行する各バッファー、すなわち平衡化バッファー、第一洗浄バッファー、及び第二洗浄バッファーの伝導率よりも実質的に高い。「実質的に高い」伝導率とは、例えば、バッファーが、比較される組成物又はバッファーの伝導率よりも、少なくとも２、３、４、５又は６伝導率単位(ｍＳ／ｃｍ)高い伝導率を有することを意味する。一実施態様では、溶出バッファーのｐＨは、平衡化バッファー及び／又は第二洗浄バッファーのｐＨと実質的に同じである。好ましくは、ここでの溶出バッファーのｐＨは約５．０〜約６．０の範囲、好ましくは約５．５、最も好ましくは５．５である。好ましくは、ここでの溶出バッファーの伝導率は、約１０〜約１００ｍＳ／ｃｍ、好ましくは約１２ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、最も好ましくは約１２〜約２０ｍＳ／ｃｍの範囲にある。増加した伝導率は、塩、例えば塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウムを溶出バッファーに添加することにより達成され得る。好ましくは、溶出バッファーは約１００〜約３００ｍＭのＮａＣｌ、好ましくは約１５０ｍＭ〜約２００ｍＭのＮａＣｌ、例えば約１７５ｍＭのＮａＣｌ又は約１６０ｍＭのＮａＣｌを含有する。
「再生バッファー」は、陽イオン交換材料が再使用可能になるように、陽イオン交換材料を再生するために使用され得る。再生バッファーは、陽イオン交換材料から、実質的に全ての汚染物質及び関心ある抗体を除去するのに必要な伝導率及び／又はｐＨを有する。
「伝導率」なる用語は、２つの電極の間の電流を伝導させる水溶液の能力を意味する。溶液中では、電流はイオン輸送により流れる。よって、水溶液中に存在するイオン量を増加させると、溶液は高伝導率を有するようになる。伝導率の測定値の基本単位はジーメンス(又はｍｈｏ)、ｍｈｏ(ｍＳ／ｃｍ)であり、導電率計、例えば様々なモデルのオリオン導電率計を使用して測定可能である。電解伝導率は、溶液中における電流を運ぶイオンの能力であるため、溶液の伝導率は、そこでのイオン濃度が変化することにより変わり得る。例えば、溶液中の緩衝剤の濃度及び／又は塩(例えば、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、又は塩化カリウム)の濃度を、所望の伝導率が達成されるように変えてもよい。好ましくは、種々のバッファーの塩分濃度は、所望の伝導率が達成されるように調節される。
抗体と一又は複数の汚染物質を含有する組成物から抗体を「精製」するとは、組成物から少なくとも一の汚染物質を(完全に又は部分的に)除去することにより、組成物における抗体の純度を増加させることを意味する。「精製工程」は「均質」な組成物にする全体的な精製プロセスの一部であってもよい。ここで使用される「均質」とは、組成物の全重量に基づき少なくとも約７０重量％、好ましくは少なくとも約８０重量％、より好ましくは少なくとも約９０重量％、さらに好ましくは少なくとも約９５重量％の関心ある抗体を含有する組成物を意味する。
陽イオン交換材料に分子を「結合」させるとは、分子と陽イオン交換材料の荷電基又は荷電基群との間のイオン相互作用により、陽イオン交換材料内又は上に、分子が可逆的に固定化されるように、適切な条件下(ｐＨ及び／又は伝導率)で、分子を陽イオン交換材料に暴露させることを意味する。
陽イオン交換材料を「洗浄する」とは、陽イオン交換材料上に又はこれに通して、適切なバッファーを通過させることを意味する。
陽イオン交換材料から分子(例えば、抗体又は汚染物質)を「溶出させる」とは、そこから分子を除去することを意味する。
本発明の好ましい実施態様では、ここで精製される抗体は組換え抗体である。「組換え抗体」は、抗体をコードする核酸が形質移入又は形質転換された宿主細胞において精製されるものか、又は相同的組換えの結果として生成される抗体である。「形質転換」及び「形質移入」は交換可能に使用され、細胞に核酸を導入する方法を意味する。形質転換又は形質転換後、核酸は宿主細胞ゲノムに統合されてもよく、又は染色体外エレメントとして存在してもよい。「宿主細胞」には、インビトロ細胞培養における細胞、並びに宿主動物内の細胞が含まれる。ポリペプチドの組換え生産方法は、例えば、特に出典明示によりここに援用される米国特許第５５３４６１５号に記載されている。
出発ポリペプチドの「変異体」又は「アミノ酸配列変異体」は、出発ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を含有するポリペプチドのことである。一般的に、変異体は、天然ポリペプチドと、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するであろう。配列同一性パーセントは、例えばFitchら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1382-1386(1983)、Needlemanら, J. Mol. Biol. 48:443-453(1970)により記載されたアルゴリズムバージョンにより、最大相同性が提供される配列に整列させた後に決定される。ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、ポリペプチドをコードするＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入するか、又はペプチド合成により調製されうる。このような変異体には、関心あるポリペプチドのアミノ酸配列内の残基が欠失した形態、及び／又は挿入及び／又は置換されたものが含まれる。最終的なコンストラクトが所望の特性を有するように、欠失、挿入及び置換を任意に組合せて、最終コンストラクトに至らしめる。またアミノ酸変化により、例えばグリコシル化部位の数又は位置を変えることにより、ポリペプチドの翻訳後プロセシングを変えてもよい。他の翻訳後修飾には、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル、スレオニル又はチロシル残基のヒドロキシル基のホスホリル化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化が含まれる(T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983))。ポリペプチドのアミノ酸配列変異体を産生させる方法は、例えば、出典明示により明示的にここに援用米国特許第５５３４６１５号に記載されている。
「抗体」なる用語は、最も広義に使用され、特にモノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及び所望する結合特異性を示す限りそれらの抗体断片を包含する。
ここでの抗体は関心ある「抗原」に対するものである。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、疾病や疾患を患っている哺乳動物への抗体の投与によりその哺乳動物に治療的恩恵がもたらされうる。しかしながら、非ポリペプチド抗原(例えば腫瘍関連糖脂質抗原；米国特許第５０９１１７８号参照)に対する抗体もまた考慮される。抗原がポリペプチドである場合、それは膜貫通型分子(例えばレセプター)又はリガンド、例えば増殖因子でありうる。例示的な抗原には上述したポリペプチドが含まれる。本発明に包含される抗体に対する好ましい分子標的は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３４のようなＣＤポリペプチド；ＨＥＲレセプターファミリーのメンバー、例えばＥＧＦレセプター(ＨＥＲ１)、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３あるいはＨＥＲ４レセプター；細胞接着分子、例えばＬＦＡ-１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ-４、ＩＣＡＭ-１、ＶＣＡＭ及びａｖ／ｂ３インテグリンで、そのａ又はｂ何れかのサブユニットを含むもの(例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８あるいは抗ＣＤ１１ｂ抗体)；ＶＥＧＦのような増殖因子；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満(ＯＢ)レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ-４；プロテインＣ等を含む。他の分子に場合によってはコンジュゲートした可溶型抗原あるいはその断片も、抗体産生のための免疫原として用いることができる。レセプターのような膜貫通型分子については、これらの断片(例えば、レセプターの細胞外ドメイン)を免疫原として用いることができる。あるいは、膜貫通型分子を発現する細胞を免疫原として用いることができる。そのような細胞は、天然源(例えば癌細胞株)に由来しうるか、あるいは膜貫通型分子を発現させるために組換え技術によって形質転換された細胞でありうる。
