JP5230420B2 - Ｃｄ４結合ペプチドおよび放射線による治療 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、放射線による臨床状態の処置の分野に関する。特に、本発明は、放射線処置を媒介するための、CD4に結合することができる抗体等のペプチドの使用に関する。
本発明は、放射線による臨床状態の処置の分野に関する。特に、本発明は、放射線処置を媒介するための、CD4に結合することができる抗体等のペプチドの使用に関する。
本出願において引用された全ての特許および非特許参考文献は、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる。
発明の背景
放射線は、皮膚浸潤性T細胞におけるアポトーシスの誘導において非常に有効であり、したがってT細胞媒介皮膚疾患を有する患者において有益な効果を発揮する。しかし、十分な臨床有効性と引き換えに、（悪性）T細胞の放射線に対する感受性が増強することがある。リンパ腫細胞のUV曝露後、G1期での細胞の蓄積およびアポトーシス細胞分画の増加が観察され、これはG1チェックポイント阻害剤である2-APによる処置によって増強された（Takemura T et al., Apoptosis. 4(4), 245-53 (1999)(非特許文献1)）。本試験はまた、G1期におけるp53の発現レベルの増加がUV照射誘発細胞死に対する感受性の増加にも連結することを示した。G1期におけるp53発現の上昇によって放射線感受性が増加することは、他の多くの研究によって支持された（Cuddihy AR et al., Cancer Metastasis Rev. 23(3-4), 237-57 (2004)(非特許文献2), Mcllwrath AJ et al., Cancer Res. 54(14), 3718-3722 (1994)(非特許文献3), Bohnke A et al., Int J Radiat Biol. 80(1), 53-63 (2004)(非特許文献4), Nagasawa M et al., Oncogene. 20(23), 2889-99 (2001)(非特許文献5)）。さらに、扁平上皮癌細胞は、抗EGFR抗体、C225（Huang SM et al., Clin Cancer Res. 6(6), 2166-74 (2000)(非特許文献6)）によるG1停止の誘導を通して放射線に関して感作されることが示された。G1様静止期における腫瘍細胞は、増殖しつつある細胞より放射線に対して感受性が高いことが見いだされた（Ng CE et al., Br J Cancer. 56(3), 301-307 (1987)(非特許文献7)）。
放射線は、皮膚浸潤性T細胞におけるアポトーシスの誘導において非常に有効であり、したがってT細胞媒介皮膚疾患を有する患者において有益な効果を発揮する。しかし、十分な臨床有効性と引き換えに、（悪性）T細胞の放射線に対する感受性が増強することがある。リンパ腫細胞のUV曝露後、G1期での細胞の蓄積およびアポトーシス細胞分画の増加が観察され、これはG1チェックポイント阻害剤である2-APによる処置によって増強された（Takemura T et al., Apoptosis. 4(4), 245-53 (1999)(非特許文献1)）。本試験はまた、G1期におけるp53の発現レベルの増加がUV照射誘発細胞死に対する感受性の増加にも連結することを示した。G1期におけるp53発現の上昇によって放射線感受性が増加することは、他の多くの研究によって支持された（Cuddihy AR et al., Cancer Metastasis Rev. 23(3-4), 237-57 (2004)(非特許文献2), Mcllwrath AJ et al., Cancer Res. 54(14), 3718-3722 (1994)(非特許文献3), Bohnke A et al., Int J Radiat Biol. 80(1), 53-63 (2004)(非特許文献4), Nagasawa M et al., Oncogene. 20(23), 2889-99 (2001)(非特許文献5)）。さらに、扁平上皮癌細胞は、抗EGFR抗体、C225（Huang SM et al., Clin Cancer Res. 6(6), 2166-74 (2000)(非特許文献6)）によるG1停止の誘導を通して放射線に関して感作されることが示された。G1様静止期における腫瘍細胞は、増殖しつつある細胞より放射線に対して感受性が高いことが見いだされた（Ng CE et al., Br J Cancer. 56(3), 301-307 (1987)(非特許文献7)）。
p53のアップレギュレーションは、T細胞における重要なシグナル経路であるホスファチジルイノシトール3-キナーゼ（PI3K）の阻害に関連することが示されている（Grandage VL et al., Leukemia. 19(4), 586-94 (2005)(非特許文献8)）。阻害性アダプター分子（inhibitory adaptor molecule）SHIP-1は、PI3Kの阻害剤であり（Horn S et al., Leukemia. 18(11), 1839-49 (2004)(非特許文献9)）、したがってSHIP-1の活性化によってp53のアップレギュレーションが起こると考えられる。
Dok-1およびSHIP-1は、造血細胞において発現されるいわゆる「阻害性アダプター分子」であり、これはシグナル伝達を減弱させて、それによって不適当な細胞の活性化を防止する働きを有する（Veillette A et al., 55(2), 301-8 (1988)(非特許文献10)）。Dok-1のリン酸化は、SHIP-1との相互作用を誘発し、これは、PI3Kタンパク質キナーゼB（PKB）/Akt経路の負の調節に至る。B細胞におけるDok-1の過剰発現は、細胞周期阻害剤p21WAF1/Cip1の発現の増加、サイクリンD2発現の減少、および抗アポトーシスタンパク質bcl-XLの発現の減少を引き起こすことが示されている（Yamakawa N et al., EMBO J. 21(7), 1684-94 (2002)(非特許文献11)）。G1/S阻害剤p21の増加およびG1サイクリンサイクリンDの減少は、Dok-1活性化の際にG1期での延長または停止が起こっていることを暗示すると考えられる。
内因性のSHIP-1欠損Jurkat T細胞におけるSHIP-1発現の回復によって、SHIP-1を人為的に誘発すると、G1期の移行時間が増加することが示された。G1期のこの延長は、細胞周期阻害剤p27Kip1の安定性の増加に関連した（Horn, 2004、前記）。G1期を通しての進行に及ぼすSHIP活性化の阻害性の影響は、T細胞においても同様に発現されるSHIP-1、SHIP-2のより広く発現される相同体を調べることによって確認された（Bruyns et al., Biol Chem. 380(7-8), 969-74 (1999)(非特許文献12)）。神経膠芽腫細胞においてSHIP-2が過剰発現されると、PI3Kタンパク質キナーゼB（PHB）経路を阻害して、G1における細胞周期停止を引き起こし、これはまた、細胞周期阻害剤p27Kip1の安定性の増加に関連した（Taylor V et al., Mol Cell Biol. 20(18), 6860-6871 (2000)(非特許文献13)）。
UVB照射、ソラレンおよびUVA（PUVA）治療、電離放射線、電子ビーム、x線（Kacinski et al., Ann N Y Acad Sci. 941, 194-199 (2001)(非特許文献14)）ならびにフォトフォレーシス（UVAおよびソラレン曝露を伴う血液の体外循環）（Baron et al., Dermatol Ther. 16(4), 303-310 (2003)(非特許文献15)）を含む、DNA損傷を誘発する多様な治療が、CTCLに関して適応されている。
PUVAは、正常または新生物Tリンパ球による皮膚浸潤によって引き起こされる皮膚疾患の非常に有効な処置である。Tリンパ球はケラチノサイトのような他の皮膚常在細胞よりPUVAの細胞障害作用に対して50倍を超える感受性を有すると報告された（Johnson et al., Photochem Photobiol. 63(5), 566-571 (1996)(非特許文献16)）。サブG1 DNAピークは、アポトーシスおよびPUVA処置によって引き起こされた細胞死が、細胞周期の進行を顕著に遅らせ、最終的に細胞周期停止を引き起こし、アポトーシスに至ることを示した（Johnson R et al., Photochem Photobiol. 63(5), 566-571 (1996)(非特許文献16)）。同様にPUVAによって、放射線照射皮膚におけるDNA鎖間のクロスリンクが起こり、損傷を受けたDNAがDNA修復メカニズムを活性化して、上皮細胞（Hashimoto Y et al., J Dermatol Sci. 10(1), 16-24 (1995)(非特許文献17)）または線維芽細胞（Ma W et al., Exp Dermatol. 12(5), 629-37 (2003)(非特許文献18)）において、細胞が細胞周期のG2期で停止することも示されている。
Takemura T et al., Apoptosis. 4(4), 245-53 (1999)
Cuddihy AR et al., Cancer Metastasis Rev. 23(3-4), 237-57 (2004)
Mcllwrath AJ et al., Cancer Res. 54(14), 3718-3722 (1994)
Bohnke A et al., Int J Radiat Biol. 80(1), 53-63 (2004)
Nagasawa M et al., Oncogene. 20(23), 2889-99 (2001)
Huang SM et al., Clin Cancer Res. 6(6), 2166-74 (2000)
Ng CE et al., Br J Cancer. 56(3), 301-307 (1987)
Grandage VL et al., Leukemia. 19(4), 586-94 (2005)
Horn S et al., Leukemia. 18(11), 1839-49 (2004)
Veillette A et al., 55(2), 301-8 (1988)
Yamakawa N et al., EMBO J. 21(7), 1684-94 (2002)
Bruyns et al., Biol Chem. 380(7-8), 969-74 (1999)
Taylor V et al., Mol Cell Biol. 20(18), 6860-6871 (2000)
Kacinski et al., Ann N Y Acad Sci. 941, 194-199 (2001)
Baron et al., Dermatol Ther. 16(4), 303-310 (2003)
Johnson et al., Photochem Photobiol. 63(5), 566-571 (1996)
Hashimoto Y et al., J Dermatol Sci. 10(1), 16-24 (1995)
Ma W et al., Exp Dermatol. 12(5), 629-37 (2003)
発明の概要
本発明は、CD4に結合することができる抗体は、p56lckリン酸化の増加を誘発しうるという驚くべき知見に関する。さらに、抗CD4モノクローナル抗体ザノリムマブ（zanolimumab）によるp56lckのリン酸化は、例えば阻害性アダプター分子であるDok-1および/またはSHIP-1のp56lckチロシンキナーゼの特定の基質のリン酸化の増加に関連している。これらの阻害性アダプター分子の活性化によってしばしばG1期での細胞周期の延長または停止が起こる。G1期で停止した細胞は、放射線処置に関して感作されて（Mcllwrath 1994、前記）、このように、その後のまたは同時の放射線処置の有効性を増強しうる。同様に、SHIP-1のように、阻害性アダプター分子の活性化によって、しばしばPI3kの阻害が起こり、これによってしばしばp53のアップレギュレーションが起こり、それによって放射線治療の際にT細胞におけるアポトーシスが促進されうる（Okkenhaug K. et al., Nature reviews 3, 317-330 (2003)）。
本発明は、CD4に結合することができる抗体は、p56lckリン酸化の増加を誘発しうるという驚くべき知見に関する。さらに、抗CD4モノクローナル抗体ザノリムマブ（zanolimumab）によるp56lckのリン酸化は、例えば阻害性アダプター分子であるDok-1および/またはSHIP-1のp56lckチロシンキナーゼの特定の基質のリン酸化の増加に関連している。これらの阻害性アダプター分子の活性化によってしばしばG1期での細胞周期の延長または停止が起こる。G1期で停止した細胞は、放射線処置に関して感作されて（Mcllwrath 1994、前記）、このように、その後のまたは同時の放射線処置の有効性を増強しうる。同様に、SHIP-1のように、阻害性アダプター分子の活性化によって、しばしばPI3kの阻害が起こり、これによってしばしばp53のアップレギュレーションが起こり、それによって放射線治療の際にT細胞におけるアポトーシスが促進されうる（Okkenhaug K. et al., Nature reviews 3, 317-330 (2003)）。
1つの態様において、本発明は、CD4に結合することができる抗体等のペプチドおよび臨床状態の放射線処置を媒介するためのその利用に関する。本発明の状況において、CD4に結合することができるペプチドを「CD4結合ペプチド」と呼んでもよく、CD4に結合することができる抗体を「抗CD4抗体」と呼んでもよい。1つの態様において、本発明に従って用いるための抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドは、以下の1つまたは複数、例えば、以下の少なくとも2つ、例えば以下の少なくとも3つなど、例えば、以下の少なくとも4つ、例えば以下の少なくとも5つなど、例えば、以下の少なくとも6つ、例えば以下の少なくとも7つなど、例えば、以下の少なくとも8つ、例えば以下の全てなどを行うことができる：
−p56lckによるα-カゼインのリン酸化の誘導、
−p56lck自己リン酸化の誘導、
−阻害性アダプター分子Dok-1および/またはSHIP-1および/またはSHIP-2のリン酸化の誘導
−p56lck媒介Dok-1リン酸化の誘導
−PKB/Akt経路の阻害
−TCRからのCD4の隔離
−p53発現の増加および/またはアップレギュレーション
−細胞周期のG1期の停止または延長の誘導
−放射線に対するCD4+細胞、好ましくはCD4+ T細胞感受性の増加。
−p56lckによるα-カゼインのリン酸化の誘導、
−p56lck自己リン酸化の誘導、
−阻害性アダプター分子Dok-1および/またはSHIP-1および/またはSHIP-2のリン酸化の誘導
−p56lck媒介Dok-1リン酸化の誘導
−PKB/Akt経路の阻害
−TCRからのCD4の隔離
−p53発現の増加および/またはアップレギュレーション
−細胞周期のG1期の停止または延長の誘導
−放射線に対するCD4+細胞、好ましくはCD4+ T細胞感受性の増加。
本発明に従って用いるための抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドは、CD4に結合することができ、それによってp56lckチロシンキナーゼの特定の基質のリン酸化を誘導することができる。一般的にp56lckチロシンキナーゼの活性化によって、チロシンキナーゼ（Dok-1）の下流の阻害性アダプタータンパク質（Martelli MP et al., J Biol Chem. 276(49), 45654-45661 (2001), Okabe S et al., Blood. 105(2), 474-480 (2005)）および/またはリン酸化により5'-イノシトールホスファターゼに接触するSH2ドメイン（SHIP-1）（Lamkin TD et al, J Biol Chem. 272(16), 10396-401 (1997)）の発現の増加に至る。Dok-1およびSHIP-1は、例えば造血細胞において発現され、そこでそれらはシグナル伝達を減弱させて、それによって不適当な細胞活性化を防止するように作用しうる（Veillette et al., Annu Rev Immunol. 20, 669-707 (2002)）。一般的にDok-1およびSHIP-1のリン酸化によって、ras/ERKおよびAKT経路の阻害が起こる。Dok-1の活性化は、SHIP-1との相互作用を誘発することがあり、これによってPI3Kタンパク質キナーゼB（PKB）/Akt経路の負の調節が起こり、このようにG1期における細胞周期の停止が起こりうる。B細胞におけるDok-1の過剰発現は、サイクリンD2発現を減少させて、および/または細胞周期阻害剤p21WAF1/Chip1発現を増加させ（Yamakawa 2002、前記）、いずれもG1期における延長または停止に至る。SHIP-1の活性化および発現は、G1期の通過時間の増加および細胞周期阻害剤p27Kip1の安定性の増加を誘導する（Horn, 2004、前記）。SHIP-1相同体SHIP-2は、広く発現され、SHIP-2の過剰発現によってPI3Kタンパク質キナーゼB（PKB）経路の阻害が起こり、このようにG1期における細胞周期の停止が起こる（Taylor V 2000、前記）。さらに、SHIP-1の発現は、PI3Kタンパク質キナーゼBを阻害し（Horn, 2004、前記）、これによってp53のアップレギュレーションが起こりうる（Grandage 2005、前記）。p53を発現する腫瘍細胞は、G1期において停止して（Bohnke 2004、前記）、さらに機能的p53は、放射線照射時にリンパ球におけるアポトーシスを促進する（Cuddihy 2004、前記）。
G1期における細胞はしばしば、電離放射線に対してより感受性が高く（Mcllwrath 1994、前記）、さらにG1様静止期に存在する腫瘍細胞は増殖しつつある細胞より放射線に対する感受性が高い（Ng 1987、前記）。したがって、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドのCD4+ T細胞に対する結合は、放射線処置に対して細胞を感作して、そのような処置後に細胞のアポトーシスを誘導しうる。
1つの態様において、本発明は、放射線処置を受けるまたは受けるであろう個体における悪性疾患または炎症性皮膚疾患を処置するための、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドに関する。
1つの態様において、本発明は、放射線処置と組み合わせて悪性疾患または炎症性皮膚疾患を処置するための、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドに関する。
1つの態様において、本発明は、臨床状態の放射線処置を媒介するための、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドに関する。
1つの態様において、本発明は、放射線処置を受けるまたは受けるであろう個体における悪性疾患または炎症性皮膚疾患を処置するための薬学的組成物を調製するための、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドの使用に関する。
1つの態様において、本発明は、放射線処置と組み合わせて悪性疾患または炎症性皮膚疾患を処置するための薬学的組成物を調製するための、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドの使用に関する。
1つの態様において、本発明は、臨床状態の放射線処置を媒介するための薬学的組成物を調製するための、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドの使用に関する。
1つの態様において、本発明は、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドの治療有効量を、その必要がある被験体に投与する段階、および被験体を放射線処置に供する段階を含む、悪性疾患または炎症性皮膚疾患を処置するための方法に関する。
1つの態様において、本発明は、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドの治療有効量を、その必要がある被験体に投与する段階、および被験体を放射線処置に供する段階を含む、臨床状態の放射線処置を媒介するための方法に関する。
1つの態様において、本発明は、薬剤として使用するための、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドおよびソラレンを1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と共に含むパーツ（parts）のキットに関する。
1つの態様において、本発明は、悪性疾患または炎症性皮膚疾患の処置における薬剤として使用するための、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドおよびソラレンを薬学的に許容される賦形剤と共に含むパーツのキットに関する。
1つの態様において、本発明は、放射線処置と組み合わせて悪性疾患または炎症性皮膚疾患の処置における薬剤として使用するための、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドおよびソラレンを薬学的に許容される賦形剤と共に含むパーツのキットに関する。
本発明は、悪性疾患または炎症性皮膚疾患を処置するためのパーツの薬学的キットの調製における、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドおよびソラレンの使用に関する。パーツのキットは、複数回剤形または単位剤形でCD4結合ペプチドを含んでもよい。同様に、パーツのキットは、複数回剤形または単位剤形でソラレンを含んでもよい。適した単位用量を本明細書において以下に記述する。
1つの態様において、本発明は、悪性疾患または炎症性皮膚疾患の処置において放射線と組み合わせて使用するためのパーツの薬学的キットの調製における、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドおよびソラレンの使用に関する。パーツのキットは、複数回剤形または単位剤形でCD4結合ペプチドを含んでもよい。同様に、パーツのキットは、複数回剤形または単位剤形でソラレンを含んでもよい。適した用量を本明細書において以下に記述する。
発明の詳細な説明
