CN101541835A - 抗独特型缀合物及其在免疫测定中作为标准物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明报道了包含缀合物的组合物以及所述组合物在免疫测定中作为标准物的用途,所述缀合物为特异性结合亲本抗体CDR区的抗独特型抗体和E、G、M或A类多克隆人血清免疫球蛋白的缀合物。
Description
技术领域
本发明包括缀合物,及其在测定抗药物抗体的免疫测定中作为标准物或阳性对照的用途。
背景技术
使用单克隆抗体的标准固相免疫测定涉及在吸附于固相支持物上的抗体(捕获抗体)、抗原,以及针对抗原另一表位并缀合了可检测标记的抗体(示踪抗体)之间形成复合物。由此形成夹层:固相支持物-捕获抗体-抗原-示踪抗体。在夹层中,抗体缀合的可检测标记的强度与孵育介质中的抗原浓度成比例。由于捕获抗体和示踪抗体与抗原的不同表位结合,标准夹心法也称为双抗原桥连免疫测定法(double antigen bridgingimmunoassay)。Hoesel,W.等人在J.Immunol.Methods 294(2004)101-110中报道了抗EPO双抗原桥连测定法,其中使用了与氨基和与糖基偶联的固定化rhEPO混合物。
诸如双抗原桥连ELISA的免疫测定法是研究患者对于抗体药物(治疗性抗体或诊断性抗体)的免疫原性反应中经常使用的测定法类型。Mire-Sluis,A.R.等人,在J.Immunol.Methods 289(2004)1-16中总结了设计和优化检测针对生物技术产品的宿主抗体的免疫测定法的建议。根据Mire-Sluis等人所述,众所周知的抗药物抗体测定法形式显示出显著的缺点。抗药物抗体测定法在例如WO 2005/045058和WO 90/006515中有所提及。抗独特型抗体测定法在例如US 5,219,730、WO 87/002778、EP 0 139389和EP 0 170 302中有所提及。Wadhwa,M.等人在J.Immunol.Methods278(2003)1-17中报道了检测、测量和表征由治疗性生物制品诱导的不期望抗体的策略。
Ritter,G.,Cancer Res.61(2001)6851-6859和WO 2003/016909中描述了对于人抗人抗体的血清学分析。对于IgG类人抗人抗体的鉴定,在测定之前需要进行G蛋白沉淀的额外步骤。
发明简述
本发明包括缀合物,其包含与亲本抗体的CDR区特异性结合的抗独特型抗体和属于单一免疫球蛋白类别的参考免疫球蛋白。
优选所述参考免疫球蛋白不与所述抗独特型抗体和所述亲本抗体特异性结合。
本发明还包括本发明的缀合物在免疫测定中作为标准物的用途,所述免疫测定用于测定人类样品中抗亲本抗体的抗体。
优选所述缀合物在对样品中抗亲本抗体的抗体的免疫测定中用作标准物或阳性对照,该免疫测定使用包含捕获抗体和示踪抗体的夹心免疫测定法。
优选所述捕获抗体或所述示踪抗体为所述亲本抗体。
优选所述抗亲本抗体的抗体为针对所述亲本抗体的抗独特型抗体。
优选所述亲本抗体为治疗性抗体或诊断性抗体。
优选所述捕获抗体选自所述亲本抗体的轻链、重链可变区、Fab、Fab’、F(ab)2、或F(ab’)2片段。
优选捕获抗体通过被动吸附与固相支持物进行缀合。
优选捕获抗体通过特异性结合对固定化。
优选捕获抗体与生物素缀合,通过固定化抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白进行固定。
优选示踪抗体通过特异性结合对与可检测性标记缀合。
优选示踪抗体与洋地黄毒苷缀合,并通过针对洋地黄毒苷的抗体与可检测性标记进行连接。
优选免疫测定用表面等离振子共振进行。
优选捕获抗体和/或示踪抗体与其缀合配偶体的缀合通过化学结合实现,所述化学结合经由N端和/或ε-氨基(赖氨酸)、不同赖氨酸的ε-氨基、抗体氨基酸骨架的羧基、巯基、羟基和/或酚官能团、和/或抗体糖结构的糖醇基进行结合。
优选捕获抗体通过被动吸附与固相支持物缀合,因此与固相支持物缀合的捕获抗体包含通过不同抗体位点与固相支持物缀合的至少两种捕获抗体的混合物。例如Butler,J.E.,Solid Phases in Immunoassay,在Immunoassay,Diamandis,E.P.和Christopoulos,T.K.(编著)学术出版社,圣地亚哥(1996),第205-225页中对被动吸附有所描述。