精製される抗体の具体例には、限定されるものではないが、トラスツズマブ(ハーセプチン(登録商標))(Carterら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289(1992), 米国特許第５７２５８５６号)及びペルツズマブ(OMNITARGＴＭ)(国際公開第０１／００２４５号)を含む抗ＨＥＲ２抗体；ＣＤ２０抗体(以下参照)；ＩＬ-８抗体(St John., Chest, 103:932(1993)、及び国際公開第９５／２３８６５号)；例えばヒト化ＶＥＧＦ抗体ｈｕＡ４．６．１ベバシズマブ(AVASTIN(登録商標))及びラニビズマブ(Kimら, Growth Factors, 7:53-64(1992)、国際公開第９６／３００４６号、及び国際公開第９８／４５３３１号、１９９８年１０月１５日公開)のようなヒト化及び／又は親和成熟ＶＥＧＦ抗体を含むＶＥＧＦ又はＶＥＧＦレセプター抗体；ＰＳＣＡ抗体(国際公開第０１／４０３０９号)；エファリズマブ(RAPTIVA(登録商標))を含むＣＤ１１ａ抗体(米国特許第５６２２７００号、国際公開第９８／２３７６１号、Steppeら, Transplant Intl. 4:3-7(1991)、及びHourmantら, Transplantation 58:377-380(1994))；オマリズマブ(XOLAIR(登録商標))を含むＩｇＥに結合する抗体(Prestaら, J. Immunol. 151:2623-2632(1993)、及び国際公開第９５／１９１８１号；１９９８年２月３日に公開された米国特許第５７１４３３８号、又は１９９２年２月２５日に公開された米国特許第５０９１３１３号、１９９３年３月４日に公開された国際公開第９３／０４１７３号、又は１９９８年６月３０日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１３４１０号、米国特許第５７１４３３８号)；ＣＤ１８抗体(１９９７年４月２２日に公開された米国特許第５６２２７００号、又は１９９７年７月３１日に公開された国際公開第９７／２６９１２号)；Ａｐｏ-２レセプター抗体抗体(１９９８年１１月１９日に公開された国際公開第９８／５１７９３号)；組織因子(ＴＦ)抗体(１９９４年１１月９日に許可された欧州特許出願公開第０４２０９３７Ｂ１号)；α４-α７インテグリン抗体(１９９８年２月１９日に公開された国際公開第９８／０６２４８号)；ＥＧＦＲ抗体(例えば、キメラ又はヒト化２２５抗体、セツキシマブ、ＥＲＢＵＴＩＸ(登録商標)、１９９６年１２月１９日に公開された国際公開第９６／４０２１０号)；ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ３(１９８５年５月７日に公開された米国特許第４５１５８９３号)；ＣＤ２５又はＴａｃ抗体、例えばＣＨＩ-６２１(SIMULECT(登録商標))及びZENAPAX(登録商標)(1997年12月2日に公開された米国特許第５６９３７６２号を参照)；ＣＤ４抗体、例えばｃＭ-７４１２抗体(Choyら Arthritis Rheum 39(1):52-56(1996))；ＣＤ５２抗体、例えばCAMPATH-1H(ILEX/Berlex)(Riechmannら Nature 332:323-337(1988))；Ｆｃレセプター抗体、例えばＦｃに対するＭ２２抗体(Grazianoら J. Immunol. 155(10):4996-5002(1995)にあるようなＲＩ)；癌胎児性抗原(ＣＥＡ)抗体、例えばｈＭＮ-１４(Sharkeyら Cancer Res. 55(23Suppl): 5935s-5945s(1995)))；ｈｕＢｒＥ-３、ｈｕ-Ｍｃ３及びＣＨＬ６を含む乳房上皮細胞に対する抗体(Cerianiら, Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s(1995);及びRichmanら, Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s(1995))；Ｃ２４２のような大腸癌腫細胞に結合する抗体(Littonら, Eur J. Immunol. 26(1):1-9(1996))；ＣＤ３８抗体、例えばＡＴ１３／５(Ellisら, J. Immunol. 155(2):925-937(1995))；Ｈｕ Ｍ１９５(Jurcicら, Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s(1995))及びＣＭＡ-６７６又はＣＤＰ７７１のようなＣＤ３３抗体；ＥｐＣＡＭ抗体、例えば１７-１Ａ(PANOREX(登録商標));ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、例えばアブシキシマブ又はｃ７Ｅ３ Ｆａｂ(REOPRO(登録商標))；ＲＳＶ抗体、例えばＭＥＤＩ-４９３(SYNAGIS(登録商標))；ＣＭＶ抗体、例えばＰＲＯＴＯＶＩＲ(登録商標)；ＨＩＶ抗体、例えばＰＲＯ５４２；肝炎抗体、例えばＨｅｐ Ｂ抗体ＯＳＴＡＶＩＲ(登録商標)；ＣＡ １２５抗体ＯｖａＲｅｘ；イディオタイプＧＤ３エピトープ抗体ＢＥＣ２；αｖβ３抗体(例えば、VITAXIN(登録商標)；Medimmune)；ヒト腎臓細胞癌腫抗体、例えばｃｈ-Ｇ２５０；ＩＮＧ-１；抗ヒト１７-１Ａｎ抗体(３６２２Ｗ９４)；抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体(Ａ３３)；ＧＤ３ガングリオシドを指向する抗ヒト黒色腫抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平上皮細胞癌腫(ＳＦ-２５)；ヒト白血球抗原(ＨＬＡ)抗体、例えばＳｍａｒｔ ＩＤ１０及び抗ＨＬＡ ＤＲ抗体Oncolym(Ｌｙｍ-１)；ＣＤ３７抗体、例えばＴＲＵ ０１６(Trubion)；ＩＬ-２１抗体(Zymogenetics/Novo Nordisk)；抗Ｂ細胞抗体(Impheron)；Ｂ細胞標的ＭＡｂ(Immunogen/Aventis)；１Ｄ０９Ｃ３(Morphosys/GPC)；ＬｙｍｐＨｏＲａｄ １３１(ＨＧＳ)；Ｌｙｍ-１抗体、例えばＬｙｍ-１Ｙ-９０(ＵＳＣ)、又は抗Ｌｙｍ-１ Ｏｎｃｏｌｙｍ(USC/Peregrine)；ＬＩＦ ２２６(Enhanced Lifesci.)；ＢＡＦＦ抗体(例えば、国際公開第03/33658号)；ＢＡＦＦレセプター抗体(例えば、国際公開第02/24909号を参照)；ＢＲ３抗体；Ｂｌｙｓ抗体、例えばベリムマブ(belimumab)；ＬＹＭＰＨＯＳＴＡＴ-ＢＴＭ；ＩＳＦ１５４(UCSD/Roche/Tragen)；ゴミリキシマ(gomilixima) (Idec 152; Biogen Idec)；ＩＬ-６レセプター抗体、例えばアトリズマブ(atlizumab)(ACTEMRAＴＭ; Chugai/Roche)；ＩＬ-１５抗体、例えばＨｕＭａｘ-Ｉｌ-１５(Genmab/Amgen)；ケモカインレセプター抗体、例えばＣＣＲ２抗体(例えば、MLN1202; Millieneum)；抗補体抗体、例えばＣ５抗体(例えば、エクリズマブ５Ｇ１.１; Alexion)；ヒト免疫グロブリンの経口製剤(例えばＩｇＰＯ; Protein Therapeutics)；ＩＬ-１２抗体、例えばＡＢＴ-８７４(CAT/Abbott)；テネリキシマブ(Teneliximab)(ＢＭＳ-２２４８１８；ＢＭＳ)；ＣＤ４０抗体、特にＳ２Ｃ６及びそのヒト化変異体(国際公開第００／７５３４８号)及びＴＮＸ １００(Chiron/Tanox)；ＴＮＦ-α抗体、特にｃＡ２、又はインフリキシマブ(REMICADE(登録商標))、ＣＤＰ５７１、ＭＡＫ-１９５、アダリムマブ(HUMIRAＴＭ)、ペグ化ＴＮＦ-α抗体断片、例えばＣＤＰ-８７０(Celltech)、Ｄ２Ｅ７(Knoll)、抗ＴＮＦ-αポリクローナル抗体(例えば、ＰａｓｓＴＮＦ；Verigen)；ＣＤ２２抗体、例えばＬＬ２又はエピラツズマブ(LYMPHOCIDE(登録商標)；Immunomedics)、特にエピラツズマブＹ-９０、及びエピラツズマブＩ-１３１、アビオゲン(Abiogen)製ＣＤ２２抗体(Abiogen, Italy)、ＣＭＣ ５４４(Wyeth/Celltech)、コンボトックス(combotox)(UT Soutwestern)、ＢＬ２２(NIH)、及びＬｙｍｐｏＳｃａｎ Ｔｃ９９(Immunomedics)が含まれる。好ましくは、ここで精製される抗体は、ヒトＣＤ２０に結合するネイキッドの無傷抗体、又はヒトＶＥＧＦに結合するネイキッドの無傷抗体である。
ヒト「ＣＤ２０」抗原、又は「ＣＤ２０」は、末梢血又はリンパ系器官の９０％以上のＢ細胞の表面にみられる、約３５ｋＤａの非グルコシル化リンタンパク質である。ＣＤ２０は正常なＢ細胞、並びに悪性のＢ細胞の双方に存在するが、幹細胞では発現しない。文献中でのＣＤ２０の他の名前には、「Ｂリンパ球限定抗原(B-lymphocyte-restricted antigen)」及び「Ｂｐ３５」が含まれる。ＣＤ２０抗原は、例としてClarkら Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 82:1766 (1985)に記載されている。
ここで「ＣＤ２０抗体アンタゴニスト」とは、Ｂ細胞上のＣＤ２０に結合することによって、被験者ののＢ細胞を破壊又は枯渇させる、及び／又は例えばＢ細胞に誘導される体液性反応を低減又は阻害するすることにより、一又は複数のＢ細胞機能に干渉する抗体である。好ましくは、抗体アンタゴニストは、それによって治療される被験者のＢ細胞を枯渇する(すなわち、循環Ｂ細胞レベルを低下させる)ことができる。そのような枯渇は、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)及び／又は補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)、Ｂ細胞増殖の阻害及び／又はＢ細胞死の誘導(例えば、アポトーシスを介する)等の多様な機能を介して達成されるであろう。
ここで使用される場合「Ｂ細胞枯渇」とは、一般的に、治療前のレベルに対し、薬剤又は抗体治療後の、動物又はヒトにおけるＢ細胞レベルが低減していることを意味する。Ｂ細胞枯渇は、部分的又は完全なものであってよい。Ｂ細胞レベルは公知の技術、例えばReffら, Blood 83：435-445(1994)、又は米国特許第５７３６１３７号(Andersonら)に記載されているものを使用して測定可能である。例えば哺乳動物(例えば正常な霊長類)を、種々の用量の抗体又はイムノアドヘシンで治療し、末梢Ｂ細胞濃度を、例えばＢ細胞を計測するＦＡＣＳ法により測定してもよい。
