JPH09510952A - 自己免疫疾患および炎症性疾患の治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 抗ＣＤ４抗体またはシクロスポリンＡなどのＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤を抗ＴＮＦ抗体または可溶性ＴＮＦ受容体などのＴＮＦアンタゴニストと同時にまたは逐次的に投与することによる、自己免疫疾患または炎症疾患の治療方法が開示されている。この方法は、各種の自己免疫疾患あるいは炎症疾患を有するヒトまたは他の哺乳動物の治療の助けとして使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 自己免疫疾患および炎症性疾患の治療 発明の背景 自己免疫疾患の原因となっている自己抗原の性質については不明であり、自己 免疫応答を引き起こす作用についても知られていない。ウイルスタンパク質が自 己抗原と類似性を有しているので自己反応性Ｔ細胞やＢ細胞が自己抗原を認識す るようになるという説が広く支持されている。Ｂリンパ球が抗体を産生するのに 対し、胸腺由来細胞、すなわち「Ｔ細胞」は細胞性免疫機能と関連がある。Ｔ細 胞は、細胞表面提示される抗原を認識し、これらの「抗原提示」細胞とともにそ の機能を発現する。 ヒトＴ細胞群を判定するために様々なマーカーが使われている。たとえばＣＤ ４は、免疫グロブリンと配列が部分的に同一の非多形性表面糖タンパク質受容体 である。ＣＤ４受容体は、明確な成熟末梢Ｔ細胞サブセットを定義づける。一般 に、ヘルパー機能や調節機能を発現するＣＤ４Ｔ細胞は免疫応答においてＢ細胞 と相互作用を示すが、ＣＤ８表面抗原発現Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞として機能 し、免疫応答を調節する作用を示す。Ｔ細胞受容体は、Ｔ細胞応答を強化または 調節する刺激の経路となっているので、免疫介入の標的となりうる。 細胞相互作用のうち、ＣＤ４＋Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）の相互作用は 免疫応答の根源に位置するものである。自己免疫応答は多くの点で正常免疫応答 と本質的に同様であ る。したがって、ＣＤ４＋自己抗原反応性Ｔ細胞は、結合グルーブに自己抗原ペ プチドと結合したクラスＩＩを発現するＡＰＣによって再刺激される。ある種の ヒトの疾患においてこの現象が起きることを示す証拠が示されている。たとえば 、甲状腺のグレーブズ病では、難治の場合に摘出される甲状腺にイン・ビボ活性 化Ｔ細胞が存在し、これらの細胞の多くがクローニング後に、外部からいかなる 抗原も付与されていない自己甲状腺細胞（ＡＰＣとして）、あるいは甲状腺特異 抗原である甲状腺ペルオキシダーゼやサイログロブリンが付与されているＡＰＣ を認識することを示すことができる［ロンデイら（Londei，M．et al．）、Scie nce 228: 85-89（1985）；デイアンら（Dayan，C.M．et al.）、Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 88: 7415-7419(1991)］。同様に、リウマチ様関節炎（ＲＡ）では、 ３年の経過期間中の連続３回の手術においてＲＡ患者の関節からコラーゲンＩＩ 型を認識するイン・ビボ活性化Ｔ細胞が単離されている［ロンデイら（Londei， M．et al．）、Proc．Natl．Acad．Sci. 86:636-640（1989）］。自己免疫特性 を示すその他のヒトの疾患においては、重症筋無力症におけるアセチルコリン受 容体［ホホルフェルドら（Hohlfeld，R．et al．）、Nature 310:224-246（1984 ）］、多発性硬化症におけるミエリン基礎タンパク質［ハフラーら（Hafler，D. A．et al．）、J．Immunol．139:68-72（1987）］、またはインスリン依存性糖 尿病における膵島細胞膜［デ・ベラルディニスら（De Berardinis，P．et al.） 、Lancet II:823-824（1988）；コンティアイネンら（Kontiainen ，S．et al．）、Autoimmunity 8:193-197（1991）］を認識するＣＤ４＋細胞な どの血液由来ＣＤ４＋Ｔ細胞がクローン化されている。 ＣＤ４以外の因子も細胞性免疫応答に影響を及ぼす。サイトカインの１種であ る腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα、カケクチンともいう）は、炎症、組織傷害、免 疫応答、および病変部への細胞侵入に多様な影響を及ぼすので、リウマチ様関節 炎をはじめとする炎症性関節疾患の発生に何らかの役割を果たしている［ブレナ ンら（Brennan，F.M．et al.）、Lancet 11, 244-247（1989）；フェルドマンら （Feldmann，M．et al．）、Ann．Rheumatic Dis．51:480-486（1990）］。ＴＮ Ｆαは、エンドトキシンやその他の刺激に反応して主に単球とマクロファージに よって１７ｋＤのタンパク質サブユニットの可溶性ホモトリマーとして分泌され るタンパク質である［スミスら（Smith，R.A．et al.）、J．Biol．Chem．262:6 951-6954（1987）］。膜に結合した２６ｋＤのＴＮＦ前駆体も記載されている［ クリーグラーら（Kriegler，M．et al．）、Cell 53:45-53(1988)］。ＴＮＦα をコードする遺伝子の発現は単球／マクロファージファミリーの細胞に限定され ない。ＴＮＦはＣＤ４＋およびＣＤ８＋の末梢血Ｔリンパ球や様々な培養Ｔ細胞 系およびＢ細胞系によっても産生される［クチュリら（Cuturi，M.C．et al．） 、J．Exp．Med．165:1581(1987)；スングら（Sung，S.-S.J．et al.）、J．Exp ．Med．168 :1539（1988）；ターナーら（Turner，M．et al．）、Eur．J．Immun ol．17: 1807-1814(1987)］。最近の証拠 から、自己免疫病理および移植片対宿主病理におけるＴＮＦの関与が示唆されて いる［ピグエットら（Piguet，P.-F．et al.）、J．Exp．Med．166:1280(1987) ］。 自己免疫疾患および炎症性疾患に関する多因子の原因のため、自己免疫疾患お よび炎症性疾患のより良い治療が大いに求められている。発明の概要 本発明は自己免疫疾患や炎症性疾患、とくにリウマチ様関節炎の治療において 、ＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤とＴＮＦアンタゴニストを組み合わせて使用する併用療 法が、各薬剤を単独で使用する場合よりはるかに優れた結果が得られるという発 見に関する。ＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化または抗原提示 細胞（ＡＰＣ）とＣＤ４＋Ｔ細胞の相互作用を遮断、減少、阻害または干渉する 薬剤を含む、例えば、Ｔ細胞またはＴ細胞受容体に対する抗体；ＡＰＣまたはＡ ＰＣ受容体に対する抗体；および他の適当なペプチドまたは小型分子等である。 ＴＮＦアンタゴニストはＴＮＦ活性、ＴＮＦ受容体またはＴＮＦ合成を遮断、減 少、阻害または干渉する薬剤を含む、例えば、抗ＴＮＦ抗体；可溶性ＴＮＦ受容 体；および他の適当なペプチドまたは小型分子等である。 本発明の第１の態様において、抗ＣＤ４抗体は抗ＴＮＦ抗体と併用して（同時 または逐次的に）投与される。本発明の別の態様において、抗ＣＤ４抗体はＴＮ Ｆ受容体／ＩｇＧ融合タンパク質のような可溶性ＴＮＦ受容体と併用して投与さ れる。