IT202100020042A1 - Dispositivo di test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e della produzione anticorpale relativa - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
del brevetto per invenzione industriale dal titolo: ?Dispositivo di test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e della produzione anticorpale relativa?
La presente invenzione ? relativa ad un dispositivo di test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e della produzione anticorpale relativa.
Come ? noto, si stanno riscontrando diverse problematiche nel contrastare l?epidemia generata dalla rapida diffusione da virus Sars-CoV2, anche a causa della mancanza di piattaforme tecnologiche in cui implementare i sistemi diagnostici, che consentano di agire su tutto il territorio, ad esempio, nazionale, in modo capillare.
? ormai evidente che per limitare la diffusione dei contagi sarebbe necessaria soprattutto la disponibilit? di dispositivi diagnostici capaci di supportare il monitoraggio di massa attraverso uno screening capillare della popolazione, il pi? possibile rapido, affidabile e a basso costo. In particolare, risulta fondamentale sottoporre a screening, quanti pi? soggetti possibile, sintomatici e asintomatici, specialmente in ambito sanitario, delle forze dell?ordine e appartenenti a categorie che devono stare a stretto contatto con altri utenti.
Una delle tecnologie pi? indicate per la rilevazione rapida ? quella basata sui saggi immunocromatografici a flusso laterale (Lateral Flow Test-LFT), impiegati in vari ambiti. I dispositivi basati su tale tecnologia sfruttano l?elevata affinit? e specificit? del riconoscimento antigene-anticorpo per rilevare la presenza, anche a bassi dosaggi, dell?analita (patogeno) di interesse. La selezione delle sonde molecolari (e.g.,anticorpi) e dei reagenti biochimici correlati rappresenta un aspetto cruciale per lo sviluppo e riuscita dei dispositivi LFT. Tipicamente sono necessari pochi microlitri di campione per supportare una misura e la gestione del flusso unidirezionale del campione ? affidato alla capillarit? esercitata da idonei componenti; di conseguenza, il dispositivo risulta passivo ovvero non necessita di sistemi di automazione o movimentazione dei fluidi. Anche per quanto riguarda gli elementi biologici chiamati a reagire con il campione, non sono necessarie operazioni esterne in quanto tutti i reagenti sono gi? presenti a bordo del dispositivo. Questo si ottiene, usualmente, attraverso processi di immobilizzazione per assorbimento e relativa essicazione implementati in fase di costruzione. Inoltre, per la lettura della risposta on/off, non sono necessarie ulteriori strumentazioni in quanto si pu? percepire visivamente la formazione di un elemento colorimetrico che indica in situ l?avvenuta misura e relativo controllo dell?esito. Questo sistema di analisi ? stato ampiamente utilizzato, in particolare, in campo ginecologico per la valutazione della presenza nelle urine della gonadotropina corionica umana, ormone i cui livelli aumentano precocemente in gravidanza. Il LTF usato in questo contesto rileva concentrazioni di analita al di sopra di una determinata soglia, al di sotto della quale il test ? da considerarsi negativo o da ripetersi.
In particolare, e soluzioni note per la rivelazione di Sars-Cov2 non danno particolare attenzione alla selezione e alla strategia di utilizzo dei reagenti atti a permettere il riconoscimento del recettore ACE-2 con la proteina ligando Spike, cos? come ai test funzionali associati. Infatti, nello specifico del rilevamento di SARS-CoV-2, i test antigenici rapidi recentemente disponibili intercettano specifiche porzioni delle proteine virali utilizzando principalmente anticorpi monoclonali o policlonali.
Brevemente, l?informazione che si ottiene con il dispositivo oggetto dell?invenzione ? una valutazione completa sullo stato di infettivit? insieme alla condizione immunologica del soggetto esaminato, a differenza di quella che si pu? ottenere con i dispositivi ad oggi disponibili che ? incompleta o parziale (cio? riguarda il rilevamento del virus o degli anticorpi).