ＣＤ２０抗体の例には、「リツキシマブ」(「RITUXAN(登録商標)」)と称される「Ｃ２Ｂ８」(米国特許第５７３６１３７号)、「Ｙ２Ｂ８」と呼称されるイットリウム-[９０]-ラベル２Ｂ８マウス抗体、又はIDEC pharmaceuticals社から商業的に入手可能な「イブリツモマブ・チウキセタン」(ZEVALIN(登録商標))(米国特許第５７３６１３７号；１９９３年６月２２日にＨＢ１１３８８の受託番号でＡＴＣＣに寄託された２Ｂ８；場合によっては１３１Ｉで標識され、「１３１Ｉ-Ｂ１」を生じる、「トシツモマズ」と呼称されるマウスＩｇＧ２ａ「Ｂ１」、又はCorixaから商業的に入手可能な「ヨードＩ１１３トシツモマズ」抗体(BEXXARＴＭ)(また、米国特許第５５９５７２１号を参照)；マウスモノクローナル抗体「１Ｆ５」(Pressら, Blood 69(2)：584-591(1987))及び「フレームワークパッチ」又はヒト化１Ｆ５を含むその変異体(国際公開第２００３／００２６０７号、Leung, S.; ＡＴＣＣ寄託ＨＢ−９６４５０)；マウス２Ｈ７及びキメラ２Ｈ７抗体(米国特許第5,677,180号)；ヒト化２Ｈ７(国際公開第２００４／０５６３１２号、Lowmanら、以下に説明)；２Ｆ２(ＨｕＭａｘ-ＣＤ２０)、Ｂ細胞の細胞膜においてＣＤ２０分子を標的とする全長ヒト高親和性抗体(Genmab, Denmark；例えばGlennie and van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510(2003)、及びCraggら, Blood 101: 1045-1052(2003); 国際公開第２００４／０３５６０７号；米国特許第２００４／０１６７３１９号を参照)；国際公開第２００４／０３５６０７号及び米国特許出願公開第２００４／０１６７３１９号(Teelingら)に説明されているヒトモノクローナル抗体；米国特許第２００４／００９３６２１号(Shitaraら)に記載されているような、Ｆｃ領域に結合した複合Ｎ-グリコシド-結合糖鎖を有する抗体；ＣＤ２０に結合するモノクローナル抗体及び抗原結合断片(国際公開第２００５／０００９０１号、Tedderら)、例えばＨＢ２０-３、ＨＢ２０-４、ＨＢ２０-２５、及びＭＢ２０-１１；ＣＤ２０結合分子、例えばＡＭＥシリーズの抗体、特に国際公開第２００４／１０３４０４号及び米国特許出願公開第２００５／００２５７６４号(Watkinsら, Eli Lilly/Applied Molecular Evolution, AME)に説明されているようなＡＭＥ３３抗体；米国特許出願公開第２００５／００２５７６４号(Watkinsら)に記載されているようなＣＤ２０結合分子；Ａ２０抗体又はその変異体、例えばキメラ又はヒト化Ａ２０抗体(それぞれ、ｃＡ２０、ｈＡ２０)又はＩＭＭＵ-１０６(米国特許出願公開第２００３／０２１９４３３号、Immunomedics)；ＣＤ２０-結合抗体、特にエピトープ枯渇Ｌｅｕ-１６、１Ｈ４、又は２Ｂ８で、米国特許出願公開第２００５／００６９５４５Ａ１号及び国際公開第２００５／１６９６９号(Carrら)のような、場合によってはＩＬ-２とコンジュゲートしているもの；ＣＤ２２及びＣＤ２０に結合する二重特異性抗体、例えばｈＬＬ２ｘｈＡ２０(国際公開第２００５／１４６１８号、Changら)；International Leukocyte Typing Workshopから入手可能なモノクローナル抗体Ｌ２７、Ｇ２８-２、９３-１Ｂ３、Ｂ-Ｃ１又はＮＵ-Ｂ２(Valentineら: Leukocyte Typing III(McMichael編, p. 440, Oxford University Press(1987))；１Ｈ４(Haismaら Blood 92:184(1998))；抗ＣＤ２０オーリスタチン(auristatin)Ｅコンジュゲート(Seattle Genetics)；抗ＣＤ２０-ＩＬ２(EMD/Biovation/City of Hope)；抗ＣＤ２０ ＭＡｂ治療(EpiCyte)；抗ＣＤ２０抗体ＴＲＵ ０１５(Trubion)が含まれる。ここで好ましいＣＤ２０抗体は、キメラ、ヒト化、又はヒトＣＤ２０抗体、より好ましくはリツキシマブ、ヒト化２Ｈ７、２Ｆ２(Ｈｕ-Ｍａｘ-ＣＤ２０)ヒトＣＤ２０抗体(Genmab)、及びヒト化Ａ２０又はＩＭＭＵＮ-１０６抗体(Immunomedics)である。
ここでの目的に対して、「リツキシマブ」、「RITUXAN(登録商標)」及び「Ｃ２Ｂ８」なる用語は、米国特許第５７３６１３７号、Andersonらに記載されているような、ヒトＣＤ２０抗原に結合する組換えキメラ抗体を意味する。このような抗体は、好ましくはＣＤＲ Ｈ１(配列番号：５)、ＣＤＲ Ｈ２(配列番号：６)、ＣＤＲ Ｈ３(配列番号：７)を含む重鎖と軽鎖を含有し、ここで軽鎖は、好ましくはＣＤＲ Ｌ１(配列番号：８)、ＣＤＲ Ｌ２(配列番号：９)、及びＣＤＲ Ｌ３(配列番号：１０)を含み;好ましくは、重鎖は、配列番号：３を含む可変重(ＶＨ)領域と、配列番号：４を含む可変軽(ＶＬ)領域を含有し；最も好ましくは、配列番号：１(Ｃ末端リジン残基を有する又は有さない)を含む重鎖と軽鎖を含有し、ここで軽鎖は、好ましくは配列番号：２を含む。本用語は、特に Moorhouseら J. pharm Biomed. Anal. 16:593-603(1997)に記載されているような変異体形態も含む。
ここで使用される場合「ヒトＶＥＧＦ」なる用語は、１６５-アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子を称し、天然に生じるアレルを伴い、Leungら, Science 246:1306(1989), 及びHouck ら, Mol. Endocrin. 5:1806(1991)に記載されているような、１２１-、１８９-及び２０６-アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子、及びこれらの増殖因子のプロセシング形態に関する。
本発明は、ＶＥＧＦの一又は複数の生物活性、例えばその分裂促進又は血管新生活性を阻害可能な抗ＶＥＧＦアンタゴニスト抗体を提供する。ＶＥＧＦのアンタゴニストは、細胞レセプターへのＶＥＧＦの結合に干渉することにより、ＶＥＧＦで活性化される細胞を無能力化又は殺すことにより、又は細胞レセプターにＶＥＧＦが結合した後、血管内皮細胞の活性化に干渉することにより作用する。ＶＥＧＦアンタゴニストによりインターベンションされるこのような全ての点は、この発明の目的にとって、等価であると見なされる。
ここでの目的にとって、「ベバシズマブ」、「アバスチン(AVASTIN)(登録商標)」、「Ｆ(ａｂ)-１２」及び「ｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ」なる用語は、米国特許第７１６９９０１号、Prestaらに記載されているような、ヒト血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)抗原(ｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ)に結合する組換えヒト化モノクローナル抗体を意味する。このような抗体は、好ましくはＣＤＲ Ｈ１(配列番号：１５)、ＣＤＲ Ｈ２(配列番号：１６)、ＣＤＲ Ｈ３(配列番号：１７)を含む重鎖と軽鎖を含有し、ここで軽鎖は、好ましくはＣＤＲ Ｌ１(配列番号：１８)、ＣＤＲ Ｌ２(配列番号：１９)、及びＣＤＲ Ｌ３(配列番号：２０)を含み；最も好ましくは、重鎖は、配列番号：１３を含む可変重(ＶＨ)領域と、配列番号：１４を含む可変軽(ＶＬ)領域を含有し；好ましくは、配列番号：１１(Ｃ末端リジン残基を有する又は有さない)を含む重鎖と軽鎖を含有し、ここで軽鎖は、好ましくは配列番号：１２を含む。本用語は、特に、組換え抗体産物の生成中に形成される種々の形態を含む。
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一な抗体を意味する。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む一般的な(ポリクローナル)抗体調製物に対して、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法によって生産されることを必要としていると解してはならない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって産生でき、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる(例えば米国特許第４８１６５６７号を参照)。さらなる実施態様では、「モノクローナル抗体」は、例えば、McCafferty等, Nature, 348：552-554(1990)に記載されている技術を使用して作製される抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clacksonら,Nature, 352:624-628(1991)及びMarksら, J. Mol. Biol. 222: 581-597(1991)には、それぞれファージライブラリーを使用するマウス及びヒト抗体の分離について記述されている。続く文献には、チェインシャッフリング(Marksら, Bio/Technology, 10:779-783(1992))による高親和性(ｎＭ範囲)ヒト抗体の生産、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染及びインビボ組換え(Waterhouse ら, Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266(1993))について記載がある。よって、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な代替策である。別法として、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで生成することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の生成をもたらす。Jakobovitsら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551(1993)；Jakobovitsら, Nature 362:255-258(1993); Bruggermanら, Year in Immuno., 7:33(1993)；及びDuchosalら, Nature 355:258(1992)を参照。