本発明は、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドに関する方法および使用を提供する、または放射線および/またはソラレンと組み合わせてCD4結合ペプチドを使用することを含む、悪性疾患または炎症性皮膚疾患の処置を改善するためにCD4結合ペプチドを含むパーツのキットを提供する。
本発明は、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドに関する方法および使用を提供する、または放射線および/またはソラレンと組み合わせてCD4結合ペプチドを使用することを含む、悪性疾患または炎症性皮膚疾患の処置を改善するためにCD4結合ペプチドを含むパーツのキットを提供する。
1つの態様において、本発明は、放射線処置を受けるまたは受けるであろう個体における悪性疾患または炎症性皮膚疾患を処置するための抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドに関する。
1つの態様において、本発明は、放射線処置と組み合わせて悪性疾患または炎症性皮膚疾患を処置するための抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドに関する。
1つの態様において、本発明は、放射線処置を受けるまたは受けるであろう個体における悪性疾患または炎症性皮膚疾患を処置するための薬学的組成物の調製における、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドの使用に関する。
1つの態様において、本発明は、放射線処置と組み合わせて悪性疾患または炎症性皮膚疾患を処置するための薬学的組成物の調製における、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドの使用に関する。
1つの態様において、本発明は、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドの治療有効量を、その必要がある被験体に投与する段階、および被験体を放射線処置に供する段階を含む、悪性疾患または炎症性皮膚疾患の処置方法に関する。
1つの態様において、本発明は、薬剤として使用するための、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドおよびソラレンを薬学的に許容される賦形剤と共に含むパーツのキットに関する。
1つの態様において、本発明は、悪性疾患または炎症性皮膚疾患の処置における薬剤として使用するための、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドおよびソラレンを薬学的に許容される賦形剤と共に含むパーツのキットに関する。
1つの態様において、本発明は、放射線処置と組み合わせて悪性疾患または炎症性皮膚疾患の処置における薬剤として使用するための、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドおよびソラレンを薬学的に許容される賦形剤と共に含むパーツのキットに関する。
1つの態様において、本発明は、悪性疾患または炎症性皮膚疾患を処置するためのパーツの薬学的キットの調製における、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドおよびソラレンの使用に関する。パーツのキットは、複数回剤形または単位剤形でCD4結合ペプチドを含んでもよい。同様に、パーツのキットは、複数回剤形または単位剤形でソラレンを含んでもよい。適した単位剤形を、本明細書において以下に記述する。
1つの態様において、本発明は、悪性疾患または炎症性皮膚疾患の処置において放射線と組み合わせて使用するための薬学的キットの調製における、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドおよびソラレンの使用に関する。パーツのキットは、複数回剤形または単位剤形でCD4結合ペプチドを含んでもよい。同様に、パーツのキットは、複数回剤形または単位剤形でソラレンを含んでもよい。適した単位剤形を、本明細書において以下に記述する。
1つの態様において、本発明の化合物は、抗療性疾患を処置するために用いられる。1つの態様において、本発明の化合物は、別の処置様式（modality）に対して抵抗性である癌または炎症性皮膚疾患を処置するために用いられる。
本明細書において記述されるように、CD4結合ペプチドに関するペプチドという用語には、CD4に結合する任意の適したペプチドが含まれ、特に明記していなければ、または本文が矛盾しない限り、読者が、各タイプのそれぞれのアミノ酸ポリマー含有分子が有意な差に関連することができ、それによって本発明の個々の態様を形成することができることを認識する限り（例えば、多数のポリペプチド鎖で構成される抗体などのペプチドは、例えば一本鎖抗体、ペプチドイムノアドヘシン、または一本鎖免疫原性ペプチドとは有意に異なる）、ポリペプチドおよびタンパク質という用語と同義に用いられてもよい。したがって、本明細書におけるペプチドという用語は、一般的に、任意の適した大きさおよび組成の任意の適したペプチドを指すと理解すべきである（タンパク質分子におけるアミノ酸の数および関連する鎖の数に関して）。その上、本発明の方法についての文脈におけるペプチドおよび本明細書に記述される組成物は、特に明記していなければ、または本文と矛盾しない限り、天然に存在しないおよび/または非Lアミノ酸残基を含んでもよい。
本明細書においてさらに考察されるように、特に明記していなければ、または本文と矛盾しない限り、ペプチドという用語（およびポリペプチドおよび/またはタンパク質という用語の個々の態様として考察される場合）はまた、誘導体化ペプチド分子を含む。簡単に説明すると、本発明の文脈において、特に明記していなければ、または本文と矛盾しない限り、誘導体は、ペプチドのアミノ酸残基の1つまたは複数が化学的に改変されている（例えば、アルキル化、アシル化、エステル形成、またはアミド形成によって）、または1つもしくは複数の非アミノ酸有機および/または無機の原子もしくは分子置換基（例えば、ポリエチレングリコール（PEG）基、脂肪親和性置換基（任意で、β-アラニン、γ-アミノ酪酸（GABA）、L/D-グルタミン酸、コハク酸等のようなスペーサー残基または基によってペプチドのアミノ酸配列に連結してもよい）、蛍光体、ビオチン、放射性核種等）に会合している、および同様にもしくはまたは非必須、天然に存在しない、および/または非Lアミノ酸残基を含んでもよい、ペプチドである（しかし、この場合も、そのような誘導体はそれ自身、および自発的に、本発明の独立した特色であると見なされてもよく、ペプチドの意味にそのような分子を含めることは、本発明を記述する場合の簡便さのためであり、裸のペプチドとそのような誘導体とのあいだのいかなる種類の同等性も暗示するわけではない）。そのようなアミノ酸残基の非制限的な例には、例えば2-アミノアジピン酸、3-アミノアジピン酸、β-アラニン、β-アミノプロピオン酸、2-アミノ酪酸、4-アミノ酪酸、6-アミノカプロン酸、2-アミノヘプタン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノイソ酪酸、2-アミノピメリン酸、2,4-ジアミノ酪酸、デスモシン、2,2'-ジアミノピメリン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、N-エチルグリシン、N-エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロイソロイシン、N-メチルグリシン、N-メチルイソロイシン、6-N-メチルリジン、N-メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、およびスタチン水素添加アミノ酸が含まれる。
CD4結合ペプチドは、CD4に関連する生理的効果を誘導、促進、増強、および/またはそうでなければ調節するために；ELISA、ウェスタンブロット、または本明細書において記述されるおよび/または当技術分野において公知の他の同様に適したタンパク質結合技術によって検出されるために、および/または適切な期間（例えば、少なくとも約15分間、少なくとも約30分間、少なくとも約45分間、少なくとも約1時間、少なくとも約2時間、少なくとも約4時間、少なくとも約6時間、少なくとも約12時間、約1〜24時間、約1〜36時間、約1〜48時間、約1〜72時間、約1週間またはそれより長く）の後それに検出可能に結合するように、十分な期間、細胞および/または生理的条件下でCD4の部分に特異的に結合する任意のペプチドを指す。
CD4結合ペプチドは、CD4に特異的に結合するペプチドである。本発明に従って用いるためのCD4結合ペプチドは、合成による産生または組換えによる産生などの当技術分野において公知の任意のペプチド調製法によって調製されてもよい。
CD4結合抗体、または抗CD4抗体もしくはその機能的同等物は、当技術分野において公知の任意の型の抗体であってもよく、例えば哺乳動物に由来する本来の抗体または一本鎖抗体、ダイアボディ、一価抗体、またはヒトCD4のようなCD4に特異的に結合することができる抗体断片を含むハイブリッドのような合成抗体であってもよい。さらに、抗体は、モノクローナル抗体または人工ポリクローナル抗体の混合物であってもよい。
このように本発明において用いることが企図される抗体は、本来の抗体、免疫グロブリン全体、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、および類似の断片のような抗体断片、可変ドメイン相補性決定領域（CDR）を含む一本鎖抗体、ダイアボディ、ならびに本明細書において用いられるように、その全てが「抗体」という広い用語に入る多様な任意の型となりうる。抗体はまた、本明細書において用いられるように、「抗体」という広い用語においてマウス、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体であってもよい。
本明細書において用いられるように、「本来の抗体」という用語は、天然において見いだされる抗体の構造と類似の構造の抗体に適用される。本発明に従って用いられる本来の抗体は、その基本構築ブロック、免疫グロブリンの襞またはドメインが免疫系および他の生体認識系の多くの分子において様々な型で用いられる、免疫グロブリンと呼ばれる血漿タンパク質ファミリーに属する。典型的な免疫グロブリンは、可変領域として知られる抗原結合領域と、それぞれの抗体（サブ）クラスに関して定常領域として知られる非変化領域とを含む4つのペプチド鎖を有する。
本明細書において用いられるように、本来の抗体および免疫グロブリンは通常、2つの同一の軽（L）鎖および2つの同一の重（H）鎖で構成される、約150,000ダルトンのヘテロ4量体糖タンパク質である。典型的に、それぞれの軽鎖は、1つまたは複数の共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結しており、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖により変化する。それぞれの重鎖および軽鎖はまた、鎖内ジスルフィド架橋によって一定の間隔を有する。それぞれの重鎖は、一端に可変ドメイン（VH）を有し、その後に多数の定常ドメインを有する。それぞれの軽鎖は、一端に可変ドメイン（VL）を有し、他の一端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと対を形成し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと対を形成する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変ドメインのあいだで界面を形成すると考えられている（Novotny J, & Haber E. Proc Natl Acad Sci USA. 82(14):4592-6, 1985）。
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割付されうる。免疫グロブリンには少なくとも5つの主要なクラス：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4；IgA1およびIgA2にさらに分割されうる。異なるクラスの免疫グロブリンをコードする重鎖定常遺伝子セグメントはそれぞれ、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、およびミュー（μ）と呼ばれる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる2つの明らかに異なるタイプの1つに割付することができる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。
抗体の可変ドメインの状況における「可変」という用語は、可変ドメインの特定の部分が抗体の配列において広く異なるという事実を指す。可変ドメインは、結合のためであり、その特定の抗原に関するそれぞれの特定の抗体の特異性を決定する。しかし、その多様性は抗体の可変ドメインを通して均一に分布していない。多様性は、軽鎖および重鎖可変ドメインの双方における超可変領域として知られる相補性決定領域（CDR）と呼ばれる3つのセグメントに集中している。
可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（FR）と呼ばれる。本来の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、4つのFR領域を含み、これらは主としてβ-シート立体配置をとり、3つのCDRによって接続し、これがβ-シート構造の部分を接続するおよび場合によってはβ-シート構造の一部を形成するループを形成する。それぞれの鎖におけるCDRは、FR領域によって近位に存在するように保持され、他の鎖からのCDRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接関係していないが、抗体依存的細胞障害性における抗体の参加のような、様々なエフェクター機能を示す。
「抗体断片」という用語は、完全長の一部、一般的に抗原結合領域または可変領域を指す。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2断片が含まれる。抗体のパパイン消化によって、Fab断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合断片が産生され、それぞれは、単一の抗原結合部位と、その容易な結晶化能によりそのように呼ばれる残りの「Fc断片」とを有する。ペプシン消化は、抗原をクロスリンクすることができる2つの抗原結合断片と、残りの他の断片（pFc'と呼ばれる）とを有するF(ab')2断片を生じる。さらなる断片には、ダイアボディ、直線状抗体、一本鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多重特異的抗体が含まれうる。
「抗体断片」という用語は、本明細書において「抗原結合断片」という用語と互換的に用いられる。
抗体断片は、その抗原に対するいくつかの結合能を保持する。抗体断片のいくつかのタイプを以下に定義する：
（1）Fab断片は、抗体分子の一価の抗原結合断片を含む断片である。Fab断片は、酵素パパインによる抗体全体の消化によって産生され、無傷の軽鎖と1つの重鎖の一部を生じる。
（2）Fab'は、ペプシンによる抗体全体の処置後に還元され、無傷の軽鎖と重鎖の一部を生じることによって得られうる抗体分子の断片である。抗体分子あたり2個のFab'断片が得られる。Fab'断片は、抗体のヒンジ領域からの1つまたは複数のシステインを含む、重鎖CH1ドメインのカルボキシル末端で数個の残基の付加によりFab断片とは異なる。
（3）(Fab')2は、酵素ペプシンによる抗体全体の処置後に還元を行わずに得ることができる抗体断片である。
（4）F(ab')2は、2つのFab'断片が2つのジスルフィド結合によって結合した二量体である。
（1）Fab断片は、抗体分子の一価の抗原結合断片を含む断片である。Fab断片は、酵素パパインによる抗体全体の消化によって産生され、無傷の軽鎖と1つの重鎖の一部を生じる。
（2）Fab'は、ペプシンによる抗体全体の処置後に還元され、無傷の軽鎖と重鎖の一部を生じることによって得られうる抗体分子の断片である。抗体分子あたり2個のFab'断片が得られる。Fab'断片は、抗体のヒンジ領域からの1つまたは複数のシステインを含む、重鎖CH1ドメインのカルボキシル末端で数個の残基の付加によりFab断片とは異なる。
（3）(Fab')2は、酵素ペプシンによる抗体全体の処置後に還元を行わずに得ることができる抗体断片である。
（4）F(ab')2は、2つのFab'断片が2つのジスルフィド結合によって結合した二量体である。
Fvは、完全な抗原認識および結合部位を含む小さい抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合によって会合した1つの重鎖と1つの軽鎖可変領域からなる（VH-VL二量体）。それぞれの可変ドメインの3つのCDRがVH-VL二量体の表面上で抗原結合部位を定義するように相互作用するのはこの立体配置のためである。集合的に6つのCDRは、抗体に対して抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または、抗原に関して特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分）であっても、親和性はしばしば全結合部位より低いものの、抗原の認識および結合能を有しうる。抗原の認識には、単一のCDR、特にCDR3ドメイン、最も特に重鎖のCDR3ドメインで十分でありうる（例えば、Deng and Notkins, 2000, Clin. Exp. Immunol. 119:69-76を参照されたい）。このように、抗体の抗原結合断片が、単一の可変ドメイン、単一のCDRでさえ、例えば1つまたは複数のコピーの重鎖のCDR3のような単一のCDR3でさえ含んでもよいことは、本発明に含まれる。
一本鎖抗体（「SCA」）は、遺伝的に融合した一本鎖分子として適したポリペプチドリンカーによって連結した軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝子操作分子として定義される。そのような一本鎖抗体はまた、「一本鎖Fv」または「sFv」抗体断片と呼ばれる。一般的に、Fvポリペプチドは、それによってsFvが抗原結合のための所望の構造を形成することができる、VHドメインとVLドメインのあいだにポリペプチドリンカーを含む。sFvに関する論評に関しては、Pluckthun in "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" 113, 269-315 Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, NY, 1994を参照されたい。
本発明に従って用いられる抗体はまたダイアボディであってもよい。「ダイアボディ」は、同じポリペプチド鎖において軽鎖可変ドメイン（VL）に接続された重鎖可変ドメイン（VH）を含む（VH-VL）、2つの抗原結合部位を有する低分子抗体断片を指す。同じ鎖上の2つのドメイン間の対形成を許容するには短すぎるリンカーを用いることによって、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと強制的に対形成して、2つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディは、例えば、EP 404097；WO 93/11161、およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 90, 6444-6448 (1993)においてより詳細に記述されている。
本発明は、CD4に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の双方ならびに以下の少なくとも1つまたは複数、例えば、以下の少なくとも2つ、例えば以下の少なくとも3つなど、例えば、以下の少なくとも4つ、例えば以下の少なくとも5つなど、例えば、以下の少なくとも6つ、例えば以下の少なくとも7つなど、例えば、以下の少なくとも8つ、例えば以下の全てなどを有するその抗原結合断片を企図する：
−p56lckによるα-カゼインのリン酸化の誘導、
−p56lck自己リン酸化の誘導、
−阻害性アダプター分子Dok-1および/またはSHIP-1および/またはSHIP-2のリン酸化の誘導
−p56lck媒介Dok-1リン酸化の誘導
−PKB/Akt経路の阻害
−TCRからのCD4の隔離
−p53発現の増加および/またはアップレギュレーション
−細胞周期のG1期の停止または延長の誘導
−放射線に対するCD4+細胞、好ましくはCD4+ T細胞の感受性の増加。
−p56lckによるα-カゼインのリン酸化の誘導、
−p56lck自己リン酸化の誘導、
−阻害性アダプター分子Dok-1および/またはSHIP-1および/またはSHIP-2のリン酸化の誘導
−p56lck媒介Dok-1リン酸化の誘導
−PKB/Akt経路の阻害
−TCRからのCD4の隔離
−p53発現の増加および/またはアップレギュレーション
−細胞周期のG1期の停止または延長の誘導
−放射線に対するCD4+細胞、好ましくはCD4+ T細胞の感受性の増加。
ポリクローナル抗体の調製は、当業者に周知である。例えば参照により本明細書に組み入れられる、Green et al. "Production of Polyclonal Antisera", in: Immunochemical Protocols (Manson, ed.), pages 1-5 (Humana Press, 1992)；Coligan, et al., "Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats Mice and Hamsters" in Current Protocols in Immunology, section 2.4.1を参照されたい。
モノクローナル抗体の調製も同様に、通常どおりである。例えば、Kohler & Milstein, Nature 256, 495-497 (1975)；Coligan et al.,、前記 sections 2.5.1-2.6.7；およびHarlow, et al., in "Antibodies: A Laboratory Manual", page 726, Cold Spring Harbor Pub. (1988)を査証されたい。モノクローナル抗体は、十分に確立された多様な技術によってハイブリドーマ培養から単離および精製することができる。そのような単離技術には、プロテイン-Aセファロースによるアフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。例えば、Coligan et al.,、前記 sections 2.7.1-2.7.12およびsections 2.9.1-2.9.3；Barnes, et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)" in: Methods in Molecular Biology, 10, 79-104, Humana Press, NY (1992)を参照されたい。