本発明の第３の態様において、シクロスポリンは抗ＴＮＦ抗体と併用して 投与される。併用療法は、多数のＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤と多数のＴＮＦアンタゴ ニストの併用を含むどんなＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤とどんなＴＮＦアンタゴニスト の併用をも利用することができる。併用療法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤を、ＴＮ Ｆアンタゴニスト以外の炎症メディエーターと併用して利用することもできる。 ＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤とＴＮＦアンタゴニストは薬学的に許容されるビーイク ルとともに投与することができ、投与は単回投与でもよいし、数日ないし数週の 間隔をおいて連続的に投与してもよい。 ＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤とＴＮＦアンタゴニストの併用療法の利点としては、各 治療薬を別々に使用する治療の効果より優れた結果が得られることなどが挙げら れる。また、同程度の免疫応答および炎症応答の低下をもたらすのに用量が少な くて済むので、治療ウィンドウ(therapeutic window)が広がる。用量が少なくて 済むということは、患者の出費を減らし、副作用の発現も減る可能性がある。図面の簡単な説明 図１は、それぞれ図１Ａおよび図１Ｂとした１組のグラフであり、５０μｇの 抗ＴＮＦ（ハムスターＴＮ３．１９．２）および２００μｇの抗ＣＤ４をＤＢＡ ／１雄性マウスに投与後の臨床スコア（図１Ａ）および足蹠腫大測定値（図１Ｂ ）によって関節炎抑制を評価した実験結果を示す。白抜き四 角＝対照；ダイアモンド＝抗ＣＤ４；三角＝抗ＴＮＦ；黒塗り四角＝抗ＣＤ４／ 抗ＴＮＦ。 図２は、それぞれ図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、および図２Ｄとした一連のグラフ であり、臨床スコアおよび足蹠腫大測定値に対する低用量（５０μｇ）抗ＴＮＦ または高用量（３００μｇ）抗ＴＮＦによる抗ＣＤ４の作用の強化を評価した第 ２の実験結果を示す。図２Ａは低用量抗ＴＮＦの場合の臨床スコアであり、図２ Ｂは高用量抗ＴＮＦの場合の臨床スコア、図２Ｃは低用量抗ＴＮＦの場合の足蹠 腫大測定値、図２Ｄは高用量抗ＴＮＦの場合の足蹠腫大測定値である。白抜き四 角＝対照；ダイアモンド＝抗ＣＤ４；三角＝抗ＴＮＦ；黒塗り四角＝抗ＣＤ４／ 抗ＴＮＦ。 図３は、ＤＢＡ／１マウスに２５０μｇのシクロスポリンＡ投与、５０μｇの 抗ＴＮＦ抗体投与、および２５０μｇのシクロスポリンＡと５０μｇの抗ＴＮＦ 抗体の併用投与の後の足蹠腫大測定によって評価された関節炎抑制を示すグラフ である。白抜き四角＝対照；ダイアモンド＝シクロスポリンＡ；三角＝抗ＴＮＦ ；黒塗り四角＝シクロスポリンＡ／抗ＴＮＦ。発明の詳細な説明 本発明は、ＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤をＴＮＦアンタゴニストと併用投与すること によるリウマチ様関節炎などの自己免疫疾患または炎症性疾患の治療に関する。 本発明は、多数のＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤を多数のＴＮＦアンタゴニストと併用す ることをも含む。ここで用いられる「ＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤」という用語は、Ｃ Ｄ４＋Ｔ細胞の活性化または抗原提示細胞（ＡＰＣ）とＣＤ４＋Ｔ細胞の相互作 用を遮断、減少、阻害または干渉する薬剤を指す。ＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤として は、抗ＣＤ４、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ５２（たとえばＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ）、抗 ＩＬ−２ＲなどＴ細胞またはそれらの受容体に対する抗体；抗クラスＩＩ、抗Ｉ ＣＡＭ−１、抗ＬＦＡ−３、抗ＬＦＡ−１などＡＰＣまたはそれらの受容体に対 する抗体；シクロスポリン、特にシクロスポリンＡやＦＫ−５０６などＨＬＡク ラスＩＩグルーブをブロックするかＴ細胞活性化におけるシグナル伝達をブロッ クするものをはじめとするＴ細胞／ＡＰＣ相互作用をブロックするペプチドおよ び小型分子；およびＣＤ１９、２０、２１、２３、およびＢＢ／７またはＢ１、 ＣＤ２８リガンドなどのＣＤ５＋Ｂ細胞などのＢ細胞に対する抗体が挙げられる 。ＣＤ５＋Ｂ細胞などのＢ細胞は、疾患進行において重要なタイプのＡＰＣであ ると考えられている［プラター−ザイベルクら（Plater-Zyberk，C．et al.）、Ann．N.Y．Acad．Sci. 651:540-555（1992）］。したがって、本発明においては 抗Ｂ細胞抗体がとくに有用である。 ここで用いられる「ＴＮＦアンタゴニスト」という用語は、ＴＮＦ活性、ＴＮ Ｆ合成またはＴＮＦ受容体を遮断、減少、阻害または干渉する薬剤を指す、例え ば、抗ＴＮＦ抗体；可溶性ＴＮＦ受容体（モノマー性受容体および／または受容 体を含む融合タンパク質、例えば受容体／ＩｇＧ融合タンパ ク質など）；ペントキシフィリンまたは他のフォスフォジエステラーゼ阻害剤や サリドマイドなどの他の適当なペプチドまたは小型分子である。 本発明におけるＴＮＦアンタゴニスト以外の炎症メディエーターは、ＴＮＦア ンタゴニストの代わりにまたはＴＮＦアンタゴニストに付加して用いることもで きる。培養リウマチ性関節細胞において、ブレナンら(Brennan et al.)[Lancet 11: 244-247(1989)]は、ＴＮＦの遮断がＩＬ−１産生の低レベル調節(down-regul ation)をもたらし、、前炎症性サイトカインであるＧＭ−ＣＳＦの低レベル調節 をもたらしたことを示した。[ハワースら(Haworth et al.)、E.J.I. 21:2575-25 79(1991)]；ブレナンら（Brennan et al.）、準備中]。未発表のデータは、抗Ｔ ＮＦはＩＬ−６産生も遮断することを示す。これらのサイトカインの「ネットワ ーク」すなわち「ヒエラルキー(hierarchies)」はインビボでも作用する；抗Ｔ ＮＦ抗体で処置したリウマチ性関節炎の患者は、処置後数週間以内に、血清ＩＬ −６のレベルばかりでなく、Ｃ反応性タンパク質のようなＩＬ−６依存性の急性 相タンパク質のレベルまでも低下した[エリオットら(Elliott,M.J．et al.)、Ar thritis & Rheumatism 36:1681-1690(1993)]。前炎症メディエーターであるＴＮ Ｆ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−８は同じネットワークすな わち同じヒエラルキーの一部であるので、これらのいずれを遮断しても同等の効 果が得られるであろう、従って、本発明の炎症メディエーターとして使用できる 。炎症メディエーターの代表とし てはＩＬ−１の活性、合成または受容体のシグナル化を遮断、減少、阻害または 干渉する薬剤を含み、例えば抗ＩＬ−１抗体、可溶性ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−１受容 体アンタゴニスト、または他の適当なペプチドおよび小型分子；ＩＬ−６の活性 、合成または受容体のシグナル化を遮断、減少、阻害または干渉する薬剤を含み 、例えば抗ＩＬ−６抗体、抗ｇｐ１３０、または他の適当なペプチドおよび小型 分子；他の炎症メディエーターの活性、合成または受容体のシグナル化を遮断、 減少、阻害または干渉する物質を含み、例えばＧＭ−ＣＳＦおよびヘモカイン（ ＩＬ−８）ファミリーのメンバー；およびＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦβなど 抗炎症性を有するサイトカインなどが挙げられる。