JP2016539130A - コンジュゲーションのためのcho細胞培養物からの抗体の調製 - Google Patents
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Abstract
Description
3100−00111PC−ST25.txtと指定された、2014年11月21日に作成された11KBの配列表が、参考として本明細書に援用される。
単離された抗体またはADCは、一般には、その生成または精製により生じる干渉タンパク質および他の夾雑物から少なくとも50%w/w純粋であるが、モノクローナル抗体に、その使用を容易にするのに意図される薬学的に許容される担体(複数可)または他のビヒクルを過剰量で組み合わせる可能性は排除されない。時には、モノクローナル抗体またはADCは、生成または精製に由来する干渉タンパク質および夾雑物から少なくとも60%、70%、80%、90%、95または99%w/w純粋である。
I.一般
本発明は、CHO細胞酸化酵素、特に、クイエシン(quiescin)Q6スルフヒドリルオキシダーゼ1(QSOX1)が、一見すると厳しい抗体精製プロセス後に残存し、抗体調製物中に、その後の抗体と薬物のコンジュゲーション負荷効率を低下させるのに十分な量で存在する可能性があるという知見に一部基づく。精製プロセスにより、抗体に対して許容される低い割合のバックグラウンド夾雑物/不純物を有する抗体がもたらされると思われ得るが、それにもかかわらず、抗体の還元後に抗体のスルフヒドリル基が酸化され、したがって、薬物とのコンジュゲーションに利用できなくなるのに十分な量の酸化酵素が存在し得る。本発明の実施は機構の理解に依存しないが、精製抗体産物にまでQSOX1が存続することは、一部の精製条件下での抗体とQSOX1の間の相互作用の結果であり得る。酸化酵素が精製手順後に残存するかどうかは、どの精製技法を使用するかに左右され、これは1つの抗体と別の抗体で変動し得る。少ないが有意である量のCHO細胞酸化酵素を伴う一見すると純粋な抗体の調製物が存在する潜在性が同定される前は、不十分なコンジュゲーション負荷効率(不適切な薬物と抗体の平均比に反映される)は、不正確に、多数の原因のいずれかに帰するものとされていた可能性がある。しかし、CHO細胞酸化酵素による夾雑は、その後のコンジュゲーションに関する潜在的な問題であるという知見を用いて、CHO酸化酵素(複数可)を排除するまたは少なくとも許容されるレベルまで低下させる適切な精製スキームを任意の抗体に対して考案することができる。
QSOX1は、ヒトQSOX1、Swiss−Prot 000391のチャイニーズハムスターホモログである。この酵素は、酸素の還元を伴うスルフヒドリル基のジスルフィドへの酸化を触媒する。QSOX1への言及は、全長QSOX1酵素(シグナルペプチドを伴うまたは伴わない)、および、CHO細胞によって天然に放出されるか抗体精製プロセスの結果として放出されるかにかかわらず、スルフヒドリル酸化能力を保持する、天然に存在するそのバリアントを含めた任意のその断片を指す。CHO細胞培養培地中のQSOX1により、見かけのサイズ範囲65〜75kDa、またはより詳細には、68〜72kDaのバンドがもたらされる。例示的なQSOX1断片は、細胞外ドメイン、チオレドキシンドメインおよび/またはERV/ALRスルフヒドリルオキシダーゼドメインを含み得る。予測されるQSOX1アイソフォームX1タンパク質配列は、配列番号1に記載されているものとして以前に同定されており、GenBank受託番号XP_003500174.1として見出すことができる。QSOX1予測アイソフォームX1タンパク質配列は、以来更新されている。更新された配列は、配列番号2に記載されており、GenBank受託番号XP_007639037.1として見出すことができる。一部の態様では、QSOX1とは、配列番号2に対して90%またはそれ超(91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%または100%)の配列同一性を有し、スルフヒドリル酸化能力を保持するCHO細胞酸化酵素を指す。一部の態様では、QSOX1とは、配列番号2の94番目のアミノ酸から571番目のアミノ酸までにわたるアミノ酸配列を含み、スルフヒドリル酸化能力を保持するCHO細胞酸化酵素を指す。