ここでモノクローナル抗体は、その重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であり、残りの鎖が、他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同のものである「キメラ」抗体(免疫グロブリン)と、所望の生物学的活性を表す限り、このような抗体の断片を特に包含する(米国特許第４８１６５６７号；Morrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。
ここで使用される場合「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合の原因である抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は、「相補性決定領域」あるいは「ＣＤＲ」(つまり、軽鎖可変ドメイン中の残基２４-３４(Ｌ１)、５０-５６(Ｌ２)及び８９-９７(Ｌ３)と、重鎖可変ドメイン中の残基３１-３５(Ｈ１)、５０-６５(Ｈ２)及び９５-１０２(Ｈ３)；Kabatら, Sequences of Polypeptides of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991))からのアミノ酸残基及び／又は「高頻度可変ループ」(つまり、軽鎖可変ドメイン中の残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)と、重鎖可変ドメイン中の残基２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３)；Chothia及び Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))からの残基を含む。「フレームワーク」あるいは「ＦＲ」残基は、ここに定義される高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。通例、ヒト化抗体は、所望の特異性、親和性及び能力を持つマウス、ラット、ウサギあるいは非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域からの残基によってレシピエントの高頻度可変領域からの残基が置き換えられたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基が対応する非ヒト残基と置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中あるいはドナー抗体中に見出されない残基を含みうる。これらの改変は抗体の性能をさらに洗練するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、高頻度可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、また、場合によっては、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の一部分を少なくとも含むであろう。
ヒト化抗体を作るのに使用されるヒト可変ドメインの選択は、軽鎖でも重鎖でも、抗原性を低減させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット(best-fit)」法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。齧歯類の配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク(ＦＲ)として受容される(Simsら，J. Immunol., 151:2296(1993)；Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。
別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来した特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、幾つかの異なるヒト化抗体のために使用することができる(Carterら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285(1992)；Prestaら, J. Immunol, 151:2623(1993))。
抗体は抗原への高親和性及び他の好ましい生物学的性質を保持したままヒト化されることがさらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法では、ヒト化抗体は、親及びヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析プロセスによって調製される。三次元の免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能で、当業者にはなじみが深い。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な三次元立体構造を例証し表示するコンピュータプログラムを利用することができる。これらの表示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能中で残基の可能な役割の分析、つまり、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増大のような、所望の抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及びインポート配列から選び、組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接的かつ最も実質的に関与している。
「抗体断片」は、全長抗体の一部、一般的にはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多特異性抗体が含まれる。抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennanら, Science, 229:81(1985)を参照)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他の実施態様では、Ｆ(ａｂ')２はロイシンジッパーＧＣＮ４を使用して形成され、Ｆ(ａｂ')２ 分子のアセンブリが促進される。他のアプローチでは、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片の生産のための他の技術は当業者には明らかであろう。
他の実施態様では、選択された抗体は一本鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開第９３／１６１８５号を参照。「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それはｓＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照。
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ-ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に結合した重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含む。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成ができないリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは、例えば、欧州特許出願公開第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)にさらに詳細に記載されている。
この出願を通して使用される場合「線形抗体」なる表現は、Zapataら, Polypeptide Eng. 8(10):1057-1062(1995)において記載されるような抗体を意味する。簡潔に述べると、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデム型Ｆｄセグメント(ＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１)を含む。線形抗体は二重特異性又は単一特異性であってよい。
