JP2015520758A - Ｃｄ３３抗体及び癌を処置するためのその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、CD33に特異的に結合するマウス、キメラ及びヒト化抗体を提供する。これらの抗体は、種々の癌の処置及び診断並びにCD33の検出のために有用である。【選択図】図２

Description

関連出願の相互参照
本願は、2013年3月14日出願の米国特許出願第13/804,227号の継続出願であり、2012年5月18日出願の米国仮特許出願第61/649,110号の利益を主張する。

CD33は、シアル酸に結合する67kDaの細胞膜タンパク質であり、シアル酸結合Ig関連レクチン(SIGLEC)ファミリーのタンパク質のメンバーである。CD33は、骨髄系細胞上で発現されることが知られている。CD33発現は、いくつかの悪性細胞上でも報告されてきた。

CD33は、急性骨髄性白血病などの癌の処置のために標的化されているが、有効なCD33標的化処置は、現在市場には存在しない。本発明は、これらの問題及び他の問題を解決する。

ヒトCD33タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体及びCD33タンパク質を発現する癌を処置するためにこの抗体を使用する方法が、本明細書で提供される。このモノクローナル抗体は、重鎖可変領域中に配列番号19、20及び21の相補性決定領域(CDR)並びに軽鎖可変領域中に配列番号22、23及び24のCDRを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのCDRは、保存されたアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、それぞれ配列番号18及び8由来の成熟重鎖可変領域及び成熟軽鎖可変領域(light variable region)のCDR中のいずれの差異も、H60位〜H65位に存在する。モノクローナル抗体は、マウス抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体であり得る。好ましいヒト化抗体は、本明細書に開示されるh2H12抗体である。一態様では、本発明は、重鎖可変領域中に配列番号19、20及び21のCDR並びに軽鎖可変領域中に配列番号22、23及び24のCDRを含むヒト化抗体であり、さらには、配列番号18に対して少なくとも90%の同一性を有する成熟重鎖可変領域及び配列番号8に対して少なくとも90%の同一性を有する成熟軽鎖領域を有する。さらに、重鎖の以下のアミノ酸残基が維持されている:H48はIによって占められ、H66位はKによって占められ、H67位はAによって占められ、H69位はLによって占められ、H71位はAによって占められ、H94位はSによって占められ;軽鎖の以下のアミノ酸残基が維持されている:L22はNによって占められ、L46位はTによって占められ、L69位はQによって占められ、L71位はYによって占められている。さらなる実施形態では、ヒト化抗体は、重鎖可変領域中に配列番号19、20及び21のCDR並びに軽鎖可変領域中に配列番号22、23及び24のCDRを含み、さらには、配列番号18に対して少なくとも95%の同一性を有する成熟重鎖可変領域及び配列番号8に対して少なくとも95%の同一性を有する成熟軽鎖領域を有する。

別の実施形態では、ヒト化2H12抗体は、重鎖定常領域に融合している成熟重鎖及び軽鎖定常領域に融合している成熟軽鎖を有する。さらなる実施形態では、重鎖定常領域は、天然ヒト定常領域の変異体形態であり、天然ヒト定常領域と比較して低減されたFcγ受容体に対する結合を有する。別の実施形態では、重鎖定常領域は、IgG1アイソタイプの重鎖定常領域である。例示的な重鎖定常領域アミノ酸配列には、239位のセリンがシステインで置換された(S239C)、配列番号27及び配列番号29の重鎖定常領域が含まれる。例示的な軽鎖定常領域アミノ酸配列には、配列番号25が含まれる。

一実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号18のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域及び配列番号8のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域を含む。

一実施形態では、ヒト化抗体は、細胞傷害剤又は細胞増殖抑制にコンジュゲートされている。さらなる実施形態では、ヒト化抗体は、細胞傷害剤にコンジュゲートされている。細胞傷害剤は、例えばDNA副溝結合剤であり得る。ピロロ[1,4]ベンゾジアゼピン(PBD)は、本明細書に開示されるヒト化CD33抗体にコンジュゲートされ得るDNA副溝結合剤である細胞傷害剤の一例である。一実施形態では、PBDは、酵素切断可能なリンカーを介してCD33抗体にコンジュゲートされている。別の実施形態では、細胞傷害剤は、式

[式中、波線は、リンカーへの結合の部位を示す]
を有する。

一実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト又はカニクイザルのCD33に対して、0.5〜2×10⁹M^-1の会合定数を有する。

一態様では、本発明は、本明細書に開示されるヒト化抗体CD33の有効な投与計画を患者に施すことによって、CD33を発現する癌を有しているか又は有する危険性のある患者を処置する方法を提供する。CD33発現癌には、急性骨髄性白血病(AML)、骨髄異形成症候群(MDS)、急性前骨髄球性白血病(APL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄単球性白血病(CMML)、慢性骨髄増殖性障害、前駆B細胞急性リンパ芽球性白血病(precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia)(preB-ALL)、前駆T細胞急性リンパ芽球性白血病(precursor T-cell acute lymphoblastic leukemia)(preT-ALL)、多発性骨髄腫(MM)、肥満細胞症及び骨髄肉腫が含まれる。一態様では、本発明は、重鎖可変領域中に配列番号19、20及び21の補性決定領域(CDR)並びに軽鎖可変領域中に配列番号22、23及び24のCDRを含むヒト化又はキメラ抗体を含む医薬組成物を提供する。

一態様では、本発明は、HI、配列番号18のアミノ酸配列と少なくとも90%同一な成熟重鎖可変領域及びLG、配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも90%同一な成熟軽鎖可変領域を有するヒト化抗体を提供する。さらなる実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号18に対して少なくとも95%同一な成熟重鎖可変領域及び配列番号8に対して少なくとも95%同一な成熟軽鎖可変領域を有する。別の実施形態では、重鎖可変領域のH48位、H66位、H67位、H69位、H71位及びH94位は、I、K、A、L、A及びSによって占められ、軽鎖可変領域のL22位、L46位、L69位及びL71位は、N、T、Q及びYによって占められている。いくつかの実施形態では、それぞれ配列番号18及び8由来の成熟重鎖可変領域及び成熟軽鎖可変領域のCDR中のいずれの差異も、H60位〜H65位に存在する。

さらなる実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号18の成熟重鎖可変領域と同一な成熟重鎖可変領域のCDR及び配列番号8の成熟軽鎖可変領域と同一な成熟軽鎖可変領域のCDRを有する。一実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号18のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域及び配列番号8のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域を含む。

一実施形態では、ヒト化抗体は、細胞傷害剤又は細胞増殖抑制にコンジュゲートされている。一実施形態では、ヒト化抗体は、細胞傷害剤又は細胞増殖抑制にコンジュゲートされている。さらなる実施形態では、ヒト化抗体は、細胞傷害剤にコンジュゲートされている。細胞傷害剤は、例えばDNA副溝結合剤であり得る。ピロロ[1,4]ベンゾジアゼピン(PBD)は、本明細書に開示されるヒト化CD33抗体にコンジュゲートされ得るDNA副溝結合剤である細胞傷害剤の一例である。一実施形態では、PBDは、酵素切断可能なリンカーを介してCD33抗体にコンジュゲートされている。別の実施形態では、この細胞傷害剤は、式

[式中、波線は、リンカーへの結合の部位を示す]
を有する。

別の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト又はカニクイザルのCD33に対して、0.5〜2×10⁹M^-1の会合定数を有する。

別の実施形態では、ヒト化抗体は、重鎖定常領域に融合している成熟重鎖及び軽鎖定常領域に融合している成熟軽鎖を有する。さらなる実施形態では、重鎖定常領域は、天然ヒト定常領域の変異体形態であり、天然ヒト定常領域と比較して低減されたFcγ受容体に対する結合を有する。別の実施形態では、この重鎖定常領域は、IgG1アイソタイプの重鎖定常領域である。例示的な重鎖定常領域アミノ酸配列には、配列番号27及び配列番号29(S239C)が含まれる。例示的な軽鎖定常領域アミノ酸配列には、配列番号25が含まれる。

さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載される成熟重鎖又は成熟軽鎖可変領域のいずれかをコードする核酸を提供する。重鎖可変領域をコードする例示的な核酸には、配列番号39〜47が含まれ;軽鎖可変領域をコードする例示的な核酸には、配列番号32〜38が含まれる。

一態様では、本発明は、本明細書に開示されるヒト化抗体CD33の有効な投与計画を患者に施すことによって、CD33を発現する癌を有しているか又は有する危険性のある患者を処置する方法を提供する。CD33発現癌には、急性骨髄性白血病(AML)、骨髄異形成症候群(MDS)、急性前骨髄球性白血病(APL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄単球性白血病(CMML)、慢性骨髄増殖性障害、前駆B細胞急性リンパ芽球性白血病(preB-ALL)、前駆T細胞急性リンパ芽球性白血病(preT-ALL)、多発性骨髄腫(MM)、肥満細胞症及び骨髄肉腫が含まれる。ヒト化抗体は、好ましくは、薬学的に適切な組成物中で投与される。いくつかの実施形態では、投与されるヒト化抗体は、細胞傷害剤又は細胞増殖抑制にコンジュゲートされている。一実施形態では、投与されるヒト化抗体は、細胞傷害剤又は細胞増殖抑制にコンジュゲートされている。さらなる実施形態では、投与されるヒト化抗体は、細胞傷害剤にコンジュゲートされている。細胞傷害剤は、例えばDNA副溝結合剤であり得る。ピロロ[1,4]ベンゾジアゼピン(PBD)は、本明細書に開示される投与されるヒト化CD33抗体にコンジュゲートされ得るDNA副溝結合剤である細胞傷害剤の一例である。一実施形態では、PBDは、酵素切断可能なリンカーを介して、投与されるCD33抗体にコンジュゲートされている。別の実施形態では、この細胞傷害剤は、式

[式中、波線は、リンカーへの結合の部位を示す]
を有する。

図1A及び図1Bは、親マウスmAb(m2H12と呼ばれる)とヒト化2H12重鎖可変領域(図1A)及び軽鎖可変領域(図1B)の、アミノ酸配列のアラインメントを示す。 図2は、CD33陽性AML細胞株HL-60及びHEL 92.1.7に対する、2H12由来の抗体-薬物コンジュゲート(ADC)の活性を試験するインビトロ細胞傷害性アッセイの結果を示す。h2H12dをSGD-1910にコンジュゲートし;m2H12及びh2H12をSGD-1269にコンジュゲートした。非結合対照ADC(h00d-SGD-1910及びh00-SGD-1269)を、抗原特異性の対照として試験した。MYLOTARG(登録商標)(ゲムツズマブオゾガマイシン)は、細胞傷害薬カリチアマイシンに連結された抗CD33抗体hP67.6から構成される十分に記載されたCD33指向性抗体薬物コンジュゲートであり、これもまた試験した。

定義
本発明は、とりわけ、ヒトCD33タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体及びそのコンジュゲートを提供する。該抗体は、CD33発現癌の処置及び診断並びにCD33タンパク質の検出のために有用である。

「単離された」抗体とは、同定され、その天然の環境の構成成分から分離及び/若しくは回収された抗体、並びに/又は組換え産生された抗体を指す。「精製された抗体」は、その産生又は精製から生じる妨害タンパク質及び他の夾雑物から、典型的には少なくとも50% w/w純粋な抗体であるが、該モノクローナル抗体が、その使用を促進するために意図される過剰量の薬学的に許容される担体(複数可)又は他のビヒクルと組み合わされる可能性は排除しない。妨害タンパク質及び他の夾雑物には、例えば、抗体が単離又は組換え産生される細胞の細胞性構成成分が含まれ得る。時折、モノクローナル抗体は、産生又は精製由来の妨害タンパク質及び夾雑物から、少なくとも60%、70%、80%、90%、95又は99% w/w純粋である。マウス抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体を含む本明細書に記載される抗体は、単離された形態及び/又は精製された形態で提供され得る。

用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用する場合、実質的に均質な抗体の集団から取得された抗体を指す、即ち、この集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る可能な天然に存在する変異を除いて同一である。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から取得される抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohlerら(1975) Nature 256:495によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、又は組換えDNA法によって作製され得る(例えば、米国特許第4,816,567号を参照のこと)。「モノクローナル抗体」はまた、例えばClacksonら(1991) Nature, 352:624-628及びMarksら(1991) J. Mol. Biol., 222:581-597に記載された技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離され得るか、又は他の方法によって作製され得る。本明細書に記載される抗体は、モノクローナル抗体である。

モノクローナル抗体の、その標的抗原に対する特異的結合とは、少なくとも10⁶、10⁷、10⁸、10⁹又は10¹⁰M^-1の親和性を意味する。特異的結合は、少なくとも1つの無関係の標的に対して生じる非特異的結合より規模が検出可能に高く、識別可能である。特異的結合は、特定の官能基間での結合の形成又は特定の空間的嵌合(例えば、鍵と鍵穴型)の結果であり得るが、非特異的結合は通常、ファン・デル・ワールス力の結果である。

基本的な抗体の構造単位は、サブユニットのテトラマーである。各テトラマーは、ポリペプチド鎖の2つの同一の対を含み、各対は、1つの「軽」鎖(約25kDa)及び1つの「重」鎖(約50〜70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部は、抗原認識を主に担う約100〜110又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。この可変領域は、切断可能なシグナルペプチドに連結されて最初に発現される。シグナルペプチドを含まない可変領域は、時折、成熟可変領域と呼ばれる。従って、例えば、軽鎖成熟可変領域は、軽鎖シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域を意味する。各鎖のカルボキシ末端部は、エフェクター機能を主に担う定常領域を規定する。

軽鎖は、カッパ又はラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロンとして分類され、それぞれ、IgG、IgM、IgA、IgD及びIgEとして、抗体のアイソタイプを規定する。軽鎖及び重鎖内では、可変領域及び定常領域は、約12以上のアミノ酸の「J」領域によってつながれ、重鎖はまた、約10以上のアミノ酸の「D」領域を含む(一般には、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれるFundamental Immunology (Paul, W.,編,第2版 Raven Press, N.Y., 1989,第7章を参照のこと)。

各軽鎖/重鎖対の成熟可変領域は、抗体の結合部位を形成する。従って、インタクトな抗体は、2つの結合部位を有する。二機能性抗体又は二特異性抗体を除いて、2つの結合部位は同じである。該鎖は全て、相補性決定領域又はCDRとも呼ばれる3つの超可変領域によってつながれた、比較的保存されたフレームワーク領域(FR)という同じ一般構造を示す。各対の2つの鎖由来のCDRは、フレームワーク領域によってアラインされて、特異的エピトープへの結合を可能にする。N末端からC末端に向けて、軽鎖及び重鎖の両方は、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4ドメインを含む。各ドメインに対するアミノ酸の割り当ては、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987及び1991)又はChothia及びLesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothiaら, Nature 342:878-883 (1989)の定義に従う。Kabatは、異なる重鎖間又は異なる軽鎖間の対応する残基に同じ番号が割り当てられる、広く使用される番号付け規則(Kabat番号付け)もまた提供している。