本出願は、QSOX1およびQSOX2またはALRなどの他のCHO細胞酸化酵素を同定するため、および除去するための利用可能ないくつかの技法を提供する(さらなる詳細については実施例を参照されたい)。1つの技法は、抗体の調製物をプロテインAカラムにローディングし、中〜高塩濃度条件(例えば、少なくとも150mMのNaCl、または150〜500mMのNaCl)の下で洗浄することである。QSOX1はカラムから溶出するが、抗体は結合したまま残る。別の技法は、例えば、Millipore X0HCメンブレンを使用した深層濾過(depth filtration)である。抗体はフィルターを通過するが、QSOX1はフィルターに捕捉される。別の技法は、第四級アンモニウム基を有する強力な陰イオン交換体を使用することが好ましい陰イオン交換クロマトグラフィーである。GE HealthcareのCapto−Qカラムが適している。適切な条件下で(例えば、pH約8および導電率約5〜7mS/cm)、抗体はカラムを流れるが、QSOX1は結合したまま残る。別の技法はフェニルメンブレン濾過である。この種のメンブレンは、疎水性相互作用に基づいて分離する。適切な条件下で(例えば、pH6〜8およびクエン酸ナトリウム0.35〜0.4M)、抗体は通過し、QSOX1はメンブレンに結合する。
QSOX1は、QSOX1に特異的な抗体を用いたウェスタンブロットを含めた、実施例においてさらに記載されている種々のアッセイによって検出することができる。QSOX1は、ゲルから切り出された適切な分子量のバンド(グリコシル化の状態に応じて約65〜70kDa)に対するペプチド配列解析またはLC−MS/MSによって検出することもできる。QSOX1は、機能アッセイによって検出することもできる。QSOX1活性により過酸化水素が生じ、それを今度はキシレノールオレンジの存在下でFe2+の酸化によって生じる単純な色の変化によって検出することができる。QSOX1の特徴的な機能活性は、Zn2+(例えば、少なくとも90%)によって特異的に阻害されるが、EDTAおよび多くの他の塩(KI、MnSO4、NaCl)または尿素によっては阻害されない。QSOX1は、実施例2において実証されている通り、DTNBアッセイによって検出することもできる。
CHO細胞を、発現させる抗体の鎖をコードするベクター(複数可)で形質転換し、培養して抗体を発現させる。発現は、通常、精製スキームを決定するために十分な抗体をもたらす目的のために、最初は比較的小さな培養体積(例えば、1〜50L)で行う。次いで、発現した抗体を含有する培養培地を少なくとも1つの抗体精製スキームのステップに供して、化学的コンジュゲーションまたは医薬用途に適したレベルの純度を得る(例えば、高分子夾雑物/不純物に対して少なくとも90%w/w、95%w/w、97%w/w、98%w/wまたは99%w/wの抗体)。精製スキームは、通常、少なくとも2つのカラムクロマトグラフィーステップ、少なくとも1回、通常は複数回の濾過ステップ、ウイルス不活化ステップ、ならびに濃縮および再懸濁/希釈ステップを含む。任意の1つまたは全ての精製ステップが完了した後、抗体調製物をQSOX1の存在について試験することができる。QSOXが、陰性対照アッセイのバックグラウンドを超えて(実験誤差を超えて)検出された場合、またはその後のコンジュゲーションに許容されないとみなされるレベルを超えて検出された場合、最初の培養物(または入手可能な最初の培養物の量が不十分である場合には別の同様の培養物)の精製を第2の(異なる)精製ステップおよび/またはスキームを用いて繰り返す。第2の精製ステップおよび/またはスキームは、第1のステップと、他のバリエーションの中でも、精製の型(例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーと陽イオンイオン交換クロマトグラフィー、濾過のために使用されるメンブレンの型)、またはローディングまたは溶出に使用する緩衝液が異なってよい。
抗体を細胞傷害性部分または細胞増殖抑制性部分(薬学的に適合性のその塩を含む)とコンジュゲートして、抗体薬物コンジュゲート(ADC)を形成することができる。抗体は、薬物以外の薬剤、例えば、安定剤(例えば、PEG部分)とコンジュゲートすることができる。抗体とのコンジュゲーションに特に適する部分は、細胞傷害性薬剤(例えば、化学療法薬(chemodrug))、プロドラッグ変換酵素、放射性同位元素もしくは化合物、または毒素(これらの部分は、集合的に薬物と称される)である。例えば、抗体は、化学療法薬などの細胞傷害性薬剤、または毒素(例えば、細胞増殖抑制剤もしくは細胞破壊剤(cytocidal agent)、例えば、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素など)とコンジュゲートすることができる。