在本发明的优选实施方案中,捕获抗体通过特异性结合对固定化。这样的结合对(第一组分/第二组分)为,例如链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素、抗体/抗原(参见例如Hermanson,G.T.等人,BioconjugateTechniques,学术出版社,1996)、凝集素/多糖、类固醇/类固醇结合蛋白、激素/激素受体、酶/底物、IgG/A蛋白和/或G蛋白等。优选捕获亲本抗体与生物素缀合,通过固定化的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白进行固定。
在本发明的优选实施方案中,示踪抗体与可检测性标记缀合,优选通过特异性结合对缀合。这样的结合对(第一组分/第二组分)为,例如链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素、抗体/抗原(参见例如Hermanson,G.T.等人,Bioconjugate Techniques,学术出版社,1996)、凝集素/多糖、类固醇/类固醇结合蛋白、激素/激素受体、酶/底物、IgG/蛋白A和/或G等。优选,示踪亲本抗体通过洋地黄毒苷和针对洋地黄毒苷的抗体与可检测性标记缀合。备选地,示踪亲本抗体与电化学发光标记缀合,如钌联吡啶复合物。
发明详述
本发明包括缀合物,其包含与亲本抗体的CDR区特异性结合的抗独特型抗体,以及属于单一免疫球蛋白类别的参考免疫球蛋白。优选所述亲本抗体为治疗性抗体。优选所述亲本抗体为诊断性抗体。
本发明的术语“与亲本抗体的CDR区特异性结合的抗独特型抗体”表示在非人动物中针对亲本抗体产生的抗体,即为非人抗体。优选所述针对亲本抗体产生的抗体在啮齿类动物或猕猴中产生,特别优选在小鼠、兔或食蟹猴中产生,或通过展示(display)技术,优选噬菌体或核糖体展示技术获得。优选所述抗独特型抗体为多克隆抗体。还优选所述抗独特型抗体为单克隆抗体。优选用亲本抗体或其片段对所述动物进行免疫。在之后的步骤中,通过对亲本抗体的一个或多个CDR区的亲和吸附来分离和纯化来自所述动物的免疫球蛋白。术语“亲本抗体的CDR区”表示亲本抗体轻链和重链的CDR区,即包含亲本抗体轻链CDR1、CDR2、CDR3,亲本抗体重链CDR1、CDR2、CDR3。
本发明的术语“亲本抗体”表示可以作为药物(药物抗体或治疗性抗体)或诊断工具(诊断性抗体)对个体施用的抗体,因此推测在施用之后所述个体的样品包含所述亲本抗体。在根据本发明进行的一种测定法中,亲本抗体、捕获(亲本)抗体和/或示踪(亲本)抗体包含“相同的”抗体分子,例如用相同的表达载体重组生产,并包含相同的氨基酸序列。药物抗体(治疗性单克隆抗体)广泛应用于治疗多种疾病如肿瘤疾病(例如血液恶性癌和实体恶性癌,包括非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌和结直肠癌)。例如在Levene,A.P.等人,Journal of the Royal Society of Medicine 98(2005)146-152中描述了此类抗体。此类抗体为例如针对CCR4、CD19、CD20、CD22、CD28、HLA-DR、CD33、CD40、CD52、CD80、CSF-1R、CTLA-4、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、EGFR、G250、GD3、HER2/neu、HER3、HER4、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD56、VEGF、VEGF2、TLSP-R、TIE-1、TIE-2、TNF-α、TNF样凋亡微弱诱导剂(TNF like weak inducer ofapoptosis,TWEAK)、CEA、Ep-CAM、TRAIL、TRAIL受体1、TRAIL受体2、淋巴毒素β受体、Levis Y抗原、hepsin、黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、IL-1受体、IL-6受体、VEGF-受体1、VEGF-受体2或IGF-1受体的抗体。治疗性抗体在Groner,B.等人,Curr.Mol.Meth.4(2004)539-547;和Harris,M.,Lancet Oncol.(2004)292-302中也有所描述。