「多重特異性抗体」は、少なくとも２の異なるエピトープに対する結合特異性を有し、該エピトープが通常異なる抗原からのものである。このような分子は、通常の２つの抗原のみに結合する(すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂｓ)が、さらなる特異性を有する抗体、例えば三重特異性抗体も、ここで使用される場合はこの表現に含まれる。ＢｓＡｂｓには、一本のアームが腫瘍細胞抗原に対し、他のアームが、細胞障害誘発分子、例えば抗ＦｃγＲＩ／抗ＣＤ１５、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)、抗ＣＤ３／抗悪性Ｂ-細胞(１Ｄ１０)、抗ＣＤ３／抗ｐ１８５ＨＥＲ２、抗ＣＤ３／抗ｐ９７、抗ＣＤ３／抗腎細胞癌、抗ＣＤ３／抗ＯＶＣＡＲ-３、抗ＣＤ３／Ｌ-Ｄ１(抗結腸癌)、抗ＣＤ３／抗メラニン細胞刺激ホルモン類似体、抗ＥＧＦレセプター／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／抗ＣＡＭＡ１、抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３／ＭｏＶ１８、抗神経細胞接着分子(ＮＣＡＭ)／抗ＣＤ３、抗葉酸結合タンパク質(ＦＢＰ)／抗ＣＤ３、抗パン(pan)癌腫関連抗原(ＡＭＯＣ-３１)／抗ＣＤ３に対するもの；腫瘍抗原に特異的に結合する一本のアームと、毒素、例えば抗サポリン／抗Ｉｄ-１、抗ＣＤ２２／抗サポリン、抗ＣＤ７／抗サポリン、抗ＣＤ３８／抗サポリン、抗ＣＥＡ／抗リシンＡ鎖、抗インターフェロン-α(ＩＦＮ-α)／抗ハイブリドーマイディオタイプ、抗ＣＥＡ／抗ビンカアルカロイドに結合する一本のアームを有するＢｓＡｂｓ；抗ＣＤ３０／抗アルカリホスファターゼ(マイトマイシンホスフェートプロドラッグのマイトマイシンアルコールへの転換を触媒)等、転換酵素活性化プロドラッグ用のＢｓＡｂｓ；抗フィブリン／抗組織プラスミノーゲンアクチベーター(ｔＰＡ)、抗フィブリン／抗ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター(ｕＰＡ)等、線維素溶解剤として使用可能なＢｓＡｂｓ；抗低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)／抗Ｆｃレセプター(例えば、ＦｃγＲＩ、又はＦｃγＲＩＩＩ)等、細胞表面レセプターへ免疫複合体を標的化するためのＢｓＡｂｓ；抗ＣＤ３／抗単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)、抗Ｔ細胞レセプター：ＣＤ３複合体／抗インフルエンザ、抗ＦｃγＲ／抗ＨＩＶ等の感染症の治療に使用するためのＢｓＡｂｓ；抗ＣＥＡ／抗ＥＯＴＵＢＥ、抗ＣＥＡ／抗ＤＰＴＡ、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／抗ハプテン等、インビトロ又はインビボにおいて腫瘍を検出するためのＢｓＡｂｓ；ワクチンアジュバントとしてのＢｓＡｂｓ；抗ウサギＩｇＧ／抗フェリチン、抗西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)／抗ホルモン、抗ソマトスタチン／抗サブスタンスＰ、抗ＨＲＰ／抗ＦＩＴＣ、抗ＣＥＡ／抗βガラクトシダーゼ等、診断ツールとしてのＢｓＡｂｓが含まれる。三重特異性抗体の例には、抗ＣＤ３／抗ＣＤ４／抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３／抗ＣＤ５／抗ＣＤ３７、及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ８／抗ＣＤ３７が含まれる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片(例えば、Ｆ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製可能である。
２以上の結合価を有する抗体が考慮される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J. Immunol. 147: 60(1991)。
ここでの目的に対して「ネイキッド抗体」とは、細胞障害性部分又は放射標識にコンジュゲートしない抗体である。
ここで「無傷抗体」とは、２つの抗原結合領域とＦｃ領域を含むものである。好ましくは、無傷抗体は機能的Ｆｃ領域を有する。
「処置」とは、治療的処置、及び予防的又は防止的対策の双方を意味する。処置が必要なものには、既に疾患を患っているもの、並びに疾患が予防されるものが含まれる。
「疾患」とは、ここで記載されたようにして精製された抗体を用いた処置で利益を受ける任意の病状である。これには、慢性及び急性の疾患及び病気、及び当該問題の疾患に哺乳動物がかかりやすい病的状態を含む。
ここで使用される場合「標識」なる用語は、抗体に直接又は間接的にコンジュゲートする検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自体が検出可能なもの(例えば、放射性同位元素標識又は蛍光標識)、又は酵素標識のケースでは、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変化を触媒するものであってもよい。
ここで使用される場合「細胞障害性剤」なる用語は、細胞の機能阻害又は阻止、及び／又は細胞破壊をもたらす物質を意味する。この用語は、放射性同位体(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体)、化学療法剤、及び細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素又は小分子毒素などの毒素、またはそれらの断片を含むことを意図する。
発明の実施形態
ここでの発明は、抗体と一又は複数の汚染物質を含有する組成物(例えば水溶液)から抗体を精製する方法を提供する。組成物は、一般的に抗体の組換え生産から得られるが、ペプチド合成(又は、他の合成手段)による抗体の生成から得てもよく、又は抗体は、抗体の天然源から精製されてもよい。好ましくは、抗体は、リツキシマブ等ヒトＣＤ２０抗原に結合するか、又はベバシズマブ等、ＶＥＧＦ抗原に結合する。
抗体の組換え生産
抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター内に挿入される。抗体をコードするＤＮＡは容易に単離され、一般的な手順を使用(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用)して配列化される。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分は、一般的に、これらに限定されるものではないが、次のものの一又は複数：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列(例えば、特に出典明示によりここに援用される米国特許第５５３４６１５号に記載されているもの)を含む。
ここで、ベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的に適切な原核生物は、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大量菌類、特に大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリ・スブチリス(B. subtilis)及びバシリ・リチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６７１０に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。好ましい大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ATCC 31,446)であるが、他の菌株、例えば大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ATCC 31,537)、及び大腸菌株Ｗ３１１０(ATCC27,325)も適している。これらの例は限定というよりは、例示的なものである。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母のような真核微生物は、抗体コード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は通常のパン酵母が、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用されている。しかしながら、他の多くの属、種及び菌株、例えばシゾサッカロミセス・プロンブ(Schizosaccharomyces prombe)；クルベロミセス・ホスツ(Kluveromyces hosts)、例えばケーラクチス(K. lactis)、ケーフラギリス(K. fragilis)(ATCC 12,424)、ケーブルガリクス(K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、ケーウィケラミイ(K. wickeramii)(ATCC 24,178)、ケーワルチイ(K. waltii)(ATCC 56,500)、ケードロソフィラルム(K. drosophilarum)(ATCC 36,906)、ケーテルモトレランス(K. thermotolerans)及びケーマルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)(欧州特許出願公開第４０２２２６号)；ピッチャ・パストリス(Pichia pastoris)(欧州特許出願公開第１８３０７０号)；カンジダ；トリコデルマレーシア(reesia)(欧州特許出願公開第２４４２３４号)；アカパンカビ；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(occidentalis)；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)、及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌及びクロコウジカビも、ここでは一般的に入手可能で有用である。