CHO上清からのタンパク質の精製に関して、技法の大きなレパートリーが公知である。これらの技法としては、遠心分離、濾過、沈殿、ウイルス不活化、ならびに、プロテインA、プロテインG、プロテインL、陰イオン交換、陽イオン交換、混合方式、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除クロマトグラフィー、および標的アフィニティークロマトグラフィーを含めた多数の型のカラムクロマトグラフィーが挙げられる。クロマトグラフィーステップでは、通常、少なくとも2種の緩衝液を使用し、1種はローディング用であり、1種は溶出用である。緩衝液は、他の因子の中でも、pHおよびイオン強度が変動し得る。例示的な抗体精製は、少なくとも1つの濾過ステップ、少なくとも1つのウイルス不活化ステップ、プロテインAカラムおよび少なくとも1つの他のカラムを含む。緩衝液、pH、ならびにローディング溶液および溶出溶液中の他の賦形剤に関する異なる技法および可能性の数を考慮すると、異なる精製手順の数は非常に大きい。したがって、多くの場合、異なる抗体に対する適切な精製手順を経験的に決定して、抗体が医薬用途のために許容されるレベルまで精製されるとともに(一般に抗体と高分子夾雑物/不純物の比によって決定される)、QSOX1および/または他のCHO細胞酸化酵素が検出可能なレベルを下回るまでまたは少なくとも許容されるレベルまで低下する手順を同定する。
記載されている精製方法およびワークフローは、非ヒト、ヒト化、ヒト、キメラ、ベニアリング(veneered)、ナノボディ、dAb、scFV、Fabなどを含めた任意の抗体に対して使用することができる。本方法は、診断または治療に使用するための薬剤とコンジュゲートされる抗体に対して最も有用である。例えば、方法は、治療的に使用するための薬物とコンジュゲートされる抗体に対して有用である。いくつかのそのような抗体は、がん細胞抗原、好ましくは、細胞表面上にある、抗体が結合すると細胞内に内部移行可能な抗原に対して免疫特異性である。抗体が対象とし得る標的としては、がん細胞上の受容体およびそれらのリガンドまたは対抗受容体(例えば、CD3、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD40、CD44、CD52 CD70、CD79a、Her−2、VEGFまたはVEGFR、CTLA−4、LIV−1、およびネクチン−4)が挙げられる。
上記の方法に従って生成したADCを、上記の任意の適応症を含めた、がん、自己免疫疾患または感染症などの、処置が意図された疾患の発症を遅延させ、重症度を低下させ、さらなる悪化を阻害し、かつ/または少なくとも1つの徴候または症状を改善させる投薬量、投与経路および投与頻度を意味する有効なレジメンで投与する。患者がすでに疾患に罹患している場合、レジメンは、治療的に有効なレジメンと称することができる。患者が、一般的な集団と比較して疾患のリスクが上昇しているが、まだ症状を経験していない場合、レジメンは、予防的に有効なレジメンと称することができる。いくつかの場合には、治療的または予防的有効性は、個々の患者において、歴史的な対照または同じ患者の過去の経験と比較して観察することができる。他の場合では、治療的または予防的有効性は、前臨床試験または臨床試験において、処置された患者の集団において処置されていない患者の対照集団と比較して実証することができる。
CHO細胞において発現させた抗体を精製することにより得られたロットDEVNKB−1では、予想外に乏しい薬物コンジュゲーションが示された。対照的に、ロットL22042/Eでは、望ましいレベルの薬物コンジュゲーションが示された。抗体への薬物コンジュゲーションは遊離のスルフヒドリル基によって媒介されるので、ロットDEVNKB−1では酸化活性を有する不純物の存在が疑われた。図1は、抗体への薬物コンジュゲーションの有効性に対する酸化性不純物の影響を示す。ロットDEVNKB−1由来の抗体(菱形の記号)では、還元の時間が50分を超えて延長すると薬物負荷量の減少が示されるが、ロットL22042/E由来の抗体(正方形の記号)では、還元の経過にわたって一貫した予測されたレベルの薬物負荷量が示される。