用語「抗体」には、インタクトな抗体及びその結合性断片が含まれる。典型的に、別々の重鎖、軽鎖Fab、Fab'、F(ab')₂、F(ab)c、ダイアボディ、Dab、ナノボディ及びFvをはじめとする抗体断片は、標的への特異的結合についてその抗体断片の由来となるインタクトな抗体と競合する。断片は、組換えDNA技術により、又はインタクトな免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的分離によって産生され得る。用語「抗体」には、ダイアボディ(ホモダイマーFv断片)又はミニボディ(V_L-V_H-C_H3)、二特異性抗体などもまた含まれる。二特異性抗体又は二機能性抗体は、2つの異なる重鎖/軽鎖対及び2つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である(例えば、Songsivilai及びLachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelnyら, J. Immunol., 148:1547-53 (1992)を参照のこと)。

用語「抗体」には、抗体自体(裸の抗体)又は細胞傷害薬若しくは細胞分裂阻害薬物にコンジュゲートされた抗体が含まれる。

用語「エピトープ」とは、抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、連続するアミノ酸、又は1つ以上のタンパク質の3次折り畳みによって並列される連続していないアミノ酸から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは、変性性溶媒への曝露の際に典型的には保持されるが、3次折り畳みによって形成されるエピトープは、変性性溶媒による処理の際に典型的には失われる。エピトープは典型的に、独自の空間的コンフォメーションの、少なくとも3、より通常は、少なくとも5又は8〜10アミノ酸を含む。エピトープの空間的コンフォメーションを決定する方法には、例えば、X線結晶解析及び2次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology,第66巻, Glenn E. Morris,編(1996)を参照のこと。

同じか又は重複するエピトープを認識する抗体は、標的抗原に対する別の抗体の結合と競合する1つの抗体の能力を示す単純なイムノアッセイで同定され得る。抗体のエピトープは、接触残基を同定するために、その抗原に結合した抗体のX線結晶解析によっても規定され得る。代替的に、2つの抗体は、一方の抗体の結合を低減又は排除する抗原中の全てのアミノ酸変異が、他方の抗体の結合を低減又は排除する場合、同じエピトープを有する。2つの抗体は、一方の抗体の結合を低減又は排除するいくつかのアミノ酸変異が、他方の抗体の結合を低減又は排除する場合、重複するエピトープを有する。抗体間の競合は、試験中の抗体が共通の抗原に対する参照抗体の特異的結合を阻害するアッセイによって決定される(例えば、Junghansら, Cancer Res. 50:1495, 1990を参照のこと)。試験抗体は、過剰量の試験抗体(例えば、少なくとも2×、5×、10×、20×又は100×)が、競合的結合アッセイにおいて測定した場合、少なくとも50%であるが好ましくは少なくとも75%、90%又は99%、参照抗体の結合を阻害する場合に、参照抗体と競合する。競合アッセイによって同定される抗体(競合抗体)には、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、及び立体障害が生じるように参照抗体によって結合されるエピトープと十分に近接した隣接エピトープに結合する抗体が含まれる。ヒトCD33タンパク質に対する結合についてh2H12抗体と競合する抗体は、本開示中に含まれる。

2H12抗体は、ヒトCD33タンパク質に特異的に結合し、3つの重鎖相補性決定領域(hCDR):重鎖CDR1、例えば、配列番号19又は配列番号19と実質的に同一な配列、重鎖CDR2、例えば、配列番号20又は配列番号20と実質的に同一な配列、及び重鎖CDR3、例えば、配列番号21又は配列番号21と実質的に同一な配列;並びに3つの軽鎖CDR:軽鎖CDR1、例えば、配列番号22又は配列番号22と実質的に同一な配列、軽鎖CDR2、例えば、配列番号23又は配列番号23と実質的に同一な配列、及び軽鎖CDR3、例えば、配列番号24又は配列番号24と実質的に同一な配列、を含む抗体である。2H12抗体には、マウス2H12(m2H12)抗体、及びマウス2H12抗体由来のキメラ又はヒト化抗体が含まれる。

用語「患者」には、予防的又は治療的処置のいずれかを受けるヒト及び他の哺乳動物対象が含まれる。

アミノ酸置換を保存的又は非保存的に分類する目的のために、アミノ酸は、以下のようにグループ分けされる:グループI(疎水性側鎖):met、ala、val、leu、ile;グループII(中性親水性側鎖):cys、ser、thr;グループIII(酸性側鎖):asp、glu;グループIV(塩基性側鎖):asn、gln、his、lys、arg;グループV(鎖の配向に影響を与える残基):gly、pro;及びグループVI(芳香族側鎖):trp、tyr、phe。保存的置換は、同じクラス中のアミノ酸間での置換を含む。非保存的置換は、これらのクラスのうち1つのメンバーの、別のクラスのメンバーによる交換からなる。

配列同一性パーセントは、Kabat番号付け規則によって最大限にアラインされた抗体配列で決定される。アラインメント後、被験抗体領域(例えば、重鎖又は軽鎖の成熟可変領域全体)が、参照抗体の同じ領域と比較されている場合、被験抗体領域と参照抗体領域との間の配列同一性パーセントは、被験抗体領域及び参照抗体領域の両方において同じアミノ酸によって占められた位置の数を、ギャップを数えずに、2つの領域のアラインされた位置の総数によって割り、百分率に変換するために100をかけた数である。

1つ以上の列挙された要素を「含む」組成物又は方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含み得る。例えば、抗体を含む組成物は、抗体を単独で又は他の成分と組み合わせて含み得る。

値の範囲の指定は、その範囲内の又はその範囲を規定する全ての整数を含む。

抗体エフェクター機能とは、IgのFcドメインによってもたらされる機能を指す。かかる機能は、例えば、抗体依存性細胞傷害作用(cellular cytotoxicity)、抗体依存性細胞食作用又は補体依存性細胞傷害であり得る。かかる機能は、例えば、食作用活性若しくは溶解活性を有する免疫細胞上のFc受容体に対するFcエフェクタードメインの結合、又は補体系の構成成分に対するFcエフェクタードメインの結合によって、もたらされ得る。典型的には、Fc結合細胞又は補体構成成分によって媒介される効果は、CD33標的化細胞の阻害及び/又は枯渇を生じる。抗体のFc領域は、Fc受容体(FcR)発現細胞をリクルートでき、かかる細胞を抗体被覆された標的細胞と並列させ得る。FcγRIII(CD16)、FcγRII(CD32)及びFcγRIII(CD64)を含む、IgGに対する表面FcRを発現する細胞は、IgG被覆された細胞の破壊のためのエフェクター細胞として作用し得る。かかるエフェクター細胞には、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球及び好酸球が含まれる。IgGによるFcγRの結合は、抗体依存性細胞傷害作用(ADCC)又は抗体依存性細胞食作用(ADCP)を活性化する。ADCCは、膜ポア形成タンパク質及びプロテアーゼの分泌を介してCD16⁺エフェクター細胞によって媒介されるが、食作用は、CD32⁺及びCD64⁺エフェクター細胞によって媒介される(Fundamental Immunology,第4版, Paul編, Lippincott-Raven, N.Y., 1997,第3章,第17章及び第30章; Uchidaら, 2004, J. Exp. Med. 199:1659-69; Akewanlopら, 2001, Cancer Res. 61:4061-65; Watanabeら, 1999, Breast Cancer Res. Treat. 53:199-207を参照のこと)。ADCC及びADCPに加えて、細胞に結合した抗体のFc領域は、補体依存性細胞傷害(CDC)を惹起するための補体の古典的な経路もまた活性化し得る。補体系のC1qは、抗体が抗原と複合体化した場合に抗体のFc領域と結合する。細胞に結合した抗体に対するC1qの結合は、C3コンバターゼを生成するための、C4及びC2のタンパク質分解性の活性化を含む事象のカスケードを開始させ得る。C3コンバターゼによる、C3のC3bへの切断は、C5b、C6、C7、C8及びC9を含む末端の補体構成成分の活性化を可能にする。集団的に、これらのタンパク質は、抗体被覆された細胞上に、膜攻撃複合体ポアを形成する。これらのポアは、細胞膜の完全性を壊し、標的細胞を死滅させる(Immunobiology,第6版, Janewayら, Garland Science, N. Y., 2005, 第2章を参照のこと)。

用語「抗体依存性細胞傷害作用」即ちADCCは、抗体被覆された標的細胞の、溶解活性を有する免疫細胞(エフェクター細胞とも呼ばれる)との相互作用に依存する、細胞死を誘導する機構である。かかるエフェクター細胞には、ナチュラルキラー細胞、単球/マクロファージ及び好中球が含まれる。エフェクター細胞は、その抗原結合部位を介して、標的細胞に結合したIgのエフェクタードメインに結合する。抗体被覆された標的細胞の死は、エフェクター細胞活性の結果として生じる。

用語「抗体依存性細胞食作用」即ちADCPとは、抗体被覆された細胞が、IgのFcエフェクタードメインに結合する食作用性免疫細胞(例えば、マクロファージ、好中球及び樹状細胞)によって全体的に又は一部が内在化されるプロセスを指す。

用語「補体依存性細胞傷害」即ちCDCとは、標的に結合した抗体のFcエフェクタードメインが、標的細胞膜における孔の形成で終わる一連の酵素反応を活性化する、細胞死を誘導する機構を指す。典型的には、抗体被覆された標的細胞上のものなどの抗原-抗体複合体が、補体構成成分C1qに結合して活性化し、これが次に、標的細胞死を導く補体カスケードを活性化する。補体の活性化は、白血球上の補体受容体(例えば、CR3)に結合することによってADCCを促進する、標的細胞表面上の補体構成成分の沈着もまたもたらし得る。

「細胞傷害効果」とは、標的細胞の枯渇、排除及び/又は死滅を指す。「細胞傷害剤」とは、細胞に対する細胞傷害効果を有する薬剤を指す。

細胞傷害剤は、抗体にコンジュゲートされ得るか、又は抗体と組み合わせて投与され得る。

「細胞増殖抑制効果」とは、細胞増殖の阻害を指す。「細胞増殖抑制」とは、細胞に対する細胞増殖抑制効果を有し、それにより、細胞の特定のサブセットの成長及び/又は増殖(expansion)を阻害する薬剤を指す。細胞増殖抑制剤は、抗体にコンジュゲートされ得るか、又は抗体と組み合わせて投与され得る。

用語「薬学的に許容される」とは、動物、及びより具体的にはヒトでの使用に関して、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認された若しくは承認可能なこと、又は米国薬局方若しくは他の一般に認識された薬局方に列挙されたことを意味する。用語「薬学的に適合性の成分」とは、抗CD33抗体がそれらと共に対象に投与される、薬学的に許容される希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを指す。

語句「薬学的に許容される塩」とは、抗CD33-1抗体若しくはそのコンジュゲート又は抗CD33-1抗体と共に投与される薬剤の、薬学的に許容される有機又は無機の塩を指す。例示的な塩には、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩(acid phosphate)、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩(acid citrate)、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩(gentisinate)、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、pトルエンスルホン酸塩及びパモ酸塩(即ち、1,1'メチレンビス-(2ヒドロキシ3ナフトエ酸塩))が含まれる。薬学的に許容される塩は、酢酸イオン、コハク酸イオン又は他の対イオンなどの別の分子の包接を含み得る。対イオンは、親化合物上の電荷を安定化させる任意の有機又は無機の部分であり得る。さらに、薬学的に許容される塩は、その構造中に1つより多い荷電原子を有し得る。複数の荷電原子が薬学的に許容される塩の一部である場合は、塩は複数の対イオンを有し得る。従って、薬学的に許容される塩は、1つ以上の荷電原子及び/又は1つ以上の対イオンを有し得る。

文脈が明らかに他を示さない限り、用語「約」は、示された値の標準偏差内の値を包含する。
詳細な説明
I.概要
本発明は、CD33に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。該抗体は、種々の癌の処置及び診断並びにCD33の検出のために有用である。
II.標的分子
特に示さない限り、CD33は、ヒトCD33を意味する。例示的なヒト配列には、Swiss Protアクセッション番号P20138が割り当てられている。P20138は、配列番号55として本明細書に含まれる。P20138は、シグナルペプチド、アミノ酸1〜17;IgG様ドメインを有する細胞外ドメイン、アミノ酸18〜259;膜貫通ドメイン、アミノ酸260〜282;及び細胞質ドメイン、アミノ酸283〜364を含む。文脈が明らかに他を示さない限り、参照CD33とは、少なくともタンパク質の細胞外ドメインを意味し、通常、切断可能なシグナルペプチド(P20138のアミノ酸1〜17)以外の完全タンパク質を意味する。
III.本発明の抗体
A.結合特異性及び機能的特性
本発明は、マウス抗体、m2H12、及びm2H12由来のキメラ又はヒト化抗体を提供する。マウス抗体は、ヒトCD33タンパク質及びカニクイザルCD33タンパク質の両方に結合する能力について選択された。カニクイザルCD33のアミノ酸配列は、配列番号56及び57として提供される。

マウスm2H12抗体のヒト化又はキメラ形態の親和性(即ち、Ka)は、m2H12抗体の親和性よりも大きい、又はヒトCD33に対するマウス抗体m2H12の親和性の5倍若しくは2倍以内(即ち、より多い又はより少ない)であり得る。その標的抗原に対する抗体の親和性を測定する1つの方法は、抗体の見かけの解離定数を決定することによる。本発明は、マウス2H12の見かけの解離定数と本質的に同じ(即ち、実験誤差以内の)見かけの解離定数を有する抗体(例えば、マウス2H12抗体のキメラ及びヒト化形態)並びにヒトCD33に対するマウス抗体2H12の解離定数よりも低い又は高い解離定数を有する抗体を包含する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体(例えば、マウス2H12抗体のキメラ、ヒト化及びヒト形態)は、ヒトCD33に対するマウス2H12抗体の見かけの解離定数の、0.1〜10倍の範囲内、好ましくは0.1〜5倍、0.1〜2倍又はさらには0.5〜2倍の範囲内の、見かけの解離定数を有する。いくつかの態様では、ヒトCD33に対する抗体の見かけの解離定数(Kd)は、好ましくは0.1nM〜50nMの範囲内、なおより好ましくは0.1nM〜25nMの範囲内、なお好ましくは0.1nM〜10nM、0.5nM〜5nM又は0.5nM〜2.5nMの範囲内である。ヒト化又はキメラm2H12抗体は、それらが由来するマウスm2H12抗体と同様、ネイティブ形態のヒトCD33及び/又はCHO細胞から組換え発現されたヒトCD33に特異的に結合する。ヒト化又はキメラm2H12抗体は、同じエピトープに結合する及び/又はヒトCD33に対する結合についてm2H12と競合する。いくつかの実施形態では、ヒト化又はキメラm2H12抗体は、CD33のcynoホモログにも結合し、従って、非ヒト霊長類における前臨床試験を可能にする。