さらに、抗リウマチ剤である メソトレキセートのような他の抗炎症剤もＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤および／または ＴＮＦアンタゴニストと併用して投与できる。 本発明の１つの態様において、抗ＣＤ４抗体は抗ＴＮＦ抗体と併用して用いる 。抗体という用語は、ポリクローナルおよびモノクローナル両抗体を包含するも のである。抗体という用語は、ＣＤ４またはＴＮＦと反応する２つ以上の抗体の 混合物（たとえば異なるタイプのＣＤ４またはＴＮＦ反応性モノクローナル抗体 の混合物）をも包含するものである。さらに、抗体という用語は、抗体全体、そ れらの生物学的機能を持つ断片、二重機能性抗体および２つ以上の種の一部分を 含んでなるキメラ抗体を包含する。使用可能な生物学的機能を持つ抗体断片とは 、ＣＤ４またはＴＮＦへの抗体断片の結 合に十分な断片である。 キメラ抗体は、２つの異なる種（たとえばヒトの定常領域とネズミの可変また は結合領域）に由来する部分からなるものであってよい。２つの異なる種に由来 する部分は、従来の方法によって化学的に結合させてもよいし、遺伝子操作技術 を用いて単一の連続タンパク質として調製してもよい。キメラ抗体の軽鎖と重鎖 の両部分のタンパク質をコードするＤＮＡを連続タンパク質として発現させるこ とができる。 体細胞ハイブリダイゼーション技術［ケーラーとミルスタイン（Kohler and M ilstein）、Nature 256:495-497（1975）］やその他の技術により、ＣＤ４また はＴＮＦと反応するモノクローナル抗体を製造することができる。代表的なハイ ブリダイゼーション法では、少なくともＣＤ４またはＴＮＦの一部分からなる粗 製または精製タンパク質またはペプチドを免疫原として使うことができる。動物 に免疫原を接種して、抗ＣＤ４抗体または抗ＴＮＦ抗体産生脾臓細胞を得る。免 疫される動物の種は、目的のモノクローナル抗体の種によって異なる。抗体産生 細胞を不滅化細胞（たとえば黒色腫細胞）と融合させて、抗ＣＤ４抗体または抗 ＴＮＦ抗体を分泌する能力を有するハイブリドーマを作成する。融合しなかった 残りの抗体産生細胞と不滅化細胞は除去される。目的の抗体を産生するハイブリ ドーマを従来の方法を用いて選択し、選んだハイブリドーマをクローン化し、培 養する。 動物に少なくともＣＤ４またはＴＮＦの一部分からなる粗製または精製タンパ ク質またはペプチドを免疫投与すること によって、ポリクローナル抗体を製造することができる。動物は、ＣＤ４または ＴＮＦと反応する抗体が産生される条件下で飼育される。目標の抗体値に達した ら、動物から採血する。ポリクローナル抗体含有血清（抗血清）を他の血液成分 から分離する。ポリクローナル抗体含有血清をさらに分離して、特定タイプの抗 体（たとえばＩｇＧ、ＩｇＭ）の画分に分けることができる。 ＣＤ４特異的抗体は、実験的に誘導された自己免疫疾患および自然発生的な自 己免疫疾患の両方に対し広いレンジにわたる処置に使用されてきた。抗ＣＤ４抗 体およびそれらの疾患治療用途に関するさらに詳細な説明が下記文献に記載され ており、それらの記載内容は引例として本発明に含まれるものとする。[米国特 許出願第０７／８６７，１００号、１９９２年６月２５日出願；グレイヘブら(G rayheb，J．et al.)、J．of Autoimmunity 2:627-642（1989）；ランゲスら（Ra nges，G.E．et al．）、J．Exp．Med．162:1105-1110（1985）；ホムら（Hom，J .T．et al.）、Eur．J．Immunol．18:881-888（1988）；ウーリーら（Wooley，P .H．et al．）、J．Immunol．134:2366-2374（1985）；クーパーら（Cooper，S. M．et al．）、J．Immunol．141:1958-1962（1988）；バン・デン・ブロエクら （Van den Broek，M.F．et al.）、Eur．J．Immunol．22:57-61（1992）；ウォ フシーら（Wofsy，D．et al.）、J．Immunol．134:852-857（1985）；ウォフシ ーら（Wofsy，D．et al.）、J．Immunol．136:4554-4560（1986）；エルマーク ら（Ermak，T.J．et al.）、Laboratory Investi gation 61: 447-456（1989）；レイテルら（Reiter，C．et al．）、34:525-532 （1991）；ヘルゾーグら（Herzog，C．et al．）、J．Autoimmun．2:627（1989 ）；オウヤンら（Ouyang，Q．et al．）、Dig．Dis．Sci．33:1528-1536（1988 ）；ヘルゾーグら（Herzog，C．et al．）、Lancet，p．1461（December 19，19 87）；エムリッヒら（Emmrich，J．et al.）、Lancet 338:570-571(August 31， 1991)]。 抗ＴＮＦ抗体およびそれらの疾患治療用途に関するさらに詳細な説明が下記文 献に記載されており、それらの記載内容は引例として本発明に含まれるものとす る。[米国特許出願第０７／９４３，８５２号、１９９２年９月１１日出願；ル ビンら（Rubin et al.）、ＥＰＯ特許公開第０２１８８６８号、１９８７年４月 ２２日公開；ヨネら（Yone et al．）、ＥＰＯ特許公開第０２８８０８８号、１ ９８８年１０月２６日公開；リアングら（Liang，C.-M．et al．）、Biochem．B iophys．Res．Comm. 137:847-854（1986）；ミーガーら（Meager，A．et al．） 、Hybridoma 6:305-311（1987）；フェンドリーら（Fendly et al．）、Hybrido ma 6:359-369（1987）；ブリングマンら（Bringman，T.S．et al．）、Hybridom a 6:489-507（1987）；ブリングマンら（Bringman T.S．et al．）、Hybridoma 6:489-507(1987)；ヒライら（Hirai，M．et al.）、J．Immunol．Meth．96:57-6 2（1987）；モラーら（Moller，A．et al．）、Cytokine 2:162-169（1990）； マティソンら（Mathison，J.C．et al．）、J．Clin．Invest. 81:1925-1937（1 988）；ベウトラーら（Beutler，B．et al.） 、Science 229:869-871（1985）；トレーシーら（Tracey，K.J．et al．）、Nat ure 330:662-664（1987）；シマモトら（Shimamoto，Y．et al.）、Immunol．Le tt. 17:311-318（1988）；シルバら（Silva，A.T．et al.）、J．Infect．Dis． 162:421-427（1990）；オパールら（Opal，S.M．et al．）、J．Infect．Dis．1 61:1148-1152（1990）；ヒンショーら（Hinshaw，L.B．et al.）、Circ．Shock 30:279-292（1990）；Lancet 342:173-174(1993)；ウイリアムスら(Williams,R. O．