SDS−PAGEによる分離および銀染色後のロットDEVNKB−1とL22042/Eの比較では、酸化活性に明らかに対応するいかなるタンパク質バンドも示されなかった(データは示していない)。より良好な分解能を実現するために、ロットDEVNKB−1をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画した。画分を、実施例2に記載の通り酸化活性についてアッセイした。図2aを参照されたい。ピーク活性に対応する画分を、SDS−PAGEによって分離し、ブロットし、次いで、QSOX1、QSOX2、およびALR(肝臓再生の増強因子)を含めた候補スルフヒドリルオキシダーゼタンパク質に対する抗体を用いて染色した。図2bおよび図2cは、それぞれ抗ALR一次抗体および抗QSOX1一次抗体、その後、ウサギ抗ヤギIgG二次抗体を使用したウェスタンブロット分析の結果を示す。ブロットにより、二次抗体と多くの産物関連種の間の広範囲にわたる交差反応性が明らかになった。それにもかかわらず、抗QSOX1ブロットにおいて65kDから70kDの間の分子量に対応するピーク活性画分27〜29のバンドが検出され(図2c)、これは、ハムスターQSOX1の予測された重量(70,356ダルトン)と一致する。
抗QSOX1ウェスタンブロットにおいて検出された65〜70kDのタンパク質を同定するために、ロットDEVNKB−1をPoros Protein Aカラムでアフィニティークロマトグラフィーによって分画した。図3aを参照されたい。画分を実施例2に記載の通り酸化活性についてアッセイした。図3b参照のこと。酸化活性の本質的に全てが画分3および4に現れた。一連の3回の試行からの画分3および4をプールし、SDS−PAGEによって分析した。図3cを参照されたい。最も顕著なバンドは65〜70kDの範囲にあり、拡散した単一のバンドまたは二重線を形成し、これはウェスタンブロットと一致した。ゲル消化およびLC−MS/MSを使用して、バンドはQSOX1と陽性に同定された。
さらにロットDEVNKB−1における酸化活性を特徴付けるために、ロットを、鉄酸化キシレノールオレンジ(FOX)アッセイを使用してスルフヒドリル酸化活性について試験した。スルフヒドリルオキシダーゼは以下の反応を触媒する:
2R−SH+O2→R−S−S−R+H2O2
反応が進行するに従い、酸素が消費され、過酸化水素が生成される。過酸化水素副産物は容易にかつ確実に検出することができ、したがって、スルフヒドリルオキシダーゼ活性の代理としての機能を果たす。FOXアッセイでは、過酸化水素により二価鉄(Fe2+)が酸化され、三価鉄(Fe3+)を生成する。次いで、二価鉄がキシレノールオレンジと複合体を形成して、560nmの光を吸収する化合物が形成される。したがって、560nmの光の吸収をモニターすることによって(例えば、分光光度計を使用して)、試料中のスルフヒドリル酸化活性の量を決定することができる。陰性対照の値と試験試料の値を、560nmにおける読み取りの差異を決定することによって比較する。得られた値が0.1吸光度単位よりも大きければ、試料は酸化性不純物について陽性である。表1に示されている通り、DEVNKB−1の存在によりもたらされた560nmの吸光度は0.70〜0.80であった。しかし、DEVNKB−1と1mMのZn2+の両方を添加すると、わずか0.008であった。このデータにより、1mMのZn2+によりロットDEVNKB−1の酸化活性が本質的に排除され得ることが示される。これは、QSOX1などのフラビン依存性スルフヒドリルオキシダーゼドメインを有する酸化剤と一致する。
抗体調製物における酸化活性の検出をもたらすために(例えば、抗体が、薬物とのコンジュゲーションが意図されたものである場合)、部分的に還元されたSGN−30(cAC10抗体、ブレンツキシマブベドチンの抗体成分)を基質として使用するアッセイを開発した。SGN−30を基質として選択したのは、cAC10抗体が一貫してQSOX1の夾雑を伴わずに精製されているからである。SGN−30の代わりに、他のよく特徴付けられた、遊離のチオールを有する基質を使用することができる。
プロテインAで塩洗浄を実施することによる酸化性不純物の減少
本明細書では抗体2と称される第2の抗体の調製物は、許容できない高レベルの酸化活性を有することが見出された(遠心分離および濾過による清澄化の後)。酸化性不純物を除去するために、強度を変動させた塩洗浄を伴うプロテインAクロマトグラフィーを評価した。