モノクローナル抗体のインビトロおよびインビボ操作法は当業者に周知である。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、Kohler & Milstein, Nature 256, 495-497 (1975)によって初めて記述されたハイブリドーマ法によって作製してもよく、または組換え法によって作製してもよい。本発明と共に用いるためのモノクローナル抗体はまた、Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)ならびにMarks et al., J Mol Biol 222, 581-597 (1991)において記述される技術を用いるファージ抗体ライブラリから単離してもよい。別の方法は、ヒト特異的および認識可能な配列を含む抗体を産生するために組換え手段によってモノクローナル抗体をヒト化する方法を伴う。論評に関して、Holmes et al., J Immunol 158. 2192-2201 (1997)およびVaswani, et al., Annals Allergy, Asthma & Immunol 81, 105-115 (1998)を参照されたい。
本明細書において用いられるように、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわちその集団を含む個々の抗体は、微量存在しうる潜在的な天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位またはエピトープに対して向けられる。さらに、典型的に異なる決定基（エピトープ）に対して向けられる異なる抗体が含まれる通常のポリクローナル抗体調製法とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上で単一の決定機に対して向けられる。その特異性のほかに、モノクローナル抗体は、それらがハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンが混入しないという点において有用である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示すのであって、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。
本明細書において記述されるモノクローナル抗体には、重鎖および/または軽鎖の一部が特定の種に由来する抗体における対応する配列と同一もしくは相同である、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属するが、鎖の残りは、別の種に由来する抗体における対応する配列と同一もしくは相同であるか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにそれらが所望の生物活性を示す限り、そのような抗体の断片が含まれる（US 4816567；Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984)）。
1つの態様において、本明細書において記述される抗体には、抗体依存的細胞性細胞障害性（ADCC）を活性化することができる抗体が含まれる。さらなる態様において、本明細書において記述される抗体には、ナチュラルキラー（NK）細胞を活性化することができる抗体が含まれる。1つの態様において、本明細書において記述される抗体には、NK細胞上のFcγRIII（CD16）受容体と相互作用することができる抗体が含まれる。1つのさらなる態様において、本明細書において記述される抗体はIgG1またはIgG3サブクラスである。
抗体断片を作製する方法も同様に、当技術分野において公知である（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Harlow, et al., in "Antibodies: A Laboratory Manual", page 726, Cold Spring Harbor Pub. (1988)を参照されたい）。本発明の抗体断片は、抗体のタンパク質分解加水分解によって、または断片をコードするDNAの大腸菌における発現によって調製することができる。抗体断片は、抗体全体のペプシンまたはパパイン消化という通常の方法によって得ることができる。例えば、抗体断片は、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって産生されて、F(ab')2と呼ばれる5S断片を提供することができる。この断片をさらに、チオール還元剤、および任意でジスルフィド結合の切断によって生じるスルフヒドリル基のブロッキング基を用いて切断して、3.5S Fab'一価断片を生成することができる。または、ペプシンを用いる酵素的切断は、2つの一価Fab'断片およびFc断片を直接生成する。これらの方法は、例えばUS 4036945およびUS 4331647、ならびに本明細書において含まれる参考文献に記述されている。これらの特許はその全内容が参照により本明細書に組み入れられる。抗体断片はまた、組換え技術を用いて調製してもよい。
重鎖を分離して一価の軽鎖断片、断片のさらなる切断を形成するような抗体を切断する他の方法、または他の酵素的、化学的、もしくは遺伝的技術も同様に、断片が無傷の抗体によって認識される抗原に結合する限り、用いてもよい。例えば、Fv断片は、VHおよびVL鎖の会合を含む。この会合は非共有結合であってもよく、または可変鎖は分子間ジスルフィド結合によって連結することができ、もしくはグルタルアルデヒドのような化学物質によってクロスリンクすることができる。例えば、Fv断片は、ペプチドリンカーによって接続されたVHおよびVL鎖を含んでもよい。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（sFv）は、オリゴヌクレオチドによって接続されるVHおよびVLドメインをコードするDNA配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子を発現ベクターに挿入して、次にこれを大腸菌のような宿主細胞に導入する。組換え形宿主細胞は、2つのVドメインを架橋するリンカーペプチドによって単一のポリペプチド鎖を合成する。sFvを産生する方法は、例えば、Whitlow, et al., in: "Methods: A Companion to Methods in Enzymology", 2, 97 (1991)；Bird et al., Science 242, 423-426 (1988), US 4946778；およびPack et al., BioTechnology 11, 1271-1277 (1993)において記述される。
抗体断片の別の型は、単一の相補性決定領域（CDR）、例えばCDR3をコードするペプチドである。CDRペプチド（「最小の認識単位」）はしばしば、抗原の認識および結合に関係している。CDRペプチドは、関心対象抗体のCDRをコードする遺伝子をクローニングまたは構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えばポリメラーゼ連鎖反応を用いて、抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成することによって調製される。例えば、Larrick, et al., "Methods: a Companion to Methods in Enzymology", Vol. 2, page 106 (1991)を参照されたい。
本発明はまた、非ヒト（例えばマウスまたはラット）抗体のヒト型またはヒト化型を用いることを企図する。そのようなヒト化抗体は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはエピトープ認識配列のような非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含むその断片（例えばFv、Fab、Fab'、F(ab')2、または抗体の他の抗原結合サブ配列など）である。たいていの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの1つまたは複数の相補性決定領域（CDR）からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）の1つまたは複数のCDRからの残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。
1つの態様において、モノクローナル抗体は、「ヒト」抗体（免疫グロブリン）である。ヒト抗体は例えば、トランスジェニック非ヒト動物を用いて調製してもよい。そのような動物を用いて異種抗体を産生し、有用な方法は当業者に公知である。機能的異種免疫グロブリン導入遺伝子を保有するトランスジェニック動物の構築は、それによって自己抗原に反応する抗体が産生される1つの方法である。第一に、B細胞源として作用する免疫動物は、提示された抗原に対して免疫応答を行うはずである。動物に免疫応答を行わせるために、提示される抗原は異物でなければならず、動物は、抗原に対して寛容であってはならない。本発明に従って、抗原はCD4、例えばヒトCD4もしくはその断片、またはCD4の少なくとも1つのエピトープを含む（ポリ）ペプチドである。ヒト抗体を調製するための適した方法の例は、例えばWO 97/13852の80〜98ページの「特定の好ましい態様」において、および本明細書に含まれる参考文献に記述されている。1つの態様において、本発明は、CD4に結合することができるモノクローナルヒト抗体に関する。
いくつかの状況において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基に置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体または輸入されたCDRもしくはフレームワーク配列のいずれにも見いだされない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体の性能をさらに精密にして最適にするために行われる。しばしば、ヒト化抗体は、CDR領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、FR領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域である、少なくとも1つ、典型的に2つの可変ドメインの実質的に全てを含むと考えられる。ヒト化抗体は任意で、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部、典型的にヒト免疫グロブリンの一部を含むと考えられる。さらなる詳細に関しては、Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986)；Reichmann et al., Nature 332, 323-329 (1988)；Presta, Curr Op Struct Biol 2, 593-596 (1992)；Holmes et al., J Immunol 158, 2192-2201 (1997)およびVaswani 1998、前記を参照されたい。
抗体の作製は、天然または組換え型ヒトCD4ポリペプチドまたはその断片を抗原として用いて、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生するための当技術分野において任意の標準的な方法によって得てもよい。1つの態様において、そのような抗体は、天然に存在するまたは組換えによって産生されたCD4、CD4の断片、または本来のCD4において見いだされる少なくとも1つのエピトープを含む（ポリ）ペプチドを用いて作製してもよい。該CD4は例えばヒトCD4であってもよい。
1つの態様において、本発明は、細胞周期の調節と共にCD4の生物機能を阻害することができる、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドに関する。
1つの態様において、本発明は、本明細書に記述のCD4上の特異的エピトープに結合することができ、それによって細胞周期調節に関連したCD4タンパク質の機能を阻害することができる、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドに関する。
「エピトープ」という用語は、その抗原に向けられる抗体によって認識されるアミノ酸の特異的基（抗原分子上の）を意味する。「エピトープ」という用語は、「抗原決定基」という用語の同義語である。エピトープは、隣接するアミノ酸配列内といった近位に存在する、または抗原のアミノ酸配列の遠位部分に存在するが、タンパク質の折りたたみにより互いに近づいている、例えばアミノ酸残基4、5、6、7、8個などの、3個またはそれより多いアミノ酸残基を含んでもよい。
本発明に従って用いられる抗体は、ヒトCD4のようなCD4のエピトープに結合することができる（ヒトCD4の配列に関しては、例えばMaddon PJ et al., Cell. 42(1), 93-104 (1985)を参照されたい）。1つの態様において、エピトープは、CD4の細胞外ドメインに存在する。1つの態様において、エピトープは、TCR結合に関係するCD4のドメインに存在する。1つの態様において、抗体は、CD4に対する結合に関してLeu3Aと競合する（Fishwild et al., Nat Biotechnol. 14(7), 845-51 (1996)）。非抗体CD4結合ペプチドも同様に、そのようなエピトープに結合することができうる。
本明細書において用いられるように、CD4に対する特異的結合は、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドが、少なくとも1×10-7 Mの親和性で、例えば、少なくとも1×10-8 M、例えば1×10-9 Mなど、例えば1×10-10 Mの親和性でCD4に結合する能力を指す。
「CD4に優先的に結合する」という用語は、本明細書において、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドが、上記の親和性でCD4に結合する特性を指し、CD4に対する親和性は、CD4以外の非特異的抗原（例えば、BSA、カゼイン）またはCD4に近縁のポリペプチドに対するその親和性より少なくとも2倍、例えば少なくとも5倍大きく、例えば少なくとも10倍大きい。
「CD4に選択的に結合する」という用語は、本明細書において抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドが、上記の親和性でCD4に結合する特性を指し、CD4に関する親和性は、任意の他のポリペプチドに関するその親和性より少なくとも2倍、例えば少なくとも5倍大きく、例えば少なくとも10倍大きい。
本発明は、細胞周期の調節に関連する活性のような、CD4、例えばヒトCD4の少なくとも1つの生物活性を調節することができる、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドに関する。1つの態様において、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドは、本明細書において先に述べた「発明の概要」の章で言及した活性の1つまたは複数を行うことができる。
本発明の文脈において「調節する」という用語は、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドが、ヒトCD4の生物活性を増強または減弱させることができることを意味する。1つの態様において、本発明は、細胞周期のG1期における細胞の延長または停止を誘導するような、CD4の少なくとも1つの生物活性を調節することができる、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドを特徴とする。1つの態様において、本発明に従って用いるための抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドは、細胞周期のG1期の延長または停止を誘導することができる。これは、以下の段階を含む方法によって決定されてもよい：
1）CD4+細胞集団をCD4結合ペプチドに接触させる段階；
2）G1期の細胞数を決定する段階；および
3）該細胞数を、CD4結合ペプチドに接触させていない集団におけるG1期の細胞数と比較する段階であって、G1における延長または停止が、CD4結合ペプチドに接触させた細胞集団のG1における細胞数として定義される段階。
1）CD4+細胞集団をCD4結合ペプチドに接触させる段階；
2）G1期の細胞数を決定する段階；および
3）該細胞数を、CD4結合ペプチドに接触させていない集団におけるG1期の細胞数と比較する段階であって、G1における延長または停止が、CD4結合ペプチドに接触させた細胞集団のG1における細胞数として定義される段階。
G1期における細胞数は、異なる多数の方法によって、例えば2n DNA含有量を有する細胞はG1に存在すると言われる、DNAを染色することによって決定されてもよい。同様に、G1の1つまたは複数のマーカー、すなわち細胞周期のG1期に主に存在するタンパク質または他の化合物の有無を決定することも可能である。
1つの態様において、細胞は腫瘍細胞である。1つの態様において、腫瘍細胞は癌細胞または血液の悪性細胞である。癌細胞は原発癌または転移癌のいずれに由来してもよい。特に細胞は、「臨床状態」の章において本明細書において以下に記述される任意の癌に由来する細胞であってもよい。
本発明に従って用いられる抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドは、外因性のp56lck基質としてのα-カゼインのp56lckによるリン酸化を誘導することができうる。α-カゼインのリン酸化の誘導は、例えば以下の段階を含む方法によって決定されてもよい：
1）CD4+細胞をCD4結合ペプチドに接触させる段階；
2）該細胞の溶解物を調製する段階；
3）溶解物をα-カゼインに接触させる段階；
4）α-カゼインのリン酸化を決定する段階；および
5）該リン酸化を、CD4結合ペプチドに接触していない別の細胞から調製された溶解物を用いて得られたリン酸化と比較する段階であって、リン酸化の誘導が、CD4結合ペプチドに接触させた細胞からの溶解物により得られたより高い程度のリン酸化として定義される段階。
1）CD4+細胞をCD4結合ペプチドに接触させる段階；
2）該細胞の溶解物を調製する段階；
3）溶解物をα-カゼインに接触させる段階；
4）α-カゼインのリン酸化を決定する段階；および
5）該リン酸化を、CD4結合ペプチドに接触していない別の細胞から調製された溶解物を用いて得られたリン酸化と比較する段階であって、リン酸化の誘導が、CD4結合ペプチドに接触させた細胞からの溶解物により得られたより高い程度のリン酸化として定義される段階。
方法は任意で、溶解物からの複合体を含むCD4と共にCD4を単離する段階を含んでもよい。この段階は、例えば段階2および3のあいだで行ってもよい。これは例えば、CD4に対する抗体を用いて通常の免疫沈降技術によって行ってもよい。そのような段階により、CD4に関連するキナーゼの活性のみが確実に決定されうる。
リン酸化は、任意の従来の方法によって、リン酸化特異的抗体を用いることによって、または放射活性標識リン酸塩、例えば32Pγ-ATPからのリン酸塩を用いることによって決定してもよい。
α-カゼインのリン酸化を決定する1つの方法は、本明細書において以下の実施例2において開示される。
本発明に従って用いられる抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドは、p56lck自己リン酸化を誘導することができうる。所定のCD4結合ペプチドによるp56lck自己リン酸化の誘導は、以下の段階を含む方法によって決定してもよい：
1）CD4+細胞をCD4結合ペプチドに接触させる段階；
2）細胞の溶解物を調製する段階；
3）p56lckを含む複合体を単離する段階；
4）p56lckのリン酸化を決定する段階；および
5）該リン酸化を、CD4結合ペプチドに接触していない別の細胞から調製された溶解物を用いて得られたリン酸化と比較する段階であって、リン酸化の誘導が、抗体に接触させた細胞からの溶解物により得られたより高い程度のリン酸化として定義される段階。
1）CD4+細胞をCD4結合ペプチドに接触させる段階；
2）細胞の溶解物を調製する段階；
3）p56lckを含む複合体を単離する段階；
4）p56lckのリン酸化を決定する段階；および
5）該リン酸化を、CD4結合ペプチドに接触していない別の細胞から調製された溶解物を用いて得られたリン酸化と比較する段階であって、リン酸化の誘導が、抗体に接触させた細胞からの溶解物により得られたより高い程度のリン酸化として定義される段階。
p56lckを含む複合体の単離は、多数の異なる方法によって、例えば、p56lckに対して特異的な抗体を用いる免疫沈降によって、またはp56lckと会合することが公知のタンパク質、例えばCD4に対する抗体を用いることによって、得てもよい。リン酸化は、上記のように決定してもよい。p56lckの自己リン酸化を決定するための1つの方法は、本明細書において以下の実施例2において記述される。
本発明に従って用いられる抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドは、p53発現を増加させるおよび/またはアップレギュレートすることができうる。所定のCD4結合ペプチドによるp53発現の増加および/またはアップレギュレーションは、以下の段階を含む方法によって決定されてもよい：
1）CD4+細胞をCD4結合ペプチドに接触させる段階；
2）p53の発現を決定する段階；および
3）該発現を、CD4結合ペプチドに接触していない別の細胞におけるp53の発現と比較する段階であって、p53の発現の増加および/またはアップレギュレーションが、CD4結合ペプチドに接触させた細胞におけるより高いレベルのp53発現として定義される段階。
1）CD4+細胞をCD4結合ペプチドに接触させる段階；
2）p53の発現を決定する段階；および