Una prima soluzione nota nel campo di applicazione dell?invenzione ? riportata nella domanda di brevetto CN101283093 che descrive un metodo per la determinazione della proteina nucleocapsidica del virus SARS-NP utilizzando un primo anticorpo e un secondo anticorpo, entrambi in grado di legarsi specificatamente a SARS-NP e che possono riconoscere un epitopo presente in una regione compresa tra il 283? nucleotide e il 422? nucleotide all?estremit? N nella sequenza amminoacidica per SARS-NP.
Una seconda soluzione riportata dalla domanda di brevetto CN111398603 descrive una striscia reattiva per immunocromatografia per rilevare gli anticorpi contro il nuovo coronavirus e un metodo di preparazione e applicazione della striscia reattiva.
Una terza domanda di brevetto CN107202883 descrive un dispositivo di analisi immunocromatografica a flusso laterale. Il prodotto comprende un tampone campione, un tampone assorbitore e una membrana di rivestimento, in cui il tampone campione e il tampone assorbimento sono collegati tra loro.
Tali sistemi hanno, per?, il limite di non rilevare il virus SARS-CoV-2 e la produzione anticorpale contemporaneamente.
Scopo della presente invenzione ? fornire un test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e per la produzione anticorpale relativa in grado di rilevare l?immunizzazione raggiunta in caso di avvenuto contatto con il virus, specie se questo contatto ? avvenuto in maniera subclinica, cio? senza alcuna sintomatologia clinica.
Ulteriore scopo della presente invenzione ? fornire un test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e per la produzione anticorpale relativa in grado di dare una risposta ON/OF in relazione, in particolare, all?abbassamento della soglia di rilevazione in funzione dell?utilizzo di ACE-2 come sonda molecolare, della realizzazione di biointerfacce funzionali ottimali e di una opportuna strategia di amplificazione del segnale. ACE-2 rappresenta l?esca molecolare fisiologica (i.e., il virus sfrutta il recettore ACE-2 espresso dalle cellule epiteliali per infettarle), verosimilmente in grado di aumentare la probabilit? di legame con la proteina ligando Spike espressa dal virus, incrementando quindi la sensibilit? di rilevamento del virus. L?utilizzo di ACE-2 offre l?opportunit? di riconoscere il virus a prescindere dalle possibili varianti della proteina Spike.
Inoltre, scopo della presente invenzione ? abbassare la soglia di rilevazione con un incremento della sensibilit? diagnostica rispetto ad altri sistemi simili o alternativi, convenzionalmente utilizzati nella pratica clinica.
Ancora, il test secondo l?invenzione offre l?opportunit? di monitorare il soggetto sottoposto a vaccinazione nel quale ? in corso l?immunizzazione. La produzione di anticorpi indotta dalla vaccinazione potrebbe essere eccessiva o bassa, e tali livelli influenzeranno il tipo di reazione immunitaria, in caso di un probabile successivo incontro con il virus. Il soggetto vaccinato ? protetto da un efficace produzione anticorpale che con il dispositivo qui presentato, pu? essere monitorata nel tempo in maniera semplice e pratica. Inoltre, con il contemporaneo saggio analitico del virus, il dispositivo qui presentato ? in grado di informare se lo stesso soggetto vaccinato ha avuto un contatto con l?agente patogeno e contemporaneamente se la sua produzione anticorpale ? efficiente. L?invenzione risulta avere, quindi, caratteristiche tali da superare quelle degli attuali sistemi noti.
Secondo la presente invenzione viene realizzato un test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e per la produzione anticorpale relativa, come definito nella rivendicazione 1.
Per una migliore comprensione della presente invenzione viene ora descritta una forma di realizzazione preferita, a puro titolo di esempio non limitativo, con riferimento ai disegni allegati, nei quali:
- la figura 1 mostra una vista schematica tridimensionale di un dispositivo di test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e per la produzione anticorpale relativa, secondo l?invenzione;
- la figura 2 mostra una prima forma di applicazione del dispositivo di test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e per la produzione anticorpale relativa, secondo l?invenzione;
- la figura 3 ? rappresentativa dei risultati sperimentali ottenibili utilizzando un prototipo del dispositivo di test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e per la produzione anticorpale relativa, secondo l?invenzione.