深層濾過も、酸化性不純物を除去するその能力について試験した。デプスフィルター、Millipore X0HCフィルターを50〜100L/m2の水で湿らせ、少なくとも15L/m2の平衡化緩衝液(例えば、pH7.5〜8およびNaCl濃度50〜100mM)で平衡化した。濾過を、230L/m2/時間(LMH)、標的ローディング係数20〜60L/m2で実施した。産物を回収するために、フィルターを十分な体積の平衡化緩衝液で洗い流して、標的ピーク収集に達することを確実にした。濾液を280nmにおける吸光度によって収集した。そのような条件を使用して、酸化性不純物を除去した。
Capto Q強力陰イオン交換カラム(GE Healthcare Life Sciences、カタログ番号17−5316)を、pH8.0の緩衝液および導電率<8mS/cm(例えば、5〜7mS/cm)を用いてフロースルーモードで操作すると、酸化性不純物が除去されることが観察された。これらの条件により、Capto Qカラムを使用して酸化性不純物の除去を評価するための出発点がもたらされる。抗体1について、酸化性不純物の有効なクリアランスのためには低導電率および高pHを有する緩衝液が必要であることが実証された。Capto Qカラムをフロースルーモードで操作した。適切な条件で、mAbは樹脂に保持されないが、酸化性不純物は樹脂に吸着する。後に、高塩濃度の緩衝液を使用して酸化性不純物を樹脂から剥がす。第2の抗体、抗体2については、表5に示されている通り、緩衝液の導電率が11mS/cmという条件で(11未満またはそれと同等の導電率が必要である)、pH7.5で有効なクリアランスが実証された(7.5〜8が有効である)。pH7、および11mS/cmから15mS/cmまでにわたる導電率を有する緩衝液は、フロースルーモードでmAbから不純物を分離するのに有効ではなく、pH7.5および導電率15mS/cmを有する緩衝液も同様であった。
Sartobind Phenyl(登録商標)も、フロースルーモードで操作すると、CHO細胞において産生された抗体調製物から酸化性不純物を有効に除去することが見出されている。適切な条件下で、酸化性不純物はメンブレンに保持されるが、mAbは保持されない。後に、低塩緩衝液を使用して酸化性不純物を樹脂から剥がすことができる。ローディングは、抗体を標的クエン酸塩モル濃度(一般には、0.3〜0.4Mのクエン酸ナトリウム)およびpH(一般には、6〜8)まで希釈することによって調製する。メンブレンを、希釈した抗体ローディングに適合するように選択された、5メンブレン体積(MV)の平衡化緩衝液中で平衡化する。次いで、希釈したローディングをメンブレンに適用し、メンブレンを10MVの平衡化緩衝液で洗浄する。酸化性不純物を含まない抗体調製物がフロースルー中に現れる。結合した材料を、例えば、50mMのTris、pH8を用いて溶出させ、メンブレンを、例えば、5MVの25mMのリン酸ナトリウム、20%IPA、pH6.5を用いて再生させる。プロセスは、10mL/分または3.3MV/分で操作する。フロースルーのピーク全体、例えば、2mmの流路を使用して280nmにおいて0.1〜0.1AUを収集する。
Claims (32)
- コンジュゲートした抗体を生成する方法であって、
(a)精製スキームの精製ステップを少なくとも1つ実施して、抗体の少なくとも部分的に精製された調製物を、前記抗体を発現するCHO細胞の培養物から得るステップと、
(b)前記調製物をCHO細胞酸化酵素の存在について試験するステップと、
(c)ステップ(b)の前記調製物中に許容されないレベルの前記酵素が存在することが検出された場合に、ステップ(a)と(b)を、異なる精製ステップを用いて繰り返すステップと、
(d)ステップ(b)の前記調製物中に許容されるレベルのCHO細胞酸化酵素が存在するかまたは存在しないことが検出された場合に、同じ培養物または前記抗体を発現するCHO細胞の第2の培養物に対して、検出されるCHO細胞酸化酵素が許容されるレベルになるまたはCHO細胞酸化酵素が検出されなくなる精製ステップを少なくとも1つ実施して、抗体の少なくとも部分的に精製された調製物を得るステップと
を含む、方法。 - 前記少なくとも部分的に精製された抗体を、1つまたは複数のスルフヒドリル基を介して薬物とコンジュゲートして、前記コンジュゲートした抗体を生成するステップ(e)をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記CHO細胞酸化酵素がQSOX1である、請求項1または2に記載の方法。