3）該発現を、CD4結合ペプチドに接触していない別の細胞におけるp53の発現と比較する段階であって、p53の発現の増加および/またはアップレギュレーションが、CD4結合ペプチドに接触させた細胞におけるより高いレベルのp53発現として定義される段階。
p53発現は、従来の多くの方法によって決定してもよい。これは、例えばウェスタンブロッティングによってp53に対する抗体を用いて行ってもよい。
本発明に従って用いられる抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドは、Dok-1および/またはSHIP-1および/またはSHIP-2のリン酸化を誘導することができうる。所定のCD4結合ペプチドによるリン酸化の誘導は、以下の段階を含む方法によって決定してもよい：
1）CD4+細胞をCD4結合ペプチドに接触させる段階；
2）該細胞の溶解物を調製する段階；
3）Dok-1および/またはSHIP-1および/またはSHIP-2を含む複合体を単離する段階；
4）Dok-1および/またはSHIP-1および/またはSHIP-2のリン酸化を決定する段階；ならびに
5）該リン酸化を、CD4結合ペプチドに接触していない別の細胞から調製した溶解物を用いて得られたリン酸化と比較する段階であって、リン酸化の誘導が、CD4結合ペプチドに接触させた細胞からの溶解物により得られたより高い程度のリン酸化として定義される段階。
1）CD4+細胞をCD4結合ペプチドに接触させる段階；
2）該細胞の溶解物を調製する段階；
3）Dok-1および/またはSHIP-1および/またはSHIP-2を含む複合体を単離する段階；
4）Dok-1および/またはSHIP-1および/またはSHIP-2のリン酸化を決定する段階；ならびに
5）該リン酸化を、CD4結合ペプチドに接触していない別の細胞から調製した溶解物を用いて得られたリン酸化と比較する段階であって、リン酸化の誘導が、CD4結合ペプチドに接触させた細胞からの溶解物により得られたより高い程度のリン酸化として定義される段階。
Dok-1および/またはSHIP-1および/またはSHIP-2を含む複合体の単離は、異なる多くの方法によって得てもよく、例えばDok-1および/またはSHIP-1および/またはSHIP-2に結合する化合物、またはDok-1および/またはSHIP-1および/またはSHIP-2に会合するタンパク質に結合する化合物を用いて沈殿によって得てもよい。該化合物は抗体であってもよい。しかし、化合物はまた、例えばSH2であってもよい。リン酸化は先に記述されたように決定してもよい。Dok-1および/またはSHIP-1リン酸化を決定するための1つの方法は、本明細書において以下の実施例2に記述される。
本発明に従って用いられる抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドは、CD4+ T細胞のようなCD4+細胞、例えばヒトCD4+ T細胞の放射線に対する感受性を増加させることができうる。これは、以下の段階を含む方法によって決定してもよい：
1）CD4+ T細胞のようなCD4+細胞、例えばヒトCD4+ T細胞をCD4結合ペプチドに接触させる段階；
2）細胞を放射線に供する段階；
3）細胞のアポトーシスのような、細胞死を決定する段階；および
4）該細胞死を、CD4結合ペプチドに接触していない細胞において得られた細胞死と比較する段階であって、感受性の増加が、CD4結合ペプチドに接触した細胞におけるアポトーシスのようなより高い程度の細胞死として定義される。
1）CD4+ T細胞のようなCD4+細胞、例えばヒトCD4+ T細胞をCD4結合ペプチドに接触させる段階；
2）細胞を放射線に供する段階；
3）細胞のアポトーシスのような、細胞死を決定する段階；および
4）該細胞死を、CD4結合ペプチドに接触していない細胞において得られた細胞死と比較する段階であって、感受性の増加が、CD4結合ペプチドに接触した細胞におけるアポトーシスのようなより高い程度の細胞死として定義される。
放射線は、UVのような任意の放射線であってもよい。アポトーシスを決定するための多数の適した方法が当業者に公知である。適した方法の非制限的な例は、アネキシン-V染色法、カスパーゼ活性に関するアッセイ、カスパーゼ分解産物の存在に関する染色、3,3'-ジヘキシルオキサカルボシアニンヨウ化物による染色、または膜完全性アッセイである。放射線に対するCD4+細胞の感受性を決定するための方法の例は、本明細書において以下の実施例3、4、5および6において記述されている。
本発明に従って用いられる抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドは、1つの態様において、TCRからのp56lckの隔離を引き起こしうる。さらに、CD4結合ペプチドは、p56lckを通して負のシグナルを直接生成しうる。このように、本発明に従って用いられるCD4結合ペプチドはしばしば、TCRによるシグナル伝達の阻害を通して、おそらくTCRからのp56lckの隔離を通して、および同様に直接の阻害性のシグナル伝達を通して、T細胞シグナル伝達に及ぼすその阻害効果を媒介しうる。本発明の1つの態様において、CD4結合ペプチドは、p56lckキナーゼ活性化を引き起こすことができ、次にこれはDok-1および/またはSHIP-1リン酸化をもたらしうる。
本発明の1つの態様において、CD4結合ペプチドは、特許出願WO 97/13852において開示される抗CD4抗体の任意のペプチドである。例えば、抗体は、Leu 3a、RPA-TA、92-09A-4F7-A5-2、または92-09A-1D7-1-7-1のような、上記出願において記述されるようなCD4に結合することができる任意のマウス抗体であってもよい。92-09A-4f7-A5-2および92-09A-1D7-1-7-1は、ブダペスト条約の下でATCC Patent Culture Depositoryにおいてそれぞれ、寄託番号HB 11307およびHB 11308として寄託されている。1つの態様において、CD4結合ペプチドは、上記出願において記述されるように2C11-8、1F2、1E11、2E4、4D1 、6C1 、6G5、7G2、10C5、1Gl、1G2、2C5.1または4E4.2のようなヒト抗体である。 特に、2C5.1および4E4.2のVDJ接合部の配列は、上記出願において記述される。1つの態様において、CD4結合ペプチドは、上記出願において記述される6G5である。6G5のVHおよびVL配列を図1に示す。
本発明の1つの態様において。CD4結合ペプチドは、ザノリムマブ（GenMab, Denmark, Humax-CD4およびHM6Gとしても知られる（Fishwild et al., Clin Immunol. 92(2), 138-52 (1999)、およびWO 97/13852において記述される6G5と同じ））、ケリキシマブ（keliximab）（IDEC-CE9.1, IDECとしても知られる）、クレノリキシマブ（clenoliximab）（IDEC-151、IDECとしても知られる）、TNX/355（Hu-5A8, Tanox, Biogenとしても知られる）、TRX/1（TolerRx/Genentech）、IOT4a（13B8.2, Immunotechとしても知られる）、プリリキシマブ（priliximab）（cM-T412, Centocorとしても知られる）、ならびに4162W94（Glaxo）からなる群より選択される。本発明のいくつかの態様において、CD4結合ペプチドはヒト化またはヒト抗体である。このように、これらの態様において、抗体は、ザノリムマブ、TNX/355、TRX/1、IOT4a、および4162W94からなる群より選択されてもよい。本発明の1つの態様において、CD4結合ペプチドはザノリムマブである。
CD4結合ペプチドは、例えば、重鎖の少なくともCDR3、または例えば少なくとも1つの可変領域、例えばザノリムマブ、ケリキシマブ、クレノリキシマブ、TNX/355、TRX/1、IOT4a、プリリキシマブ、および4162W94からなる群より選択される、またはWO 97/13852において開示されるLeu 3a、RPA-TA、92-09A-4F7-A5-2、92-09A-1D7-1-7-1、2C11-8、1F2、1E11、2E4、4D1、6C1、6G5、7G2、10C5、1Gl、1G2、2C5.1および4E4.2からなる群より選択される抗体の双方の可変領域のような、少なくとも全てのCDRを含む、抗体の重鎖および/または軽鎖の少なくともVDJ接合部を含む任意の抗体であってもよいことも、同様に本発明に含まれる。
1つの態様において、本発明に従って用いられるCD4結合ペプチドは、ザノリムマブ、ケリキシマブ、クレノリキシマブ、TNX/355、TRX/1、IOT4a、プリリキシマブ、および4162W94からなる群より選択される、またはWO 97/13852において開示されるLeu 3a、RPA-TA、92-09A-4F7-A5-2、92-09A-1D7-1-7-1、2C11-8、1F2、1E11、2E4、4D1、6C1、6G5、7G2、10C5、1Gl、1G2、2C5.1および4E4.2からなる群より選択される抗体によって認識されるエピトープ、またはそれらの抗体によって認識されるエピトープと重なり合うエピトープに特異的に結合することができる、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドである。
当業者に利用可能な異なるアッセイを用いて、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチド（試験CD4結合ペプチドとも呼ばれる）が特定のモノクローナル抗体（参照抗体とも呼ばれる）と同じまたは重なり合うエピトープを認識するか否かを決定してもよい。例えば、アッセイは、以下の段階を伴う：
−参照抗体によって認識されるエピトープを含むCD4またはその断片を提供する段階。
−いずれかが検出可能な標識によって標識されている試験CD4結合ペプチドおよび参照抗体を該CD4に加える段階。または試験CD4結合ペプチドおよび参照抗体はいずれも、異なる検出可能な標識によって標識されてもよい。
−CD4で検出可能な標識の存在を検出する段階。
−それによって試験CD4結合ペプチドが参照抗体を置換することができるか否かを検出する段階。
−参照抗体によって認識されるエピトープを含むCD4またはその断片を提供する段階。
−いずれかが検出可能な標識によって標識されている試験CD4結合ペプチドおよび参照抗体を該CD4に加える段階。または試験CD4結合ペプチドおよび参照抗体はいずれも、異なる検出可能な標識によって標識されてもよい。
−CD4で検出可能な標識の存在を検出する段階。
−それによって試験CD4結合ペプチドが参照抗体を置換することができるか否かを検出する段階。
試験CD4結合ペプチドが参照抗体を置換することができる場合、試験CD4結合ペプチドは、参照抗体と同じまたは重なり合うエピトープを認識する。したがって、参照抗体が検出可能な標識によって標識される場合、CD4での低い検出可能なシグナルは、参照抗体の置換を示している。試験CD4結合ペプチドが検出可能な標識によって標識される場合、CD4での高い検出可能なシグナルは参照抗体の置換を示している。CD4断片は、例えば取り扱いを容易にするために固相支持体に固定してもよい。検出可能な標識は、酵素、放射活性同位元素、重金属、発色化合物、または蛍光化合物のような、任意の直接または間接的に検出可能な標識であってもよい。
本発明に従って用いられる抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドは、タンパク質および抗体の送達に関する医学の技術分野において公知の任意の方法によって患者に投与してもよい。抗体のようなペプチドは非経口投与に特に適している。非経口投与は、例えば注入または注射を含む、皮下、筋肉内、または静脈内投与による投与であってもよい。本発明の薬学的組成物は、代替の薬物送達アプローチも同様に用いる投与にとって適している（例えば、Langer, Science, 249, 1527-1533 (1990)を参照されたい）。
非経口投与のための薬学的組成物は、通常抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチド、例えば水性担体のような許容される担体に溶解したモノクローナル抗体の溶液を含む。多様な水性担体、例えば水、緩衝液、0.4％生理食塩液、0.3％グリシン等を用いることができる。これらの溶液は無菌的であり、一般的に微粒子物質を含まない。これらの組成物は従来の周知の滅菌技術によって滅菌してもよい。これらの組成物は、従来の周知の技術によってウイルス低減または多数のウイルス低減に供してもよい。組成物は、pH調節剤および緩衝剤、等張性調節剤等のような、生理的条件を模倣するために必要に応じて薬学的に許容される補助物質、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含んでもよい。これらの製剤における抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドの濃度は、幅広く変動してもよく、例えば重量で約0.5％未満、通常、約0.1％もしくは少なくとも約0.1％から1.5％もしくは2.0％もの量、またはさらにそれより多くてもよく、選択される特定の投与方式に従って、主に液体の容積、粘度等に基づいて選択されると考えられる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知または明らかであり、例えば参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences, 17th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1985)においてより詳細に記述される。
他の有用な製剤、例えば吸入剤およびエアロゾルは、鼻腔内および肺内投与に適している。
抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドは、中性または塩型として製剤化されてもよい。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（ペプチド化合物の遊離のアミノ基によって形成される）が含まれ、これらは塩酸もしくはリン酸のような無機酸によって、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等のような有機酸によって形成される。遊離のカルボキシル基によって形成される塩も同様に、例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または第二鉄等のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基に由来してもよい。
注射剤は通常、液体溶液または懸濁液、注射前に滅菌水のような液体における溶液または懸濁液として適した固体形態として調製される。調製物はまた、乳化されてもよい。活性成分はしばしば、薬学的に許容され、活性成分と適合性の賦形剤と混合される。適した賦形剤は、例えば水、生理食塩液、デキストロース、グリセロール、エタノール等およびその組み合わせである。さらに、望ましければ、調製物は、湿潤剤または乳化剤、塩、pH緩衝剤、または調製物の有効性または輸送を増強する物質のような補助物質の微量を含んでもよい。
本発明に従って用いるための抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドを含む組成物、またはそのカクテルは、悪性疾患、炎症性皮膚疾患の治療的処置のために、または臨床状態の放射線処置の媒介のために投与してもよい。治療応用において、組成物は、所望の治療結果が得られるように必要な用量および期間で有効な量で患者に投与される。本発明の文脈において、そのような量は、「治療有効量」であると定義される。抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドの治療有効量は、疾患の状態、個体の年齢、性別、および体重、ならびにCD4結合ペプチドが個体において所望の反応を誘発する能力などの要因に従って変化しうる。治療有効量はまた、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドの任意の毒性または有害な作用を、治療的に有益な効果が補って余りある量でもある。
本発明に従って用いられるCD4結合ペプチドの治療有効量は、当技術分野において公知であるように、臨床医によって決定されてもよい。例えば、局所塗布（topical）使用または局所使用の場合、CD4結合ペプチドの量は、1回全身治療の場合より低くてもよく、それによって起こりうる全身性の副作用（例えばCD4+細胞の全身性の枯渇など）が減弱または回避されうる。用量は例えば、20 mg〜2000 mgの範囲、例えば20 mg〜100 mgの範囲などであってもよく（例えば、約20 mg、約40 mg、約60 mg、約80 mgまたは約100 mgの量など）、または例えば、約150 mg、約200 mg、約250 mg、約300 mg、約350 mg、約400 mg、約450 mg、約500 mg、約550 mg、約600 mg、約650 mg、約700 mg、約750 mg、約800 mg、約850 mg、約900 mg、約950 mg、約1000 mg、約1050 mg、約1100 mg、約1150 mg、約1200 mg、約1250 mg、約1300 mg、約1350 mg、約1400 mg、約1450 mg、約1500 mg、約1550 mg、約1600 mg、約1650 mg、約1700 mg、約1750 mg、約1800 mg、約1850 mg、約1900 mg、約1950 mg、または約2000 mgの量であってもよい。一般的に、臨床医は、当技術分野において周知であるように、適した治療用量を確立するように設計された共通の実験を通して適した用量を決定することができると考えられる。
いくつかの態様に関して、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドは、局所に、例えば疾患部位への直接注射によって投与される。他の態様において、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドは、全身投与される。
本発明において用いるためのCD4結合ペプチドのいくつかは、十分に活性であるが、他のいくつかに関して、効果は調製物が薬学的に許容される添加剤および/または担体をさらに含む場合に増強されると考えられる。いくつかの場合において、その標的への活性物質の送達を促進する化合物を含めることは有利であると考えられる。
本発明の1つの態様において、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドは、放射線処置の前に少なくとも1回投与され、抗体は週に少なくとも1回投与される。
本発明の1つの態様において、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドは、放射線処置の前に2、3、4、5回またはそれより多く投与され、抗体は週に少なくとも1回投与される。
本発明の1つの態様において、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドは、放射線処置の開始と同時に投与される。
本発明の1つの態様において、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドは、放射線処置の開始後2、3、4、5回またはそれより多く投与され、抗体は週に少なくとも1回投与される。
本発明の1つの態様において、そのような持続時間における該CD4結合ペプチドの投与期間は治療的に有効であると考えられる。投与の持続時間は、例えば被験体の体重および年齢、処置される疾患、および疾患の進行期を含む、処置される被験体に依存する。CD4結合ペプチドの投与期間は、1〜48週の範囲、例えば4〜30週の範囲など、または例えば、8〜16週の範囲、例えば12週間などであってもよい。
本発明の1つの態様において、CD4結合ペプチドの投与は、治療的に有効である方法で数回繰り返してもよい。2回の連続処置のあいだの期間は、1〜200週の範囲、例えば4〜104週の範囲など、例えば、24〜52週の範囲であってもよい。
1つの態様において、本発明は、悪性疾患または炎症性皮膚疾患を含む、本発明において先に記述した任意の臨床状態などの臨床状態を処置するための、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドの投与と組み合わせた放射線処置の使用に関する。ソラレンおよび長波長紫外放射線（PUVA）、UVB、狭帯域UVB、高線量UVA、フォトフェレーシス、電子ビーム、またはx線のような多数の放射線処置を用いてもよい。1つの態様において、本発明は、ソラレンおよび長波長紫外放射線（PUVA）に関する。
本発明の1つの態様において、PUVAは、放射線処置として用いられる。ソラレン化合物は先に記述したように経口投与または局所塗布投与される。該ソラレンの経口投与は、先に記述したように、紫外線A（UVA）放射線処置の少なくとも約1時間前であって、該照射処置のわずか約3時間前のように行ってもよい。ソラレンを皮膚に直接適用する場合、紫外線A（UVA）放射線処置は、先に記述したように、例えば、1〜30分の範囲内、例えば1〜15分以内などに行ってもよい。PUVA処置は、1ヶ月に1〜10回処置、例えば1ヶ月に1〜7回処置など、例えば、1ヶ月に1〜5回処置、例えば1〜5回の週単位処置（weekly treatment）など、例えば、1〜3回の週単位処置、例えば1回の週単位処置などとして行う。1つの態様において、放射線処置は、CD4結合ペプチドの投与と同じ処置間隔で行われる。
本発明に従うPUVA放射線処置の際の光の強度は、患者に対する不要な損傷を回避するために最大放射線被曝量を制御するために注意を払って行われると考えられる。当業者は、適した光の強度を容易に決定することができると考えられる。紫外線に対する最大放射線被曝量を計算するための方法は、当技術分野において公知である。PUVA放射線処置は、長波長紫外線（UVA）を用いて、例えば、280〜440 nmの範囲、例えば320〜400 nmの範囲などの波長で行われると考えられる。
本発明に従う初回のUVA放射線処置の持続期間は、10秒〜20分の範囲、例えば20秒〜10分の範囲であってもよい。曝露時間は、処置によって徐々に増加してもよい。一般的に、UVAに対する曝露時間は、1〜60分の範囲、例えば1〜30分の範囲であってもよい。