本文使用的术语“参考免疫球蛋白”表示完整的免疫球蛋白,即包含Fab区和Fc区的免疫球蛋白,以及完整免疫球蛋白的片段,如Fc区、CH2结构域或CH3结构域。参考免疫球蛋白优选为人免疫球蛋白。优选“参考免疫球蛋白”为人免疫球蛋白或人免疫球蛋白的Fc区。本发明的“参考免疫球蛋白”不与抗独特型抗体特异性结合,不与缀合物的亲本抗体特异性结合。免疫球蛋白的Fc区由对完整免疫球蛋白的胃蛋白酶切割或木瓜蛋白酶切割得到。参考免疫球蛋白属于“单个免疫球蛋白类”。术语“单个免疫球蛋白类”表示所述参考免疫球蛋白包含免疫球蛋白类特异性恒定区氨基酸序列,其选自免疫球蛋白A、E、M和G类。关于免疫球蛋白类特异性恒定区氨基酸序列,参见例如Pink,J.R.等人,Biochem.J.117(1970)33-47。
“抗亲本抗体的抗体”为与亲本抗体特异性结合的抗体,即针对亲本抗体的抗体。同样,抗-抗IL-6R抗体的抗体为与抗IL-6R抗体特异性结合的抗体。“抗亲本抗体的抗体”为针对亲本抗体任何区域的抗体,如亲本抗体的可变区、恒定区或糖结构。此类抗亲本抗体的抗体可能在抗体治疗过程中作为患者的免疫原性反应出现(见Pan,Y.等人,FASEB J.9(1995)43-49)。“抗独特型抗体”为与亲本抗体CDR区特异性结合的抗体。抗独特型抗体特异性结合亲本抗体的轻链CDR1区、轻链CDR2区、轻链CDR3区、重链CDR1区、重链CDR2区或重链CDR3区。
亲本抗体(优选单克隆)的实例为针对IL-6受体的抗体(抗IL-6R抗体)。此类抗体在例如Mihara,M.等人,Clin.Immunol.98(2001)319-326;Nishimoto,N.等人,Blood 106(2005)2627-2632;临床实验NCT00046774;或WO 2004/096274中有所描述。
亲本抗体(优选单克隆)的实例为针对IGF-1受体的抗体(抗IGF-1R抗体)。此类抗体在例如WO 2004/087756,WO 2005/005635中有所描述。
本发明的术语“结合”或“特异性结合”指以小于10-6M(M=mol/l)(例如10-12M)的KD值,更优选以范围在10-9M到10-15M中的KD值与抗原、免疫球蛋白的恒定区、亲本抗体或亲本抗体的CDR区结合,KD值以BIAcore测定法测定。当KD值大于10-5M(例如10-4M)时见到“非特异性结合”。
例如Hage,D.S.在Anal.Chem.71(1999)294R-304R中描述了不同免疫测定法的原理。Lu,B.等人在Analyst.121(1996)29R-32R中报道了抗体的定向固定,以用于免疫测定法。例如Wilchek,M.和Bayer,E.A.,Methods Enzymol.184(1990)467-469报道了抗生物素蛋白-生物素介导的免疫测定法。
抗体(特别是其恒定结构域)包含氨基酸侧链功能性,即化学反应性基团,以与结合配偶体偶联,所述结合配偶体如表面、蛋白质、聚合物(例如PEG、纤维素、或聚苯乙烯)、酶、或结合对的成员。抗体的化学反应基团为例如,氨基(赖氨酸的ε-氨基、α-氨基)、巯基(胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸)、羧酸基团(天冬氨酸、谷氨酸)和糖醇基。例如Aslam,M.和Dent,A.,Bioconjuation,麦考林出版公司(MacMillan Ref.Ltd.)(1999),50-100页,对此类方法有所描述。
多肽与例如固相支持物的缀合需要适当的化学保护剂。这些保护剂例如与无保护的侧链胺结合,这种结合没有在N端的结合稳定,且与之不同。许多这样的化学保护剂是已知的(参见例如EP 0 651 761)。优选的化学保护剂包括环状二羧酸酐如马来酸酐或柠康酸酐(citraconylic anhydride)。