好ましい抗体(例えば、ヒト化又はキメラm2H12抗体)は、培養物中で増殖している癌性細胞について、動物モデルにおいて、又は臨床試験において示されるように、癌(例えば、細胞の成長、転移及び/又は生物に対する致死性)を阻害する。動物モデルは、CD33発現ヒト腫瘍細胞株又は初代患者腫瘍細胞を、適切な免疫不全げっ歯類系統、例えば、胸腺欠損ヌードマウス、NSG又はSCIDマウスに移植することによって形成され得る。これらの腫瘍細胞株は、皮下注射によって固形腫瘍として、又は静脈内注射によって播種性腫瘍としてのいずれかで、免疫不全げっ歯類宿主において樹立され得る。一旦宿主内で樹立されると、これらの腫瘍モデルは、実施例に記載されるように、抗CD33抗体又はそのコンジュゲート形態の治療効力を評価するために適用され得る。
B.抗体
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体由来のCDRがヒト「アクセプター」抗体配列中にグラフトされた、遺伝子操作された抗体である(例えば、Queen、米国特許第5,530,101号及び米国特許第5,585,089号;Winter、米国特許第5,225,539号;Carter、米国特許第6,407,213号;Adair、米国特許第5,859,205号;並びにFoote、米国特許第6,881,557号を参照のこと)。アクセプター抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、かかる配列の複合、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、又は生殖系列領域配列であり得る。重鎖について好ましいアクセプター配列は、生殖系列V_HエキソンV_H1-18であり、Jエキソン(J_H)については、エキソンJ_H-6である。軽鎖について、好ましいアクセプター配列は、エキソンV_L1-16 JエキソンJκ-4である。従って、ヒト化抗体は、非ヒトドナー抗体に全体的に又は実質的に由来するいくつかの又は全てのCDR、並びに存在する場合には、ヒト抗体配列に全体的に又は実質的に由来する可変領域フレームワーク配列及び定常領域を有する抗体である。同様に、ヒト化重鎖は、ドナー抗体重鎖に全体的に又は実質的に由来する少なくとも1つ、2つ及び通常は3つ全てのCDR、並びに存在する場合には、ヒト重鎖可変領域フレームワーク及び定常領域配列に実質的に由来する重鎖可変領域フレームワーク配列及び重鎖定常領域を有する。同様に、ヒト化軽鎖は、ドナー抗体軽鎖に全体的に又は実質的に由来する少なくとも1つ、2つ及び通常は3つ全てのCDR、並びに存在する場合には、ヒト軽鎖可変領域フレームワーク及び定常領域配列に実質的に由来する軽鎖可変領域フレームワーク配列及び軽鎖定常領域を有する。ナノボディ及びdAbを除き、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖及びヒト化軽鎖を含む。ヒト化又はヒト抗体中のCDRは、対応する残基の少なくとも60%、85%、90%、95%又は100%(Kabatによって規定される)がそれぞれのCDR間で同一である場合に、非ヒト抗体中の対応するCDRに実質的に由来する又はかかるCDRと実質的に同一である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体又はヒト抗体中のCDRは、各CDR中に3つ以下の保存的アミノ酸置換が存在する場合に、非ヒト抗体中の対応するCDRに実質的に由来する又はかかるCDRと実質的に同一である。抗体鎖の可変領域フレームワーク配列又は抗体鎖の定常領域は、Kabatによって規定される対応する残基の少なくとも70%、80%、85%、90%、95%又は100%が同一である場合に、それぞれヒト可変領域フレームワーク配列又はヒト定常領域に実質的に由来する。本発明のいくつかのヒト化抗体では、抗体の重鎖可変フレームワーク領域中に、少なくとも1つのマウス2H12復帰変異が存在する。ヒト化抗体は、マウス抗体由来の6つ全てのCDR(好ましくはKabatによって規定される)を組み込む場合が多いが、マウス抗体由来の全て未満のCDR(例えば、(例えば、少なくとも3つ、4つ又は5つの)CDRでも作製され得る(例えば、Pascalisら, J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdosら, Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002; Iwahashiら, Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamuraら, Journal of Immunology, 164:1432-1441, 2000)。

ヒト可変領域フレームワーク残基由来の特定のアミノ酸は、CDRコンフォメーション及び/又は抗原に対する結合に対する考えられる影響に基づいて、置換のために選択され得る。かかる考えられる影響の調査は、モデリング、特定の位置におけるアミノ酸の特徴の試験、又は特定のアミノ酸の置換若しくは変異誘発の影響の実験的観察による。

例えば、アミノ酸が、マウス可変領域フレームワーク残基と選択されたヒト可変領域フレームワーク残基との間で異なる場合、このヒトフレームワークアミノ酸は、アミノ酸が:
(1)非共有結合により抗原に直接結合する、
(2)CDR領域に隣接している、
(3)CDR領域と別の方法で相互作用する(例えば、CDR領域の約6Å以内に存在する);又は
(4)重鎖と軽鎖との間の相互作用を媒介する、
と合理的に予測される場合、マウス抗体由来の等価なフレームワークアミノ酸によって置換され得る。

本発明は、9つの例示されたヒト化重鎖成熟可変領域(HA〜HI)及び7つの例示されたヒト化軽鎖成熟可変領域(LA〜LG)を含むマウスm2H12抗体のヒト化形態を提供する。最も強い結合(最も低いEC50)を有するこれらの鎖の順列は、HCLA、HCLE、HCLG、HILA、HILE及びHILGである。これらの順列のうち、HILG(h2H12としても知られる)は、最も強い結合を有するので好ましい。

本発明は、重鎖可変領域がHA(配列番号10)に対して少なくとも90%の同一性を示し、軽鎖可変領域がLA(配列番号2)と少なくとも90%同一である、2H12抗体を提供する。いくつかの態様では、抗体はヒト化抗体であり、重鎖可変フレームワーク領域中に少なくとも1つのマウス2H12復帰変異が存在する。他の態様では、抗体はヒト化抗体であり、軽鎖可変フレームワーク領域中に少なくとも1つのマウス2H12復帰変異が存在する。さらに、本発明は、ヒト化重鎖可変領域が、配列番号10〜18に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を示し、ヒト化軽鎖可変領域が、配列番号2〜8に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を示す2H12抗体、及びそれらの任意の組み合わせを提供する(即ち、該抗体は、軽鎖可変領域のいずれか1つと対になった、重鎖可変領域のいずれか1つを含み得る)。例えば、本発明は、重鎖可変領域が、配列番号10、11、12、13、14、15、16、17又は18に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を示し、ヒト化軽鎖可変領域が、配列番号2、3、4、5、6、7又は8に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を示す、抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域が、配列番号10、11、12、13、14、15、16、17又は18に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を示し、軽鎖可変領域が、配列番号2に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を示す、抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域が、配列番号10、11、12、13、14、15、16、17又は18に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を示し、軽鎖可変領域が、配列番号3に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を示す、抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域が、配列番号10、11、12、13、14、15、16、17又は18に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を示し、軽鎖可変領域が、配列番号4に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を示す、抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域が、配列番号10、11、12、13、14、15、16、17又は18に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を示し、軽鎖可変領域が、配列番号5に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を示す、抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域が、配列番号10、11、12、13、14、15、16、17又は18に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を示し、軽鎖可変領域が、配列番号6に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を示す、抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域が、配列番号10、11、12、13、14、15、16、17又は18に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を示し、軽鎖可変領域が、配列番号7に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を示す、抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域が、配列番号10、11、12、13、14、15、16、17又は18に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を示し、軽鎖可変領域が、配列番号8に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を示す、抗体を提供する。

いくつかの態様では、これらの抗体はヒト化抗体であり、それぞれの抗体中の復帰変異のいくつか又は全てが保持されている。いくつかの抗体では、H94位はSによって占められている。いくつかの抗体では、好ましくは、H48位、H66位、H67位、H69位、H71位及びH94位のうち少なくとも1つが、マウス2H12抗体の対応する位置由来のアミノ酸によって占められている。任意選択で、任意のかかる抗体では、H48位はIによって占められ;H66位はKによって占められ;H67位はAによって占められ;H69位はLによって占められ;H71位はAによって占められ;H94位はSによって占められている。他の実施形態では、かかる抗体において、好ましくは、L22位、L46位、L69位及びL71位のうち少なくとも1つが、マウス2H12抗体の対応する位置由来のアミノ酸によって占められている。任意選択で、任意のかかる抗体では、L22位はNによって占められ;L46位はTによって占められ;L69位はQによって占められ;L71位はYによって占められている。

好ましくは、上記抗体のいずれか、例えば、重鎖可変領域が配列番号10〜18に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を示し、軽鎖可変領域が、配列番号2〜8に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を示す2H12ヒト化抗体において、CDR領域は、マウスドナー抗体、即ちマウス2H12抗体のCDR領域(配列番号19〜24)と同一又は実質的に同一である。該CDR領域は、Kabatによって規定される。本発明の抗体には、抗体HCLA、HCLE、HCLG、HILA、HILE及びHILGが含まれる。

本発明は、ヒト化重鎖成熟可変領域が、配列番号18に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を示し、ヒト化軽鎖成熟可変領域が、配列番号8に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を示す、HILGヒト化抗体のバリアントを提供する。いくつかのかかる抗体では、H94位はSによって占められている。好ましくは、かかる抗体では、HILG中の復帰変異のいくつか又は全てが保持されている。言い換えると、重鎖のH48位、H66位、H67位、H69位、H71位及びH94位のうち少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は好ましくは6つ全てが、それぞれI及びK及びA及びL及びA及びSによって占められている。また、軽鎖のL22位、L46位、L69位及びL71位のうち少なくとも1つ、2つ、3つ又は好ましくは4つ全てが、それぞれN及びT及びQ及びYによって占められている。かかるヒト化抗体のCDR領域は、好ましくは、マウスドナー抗体のCDR領域と同じであるHILGのCDR領域と実質的に同一である。。該CDR領域は、任意の従来の定義(例えば、Chothia)によって規定され得るが、Kabatによって規定されることが好ましい。一実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号18の3つのCDR及び配列番号18の可変領域フレームワークに対して少なくとも95%の同一性を有する可変領域フレームワークを含む重鎖を含む。別の実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号8の3つのCDR及び配列番号8の可変領域フレームワークに対して少なくとも95%の同一性を有する可変領域フレームワークを含む軽鎖を含む。さらなる実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号18の3つのCDR及び配列番号18の可変領域フレームワークに対して少なくとも95%の同一性を有する可変領域フレームワークを含む重鎖、並びに配列番号8の3つのCDR及び配列番号8の可変領域フレームワークに対して少なくとも95%の同一性を有する可変領域フレームワークを含む軽鎖を含む。

ヒト化抗体が例示されたHILGヒト化抗体からの任意のバリエーションを示す限りにおいて、かかるさらなるバリエーションの1つの可能性は、可変領域フレームワーク中のさらなる復帰変異である。他の例示されたヒト化重鎖又は軽鎖成熟可変領域中の復帰変異した位置のいずれか又は全てもまた、作製され得る(即ち、重鎖中のNによって占められるH38、Rによって占められるH40、Kによって占められるH73、Sによって占められるH82A、及びTによって占められるH83のうち1つ、2つ、3つ、4つ又は5つ全て、並びに軽鎖中のKによって占められるL3及びIによって占められるL20のうち1つ又は両方)。しかし、かかるさらなる復帰変異は、一般に親和性を改善せず、より多くのマウス残基を導入することは、免疫原性の危険性の増加を生じ得るので、好ましくない。

別の可能なバリエーションは、ヒトCDR配列由来の、典型的には例示されたヒト化抗体を設計する際に使用されるヒトアクセプター配列のCDR由来の対応する残基で、マウス抗体のCDR中の特定の残基を置換することである。いくつかの抗体では、CDRの一部のみ、即ち、SDRと称される、結合に必要とされるCDR残基のサブセットが、ヒト化抗体において結合を保持するために必要である。抗原と接触しない、SDR中に存在しないCDR残基は、Chothia超可変ループ(Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987)の外側に存在するKabat CDRの領域から、分子モデリングによって及び/若しくは実験的に、又はGonzalesら, Mol. Immunol. 41: 863 (2004)に記載されるように、以前の研究に基づいて同定され得る(例えば、CDR H2中の残基H60〜H65は、必要とされない場合が多い)。かかるヒト化抗体では、1つ以上のドナーCDR残基が存在しない位置又はドナーCDR全体が割愛される位置において、その位置を占めるアミノ酸は、アクセプター抗体配列中の対応する位置(Kabat番号付けによる)を占めるアミノ酸であり得る。CDR中に含めるアクセプターアミノ酸によるドナーアミノ酸のかかる置換の数は、競合する考慮事項のバランスを反映する。かかる置換は、ヒト化抗体中のマウスアミノ酸の数を減少させ、結果として、潜在的な免疫原性を減少させることにおいて、潜在的に有益である。しかし、置換は、親和性の変化もまた引き起こし得、親和性における顕著な低減は、回避されることが好ましい。CDR内の置換のための位置及び置換するアミノ酸は、実験的に選択することもできる。

好ましくはないものの、他のアミノ酸置換は、例えば、CDRと接触しないフレームワーク残基中、又はさらにはCDR内のいくつかの潜在的なCDR接触残基アミノ酸について行われ得る。バリアントヒト化配列において行われる置換は、ヒト化2H12抗体の場合、置換されたHILGアミノ酸に関して保存的である場合が多い。好ましくは、HILGに対する置換(保存的であってもなくても)は、ヒト化mAbの結合親和性又は効力、即ち、ヒトCD33に結合し、癌細胞の成長を阻害するその能力に対して、実質的な影響を有さない。

バリアントは典型的に、少数(例えば、典型的には、軽鎖成熟可変領域若しくは重鎖成熟可変領域のいずれか、又はそれら両方において、1以下、2以下、3以下、5以下又は10以下)の置換、欠失又は挿入によって、HILG(h2H12)の重鎖及び軽鎖成熟可変領域配列とは異なっている。