Con riferimento a tali figure, e, in particolare, alla figura 1, un dispositivo di test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e per la produzione anticorpale relativa ? mostrato secondo l?invenzione.
Il dispositivo 100 di test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e per la produzione anticorpale relativa comprende un substrato del saggio immunocromatografico a flusso laterale suddiviso in 5 regioni: una prima area di accoglienza del campione biologico, denominata ?Sample Deposition?; una seconda area in cui avviene la prima reazione tra un?analita presente nella matrice biologica depositata e la molecola utilizzata per la sua specifica identificazione, detta ?Conjugation pad?; una terza area, detta di ?Signal amplification? dove si concentrano le strategie di amplificazione del segnale; una quarta area detta ?Test line? e una quinta area detta ?Control Line? in cui hanno luogo una seconda e una terza immunoreazione finalizzate a produrre il risultato on/off e la sua verifica.
Il dispositivo ? progettato e la tecnologia ottimizzata per consentire la lettura visiva del risultato del test, possibilmente ad occhio nudo, mediante una finestra e due risultati visibili mediante striscia colorata. La visualizzazione ad occhio nudo del risultato potrebbe creare un difetto interpretativo in presenza di un doppio risultato come quello fornito dal test combinato. A tal proposito l?invenzione prevede di poter essere associata ad un?applicazione basata sull?analisi d?immagine di fotografie per offrire un?immediata intellegibilit? al fruitore del test e nel contempo poter trasmettere il dato, attraverso il sistema di telefonia mobile, con previo occultamento del numero personale, nel rispetto della privacy.
Secondo un aspetto dell?invenzione, l?area di ?sample deposition? comprende un filtro caratterizzato da una porosit? di circa 200nm - 1?m per favorire il passaggio di particelle nanometriche come quelle del coronavirus e trattenere le componenti biologiche non volute.
Secondo un altro aspetto dell?invenzione, l?area di ?sample deposition? ? strutturata con nitrocellulosa a rilievo per favorire una formazione sferica della goccia di campione diluita con una soluzione acquosa 1:2.
Vantaggiosamente secondo l?invenzione, il virus e gli anticorpi presenti nella goccia saranno trasportati dal movimento di diffusione laterale del flusso.
Secondo un aspetto dell?invenzione, la matrice biologica utilizzata per la valutazione del virus pu? essere diversa dalla matrice biologica utilizzata per la valutazione degli anticorpi, o sieroprelevanza.
Secondo un aspetto del l?invenzione, l?area di ?sample deposition? ? provvista diversamente nei due sistemi in parallelo, cio? una per la analisi antigenica (virus) e una per l?analisi dell?anticorpo.
Secondo un altro aspetto dell?invenzione, per l?isolamento del virus il volume di una goccia di campione viene diluita con soluzione acquosa che viene poi depositata sull?area di ?Sample deposition?.
In uso, viene depositata una goccia di campione biologico da esaminare nell?area di ?Sample deposition?; in seguito il flusso campione si sposta spontaneamente da sinistra verso destra per gradiente di diffusione. Il coefficiente di diffusione, che ? influenzato dalla struttura e dalla densit? del campione biologico, influenzer? il grado e la velocit? di diffusione e distribuzione dell?analita in tutta l?area del dispositivo, in accordo con la legge di Fick. Nell?area di ?Conjugation Pad? avviene il riconoscimento tra l?analita e la molecola che specificatamente ? deputata al suo riconoscimento. Per la verifica tale area viene funzionalizzata con molecole di ACE2 recettore legate a nanoparticelle d?oro. Il corrispettivo CP (area di ?Conjugation Pad?) per la valutazione della sieroprevalenza viene funzionalizzato con proteine del nucleocapside (NC) legate a nanoparticelle d?oro. Gli anticorpi diretti contro le nucleoproteine del virus sono quelli che hanno la pi? alta probabilit? di essere anticorpi neutralizzanti cio? efficaci nel ostacolare l?infezione.