术语“样品”包括但不限于来自人的任意量的物质。此类物质包括但不限于来自个体的全血、血清或血浆,这些是在临床实践中最广泛使用的样品来源。
本发明免疫测定的固相支持物在本领域技术中有广泛描述(参见例如Butler,J.E.,Methods 22(2000)4-23)。
术语“固相支持物”表示非流体物质,包括:芯片、小管和颗粒(包括微粒和小珠),其由如诸如聚合物、金属(顺磁、铁磁性颗粒)、玻璃和陶瓷等材料制成;凝胶物质如硅胶、氧化铝和聚合物凝胶;毛细管,其可以由聚合物、金属、玻璃和/或陶瓷制成;沸石和其他多孔物质;电极;微量滴定板;固体检测条(strip);比色皿、管或其他分光计样品容器。测定法中的固相支持物元件与测定法中可能接触到的惰性固体表面的不同之处在于,“固相支持物”表面包含至少一个预期与捕获抗体直接或间接相互作用的部分。固相支持物可以是固定元件,如管、检测条、比色皿或微量滴定板,或可以是不固定的元件,如小珠和微粒。微粒还可以作为匀相测定法形式的固相支持物。可以使用允许蛋白质和其他物质非共价或共价连接的多种微粒。这样的颗粒包括:聚合物颗粒如聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯;金颗粒如金纳米颗粒和胶体金;和陶瓷颗粒如硅胶、玻璃和金属氧化物颗粒。见例如Martin,C.R.等人,Analytical Chemistry-News &Features 70(1998)322A-327A,其引入本文作为参考。
“芯片”为固相、无孔材料,如金属、玻璃或塑料。该材料可以任选完全或在某些区域被包被。在该材料的表面上,点的任何排列可见地或在坐标中呈现。在各点上,确定的多肽可以通过或不通过连接体(linker)或间隔物(spacer)固定到材料的表面上。
上文和下文中提到的所有文件均在此引入本文作为参考。
可检测性标记的实例为色原(荧光或发光基团和染料)、酶、NMR-活性基团或金属颗粒、半抗原(例如洋地黄毒苷)。可检测性标记还可以是光活化交联基团,例如叠氮基或吖丙啶基(azirine)。可以用电化学发光检测的金属螯合物也是用作可检测标记的优选信号发射基团,特别优选钌螯合物,例如钌(联吡啶)3 2+螯合物。例如EP 0 580 979、WO 90/05301、WO 90/11511和WO 92/14138中描述了适合的钌标记基团。
本发明包括缀合物,其包含与亲本抗体的CDR区特异性结合的抗独特型抗体和属于单一免疫球蛋白类别的参考免疫球蛋白。
本发明包括缀合物,其包含与亲本抗体的CDR区特异性结合的抗独特型抗体和属于选自人免疫球蛋白E、人免疫球蛋白G、人免疫球蛋白M或人免疫球蛋白A的单一免疫球蛋白类别的参考免疫球蛋白,即所述参考免疫球蛋白为人IgE类、或为人IgG类、或为人IgM类、或为人IgA类。
优选本发明包括缀合物,其包含与亲本抗体的CDR区特异性结合的抗独特型抗体和属于单一免疫球蛋白类别的参考免疫球蛋白,所述参考免疫球蛋白不与所述抗独特型抗体特异性结合,不与所述亲本抗体特异性结合。
优选所述亲本抗体为治疗性抗体或诊断性抗体。优选所述参考免疫球蛋白为属于单一免疫球蛋白类别的无功能的免疫球蛋白,或为属于单一免疫球蛋白类别的免疫球蛋白的Fc区。
术语“诊断性抗体”表示用于检测和显示其靶抗原的抗体,其为天然抗体或重组生产的抗体。诊断性抗体在例如测定系统(例如ELISA)中使用,或用于体外成像。诊断性抗体可以为例如标记的治疗性抗体。
优选所述参考免疫球蛋白为人免疫球蛋白或人免疫球蛋白Fc区。
参考免疫球蛋白提供免疫球蛋白类别特异性恒定区,该免疫球蛋白类别特异性恒定区可以与抗免疫球蛋白类抗体,如抗人免疫球蛋白G抗体特异性结合。因此参考免疫球蛋白为本发明的缀合物提供了免疫球蛋白类别特异性标记,该免疫球蛋白类别特异性标记可以通过标记特异性抗体得到特异性鉴定。例如,如果该标记为免疫球蛋白G恒定区,则标记特异性抗体为抗免疫球蛋白G抗体。
优选所述抗独特型抗体为多克隆抗体,所述参考免疫球蛋白为多克隆免疫球蛋白。还优选所述抗独特型抗体为多克隆抗体,所述参考免疫球蛋白为单克隆免疫球蛋白。更优选所述抗独特型抗体为单克隆抗体,所述参考免疫球蛋白为单克隆免疫球蛋白。