ソラレンは、細胞においてDNAに結合して、それらの複製を中止させ、治療効果のために光に対する皮膚の反応を増加させる光感作化学物質である多くの任意の薬物および他の物質と定義される。ソラレンは、核酸に関して天然の親和性を有し、塩基のあいだ、DNA二重らせんの2つの鎖、典型的にアデニンとチミン塩基のあいだに介入しうる、平面の三環構造を含む化合物である。長波長紫外（UV）光を照射すると、ソラレンは典型的に、核酸、しばしばチミジンに対して共有的に付着して、ならびにウリジンおよびシチジンに対しても共有的に付着し、二重らせんを共に有効に結びつける。次に、二重らせんの巻き戻しを必要とするプロセスは、ソラレン分子によって阻害されうる。ソラレンは好ましくは細胞を殺すことなく細胞の活性を停止させる。
1つの態様において、本発明に従って用いるためのソラレン化合物は以下の一般式の化合物である：
または
式中、R1、R2、R3、R4、R4'およびR5は個々に、水素、ハロゲン、C(1-10)-アルキル、およびハロゲン、アミン、またはヒドロキシルによって置換されたC(1-10)-アルキル、ならびにヒドロキシによって置換されていてもよいC(1-10)-エーテルからなる群より選択されるか；またはR1およびR5は共にピリドを形成する。
ハロゲンは、塩素、フッ素、臭素、およびヨウ素からなる群より選択されるハロゲンラジカルを意味すると解釈されるべきである。
C(1-10)-アルキルは、炭素原子1〜10個を含むアルキルラジカルを意味すると解釈されるべきである。アルキルラジカルは直鎖または分岐鎖であってもよい。C(1-10)-アルキルの例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、およびペンチルである。
アミンは、構造式RaRbN-のラジカルを意味すると解釈されるべきであり、式中RaおよびRbは、独立して水素またはC(1-10)-アルキルである。1つの態様において、RaおよびRbはいずれも水素である。
ヒドロキシは、構造式HO-のラジカルを意味すると解釈されるべきである。
C(1-10)-アルキル-O-は、炭素原子1〜10個を含むエーテルラジカルを意味すると解釈されるべきである。エーテルラジカルは、直鎖または分岐鎖であってもよい。C(1-10)-アルキル-O-の例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、およびペントキシである。
1つの態様において、ソラレン化合物は、ピリド-[3,4-c]ソラレン、7-メチルピリド-[3,4-c]ソラレン、5-メトキシソラレン、8-メトキシソラレン、4,5',8-トリメチルソラレン、4-メチルソラレン、4,4-ジメチルソラレン、4-5'-ジメチルソラレン、4',8-メトキシソラレン、4'-(ω-アミノ-2-オキサ)アルキル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-(4-アミノ-2-オキサ)-ブチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-クロロメチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-アミノメチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-(2-ヒドロキシエトキシ)-メチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-(6-ヒドロキシヘキシルオキシ)-メチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-ヒドロキシメチル-4,5',8-トリメチルソラレン、5-メチル-アンゲリシン、および2H-フルオロ[2,3-h][1]ベンゾピラン-2-オンからなる群より選択されてもよい。
1つの態様において、ソラレンは5-メトキシソラレンまたは8-メトキシソラレンであってもよい。5-メトキシソラレンは、例えば商品名Pendermとして入手可能であり、8-メトキシソラレンは、例えば商品名Genoxalenとして入手可能である。
本発明において用いるためのソラレンは、ソラレンの送達に関する医学の技術分野において公知の任意の方法によって患者に投与してもよい。ソラレンは一般的に経口投与または局所塗布投与に適している。
ソラレンを含む製剤は、例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, edited by E. W. Martin, Mack Publishing Company, 19th edition, Easton, Paにおいて記述されるように通常の技術によって調製されてもよい。薬学的製剤は、当業者に公知の任意の形態を有してもよい。例えば、薬学的製剤は、生体接着性および非生体接着性のゲル、粉剤、錠剤、ロゼンジ、咀嚼錠、チューインガム、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、坐剤、分散性顆粒剤、パッチ、ロリポップ、軟膏、ローション、クリーム、フォーム、インプラントまたは香膏の形態であってもよい。ソラレンを含む薬学的製剤は通常、錠剤、カプセル剤、クリーム、ローション、ゲル、または軟膏からなる群より選択される形状である。
ソラレンを含む製剤は通常、薬学的に許容される賦形剤を含む。そのような薬学的に許容される賦形剤は必ずしも治療的に活性な成分ではなく、むしろ該賦形剤は希釈剤、着香料、溶解剤、潤滑剤、懸濁剤、結合剤、保存剤、湿潤剤、錠剤崩壊剤、または封入材料として作用しうる1つまたは複数の物質であってもよい。そのような賦形剤には、薬学等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、乳糖、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、蔗糖、炭酸マグネシウム、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、低融点ロウ、カカオバター等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。さらに、薬学的に許容される賦形剤は、着色剤、香料、安定化剤、緩衝剤、人工および天然の甘味料、分散剤、濃化剤等であってもよい。
粉剤において、賦形剤は細粉化された固体であってもよく、これは細粉化活性成分の混合物である。錠剤において、活性成分は、適した比率で必要な結合能を有する賦形剤と混合され、所望の形状および大きさに圧縮される。粉剤および錠剤は、活性化合物を1〜約70％まで含んでもよい。
本発明に従うクリーム、軟膏、またはゲルは、外用のための活性成分の半固体製剤である。それらは、細粉化または粉剤型の活性成分を単独で、または適した機器の助けを借りて水性または非水性液体における溶液もしくは懸濁液において、当業者に公知のような油脂性基剤または非油脂性基剤と共に混合する段階によって作製してもよい。
基剤の例は、硬質、軟質、または液体のパラフィン、グリセロール、パラフィン油、蜜ロウ、金属石けんなどの1つまたは複数の炭化水素；漿剤；アーモンド油、コーン油、落花生油、ヒマシ油、もしくはオリーブ油、またはその誘導体（例えばヒマシ油ポリオキシルなど）などの天然起源の油；羊毛脂もしくはその誘導体、またはステリック（steric）酸、オレイン酸、もしくはミリスチン酸イソプロピルなどの脂肪酸および/またはエステルを含んでいてもよい基剤である。
基剤はさらに、異なる分子量のプロピレングリコール、ポリエチレングリコール（PEG）、セチルアルコール、エタノールまたはマクロゲルのようなアルコールを含んでもよい。製剤は、ソルビタンエステル、ポリソルベート、Cremophor EL、Tween 20、そのポリオキシエチレン誘導体のような、陰イオン、陽イオン、または非イオン性界面活性剤のような任意の適した表面活性物質または乳化剤を組み入れてもよい。天然ゴム、セルロース誘導体、またはシリカ（silicaceous silica）のような無機材料などの懸濁剤、およびラノリンのような他の成分も同様に含まれてもよい。
本発明に従うローションには、皮膚または眼に適用するために適しているローションが含まれる。皮膚に適用するためのローションまたはリニメントには、アルコールまたはアセトンのような乾燥を促進する、または皮膚を冷却する物質、および/またはグリセロールのような湿潤剤、またはヒマシ油もしくは落花生油のような油が含まれてもよい。
本発明の1つの態様において、ソラレンの単位用量は、約1〜約1000 mgの範囲、例えば、約2〜約500 mgの範囲、例えば約5〜約100 mgなど、例えば、約10〜約50 mgの範囲であってもよい。
経口投与する場合、ソラレンは例えば、放射線処置の少なくとも15分前、例えば少なくとも30分前など、例えば、少なくとも1時間前、例えば少なくとも2時間前などに投与してもよい。ソラレンは、放射線処置の長くて2日前、例えば長くて1日前など、例えば、長くて12時間前、例えば長くて6時間前など、例えば、長くて3時間前、例えば長くて2時間前などに投与される。1つの態様において、ソラレンは、放射線処置の約1時間前であって、放射線処置のわずか約3時間前に投与される。皮膚に直接投与される場合、ソラレンは、UV放射線処置、例えば紫外線A（UVA）放射線処置前の1分から2日以内、例えば、1分から1日以内、例えば1分から12時間以内など、例えば、1分から6時間以内、例えば1分から3時間以内など、例えば、1分から1時間以内、例えば1分から30分以内などに、例えば、該放射線処置前の1分から15分以内などに投与されてもよい。
本発明の1つの態様において、UVBまたはUVB狭帯域放射線処置を行ってもよい。UBVまたはUVB狭帯域処置は、1ヶ月に1〜10回処置、例えば1ヶ月に1〜7回処置など、例えば、1ヶ月に1〜5回処置、例えば1〜5回の週単位処置など、例えば、1〜3回の週単位処置、例えば1回の週単位処置などとして行われる。1つの態様において、放射線処置は、CD4結合ペプチドの投与と同じ処置間隔で与えられる。光の強度は、標準的なレジメに従って、最もしばしば最小紅斑線量（MED）または標準紅斑線量（SED）に基づいて調節される。MEDは、適用後皮膚に発赤を生成するために十分なx線または他の型の放射線の最小量として定義され、一度に投与しても安全である線量であると見なされる。UVBまたはUVB狭帯域のために用いられる波長は、250〜400 nmの範囲、例えば280〜320 nmの範囲などであってもよい。
「電子ビーム放射線処置」という用語は、本明細書において「全皮膚電子ビーム治療（TSEBT）」という用語と互換的に用いられる。
本発明の1つの態様において、電子ビーム放射線処置を放射線処置として用いてもよい。電子ビームは、局所または全皮膚に適用してもよく、皮膚のみを処置するために、1〜15 MeVの範囲、例えば4〜9 MeVの範囲などのエネルギーで送達される。全皮膚電子ビーム治療（TSEBT）のコースの線量はしばしば、36 Gyまでであり、これはCD4結合ペプチドの投与と同じ処置間隔で、通常、0.1〜5 Gyの範囲、例えば1.5〜2 Gyの範囲などで分割用量で週に3回まで送達されてもよい。
本発明の1つの態様において、放射線処置はフォトフェレーシスであってもよい。フォトフェレーシスは単核球分画の単離を伴う白血球搬出によって行ってもよく、次にこれをUVAおよびGenoxalenまたは本明細書において先に記述した他の任意のソラレンに曝露する。次に、放射線を照射された細胞を患者に戻す。先に記述した方法は当業者に周知である。フォトフェレーシスは、例えばCTCLのようなT細胞リンパ腫のような循環中の悪性細胞を含む悪性状態にとって特に適している。フォトフェレーシスは、最初、1ヶ月に少なくとも連続して2日間、例えば連続して2日など、または例えば、1ヶ月に2回、最大の清澄化が起こるまで行う。この後に毎月処置を少なくとも3ヶ月間、例えば6ヶ月間などの処置を行い、その後4週間隔、例えば6週間隔など、例えば、8週間間隔へと徐々に漸減させ、中止とする。しかし、当業者は、患者、処置される状態および自身の経験に従って特定のフォトフェレーシス処置を調節することができる。
本発明の1つの態様において、X線を放射線処置として用いてもよい。X線は、リンパ節、内臓臓器に局在するリンパ腫、腫瘍または広範囲の大きいプラークの疾患のような皮膚病変に与えてもよい。処置は、例えばCD4結合ペプチドの投与後に投与してもよく、CD4結合ペプチドの投与と同じ処置間隔で投与してもよい。本発明において用いてもよい放射線のタイプには、低電位X線が含まれるがこれらに限定されるわけではない。線量の分割がしばしば行われる。処置を必要とする患者における治療的有効性を達成するために必要なx線の強度および持続を決定するための方法は、当業者に周知である。
本発明は、抗CD4抗体またはその抗原結合断片のようなCD4結合ペプチドおよび放射線による臨床状態の処置に関する。臨床状態は、そのような処置に反応性の任意の臨床状態であってもよい。
1つの態様において、臨床状態は、CD4を発現する細胞を直接または間接的に含む状態である。このように、臨床状態は、CD4+ T細胞を直接または間接的に含む任意の状態であってもよい。このように、臨床状態は、CD4+ T細胞の過増殖のようなCD4+ T細胞の増殖の増加を伴う疾患であってもよく、または疾患部位へのCD4+ T細胞の動員の増加、例えばCD4+ T細胞の疾患部位への望ましくない動員を伴ってもよい。CD4+ T細胞の過増殖を伴う臨床状態には、例えば特定の悪性疾患が含まれる。
1つの態様において、臨床状態は、放射線処置に少なくとも部分的に反応性であってもよい。
1つの態様において、臨床状態は、悪性疾患および炎症性皮膚疾患からなる群より選択される。
悪性疾患は、任意の悪性疾患、例えば原発癌または転移癌であってもよい。本明細書において用いられるように「悪性疾患」という用語は、同様に前悪性疾患も含むことを意味する。
「原発癌」とは、癌細胞の少なくとも1つの特徴的特色を獲得したが、隣接する組織にはまだ浸潤しておらず、原発起源の場所に局在する腫瘍において留まっている腫瘍細胞の群を意味する。「転移癌」は、原発癌の細胞に由来し、該原発癌を取り巻く組織に浸潤して、全身に散在し、離れた新しい場所に接着して新しい腫瘍に成長する、腫瘍細胞の群を意味する。
前悪性および/または悪性状態は例えば、癌または癌へと発達しうる状態であってもよい。本発明の範囲内の癌という用語は、白血病およびリンパ腫、ならびに悪性および良性腫瘍の双方を含む。
癌は例えば腺腫、癌腫、または肉腫であってもよい。癌は例えば黒色腫、脳腫瘍、神経芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、子宮頚癌、子宮癌、卵巣癌、白血病、結腸癌、直腸癌、精巣癌、腎癌、肝癌、口唇癌、舌癌、胃癌、皮膚癌、肉腫、中皮腫、膀胱癌、骨腫瘍、悪性胸膜浸潤、腹水、髄膜癌腫症、頭頚部癌、ならびに甲状腺、下垂体、および腎上体のような内分泌臓器の癌からなる群より選択されてもよい。
1つの態様において、悪性疾患は、成人T細胞白血病またはリンパ腫、およびT細胞前リンパ球性白血病からなる群より選択される。
1つの態様において、悪性疾患は、菌状息肉腫のようなCD4+皮膚T細胞リンパ腫、セザリー病、リンパ様丘疹症（lymphoid papulosis）、または未分化大細胞リンパ腫からなる群より選択される。
1つの態様において、悪性疾患は、末梢T細胞リンパ腫のようなCD4+節性T細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性T細胞リンパ腫、または未分化ラージT細胞リンパ腫（anaplastic large T-cell lymphoma）からなる群より選択される。
1つの態様において、皮膚の炎症疾患は、乾癬、皮膚炎 湿疹（dermatitis eczema）、アトピー性皮膚炎、強皮症、扁平苔癬、および円形脱毛症からなる群より選択される。
以下は、本発明の態様の一覧である。
態様1：放射線処置を受けるまたは受けるであろう個体における臨床状態を処置するための薬学的組成物の調製におけるCD4結合ペプチドの使用。
態様2：放射線処置と組み合わせて臨床状態を処置するための薬学的組成物の調製におけるCD4結合ペプチドの使用。
態様3：臨床状態の放射線処置を媒介するための薬学的組成物の調製におけるCD4結合ペプチドの使用。
態様4：臨床状態を処置するためのパーツの薬学的キットの調製におけるCD4結合ペプチドおよびソラレン化合物の使用。
態様5：パーツの薬学的キットが放射線処置を媒介するためのものである、態様4記載の使用。
態様6：CD4結合ペプチドがヒトCD4に結合することができる、態様1〜5のいずれかに記載の使用。
態様7：CD4結合ペプチドが哺乳動物細胞培養を用いて製造される、態様1〜6のいずれかに記載の使用。
態様8：CD4結合ペプチドがp56lckキナーゼを活性化することができる、態様1〜7のいずれかに記載の使用。
態様9：p56lckキナーゼの活性化が、阻害性アダプター分子であるDok-1および/またはSHIP-1の少なくとも1つのリン酸化を増加させる、態様8記載の使用。
態様10：CD4結合ペプチドが抗CD4抗体またはそのCD4結合断片である、態様1〜9のいずれかに記載の使用。
態様11：抗体がモノクローナル抗体である、態様10記載の使用。
態様12：抗体がヒト化抗体である、態様10または態様11記載の使用。
態様13：抗体がヒト抗体である、態様10〜11のいずれかに記載の使用。
態様14：抗体がκ型の軽鎖を有する、態様10〜13のいずれかに記載の使用。
態様15：抗体が、ザノリムマブ、ケリキシマブ、クレノリキシマブ、TNX/355、TRX/1、IOT4a、プリリキシマブ、および4162W94からなる群より選択される、態様10〜14のいずれかに記載の使用。
態様16：抗体がザノリムマブである、態様15記載の使用。
態様17：放射線処置が、ソラレン化合物の投与と長波長紫外放射線との組み合わせ（PUVA）；UVB；狭帯域UVB；高線量UVA；電子ビーム；およびx線からなる群より選択される、態様1〜16のいずれかに記載の使用。
態様18：放射線処置がソラレン化合物の投与と長波長紫外放射線との組み合わせ（PUVA）である、態様17記載の使用。
態様19：ソラレン化合物が以下の一般式を有する、態様18記載の使用：
または
式中、R1、R2、R3、R4、R4'およびR5は個々に、水素、ハロゲン、C(1-10)-アルキル、およびハロゲン、アミン、またはヒドロキシルによって置換されたC(1-10)-アルキル、ならびにヒドロキシによって置換されていてもよいC(1-10)-エーテルからなる群より選択されるか；またはR1およびR5は共にピリドを形成する。
態様20：ソラレン化合物が、ピリド-[3,4-c]ソラレン、7-メチルピリド-[3,4-c]ソラレン、5-メトキシソラレン、8-メトキシソラレン、4,5',8-トリメチルソラレン、4-メチルソラレン、4,4-ジメチルソラレン、4-5'-ジメチルソラレン、4',8-メトキシソラレン、4'-(ω-アミノ-2-オキサ)アルキル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-(4-アミノ-2-オキサ)-ブチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-クロロメチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-アミノメチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-(2-ヒドロキシエトキシ)-メチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-(6-ヒドロキシヘキシルオキシ)-メチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-ヒドロキシメチル-4,5',8-トリメチルソラレン、5-メチル-アンゲリシン、および2H-フルオロ[2,3-h][1]ベンゾピラン-2-オンからなる群より選択される、態様1〜19のいずれかに記載の使用。
態様21：ソラレン化合物が5-メトキシソラレンまたは8-メトキシソラレンである、態様20記載の使用。
態様22：臨床状態が悪性疾患または炎症性皮膚疾患である、態様1〜21のいずれかに記載の使用。
態様23：臨床状態が悪性疾患である、態様22記載の使用。
態様24：悪性疾患が白血病およびリンパ腫からなる群より選択される、態様22または態様23記載の使用。
態様25：悪性疾患がT細胞前リンパ球性白血病である、態様22〜24のいずれかに記載の使用。
態様26：悪性疾患がCD4+皮膚T細胞リンパ腫からなる群より選択される、態様22〜24のいずれかに記載の使用。
態様27：悪性疾患が、菌状息肉腫、セザリー症候群、リンパ様丘疹症、および未分化大細胞リンパ腫からなる群より選択される、態様26記載の使用。
態様28：悪性疾患がCD4+節性T細胞リンパ腫からなる群より選択される、態様22〜24のいずれかに記載の使用。
態様29：悪性疾患が、末梢T細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性T細胞リンパ腫、および未分化ラージT細胞リンパ腫からなる群より選択される、態様28記載の使用。
態様30：臨床状態が炎症性皮膚疾患である、態様22記載の使用。
態様31：炎症性皮膚疾患が、乾癬、皮膚炎 湿疹、アトピー性皮膚炎、強皮症、扁平苔癬、および円形脱毛症からなる群より選択される、態様22または態様30記載の使用。
態様32：その必要がある被験体にCD4結合ペプチドの治療有効量を投与する段階、および該被験体を放射線処置に供する段階を含む、悪性疾患の処置方法。
態様33：悪性疾患が白血病およびリンパ腫からなる群より選択される、態様32記載の方法。
態様34：悪性疾患がT細胞前リンパ球性白血病である、態様32または態様33に記載の方法。
態様35：悪性疾患がCD4+皮膚T細胞リンパ腫からなる群より選択される、態様32または態様33記載の方法。
態様36：悪性疾患が、菌状息肉腫、セザリー症候群、リンパ様丘疹症、および未分化大細胞リンパ腫からなる群より選択される、態様35記載の方法。
態様37：悪性疾患がCD4陽性節性T細胞リンパ腫からなる群より選択される、態様32または態様33記載の方法。
態様38：悪性疾患が、末梢T細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性T細胞リンパ腫、および未分化ラージT細胞リンパ腫からなる群より選択される、態様37記載の方法。
態様39：その必要がある被験体にCD4結合ペプチドの治療有効量を投与する段階、および該被験体を放射線処置に供する段階を含む、炎症性皮膚疾患の処置方法。
態様40：炎症性皮膚疾患が、乾癬、皮膚炎 湿疹、アトピー性皮膚炎、強皮症、扁平苔癬、および円形脱毛症からなる群より選択される、態様39記載の方法。
態様41：その必要がある被験体にCD4結合ペプチドの治療有効量を投与する段階、および該被験体を放射線処置に供する段階を含む、臨床状態の放射線処置を媒介する方法。
態様42：CD4結合ペプチドがヒトCD4に結合することができる、態様32〜41のいずれかに記載の方法。
態様43：CD4結合ペプチドが哺乳動物細胞培養を用いて製造される、態様32〜42のいずれかに記載の方法。