Secondo un aspetto dell?invenzione, l?area di amplificazione del segnale ? comune ad entrambi i LFT e si avvale dell?addizione di nanoparticelle d?oro di dimensioni calibrate e di due tipi differenti tali da favorire un gradiente e una differente diffusione dell?analita ad essi legato nelle aree successive del LFT.
Secondo un altro aspetto dell?invenzione, l?area di ?Test line? nel LFT-virus prevede la presenza di anticorpi anti-glico proteina Spike del virus, mentre nel LFT-anticorpi la presenza di anticorpi diretti contro le nucleoproteine dell?involucro virale.
Secondo un aspetto dell?invenzione le sonde molecolari prescelte vengono immobilizzate tramite la formazione di legami covalenti con la superficie dei materiali coinvolti per garantire un?idonea conformazione, e quindi funzionalit?, delle sonde molecolari (e.g. anticorpi e/o attameri e/o MIP (Molecular imprinted polymer)). Inoltre processi di passivazione superficiale verranno applicati per ridurre e controllare l?adesione aspecifica di biomolecole presenti nel campione in grado di interferire con l?analisi.
Secondo un aspetto dell?invenzione, il campione biologico di partenza ? una soluzione liquida arricchita per la presenza di cellule di esfoliazione del cavo orale e del primo tratto respiratorio, o arricchita di cellule intestinali o direttamente una goccia di sangue intero per la valutazione antigenica virale. Per la valutazione dell?assetto anticorpale la matrice biologica sar? il sangue intero.
Secondo un altro aspetto dell?invenzione, il dispositivo ? basato sul differente grado di concentrazione del virus in una goccia di muco nasale.
Secondo un altro aspetto dell?invenzione, il dispositivo ? basato sul differente grado di concentrazione del virus nel campione biologico considerato.
Sebbene il differente grado di concentrazione del virus in una goccia di sangue e in una goccia di muco nasale/saliva suggerisca come preferenziale la rilevazione del virus nel muco nasale/saliva, il dispositivo ? adattabile alla rilevazione del virus anche a partire da sangue.
Secondo un aspetto dell?invenzione, LFT modificato per lo screening di malattie complesse pu? essere utilizzato sostituendo gli interlocutori molecolari con reagenti idonei e specifici per la malattia in oggetto.
Pertanto, il dispositivo di test per la valutazione combinata del coronavirus SARS-CoV-2 e per la produzione anticorpale relativa secondo l?invenzione ? altamente specifico, rapido, a basso costo, a basso rischio per gli operatori e non richiede apparecchiature da laboratorio.
Un altro vantaggio del dispositivo di test per la valutazione combinata del coronavirus SARS-CoV-2 e della produzione anticorpale secondo l?invenzione ? di essere di tipo ON/OFF, ovvero di stimare la presenza o meno del virus SARS-CoV-2 e della produzione anticorpale anti SARS-CoV-2.
Infine, il dispositivo di test per la valutazione combinata del coronavirus SARS-CoV-2 e della produzione anticorpale secondo l?invenzione ? portatile e di facile utilizzo.
Risulta, infine, chiaro che al dispositivo di test per la valutazione combinata del coronavirus SARS-CoV-2 e della produzione anticorpale secondo l?invenzione qui descritto e illustrato possono essere apportate modifiche e varianti senza per questo uscire dall?ambito protettivo della presente invenzione, come definito nelle rivendicazioni allegate.
Claims (14)
1. Dispositivo di test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e per la produzione anticorpale relativa comprendente un substrato del saggio immunocromatografico a flusso laterale suddiviso in 5 regioni: una prima area di accoglienza del campione biologico (?Sample Deposition?); una seconda area in cui avviene la prima reazione tra un?analita presente nella matrice biologica depositata e la molecola utilizzata per la sua specifica identificazione (?Conjugation pad?); una terza area dove si concentrano le strategie di amplificazione del segnale (?Signal amplification?); una quarta area di test (?Test line?) e una quinta area di controllo (?Control Line?) in cui hanno luogo una seconda e una terza immunoreazione finalizzate a produrre il risultato on/off e la sua verifica.