et al.)、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:9784-9788(1992)]。 ＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤およびＴＮＦアンタゴニストは、従来の無毒の薬学的に 許容される担体、アジュバント、およびビーイクルを含む処方として、皮下投与 、静脈内投与、筋肉内投与、局所投与、経口投与、直腸内投与、経鼻的投与、経 頬的投与、経膣的投与、吸入噴霧投与、または留置片(implanted reservoir)投 与などを含む種々の経路で投与することができる。薬剤が投与される剤形（たと えばカプセル、錠剤、溶液、乳剤）は、少なくとも部分的には投与経路によって 決まる。 抗ＣＤ４薬剤と抗ＴＮＦ薬剤を組み合わせたものの治療有効量とは、ある自己 免疫疾患または炎症性疾患に伴う症状を有意に抑制または除去するのに要する量 をいう。治療有効量は個体ベースで決定され、少なくとも一部は使用薬剤の特殊 性、その個体のサイズ、治療しようとする症状の程度、目標とする効果などを考 慮して決められる。例えば１つの態様に おいて、抗ＣＤ４抗体と抗ＴＮＦ抗体の併用投与の好ましい治療有効量とは、各 抗体について投与１回あたり０．１〜１０ｍｇ／ｋｇである。したがって、治療 有効量は、通常の技術を有する者であれば上記因子を用いて常法による実験を行 なうことによって決定することができる。 治療有効量は、単回投与または数日ないし数週の間隔を置いて連続投与するこ とができる。治療有効量を投与したら、維持量の抗ＣＤ４薬剤、抗ＴＮＦ薬剤ま たは抗ＣＤ４薬剤と抗ＴＮＦ薬剤を組み合わせた物を投与することができる。維 持量とは、治療有効量によって達成された症状の抑制または除去を維持するのに 要する抗ＣＤ４薬剤、抗ＴＮＦ薬剤、または抗ＣＤ４薬剤と抗ＴＮＦ薬剤を組み 合わせた物の量をいう。この維持量は、単回投与または数日ないし数週の間隔を 置いて連続投与することができる。治療有効量と同様に、維持量も個体ベースで 決定される。 したがって、本発明の併用療法はヒトおよび動物の多くの自己免疫疾患や炎症 性疾患の治療に有用である。ヒトにおいては、本療法が適している疾患としては 、リウマチ様関節炎（ＲＡ）および若年性慢性関節炎（ＪＣＡ）などが挙げられ る。併用療法に適したその他の疾患としては、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、炎 症性腹症関連関節炎などの脊椎関節症；結節性多発性動脈炎、ベーゲナー肉芽腫 症、巨細胞性動脈炎、ヘーノホーシェーンライン紫斑病、腎臓の顕微脈管炎など の脈管障害；シェーグレン症候群；全身性狼瘡；クローン病および潰瘍性大腸炎 などの炎症性腹症；慢性活動性肝炎；原 発性胆汁性肝硬変；原因不明繊維形成肺胞炎およびその他の繊維形成肺疾患；ブ ドウ膜炎；多発性硬化症；重症筋無力症；溶血性貧血；強皮症；移植片対宿主疾 患(graft versus host disease)；アレルギー；および腎臓、肝臓、心臓、肺、 骨髄、皮膚、その他器官の移植などが挙げられる。 以下、実施例により本発明をさらに詳細かつ具体的に説明する。実施例１ 抗ＣＤ４抗体および抗ＴＮＦ抗体を使用したネズミモデルにおける誘 導関節炎の治療 コラーゲンＩＩ型誘導関節炎のネズミモデルは、顕著なＭＨＣクラスＩＩ素因 、ならびに組織学的特徴、免疫組織学的特徴、および軟骨と骨の侵食の点でリウ マチ性関節炎（ＲＡ）と類似性がある。さらに、治療上の応答とヒトのリウマチ 性関節炎とは良い相関がある。例えば、両疾患において、抗ＴＮＦ抗体は有益な 効果があり[ウイリアムスら(Williams,R.O．et al.)、PNAS 89:9784-9788(1992) ；エリオットら(Elｌiott,M.J．et al.)、Arthritis & Rheumatism 36:1681-90( 1993)]、抗ＣＤ４抗体は最小の効果がある[ウイリアムスら(Williams,R.O．et a l.)、PNAS(投稿中)(1994)およびホーネフら(Horneff,G．et al.)、Arthritis & Rheumatism 1991:34-129(1992)]。したがって、この動物モデルはヒトの疾患に よく近似したモデルとして使用することができる。 本実施例で使用したリウマチ様関節炎モデルは、ウイリアムスら［（Williams ，R.O．et al．）、PNAS 89:9784-9788 (1992)］によって記載されているＤＢＡ／１マウスのコラーゲンＩＩ型誘導関節 炎である。ＩＩ型コラーゲンは、ミラーが述べるように［Miller、Biochemistry 11:4903-4909(1972)］、限定的ペプシン可溶化と塩分画法によってウシ関節軟 骨から精製した。Ａ． 試験１ ８〜１２週齢の雄性ＤＢＡ／１マウスに、フロインドの完全アジュバント(Dif co Laboratories,East Molsey,UK)に乳化した１００μｇのウシＩＩ型コラーゲ ンを皮内免疫投与し、２１日後に１００μｇのコラーゲンを腹腔内（ｉ．ｐ．） に免疫投与した。最初の注射から約３５日目に臨床的に明白な関節炎症状（１肢 以上に赤変と腫脹の両方または一方が見られる）が発現した直後に、マウスに抗 ＣＤ４、抗ＴＮＦ、抗ＣＤ４と抗ＴＮＦの両方、またはイソタイプ対照をi.p.注 射した。関節炎の臨床スコアと足蹠腫大測定値を１０日間モニターした。抗体投 与は１日目（発症時）、４日目、および７日目に行なった。 臨床スコアと足蹠腫大 ２つの実験を行ない、臨床スコアと足蹠腫大を評価した。各実験では、注射１ 回あたり２００μｇの抗ＣＤ４（ラットＹＴＳ１９１およびＹＴＡ３．１）を使 用した。臨床スコアは以下の基準で評価した。０＝正常、１＝軽度の腫大と紅斑 の両方または一方、２＝顕著な水腫、３＝関節硬直。各肢に ついて等級評価し、マウス１匹あたり最高１２点のスコアを与えた。足蹠腫脹は 、障害を有する後足蹠の厚みをキャリパーで測定することによってモニターした 。結果は、関節炎発症前の足蹠幅に対する足蹠幅の増大率で示した。 第１の実験では、注射１回あたり５０μｇの抗ＴＮＦ（ハムスターＴＮ３．１ ９．２）を１群あたり５匹のマウスそれぞれに単回投与した。抗ＣＤ４または抗 ＴＮＦ（ＴＮ３．１９を５０μｇ／マウスの用量で３回投与）の有意な作用はみ られなかった。臨床スコアと足蹠腫脹のいずれについても併用療法の利点が明白 に認められる（図１Ａと図１Ｂ参照）。 第２の実験では、５０μｇまたは３００μｇの抗ＴＮＦを１群あたり７匹のマ ウスそれぞれに投与した。抗ＣＤ４と低濃度（５０μｇ）の抗ＴＮＦはいずれも いくらかの作用を示し、この２つの濃度の併用療法の利点は、足蹠腫脹について は認められたが、臨床スコアでは認められなかった。しかし、抗ＴＮＦを３００ μｇ／マウスの用量で投与したところ、抗ＣＤ４との併用療法の利点が臨床スコ アと足蹠腫脹の両方で見られ、足蹠腫脹でより明白であった（図２Ａ、図２Ｂ、 図２Ｃ、図２Ｄ参照）。 上記実験の結果は、抗ＴＮＦ抗体と抗ＣＤ４抗体を組み合わせて用いる併用療 法は臨床スコアと足蹠腫脹で評価できる明白な利点があることを示すものである 。Ｂ． 試験２ ８〜１２週齢の雄性ＤＢＡ／１マウスに、フロインドの完 全アジュバント(Difco Laboratories,East Molsey,UK)に乳化した１００μｇの ＩＩ型コラーゲンを皮内免疫投与した。１肢以上で紅斑と腫脹の両方または一方 が初めて見られた日を関節炎発症１日目とした。関節炎は、ＩＩ型コラーゲン免 疫後３０日目ごろに臨床的に明白となった。各マウスにつき、関節炎が初めて見 られた日に処理を開始し、１０日にわたり処理を続け、その後マウスを屠殺し、 関節を組織検査用に処理した。