本发明的缀合物由抗独特型抗体和参考免疫球蛋白的化学缀合得到。
在本发明的缀合物中,抗独特型抗体为有功能的免疫球蛋白,参考免疫球蛋白为无功能的免疫球蛋白。这表示抗独特型抗体与其靶抗体特异性结合,而参考抗体不与任何人抗原特异性结合。提供参考抗体是为了呈现与天然存在的免疫球蛋白尽可能相似的Fc区,而不是为了结合抗原。抗独特型抗体和参考抗体不是相同抗体的情况也涵盖在本发明的范围内,这样的情况即它们有至少20%的氨基酸残基不同,即它们基于氨基酸序列的同一性为80%或更少。参考抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。本申请中使用的术语“单克隆”表示由单种细胞或其子代产生的抗体群。该术语表示所述抗体具有相同的氨基酸序列,即所述抗体具有相同的氨基酸序列,虽然在产生抗体的细胞增殖的过程中有偶然突变。
本申请中使用的术语“无功能的免疫球蛋白”表示以10-5mol/l或更高(例如10-3mol/l)的KD值(结合亲和力),优选以10-6mol/l或更高的KD值与人抗原结合的免疫球蛋白。结合亲和力用标准结合测定法,如表面等离振子共振技术()测定。此结合亲和力值不必作为精确值对待;它只是参考点。该结合亲和力值用于确定和/或选择对于人抗原不显示免疫球蛋白典型的特异性结合,从而在人类中没有治疗活性的免疫球蛋白。这不排除免疫球蛋白对于非人抗原显示特异性结合。此与非人抗原的特异性结合的KD值为10-7mol/l或更低(例如10-10mol/l),优选KD值为10-8mol/l或更低。
基于转染瘤,即从免疫的小鼠获得的包含转染的免疫球蛋白基因的淋巴样细胞,本发明的缀合物可以通过核酸水平上的缀合得到。
对哺乳动物使用源自受体生物之外的药物,例如施用外源性治疗多肽,会导致受体哺乳动物的免疫应答。此免疫应答通过抗药物抗体的出现而变得显而易见。评估此类免疫应答需要检测针对该药物的抗体的方法。
本发明的缀合物可以在免疫测定中用作标准物。因此,本发明包括缀合物用于在测定人类样品中抗亲本抗体的抗体的免疫测定中作为标准物的用途的用途,所述缀合物包含与亲本抗体的CDR区特异性结合的抗独特型抗体和属于单一免疫球蛋白类别的参考免疫球蛋白。
本发明的缀合物还可以在免疫测定中用作阳性对照。这使得例如可以例如建立检测限。因此,本发明包括缀合物在用于测定人类样品中抗亲本抗体的抗体的免疫测定中作为阳性对照的用途,所述缀合物包含与亲本抗体的CDR区特异性结合的抗独特型抗体和属于单一免疫球蛋白类别的参考免疫球蛋白。在此实施方案中优选所述缀合物在免疫测定之前加入人类样品中。
亲本抗体优选为治疗性抗体。并且优选亲本抗体为鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。优选亲本抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。特别优选所述亲本抗体为治疗性的嵌合、人源化或人抗体。检测针对亲本抗体的抗体可以使用不同的方法,如放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫放射测定(IRMA)或表面等离振子共振(SPR)。
本申请中使用的术语“治疗性抗体”及其语法上的等同用语优选表示单克隆抗体,其预期施用于哺乳动物,优选人类,用于疾病的治疗(treatment)、疗法(therapy)或诊断。治疗性抗体通常用重组方法生产,例如通过培养用编码所述治疗性抗体的核酸转染的真核细胞生产。优选治疗性抗体为嵌合抗体、或人源化抗体、或人抗体。施用治疗性抗体以实现期望的效果,例如消耗靶细胞、或介导ADCC(依赖抗体的细胞介导的细胞毒性)、或介导CDC(依赖补体的细胞毒性)。靶细胞可以是例如癌细胞或病毒感染的细胞。要介导ADCC或CDC,治疗性抗体必须结合靶细胞,因此是对例如肿瘤抗原特异性的,即与其特异性结合。