いくつかの実施形態では、ヒト化又はキメラ抗体は、重鎖HIのCDR H2に対して最大で1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つの置換、欠失又は挿入を有するCDR H2、並びに重鎖HI又は軽鎖LGの対応するCDRに対して最大で1つ、2つ、3つ又は4つの置換、欠失又は挿入を各々有するCDR H1、H3、L1、L2及びL3を有する。いくつかの実施形態では、本発明のヒト化又はキメラ抗体は、CDRの一部として同定されたアミノ酸において、1つの又は最大で2つの保存されたアミノ酸置換を有する。好ましいアミノ酸置換の例には、以下が含まれる。軽鎖のCDR1では、R残基が、24位においてKを置換し得;G、S又はTが、25位においてAを置換し得;Mが、33位においてLを置換し得;Tが、34位においてSを置換し得る。軽鎖のCDR2では、K残基が、53位においてR残基を置換し得;M残基が、54位においてL残基を置換し得;I残基が、55位においてV残基を置換し得;E残基が、56位においてD残基を置換し得る。重鎖のCDR2では、D残基が、61位においてE残基を置換し得;R残基が、62位においてK残基を置換し得;Y残基が、63位においてF残基を置換し得;R残基が、64位においてK残基を置換し得;G残基が、65位においてA残基を置換し得る。

いくつかの実施形態では、本発明のヒト化抗体は、上で列挙したようなCDR配列中の1つ、2つ又は3つの保存的置換を有する、配列番号18の成熟重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明のヒト化抗体は、上で列挙したようなCDR配列中の1つ、2つ又は3つの保存的置換を有する、配列番号8の成熟軽鎖可変領域を含む。
C.定常領域の選択
ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖可変領域は、ヒト定常領域の少なくとも一部に連結され得る。定常領域の選択は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、抗体依存性細胞食作用及び/又は補体依存性細胞傷害が所望されるか否かに、一部依存する。例えば、ヒトアイソタイプIgG1及びIgG3は、強い補体依存性細胞傷害を有し、ヒトアイソタイプIgG2は弱い補体依存性細胞傷害を有し、ヒトIgG4は補体依存性細胞傷害を欠く。ヒトIgG1及びIgG3は、ヒトIgG2及びIgG4よりも強い細胞媒介性エフェクター機能もまた誘導する。軽鎖定常領域は、ラムダ又はカッパであり得る。抗体は、2つの軽鎖及び2つの重鎖を含むテトラマーとして、別々の重鎖、軽鎖として、Fab、Fab'、F(ab')2及びFvとして、又は重鎖及び軽鎖可変ドメインがスペーサーを介して連結された単鎖抗体として、発現され得る。

ヒト定常領域は、異なる個体間のアロタイプバリエーション及びイソアロタイプバリエーションを示す、即ち、定常領域は、1つ以上の多型位置において、異なる個体において異なり得る。イソアロタイプは、イソアロタイプを認識する血清が1つ以上の他のアイソタイプの非多型領域に結合するという点で、アロタイプとは異なっている。

軽鎖及び/又は重鎖のアミノ末端又はカルボキシ末端における1つ又はいくつかのアミノ酸、例えば、重鎖のC末端リジンは、これらの分子の一部又は全てにおいて、失われている可能性がある又は誘導体化され得る。置換は、補体媒介性細胞傷害若しくはADCCなどのエフェクター機能を低減若しくは増加させるため(例えば、Winterら、米国特許第5,624,821号;Tsoら、米国特許第5,834,597号;及びLazarら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006を参照のこと)、又はヒトにおいて半減期を延長させるため(例えば、Hintonら, J. Biol. Chem. 279:6213, 2004を参照のこと)に、定常領域において行われ得る。

例示的な置換には、ネイティブアミノ酸のシステイン残基へのアミノ酸置換が含まれ、これは、ヒトIgG1アイソタイプ中のアミノ酸位置234、235、237、239、267、298、299、326、330又は332において導入され、好ましくは、S239C変異である(番号付けは、EUインデックス(Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987及び1991)に従う;本明細書に組み込まれる参考文献である米国特許出願公開第20100158909号を参照のこと)。さらなるシステイン残基の存在は、鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする。かかる鎖間ジスルフィド結合の形成は、立体障害を生じ得、それにより、Fc領域-FcγR結合相互作用の親和性を低減させ得る。IgG定常領域のFc領域中又はそれに近接して導入されたシステイン残基は、治療剤へのコンジュゲート化(即ち、薬物のマレイミド誘導体などのチオール特異的試薬を使用して細胞傷害薬をカップリングする)のための部位としても機能し得る。治療剤の存在は、立体障害を生じ得、それにより、Fc領域-FcγR結合相互作用の親和性をさらに低減させ得る。234位、235位、236位及び/又は237位のいずれかにおける他の置換は、Fcγ受容体、特にFcγRI受容体に対する親和性を低減させる(例えば、米国特許第6,624,821号、米国特許第5,624,821号を参照のこと)。

抗体のインビボ半減期もまた、そのエフェクター機能に影響を与え得る。抗体の半減期は、その治療活性を改変するために、増加又は減少され得る。FcRnは、β2-ミクログロブリンと非共有結合的に会合するMHCクラスI抗原と構造的に類似した受容体である。FcRnは、IgGの異化及び組織を横切るそのトランスサイトーシスを調節する(Ghetie及びWard, 2000, Annu. Rev. Immunol. 18:739-766; Ghetie及びWard, 2002, Immunol. Res. 25:97-113)。IgG-FcRn相互作用は、pH6.0(細胞内小胞のpH)で起こるが、pH7.4(血液のpH)では起こらない;この相互作用は、IgGが循環にリサイクルして戻されるのを可能にする(Ghetie及びWard, 2000, Ann. Rev. Immunol. 18:739-766; Ghetie及びWard, 2002, Immunol. Res. 25:97-113)。FcRn結合に関与するヒトIgG1上の領域は、マッピングされている(Shieldsら, 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604)。ヒトIgG1のPro238位、Thr256位、Thr307位、Gln311位、Asp312位、Glu380位、Glu382位又はAsn434位におけるアラニン置換は、FcRn結合を増強する(Shieldsら, 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604)。これらの置換を有するIgG1分子は、より長い血清半減期を有する。結果として、これらの改変されたIgG1分子は、そのエフェクター機能を実行することが可能であり得、従って、未改変のIgG1と比較してより長い期間にわたり、その治療効力を発揮し得る。FcRnに対する結合を増加させるための他の例示的な置換には、250位におけるGln及び/又は428位におけるLeuが含まれる。EU番号付けが、定常領域中の全ての位置について使用される。

保存されたAsn297に共有結合したオリゴ糖は、IgGのFc領域がFcγRに結合する能力に関与する(Lundら, 1996, J. Immunol. 157:4963-69; Wright及びMorrison, 1997, Trends Biotechnol. 15:26-31)。IgG上のこのグリコフォームの操作は、IgG媒介性のADCCを顕著に改善し得る。2つに分岐しているN-アセチルグルコサミン改変の、このグリコフォームへの付加(Umanaら, 1999, Nat. Biotechnol. 17:176-180; Daviesら, 2001, Biotech. Bioeng. 74:288-94)、又はこのグリコフォームからのフコースの除去(Shieldsら, 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-40; Shinkawaら, 2003, J. Biol. Chem. 278:6591-604; Niwaら, 2004, Cancer Res. 64:2127-33)は、IgG FcとFcγRとの間の結合を改善するIgG Fc操作の2つの例であり、それにより、Ig媒介性のADCC活性を増強する。

ヒトIgG1 Fc領域の溶媒曝露されたアミノ酸の全体的置換は、変更されたFcγR結合親和性を有するIgGバリアントを生成している(Shieldsら, 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604)。親IgG1と比較した場合、Thr256/Ser298、Ser298/Glu333、Ser298/Lys334又はSer298/Glu333/Lys334におけるAlaへの置換を含むこれらのバリアントのサブセットは、FcγRに対する結合親和性及びADCC活性の両方における増加を実証している(Shieldsら, 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604; Okazakiら, 2004, J. Mol. Biol. 336:1239-49)。

抗体の補体固定活性(C1q結合及びCDC活性の両方)は、Lys326及びGlu333における置換によって改善され得る(Idusogieら, 2001, J. Immunol. 166:2571-2575)。ヒトIgG2骨格上の同じ置換は、C1qに不十分に結合し、補体活性化活性において大幅に欠損している抗体アイソタイプを、C1qに結合できかつCDCを媒介できる抗体アイソタイプに変換し得る(Idusogieら, 2001, J. Immunol. 166:2571-75)。いくつかの他の方法もまた、抗体の補体結合活性を改善するために適用されてきた。例えば、IgMの18アミノ酸のカルボキシル末端テイル片をIgGのカルボキシル末端にグラフトすることで、そのCDC活性は大いに増強される。これは、検出可能なCDC活性を通常は有さないIgG4でさえも観察される(Smithら, 1995, J. Immunol. 154:2226-36)。また、IgG1重鎖のカルボキシ末端の近くに位置するSer444をCysで置換することで、モノマー性IgG1よりも200倍増加したCDC活性を有する、IgG1のテイル-テイル(tail-to-tail)ダイマー化が誘導された(Shopesら, 1992, J. Immunol. 148:2918-22)。さらに、C1qに対する特異性を有する二特異性ダイアボディ構築物もまた、CDC活性を付与する(Kontermannら, 1997, Nat. Biotech. 15:629-31)。

補体活性は、重鎖のアミノ酸残基318、320及び322のうち少なくとも1つを、Alaなどの異なる側鎖を有する残基に変異させることによって、低減され得る。これら3つの残基のいずれか1つの代わりの、他のアルキル置換された非イオン性残基、例えばGly、Ile、Leu若しくはVal、又はかかる芳香族非極性残基、例えばPhe、Tyr、Trp及びProもまた、C1q結合を低減又は消滅させる。Ser、Thr、Cys及びMetは、C1q結合活性を低減又は消滅させるために、残基320及び322において使用され得るが、残基318では使用され得ない。極性残基による318(Glu)残基の置換は、C1q結合活性を改変し得るが、消滅させることはない。残基297(Asn)をAlaで置換すると、溶解活性の除去が生じるが、C1qに対する親和性は僅かにのみ低減される(約3倍弱い)。この変更は、グリコシル化部位、及び補体活性化のために必要とされる炭水化物の存在を破壊する。この部位における任意の他の置換もまた、グリコシル化部位を破壊する。以下の変異及びその任意の組み合わせもまた、C1q結合を低減させる:D270A、K322A、P329A及びP311S(WO 06/036291を参照のこと)。ヒト定常領域に対する言及には、任意の天然アロタイプ、又は天然アロタイプにおいて多型位置を占める残基の任意の順列を有する定常領域が含まれる。また、天然ヒト定常領域に対して最大で1個、2個、5個又は10個の変異が、Fcガンマ受容体結合を低減させるか又はFcRNに対する結合を増加させるために上で示されたもののように、存在し得る。
D.組換え抗体の発現
ヒト化又はキメラ抗体は典型的に、組換え発現によって産生される。組換えポリヌクレオチド構築物は典型的に、天然に関連しているプロモーター領域又は異種プロモーター領域を含む、抗体鎖のコード配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む。好ましくは、この発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトすることが可能なベクター中の真核生物プロモーター系である。ベクターが一旦適切な宿主中に取り込まれると、この宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現、並びに交差反応性抗体の収集及び精製に適した条件下で維持される。

哺乳動物細胞は、免疫グロブリン又はその断片をコードするヌクレオチドセグメントを発現させるための好ましい宿主である。Winnacker, From Genes to Clones (VCH Publishers, NY, 1987)を参照のこと。インタクトな異種タンパク質を分泌することが可能ないくつかの適切な宿主細胞株が、当該分野で開発されており、これには、CHO細胞株(例えば、DG44)、種々のCOS細胞株、HeLa細胞、HEK293細胞、L細胞、並びにSp2/0及びNS0を含む非抗体産生骨髄腫が含まれる。好ましくは、該細胞は非ヒトである。これらの細胞のための発現ベクターは、発現制御配列、例えば複製起点、プロモーター、エンハンサー(Queenら, Immunol. Rev. 89:49 (1986))、並びに必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終結配列を含み得る。好ましい発現制御配列は、内因性遺伝子、サイトメガロウイルス、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターである。Coら, J. Immunol. 148:1149 (1992)を参照のこと。

CD33タンパク質に対するヒト抗体は、以下に記載される種々の技術によって提供され得る。ヒト抗体を産生するための方法には、Oestbergら, Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg、米国特許第4,634,664号;及びEnglemanら、米国特許第4,634,666号のトリオーマ法;ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスの使用(例えば、Lonbergら、WO93/12227(1993);米国特許第5,877,397号、米国特許第5,874,299号、米国特許第5,814,318号、米国特許第5,789,650号、米国特許第5,770,429号、米国特許第5,661,016号、米国特許第5,633,425号、米国特許第5,625,126号、米国特許第5,569,825号、米国特許第5,545,806号、Nature 148, 1547-1553 (1994)、Nature Biotechnology 14, 826 (1996)、Kucherlapati、WO 91/10741(1991)を参照のこと)及びファージディスプレイ法(例えば、Dowerら、WO 91/17271及びMcCaffertyら、WO 92/01047、米国特許第5,877,218号、米国特許第5,871,907号、米国特許第5,858,657号、米国特許第5,837,242号、米国特許第5,733,743号及び米国特許第5,565,332号を参照のこと)が含まれる。

一旦発現されると、抗体は、HPLC精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、当該分野の標準的な手順に従って精製され得る(一般に、Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)を参照のこと)。
IV.核酸
本発明は、上記ヒト化重鎖及び軽鎖のいずれかをコードする核酸をさらに提供する。典型的には、該核酸は、成熟重鎖及び軽鎖に融合されたシグナルペプチドもまたコードする。核酸上のコード配列は、コード配列の発現を確実にする調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナルなどに、作動可能に連結されていてもよい。重鎖及び軽鎖をコードする核酸は、単離された形態で存在してもよく、1つ以上のベクター中にクローニングされていてもよい。該核酸は、例えば、重複するオリゴヌクレオチドの固相合成又はPCRによって合成され得る。重鎖及び軽鎖をコードする核酸は、例えば発現ベクター内に、1つの連続する核酸としてつながれ得るか、又は例えば各々がそれ自身の発現ベクター中にクローニングされて別々であり得る。

一実施形態では、本開示は、配列番号18のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。この単離されたポリヌクレオチドは、ヒトIgG重鎖定常領域をさらにコードし得る。IgG定常領域のアイソタイプは、例えば、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4である。一実施形態では、IgG定常領域のアイソタイプは、IgG1である。別の実施形態では、コードされたIgG1定常領域は、Kabat番号付けシステムに従って、残基239における置換、即ちS239Cを含むアミノ酸配列を有する。本開示は、配列番号18のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及びさらには、該発現ベクターを含む宿主細胞もまた、提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞、例えばCHO細胞である。

別の実施形態では、本開示は、配列番号8のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。この単離されたポリヌクレオチドは、ヒトIgG軽鎖定常領域をさらにコードし得る。IgG軽鎖定常領域のアイソタイプは、例えばカッパ定常領域である。本開示は、配列番号8のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及びさらには、該発現ベクターを含む宿主細胞もまた、提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞、例えばCHO細胞である。別の実施形態では、本開示は、配列番号18のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域及び配列番号8のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、この重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、ヒトCD33に特異的に結合する抗体又は抗原結合性断片を形成する。本開示は、配列番号18のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域及び配列番号8のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターもまた提供する。該発現ベクターを含む宿主細胞もまた提供される。宿主細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、例えばCHO細胞である。