１日目、４日目、および７日目にモノクローナル 抗体（ｍＡｂ）処理を行なった。抗ＴＮＦ抗体として、中和性のハムスターＩｇ Ｇ１抗ＴＮＦα／βモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるＴＮ３−１９．１２を 使用した[シーハンら（Seehan,K.C.et al.）、J.Immunology 142:3884-3893(198 9)]。イソタイプ対照はＬ２であった。抗ＴＮＦ抗体とイソタイプ対照はセルテ ック社（Celltech,Slough,UK）と共同で、ワシントン大学医学部(St.Louis,MO,U SA)のシュライバー(R.Schreiber)より供与された。ＹＴＳ１９１．１．２とＹＴ Ａ３．１．２の１：１混合物よりなる細胞を除去した抗ＣＤ４モノクローナル抗 体（ラットＩｇＧ２ｂ）は、ウォルトマン(H.Waldmann)(University of Cambrid ge,UK)により供与された[ガルフレら(Galfre,G．et al.)、Nature 277:131-133( 1979)；コッブボルドら(Cobbold,S.P．et al.)、Nature 312:548-551(1984)；キ ンら(Qin,S．et al.)、European J．Immunology 17:1159-1165(1987)]。 足蹠腫大 まず、５０μｇという最適用量以下(sub-optimal dose)の抗ＴＮＦを単独で投 与した場合を、同用量で２００μｇの抗ＣＤ４と併用投与した場合と比較した。 結果を確認するために、上記と同一内容の２つの実験を別に行なった（それぞれ マウス１１〜１２匹／群および７〜８匹／群）。抗ＣＤ４単独でも最適用量以下 の抗ＴＮＦ単独でも、足蹠腫大を有意に低下させることはできなかった（データ は示さない）。しかし、抗ＴＮＦと抗ＣＤ４の併用処理は、対照ｍＡｂを投与さ れた群と比べて、足蹠腫大が一貫して統計的に有意な低下を引き起こした（Ｐ＜ ０．００１）。さらに、いずれの実験においても、抗ＴＮＦ／抗ＣＤ４併用処理 （本明細書では抗ＣＤ４／抗ＴＮＦ処理ともいう）は、抗ＣＤ４単独および抗Ｔ ＮＦ単独と比べて足蹠腫大を有意に低下させた（Ｐ＜０．０５）。 次に、最適用量の抗ＴＮＦ（３００μｇ）を単独投与した場合と、同用量で抗 ＣＤ４と併用投与した場合を、同一内容の別の２つの実験（それぞれマウス７〜 ７匹／群およびマウス６〜７匹／群）と比較した。前記試験同様、抗ＴＮＦ／抗 ＣＤ４併用処理は、対照ｍＡｂを投与された群と比べて足蹠腫大を有意に低下さ せた（Ｐ＜０．００５、データは示さない）。第１の実験では、抗ＣＤ４単独ま たは抗ＴＮＦ単独を投与された群と比べても、足蹠腫大は抗ＣＤ４／抗ＴＮＦ併 用処理群で有意に低下した（Ｐ＜０．０５）。有意差はなかったが、抗ＴＮＦ単 独または抗ＣＤ４単独の投与を受けたマウスで足蹠腫大がある程度低下したが、 これはおそらく群サ イズが小さいことによるものであろう（１群あたり６匹）。第２の実験では、抗 ＣＤ４／抗ＴＮＦ併用投与は抗ＣＤ４単独投与と比べて足蹠腫大を有意に低下さ せたが（Ｐ＜０．０５）、抗ＴＮＦ単独と比べると有意な低下はなかった。これ は、過去の研究［ウイリアムスら（Williams，R.O．et al.）、PNAS 89:9784-97 88(1992)］から予想されたように、抗ＴＮＦ自体が足蹠腫大の有意な低下を引き 起こしたからである。実験では、抗ＴＮＦ単独に起因する足蹠腫大低下率はそれ ぞれ２３％と３３％であった。したがって、抗ＴＮＦ処理による足蹠腫脹低下は 、ＴＮ３−１１９．１２（３００μｇ／マウス）による処理が処理期間を通じて 対照と比べて平均約３４％の足蹠腫大測定値の低下をもたらした既報の知見にほ ぼ匹敵するものである［ウイリアムスら（Williams，R.O．et al．）、PNAS 89: 9784-9788(1992)］。 四肢での併発 コラーゲン誘導関節炎では、ＲＡの場合と同様に、臨床疾患が最初に発現した 後に新たに別の四肢に併発するのが普通であり、新たな四肢での併発はこの疾患 の進行の重要な指標である。新たな四肢での併発に及ぼす抗ＣＤ４／抗ＴＮＦ処 理の影響を調べるために、10日間の処理期間の最終日に臨床的に検出可能な関節 炎を有する四肢の数を処理前の関節炎四肢数と比較した。対照ｍＡｂを投与され たマウスでは、症状を有する肢が１０日間に約５０％増加した。上記２つの実験 の結果をまとめて表１に示す。 抗ＣＤ４単独および最適用量以下の抗ＴＮＦ単独の投与を受けた群において四 肢への新たな影響が減ったが、その差は有意でなかった。最適用量の抗ＴＮＦを 投与された群では、四肢への影響の増加率は１０％未満であった（Ｐ＜０．０５ ）。しかし、さらに注目すべき点は、抗ＣＤ４／抗ＴＮＦの併用投与を受けた群 で四肢への新たな影響がほとんどなかっ たことである。新たな四肢への影響の増加は、抗ＣＤ４と最適用量以下の抗ＴＮ Ｆの投与を受けたマウスではわずか３％であり（Ｐ＜０．０５）、抗ＣＤ４と最 適用量の抗ＴＮＦの投与を受けたマウスでは０％（Ｐ＜０．００５）であった。 組織学的特徴 １０日後、マウスを屠殺し、最初に関節炎の臨床症状を示した四肢を各マウス から切除し、ホルマリン固定し、脱カルシウム化し、ワックス埋入した後、切片 を作成し、ヘマトキシリンとエオジンで染色した。中指近位指節間（ＰＩＰ）関 節の矢状切片について、軟骨と骨のいずれかに侵食があるかどうかを盲検的に調 べた（炎症組織が充満した軟骨または骨の分界欠損(demarcated defects)として 判定）。比較は同一関節についてのみ行ない、関節炎は同一継続期間のものとし た。侵食は対照群のＰＩＰ関節のほぼ１００％で見られ、抗ＣＤ４単独または最 適用量以下の抗ＴＮＦ単独の投与を受けた関節の約７０〜８０％で見られた。上 記２つの実験の結果をまとめ、表２に示す。 最適用量の抗ＴＮＦ単独を投与した場合、既報［ウイリアムスら（Williams， R.O．et al．）、PNAS 89:9784-9788（1992）］の通り病変が有意に低下した。 したがって、最適用量の抗ＴＮＦ単独の投与を受けたマウスでは、侵食変化を示 した関節の割合は５４％に低下し（Ｐ＜０．００１）、抗ＣＤ４と最適用量以下 または最適用量の抗ＴＮＦを投与された群ではそれぞれ関節の２２％（Ｐ＜０． ０１）と３１％（Ｐ＞０．０１）のみが侵食された。このように、３００μｇの 抗ＴＮＦ単独投与により関節侵食からある程度保護されたが、抗ＣＤ４／抗ＴＮ Ｆを併用投与すると保護の程度が有意に高くなった。 ＣＤ４＋Ｔ細胞の減少 抗ＣＤ４処理がどの程度まで末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞を減少させるかをフローサイ トメトリー法によって測定した。解離脾臓細胞または末梢血におけるＣＤ４＋リ ンパ球の比率を計算するために、細胞をフィコエリスリン−コンジュゲート化抗 ＣＤ４（Becton Dickinson，Oxford，UK）とともにインキュベーションした後、 リンパ球画分上にスキャッターゲートを設定するフローサイトメトリー法（FACS can，Becton Dickinson）によって分析した。抗ＣＤ４処理によって、脾臓のＣ Ｄ４＋細胞は９８％（±１％）減少し、血液中のＣＤ４＋Ｔ細胞は９６％（±３ ％）減少した。 免疫組織化学 次に、末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞が実質的に全て除去されても関節内にＣＤ４＋Ｔ細 胞が残存している可能性があるかどうか、処理済み関節炎マウスから採取した切 片の免疫組織化学的分析によって調べた。ワックス埋入切片を脱ワックス処理し 、トリプシン消化した後、抗ＣＤ４ｍＡｂ（ＹＴＳ１９１．１．２／ＹＴＡ３． １．２）とともにインキュベーションした。ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴ細胞同一性(T c ell identity)を確認するために、一連の切片を抗Ｔｈｙ−１ｍＡｂ（ＹＴＳ１ ５４．７）で染色した［コッブボルドら（Cobbold，S.P．et al.）、Nature 312 :548-551（1984）］。対照切片は、ＨＲＰＮ１１／１２ａとともにインキュベー ションした。結合抗体の検出は、既報［デレウランら（Deleuran，B.W．et al. ）、Arthritis & Rheumatism 34:1125-1132(1991)］に従い、アルカリホスファ ターゼ／ラット抗アルカリホスファターゼ複合体（ＡＰＡＡＰ、Dako，High Wyc ombe，UK）および高速赤色基質(fast red substrate)によつておこなった。対照 ｍＡｂ投与マウスだけでなく、抗ＣＤ４処理マウスの関節からも少数のＣＤ４＋ Ｔ細胞が検出された（データは示さない）。さらに、調べた少数のマウス（１処 理群あたり４匹）の範囲内では、抗ＣＤ４単独投与または抗ＣＤ４と抗ＴＮＦの 併用投与を受けた群にＣＤ４＋Ｔ細胞数の有意な減少は見られなかった（データ は示さない）。したがって、抗ＣＤ４処理は関節からＣＤ４＋Ｔ細胞を除去しな かったことになる。 抗コラーゲンＩｇＧ値 酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって血清抗コラーゲンＩｇＧ値を 測定した。マイクロタイタープレートにウシＩＩ型コラーゲン（２μｇ／ｍｌ） を被覆し、ブロックした後、段階的に希釈した一連の試験血清とともにインキュ ベーションした。結合ＩｇＧの検出は、アルカリホスファターゼ−コンジュゲー ト化ヤギ抗マウスＩｇＧとともにインキュベーションし、次いで基質（ジニトロ フェニルホスフェー ト）を加えることによって行なった。４０５ｎｍで光学密度を読み取った。アフ ィニティー精製マウス抗ＩＩ型コラーゲン抗体からなる参照試料を各プレートに 加えた。結果を表３に示す。 抗ＣＤ４単独、抗ＴＮＦ単独、あるいは抗ＣＤ４と抗ＴＮＦを組み合わせたもの を投与しても、１０日間の処理期間中に抗ＩＩ型コラーゲンＩｇＧの血清値は有 意な変化を示さなかった。 抗グロブリン応答 抗ＣＤ４処理が抗ＴＮＦｍＡｂに対する中和性抗グロブリン応答を防止するか どうかを調べるために、ＥＬＩＳＡで測定した１０日目のＩｇＭ抗ＴＮ４−１９ ．１２値を比較した。この時点では、ＩｇＧ抗ＴＮ３−１９．１２応答は検出さ れなかった。マイクロタイタープレートにＴＮ３−１９．１２（５μｇ／ｍｌ） を被覆し、ブロックした後、一連の希釈試験血清とともにインキュベーションし た。ヤギ抗マウスＩｇＭアルカリホスファターゼコンジュゲートを加え、次いで 基質を加えることによって、結合ＩｇＭを検出した。その結果、抗ＣＤ４は、抗 ＴＮ３−１９．１２抗体応答の発現の防止に非常に有効であることがわかった（ 表４）。次に、抗ＣＤ４処理が循環抗ＴＮＦ−α値の上昇をもたらす（ハムスタ ー抗ＴＮＦに対する抗体応答を低下させることによって）かどうかを調べるため に、実験１０日目に組換えネズミＴＮＦ−αを用いて、マウス血清中遊離ＴＮ３ −１９．１２を検出するＥＬＩＳＡを行なった。マイクロタイタープレートに組 換えネズミＴＮＦ−αを被覆し、ブロックした後、試験血清とともにインキュベ ーションした。次いで、ヤギ抗ハムスターＩｇＧアルカリホスファターゼコンジ ュゲート（ネズミＩｇＧに吸着させたもの）を加え、次いで基質を加えた。既知 濃度のＴＮ３−１９．１２試料と比較することで定量を行なった。結果を表４に 示す。 ＴＮ３−１９．１２値は、抗ＴＮＦ単独投与の場合と比べて、抗ＣＤ４と抗ＴＮ Ｆを併用投与した群でやや上昇したが、その差は統計的に有意ではなかった。実施例２ ＴＮＦ受容体／ＩｇＧ融合タンパク質と抗ＣＤ４抗体を併用したネズ ミモデルにおける誘導関節炎の治療 コラーゲン誘導関節炎における関節疾患の重症度を調節する可能性について、 抗ＣＤ４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）とヒトｐ５５ＴＮＦ受容体／ＩｇＧ融合 タンパク質の併用の有効性を調べるため、上述のようなコラーゲンＩＩ型誘導関 節炎のネズミモデルを使用した。第１に、ＴＮＦ受容体／ＩｇＧ融合タンパク質 処置、抗ＴＮＦｍＡｂ処置および高用量のコルチコステロイド療法間の有効性を 比較した。続いて、 抗ＣＤ４抗体とＴＮＦ受容体／ＩｇＧ融合タンパク質の併用療法を調べた。Ａ． 実験手順 雄性ＤＢＡ／１マウスに、フロインドの完全アジュバント(Difco Laboratorie s,East Molsey,UK)に乳化した１００μｇのウシＩＩ型コラーゲンを皮内投与し て免疫した。関節炎発症日の平均は、免疫後約１カ月であった。臨床的に明白な 関節炎症状（紅斑と腫脹の両方または一方）が発現した後に、マウスに治療剤を 腹腔内注射した。関節炎の臨床スコアと足蹠腫大（キャリパーで測定）を１０日 間モニターし、その後マウスを屠殺し、関節を組織検査用に処置した。血清は分 析のため１０日目に採取した。１日目（発症時）、４日目および７日目に治療剤 を投与した。治療剤は、ＴＮＦ受容体／ＩｇＧ融合タンパク質（ｐ５５−ｓｆ２ ）、抗ＴＮＦ抗体、抗ＣＤ４抗体およびメチルプレドニソロンアセテートなどで あった。Ｂ． ＴＮＦ受容体／ＩｇＧ融合タンパク質、抗ＴＮＦ抗体、またはメチルプレ ドニソロンアセテートによる治療の比較 上記の実験手順を用いて、ＴＮＦ受容体／ＩｇＧタンパク質（２μｇ）（１８ 匹）、ＴＮＦ受容体／ＩｇＧタンパク質（２０μｇ）（１８匹）、ＴＮＦ受容体 ／ＩｇＧタンパク質（１００μｇ）（１２匹）、抗ＴＮＦモノクローナル抗体（ ｍＡｂ）（３００μｇ）（１７匹）、メチルプレドニソロンアセテート（６匹） 、無関係なヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（６匹）または生理食塩 水（対照）でマウス群を処置した。ＴＮＦ受容体／ＩｇＧ融合タンパク質を、本 明細書ではｐ５５−ｓｆ２と称する[バトラーら(Butler et al.)、Cytokine(投 稿中)：(1994)]、セントコール社（Centocor Inc．、Malvern PA）より購入した ；それは２量体であり、Ｊ配列の一部と融合したヒトｐ５５ＴＮＦ受容体（細胞 外領域）からなる。そしてこのＪ配列にはそれ自身κ軽鎖の定常領域と会合して いるヒトＩｇＧ重鎖の定常領域全体が結合している。抗ＴＮＦ抗体はＴＮ３−１ ９．１２、すなわち、中和するハムスターＩｇＧ１抗ＴＮＦα／βモノクローナ ル抗体[シーハンら(Sheehan,K.C．et al.)、J.Immunology 142:3884-3893(1989) ]であり、セルテック社（Celltech,Slough,UK）と共同で研究しているワシント ン大学メディカルスクール(St.Louis,MO,USA)のシュライバー(R.Schreiber)より 供与された。中和価は、３量体の組換えネズミＴＮＦαによるＷＥＨＩ１６４細 胞の死滅を５０％阻害させるのに必要なＴＮＦα中和剤の濃度として表した；６ ０ｐｇ／ｍｌのマウスＴＮＦαを使用しての、ｐ５５−ｓｆ２の中和価は、抗Ｔ ＮＦｍＡｂ（ＴＮ３−１９．１２）に対する６２．０ｎｇ／ｍｌと比較して０． ６ｎｇ／ｍｌであった。上記の方法を用いて、コルチコステロイドであるメチル プレドニソロンアセテート(Upjohn,Crawley,UK)を、２ｍｇ／ｋｇ体重の用量レ ベルで水溶性懸濁物として腹腔内注射により投与した 。この用量は４．２ｍｇ／ｋｇ／週と同等であり、ヒトの難治性ＲＡを治療する ときに用いられる典型的な用量（１−２ｍｇ／ｋｇ／週）よりも高い量である。 足蹠腫大 ｐ５５−ｓｆ２での処置は、処置期間にわたって足蹠腫大において用量依存性 の低下という結果となり、２０μｇおよび１００μｇの用量を用いた場合、生理 食塩水を与えたマウスと比較して統計的に有意な低下を示した（Ｐ＜０．