本文使用的“肿瘤抗原”,包括本领域已知的含义,其包括在肿瘤细胞上表达(或与肿瘤细胞发育相关)、已知或被认为对肿瘤细胞的致瘤特性有作用的任何分子。许多肿瘤抗原为本领域已知。一种分子是否为肿瘤抗原还可以根据本领域技术人员熟知的技术和测定法确定,例如克隆发生测定法(clonogenic assay)、转化试验、体外或体内肿瘤形成测定法、凝胶迁移测定法(gel migration assay)、基因敲除分析等。优选术语“肿瘤抗原”在本文中使用时指人跨膜蛋白,即锚定在细胞脂双层中的细胞膜蛋白。本文使用的人跨膜蛋白通常会包含“细胞外结构域”,其可以结合配体、亲脂跨膜结构域、保守的胞内结构域,例如酪氨酸激酶结构域,和具有若干可被磷酸化的酪氨酸残基的羧基末端信号结构域。肿瘤抗原包括分子如EGFR、HER2/neu、HER3、HER4、EpCAM、CEA、TRAIL、TRAIL受体1、TRAIL受体2、淋巴毒素β受体、CCR4、CD19、CD20、CD22、CD28、CD33、CD40、CD80、CSF-1R、CTLA-4、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、hepsin、黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、VEGF受体1、VEGF受体2、IGF1-R、TSLP-R、TIE-1、TIE-2、TNF-α、TNF样凋亡微弱诱导剂(TWEAK)或IL-1R。
优选本发明的缀合物在使用包含捕获抗体和示踪抗体的夹心免疫测定法对样品中的抗亲本抗体的抗体进行的免疫测定中用作标准物。特别优选所述捕获抗体或所述示踪抗体为所述亲本抗体。
例如,抗药物抗体测定法在WO 2005/045058和WO 90/006515中有所提及,抗独特型抗体测定法在US 5,219,730、WO 87/002778、EP 0139389和EP 0 170 302中有所提及。
优选所述抗独特型抗体为单克隆抗体,所述参考免疫球蛋白为多克隆人免疫球蛋白。还优选所述抗独特型抗体为单克隆抗体,所述参考免疫球蛋白为单克隆人免疫球蛋白。
本发明的缀合物优选在对样品中针对亲本抗体的抗独特型抗体进行的免疫测定中用作标准物。所述免疫测定使用捕获抗体和示踪抗体。在一个实施方案中捕获抗体为亲本抗体。优选用作捕获抗体的亲本抗体为完整抗体,即它包含轻链和重链,其中轻链包含可变结构域和恒定结构域,其中重链包含可变结构域、CH1、CH2、CH3和任选的CH4结构域和铰链区。优选捕获抗体选自所述亲本抗体的轻链、重链可变区、Fab、Fab’、F(ab)2或F(ab’)2片段,即其为所述亲本抗体的轻链、重链可变区、Fab、或Fab’、或F(ab)2、或F(ab’)2片段。在其他实施方案中,示踪抗体为亲本抗体。在此实施方案中,例如本发明的缀合物通过与缀合物的参考免疫球蛋白特异性结合的免疫球蛋白与固相支持物结合。
示踪抗体和/或捕获抗体与其缀合配偶体的缀合可以通过不同方法实现,如被动吸附、化学结合或通过特异性结合对结合。本文使用的术语“缀合配偶体”表示例如固相支持物、多肽、可检测性标记、特异性结合对的成员。在一个实施方案中,捕获抗体和/或示踪抗体与其缀合配偶体的缀合是通过化学结合实现,其经由N端和/或ε-氨基(赖氨酸)、不同赖氨酸的ε-氨基、抗体氨基酸骨架的羧基、巯基、羟基和/或酚官能团、和/或抗体糖结构的糖醇基进行结合。在一个实施方案中,捕获抗体和/或示踪抗体通过特异性结合对与其缀合配偶体缀合。优选捕获抗体与生物素缀合,通过固定于固相支持物的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白实现与固相支持物的固定。优选示踪抗体与洋地黄毒苷缀合,通过针对洋地黄毒苷的抗体实现与可检测标记的连接。在另一实施方案中,捕获抗体通过被动吸附与固相支持物缀合。通过被动吸附与固相支持物缀合的抗体包含通过不同抗体位点与固相支持物缀合的抗体的混合物。因此,通过被动吸附与固相支持物缀合的捕获抗体为两种或多种不同缀合物的混合物,其中缀合物在实现与固相支持物的缀合的抗体位点(即抗体残基)上有所不同。例如Butler,J.E.,Solid Phases in Immunoassay,Immunoassay,第205-225页,Diamandis,E.P.和Christopoulos,T.K.(编)学术出版社,圣地亚哥(1996)中对被动吸附有所描述。