態様44：CD4結合ペプチドがp56lckキナーゼを活性化することができる、態様32〜43のいずれかに記載の方法。
態様45：p56lckキナーゼの活性化が、阻害性アダプター分子であるDok-1および/またはSHIP-1の少なくとも1つのリン酸化を増加させる、態様44記載の方法。
態様46：CD4結合ペプチドが抗CD4抗体またはそのCD4結合断片である、態様32〜45のいずれかに記載の方法。
態様47：抗体がモノクローナル抗体である、態様46記載の方法。
態様48：抗体がヒト化抗体である、態様46または態様47記載の方法。
態様49：抗体がヒト抗体である、態様46または態様47記載の方法。
態様50：抗体が、κ型の軽鎖を有する、態様46〜49のいずれかに記載の方法。
態様51：抗体が、ザノリムマブ、ケリキシマブ、クレノリキシマブ、TNX/355、TRX/1、IOT4a、プリリキシマブ、および4162W94からなる群より選択される、態様46〜50のいずれかに記載の方法。
態様52：抗体がザノリムマブである、態様51記載の方法。
態様53：放射線処置が、ソラレンおよび長波長紫外放射線（PUVA）；UVB；狭帯域UVB；高線量UVA；電子ビーム；ならびにx線からなる群より選択される、態様32〜52のいずれかに記載の方法。
態様54：放射線処置がソラレンおよび長波長紫外放射線（PUVA）であり、かつソラレン化合物がUVA処置の前に投与される、態様53記載の方法。
態様55：ソラレン化合物が以下の一般式を有する、態様54記載の方法：
または
式中、R1、R2、R3、R4、R4'およびR5は個々に、水素、ハロゲン、C(1-10)-アルキル、およびハロゲン、アミン、またはヒドロキシルによって置換されたC(1-10)-アルキル、ならびにヒドロキシによって置換されていてもよいC(1-10)-エーテルからなる群より選択されるか；またはR1およびR5は共にピリドを形成する。
態様56：ソラレン化合物が、ピリド-[3,4-c]ソラレン、7-メチルピリド-[3,4-c]ソラレン、5-メトキシソラレン、8-メトキシソラレン、4,5',8-トリメチルソラレン、4-メチルソラレン、4,4-ジメチルソラレン、4-5'-ジメチルソラレン、4',8-メトキシソラレン、4'-(ω-アミノ-2-オキサ)アルキル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-(4-アミノ-2-オキサ)-ブチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-クロロメチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-アミノメチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-(2-ヒドロキシエトキシ)-メチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-(6-ヒドロキシヘキシルオキシ)-メチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-ヒドロキシメチル-4,5',8-トリメチルソラレン、5-メチル-アンゲリシン、および2H-フルオロ[2,3-h][1]ベンゾピラン-2-オンからなる群より選択される、態様32〜55のいずれかに記載の方法。
態様57：ソラレン化合物が5-メトキシソラレンまたは8-メトキシソラレンである、態様56記載の方法。
態様58：ソラレン化合物が放射線処置の5時間前〜0.5時間前の期間に投与される、態様54〜57のいずれかに記載の方法。
態様59：ソラレン化合物が放射線処置の2時間前〜1時間前の期間に投与される、態様58記載の方法。
態様60：CD4結合ペプチドが静脈内、皮下、または筋肉内注射によって投与される、態様32〜59のいずれかに記載の方法。
態様61：CD4結合ペプチドが放射線処置の前に少なくとも1回投与される、態様32〜60のいずれかに記載の方法。
態様62：CD4結合ペプチドが週1回投与される、態様32〜61のいずれかに記載の方法。
態様63：被験体が週1〜5回の範囲で放射線処置に供される、態様32〜62のいずれかに記載の方法。
態様64：少なくとも1回のCD4結合ペプチド処置および少なくとも1回の放射線処置が同じ週に行われる、態様32〜63のいずれかに記載の方法。
態様65：CD4結合ペプチド処置および放射線処置が4〜30週間の期間内に行われる、態様32〜64のいずれかに記載の方法。
態様66：CD4結合ペプチド処置および放射線処置が8〜16週間の期間内に行われる、態様65記載の方法。
態様67：CD4結合ペプチド処置および放射線処置が12週間の期間内に行われる、態様66記載の方法。
態様68：放射線処置が局所または全皮膚に行われる、態様32〜67のいずれかに記載の方法。
態様69：放射線処置が体外血液に行われる、態様32〜67のいずれかに記載の方法。
態様70：放射線処置がフォトフェレーシスである、態様69記載の方法。
態様71：薬剤として使用するための、CD4結合ペプチドおよびソラレン化合物を1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と共に含むパーツのキット。
態様72：悪性疾患の処置における薬剤として使用するための、CD4結合ペプチドおよびソラレン化合物を1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と共に含むパーツのキット。
態様73：放射線処置と組み合わせて悪性疾患の処置における薬剤として使用するための、CD4に結合することができるCD4結合ペプチドおよびソラレン化合物を1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と共に含むパーツのキット。
態様74：悪性疾患が白血病およびリンパ腫からなる群より選択される、態様72または態様73記載のパーツのキット。
態様75：悪性疾患がT細胞前リンパ球性白血病である、態様72〜74のいずれかに記載の使用。
態様76：悪性疾患がCD4+皮膚T細胞リンパ腫からなる群より選択される、態様72〜74のいずれかに記載の使用。
態様77：悪性疾患が、菌状息肉腫、セザリー症候群、リンパ様丘疹症、および未分化大細胞リンパ腫からなる群より選択される、態様76記載の使用。
態様78：悪性疾患がCD4+節性T細胞リンパ腫からなる群より選択される、態様72〜74のいずれかに記載の使用。
態様79：悪性疾患が、末梢T細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性T細胞リンパ腫、および未分化ラージT細胞リンパ腫からなる群より選択される、態様78記載の使用。
態様80：炎症性皮膚疾患の処置における薬剤として使用するための、CD4結合ペプチドおよびソラレン化合物を1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と共に含むパーツのキット。
態様81：放射線処置と組み合わせて炎症性皮膚疾患の処置における薬剤として使用するための、CD4結合ペプチドおよびソラレン化合物を1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と共に含むパーツのキット。
態様82：炎症性皮膚疾患が、乾癬、皮膚炎 湿疹、アトピー性皮膚炎、強皮症、扁平苔癬、および円形脱毛症からなる群より選択される、態様80または態様81記載の使用。
態様83：臨床状態を処置するために放射線処置の媒介における薬剤として使用するための、CD4結合ペプチドおよびソラレン化合物を1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と共に含むパーツのキット。
態様84：ソラレン化合物が治療有効量で存在する、態様71〜83のいずれかに記載のパーツのキット。
態様85：CD4結合ペプチドが治療有効量で存在する、態様71〜84のいずれかに記載のパーツのキット。
態様86：CD4結合ペプチドがヒトCD4に結合することができる、態様71〜85のいずれかに記載のパーツのキット。
態様87：CD4結合ペプチドが哺乳動物細胞培養を用いて製造される、態様71〜86のいずれかに記載のパーツのキット。
態様88：CD4結合ペプチドがp56lckキナーゼを活性化することができる、態様71〜87のいずれかに記載のパーツのキット。
態様89：p56lckキナーゼの活性化が、阻害性アダプター分子であるDok-1および/またはSHIP-1の少なくとも1つのリン酸化を増加させる、態様88記載のパーツのキット。
態様90：CD4結合ペプチドが抗CD4抗体またはそのCD4結合断片である、態様71〜89のいずれかに記載のパーツのキット。
態様91：抗体がモノクローナル抗体である、態様90記載のパーツのキット。
態様92：抗体がヒト化抗体である、態様90または態様91のいずれかに記載のパーツのキット。
態様93：抗体がヒト抗体である、態様90または態様91記載のパーツのキット。
態様94：抗体がκ型の軽鎖を有する、態様90〜93のいずれかに記載のパーツのキット。
態様95：抗体が、ザノリムマブ、ケリキシマブ、クレノリキシマブ、TNX/355、TRX/1、IOT4a、プリリキシマブ、および4162W94からなる群より選択される、態様90〜94のいずれかに記載のパーツのキット。
態様96：抗体がザノリムマブである、態様95記載のパーツのキット。
態様97：ソラレン化合物が以下の一般式の化合物である、態様71〜96のいずれかに記載のパーツのキット：
または
式中、R1、R2、R3、R4、R4'およびR5は個々に、水素、ハロゲン、C(1-10)-アルキル、およびハロゲン、アミン、またはヒドロキシルによって置換されたC(1-10)-アルキル、ならびにヒドロキシによって置換されていてもよいC(1-10)-エーテルからなる群より選択されるか；またはR1およびR5は共にピリドを形成する。
態様98：ソラレン化合物が、ピリド-[3,4-c]ソラレン、7-メチルピリド-[3,4-c]ソラレン、5-メトキシソラレン、8-メトキシソラレン、4,5',8-トリメチルソラレン、4-メチルソラレン、4,4-ジメチルソラレン、4-5'-ジメチルソラレン、4',8-メトキシソラレン、4'-(ω-アミノ-2-オキサ)アルキル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-(4-アミノ-2-オキサ)-ブチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-クロロメチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-アミノメチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-(2-ヒドロキシエトキシ)-メチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-(6-ヒドロキシヘキシルオキシ)-メチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-ヒドロキシメチル-4,5',8-トリメチルソラレン、5-メチル-アンゲリシン、および2H-フルオロ[2,3-h][1]ベンゾピラン-2-オンからなる群より選択される、態様71〜97のいずれかに記載のパーツのキット。
態様99：ソラレン化合物が5-メトキシソラレンまたは8-メトキシソラレンである、態様98記載のパーツのキット。
態様100：CD4結合ペプチドの各単位用量が20 mg〜2000 mgの範囲のペプチドを含む、単位剤形で製剤化される態様71〜99のいずれかに記載のパーツのキット。
態様101：ソラレンの各単位用量が10〜50 mgの範囲のソラレン化合物を含む、単位剤形で製剤化される態様71〜100のいずれかに記載のパーツのキット。
態様102：CD4結合ペプチドが非経口投与に適した製剤中にある、態様71〜101のいずれかに記載のパーツのキット。
態様103：CD4結合ペプチドが液剤として、または懸濁剤もしくは液剤の調製に適した粉剤として製剤化される、態様71〜102のいずれかに記載のパーツのキット。
態様104：ソラレン化合物が経口または局所塗布投与に適した製剤中にある、態様71〜103のいずれかに記載のパーツのキット。
態様105：ソラレン化合物が、錠剤、カプセル剤、クリーム、ローション、または軟膏からなる群より選択される形態に製剤化される、態様71〜104のいずれかに記載のキット。
態様106：放射線処置を受けるまたは受けるであろう個体における悪性疾患または炎症性皮膚疾患の処置において使用するためのCD4結合ペプチド。
態様107：放射線処置と組み合わせて悪性疾患または炎症性皮膚疾患の処置において使用するためのCD4結合ペプチド。
態様108：臨床状態の放射線処置の媒介において使用するためのCD4結合ペプチド。
態様109：ヒトCD4に結合することができる、態様106〜108のいずれかに記載のCD4結合ペプチド。
態様110：哺乳動物細胞培養を用いて製造される、態様106〜109のいずれかに記載のCD4結合ペプチド。
態様111：p56lckキナーゼを活性化することができる、態様106〜110のいずれかに記載のCD4結合ペプチド。
態様112：p56lckキナーゼの活性化が、阻害性アダプター分子であるDok-1および/またはSHIP-1の少なくとも1つのリン酸化を増加させる、態様111記載のCD4結合ペプチド。
態様113：抗CD4抗体またはそのCD4結合断片である、態様106〜112のいずれかに記載のCD4結合ペプチド。
態様114：抗体がモノクローナル抗体である、態様113記載のCD4結合ペプチド。
態様115：抗体がヒト化抗体である、態様113または態様114のいずれかに記載の使用。
態様116：抗体がヒト抗体である、態様113または態様114記載のCD4結合ペプチド。
態様117：抗体がκ型の軽鎖を有する、態様113〜116のいずれかに記載のCD4結合ペプチド。
態様118：抗体が、ザノリムマブ、ケリキシマブ、クレノリキシマブ、TNX/355、TRX/1、IOT4a、プリリキシマブ、および4162W94からなる群より選択される、態様113〜117のいずれかに記載のCD4結合ペプチド。
態様119：抗体がザノリムマブである、態様118記載のCD4結合ペプチド。
態様120：放射線処置が、ソラレン化合物の投与と長波長紫外放射線との組み合わせ（PUVA）；UVB；狭帯域UVB；高線量UVA；電子ビーム；およびx線からなる群より選択される、態様106〜119のいずれかに記載のCD4結合ペプチド。
態様121：放射線処置が、ソラレン化合物の投与と長波長紫外放射線の組み合わせ（PUVA）である、態様120記載のCD4結合ペプチド。
態様122：ソラレン化合物が以下の一般式を有する、態様121記載のCD4結合ペプチド：
または
式中、R1、R2、R3、R4、R4'およびR5は個々に、水素、ハロゲン、C(1-10)-アルキル、およびハロゲン、アミン、またはヒドロキシルによって置換されたC(1-10)-アルキル、ならびにヒドロキシによって置換されていてもよいC(1-10)-エーテルからなる群より選択されるか；またはR1およびR5は共にピリドを形成する。
態様123：ソラレン化合物が、ピリド-[3,4-c]ソラレン、7-メチルピリド-[3,4-c]ソラレン、5-メトキシソラレン、8-メトキシソラレン、4,5',8-トリメチルソラレン、4-メチルソラレン、4,4-ジメチルソラレン、4-5'-ジメチルソラレン、4',8-メトキシソラレン、4'-(ω-アミノ-2-オキサ)アルキル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-(4-アミノ-2-オキサ)-ブチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-クロロメチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-アミノメチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-(2-ヒドロキシエトキシ)-メチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-(6-ヒドロキシヘキシルオキシ)-メチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-ヒドロキシメチル-4,5',8-トリメチルソラレン、5-メチル-アンゲリシン、および2H-フルオロ[2,3-h][1]ベンゾピラン-2-オンからなる群より選択される、態様106〜122のいずれかに記載のCD4結合ペプチド。
態様124：ソラレン化合物が5-メトキシソラレンまたは8-メトキシソラレンである、態様123記載のCD4結合ペプチド。
本明細書に記述の処置方法はまた、他の処置、特に特定の臨床状態の処置のために通常用いられる他の処置と組み合わせてもよい。例えば、臨床状態が悪性疾患である本発明の態様において、処置は、化学療法、手術による処置、免疫刺激物質による処置、遺伝子治療、抗体のような他のペプチドによる処置、および/または樹状細胞を用いる処置と組み合わせてもよい。
実施例
実施例1
ザノリムマブによる活性化T細胞におけるT細胞シグナル伝達の阻害
本実施例は、T細胞受容体（TCR）を通してのT細胞の活性化に及ぼすザノリムマブ（GenMab, Denmark）の阻害作用を証明する。結果を図2に示す。
実施例1
ザノリムマブによる活性化T細胞におけるT細胞シグナル伝達の阻害
本実施例は、T細胞受容体（TCR）を通してのT細胞の活性化に及ぼすザノリムマブ（GenMab, Denmark）の阻害作用を証明する。結果を図2に示す。
図2において示されるT細胞活性化の際のT細胞シグナル伝達分子に及ぼす効果を、健康なドナーの末梢血から単離したCD4+ T細胞について得た。CD4+ T細胞を、濃縮RosetteSep cocktail（Stemcell Technologies Inc, Canada）を用いて単離して、リンフォプレップ（Axis Shield, Poc AS, Norway）密度遠心によって分離した。CD4+ T細胞（細胞107個）をザノリムマブと共にインキュベートした後、ラテックスビーズ上に固定したCD3モノクローナル抗体（OKT3、Orthoclone, Pharmacy, UMC, Utrechtから入手可能）によって刺激した。溶解緩衝液（1％ Nonidet P-40、20 mM Tris-HCl、pH 7.4、150 mM NaCl、2 mM EGTA、1 mM Na3VO4、10 mM NaF、10 mMピロリン酸ナトリウム、およびプロテアーゼ阻害剤（Roche Molecular Biochemicals, Sussex, UK））を用いて細胞を溶解した。2連の細胞溶解物試料におけるタンパク質を7〜15％勾配ゲルSDS-PAGEによって分離した後、電気泳動によってブロッティングメンブレンに転写した。メンブレンを特異的チロシンリン酸化タンパク質に関する抗体と共にインキュベートした後、剥がして、そのリン酸化状態によらず、特異的タンパク質を認識する抗体によって再度プロービングした。タンパク質を、HRP結合二次抗体によって検出して、ECLによって可視化し、ホスホイメージャーを用いて定量した。
図2における結果は、ザノリムマブが、固定されたCD3モノクローナル抗体によるTCR刺激後に、細胞内タンパク質のチロシンリン酸化の全般的阻害を引き起こすことを証明する（図2A）。21 kDaおよび23 kDaのタンパク質は、そのリン酸化が顕著に阻害され、TCR-ζ鎖のp21およびp23リン酸化異性体であると同定される（図2A）。ザノリムマブによる下流のチロシンキナーゼ「ζ-鎖関連タンパク質70」（ZAP-70）のリン酸化について観察された阻害は、これと一致する（図2B）。先に、TCRζの活性化およびその後のZAP-70の活性化は、CD4の細胞質テールに会合している（Rudd CE, Proc Natl Acad Sci USA. 85(14), 5190-5194 (1988), Veillette 1988、前記）チロシンキナーゼp56lckによって誘導されることが示された（Chan AC et al., Annu Rev Immunol. 12, 555-92 (1994), van Oers NS et al., J Exp Med. 183(3), 1053-1062 (1996), Weiss A et al., 76(2), 263-74 (1994)）。そのリン酸化が同様にザノリムマブによって阻害される、36〜38 kDaの顕著なチロシンリン酸化タンパク質は、「T細胞活性化に関するアダプタータンパク質リンカー（LAT）」として同定される（図2A）。さらに、ザノリムマブは、T細胞活性化において重大な役割を果たす下流の3つのシグナル伝達経路：Erk1/2、p38セリン/トレオニンおよびAKT/PKBを阻害する（図2C）。
要約すると、ザノリムマブは、非常に早期のT細胞活性化事象を約50％阻害し、これは同様にp56lck依存的であり、同等レベルの阻害作用が、それによって多数の下流のシグナル伝達経路に伝搬される。
実施例2
ザノリムマブによるT細胞における直接阻害性シグナル伝達
本実施例は、T細胞におけるザノリムマブによる直接の阻害性シグナル伝達を証明する。結果を図3に示す。
ザノリムマブによるT細胞における直接阻害性シグナル伝達
本実施例は、T細胞におけるザノリムマブによる直接の阻害性シグナル伝達を証明する。結果を図3に示す。
図3において示したT細胞における阻害性アダプター分子の活性化を、実施例1において記述したように単離したCD4+ T細胞について得た。CD4+ T細胞（細胞3×10E7個）をザノリムマブと共にインキュベートして、適当であればSrcキナーゼ阻害剤PP2またはダムナカンサル（Merck Biosciences, Nottingham, UK）と共にプレインキュベートした後、ザノリムマブに曝露した。細胞溶解物をCD4沈殿抗体と共にインキュベートして、抗体結合タンパク質をプロテイン-Gセファロースによって沈殿させた。SH2結合タンパク質の沈殿に関して、溶解物を、グルタチオンアガロースビーズに結合させたSH2C-RasGAP-GSTと共にインキュベートした。CD4-沈殿物を、1 mM DTT、5μM ATP、および1μCi 32Pγ-ATPを含むキナーゼ緩衝液（10％グリセロールにおいて40 mM HEPES、pH 7.4、10 mM MgCl2、3 mM MnCl2、200μM Na3VO4）においてインキュベートした。Laemmli緩衝液において沸騰させることによって、反応を停止させた。タンパク質を7〜15％勾配ゲルSDS-PAGEによって分離して、電気泳動によってブロッティングメンブレンに転写した。乾燥させたメンブレンを放射線増感フィルムに露出した後、特異的タンパク質に関する抗体と共にインキュベートした。タンパク質を、HRP結合二次抗体によって検出して、ECLによって可視化し、ホスホイメージャーを用いて定量した。