- ステップ(d)の前記第2の培養物がステップ(a)の前記培養物よりも体積が大きい培養物である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)の前記第2の培養物の体積が、ステップ(a)の培養物よりも少なくとも1000倍大きい、請求項4に記載の方法。
- ステップ(d)および(e)を、前記抗体の異なる培養物に対して少なくとも1年の期間にわたって複数回実施する、請求項2に記載の方法。
- 検出される酵素が許容されるレベルになるまたは酵素が検出されなくなる前記精製スキームが、150〜500mMのNaClの濃度での塩洗浄を用いてプロテインAカラムを洗浄するステップ、深層濾過を使用するステップ、第四級アンモニウムイオンカラムを用いた陰イオン交換を使用するステップ、またはフェニルメンブレン濾過を使用するステップの少なくとも1つを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試験するステップが、ゲル上の65kDa〜75kDaのバンドを同定するステップを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バンドをウェスタンブロットまたは銀染色によって同定する、請求項8に記載の方法。
- 前記試験するステップが、QSOX1活性についての機能試験を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記機能試験により、前記活性の指標として過酸化水素が生成される、請求項10に記載の方法。
- 前記活性が亜鉛イオンによって阻害され、その阻害がEDTAによって逆転される、請求項11に記載の方法。
- 前記抗体がブレンツキシマブではない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞傷害性薬物が、抗チューブリン剤、DNA副溝結合剤、DNA複製阻害剤、化学療法感作物質およびピロロベンゾジアゼピン二量体から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- CHO細胞培養物から抗体を精製するための方法を決定する方法であって、
(a)精製方法を実施して、抗体を発現するCHO細胞の培養物から前記抗体の少なくとも部分的に精製された調製物を得るステップと、
(b)前記調製物をCHO酵素QSOX1の存在について試験するステップと、
(c)ステップ(b)の前記調製物中に許容されないレベルの前記酵素が存在することが検出された場合に、ステップ(a)と(b)を、異なる精製方法を用いて繰り返すステップと
を含む、方法。 - コンジュゲートした抗体を生成する方法であって、
プロテインAカラムを25〜100mMのNaClの濃度で洗浄するステップ、深層濾過を使用するステップ、第四級アンモニウムイオンカラムを用いた陰イオン交換を使用するステップ、またはフェニルメンブレン濾過を使用するステップの少なくとも1つを含む精製方法によってCHO細胞の培養物から抗体を精製するステップであって、前記抗体は、前記培養物中のQSOX1酵素から分離される、ステップと、
前記精製された抗体を、1つまたは複数のスルフヒドリル基を介して細胞傷害性薬物とコンジュゲートして、前記コンジュゲートした抗体を生成するステップと
を含む、方法。 - コンジュゲートした抗体を生成する方法であって、
(a)精製スキームの精製ステップを少なくとも1つ実施して、抗体の少なくとも部分的に精製された調製物を、前記抗体を発現するCHO細胞の培養物から得るステップと、
(b)前記少なくとも部分的に精製された抗体を、前記コンジュゲートした抗体を生成する条件下で、1つまたは複数のスルフヒドリル基を介して細胞傷害性薬物とコンジュゲートするステップであって、ここで許容されない低レベルのコンジュゲートした抗体が生成される、ステップと、
(c)ステップ(a)の前記精製された調製物をCHO細胞酸化酵素の存在について試験するステップと、
(d)ステップ(c)において許容されないレベルの前記CHO細胞酸化酵素が存在することが検出された場合に、ステップ(c)において前記CHO細胞酸化酵素が存在しなくなるまでまたは許容されるレベルになるまで、ステップ(a)および(c)を、異なる精製ステップを用いて実施するステップと、