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルスの菌株及び変異体、宿主、例えばヨトウガ(イモムシ)、ネッタイシマカ(蚊)、ヒトスジシマカ(蚊)、キイロショウショウバエ(ショウジョウバエ)、及びカイコからの対応する許容的昆虫宿主細胞が同定されている。形質移入用の様々なウイルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)ＮＰＶのＬ-１変異体、及びカイコＮＰＶのＢｍ-５株も公に入手可能であり、このようなウイルスは、本発明では、特にヨウトガ細胞の形質移入用のウイルスとして使用されてよい。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、及びタバコの植物細胞培養体も、宿主として利用可能である。
しかしながら、脊椎動物細胞にも大きな興味があり、培養(組織培養)における脊椎動物細胞の増殖は、常套的な手順でなされる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例には、限定されるものではないが、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓細胞(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ベビーハムスター腎臓細胞(BHK, ATCC CCL 1０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaubら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サル腎臓細胞(CV1 ATCC CCL70)；アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587)；ヒト子宮頸癌細胞(HELA, ATCC CCL 2)；イヌ腎臓細胞(MDCK, ATCC CCL 34)；バッファロラット肝臓細胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442)；ヒト肺細胞(W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞(Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍(MMT 060562, ATTC CCL51)；ＴＲＩ細胞(Matherら, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982))；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞腫(Hep G2)が含まれる。多くの場合、抗体の発現にはＣＨＯ細胞が好ましくは、本発明で精製される抗体を産生するのにも有利に使用される。
宿主細胞は、抗体生成用の上述した発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターの誘発、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変された従来からの栄養培地で培養される。
この発明の抗体の生成に使用される宿主細胞は、様々な培地で培養されてよい。商業的に入手可能な培地、例えばハム(Ｈａｍ)のＦ１０(Sigma)、最小必須培地((ＭＥＭ)、Sigma)、ＲＰＭＩ-１６４０(Sigma)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ)、Sigma)が、宿主細胞の培養に適している。さらに、 Hamら, Meth. Enz. 58:44(1979)、Barnesら, Anal. Biochem.102:255(1980)、米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国特許第Ｒｅ．３０９８５号に記載されている任意の培地も、宿主細胞用の培養培地として使用されてよい。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮増殖因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えばガラマイシン：ゲンタマイシン(登録商標))、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
組換え技術を使用する場合、抗体は細胞膜周辺腔で細胞内で産生されるか、あるいは直接培地へ分泌されるかである。最初の段階として、タンパク質が、微粒子状破片、宿主細胞あるいは溶解された断片(例えば、ホモジナイズの結果)のいずれかから細胞内で産生されるなら、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地へ分泌される場合には、このような発現系からの上清は、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮されうる。
本発明の陽イオン交換クロマトグラフィー法
本発明の好ましい実施態様では、ここでの精製方法にかけられる組成物は、組換え生産された抗体、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)組換え宿主細胞培養で発現した無傷抗体である。場合によっては、組成物は、陽イオン交換クロマトグラフィーの前に、少なくとも一の精製工程にかけられる。組成物は関心ある抗体と一又は複数の汚染物質、例えばチャイニーズハムスター卵巣タンパク質(ＣＨＯＰ)；浸出プロテインＡ；核酸；所望する抗体の変異体、断片、凝集体又は誘導体；他のポリペプチド；エンドトキシン；ウイルス性汚染物質；細胞培養培地成分(例えばガラマイシン：ゲンタマイシン(登録商標))等を含有する。
陽イオン交換クロマトグラフィー法の前、実施中又は後に実施されてもよいさらなる精製手順の例には、疎水性相互作用クロマトグラフィー(例えば、フェニル-セファロースＴＭ)における分画、エタノール沈殿、等電点電気泳動、逆相ＨＰＬＣ、シリカにおけるクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースＴＭにおけるクロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、さらなる陽イオン交換クロマトグラフィー、混合モードイオン交換、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、親水性電荷誘導クロマトグラフィー、及びアフィニティクロマトグラフィー(例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体、又は特定の基質、リガンド、又はキャプチャー試薬としての抗原を使用)が含まれる。
本発明によれば、陽イオン交換精製スキームは、典型的には、逐次的に実施される次の工程を含む：(１)陽イオン交換材料の平衡化；(２)陽イオン交換材料への、精製される組成物のロード；(３)第１の洗浄工程；(４)第２の洗浄工程、及び(５)関心ある抗体の溶出。
陽イオン交換精製スキームに少なくとも２の洗浄工程で、その少なくとも第一のものが高ｐＨ(約ｐＨ６．８以上)で実施される工程を含めることにより、精製効率が有意に改善される。特に、約６．８〜約９．０(例えば、約７．０〜８．０)、例えば約ｐＨ７．８又はｐＨ７．０の範囲のｐＨを有する洗浄バッファーを使用する第一の洗浄工程を実施することで、約５．０〜約５．５の従来からの低ｐＨ範囲を使用する場合よりも、上述した汚染物質がより効果的に除去される。結果として、陽イオン交換材料から溶出する抗体を含有する組成物の宿主細胞タンパク質の含有量は、典型的には約２００ｐｐｍであり、約５〜５．５のｐＨでの洗浄工程１回を使用して達成される約５００ｐｐｍレベル以下である。
本発明の好ましい実施態様では、陽イオン交換材料は、スルホプロピル基で官能化されたポリヒドロキシル化ポリマーで被覆された架橋ポリ(スチレン-ジビニルベンゼン)フロースルー粒子(固相)、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なＰＯＲＯＳ ５０ＨＳ(登録商標)カラムを含む。
通常、平衡化バッファーは、関心ある抗体と一又は複数の汚染物質を含有する組成物を、前記物質にロードする前に、陽イオン交換材料上に又はこれに通して通過される。本発明の好ましい実施態様では、平衡化バッファーは約５．０〜約６．０、例えば約５．５のｐＨを有する。一例では、平衡化バッファーは１９ｍＭのＭＥＳ、６０ｍＭのＮａＣｌを含有し、ｐＨ５．５０である。他の例では、平衡化バッファーは２３ｍＭのＭＥＳ、６０ｍＭのＮａＣｌを含有し、ｐＨ５．５０である。
平衡後、関心ある抗体と一又は複数の汚染物質を含有する水溶液が、陽イオン交換材料にロードされる。場合によっては、ロード物のｐＨは約４．０〜約６．０の範囲であり、例えばｐＨ約５．０又はｐＨ約５．５である。好ましい実施態様では、前の精製工程からの調整された生成物プールがロードされる。一実施態様では、前のプロテインＡクロマトグラフィー精製、ｐＨ５．０からのプロテインＡプールがイオン交換物質にロードされる。他の実施態様においては、調整されたＱ-セファロース(登録商標)プール、ｐＨ５．５が陽イオン交換材料にロードされる。例示的なロード密度は、約１０〜約１００ｇ／Ｌ樹脂、好ましくは約１０〜約６０ｇ／Ｌ樹脂、最も好ましくは約１５〜約４５ｇ／Ｌ樹脂である。関心ある抗体は、このロード工程の結果として、陽イオン交換材料に結合する。