在本发明的优选实施方案中,捕获抗体通过特异性结合对固定化。此类结合对(第一组分/第二组分)为,例如链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素、抗体/抗原(参见例如Hermanson,G.T.等人,BioconjugateTechniques,学术出版社,1996)、凝集素/多糖、类固醇/类固醇结合蛋白、激素/激素受体、酶/底物、IgG/A蛋白和/或G蛋白和/或L蛋白等。优选捕获亲本抗体与生物素缀合,通过固定化的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白进行固定。在本发明的其他优选实施方案中,示踪抗体与可检测性标记缀合,优选通过特异性结合对缀合。这样的结合对(第一组分/第二组分)为,例如链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素、抗体/抗原、凝集素/多糖、类固醇/类固醇结合蛋白、激素/激素受体、酶/底物、IgG/A蛋白和/或G蛋白和/或L蛋白等。优选示踪亲本抗体通过洋地黄毒苷和针对洋地黄毒苷的抗体与可检测性标记缀合。可选地,示踪亲本抗体与电化学发光标记(如钌联吡啶复合物)缀合。
如果本发明的缀合物在测定人类样品中针对亲本抗体的抗独特型抗体的免疫测定中用作标准物,则优选以两种或多种不同浓度使用该缀合物。使用测定的对不同浓度标准物的反应,计算/可以计算校准曲线。
如果本发明的缀合物在测定人类样品中针对亲本抗体的抗独特型抗体的免疫测定中用作标准物,可以使用与所述缀合物的所述参考免疫球蛋白特异性结合的(任选的)其他抗体。本发明的缀合物可以作为标准物单独使用,或与任选其他的抗人免疫球蛋白抗体组合使用(图3和4)。
在本申请中可以互换使用的术语“标准物”或“标准物质”表示分析方法中的参考点,用于设定相对于相同分析方法中比较的其他结果的值。本文使用的术语“阳性对照”表示这样的标准物质,当在分析方法中使用它时,会得到高于确定的截断值或阈值的反应。截断值通常是在不含抗药物抗体样品的分析中得到的平均值加上两倍、优选三倍所得值的标准差。
本发明还包含在免疫测定中使用本发明的缀合物作为标准物的方法,所述方法包含下列步骤:a)本发明的缀合物与捕获抗体相接触,b)检测所述缀合物与所述捕获抗体的结合。对步骤a)中的结合的检测可以例如通过SPR角度的变化直接进行,或例如通过示踪抗体和/或可检测性标记间接进行。
本发明还包含测定抗药物抗体是否与亲本抗体的Fc区或Fab区结合,以及测定所述抗药物抗体属于哪种免疫球蛋白类别的方法(见例如图7)。在此方法中,样品的结合使用固定化的亲本抗体、固定化的所述亲本抗体的Fc区和/或固定化的所述亲本抗体的Fab区进行测定。这可以例如在BIAcore芯片上实现,其上的四个槽(channel)中一个含有固定化的亲本抗体,一个含有固定化的亲本抗体的Fc区,一个含有固定化的亲本抗体的Fab区,一个不含固定化的亲本抗体。取决于哪些槽,于是也就是亲本抗体的哪(些)部分显示与来自样品的抗药物抗体结合,由此可以确定抗药物抗体的结合区域。免疫球蛋白的类别通过结合抗人免疫球蛋白E抗体、抗人免疫球蛋白M抗体、抗人免疫球蛋白G抗体或抗人免疫球蛋白A抗体确定。依次或伴随使用抗人免疫球蛋白抗体,优选依次使用。本发明的缀合物可以在此方法中用作标准物。
本发明还包括用包含捕获抗体、示踪抗体和本发明的缀合物的夹心免疫测定法,以测定样品中与亲本抗体的CDR区特异性结合的抗独特型抗体的免疫球蛋白类别的方法,其包含下列步骤:
a)所述样品与捕获抗体在适合形成捕获抗体/抗独特型抗体复合物的条件下相接触,
b)分别以
i)抗人免疫球蛋白A抗体,
ii)抗人免疫球蛋白E抗体,
iii)抗人免疫球蛋白M抗体,和
iv)抗人免疫球蛋白G抗体
作为示踪抗体与所述捕获抗体/抗独特型抗体复合物相接触,
c)测定各所述示踪抗体与所述复合物的结合,由此确定所述抗独特型抗体的免疫球蛋白类别,
其中本发明的缀合物用作阳性对照。
此方法的图解和示例性反应图在图1和2中给出。