図3における結果は、ザノリムマブが、CD4関連p56lckチロシンキナーゼ活性の最適な刺激、外因性のp56lck基質としてのα-カゼインのリン酸化、およびp56lckの自己リン酸化を引き起こすことを示している（図3A）。ザノリムマブによって誘導されるp56lckの活性の増加は、ザノリムマブのインキュベーションによって損なわれたT細胞活性化を示すデータと矛盾するように思われることがある（図2）。可能性がある1つの説明を以下に概要するが、本発明は、特定の基礎メカニズムに拘束されない。本発明者らは、ザノリムマブがTCRからのp56lckの隔離を引き起こしうるという仮説を立てている。さらに、p56lckがリン酸化においておよびそれによって「チロシンキナーゼの下流の」阻害性アダプター分子（Dok-1）（(Martelli 2001、前記, Okabe 2005、前記）、および「5'-イノシトールホスファターゼに接触するSH2ドメイン」（SHIP-1）（Lamkin 1997、前記）の活性化において役割を果たすことが示されていることから、ザノリムマブはp56lckを通して負のシグナルを直接生成しうる。ザノリムマブは実際に、Dok-1およびSHIP-1のリン酸化を誘導する（図3B、3C）。ザノリムマブによる観察されたp56lck活性化の増加と、Dok-1活性化の誘導との直接相関は、細胞をSrc阻害剤PP2によって、またはより特異的なp56lck阻害剤であるダムナカンサルによって前処置することによって確認される。これらの阻害剤による前処置により、沈殿したDok-1の量の低減が起こる（図3D）。要約すると、ザノリムマブによるCD4結合は、p56lckキナーゼ活性化を引き起こし、次にこれがDok-1およびSHIP-1リン酸化の増加を引き起こす。
実施例3
初代培養CD4 + T細胞に及ぼすUV処置と組み合わせたザノリムマブの影響
総CD4+ T細胞またはCD45RO+およびCD45RA+サブセットを、男女の健康なドナーから得られた血液バンク白血球搬出パックから単離する。滅菌PBSをそれぞれの血液パックに加えて、末梢血単核球（PBMC）を、リンフォプレップ密度遠心（Lymphocyte Separation Medium; BioWhittaker, via Cambrex Verviers, Belgium；製品番号17-829E）によって800×gで20分間（ブレーキ0）分離した。勾配界面のPBMCを採取して、PBSによって3回洗浄した（400×gで7分間、ブレーキ3）後、RPMIに浮遊させた。CD4+ T細胞をDynal(登録商標)CD4+ T細胞Negative Isolation Kit (Dynal Biotech GmbH, Hamburg, Germany；製品番号113.11)を用いて製造元のプロトコールに従って負の選択によって単離する。CD4+CD45RA+およびCD4+CD45R0+ T細胞サブセットを、CD45R0+（Becton Dickinson, カタログ番号555491）およびCD45RA+（Becton Dickinson, カタログ番号556625）細胞に対するマウスモノクローナル抗体と組み合わせて、抗マウス磁気ビーズと共に、Dynal(登録商標)CD4+ T細胞Negative Isolation Kit (Dynal Biotech GmbH, Hamburg, Germany；製品番号113.11)を用いてPBMC浮遊液から単離する。CD4+ T細胞のパーセンテージを、ザノリムマブ-FITC（Genmab B.V.；バッチ番号200302）、および抗CD3-PE (Becton Dickinson, カタログ番号556612）、ならびにCD4+CD45RA+およびCD4+CD45R0+ T細胞サブセットの場合には抗CD45RA-FITCおよびCD45RO-PE抗体による染色によるフローサイトメトリー、ならびにCell Questソフトウェア（Becton Dickinson, Erembodegem-Aalst, Belgium）を用いてFACS Caliburにおいて細胞関連蛍光を分析することによってチェックする。
初代培養CD4 + T細胞に及ぼすUV処置と組み合わせたザノリムマブの影響
総CD4+ T細胞またはCD45RO+およびCD45RA+サブセットを、男女の健康なドナーから得られた血液バンク白血球搬出パックから単離する。滅菌PBSをそれぞれの血液パックに加えて、末梢血単核球（PBMC）を、リンフォプレップ密度遠心（Lymphocyte Separation Medium; BioWhittaker, via Cambrex Verviers, Belgium；製品番号17-829E）によって800×gで20分間（ブレーキ0）分離した。勾配界面のPBMCを採取して、PBSによって3回洗浄した（400×gで7分間、ブレーキ3）後、RPMIに浮遊させた。CD4+ T細胞をDynal(登録商標)CD4+ T細胞Negative Isolation Kit (Dynal Biotech GmbH, Hamburg, Germany；製品番号113.11)を用いて製造元のプロトコールに従って負の選択によって単離する。CD4+CD45RA+およびCD4+CD45R0+ T細胞サブセットを、CD45R0+（Becton Dickinson, カタログ番号555491）およびCD45RA+（Becton Dickinson, カタログ番号556625）細胞に対するマウスモノクローナル抗体と組み合わせて、抗マウス磁気ビーズと共に、Dynal(登録商標)CD4+ T細胞Negative Isolation Kit (Dynal Biotech GmbH, Hamburg, Germany；製品番号113.11)を用いてPBMC浮遊液から単離する。CD4+ T細胞のパーセンテージを、ザノリムマブ-FITC（Genmab B.V.；バッチ番号200302）、および抗CD3-PE (Becton Dickinson, カタログ番号556612）、ならびにCD4+CD45RA+およびCD4+CD45R0+ T細胞サブセットの場合には抗CD45RA-FITCおよびCD45RO-PE抗体による染色によるフローサイトメトリー、ならびにCell Questソフトウェア（Becton Dickinson, Erembodegem-Aalst, Belgium）を用いてFACS Caliburにおいて細胞関連蛍光を分析することによってチェックする。
単離CD4+ T細胞、ならびにCD4+CD45RA+およびCD4+CD45R0+ T細胞サブセットを培養培地（10％熱不活化仔ウシ胎児血清（Fetal clone II - Hyclone；製品番号SH30066.3）、2 mM L-グルタミン（BioWhittaker, via Cambrex；製品番号17-605F）ならびに50単位/mlペニシリンおよび50μg/mlストレプトマイシン（BioWhittaker, via Cambrex；製品番号DE17-603E）を添加したRPMI 1640）において1時間馴化させた後、細胞を培養培地単独、10μg/mlザノリムマブ（Genmab, Denmark）を含む培養培地、および10μg/ml HuMab-KLH（Genmab B.V.；対照IgGκ）を含む培養培地に浮遊させる。これらのバッチを、UVクロスリンク剤（UV Stratalinker 2400, Stratagene）と共に様々な線量のUV（50〜1000 J/m2）によって処置して、アポトーシスに入る細胞の量を3回の異なるアッセイによって0、4、8、24、および48時間目に確立する。第一に、アネキシン-V染色法の場合、アネキシン-V-FITCおよび7-AAD（7-アミノアクチノマイシンD）（BD Biosciences）を用いてフローサイトメトリーによって分析を行い、アネキシン-V-FITC+/7-AAD+細胞はアポトーシスであると計数される。第二に細胞内カスパーゼ-3染色法に関して、CD4+ T細胞をFACS緩衝液（2％HIFCSおよび0.01％アジドを含むPBS）において2回洗浄した後、Cytofix/Cytoperm（BD Biosciences）に浮遊させる。4℃で20分間インキュベートした後、細胞を透過/洗浄緩衝液（BD Biosciences）において2回洗浄した後、活性カスパーゼ-3モノクローナル抗体（BD Biosciences）によって染色した後フローサイトメトリーを行い、カスパーゼ-3陽性細胞はアポトーシスであると計数される。3,3'-ジヘキシルオキサカルボシアニンヨウ化物（DiOC6）（Aldrich, Poole, Dorset, UK）法による分析に関して、細胞をフローサイトメトリーの前に23 ng/ml DiOC6によって染色する。FSCおよびDiOC6強度の喪失を示す細胞はアポトーシスであると計数される。
実施例4
CD4 + T細胞株に及ぼすUV処置と組み合わせたザノリムマブの影響
CD4+ T細胞株SUP-T1（ATCC、注文番号CRL-1942）、CEM-NKr（NIH AIDS Research and Reference Reagent Program；試薬番号458）を、培養培地（10％熱不活化仔ウシ胎児血清（Fetal clone II - Hyclone；製品番号SH30066.3）、2 mM L-グルタミン（BioWhittaker, via Cambrex；製品番号17-605F）ならびに50単位/mlペニシリンおよび50μg/mlストレプトマイシン（BioWhittaker, via Cambrex；製品番号DE17-603E）を添加したRPMI 1640）において5％CO2-95％大気中で37℃で、最適な細胞密度3〜10×105個/mlで培養する。
CD4 + T細胞株に及ぼすUV処置と組み合わせたザノリムマブの影響
CD4+ T細胞株SUP-T1（ATCC、注文番号CRL-1942）、CEM-NKr（NIH AIDS Research and Reference Reagent Program；試薬番号458）を、培養培地（10％熱不活化仔ウシ胎児血清（Fetal clone II - Hyclone；製品番号SH30066.3）、2 mM L-グルタミン（BioWhittaker, via Cambrex；製品番号17-605F）ならびに50単位/mlペニシリンおよび50μg/mlストレプトマイシン（BioWhittaker, via Cambrex；製品番号DE17-603E）を添加したRPMI 1640）において5％CO2-95％大気中で37℃で、最適な細胞密度3〜10×105個/mlで培養する。
細胞を培養培地単独、10μg/mlザノリムマブ（Genmab, Denmark）を含む培養培地、および10μg/ml HuMab-KLH（Genmab B.V.；対照IgG1, k）を含む培養培地に浮遊させる。これらのバッチを、UVクロスリンク剤（UV Stratalinker 2400, Stratagene）と共に様々な線量のUV（50〜1000 J/m2）によって処置して、アポトーシスに入る細胞の量を3回の異なるアッセイによって0、4、8、24、および48時間目に確立する。第一に、アネキシン-V染色法に関して、アネキシン-V-FITCおよび7-AAD（7-アミノアクチノマイシンD）（BD Biosciences）を用いてフローサイトメトリーによって分析を行い、アネキシン-V-FITC+/7-AAD+細胞はアポトーシスであると計数される。第二に細胞内カスパーゼ-3染色法に関して、CD4+ T細胞をFACS緩衝液（2％HIFCSおよび0.01％アジドを含むPBS）において2回洗浄した後、Cytofix/Cytoperm（BD Biosciences）に浮遊させる。4℃で20分間インキュベートした後、細胞を透過/洗浄緩衝液（BD Biosciences）において2回洗浄した後、活性カスパーゼ-3モノクローナル抗体（BD Biosciences）によって染色した後フローサイトメトリーを行い、カスパーゼ-3陽性細胞はアポトーシスであると計数される。3,3'-ジヘキシルオキサカルボシアニンヨウ化物（DiOC6）（Aldrich, Poole, Dorset, UK）法による分析に関して、細胞をフローサイトメトリーの前に23 ng/ml DiOC6によって染色する。FSCおよびDiOC6強度の喪失を示す細胞はアポトーシスであると計数される。
実施例5
初代培養CD4 + T細胞に及ぼすPUVA処置と組み合わせたザノリムマブの影響
初代培養CD4+ T細胞、ならびにCD4+CD45RA+およびCD4+CD45R0+ T細胞サブセットは、実施例3における記述のとおりに単離した。
初代培養CD4 + T細胞に及ぼすPUVA処置と組み合わせたザノリムマブの影響
初代培養CD4+ T細胞、ならびにCD4+CD45RA+およびCD4+CD45R0+ T細胞サブセットは、実施例3における記述のとおりに単離した。
単離した細胞を培養培地（10％熱不活化仔ウシ胎児血清（Fetal clone II - Hyclone；製品番号SH30066.3）、2 mM L-グルタミン（BioWhittaker, via Cambrex；製品番号17-605F）ならびに50単位/mlペニシリンおよび50μg/mlストレプトマイシン（BioWhittaker, via Cambrex；製品番号DE17-603E）を添加したRPMI 1640）において少なくとも1時間馴化させた後、細胞を培養培地単独、10μg/mlザノリムマブ（Genmab）を含む培養培地、および10μg/ml HuMab-KLH（Genmab B.V.；対照IgG1, k）を含む培養培地に浮遊させる。これらの細胞を5％CO2-95％大気中で37℃で0、0.3、1、2、4、および8時間培養する。培養後、細胞を無血清培地ににおいて洗浄する。細胞を2つに分けて、1つを無血清培地において8-MOP（8-メトキシソラレン200 ng/ml）と共に室温で5分間インキュベートし、もう一つを無血清培地単独において室温で5分間インキュベートする。次に、細胞を、UVクロスリンク剤（UV Stratalinker 2400, Stratagene）と共に様々な線量のUV（50〜1000 J/m2）に曝露する。処置後、細胞を培養培地においてインキュベートして、アポトーシスに入る細胞の量を3回の異なるアッセイによって0、4、8、12、24、および48時間目に確立する。第一に、アネキシン-V染色法に関して、アネキシン-V-FITCおよび7-AAD（7-アミノアクチノマイシンD）（BD Biosciences）を用いてフローサイトメトリーによって分析を行い、アネキシン-V-FITC+/7-AAD+細胞はアポトーシスであると計数される。第二に細胞内カスパーゼ-3染色法に関して、CD4+ T細胞をFACS緩衝液（2％HIFCSおよび0.01％アジドを含むPBS）において2回洗浄した後、Cytofix/Cytoperm（BD Biosciences）において浮遊させる。4℃で20分間インキュベートした後、細胞を透過/洗浄緩衝液（BD Biosciences）において2回洗浄した後、活性カスパーゼ-3モノクローナル抗体（BD Biosciences）によって染色した後フローサイトメトリーを行い、カスパーゼ-3陽性細胞はアポトーシスであると計数される。3,3'-ジヘキシルオキサカルボシアニンヨウ化物（DiOC6）（Aldrich, Poole, Dorset, UK）法による分析に関して、細胞をフローサイトメトリーの前に23 ng/ml DiOC6によって染色する。FSCおよびDiOC6強度の喪失を示す細胞はアポトーシスであると計数される。
実施例6
CD4 + T細胞株に及ぼすPUVA処置と組み合わせたザノリムマブの影響
細胞株SUP-T1およびCEM-NKrは実施例4において記述されている。細胞を培養培地単独、10μg/mlザノリムマブ（Genmab）を含む培養培地、および10μg/ml HuMab-KLH（Genmab B.V.；対照IgG1, k）を含む培養培地に浮遊させる。これらの細胞を5％CO2-95％大気中で37℃で0、0.3、1、2、4、および8時間培養する。培養後、細胞を無血清培地ににおいて洗浄する。細胞を2つに分けて、1つを無血清培地において8-MOP（メトキシソラレン200 ng/ml）と共に室温で5分間インキュベートし、もう一つを無血清培地単独において室温で5分間インキュベートする。次に、細胞を、UVクロスリンク剤（UV Stratalinker 2400, Stratagene）と共に様々な線量のUV（50〜1000 J/m2）に曝露する。処置後、細胞を培養培地においてインキュベートして、アポトーシスに入る細胞の量を3回の異なるアッセイによって0、4、8、12、24、および48時間目に確立する。第一に、アネキシン-V染色法に関して、アネキシン-V-FITCおよび7-AAD（7-アミノアクチノマイシンD）（BD Biosciences）を用いてフローサイトメトリーによって分析行い、アネキシン-V-FITC+/7-AAD+細胞はアポトーシスであると計数される。第二に細胞内カスパーゼ-3染色法に関して、CD4+ T細胞をFACS緩衝液（2％HIFCSおよび0.01％アジドを含むPBS）において2回洗浄した後、Cytofix/Cytoperm（BD Biosciences）に浮遊させる。4℃で20分間インキュベートした後、細胞を透過/洗浄緩衝液（BD Biosciences）において2回洗浄した後、活性カスパーゼ-3モノクローナル抗体（BD Biosciences）によって染色した後フローサイトメトリーを行い、カスパーゼ-3陽性細胞はアポトーシスであると計数される。3,3'-ジヘキシルオキサカルボシアニンヨウ化物（DiOC6）（Aldrich, Poole, Dorset, UK）法による分析に関して、細胞をフローサイトメトリーの前に23 ng/ml DiOC6によって染色する。FSCおよびDiOC6強度の喪失を示す細胞はアポトーシスであると計数される。
CD4 + T細胞株に及ぼすPUVA処置と組み合わせたザノリムマブの影響
細胞株SUP-T1およびCEM-NKrは実施例4において記述されている。細胞を培養培地単独、10μg/mlザノリムマブ（Genmab）を含む培養培地、および10μg/ml HuMab-KLH（Genmab B.V.；対照IgG1, k）を含む培養培地に浮遊させる。これらの細胞を5％CO2-95％大気中で37℃で0、0.3、1、2、4、および8時間培養する。培養後、細胞を無血清培地ににおいて洗浄する。細胞を2つに分けて、1つを無血清培地において8-MOP（メトキシソラレン200 ng/ml）と共に室温で5分間インキュベートし、もう一つを無血清培地単独において室温で5分間インキュベートする。次に、細胞を、UVクロスリンク剤（UV Stratalinker 2400, Stratagene）と共に様々な線量のUV（50〜1000 J/m2）に曝露する。処置後、細胞を培養培地においてインキュベートして、アポトーシスに入る細胞の量を3回の異なるアッセイによって0、4、8、12、24、および48時間目に確立する。第一に、アネキシン-V染色法に関して、アネキシン-V-FITCおよび7-AAD（7-アミノアクチノマイシンD）（BD Biosciences）を用いてフローサイトメトリーによって分析行い、アネキシン-V-FITC+/7-AAD+細胞はアポトーシスであると計数される。第二に細胞内カスパーゼ-3染色法に関して、CD4+ T細胞をFACS緩衝液（2％HIFCSおよび0.01％アジドを含むPBS）において2回洗浄した後、Cytofix/Cytoperm（BD Biosciences）に浮遊させる。4℃で20分間インキュベートした後、細胞を透過/洗浄緩衝液（BD Biosciences）において2回洗浄した後、活性カスパーゼ-3モノクローナル抗体（BD Biosciences）によって染色した後フローサイトメトリーを行い、カスパーゼ-3陽性細胞はアポトーシスであると計数される。3,3'-ジヘキシルオキサカルボシアニンヨウ化物（DiOC6）（Aldrich, Poole, Dorset, UK）法による分析に関して、細胞をフローサイトメトリーの前に23 ng/ml DiOC6によって染色する。FSCおよびDiOC6強度の喪失を示す細胞はアポトーシスであると計数される。
実施例7
G1期T細胞の(P)UVA誘発アポトーシス
SUP-T1およびCEM-NKr細胞株を、0.5〜50μg/mlアフィジコリンによって5〜18時間同期させて、細胞をG1/S境界域に蓄積させる。細胞周期の停止は、細胞をPBSによって3回洗浄する段階、これらを通常の培養培地に戻す段階、および4〜6時間培養する段階によって開放されると考えられる。その後、ノコダゾール（200μg/ml）を培養培地に加えてさらに6時間培養する。この技法によって、ほぼ全ての細胞がM期で同期される。PBSによって3回洗浄することによってノコダゾールを除去して通常の培地に浮遊させた後、同期した細胞は1時間以内にG1期に移動すると考えられる。10、20、30、40、50、および60分目に、細胞を、UVクロスリンク剤（UV Stratalinker 2400, Stratagene）と共に、様々な線量のUV（50〜1000 J/m2）に曝露して、アポトーシスに入る細胞の量を3回の異なるアッセイによって確立する。第一に、アネキシン-V染色法に関して、アネキシン-V-FITCおよび7-AAD（7-アミノアクチノマイシンD）（BD Biosciences）を用いてフローサイトメトリーによって分析を行い、アネキシン-V-FITC+/7-AAD+細胞はアポトーシスであると計数される。第二に細胞内カスパーゼ-3染色法に関して、CD4+ T細胞をFACS緩衝液（2％HIFCSおよび0.01％アジドを含むPBS）において2回洗浄した後、Cytofix/Cytoperm（BD Biosciences）に浮遊させる。4℃で20分間インキュベートした後、細胞を透過/洗浄緩衝液（BD Biosciences）において2回洗浄した後、活性カスパーゼ-3モノクローナル抗体（BD Biosciences）によって染色した後フローサイトメトリーを行い、カスパーゼ-3陽性細胞はアポトーシスであると計数される。3,3'-ジヘキシルオキサカルボシアニンヨウ化物（DiOC6）（Aldrich, Poole, Dorset, UK）法による分析に関して、細胞をフローサイトメトリーの前に23 ng/ml DiOC6によって染色する。FSCおよびDiOC6強度の喪失を示す細胞はアポトーシスであると計数される。
G1期T細胞の(P)UVA誘発アポトーシス