ロード後、陽イオン交換材料は、第一洗浄バッファーを用いて、第一の洗浄工程にて洗浄される。洗浄プロセス中、洗浄バッファーは陽イオン交換材料上を通過する。洗浄バッファーの組成は、典型的には、関心ある抗体を実質量溶出させることなく、可能な限り多くの汚染物質が樹脂から溶出するように選択される。第一洗浄バッファーのｐＨは、平衡化バッファー及び／又はロードされる組成物のｐＨよりも一般的に高く、例えば約２〜約３ｐＨ単位高い。好ましくは、第一洗浄バッファーのｐＨは、ｐＨ約６．８〜約９．０、好ましくはｐＨ約６．８〜約８．０の範囲にあり、例えばｐＨ約７．８又はｐＨ約７．０である。このｐＨ範囲にあるバッファーの例には、限定されるものではないが、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、酢酸ナトリウム、トリス／ＨＣｌ、トリエタノールアミン 塩酸／ＮａＯＨ、ビシン／ＨＣｌ、トリシン／ＨＣＬ等が含まれる。好ましい第一洗浄バッファーは：(１)２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８、又は(２)２５ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．０を含有するか、又はこれらからなる。
この点に関し、本発明は、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８に、組換えキメラＣＤ２０抗体、例えばリツキシマブを含有する組成物を提供する。また本発明は、２５ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．０に、組換えヒト化ＶＥＧＦ抗体、例えばベバシズマブを含有するものを提供する。このような組成物は、とりわけ、これらの生成物の精製に使用される中間組成物として有用である。
本発明は、第二洗浄バッファーを使用する、少なくとも一のさらなる又は第二の洗浄工程を、一般的には必要とする。第二洗浄バッファーのｐＨは、好ましくは第一洗浄バッファーより低く、例えば約２〜約３ｐＨ単位低い。それで、第二洗浄バッファーのｐＨは、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約６．０の範囲であってよい。好ましくは、第二洗浄バッファーのｐＨは約５．５である。このｐＨ範囲にあるバッファーの例には、限定されるものではないが、ＭＥＳ、酢酸／酢酸ナトリウム、又はＮａＯＨ、ＮａＨ２ＰＯ３／Ｎａ２ＨＰＯ４、ビス.トリス／ＨＣｌが含まれる。ＭＥＳ、ｐＨ５．５が、第２の洗浄において好ましいバッファーである。一実施態様では、第二洗浄バッファーは、１９ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５０を含有するか、又はこれらからなる。他の実施態様では、第二洗浄バッファーは、２３ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５０を含有するか、又はこれらからなる。
付加的な洗浄工程が使用されてもよいが、所望の抗体の溶出の前には、第一及び第二の洗浄工程のみが実施されることが好ましい。汚染物質、例えば上述したものは、第一及び／又は第二の洗浄抗体中に、陽イオン交換材料から除去される。好ましくは、第一の洗浄工程でほとんどの汚染物質が除去される。
上述した洗浄工程(類)に続いて、所望の抗体が陽イオン交換材料から溶出される。抗体の溶出は、伝導率又はイオン強度を増加させることによって達成され得る。望ましくは、溶出バッファーの伝導率は約１０ｍＳ／ｃｍ以上である。溶出バッファーにおいて、比較的高い塩分濃度を増加させることにより、伝導率の増加が達成され得る。この目的のための例示的な塩には、限定されるものではないが、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム(ＮａＣｌ)、及び塩化カリウム(ＫＣｌ)が含まれる。一実施態様では、溶出バッファーは約１００〜約３００ｍＭのＮａＣｌを含有する。溶出バッファーは、一般的に第二洗浄バッファーとほぼ同じｐＨを有する。好ましい溶出バッファーは、１９ｍＭのＭＥＳ、１６０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５を含有する。他の好ましい溶出バッファーは、２３ｍＭのＭＥＳ、１７５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５を含有する。溶出は段階溶出(勾配溶出とは対照)を好ましくは含む。
溶出工程には、場合によっては再生工程が続くが、これは本発明の好ましい実施態様に必要ではない。
さらなる工程が考慮されるが、好ましくは、陽イオン交換精製法は次の工程：平衡化(例えば、ｐＨ約５．５の平衡化バッファーを使用)、抗体と汚染物質(類)を含有する組成物のロード(例えば、ロードされる組成物のｐＨは約５．０又は約５．５である)、汚染物質を溶出させるための第一の洗浄工程(例えば、ｐＨ約７．８の第一洗浄バッファー、又はｐＨ約７．０の第一洗浄バッファーを使用)、第二の洗浄工程(例えば、ｐＨ約５．５の第二洗浄バッファーを使用)、及び溶出(例えば、抗体を溶出させる初期の各工程よりも比較的増加した伝導率、及びｐＨ約５．５の溶出バッファーを使用)のみからなる。
ここで陽イオン交換クロマトグラフィー法により得られる抗体調製物には、必要ならば、さらなる精製工程を施してもよい。例示的なさらなる精製工程は、上述にて検討している。
場合によっては、抗体は、所望の場合は一又は複数の異種分子にコンジュゲートされる。異種分子は、例えば抗体の血清半減期を増加させるもの(例えば、ポリエチレングリコール、ＰＥＧ)であり得、又は標識(例えば、酵素、蛍光標識及び／又は放射性核種)、又は細胞障害性分子(例えば、毒素、化学治療剤、又は放射性同位元素)でありうる。
場合によっては異種分子とコンジュゲートした抗体を含有する治療用製剤は、所望の純度を有する抗体を、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、任意の薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤(Remington's pharmaceutical Sciences 第16版, Osol, A. 編(1980))と混合することにより調製されてよい。「薬学的に許容可能な」担体、賦形剤、又は安定剤は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)；及び／又はトゥイーン(TWEEN)ＴＭ、プルロニクス(PLURONICS)ＴＭ、又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中に包括されてもよい。これらの技術はRemington's Pharmaceutical Science 第16版, Osol, A. 編(1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例は、抗体変異体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、このマトリックスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸及びγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドからなる注射可能なミクロスフィア)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸を含む。
ここで開示されたようにして精製される抗体、又は抗体と薬学的に許容可能な担体を含有する組成物は、種々の診断、治療、及びこのような抗体及び組成物に公知の他の用途に使用される。例えば、治療的有効量の抗体を哺乳動物に投与することにより、哺乳動物における疾患を処置するのに、抗体は使用される。ＣＤ２０抗体、例えばリツキシマブのケースにおいては、Ｂ-細胞の枯渇、リンパ腫(例えば、非ホジキンリンパ腫、ＮＨＬ)、又は白血病(例えば、慢性リンパ性白血病、ＣＬＬ)、並びに自己免疫疾患、例えば関節リウマチ(ＲＡ)、多発性硬化症(ＭＳ)、ループス等の処置に使用することができる。ＶＥＧＦに結合する抗体、例えばベバシズマブについては、血管新生の阻害、癌の処置、及び黄斑変性症の処置に使用することができる。
次の実施例は例証のために提供されるものであって、限定するためのものではない。本明細書における全ての引用の開示は、出典明示により明示的にここに援用される。
実施例１：ＣＤ２０抗体の精製
この実施例は、ＣＤ２０抗体のリツキシマブを精製するための改善された陽イオン交換クロマトグラフィー法を記載する。リツキシマブはＮＨＬ、ＣＬＬ、ＲＡ、ＭＳ等の治療に使用される。リツキシマブ分子の構造はAndersonらの米国特許第５７３６１３７号 (出典明示により明示的にここに援用)、並びに図１Ａ-１Ｂに開示されている。リツキシマブはジェネンテック社から商業的に入手可能である。
陽イオン交換クロマトグラフィーは、ＣＨＯＰ、ＤＮＡ、浸出プロテインＡ、ガラマイシン(ゲンタマイシン(登録商標))、リツキシマブ凝集体、及び潜在的ウイルスのレベルをさらに低下させるのに使用される。リツキシマブはロード条件下でカラムに結合する。ついで、カラムは、洗浄、溶出、再生／衛生化され、次の使用まで保存される。複数サイクルを使用してアフィニティプールのバッチ全体を処理してもよい。陽イオン交換プールは、室温から３０℃までで３日間まで、あるいは５℃で７日間まで保持されうる。