(e)前記抗体を発現するCHO細胞の第2の培養物に対して、検出されるQSOX1酵素が許容されるレベルになるまたはQSOX1酵素が検出されなくなる少なくとも1つの前記精製ステップを実施して、精製された抗体を得るステップと、
(f)前記精製された抗体を、1つまたは複数のスルフヒドリル基を介して細胞傷害性薬物とコンジュゲートして、前記コンジュゲートした抗体を生成するステップと
を含む、方法。 - コンジュゲートした抗体を生成する方法であって、
(a)抗体の調製物を得るステップと、
(b)前記調製物をCHO細胞酸化酵素の存在について試験するステップと、
(c)ステップ(b)の前記調製物中に許容されないレベルの前記酵素が存在することが検出された場合に、精製ステップを実施して、前記CHO細胞酸化酵素を許容されるレベルまで除去するステップと、
(d)少なくとも部分的に精製された抗体を、1つまたは複数のスルフヒドリル基を介して薬物とコンジュゲートして、前記コンジュゲートした抗体を生成するステップと
を含む、方法。 - 抗体調製物の、医薬品として使用するための適合性を決定する方法であって、
前記調製物をCHO細胞酸化酵素の存在について試験するステップと、
前記抗体調製物中に許容されないレベルの前記酵素が存在することが検出された場合に、前記調製物を、コンジュゲーションに適さないものとして同定し、さらなる精製を必要とするステップと、
前記抗体調製物中に酵素が許容されるレベルで存在するかまたは存在しないことが検出された場合に、前記調製物をコンジュゲーションに適するものとして同定するステップと
を含む、方法。 - 抗体調製物の薬物とのコンジュゲーションに対する適合性を決定する方法であって、
前記調製物をCHO細胞酸化酵素の存在について試験するステップと、
前記抗体調製物中に許容されないレベルの前記酵素が存在することが検出された場合に、前記調製物を、コンジュゲーションに適さないものとして同定し、さらなる精製を必要とするステップと、
前記抗体調製物中に酵素が許容されるレベルで存在するかまたは存在しないことが検出された場合に、前記調製物をコンジュゲーションに適するものとして同定するステップと
を含む、方法。 - 抗体調製物の、医薬品として使用するための適合性を決定する方法であって、
前記調製物をCHO細胞酸化酵素の存在について試験するステップ
を含む、方法。 - 抗体調製物の薬剤(例えば、薬物)とのコンジュゲーションに対する適合性を決定する方法であって、
前記調製物をCHO細胞酸化酵素の存在について試験するステップ
を含む、方法。 - 前記抗体がCHO細胞において産生された抗体である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体調製物が、すでに少なくとも1つの精製ステップに供されている、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記精製ステップがクロマトグラフィー精製ステップである、請求項24に記載の方法。
- 抗体がコンジュゲーション前にCHO細胞酸化酵素の存在について試験された、抗体薬物コンジュゲート。
- 前記試験するステップが、ゲル上の65kDa〜75kDaのバンドを同定するステップを含む、請求項15または請求項17から26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バンドがウェスタンブロットまたは銀染色によって同定される、請求項27に記載の方法。
- 前記試験するステップが、QSOX1活性についての機能試験を含む、請求項15または請求項17から26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記機能試験により、前記活性の指標として過酸化水素が生成される、請求項29に記載の方法。
- 前記活性が亜鉛イオンによって阻害され、その阻害はEDTAによって逆転される、請求項30に記載の方法。
- 前記試験するステップが、対照試料中の遊離のチオール基とDTNBの間の反応および試験試料中の遊離のチオール基とDTNBの間の反応をモニタリングするステップと、その2つを比較するステップを伴う、請求項1から7、請求項15または請求項17から26のいずれか一項に記載の方法。
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