０５） 。対照として無関係なヒトＩｇＧ１ｍＡｂを与えたマウス群は、生理食塩水処置 群と何の偏差も示さなかった（データは示さない）。このことは、ｐ５５−ｓｆ ２の治療上の効果はヒトＩｇＧ１定常領域よりもＴＮＦ受容体に帰因させうるこ とを示した。足蹠腫大の阻害において、抗ＴＮＦｍＡｂは限界的投与ではｐ５５ −ｓｆ２よりも効果的であったけれども、３００μｇの抗ＴＮＦｍＡｂを与えた マウスは、１００μｇのｐ５５−ｓｆ２を与えたマウスと同程度の足蹠腫大低下 が見られた。メチルプレドニソロンアセテート治療群においては、１００μｇの ｐ５５−ｓｆ２または３００μｇの抗ＴＮＦｍＡｂが示した低下に匹敵する大き さの足蹠腫大低下が観察された。 四肢での併発 １０日間の処置期間にわたって、関節炎の四肢の数の変化を観察した。結果を 表５に示す。 ｐ５５−ｓｆ２、抗ＴＮＦｍＡｂまたはメチルプレドニソロンアセテートを与え たマウス群において、四肢の回復への強い傾向が見られたが、抗ＴＮＦｍＡｂ処 置群においてのみ、統計的に有意な回復に到達した（Ｐ＜０．０５）。 組織学的特徴 １０日後、マウスを屠殺し、最初に関節炎の臨床症状を示した四肢を各マウス から切除し、固定し、脱カルシウム化し 、ワックス埋入し、切片を作成し、ヘマトキシリンとエオジンで染色した。各マ ウスの中指近位指節間（ＰＩＰ）関節の矢状切片について、軟骨と骨のいずれか に侵食があるかどうかを上述のように盲検的に調べ、エオジンの有無によって分 類した。従って、比較は同一関節について行ない、関節炎は同一継続期間のもの とした。結果を表６に示す。 生理食塩水処置群、対照ヒトＩｇＧ１処置群において、ＰＩＰ関節の侵食がそれ ぞれ９２％および１００％存在した。しかし、ｐ５５−ｓｆ２（１００μｇ）で 処置されたマウスの関節では僅か５０％（Ｐ＜０．０５）しかおよび抗ＴＮＦｍ Ａｂ処置マウスでは僅か４１％（Ｐ＜０．０１）しか侵食変 化を示さなかった。２μｇまたは２０μｇのｐ５５−ｓｆ２処置マウスにおいて 、侵食された関節の比率の多少の低下が観察されたが、それらは統計的に有意で はなかった。同様に、メチルプレドニソロンアセテート処置も関節侵食を有意に 低下させなかった。 抗コラーゲン抗体値 既知のＥＬＩＳＡ法［ウイリアムスら（Williams，R.O．et al．）、PNAS 89: 9784-9788（1992）］により、１０日目における抗コラーゲンＩｇＧ値を測定し たマイクロタイタープレートをＩＩ型コラーゲンで増感し、それから、段階的に 希釈した一連の試験血清とともにインキュベートした。結合ＩｇＧの検出は、ア ルカリホスファターゼ−コンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ、続いて基質（ジ ニトロフェニルホスフェート）を用いて行なった。４０５ｎｍで光学密度を読み 取った。どんな処置群間の差異も検出しなかった（データは示さない）。このこ とより、ｐ５５−ｓｆ２の治療効果は一般的な免疫抑制効果に依るものではない ことが示唆される。Ｃ． 抗ＣＤ４抗体とｐ５５−ｓｆ２の併用処置の効果 融合タンパク質で処置したマウスにおいて検出されたｐ５５−ｓｆ２に対する 抗体の力価が高いという観点に立って１つの実験を行い、抗ＣＤ４モノクローナ ル抗体（ｍＡｂ）の同時投与がｐ５５−ｓｆ２の治療効果を高めるかどうかを決 定した。上述の実験手順を用いて、３つの異なる処置法を比 較した：抗ＣＤ４ｍＡｂ単独（２００μｇ）、ｐ５５−ｓｆ２単独（１００μｇ ）または抗ＣＤ４ｍＡｂ（２００μｇ）＋ｐ５５−ｓｆ２（１００μｇ）。４番 目の群は未処置の対照マウスよりなるものであった。ＹＴＳ１９１．１．２とＹ ＴＡ３．１．２の１：１混合物よりなる細胞を除去した抗ＣＤ４ｍＡｂ（ラット ＩｇＧ２ｂ）は、ウォルトマン(H.Waldmann)(University of Cambridge,UK)より 供与された[ガルフレら(Galfre,G．et al.)、Nature 277:131-133(1979)；コッ ブボルドら(Cobbold,S.P．et al.)、Nature 312:548-551(1984)；キンら(Qin,S ．et al.)、European J．Immunology 17:1159-1165(1987)]。ｐ５５−ｓｆ２に ついては前記記載の通りである。 足蹠腫大 ｐ５５−ｓｆ２単独での処置は、足蹠腫大を著しく阻害したが、ｐ５５−ｓｆ ２と抗ＣＤ４ｍＡｂの併用による相乗阻害効果は顕著であった。それに反し、抗 ＣＤ４ｍＡｂ単独での処置は、足蹠腫大に対しほとんど効果を示さなかった。 四肢での併発 前述のように、関節炎が最初に発現した後の別の四肢での進行的併発を研究し た。結果を表７に示す。 対照群では、四肢での併発が平均７１％増加し、抗ＣＤ４ｍＡｂ単独投与群では ５６％に低下し、そして、ｐ５５−ｓｆ２投与群ではわずか１９％に低下した。 しかし、抗ＣＤ４ｍＡｂ＋ｐ５５−ｓｆ２投与群では、四肢での併発の増加は０ ％で統計上有意な差異であった。 組織学的特徴 上記のように、処置したマウスのＰＩＰ関節の組織学的分析を行った。結果を 表８に示す。 対照群と抗ＣＤ４ｍＡｂ単独投与群は同じ結果を示し、両群で有意な侵食を示す ＰＩＰ関節は６／６（１００％）であった。しかし、ｐ５５−ｓｆ２単独投与群 ではＰＩＰ関節の２／６（３３％）だけが侵食を示した。抗ＣＤ４プラスｐ５５ −ｓｆ２投与群では、関節の１／６（１７％）だけが侵食を示した。 ｐ５５−ｓｆ２に対する抗体応答 処置期間の終わりに（１０日目）、注射したｐ５５−ｓｆ２に対するＩｇＭ／ ＩｇＧ応答をＥＬＩＳＡ法で測定した。マイクロタイタープレートをｐ５５−ｓ ｆ２（５μｇ／ｍｌ）で被覆し、ブロックした後、段階的に希釈した一連の試験 血清とともにインキュベートした。生理食塩水で処置したマウス由来の血清を負 の対照とした。結合ＩｇＭまたはＩｇＧは、適切なアルカリホスファターゼ−コ ンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇ続いて基質、により検出した。結果を表９に示 す。 ｐ５５−ｓｆ２に対するＩｇＭとＩｇＧの両抗体の高力価が処置マウスに検出さ れ、１００μｇの用量を投与したマウスに最高の力価が見られた。これらの結果 は、ヒトのタンパク質由来のｐ５５−ｓｆ２がマウスにおいて高い免疫原性を持 つことを示す。このことは、インビトロでの融合タンパク質のより高い中和価に もかかわらず、上記Ｂのセクションで述 べたように、インビボでは抗ＴＮＦｍＡｂの方が若干大きな効果があるという説 明となり得る。抗ＣＤ４ｍＡｂ処置は、ｐ５５−ｓｆ２に対するＩｇＭおよびＩ ｇＧ両抗体の形成をほぼ完全に阻害することがわかった。 遊離のｐ５５−ｓｆ２の血清中濃度 マイクロタイタープレートを組換えネズミＴＮＦ−α（Genentech Inc.，San Francisco,CA）で被覆し、ブロックした後、試験血清とともにインキュベートし た。次いで、ヤギ抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲートを加え、 次いで基質を加えた。既知濃度のｐ５５−ｓｆ２試料と比較することで定量を行 なった。 抗体応答の阻害は、処置マウスにおけるｐ５５−ｓｆ２の循環系における濃度 の明白な差異に関連する。すなわち、融合タンパク質単独投与マウスでは遊離の ｐ５５−ｓｆ２は検出できなかったが、抗ＣＤ４ｍＡｂ＋ｐ５５−ｓｆ２投与マ ウスでは、ｐ５５−ｓｆ２の血清濃度の平均は１２．３μｇ／ｍｌであった。実施例３ シクロスポリンＡおよび抗ＴＮＦ抗体を併用したネズミモデルにおけ る誘導関節炎の処置 上述のように、コラーゲンＩＩ型誘導関節炎のネズミモデルを使用して、コラ ーゲン誘導関節炎において、関節の疾患の重症度を調節する可能性に対する、Ｃ Ｄ４＋Ｔ細胞阻害剤であるシクロスポリンＡと抗ＴＮＦモノクローナル抗体（ｍ Ａｂ）の併用の有効性を調べた。シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）処置、抗ＴＮＦ抗 体処置およびＣｓＡと抗ＴＮＦ抗体の併用処置間の有効性を比較した。Ａ． 実験手順 雄性ＤＢＡ／１マウスを、フロインドの完全アジュバント(Difco Laboratorie s,East Molsey,UK)中に乳化した１００μｇのウシＩＩ型コラーゲンを皮内投与 し免疫した。関節炎開始日の平均は、免疫後約１カ月であった。臨床的に明白な 関節炎症状（紅斑と腫脹の両方または一方）が発現した後に、マウス群（各１１ 匹）に次の治療法を１つ施した：５０μｇ（２ｍｇ／ｋｇ）のＬ２（抗ＴＮＦ抗 体のイソタイプ対照）、３日毎に１回腹腔内（１、４および７日）；２５０μｇ （１０ｍｇ／ｋｇ）のシクロスポリンＡを毎日腹腔内；５０μｇ（２ｍｇ／ｋｇ ）の抗ＴＮＦｍＡｂであるＴＮ３−１９．１２、３日毎に１回腹腔内（１、４お よび７日）または３日毎に１回５０μｇの抗ＴＮＦｍＡｂ腹腔内と併用して２５ ０μｇのシクロスポリンＡを毎日腹腔内。関節炎は足蹠腫大（キャリパーで測定 ）で１０日間モニターし、その後マウスを屠殺し、関節を組織検査用に処理した 。 足蹠腫大 対照抗体で処置したマウスと比較して、シクロスポリンＡと抗ＴＮＦｍＡｂの 併用処置により、治療期間にわたって足蹠腫大の低下がもたらされた。結果を図 ３に示す。 四肢での併発 前述のように、関節炎が最初に発現した後の別の四肢での進行的併発を研究し た。結果を表１０に示す。 対照モノクローナル抗体と比較して、シクロスポリンＡと抗ＴＮＦｍＡｂの併用 療法により、四肢での併発の統計的に有意な低下がみられた（Ｐ＝０．０３）。均等物 当業者であれば、単に常識的実験手法を用いて、ここに述べた発明の具体的態 様に対する多くの均等物を認識しまた確認し得るであろう。そのような均等物は 、下記のクレームの範疇に含まれるものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年１０月１０日 【補正内容】 １５．哺乳動物における自己免疫疾患または炎症性疾患の治療のための方法であ って、該哺乳動物にＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤およびサイトカインを低レベルに調節 する（down-regulate）炎症メディエーターの治療上有効用量を併用投与する方 法。 １６．炎症メディエーターがＴＮＦの活性または合成を妨害する薬剤である、請 求項１５記載の方法。 １７．炎症メディエーターがＩＬ−１の活性または合成を妨害する薬剤である、 請求項１５記載の方法。 １８．炎症メディエーターがＩＬ−６の活性または合成を妨害する薬剤である、 請求項１５記載の方法。 １９．炎症メディエーターが抗炎症性を有するサイトカインである、請求項１５ 記載の方法。 ２０．哺乳動物における自己免疫疾患または炎症性疾患の治療のための方法であ って、該哺乳動物に抗ＣＤ４抗体および抗ＴＮＦ抗体の治療上有効用量を併用投 与する方法。 ２１．哺乳動物における自己免疫疾患または炎症性疾患の治 療のための方法であって、該哺乳動物に抗ＣＤ４抗体および可溶性ＴＮＦ受容体 の治療上有効用量を併用投与する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ウィリアムス，リチャード オーエン 英国，ロンドン イー２ ９ビーエヌ プ リチャーズ ロード，シェベレル ハウス 60

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳動物における自己免疫疾患または炎症性疾患を治療する方法であって、 該哺乳動物にＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤およびＴＮＦアンタゴニストの治療上有効用 量を併用投与することを含む方法。 ２．ＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤がＴＮＦアンタゴニストと同時に投与されるものであ る、請求項１記載の方法。 ３．ＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤がＴＮＦアンタゴニストと共に逐次的に投与されるも のである、請求項１記載の方法。 ４．ＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤およびＴＮＦアンタゴニストが、皮下、静脈内、およ び筋肉内投与からなる群より選ばれるルートにより投与されるものである、請求 項１記載の方法。 ５．ＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤およびＴＮＦアンタゴニストが、薬学的に許容される ビーイクルと配合されて投与されるものである、請求項１記載の方法。 ６．抗炎症剤がＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤およびＴＮＦアンタゴニストと併用投与さ れるものである、請求項１記載の方法。 ７．抗炎症剤がＴＮＦの活性または合成を妨害する薬剤である、請求項６記載の 方法。 ８．抗炎症剤がＩＬ−１の活性または合成を妨害する薬剤である、請求項６記載 の方法。 ９．抗炎症剤がＩＬ−６の活性または合成を妨害する薬剤である、請求項６記載 の方法。 １０．抗炎症剤が抗炎症性を有するサイトカインである、請求項６記載の方法。 １１．自己免疫疾患がリウマチ性関節炎である、請求項１記載の方法。 １２．ＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤がＴ細胞またはＴ細胞受容体に対する抗体である、 請求項１記載の方法。 １３．ＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤が抗原提示細胞に対する抗体または抗体提示細胞の 受容体に対する抗体である、請求項１記載の方法。 １４．ＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤がＴ細胞と抗原提示細胞の相互作用を阻害するペプ チドまたは小型分子である、請求項１記載の方法。 １５．哺乳動物における自己免疫疾患または炎症性疾患を治療する方法であって 、該哺乳動物にＣＤ４＋Ｔ細胞阻害剤および炎症メディエーターの治療上有効用 量を併用投与することを含む方法。 １６．炎症メディエーターがＴＮＦの活性または合成を妨害する薬剤である、請 求項１５記載の方法。 １７．炎症メディエーターがＩＬ−１の活性または合成を妨害する薬剤である、 請求項１５記載の方法。 １８．炎症メディエーターがＩＬ−６の活性または合成を妨害する薬剤である、 請求項１５記載の方法。 １９．炎症メディエーターが抗炎症性を有するサイトカインである、請求項１５ 記載の方法。 ２０．哺乳動物における自己免疫疾患または炎症性疾患を治療する方法であって 、該哺乳動物に抗ＣＤ４抗体および抗ＴＮＦ抗体の治療上有効用量を併用投与す る方法。 ２１．哺乳動物における自己免疫疾患または炎症性疾患を治療する方法であって 、該哺乳動物に抗ＣＤ４抗体および可溶性ＴＮＦ受容体の治療上有効用量を併用 投与する方法。 ２２．哺乳動物における自己免疫疾患または炎症性疾患を治療する方法であって 、該哺乳動物に抗ＣＤ４抗体およびＴＮＦ受容体／ＩｇＧ融合タンパク質の治療 上有効用量を併用投与する方法。 ２３．哺乳動物における自己免疫疾患または炎症性疾患を治療する方法であって 、該哺乳動物にシクロスポリンＡおよび抗ＴＮＦ抗体の治療上有効用量を併用投 与する方法。