別の実施形態では、本開示は、配列番号18のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド及び配列番号8のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第1及び第2のベクターを提供し、この重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、ヒトCD33に特異的に結合する抗体又は抗原結合性断片を形成する。該ベクターを含む宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞、例えばCHO細胞が提供される。
V.抗体薬物コンジュゲート
抗CD33抗体は、抗体-薬物コンジュゲート(ADC)を形成するために細胞傷害性部分にコンジュゲートされ得る。抗体へのコンジュゲートのために特に適した部分は、細胞傷害剤(例えば、化学療法剤)、プロドラッグ変換酵素、放射性同位体若しくは化合物、又は毒素(これらの部分は、集合的に治療剤又は薬物と呼ばれる)である。例えば、抗CD33抗体は、細胞傷害剤、例えば化学療法剤、又は毒素(例えば、細胞分裂停止剤又は細胞破壊剤、例えば、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素又はジフテリア毒素など)に、コンジュゲートされ得る。細胞傷害剤の有用なクラスの例には、例えば、DNA副溝結合剤、DNAアルキル化剤及びチューブリン阻害剤が含まれる。例示的な細胞傷害剤には、例えば、オーリスタチン、カンプトテシン、デュオカルマイシン、エトポシド、マイタンシン及びマイタンシノイド(例えば、DM1及びDM4)、タキサン、ベンゾジアゼピン(例えば、ピロロ[1,4]ベンゾジアゼピン(PBD)、インドリノベンゾジアゼピン(indolinobenzodiazepine)及びオキサゾリジノベンゾジアゼピン(oxazolidinobenzodiazepine))並びにビンカアルカロイドが含まれる。タンパク質、及び特に抗体に治療剤をコンジュゲートするための技術は、周知である(例えば、Alleyら, Current Opinion in Chemical Biology 2010 14:1-9; Senter, Cancer J., 2008, 14(3):154-169を参照のこと)。

治療剤(例えば、細胞傷害剤)は、(例えば、加水分解により、抗体分解により、又は切断剤により)抗体から脱離されない限り、その活性を低減させる様式で、抗体にコンジュゲートされ得る。かかる治療剤は、リンカーを介して抗体に結合され得る。リンカーにコンジュゲートされた治療剤は、本明細書で薬物リンカーとも呼ばれる。リンカーの性質は、広く変動し得る。リンカーを構成する構成成分は、コンジュゲートが送達される部位における条件によって一部決定され得るその特徴に基づいて選択される。

この治療剤は、抗CD33発現癌細胞の細胞内環境における切断に対して感受性であるが、細胞外環境に対して実質的に感受性でない切断可能なリンカーを用いて抗体に結合され得、その結果、このコンジュゲートは、抗CD33発現癌細胞によって内在化される場合、抗体から切断される(例えば、エンドソームにおいて、又は例えばpH感受性若しくはプロテアーゼ感受性によって、リソソーム環境において、又はカベオラ(caveolear)環境において)。治療剤は、切断不能なリンカーを用いても抗体に結合され得る。示されるように、このリンカーは、切断可能な単位を含み得る。いくつかのかかる実施形態では、切断可能な単位の構造及び/又は配列は、標的部位(例えば、標的細胞)に存在する酵素の作用によってかかる切断可能な単位が切断されるように、選択される。他の実施形態では、pH(例えば、酸又は塩基不安定性)、温度における変化によって、又は照射の際に(例えば、光解離性)切断可能な、切断可能な単位もまた、使用され得る。

いくつかの実施形態では、この切断可能な単位は、1つのアミノ酸又はアミノ酸の連続する配列を含み得る。このアミノ酸配列は、酵素の標的基質であり得る。

いくつかの態様では、この切断可能な単位は、ペプチジル単位であり、少なくとも2アミノ酸長である。切断剤には、カテプシンB及びD並びにプラスミンが含まれ得る(例えば、Dubowchik及びWalker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123を参照のこと)。最も典型的なものは、抗CD33発現細胞中に存在する酵素によって切断可能な切断可能な単位、即ち酵素切断可能なリンカーである。従って、リンカーは、リソソーム又はエンドソームのプロテアーゼを含む、細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素によって切断され得る。例えば、癌性組織において高度に発現されるチオール依存的プロテアーゼカテプシン-Bによって切断可能なリンカーが、使用され得る(例えば、Phe-Leu若しくはVal-Citペプチド又はVal-Alaペプチドを含むリンカー)。

いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能な単位(例えば、ペプチジル単位)を含み、切断可能な単位は、治療剤に直接コンジュゲートされる。他の実施形態では、切断可能な単位は、さらなる機能単位、例えば、自壊性(self-immolative)スペーサー単位又は非自壊性スペーサー単位を介して、治療剤にコンジュゲートされる。非自壊性スペーサー単位は、スペーサー単位の一部又は全てが、抗体薬物コンジュゲートからの切断可能な単位(例えば、アミノ酸)の切断後に、薬物単位に結合したままであるスペーサー単位である。薬物を遊離させるために、独立した加水分解反応が、薬物からスペーサー単位を切断するために、標的細胞内で生じる。自壊性スペーサー単位を用いた場合、薬物は、薬物が別々の加水分解ステップを必要とすることなく放出される。リンカーが切断可能な単位及び自壊性基を含む一実施形態では、切断可能な単位は、酵素の作用によって切断可能であり、切断可能な単位の切断後に、自壊性基が治療剤を放出する。いくつかの実施形態では、リンカーの切断可能な単位は、一方の末端で、治療剤に直接的又は間接的にコンジュゲートされ、他方の末端で、抗体に直接的又は間接的にコンジュゲートされる。いくつかのかかる実施形態では、切断可能な単位は、一方の末端で、治療剤に直接的又は間接的に(例えば、自壊性スペーサー単位又は非自壊性スペーサー単位を介して)コンジュゲートされ、他方の末端で、ストレッチャー単位を介して抗体にコンジュゲートされる。ストレッチャー単位は、薬物の残部及び/又は薬物リンカーに抗体を連結させる。一実施形態では、抗体と薬物の残部又は薬物リンカーとの間の接続は、マレイミド基、例えばマレイミドカプロイルリンカーを介した接続である。いくつかの実施形態では、ジスルフィド連結されたマイタンシノイドコンジュゲートSPDB-DM4及びSPP-DM1など、抗体は、ジスルフィドを介して薬物に連結される。

抗体とリンカーとの間の接続は、いくつかの異なる経路を介して、例えば、チオエーテル結合を介して、ジスルフィド結合を介して、アミド結合を介して、又はエステル結合を介しての接続であり得る。一実施形態では、抗CD33抗体とリンカーとの間の接続は、抗体のシステイン残基のチオール基とリンカーのマレイミド基との間で形成される。いくつかの実施形態では、抗体の鎖間結合は、リンカーの官能基との反応の前に、遊離チオール基に変換される。いくつかの実施形態では、システイン残基が、抗体の重鎖又は軽鎖中に導入され、リンカーと反応させられる。抗体の重鎖又は軽鎖中の置換によるシステイン挿入のための位置には、その各々が全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2007-0092940号及び国際特許公開WO2008070593中に記載された位置が含まれる。

いくつかの実施形態では、この抗体-薬物コンジュゲートは、以下の式I:
L-(LU-D)_p (I)
[式中、Lは抗CD33抗体であり、LUはリンカー単位であり、Dは薬物単位(即ち治療剤)である]
を有する。下付き文字pは、1から20までの範囲である。かかるコンジュゲートは、リンカーを介して少なくとも1つの薬物に共有結合により連結された抗CD33抗体を含む。このリンカー単位は、一方の末端で抗体に接続され、他の末端で薬物に接続される。

薬物負荷は、1抗体当たりの薬物分子の数pによって示される。薬物負荷は、1抗体当たり1から20までの薬物単位(D)の範囲であり得る。当業者は、いくつかの態様では、下付き文字pが、1から20までの範囲(即ち、1から20までの整数値及び非整数値の両方) であることを理解する。当業者は、いくつかの態様では、下付き文字pが、1から20までの整数であり、単数の抗体上の薬物-リンカーの数を示すことを理解する。他の態様では、pは、1抗体当たりの薬物-リンカー分子の平均数、例えば、反応混合物又は組成物(例えば、医薬組成物)中の1抗体当たりの薬物-リンカーの平均数を示し、整数値又は非整数値であり得る。従って、いくつかの態様では、組成物(例えば、医薬組成物)について、pは、組成物中の抗体-薬物コンジュゲートの平均薬物負荷を示し、pは、1から20までの範囲である。

いくつかの実施形態では、pは、1抗体当たり約1から約8までの薬物である。いくつかの実施形態では、pは1である。いくつかの実施形態では、pは2である。いくつかの実施形態では、pは、1抗体当たり約2から約8までの薬物である。いくつかの実施形態では、pは、1抗体当たり約2から約6まで、2から約5まで、又は2から約4までの薬物である。いくつかの実施形態では、pは、1抗体当たり約2、約4、約6又は約8の薬物である。

コンジュゲート反応由来の調製物中の1抗体単位当たりの薬物の平均数は、質量分析、ELISAアッセイ、HIC及びHPLCなどの従来の手段によって特徴付けられ得る。pに関してのコンジュゲートの量的分布もまた、決定され得る。

例示的な抗体-薬物コンジュゲートには、オーリスタチンベースの抗体-薬物コンジュゲート、即ち、薬物構成成分がオーリスタチン薬物であるコンジュゲートが含まれる。オーリスタチンは、チューブリンに結合し、微小管動力学並びに核分裂及び細胞分裂を妨害することが示されており、抗癌活性を有する。典型的には、このオーリスタチンベースの抗体-薬物コンジュゲートは、オーリスタチン薬物と抗CD33抗体との間にリンカーを含む。オーリスタチンは、リンカーへのコンジュゲートに適した任意の位置において、抗CD33抗体に連結され得る。リンカーは、例えば、切断可能なリンカー(例えば、ペプチジルリンカー)又は切断不能なリンカー(例えば、抗体の分解によって放出されるリンカー)であり得る。オーリスタチンは、オーリスタチンE又はその誘導体であり得る。オーリスタチンは、例えば、オーリスタチンEとケト酸との間で形成されるエステルであり得る。例えば、オーリスタチンEは、パラアセチル安息香酸又はベンゾイル吉草酸と反応させて、それぞれAEB及びAEVBを生じ得る。他の典型的なオーリスタチンには、MMAF(モノメチルオーリスタチンF)及びMMAE(モノメチルオーリスタチンE)が含まれる。例示的なオーリスタチンの合成及び構造は、その各々が全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第7,659,241号、米国特許第7,498,298号、米国特許出願公開2009-0111756号、米国特許出願公開2009-0018086号、米国特許第7,968,687号に記載されている。

例示的なオーリスタチンベースの抗体-薬物コンジュゲートには、以下:

[式中、Abは、本明細書に記載される抗体であり、val-citは、バリン-シトルリンジペプチドを示す]
に示されるようなvcMMAE、vcMMAF及びmcMMAF抗体-薬物コンジュゲート、又はそれらの薬学的に許容される塩が含まれる。薬物負荷は、1抗体当たりの薬物-リンカー分子の数pによって示される。文脈に依存して、pは、1抗体当たりの薬物-リンカー分子の平均数を示し得、平均薬物負荷とも呼ばれる。変数pは、1から20までの範囲であり、好ましくは1から8までである。いくつかの好ましい実施形態では、pが平均薬物負荷を示す場合、pは、約2から約5までの範囲である。いくつかの実施形態では、pは、約2、約3、約4又は約5である。いくつかの態様では、抗体は、システイン残基の硫黄原子を介してリンカーにコンジュゲートされる。いくつかの態様では、システイン残基は、抗体中に操作されたシステイン残基である。他の態様では、システイン残基は、鎖間ジスルフィドシステイン残基である。

例示的な抗体-薬物コンジュゲートには、PBDベースの抗体-薬物コンジュゲート;即ち、薬物構成成分がPBD薬物である抗体-薬物コンジュゲートが含まれる。

PBDは、一般構造:

のものである。

これらは、その芳香族A環及びピロロC環の両方における置換基の数、型及び位置、並びにC環の飽和度が異なる。B環中には、DNAのアルキル化を担う求電子中心であるN10-C11位において、イミン(N=C)、カルビノールアミン(NH-CH(OH))又はカルビノールアミンメチルエーテル(NH-CH(OMe))のいずれかが存在する。既知の天然産物の全てが、キラルC11a位において(S)-立体配置を有し、これが、C環からA環を見た場合の右巻きねじれをこれらの産物に提供する。これは、B型DNAの副溝とのイソらせん性(isohelicity)に適した3次元形状をこれらの産物に与え、結合部位におけるぴったりした嵌合を導く。副溝において付加物を形成するPBDの能力により、これらはDNAプロセシングを妨害することができるようになり、従って、抗腫瘍剤としての使用が可能になる。

これらの分子の生物学的活性は、柔軟なアルキレンリンカーを介して、そのC8/C'-ヒドロキシル官能基を介して2つのPBD単位を一緒につなぐことによって強化され得る。このPBDダイマーは、その生物学的活性を主に担うと考えられているパリンドローム5'-Pu-GATC-Py-3'鎖間架橋などの、配列選択的DNA病変を形成すると考えられている。

いくつかの実施形態では、PBDベースの抗体-薬物コンジュゲートは、抗CD33抗体に連結されたPBDダイマーを含む。PBDダイマーを形成するモノマーは、同じか又は異なり得る、即ち、対称的又は非対称的であり得る。PBDダイマーは、リンカーへのコンジュゲートに適した任意の位置において、抗CD33抗体に連結され得る。例えば、いくつかの実施形態では、PBDダイマーは、化合物を抗CD33抗体に連結するためのアンカーを提供する、C2位における置換基を有する。代替的実施形態では、PBDダイマーのN10位が、化合物を抗CD33抗体に連結するためのアンカーを提供する。

典型的には、PBDベースの抗体-薬物コンジュゲートは、PBD薬物と抗CD33抗体との間にリンカーを含む。リンカーは、切断可能な単位(例えば、酵素の標的基質であるアミノ酸又はアミノ酸の連続する配列)又は切断不能なリンカー(例えば、抗体の分解によって放出されるリンカー)を含み得る。リンカーは、抗体への連結のためのマレイミド基、例えば、マレイミドカプロイルをさらに含み得る。リンカーは、いくつかの実施形態では、例えばp-アミノベンジルアルコール(PAB)単位などの自壊性基をさらに含み得る。

コンジュゲートとしての使用のための例示的なPBDは、国際特許出願公開WO 2011/130613に記載されており、下記式:

[式中、波線は、リンカーへの結合の部位を示す]
を有するもの又はその薬学的に許容される塩である。例示的なリンカーは、以下:

[式中、波線は、薬物への結合の部位を示す]
であり、抗体は、マレイミド基を介して連結されている。

例示的なPBDベースの抗体-薬物コンジュゲートには、以下:

[式中、Abは、本明細書に記載される抗体である]
に示すような抗体-薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩が含まれる。薬物負荷は、1抗体当たりの薬物-リンカー分子の数pによって示される。文脈に依存して、pは、1抗体当たりの薬物-リンカー分子の平均数を示し得、平均薬物負荷とも呼ばれる。変数pは、1から20までの範囲であり、好ましくは1から8までである。いくつかの好ましい実施形態では、pが平均薬物負荷を示す場合、pは、約2から約5までの範囲である。いくつかの実施形態では、pは、約2、約3、約4又は約5である。いくつかの態様では、抗体は、抗体中に操作されたシステイン残基の硫黄原子を介して薬物リンカーにコンジュゲートされる。いくつかの態様では、システイン残基は、EUインデックス(Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987及び1991)によって決定されるように、239位(IgG1)において抗体中に操作される。
VI.CD33に対する他の抗体
上で議論したm2H12抗体のヒト化形態だけでなく、CD33の細胞外ドメインに結合する他の抗体が、本発明の方法のいくつか、特に癌の処置において使用され得る。これらの抗体のキメラ又はベニヤ化(veneered)形態は、以下に要約した従来の方法によって作製され得る。

キメラ抗体は、非ヒト抗体(例えば、マウス)の軽鎖及び重鎖の成熟可変領域がヒト軽鎖及び重鎖定常領域と組み合わされた抗体である。かかる抗体は、マウス抗体の結合特異性を実質的に又は完全に保持しており、約3分の2がヒト配列である。

ベニヤ化抗体は、非ヒト抗体のCDRのうちいくつか及び通常は全て並びに非ヒト可変領域フレームワーク残基のいくつかを保持するが、B細胞エピトープ又はT細胞エピトープに寄与し得る他の可変領域フレームワーク残基、例えば曝露された残基(Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991)をヒト抗体配列の対応する位置由来の残基で置換する、ヒト化抗体の1つの型である。その結果は、CDRが完全に又は実質的に非ヒト抗体に由来し、非ヒト抗体の可変領域フレームワークが置換によってよりヒト様になっている、抗体である。

任意の抗体は、実施例に記載されるもの又は他の方法での競合的結合アッセイによって、m2H12抗体などの例示的抗体と同じ又は重複するエピトープ特異性を有するように選択され得る。好ましい抗体は、m2H12抗体と同じエピトープ特異性を有する。当業者は、種々の方法を使用して、抗体が結合するエピトープを同定することができる。例えば、アレイベースのオリゴペプチドスキャニング又はペプスキャン（pepscan）分析は、標的抗原の重複するセグメント及び重複しないセグメント由来のオリゴペプチド配列のライブラリーを使用し、目的の抗体に結合するその能力について試験する。例えば、Geysenら, PNAS 81:3998-4002 (1984)を参照のこと。非線状エピトープは、例えば、CLIPS(商標)技術、アレイベースのオリゴペプチドスキャニングのバリエーションを使用して同定され得る。例えば、Timmermanら, Open Vaccine J. 2:56-67 (2009)を参照のこと。抗原タンパク質もまた、変異誘発され得、次いで、目的の抗体による結合を評価するために使用され得る。タンパク質の体系的な部位特異的変異誘発が使用され得るか、又は変異のライブラリーが作製され得、抗体結合についてスクリーニングするために使用され得る。変異ライブラリーは、例えば、Integral Molecularから購入され得る。アミド水素/重水素交換MSが、エピトープを同定するために使用され得る。目的の抗原は、重水中に配置され、重陽子で標識される。このタンパク質は、次いでプロテアーゼで消化され、得られたペプチド断片は、質量分析に供される。この抗原は、抗体の存在下でも評価され、ペプチド断片の標識化における差異は、抗体結合の領域を示す。
VII.治療的適用
マウス2H12抗体由来の抗体、例えば、キメラ又はヒト化抗体は、単独で又はそのCD33抗体薬物コンジュゲートとして、癌を処置するために使用され得る。いくつかのかかる癌は、タンパク質レベル(例えば、例示された抗体のうち1つを使用したイムノアッセイにより)又はmRNAレベルのいずれかで測定された検出可能なレベルのCD33を示す。いくつかのかかる癌は、同じ型の非癌性組織、好ましくは同じ患者由来の非癌性組織と比較して、上昇したレベルのCD33を示す。処置に適した癌細胞上のCD33の例示的なレベルは、1細胞当たり5000〜150000のCD33分子であるが、より高い又はより低いレベルが処置され得る。任意選択で、癌中のCD33のレベルは、処置を実施する前に測定される。

CD33発現と関連する、処置に適した癌の例には、骨髄疾患、例えば、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄単球性白血病及び慢性骨髄増殖性障害を含む他の骨髄増殖性障害、急性前骨髄球性白血病(APL)、血小板性白血病、骨髄異形成症候群、前駆B細胞急性リンパ芽球性白血病(preB-ALL)、前駆T細胞急性リンパ芽球性白血病(preT-ALL)、多発性骨髄腫(MM)、肥満細胞白血病及び肥満細胞肉腫を含む肥満細胞症、骨髄肉腫、不応性貧血、前白血病症候群、リンパ性白血病、又は未分化白血病が含まれる。処置は、処置ナイーブな患者、従来の処置(例えば、化学療法又はMYLOTARG(登録商標)(ゲムツズマブオゾガマイシン)に対して不応性の患者、又はかかる処置に対する応答の後に再発した患者にも、適用され得る。

キメラ抗体又はヒト化抗体、例えばh2H12抗体を含む、マウス2H12抗体由来のCD33抗体は、CD33タンパク質を発現する癌を処置するために使用され得る。一実施形態では、マウス2H12抗体由来のヒト化抗体は、CD33陽性急性骨髄性白血病(AML)を有する対象を処置するために使用される。さらなる実施形態では、h2H12抗体は、CD33陽性AMLを有する対象を処置するために使用される。別の実施形態では、マウス2H12抗体由来のヒト化抗体は、CD33陽性慢性骨髄性白血病(CML)を有する対象を処置するために使用される。さらなる実施形態では、h2H12抗体は、CD33陽性CMLを有する対象を処置するために使用される。別の実施形態では、マウス2H12抗体由来のヒト化抗体は、CD33陽性慢性骨髄単球性白血病(CMML)を有する対象を処置するために使用される。さらなる実施形態では、h2H12抗体は、CD33陽性慢性CMMLを有する対象を処置するために使用される。別の実施形態では、マウス2H12抗体由来のヒト化抗体は、CD33陽性甲状腺白血病(thyroid leukemia)を有する対象を処置するために使用される。さらなる実施形態では、h2H12抗体は、CD33陽性甲状腺白血病を有する対象を処置するために使用される。別の実施形態では、マウス2H12抗体由来のヒト化抗体は、CD33陽性骨髄異形成症候群を有する対象を処置するために使用される。さらなる実施形態では、h2H12抗体は、CD33陽性骨髄異形成症候群を有する対象を処置するために使用される。別の実施形態では、マウス2H12抗体由来のヒト化抗体は、CD33陽性骨髄増殖性障害を有する対象を処置するために使用される。さらなる実施形態では、h2H12抗体は、CD33陽性骨髄増殖性障害を有する対象を処置するために使用される。別の実施形態では、マウス2H12抗体由来のヒト化抗体は、CD33陽性不応性貧血を有する対象を処置するために使用される。さらなる実施形態では、h2H12抗体は、CD33陽性不応性貧血を有する対象を処置するために使用される。別の実施形態では、マウス2H12抗体由来のヒト化抗体は、CD33陽性前白血病症候群を有する対象を処置するために使用される。さらなる実施形態では、h2H12抗体は、CD33陽性前白血病症候群を有する対象を処置するために使用される。別の実施形態では、マウス2H12抗体由来のヒト化抗体は、CD33陽性リンパ性白血病を有する対象を処置するために使用される。さらなる実施形態では、h2H12抗体は、CD33陽性リンパ性白血病を有する対象を処置するために使用される。別の実施形態では、マウス2H12抗体由来のヒト化抗体は、CD33陽性未分化白血病を有する対象を処置するために使用される。さらなる実施形態では、h2H12抗体は、CD33陽性未分化白血病を有する対象を処置するために使用される。一実施形態では、マウス2H12抗体由来のヒト化抗体は、CD33陽性前駆B細胞急性リンパ芽球性白血病(preB-ALL)を有する対象を処置するために使用される。さらなる実施形態では、h2H12抗体は、CD33陽性pre-B-ALLを有する対象を処置するために使用される。一実施形態では、マウス2H12抗体由来のヒト化抗体は、CD33陽性前駆T細胞急性リンパ芽球性白血病(preT-ALL)を有する対象を処置するために使用される。さらなる実施形態では、h2H12抗体は、CD33陽性preT-ALLを有する対象を処置するために使用される。一実施形態では、マウス2H12抗体由来のヒト化抗体は、CD33陽性多発性骨髄腫(MM)を有する対象を処置するために使用される。さらなる実施形態では、h2H12抗体は、CD33陽性MMを有する対象を処置するために使用される。一実施形態では、マウス2H12抗体由来のヒト化抗体は、肥満細胞白血病及び肥満細胞肉腫を含むCD33陽性肥満細胞症を有する対象を処置するために使用される。さらなる実施形態では、h2H12抗体は、肥満細胞白血病及び肥満細胞肉腫を含むCD33陽性肥満細胞症を有する対象を処置するために使用される。

CD33抗体は、例えば、非コンジュゲート抗体又はコンジュゲート抗体、例えば、CD33抗体薬物コンジュゲートであり得る。いくつかの実施形態では、抗CD33抗体は、ヒト化又はキメラ2H12抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗CD33抗体は、CD33に対する特異的結合についてマウス、ヒト化又はキメラ2H12抗体と競合する抗体であり得る。

キメラ抗体又はヒト化抗体、例えばh2H12を含む、マウス2H12抗体由来のCD33抗体は、治療剤にコンジュゲートでき、CD33陽性癌を有する対象を処置するために使用され得る。活性な治療剤、例えば、オーリスタチン、及び高度に活性な治療剤、例えば、PBDを含む治療剤の例が、本明細書に提供される。活性な治療剤にコンジュゲートされたh2H12抗体、即ち、h2H12抗体-薬物コンジュゲート(ADC)は、CD33陽性癌を有するコンジュゲートを処置するために使用され得る。オーリスタチンにコンジュゲートされたh2H12抗体は、CD33陽性癌を有する対象を処置するために使用され得る。高度に活性な治療剤にコンジュゲートされたh2H12抗体は、CD33陽性癌を有する対象を処置するために使用され得る。PBDにコンジュゲートされたh2H12抗体は、CD33陽性癌を有する対象を処置するために使用され得る。

いくつかの癌細胞は、癌細胞からの治療剤の流出を増加させるタンパク質の発現を増加させた後に、治療剤に対する耐性を発生させ得る。かかるタンパク質には、P-糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質、肺耐性関連タンパク質及び乳癌耐性タンパク質が含まれる。癌細胞における薬物耐性の検出は、当業者によって実施され得る。流出タンパク質を検出する抗体又はアッセイは、例えば、Promega、Millipore、Abcam及びSigma-Aldrichから市販されている。一実施形態では、マウス2H12抗体由来の抗体は、多剤耐性癌、例えば、CD33陽性多剤耐性癌を有する対象を処置するために使用される。別の実施形態では、マウス2H12抗体由来のヒト化抗体は、多剤耐性癌、例えば、CD33陽性多剤耐性癌を有する対象を処置するために使用される。一実施形態では、h2H12抗体は、多剤耐性癌、例えば、CD33陽性多剤耐性癌を有する対象を処置するために使用される。さらなる実施形態では、h2H12 ADCは、多剤耐性癌、例えば、CD33陽性多剤耐性癌を有する対象を処置するために使用される。別の実施形態では、高度に活性な治療剤にコンジュゲートされたh2H12抗体は、多剤耐性癌、例えば、CD33陽性多剤耐性癌を有する対象を処置するために使用される。別の実施形態では、PBDにコンジュゲートされたh2H12抗体は、多剤耐性癌、例えば、CD33陽性多剤耐性癌を有する対象を処置するために使用される。さらなる実施形態では、PBDにコンジュゲートされたh2H12抗体は、多剤耐性のCD33陽性急性骨髄性白血病(AML)を有する対象を処置するために使用される。

マウス2H12抗体由来のヒト化抗体又はキメラ抗体は、単独で又はその薬物-コンジュゲートとして、発症を遅延させる、重症度を低減させる、さらなる増悪を阻害する、及び/又は癌の少なくとも1つの徴候若しくは症状を寛解させる投与量、投与経路及び投与頻度を意味する、有効な投与計画で施される。患者が既に癌に罹患している場合、この投与計画は、治療的に有効な投与計画と呼ばれ得る。患者が、一般的集団と比較して癌の危険性が上昇しているが、未だ症状を経験していない場合、この投与計画は、予防的に有効な投与計画と呼ばれ得る。いくつかの場合、治療効力又は予防効力は、歴史的対照又は同じ患者における過去の経験と比較して、個々の患者において観察され得る。他の場合、治療効力又は予防効力は、未処置患者の対照集団と比較して、処置患者の集団における前臨床試験又は臨床試験において実証され得る。

モノクローナル抗体についての例示的な投与量は、患者の体重の0.1mg/kg〜50mg/kg、より典型的には1mg/kg〜30mg/kg、1mg/kg〜20mg/kg、1mg/kg〜15mg/kg、1mg/kg〜12mg/kg、又は1mg/kg〜10mg/kg1、又は2mg/kg〜30mg/kg、2mg/kg〜20mg/kg、2mg/kg〜15mg/kg、2mg/kg〜12mg/kg、又は2mg/kg〜10mg/kg、又は3mg/kg〜30mg/kg、3mg/kg〜20mg/kg、3mg/kg〜15mg/kg、3mg/kg〜12mg/kg、又は3mg/kg〜10mg/kgである。その活性なモノクローナル抗体薬物コンジュゲート、例えば、オーリスタチンについての例示的な投与量は、対象の体重の1mg/kg〜7.5mg/kg、又は2mg/kg〜7.5mg/kg又は3mg/kg〜7.5mg/kg、又は0.1〜20、又は0.5〜5mg/kg体重(例えば、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10mg/kg)、又は固定された投与量として10〜1500若しくは200〜1500mgである。その高度に活性なモノクローナル抗体薬物コンジュゲート、例えば、PBDについての例示的な投与量は、対象の体重の1.0μg/kg〜1.0mg/kg又は1.0μg/kg〜500.0μg/kgである。いくつかの方法では、この患者には、次いで、2週間、3週間又は4週間毎に、抗体又はADCが投与される。投与量は、他の因子の中でも、投与頻度、患者の状態、及びこの処置が予防的であれ治療的であれ、この障害が急性であれ慢性であれ、存在する場合には以前の処置に対する応答に依存する。