SUP-T1およびCEM-NKr細胞株を、0.5〜50μg/mlアフィジコリンによって5〜18時間同期させて、細胞をG1/S境界域に蓄積させる。細胞周期の停止は、細胞をPBSによって3回洗浄する段階、これらを通常の培養培地に戻す段階、および4〜6時間培養する段階によって開放されると考えられる。その後、ノコダゾール（200μg/ml）を培養培地に加えてさらに6時間培養する。この技法によって、ほぼ全ての細胞がM期で同期される。PBSによって3回洗浄することによってノコダゾールを除去して通常の培地に浮遊させた後、同期した細胞は1時間以内にG1期に移動すると考えられる。10、20、30、40、50、および60分目に、細胞を、UVクロスリンク剤（UV Stratalinker 2400, Stratagene）と共に、様々な線量のUV（50〜1000 J/m2）に曝露して、アポトーシスに入る細胞の量を3回の異なるアッセイによって確立する。第一に、アネキシン-V染色法に関して、アネキシン-V-FITCおよび7-AAD（7-アミノアクチノマイシンD）（BD Biosciences）を用いてフローサイトメトリーによって分析を行い、アネキシン-V-FITC+/7-AAD+細胞はアポトーシスであると計数される。第二に細胞内カスパーゼ-3染色法に関して、CD4+ T細胞をFACS緩衝液（2％HIFCSおよび0.01％アジドを含むPBS）において2回洗浄した後、Cytofix/Cytoperm（BD Biosciences）に浮遊させる。4℃で20分間インキュベートした後、細胞を透過/洗浄緩衝液（BD Biosciences）において2回洗浄した後、活性カスパーゼ-3モノクローナル抗体（BD Biosciences）によって染色した後フローサイトメトリーを行い、カスパーゼ-3陽性細胞はアポトーシスであると計数される。3,3'-ジヘキシルオキサカルボシアニンヨウ化物（DiOC6）（Aldrich, Poole, Dorset, UK）法による分析に関して、細胞をフローサイトメトリーの前に23 ng/ml DiOC6によって染色する。FSCおよびDiOC6強度の喪失を示す細胞はアポトーシスであると計数される。
実施例8
(P)UVA処置後の初代培養CD4 + T細胞のNK細胞媒介ADCC、細胞溶解の誘導
健康なボランティア（インフォームドコンセントを得た後）からの末梢ヒト血液を、静脈穿刺により採取して、バフィーコート（Sanquin, Utrecht, The Netherlands）の形で提供する。滅菌PBSをヒト血液に加えて、末梢血単核球（PBMC）を800×g（ブレーキ0）で20分間のリンフォプレップ密度遠心（Lymphocyte Separation Medium; BioWhittaker, via Cambrex Verviers, Belgium；製品番号17-829E）によって分離する（Heraeus Multifuge 3S-R）。PBMCを勾配界面から採取して、PBSにおいて3回洗浄した後（400×gで7分間、ブレーキ3）、0.1％BSAを添加したPBSに浮遊させる。
(P)UVA処置後の初代培養CD4 + T細胞のNK細胞媒介ADCC、細胞溶解の誘導
健康なボランティア（インフォームドコンセントを得た後）からの末梢ヒト血液を、静脈穿刺により採取して、バフィーコート（Sanquin, Utrecht, The Netherlands）の形で提供する。滅菌PBSをヒト血液に加えて、末梢血単核球（PBMC）を800×g（ブレーキ0）で20分間のリンフォプレップ密度遠心（Lymphocyte Separation Medium; BioWhittaker, via Cambrex Verviers, Belgium；製品番号17-829E）によって分離する（Heraeus Multifuge 3S-R）。PBMCを勾配界面から採取して、PBSにおいて3回洗浄した後（400×gで7分間、ブレーキ3）、0.1％BSAを添加したPBSに浮遊させる。
CD4+ T細胞（またはCD45RO+およびCD45RA+サブセット）をDynal(登録商標)CD4 Negative Isolation Kit（Dynal Biotech GmbH, Hamburg, Germany；製品番号113.17）を用いて製造元のプロトコールに従って負の選択によって単離する。
CD4+CD45RA+またはCD4+CD45RO+ T細胞サブセットを、CD45R0+（Becton Dickinson, カタログ番号555491）またはCD45RA+（Becton Dickinson, カタログ番号556625）細胞に対するマウスmAbと組み合わせてDynal(登録商標)CD4 Negative Isolation Kitを用いてPBMC浮遊液から単離する。CD4+ T細胞のパーセンテージは、HuMax-CD4-FITC（Genmab B.V.；バッチ番号200302）、および抗CD3-PE (Becton Dickinson, カタログ番号556612）、ならびにCD4+CD45RA+およびCD4+CD45R0+ T細胞サブセットの場合には抗CD45RA-FITCおよびCD45RO-PE抗体による染色によるフローサイトメトリーによってチェックする。Cell Questソフトウェア（Becton Dickinson, Erembodegem-Aalst, Belgium）を用いてFACS Caliburにおいて細胞関連蛍光を分析する。
NK細胞を、Dynal(登録商標)NK細胞Negative Isolation Kit (Dynal Biotech GmbH, Hamburg, Germany；製品番号113.15)を用いて、製造元のプロトコールに従って負の選択によってヒト末梢血から単離する。NK細胞のパーセンテージを CD56-PE（Becton Dickinson, カタログ番号555516）およびCD16-FITC（Becton Dickinson, カタログ番号555406）による染色によってフローサイトメトリーによってチェックして、細胞関連蛍光をCell Questソフトウェア（Becton Dickinson, Erembodegem-Aalst, Belgium）を用いてFACS Caliburにおいて分析する。
単離NK細胞を10％熱不活化コスミック仔ウシ血清（CCS）、50 μg/mlストレプトマイシンおよび50 U/mlペニシリン（Cambrex, カタログ番号DE17-603E）、2 mM L-グルタミン（Cambrex, カタログ番号BE17-605F）および200〜300 U/ml IL-2を添加したRPM1 1640（Cambrex, カタログ番号BE12-115F）において37℃で5％CO2において、CD4+ T細胞がPUVA処置される（2日後）まで培養する。
単離CD4+ T細胞、または単離CD4+CD45RA+およびCD4+CD45R0+細胞サブセットを、蛍光細胞膜標識PKH26（FL2）（PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit, Sigma-Aldrich Chemie, Zwijndrecht, The Netherlands；製品番号PKH26-GL）によって製造元のプロトコールに従って標識する。
PKH26標識CD4+ T細胞（または単離サブセット）を96ウェル平底プレート（10μg/ml OKT3（Orthoclone, カタログ番号01KS34H）によってコーティング）に100μlにおいて1×105個/ウェルで移す。
次に、CD28 50μl（CLB, カタログ番号M1650；最終濃度は2 μg/ml）を加える。最後に、希釈したザノリムマブ50μlを加えて最終容積を200μl/ウェルとする。
これらのCD4+ T細胞を37℃、5％CO2において2日間インキュベートする。培養後、細胞を等しい2つの部分に分ける：1つの部分を1μg/ml 8-MOP（ソラレン；Fluka, カタログ番号95560）と共に室温で30分間インキュベートして、もう一つの部分を8-MOPを含まずに室温で30分間インキュベートする。
次に細胞に、UVA光源（UVP(登録商標)8WモデルUVLMS-38）から様々な距離で様々な期間、1 J/cm2のUVAを照射する。
培養NK細胞をPBSによって3回洗浄した後（400×gで7分間、ブレーキ3）、培養培地に2.5〜5×106個/ml（培養および洗浄後のNK細胞の収量に応じて）で浮遊させる。
放射線の照射後、PKH26標識および(P)UVA処置CD4+ T細胞を96ウェル丸底プレートに100μlにおいて2.5〜5×104個/ウェルで移す（培養および培養培地における洗浄後のNK細胞収量に応じて）。
次に、NK細胞100μlを2.5〜5×105個/ウェル（ウェルあたりのNK細胞の量はエフェクター：標的細胞比が10：1を得るように調節される）で加え、細胞を遠心する（54×gで10秒間、ブレーキ3）。沈降させた細胞を5％CO2において37℃で0、4、および24時間インキュベートする。自然発生溶解を測定するために、標的細胞をNK細胞の非存在下で培養培地と共にインキュベートする。
インキュベーション後、細胞を遠心して（500×gで5分間、ブレーキ3）、FACS緩衝液100μlを加えたMicronic FACS試験管に細胞を移す。細胞を、分析の直前にTO-PRO(登録商標)-3（Molecular Probes, Leiden, The Netherlands；製品番号T3605；最終希釈倍率1 : 100,000倍）によって染色する。TO-PRO-3ヨウ化物は、溶解したT細胞の透過性の膜を通して流入した後の核酸に関する蛍光色素であり、FL4において測定可能である。細胞関連蛍光は、FACSCalibur(商標)およびCell Quest Proソフトウェア（Becton Dickinson）を用いて適当な代償設定を用いてフローサイトメトリーによって査定する。細胞溶解パーセンテージは、PKH26+細胞の総数によって、PKH26+細胞集団内のTO-PRO(登録商標)-3細胞数を除することによって計算される。
実施例9
臨床状況における応用
本発明の1つの態様において、悪性疾患または炎症性皮膚疾患に罹患する患者をPUVAに曝露した後、CD4結合ペプチドの投与を行い、すなわち患者は説明に従ってPUVA処置に1週間、2週間、または2〜4週間曝露された後、CD4結合ペプチドの投与が開始される。CD4結合ペプチドの投与は、単独またはPUVAによる継続処置のあいだのいずれかに継続してもよい。1つの態様において、PUVA処置およびCD4結合ペプチドの投与は、同時に開始および実行される。1つの態様において、CD4結合ペプチドはザノリムマブ（Genmab, Denmark）である。1つの態様において、CD4結合ペプチドは2〜3時間かけて静脈内注入によって用量700 mgで投与される。初回用量の後にCD4結合ペプチドの維持用量350 mgを、臨床症状の有意な改善が認められるまで、または症状が消失するまで、必要に応じて2週間毎に投与する。1つの態様において、CD4結合ペプチドの用量は、症状に及ぼす効果が認められるまで、または許容されない副作用が起こるまで徐々に増加させる。処置レジメは、必要に応じて3〜9ヶ月毎に1回またはそれより多く繰り返される。患者は他の確立された処置レジメによって同時に処置されてもよい。
臨床状況における応用
本発明の1つの態様において、悪性疾患または炎症性皮膚疾患に罹患する患者をPUVAに曝露した後、CD4結合ペプチドの投与を行い、すなわち患者は説明に従ってPUVA処置に1週間、2週間、または2〜4週間曝露された後、CD4結合ペプチドの投与が開始される。CD4結合ペプチドの投与は、単独またはPUVAによる継続処置のあいだのいずれかに継続してもよい。1つの態様において、PUVA処置およびCD4結合ペプチドの投与は、同時に開始および実行される。1つの態様において、CD4結合ペプチドはザノリムマブ（Genmab, Denmark）である。1つの態様において、CD4結合ペプチドは2〜3時間かけて静脈内注入によって用量700 mgで投与される。初回用量の後にCD4結合ペプチドの維持用量350 mgを、臨床症状の有意な改善が認められるまで、または症状が消失するまで、必要に応じて2週間毎に投与する。1つの態様において、CD4結合ペプチドの用量は、症状に及ぼす効果が認められるまで、または許容されない副作用が起こるまで徐々に増加させる。処置レジメは、必要に応じて3〜9ヶ月毎に1回またはそれより多く繰り返される。患者は他の確立された処置レジメによって同時に処置されてもよい。
1つの態様において、ソラレンは、PUVAおよびCD4結合ペプチド処置の開始前に患者に適用される。1つの態様において、ソラレンは、PUVAおよびCD4結合ペプチド処置の開始と同時または開始後に適用される。
Claims (52)
- 配列番号１に示されるアミノ酸配列中のCDR1、CDR2およびCDR3の領域を含む重鎖可変領域ならびに配列番号２に示されるアミノ酸配列中のCDR1、CDR2およびCDR3の領域を含む軽鎖可変領域を含み、CD4に結合する抗体またはその抗原結合断片が、ソレラン化合物の投与と長波長紫外放射線との組み合わせを含むPUVA治療と組み合わせて用いられることを特徴とする、該抗体またはその抗原結合断片を含有する、個体における臨床状態の治療剤。
- 該抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１記載の治療剤。
- 該抗体またはその抗原結合断片が、ヒトCD4に結合することができる、請求項1または2記載の治療剤。
- 該抗体またはその抗原結合断片が、哺乳動物細胞培養を用いて製造される、請求項1〜3のいずれか一項記載の治療剤。
- 該抗体またはその抗原結合断片が、p56lckキナーゼを活性化することができる、請求項1〜4のいずれか一項記載の治療剤。
- p56lckキナーゼの活性化が、阻害性アダプター分子（inhibitory adaptor molecule）であるDok-1および/またはSHIP-1の少なくとも1つのリン酸化を増加させる、請求項5記載の治療剤。
- 該抗体またはその抗原結合断片が、CD4陽性細胞に結合するとナチュラルキラー細胞を活性化することができる、請求項1〜6のいずれか一項記載の治療剤。
- 該抗体またはその抗原結合断片が、CD4陽性細胞に結合した場合にナチュラルキラー細胞上のCD16に結合することができ、それによってナチュラルキラー細胞を活性化する、請求項7記載の治療剤。
- 該抗体が、モノクローナル抗体である、請求項1〜8のいずれか一項記載の治療剤。
- 該抗体が、ヒト化抗体である、請求項9記載の治療剤。
- 該抗体が、ヒト抗体である、請求項9記載の治療剤。
- 該抗体が、κ型の軽鎖を有する、請求項9〜11のいずれか一項記載の治療剤。
- ソラレン化合物が以下の一般式を有する、請求項1〜12のいずれか一項記載の治療剤：
または
式中、R1、R2、R3、R4、R4'およびR5は個々に、水素、ハロゲン、C(1-10)-アルキル、およびハロゲン、アミン、またはヒドロキシルによって置換されたC(1-10)-アルキル、ならびにヒドロキシによって置換されていてもよいC(1-10)-エーテルからなる群より選択されるか；またはR1およびR5は共にピリドを形成する。 - ソラレン化合物が、ピリド-[3,4-c]ソラレン、7-メチルピリド-[3,4-c]ソラレン、5-メトキシソラレン、8-メトキシソラレン、4,5',8-トリメチルソラレン、4-メチルソラレン、4,4-ジメチルソラレン、4-5'-ジメチルソラレン、4',8-メトキシソラレン、4'-(ω-アミノ-2-オキサ)アルキル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-(4-アミノ-2-オキサ)-ブチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-クロロメチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-アミノメチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-(2-ヒドロキシエトキシ)-メチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-(6-ヒドロキシヘキシルオキシ)-メチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-ヒドロキシメチル-4,5',8-トリメチルソラレン、5-メチル-アンゲリシン、および2H-フルオロ[2,3-h][1]ベンゾピラン-2-オンからなる群より選択される、請求項1〜13のいずれか一項記載の治療剤。
- ソラレン化合物が、5-メトキシソラレンまたは8-メトキシソラレンである、請求項14記載の治療剤。
- 臨床状態が、悪性疾患または炎症性皮膚疾患である、請求項1〜15のいずれか一項記載の治療剤。
- 臨床状態が、悪性疾患である、請求項16記載の治療剤。
- 悪性疾患が、白血病およびリンパ腫からなる群より選択される、請求項17記載の治療剤。
- 悪性疾患が、T細胞前リンパ球性白血病である、請求項17または18記載の治療剤。
- 悪性疾患が、CD4+皮膚T細胞リンパ腫である、請求項16〜19のいずれか一項記載の治療剤。
- 悪性疾患が、菌状息肉腫、セザリー症候群、リンパ様丘疹症（lymphoid papulosis）、および未分化大細胞リンパ腫からなる群より選択される、請求項17〜20のいずれか一項記載の治療剤。
- 悪性疾患が、CD4+節性T細胞リンパ腫である、請求項17または18記載の治療剤。
- 悪性疾患が、末梢T細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性T細胞リンパ腫、および未分化ラージT細胞リンパ腫（anaplastic large T-cell lymphoma）からなる群より選択される、請求項22記載の治療剤。
- 悪性疾患が、少なくとも1つの他の処置様式（modality）に対して抗療性である、請求項17〜23のいずれか一項記載の治療剤。
- 臨床状態が、炎症性皮膚疾患である、請求項16記載の治療剤。
- 炎症性皮膚疾患が、乾癬、皮膚炎 湿疹（dermatitis eczema）、アトピー性皮膚炎、強皮症、扁平苔癬、および円形脱毛症からなる群より選択される、請求項25記載の治療剤。
- 炎症性皮膚疾患が、少なくとも1つの他の処置様式に対して抗療性である、請求項25または26記載の治療剤。
- ソラレン化合物が、放射線処置の5時間前〜0.5時間前の期間に投与される、請求項1〜27のいずれか一項記載の治療剤。
- ソラレン化合物が、放射線処置の2時間前〜1時間前の期間に投与される、請求項28記載の治療剤。
- 該抗体またはその抗原結合断片が、静脈内、皮下、または筋肉内注射によって投与される、請求項1〜29のいずれか一項記載の治療剤。
- 該抗体またはその抗原結合断片が、PUVA治療の前に少なくとも1回投与される、請求項1〜30のいずれか一項記載の治療剤。
- 該抗体またはその抗原結合断片が、週1回投与される、請求項1〜31のいずれか一項記載の治療剤。
- 該放射線処置が、週1〜5回の範囲で供される、請求項1〜32のいずれか一項記載の治療剤。
- 少なくとも1回の該抗体またはその抗原結合断片による処置および少なくとも1回のPUVA治療が同じ週に行われる、請求項1〜33のいずれか一項記載の治療剤。
- 該抗体またはその抗原結合断片による処置およびPUVA治療が4〜30週間の期間内に行われる、請求項1〜34のいずれか一項記載の治療剤。
- 該抗体またはその抗原結合断片による処置およびPUVA治療が8〜16週間の期間内に行われる、請求項35記載の治療剤。
- 該抗体またはその抗原結合断片による処置およびPUVA治療が12週間の期間内に行われる、請求項36記載の治療剤。
- 該PUVA治療が、局所または全皮膚に行われる、請求項1〜37のいずれか一項記載の治療剤。
- 該PUVA治療が、体外血液に対して行われる、請求項1〜38のいずれか一項記載の治療剤。
- i）配列番号１に示されるアミノ酸配列中のCDR1、CDR2およびCDR3の領域を含む重鎖可変領域ならびに配列番号２に示されるアミノ酸配列中のCDR1、CDR2およびCDR3の領域を含む軽鎖可変領域を含み、CD4に結合する抗体またはその抗原結合断片；
ii）ソラレン化合物；および
iii）薬剤として使用するための1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、
を含むキットであって、該抗体またはその抗原結合断片を、該ソレラン化合物の投与と長波長紫外放射線との組み合わせを含むPUVA治療と組み合わせて用いることを特徴とする個体における臨床状態の治療、において用いるためのキット。 - 臨床状態が、悪性疾患である、請求項40記載のキット。
- 該抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項40または41記載のキット。
- 該悪性疾患が、白血病およびリンパ腫からなる群より選択される、請求項41または42記載のキット。
- 該抗体が、モノクローナル抗体である、請求項40〜43のいずれか一項記載のキット。
- 該抗体が、ヒト化抗体である、請求項44記載のキット。
- 該抗体が、ヒト抗体である、請求項44記載のキット。
- 該抗体が、κ型の軽鎖を有する、請求項40〜46のいずれか一項記載のキット。
- ソラレン化合物が以下の一般式を有する、請求項40〜47のいずれか一項記載のキット：
または
式中、R1、R2、R3、R4、R4'およびR5は個々に、水素、ハロゲン、C(1-10)-アルキル、およびハロゲン、アミン、またはヒドロキシルによって置換されたC(1-10)-アルキル、ならびにヒドロキシによって置換されていてもよいC(1-10)-エーテルからなる群より選択されるか；またはR1およびR5は共にピリドを形成する。 - ソラレン化合物が、ピリド-[3,4-c]ソラレン、7-メチルピリド-[3,4-c]ソラレン、5-メトキシソラレン、8-メトキシソラレン、4,5',8-トリメチルソラレン、4-メチルソラレン、4,4-ジメチルソラレン、4-5'-ジメチルソラレン、4',8-メトキシソラレン、4'-(ω-アミノ-2-オキサ)アルキル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-(4-アミノ-2-オキサ)-ブチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-クロロメチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-アミノメチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-(2-ヒドロキシエトキシ)-メチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-(6-ヒドロキシヘキシルオキシ)-メチル-4,5',8-トリメチルソラレン、4'-ヒドロキシメチル-4,5',8-トリメチルソラレン、5-メチル-アンゲリシン、および2H-フルオロ[2,3-h][1]ベンゾピラン-2-オンからなる群より選択される、請求項40〜48のいずれか一項記載のキット。
- ソラレン化合物が、5-メトキシソラレンまたは8-メトキシソラレンである、請求項49記載のキット。
- 該抗体またはその抗原結合断片が、20 mg〜2000 mgの範囲の単位剤形で製剤化される請求項40〜50のいずれか一項記載のキット。
- ソラレン化合物が、10〜50 mgの範囲の単位剤形で製剤化される請求項40〜51のいずれか一項記載のキット。
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