2. Dispositivo di test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e per la produzione anticorpale secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di prevedere una lettura visiva del risultato del test mediante una finestra e due risultati visibili mediante striscia colorata.
3. Dispositivo di test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e per la produzione anticorpale secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di essere associato ad un?applicazione basata sull?analisi d?immagine di fotografie.
4. Dispositivo di test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e per la produzione anticorpale secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l?area di ?sample deposition? comprende un filtro caratterizzato da una porosit? di circa 200 nm - 1?m per favorire il passaggio di particelle nanometriche come quelle del coronavirus trattenendo invece le componenti biologiche non volute.
5. Dispositivo di test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e per la produzione anticorpale secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l?area di ?sample deposition? ? strutturata con nitrocellulosa a rilievo per favorire una formazione sferica della goccia di campione diluita con una soluzione acquosa 1:2.
6. Dispositivo di test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e per la produzione anticorpale secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la matrice biologica utilizzata per la valutazione del virus ? diversa dalla matrice biologica utilizzata per la valutazione degli anticorpi.
7. Dispositivo di test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e per la produzione anticorpale secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che sull?area di ?Sample deposition? viene depositata una soluzione acquosa di diluizione 1:2 di una goccia di campione.
8. Dispositivo di test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e per la produzione anticorpale secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che nell?area di Conjugation Pad avviene il riconoscimento tra l?analita e la molecola che specificatamente ? deputata al suo riconoscimento, detta area essendo funzionalizzata con molecole di ACE2 recettore legate a nanoparticelle d?oro e con proteine del nucleocapside (NC) legate a nanoparticelle d?oro, per il rilevamento del virus SARS-CoV-2 e per la valutazione della sieroprevalenza, rispettivamente.
9. Dispositivo di test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e per la produzione anticorpale secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che nell?area di ?signal amplification? vengono addizionate nanoparticelle d?oro di dimensioni calibrate e di due tipi differenti.
10. Dispositivo di test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e per la produzione anticorpale secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l?area di ?Test line? comprende, nella porzione dedicata al rilevamento di virus SARS-CoV-2, anticorpi anti-glico proteina Spike del virus, e nella porzione dedicata al rilevamento della produzione anticorpale relativa, la presenza di anticorpi diretti contro le nucleoproteine dell?involucro virale.
11. Dispositivo di test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e per la produzione anticorpale secondo la rivendicazione 1, caratterizzato 1) dal fatto che le principali sonde molecolari (i.e., ACE2 recettore, anticorpi e/o attameri e/ MIP (molucular imprinted polymer) diretti contro le nucleoproteine dell?involucro virale prescelte vengono immobilizzate tramite la formazione di legami covalenti con la superficie dei materiali coinvolti per garantire un?idonea conformazione, e quindi funzionalit?, delle sonde molecolari e 2) processi di passivazione superficiale vengono applicati per ridurre e controllare l?adesione aspecifica di biomolecole presenti nel campione in grado di interferire con l?analisi.
12. Dispositivo di test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e per la produzione anticorpale secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il campione biologico di partenza ? una soluzione liquida arricchita per la presenza di cellule di esfoliazione del cavo orale e del primo tratto respiratorio, o arricchita di cellule intestinali o direttamente una goccia di sangue intero per la valutazione antigenica virale.
13. Dispositivo di test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e per la produzione anticorpale secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di essere basato sul differente grado di concentrazione del virus in una goccia di muco nasale.
14. Dispositivo di test rapido per il rilevamento di virus SARS-CoV-2 e per la produzione anticorpale secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di essere basato sul differente grado di concentrazione del virus in una goccia di sangue.
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