投与は、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、くも膜下腔内、腹腔内、局所、鼻腔内又は筋内であり得る。投与はまた、腫瘍中に直接的に局在化され得る。静脈内投与又は皮下投与による全身循環中への投与が好ましい。静脈内投与は、例えば、30〜90分間などの期間にわたる注入による投与、又は単回ボーラス注射による投与であり得る。

投与頻度は、他の因子の中でも、循環中での抗体又は抗体-薬物コンジュゲートの半減期、患者の状態及び投与経路に依存する。頻度は、患者の状態における変化又は処置されている癌の進行に応答して、1日1回、1週間に1回、1か月に1回、1年に4回、又は不規則な間隔であり得る。静脈内投与のための例示的な頻度は、処置の連続的な過程にわたって1週間に2回と1年に4回との間であるが、より多い又はより少ない頻度での投薬もまた可能である。静脈内投与のための他の例示的な頻度は、処置の連続的な過程にわたって1週間に1回又は1か月に1回の間であるが、より多い又はより少ない頻度での投薬もまた可能である。皮下投与のために、例示的な投薬頻度は、1日1回〜1か月に1回であるが、より多い又はより少ない頻度での投薬もまた可能である。

投与される投与量の数は、癌の性質(例えば、急性症状又は慢性症状を呈するか否か)及び処置に対する障害の応答に依存する。急性障害又は慢性障害の急性悪化には、1用量と10用量との間が十分である場合が多い。時折、任意選択で分割された形態の、単一ボーラス用量が、急性障害又は慢性障害の急性悪化に十分である。処置は、急性障害又は急性悪化の再発に対して反復され得る。慢性障害について、抗体は、一定の間隔、例えば、少なくとも1年間、5年間若しくは10年間、又は患者の生涯にわたって、1週間に1回、2週間に1回、1か月に1回、1年に4回、6か月毎に1回で、投与され得る。非経口投与のための医薬組成物は、好ましくは無菌であり、実質的に等張であり、GMP条件下で製造される。医薬組成物は、単位剤形(即ち、単回投与のための投与量)で提供され得る。医薬組成物は、1種以上の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又は補助剤を使用して製剤化され得る。製剤化は、選択された投与経路に依存する。注射のために、抗体は、水溶液中、好ましくは、生理学的に適合性の緩衝液、例えば、Hank溶液、Ringer溶液、又は生理食塩水若しくは酢酸塩緩衝液(注射部位における不快感を低減させるため)中で、製剤化され得る。この溶液は、懸濁剤、安定化剤及び/又は分散剤などの製剤用剤(formulatory agent)を含み得る。代替的に、抗体は、使用前の、適切なビヒクル、例えば無菌の発熱物質を含まない水での構成のために、凍結乾燥形態であり得る。液体製剤中の抗体の濃度は、例えば、.01〜10mg/ml、例えば1.0mg/mlであり得る。

本発明の抗体による処置は、化学療法、放射線、幹細胞処置、手術、処置されている障害に対して有効な他の処置と組み合わされ得る。CD33に対するヒト化抗体と共に投与され得る有用なクラスの他の薬剤には、例えば、癌性細胞上で発現されている他の受容体に対する抗体、抗チューブリン剤(例えば、オーリスタチン)、DNA副溝結合剤(例えば、PBD)、DNA複製阻害剤、アルキル化剤(例えば、白金錯体、例えばシスプラチン、モノ(白金)、ビス(白金)及び三核白金錯体並びにカルボプラチン)、アントラサイクリン、抗生物質、葉酸代謝拮抗剤、代謝拮抗剤、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、予備形成(pre-forming)化合物、プリン代謝拮抗剤、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどが含まれる。

任意選択で上記他の薬剤若しくは投与計画のいずれかと組み合わせた、単独で又は抗体薬物コンジュゲートとしての、マウス2H12抗体由来の抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体又はh2H12抗体による処置は、単独で又は抗体-薬物コンジュゲートとしてのマウス2H12抗体由来の抗体なしの同じ処置(例えば、化学療法)と比較して、特に再発性又は不応性の場合、癌(例えば、ALL、CML、CMML)を有する患者の無増悪生存期間中央値又は全生存期間中央値を、少なくとも30%又は40%であるが好ましくは50%、60%〜70%又はさらには100%若しくはそれ以上、増加させ得る。さらに、又は代替的に、単独で又は抗体-薬物コンジュゲートとしてマウス2H12抗体由来の抗体を含む処置(例えば、標準的な化学療法)は、マウス2H12抗体由来の抗体なしの同じ処置(例えば、化学療法)と比較して、腫瘍を有する患者の完全奏効率、部分奏効率又は客観的奏効率(完全+部分)を、少なくとも30%又は40%であるが好ましくは50%、60%〜70%又はさらには100%、増加させ得る。

典型的には、臨床試験(例えば、第II相、第II/III相又は第III相試験)において、標準的な治療単独(又は+偽薬)を受けている患者の対照群と比較して、標準的な治療+マウス2H12抗体由来の抗体で処置された患者の無増悪生存期間中央値及び/又は奏効率中央値の上述の増加は、例えば、p=0.05又は0.01又はさらには0.001のレベルで、統計的に有意である。完全奏効率及び部分奏効率は、例えば、National Cancer Institute及び/又はFood and Drug Administrationに列挙されている又はこれらによって許容される、癌に対する臨床試験で一般に使用される客観的基準によって決定される。
VIII.他の適用
本発明に開示される抗CD33抗体は、臨床的診断若しくは処置又は研究の文脈において、CD33を検出するために使用され得る。癌上でのCD33の発現は、その癌が本発明の抗体による処置に適していることの指標を提供する。該抗体は、CD33を有する細胞及び種々の刺激に対するそれらの応答を検出する際の、実験室研究のための研究試薬としても販売され得る。かかる使用では、モノクローナル抗体は、蛍光分子、スピン標識された分子、酵素又は放射性同位体で標識され得、CD33についてのアッセイを実施するための全ての必要な試薬を有するキットの形態で提供され得る。本明細書に記載される抗体、m2h12、及びそのキメラ又はヒト化バージョン、例えばh2H12は、CD33タンパク質の発現を検出するため、及び癌がCD33 ADCによる処置に適しているか否かを決定するために使用され得る。一例として、マウス2H12、及びそのキメラ又はヒト化バージョン、例えばh2H12は、リンパ球、リンパ芽球、単球、骨髄性単球又は他のCD33発現細胞上のCD33発現を検出するために使用され得る。該抗体は、例えばアフィニティクロマトグラフィーによって、CD33タンパク質を精製するためにも使用され得る。

本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態又は態様は、特に示さない限り、任意の他の特徴、ステップ、要素、実施形態又は態様と組み合わせて使用され得る。本発明を、明確さ及び理解の目的のために、例示及び例としていくらか詳細に記載してきたが、特定の変化及び改変が、添付の特許請求の範囲内で実施され得ることが明らかである。

I.抗CD33抗体の作製
材料
以下の実施例に記載した細胞株を、American Type Culture Collection(ATCC)(Manassas、VA)又はDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)(Braunschweig、Germany)によって特定された条件に従って、培養物中で維持した。初代AML細胞を、各々25ng/mlの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、インターロイキン-3(IL-3)及び幹細胞因子(SCF)を補充した、20%熱不活化FBSを含むイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)中で維持した。細胞培養試薬はInvitrogen Corp(Carlsbad、CA)から取得し、サイトカインはPeproTech(Rocky Hill、NJ)から購入した。
方法論:
飽和結合アッセイ
100000のCD33陽性細胞(ヒト又はカニクイザル(cynomologus)CD33を発現するようにトランスフェクトされたHL-60、HEL 92.1.7及びHEK-293F細胞)を、96ウェルプレートに移した。AlexaFluor-647標識したCD33 mAbを、50nMから0.85pMまでの範囲の濃度で添加し、細胞を30分間氷上でインキュベートした。細胞を、遠心分離によってペレット化し、PBS+1%BSA溶液で3回洗浄し、125μLのPBS+1%BSA中で再懸濁した。蛍光を、フローサイトメーターを使用して分析し、飽和蛍光シグナルのパーセントを使用して、パーセント結合を決定し、引き続いて見かけのKdを計算した。
競合的結合アッセイ
100000のCD33陽性細胞を、96ウェルプレートに移し、1nMのAlexaFluor-647標識したm2H12、及び漸増濃度(0.03nMから600nMまで)の未標識のハイブリッド、ヒト化又はキメラ2H12 mAbと共に、氷上で1時間インキュベートした。細胞を遠心分離し、PBSで3回洗浄し、125μLのPBS+1%BSA溶液中で再懸濁した。蛍光を、フローサイトメーターを使用して分析し、飽和蛍光シグナルのパーセントを使用して、パーセント結合した標識化2H12 mAbを決定した。EC50を、可変の傾きを有するシグモイド用量反応曲線にデータをフィッティングすることによって外挿した。
細胞傷害性アッセイ
AML細胞株又は初代AML細胞を、CD33特異的mAb及び抗体薬物コンジュゲート(ADC)で、37℃で96時間処理した。いくつかの実験では、非抗原結合ADCを、陰性対照として含めた。細胞株についての細胞生存度を、製造者の指示に従ってCelltiterGlo(Promega Corporation、Madison、WI)を使用して測定した。細胞を、CelltiterGlo試薬と共に室温で25分間インキュベートし、発光を、Fusion HT蛍光プレートリーダー(Perkin Elmer、Waltham、MA)で測定した。初代AML細胞について、生存度を、Annexin V及びヨウ化プロピジウム染色を使用するフローサイトメトリーによって測定した。結果を、ビヒクル処理した細胞(対照=100%)と比較した、生存度における50%の低減を生じるのに必要な化合物の濃度であるIC50として報告する。
抗体薬物コンジュゲートの産生
CD33抗体の抗体薬物コンジュゲートを、本明細書に記載される抗CD33抗体を使用して、米国特許出願公開第20050238649号及びWO2011/130613に記載されるように調製した。薬物リンカーSGD-1269(mcMMAF)は、米国特許出願公開第20050238649号に記載され、薬物リンカーSGD-1910は、WO2011/130613に記載されている。IgG1 mAbのシステイン変異体の調製は、米国特許出願公開第20100158909号に一般に記載されている。薬物-リンカーSGD-1269を、鎖間ジスルフィド結合のシステイン残基のチオール基を介して抗CD33抗体h2H12にコンジュゲートし、平均薬物負荷は、1抗体当たり約4薬物であった。薬物-リンカーSGD-1910を、抗体のIgG1鎖の239位に導入されたシステイン残基のチオール基を介して抗CD33抗体にコンジュゲートし、平均薬物負荷は、1抗体当たり約2薬物であった。239位にシステインを有する抗体は、記号表示EC、例えば、h2H12EC又はh00ECを有する。
インビボ活性研究
播種性AMLモデル
CB-17/IcrHsd-PrkdcSCID(SCID)マウスに、尾部静脈において5×10⁶のHL-60腫瘍細胞を静脈内接種した。腫瘍接種の1日後、マウス(n=8/群)を、処置しなかったか、又はCD33 mAb及びADC若しくは非結合対照mAb及びADCを、合計2用量にわたり4日毎に腹腔内投薬した。合計2用量にわたり7日毎に腹腔内投薬したMylotargを、このMylotarg感受性AMLモデルにおける陽性対照として含めた。動物は、体重減少が20%以上になった場合、或いはマウスが頭蓋腫脹及び/若しくは後肢麻痺、又は触知可能な播種性腫瘍塊の発達を含む中枢神経系症状として顕在化した播種性疾患の徴候を示した場合に、安楽死させた。
皮下AMLモデル
SCIDマウスに、5×10⁶のHL-60又はTF1-αAML腫瘍細胞を皮下接種した。腫瘍成長を、ノギスを用いてモニタリングし、平均腫瘍体積を、式(0.5×[長さ×幅²])を使用して計算した。平均腫瘍体積がおよそ100mm³に達したときに、マウス(n=6〜7/群)を、処置しなかったか、又は単一用量のCD33 ADC又は非結合対照ADCを腹腔内投薬した。HL-60モデルについて、マウスを、治療抗体への投与のおよそ4時間前にヒトIVIg(10mg/kgの単回腹腔内注射)で処置して、試験ADCとAML細胞上のFc受容体との相互作用を最小化した。マウスを、腫瘍体積がおよそ1000mm³に達したときに安楽死させた。全ての動物手順を、Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Careによって公認された施設において、Institutional Animal Care and Use Committeeによって承認されたプロトコルの下で実施した。
結果
1.マウスCD33 mAbの作製
ヒトCD33抗原に対する抗体を、組換えヒトCD33-Fc融合タンパク質を用いた免疫によって、Balb/cマウスにおいて作製した。マウスmAb 2H12(m2H12)を、ヒトCD33及びカニクイザル(cynomologus)CD33に対する結合親和性に基づいて選択し、非ヒト霊長類における前臨床試験を可能にした。

2.ヒト化抗体の設計及び試験
ヒト化抗体を、マウス2H12抗体から誘導した。異なる位置において復帰変異を組み込む9つのヒト化重鎖(HA〜HI)及び7つのヒト化軽鎖(LA〜LG)を作製した。図1A、Bの配列アラインメント及び表1〜4を参照のこと。