陽イオン交換樹脂(POROS 50 HS(登録商標)、Applied Biosystems)を、ベッド高さ１７−３３ｃｍになるまでカラムに充填する。アフィニティープールをロードする前に、陽イオン交換カラムは、平衡化バッファーを用いて、保存溶液のパージがなされる。平衡化後、アフィニティプールをカラムにロードする。これらの条件下で、生成物をカラムに結合させる。ついで、第一洗浄バッファー、続いて第二洗浄バッファーを用いて、カラムを洗浄する。高イオン強度の溶出バッファーを使用し、カラムからリツキシマブを溶出させる。
元の(コントロール)方法に対する本発明の方法の条件の比較を次表にまとめる。
Figure 2013173747
リツキシマブ法におけるロード物及びバッファーについての所望のｐＨ、伝導率、及びモル濃度の範囲を次表にまとめる。
Figure 2013173747
リツキシマブ精製のための実証された方法では、洗浄相において宿主細胞タンパク質が高度に除去されることで、宿主細胞タンパク質除去のロバスト性が高まり、結果として生成物プール(溶出プール)中の宿主細胞タンパク質レベルが低下し、後続する下流の工程における不純物の除去が容易になる。図３は、宿主細胞タンパク質の除去に関する本方法の利点を例証している。
実施例２：ＶＥＧＦ抗体の精製
この実施例は、組換えヒト化血管内皮増殖因子抗体(ｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ)のベバシズマブを精製するための陽イオン交換クロマトグラフィー法を記載する。ベバシズマブ分子の構造は、ここに出典明示により明示的に援用されるPrestaらの米国特許第７１６９９０１号に開示されている。また、ここでの図２Ａ-２Ｂを参照のこと。ベバシズマブはジェネンテック社から商業的に入手可能である。
この実施例は、改善されたベバシズマブ精製法のための、陽イオン交換工程で実施された開発研究をまとめたものである。これらの研究において、ＣＭ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ(登録商標)、ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ(登録商標)及びＰＯＲＯＳ ５０ＨＳ(登録商標)の３種の陽イオン交換樹脂を評価した。これらの３種の樹脂を使用する陽イオン交換精製法を、プロセス性能(不純物の除去性、レトロウイルスの除去性、及び工程収率)、生成物の品質、プロセスのロバスト性、及び現在のあらゆる製造現場でのプロセス適合性に関して評価した。これらの研究から作成されたデータに基づき、ＰＯＲＯＳ ５０ＨＳ(登録商標)が優れたプロセス性能及びロバスト性を示し、改善された精製法のための陽イオン交換樹脂として選択された。
陽イオン交換クロマトグラフィーは、精製プロセスの最終のクロマトグラフィー工程である。それにより、細胞培養培地成分(ガラマイシン)、宿主細胞誘導性の不純物(ＣＨＯＰ、及びＤＮＡ)、及びベバシズマブの凝集形態が除去される。それはまたウイルス除去工程としても機能する。
カラムは結合-溶出方式で操作し、周囲温度で実施される。カラムには陽イオン交換樹脂(POROS 50HS(登録商標))を使用する。樹脂は、負に荷電した官能基でカップリングした多孔質のポリスチレン-ジビニルベンゼンベッド担体からなる。カラムは平衡化バッファーを用いた洗浄により、保存状態から取り出される。ウイルス濾過されたプールは、≦５．５ｍＳ／ｃｍの伝導率限界を満たすように０．３容量の注射用水(ＷＦＩ)で希釈される。ついで、ウイルス濾過されたプールを平衡化したカラムにロードする。生成物が樹脂に結合する。ロード後、高ｐＨのバッファーでカラムを洗浄し、ロード物質をカラムを通して流し、ＣＨＯＰ不純物を除去する。ついで、カラムを低塩分バッファーで洗浄し、ｐＨを低下させ、溶出用のカラムを調製する。最大７カラム体積の高塩分バッファーの段階溶出を使用し、生成物を溶出させる。溶出後、衛生化溶液(０．５ＮのＮａＯＨ)を用いて、カラム及びスキッドを衛生化し、次に使用するまで貯蔵溶液(０．１ＮのＮａＯＨ)で保存する。
次表は本発明のベバシズマブ法に対する条件を記載したものである。
Figure 2013173747
ベバシズマブ法でのロード物及びバッファーに対する所望のｐＨ、伝導率及びモル濃度範囲を次表にまとめる。
Figure 2013173747
本方法は、ｐＨ５．５の第一洗浄バッファーを使用した元のベバシズマブ法より優れていることが見出された。ここでの新規方法は、低いＣＨＯＰレベルのプールを得ることができ、高い工程収率が達成され、製造中実施するのに全体的によりロバストな方法であった。

Claims (20)

  1. 抗体と少なくとも一の汚染物質を含有する組成物から抗体を精製する方法であって、
    (ａ)陽イオン交換材料に組成物をロードし、ここで組成物は第１のｐＨにあり；
    (ｂ)(ａ)の組成物のｐＨよりも高いｐＨで第一洗浄バッファーを用いて陽イオン交換材料を洗浄し、ここで第一洗浄バッファーのｐＨは約６．８〜約９．０であり；
    (ｃ)第一洗浄バッファーのｐＨより低いｐＨで第二洗浄バッファーを用いて陽イオン交換材料を洗浄し；
    (ｄ)第二洗浄バッファーよりも実質的に高い伝導率で溶出バッファーを用いて陽イオン交換材料から抗体を溶出させる
    逐次工程を含む方法。
  2. 第二洗浄バッファーのｐＨと溶出バッファーのｐＨがほぼ同じである請求項１記載の方法。
  3. 抗体がヒトＣＤ２０に結合する請求項１記載の方法。
  4. 抗体がヒト血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)に結合する請求項１記載の方法。
  5. (ａ)の組成物のｐＨが約４．０〜約６．０であり、第一洗浄バッファーのｐＨが約６．８〜約８．０であり、第二洗浄バッファーのｐＨが約５．０〜約６．０であり、溶出バッファーのｐＨが約５．０〜約６．０である請求項１記載の方法。
  6. 溶出バッファーの伝導率が約１０ｍＳ／ｃｍ〜約１００ｍＳ／ｃｍである請求項１に記載の方法。
  7. 溶出バッファーが約１００〜約３００ｍＭのＮａＣｌを含有する請求項１記載の方法。
  8. 陽イオン交換材料が、スルホプロピル基で官能化されたポリヒドロキシル化ポリマーで被覆された架橋ポリ(スチレン-ジビニルベンゼン)フロースルー粒子を含む請求項１記載の方法。
  9. 汚染物質が、チャイニーズハムスター卵巣タンパク質(ＣＨＯＰ)、浸出プロテインＡ、ＤＮＡ、凝集抗体、細胞培養培地成分、ガラマイシン、及びウイルス性汚染物質からなる群から選択される請求項１記載の方法。
  10. 均質な抗体調製物を得るために、抗体含有組成物に、工程(ａ)から(ｄ)の工程前、工程中又は工程後に、一又は複数のさらなる精製工程を施すことをさらに含む請求項１記載の方法。
  11. 精製された抗体を異種分子とコンジュゲートさせることをさらに含む請求項１０記載の方法。
  12. 抗体又はコンジュゲート抗体の均質調製物を薬学的に許容可能な担体と組合せることにより、薬学的組成物を調製することをさらに含む請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. ヒトＣＤ２０に結合する抗体を、該抗体とチャイニーズハムスター卵巣タンパク質(ＣＨＯＰ)、浸出プロテインＡ、ＤＮＡ、及び凝集ＣＤ２０抗体からなる群から選択される一又は複数の汚染物質を含有する組成物から精製する方法であって、
    (ａ)陽イオン交換材料に組成物をロードし、ここで組成物は約４．０〜約６．０のｐＨであり；
    (ｂ)約６．８〜約９．０のｐＨで第一洗浄バッファーを用いて陽イオン交換材料を洗浄し；
    (ｃ)約５．０〜約６．０のｐＨで第二洗浄バッファーを用いて陽イオン交換材料を洗浄し；
    (ｄ)約５．０〜約６．０のｐＨ及び約１０ｍＳ／ｃｍ〜約１００ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する溶出バッファーを用いて陽イオン交換材料から抗体を溶出させる
    逐次工程を含む方法。
  14. 抗体がリツキシマブである請求項１３記載の方法。
  15. 溶出バッファーが約１００〜約３００ｍＭのＮａＣｌを含有する請求項１３記載の方法。
  16. ヒト血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)に結合する抗体を、該抗体と細胞培養培地成分、ガラマイシン、チャイニーズハムスター卵巣タンパク質(ＣＨＯＰ)、ＤＮＡ、ウイルス性汚染物質、及び凝集ＶＥＧＦ抗体からなる群から選択される一又は複数の汚染物質を含有する組成物から精製する方法であって、
    (ａ)陽イオン交換材料に組成物をロードし、ここで組成物は約４．０〜約６．０のｐＨであり；
    (ｂ)約６．８〜約８．０のｐＨで第一洗浄バッファーを用いて陽イオン交換材料を洗浄し；
    (ｃ)約５．０〜約６．０のｐＨで第二洗浄バッファーを用いて陽イオン交換材料を洗浄し；さらに
    (ｄ)約５．０〜約６．０のｐＨ及び約１０ｍＳ／ｃｍ〜約１００ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する溶出バッファーを用いて陽イオン交換材料から抗体を溶出させる
    逐次工程を含む方法。
  17. 抗体がベバシズマブである請求項１６記載の方法。
  18. 溶出バッファーが約１００〜約３００ｍＭのＮａＣｌを含有する請求項１６記載の方法。
  19. 約７．８のｐＨで、約２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するバッファーにリツキシマブを含んでなる組成物。
  20. 約７．０のｐＨで、約２５ｍＭのＭＯＰＳを含有するバッファーにベバシズマブを含んでなる組成物。
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