ヒト化重鎖及び軽鎖を、それぞれキメラ軽鎖及び重鎖(マウス可変領域及びヒト定常領域から構成されたキメラ鎖)と対にした。CD33 mAbのヒト化/キメラハイブリッドバリアントを、HEL 92.1.7 AML細胞の表面上で発現されたヒトCD33に対する結合について試験した(表5)。重鎖HC及びHIを、さらなる研究のために選択した。ヒト化重鎖HC及びHI並びにヒト化軽鎖LA、LE及びLGの順列を示すヒト化抗体を発現させ、ヒト又はカニクイザル(cyno)CD33を発現する細胞に対する結合を決定した(表6)。HILG抗体(2H12 HILG)を、マウスCD33 mAb m2H12の結合特徴と最も密接に似たヒト化抗体として選択した。HILG抗体を、h2H12抗体(ヒト2H12抗体)と呼ぶ。m2H12、h2H12及びIgG1重鎖中にS239C変異(EU番号付け)を有するh2H12(操作されたシステインのために、h2H12ECと呼ばれる)についてのK_Dを、2つのAML細胞株において内因性タンパク質として、及びHEK293F細胞株において組換えタンパク質として発現されたヒトCD33について決定した。これらの抗体についてのK_Dを、HEK293F細胞株において組換えタンパク質として発現されたcyno CD33についても決定した(表7)。

h2H12 ADCのインビトロ抗腫瘍活性
h2H12抗体-薬物コンジュゲートの細胞傷害活性を、2つの薬物リンカー系、SGD-1269(オーリスタチン薬物-リンカー)及びSGD-1910(ピロロベンゾジアザピン(pyrrolobenzodiazapine)ダイマー薬物-リンカー)を使用して試験した。細胞傷害性アッセイを、非コンジュゲート抗体、h2H12-ADC、及びCD33に結合しない対照ADCを使用して、2つのCD33陽性AML細胞株、HL-60及びHEL 92.1.7に対して実施した。図2に示すように、h2H12及びh2H12EC(h2H12dとも呼ばれる)非コンジュゲート抗体は、いずれの細胞株に対しても活性を有さなかった。同様に、非結合対照ADC(h00EC-SGD-1910及びh00-SGD-1269)は、細胞傷害性でなかった。対照的に、h2H12EC-SGD-1910は、HL-60(IC50約1.6ng/mL)及びHEL 92.1.7(IC50約12.9ng/mL)に対して細胞傷害性であった。h2H12EC-SGD-1910の活性は、HL-60細胞に対しては、十分に記載された抗CD33指向性抗体薬物コンジュゲートであるMylotargの活性と類似しており、Mylotargが無効であるHEL 92.1.7(多剤耐性(MDR)細胞株)に対して試験した場合には、より強力であった。m2H12-SGD-1269及びh2H12-SGD-1269は、HL-60細胞に対して活性であり(それぞれ1.3ng/mL及び5.3ng/mLのIC50)、HEL 92.1.7に対してはより低い程度で活性であった(図2)。別々の実験において、h2H12-SGD-1269及びh2H12EC-SGD-1910を、CD33陽性AML細胞株の拡張されたパネルに対してさらに試験した。表8に示すように、h2H12-SGD-1269は、7つのAML細胞株のうち4つに対して活性であり(代表的細胞株についての平均IC50、72.8mg/mL)、h2H12EC-SGD-1910は、試験した7つのAML細胞株のうち7つに対して強力な活性を有した(平均IC50、20.4ng/mL)。h2H12EC-SGD-1910は、8つのCD33陽性AML細胞株のうち3つにおいて活性であったMylotargよりも強力であった。ADCを、AML起源のものでなくCD33を発現しなかった3つの細胞株に対して試験した場合、活性は観察されなかった(表8)。全体で、これらのデータは、h2H12及びh2H12EC抗体薬物コンジュゲートが、CD33陽性細胞を選択的に標的化し、これらの細胞に対する細胞傷害活性を示すことを実証している。

h2H12 ADCのインビボ抗腫瘍活性
h2H12-SGD-1269の活性を、HL-60 AML細胞株をSCIDマウス中に導入して播種性疾患を開始させたモデルにおいて試験した。マウスを、表9に記載される用量レベル及びスケジュールに従って、h2H12抗体、非特異的IVIg陰性対照抗体、h2H12-SGD-1269、非結合対照ADC(hBU12-SGD-1269)又はMylotargによって次の日に処置した。HL-60接種したマウスの生存期間中央値は、未処置群又はヒトIVIg処置群における22日間から、それぞれh2H12(3mg/kg)、及び1mg/kg又は3mg/kgのh2H12-SGD-1269を受けている群において、29日間(p=0.007)、41日間(p=0.001)及び52日間(p<0.001)に増加した(表9)。h2H12EC-SGD-1269は、h2H12-SGD-1269を投薬したマウスの生存と同様に生存を延長させた(それぞれ、50日間及び52日間の生存期間中央値)。Mylotargもまた、このMDR陰性モデルにおいて活性であった;Mylotarg処置マウスの50%よりも多くが、99日目の研究の最後まで生存した。非コンジュゲート抗体h2H12又は非結合対照ADC(hBU12-SGD-1269)で処置したマウスの生存は、未処置の対照マウスと比較して6〜7日間延長されたが、CD33標的化ADCで処置したマウスよりもかなり低い程度であった。

h2H12EC-SGD-1910の活性を、2つの皮下AML異種移植片モデル、HL-60及びTF1-αにおいて試験した。樹立された(約100mm³)腫瘍を有するSCIDマウスに、HL-60モデルについて表10に記載されるように、TF1-α腫瘍モデルについて表11に記載されるように、h2H12EC-SGD-1910又は非結合対照ADC(h00EC-SGD-1910)を投薬した。h2H12EC-SGD-1910による処置は、腫瘍の体積が4倍化するまでの時間の中央値によって測定されるように、未処置マウス及び非結合対照ADC処置マウスと比較して腫瘍成長を有意に減少させた(表10及び表11)。CD33標的化ADCで観察された抗腫瘍活性は、用量依存的であった。HL-60腫瘍について、0.1mg/kgの単一用量は、6匹の処置マウスのうち6匹において、完全で持続的な腫瘍退縮を生じた。0.03mg/kgのより低い用量は、6匹の処置マウスのうち1匹において完全退縮を生じ、腫瘍4倍化までの時間を、未処置マウス及び非結合対照ADC(h00d-SGD-1910)を同様に投薬したマウスについての15日間と比較して、20日間まで延長させた。MDR陽性TF1-α腫瘍モデル(表11)では、0.3mg/kgの単一用量のh2H12EC-SGD-1910は、7匹の処置マウスのうち5匹において、完全で持続的な腫瘍退縮を生じた。腫瘍4倍化までの日数の中央値には、117日目の研究の最後までには到達しなかった。対照的に、非結合対照ADC(h00EC-SGD-1910)を同様に投薬したマウスにおける腫瘍は、27日目までに体積が4倍化した。同様に、0.1mg/kg又は0.03mg/kgのh2H12EC-SGD-1910を投薬したマウスにおける腫瘍が4倍化するまでの時間の中央値は、未処置マウス又はh00EC-SGD-1910処置マウスの時間の中央値よりも有意に長かった(p=0.0001)。Mylotargは、TF1-α腫瘍モデルにおいては活性でなかった;Mylotarg処置マウスの腫瘍成長は、未処置マウスと異ならなかった。合わせて考えると、このデータは、h2H12-ADCが、用量依存的であり、かつ非標的化ADCよりも有意に高い、AML異種移植片モデルにおける抗腫瘍活性を示すことを実証している。

配列表

Claims (50)

1. ヒトCD33タンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、3つの重鎖相補性決定領域(CDR):配列番号19からなる重鎖CDR1、配列番号20からなる重鎖CDR2、及び配列番号21からなる重鎖CDR3、並びに3つの軽鎖CDR: 配列番号22からなる軽鎖CDR1、配列番号23からなる軽鎖CDR2、及び配列番号24からなる軽鎖CDR3を含む、上記抗体。
2. マウス抗体、キメラ抗体、及びヒト化抗体から選択される、請求項１に記載の抗体。
3. ヒト化2H12抗体である、請求項２に記載の抗体。
4. 配列番号18と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域を含む、ただし、H48位はIによって占められ、H66位はKによって占められ、H67位はAによって占められ、H69位はLによって占められ、H71位はAによって占められ、H94位はSによって占められ、並びに配列番号8と少なくとも90%同一である成熟軽鎖可変領域を含む、ただし、L22位はNによって占められ、L46位はTによって占められ、L69位はQによって占められ、L71位はYによって占められ、Kabat番号付けシステムによって決定される、請求項３に記載のヒト化抗体。
5. 配列番号18と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域、及び配列番号8と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域を含む、請求項３に記載のヒト化抗体。
6. 成熟重鎖可変領域が重鎖定常領域に融合し、成熟軽鎖可変領域が軽鎖定常領域に融合している、請求項３に記載のヒト化抗体。
7. 重鎖定常領域が、天然ヒト定常領域と比較して低減されたFcγ受容体に対する結合を有する、天然ヒト定常領域の変異体形態である、請求項３に記載のヒト化抗体。
8. 重鎖定常領域が、IgG1アイソタイプのものである、請求項２に記載のヒト化抗体。
9. 重鎖定常領域が配列番号27を含むアミノ酸配列を有し、軽鎖定常領域が配列番号25を含むアミノ酸配列を有する、請求項３〜６のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
10. 重鎖定常領域が配列番号29（S239C）を含むアミノ酸配列を有し、軽鎖定常領域が配列番号25を含むアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のヒト化抗体。
11. 成熟重鎖可変領域が配列番号18で示されるアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域が配列番号8で示されるアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のヒト化抗体。
12. 細胞傷害剤又は細胞増殖抑制剤にコンジュゲートされている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
13. 細胞傷害剤にコンジュゲートされている、請求項１２に記載の抗体。
14. 細胞傷害剤が、酵素切断可能なリンカーを介して抗体にコンジュゲートされている、請求項１３に記載の抗体。
15. 細胞傷害剤がDNA副溝結合剤である、請求項１３又は１４に記載の抗体。
16. 細胞傷害剤が、式：
    

    

    を有する、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の抗体。
17. ヒト又はカニクイザルのCD33に対して、0.5〜2×10⁹M^-1の会合定数を有する、請求項１に記載の抗体。
18. 請求項１〜１７のいずれか一項に記載のヒト化抗体の有効な投与計画を患者に施すことを含む、CD33を発現する癌を有しているか又は有する危険性のある患者を処置する方法。
19. 癌が、急性骨髄性白血病(AML)、骨髄異形成症候群(MDS)、急性前骨髄球性白血病(APL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄単球性白血病(CMML)、慢性骨髄増殖性障害、前駆B細胞急性リンパ芽球性白血病(preB-ALL)、前駆T細胞急性リンパ芽球性白血病(preT-ALL)、多発性骨髄腫(MM)、肥満細胞症、又は骨髄肉腫である、請求項１８に記載の方法。
20. 請求項１に記載のヒト化又はキメラ抗体を含む医薬組成物。
21. HI（配列番号18）と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域、及びLG（配列番号8）と少なくとも90%同一である成熟軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体。
22. HIと少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域、及びLGと少なくとも95%同一である成熟軽鎖可変領域を含む、請求項２１に記載のヒト化抗体。
23. H94位がSによって占められている、請求項２１又は２２に記載のヒト化抗体。
24. H48位、H66位、H67位、H69位、H71位、及びH94位がI、K、A、L、A、及びSによって占められ、L22、L46、L69、及びL71がN、T、Q、及びYによって占められている、請求項２１又は２２に記載のヒト化抗体。
25. 配列番号18と成熟重鎖可変領域の可変領域フレームワークの間のいずれの差異も、Iによって占められるH48位、Kによって占められるH66位、Aによって占められるH67位、Lによって占められるH69位、Aによって占められるH71位、Sによって占められるH94位からなる群より選択され、並びに配列番号8と成熟軽鎖可変領域の可変領域フレームワークの間のいずれの差異も、Nによって占められるL22位、Tによって占められるL46位、Qによって占められるL69位、及びYによって占められるL71位からなる群より選択される、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
26. 成熟重鎖可変領域の3つのCDRが配列番号18のものであり、成熟軽鎖可変領域の3つのCDRが配列番号8のものである、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
27. 成熟重鎖可変領域が重鎖定常領域に融合し、成熟軽鎖可変領域が軽鎖定常領域に融合している、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
28. 重鎖定常領域が、天然ヒト定常領域と比較して低減されたFcγ受容体に対する結合を有する、天然ヒト定常領域の変異体形態である、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
29. 重鎖定常領域が、IgG1アイソタイプのものである、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
30. 重鎖定常領域が配列番号27を含むアミノ酸配列を有し、軽鎖定常領域が配列番号25を含むアミノ酸配列を有する、請求項２１〜２７又は２９のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
31. 重鎖定常領域が配列番号29（S239C）を含むアミノ酸配列を有し、軽鎖定常領域が配列番号25を含むアミノ酸配列を有する、請求項２１〜２７又は２９のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
32. 配列番号18の成熟重鎖可変領域のCDR中のいずれの差異も、H60位〜H65位に存在する、請求項２１〜３１のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
33. 成熟重鎖可変領域が配列番号18を含むアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域が配列番号8を含むアミノ酸配列を有する、請求項２１〜３２のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
34. 細胞傷害剤又は細胞増殖抑制剤にコンジュゲートされている、請求項２１〜３３のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
35. 細胞傷害剤にコンジュゲートされている、請求項３４に記載の抗体。
36. 細胞傷害剤が、酵素切断可能なリンカーを介して抗体にコンジュゲートされている、請求項３５に記載のヒト化抗体。
37. 細胞傷害剤がDNA副溝結合剤である、請求項３５又は３６に記載のヒト化抗体。
38. 細胞傷害剤が、式：
    

    

    を有する、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
39. H48位、H66位、H67位、H69位、H71位、及びH94位がそれぞれI、K、A、L、A、及びSによって占められる配列番号18の3つのCDRを含む成熟重鎖可変領域、並びにL22位、L46位、L69位、及びL71位がそれぞれN、T、Q、及びYによって占められる配列番号8の3つのCDRを含む成熟軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体。
40. ヒト又はカニクイザルのCD33に対して、0.5〜2×10⁹M^-1の会合定数を有する、請求項３９に記載のヒト化抗体。
41. 請求項１〜１７又は請求項２１〜４０のいずれか一項に規定される成熟重鎖可変領域及び／又は成熟軽鎖可変領域をコードする核酸。
42. 請求項２１〜４０のいずれか一項に記載のヒト化抗体の有効な投与計画を患者に施すことを含む、癌を有しているか又は癌の危険性のある患者を処置する方法。
43. 癌が、急性骨髄性白血病(AML)、骨髄異形成症候群(MDS)、急性前骨髄球性白血病(APL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄単球性白血病(CMML)、慢性骨髄増殖性障害、前駆B細胞急性リンパ芽球性白血病(preB-ALL)、前駆T細胞急性リンパ芽球性白血病(preT-ALL)、多発性骨髄腫(MM)、肥満細胞症又は骨髄肉腫である、請求項４２に記載の方法。
44. 請求項１〜４３のいずれか一項に記載のヒト化抗体を含む医薬組成物。
45. 請求項１〜１７、２１〜３３、又は３９〜４０のいずれか一項に記載のヒト化抗体の有効な投与計画を患者に施すことを含む、急性骨髄性白血病(AML)を有しているか又は有する危険性のある患者を処置する方法。
46. 抗体が細胞傷害剤又は細胞増殖抑制剤にコンジュゲートされている、請求項４５に記載の方法。
47. 抗体が細胞傷害剤にコンジュゲートされている、請求項４６に記載の方法。
48. 細胞傷害剤が、酵素切断可能なリンカーを介して抗体にコンジュゲートされている、請求項４７に記載の方法。
49. 細胞傷害剤がDNA副溝結合剤である、請求項４７又は４８に記載の方法。
50. 細胞傷害剤が、式：
    

    

    を有する、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の方法。

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