优选所述示踪抗体与所述捕获抗体/抗独特型抗体复合物接触的顺序为:i)抗人免疫球蛋白A抗体,ii)抗人免疫球蛋白E抗体,iii)抗人免疫球蛋白M抗体,iv)抗人免疫球蛋白G抗体,即示踪抗体与复合物依次接触。
优选所述捕获抗体选自所述亲本抗体的轻链、重链可变区、Fab、Fab’、F(ab)2或F(ab’)2片段。
本发明还包含特异性结合抗IL-6R抗体CDR区的多克隆抗体。本发明的多克隆抗体的制备方法在实施例1a)中描述。
本发明测定抗独特型抗体的免疫球蛋白类别的方法优选包含下列步骤:
a)所述样品在适合形成捕获抗体/抗独特型抗体复合物的条件下与捕获抗体相接触,
b)用选自抗人免疫球蛋白G抗体、抗人免疫球蛋白E抗体、抗人免疫球蛋白M抗体、抗人免疫球蛋白A抗体的示踪抗体与所述捕获抗体/抗独特型抗体复合物相接触,
c)测定所述示踪抗体与所述复合物的结合,
d)分解所述捕获抗体/抗独特型抗体复合物,
e)用之前未选择的示踪抗体重复步骤a)至d),
f)确定所述抗独特型抗体的免疫球蛋白类别为特异性结合所述捕获抗体/抗独特型抗体复合物的所述示踪抗体的免疫球蛋白类别。
示踪抗体优选选自抗人免疫球蛋白G抗体、或抗人免疫球蛋白E抗体、或抗人免疫球蛋白M抗体、或抗人免疫球蛋白A抗体。
本申请中使用的术语“在适合形成[...]复合物的条件下”及其语法上的等同语表示在这样的条件下当目的抗体/免疫球蛋白(例如抗独特型抗体)与二级抗体相接触时会与其结合。这并不一定表示100%的目的抗体都与二级抗体结合,而是基本上100%的目的抗体与二级抗体结合,即至少85%的目的抗体与二级抗体结合,优选至少90%的目的抗体与二级抗体结合,优选至少95%的目的抗体与二级抗体结合,更优选多于95%的目的抗体与二级抗体结合。
提供下文的实施例和附图以帮助理解本发明,本发明的真正范围由随附的权利要求书阐明。应理解在不偏离本发明精神的情况下可以对列出的方法做出修改。
附图说明
图1用任选的随后亚类测定检测样品中的抗亲本抗体的抗体的图解。
图2本发明的抗独特型抗体亚类测定的BIAcore SPR图。(1)注入样品,(2)+(3)注入抗人免疫球蛋白E抗体,(4)注入抗人免疫球蛋白G抗体。
图3用本发明的缀合物作为标准物并使用任选类别的特异性抗体的图解。
图4用本发明的化合物作为标准物(一级反应)并使用任选的随后抗标准物免疫球蛋白亚类抗体(二级反应)的BIAcore SPR图。
图5抗独特型抗体ELISA测定的图解。
图6测定抗独特型抗体的ELISA标准曲线。
图7用随后的免疫球蛋白类别测定对抗亲本抗体的抗体的结合区域的多槽检测的图解。
在下列实施例中使用针对IL-6受体的抗体只是为了举例说明本发明,而不是旨在限制本发明的范围。
实施例1
制备与亲本抗体的CDR区特异性结合的多克隆抗独特型抗体和多克隆人血清免疫球蛋白E、G、A和M类的组合物。
抗-抗IL-6R抗体的多克隆抗体(抗-抗IL-6R-mAb pAb)
i)制备针对单克隆抗IL-6R抗体的多克隆抗体
从兔血清中纯化多克隆抗体
根据标准方法用单克隆抗IL-6R抗体免疫兔。通过用硅胶(Aerosil)(1.5%(w/v))脱脂除去五只免疫的兔的原始血清中的脂质成份,用硫酸铵(1.7M)沉淀免疫球蛋白。经过酸处理(30分钟,pH 5.5)和以补充有50mMNaCl,pH 7.0的15mM磷酸钾缓冲液透析之后,用DEAE离子交换层析在pH 7.0分离混合物。免疫球蛋白G级分在流出液中(=兔抗-抗IL-6R-mAbpAb),浓缩至约25mg/ml。
制备与针对IL-6R的亲本抗体的CDR区特异性结合的兔抗-抗
IL-6R-mAb抗体
将之前步骤中浓缩的IgG级分转移到补充有150mM NaCl,pH 7.5的50mM磷酸钾(PBS)缓冲系统中。用本领域现有技术将抗IL-6R抗体与NHS-琼脂糖缀合,制备具有固定化的抗IL-6R抗体(亲本抗体)的免疫吸附剂,将其填充到柱中,用补充有150mM NaCl,pH 7.5的50mM磷酸钾缓冲液平衡。
将10mg浓缩的免疫球蛋白G级分/ml免疫吸附剂上样至用PBS平衡的柱上。用PBS、补充有0.05%(w/v)20的0.5M NaCl和30mMNaCl相继洗涤柱。用3mM HCl和1M丙酸洗脱特异性结合免疫吸附剂的IgG。以PBS透析洗脱液。
为除去与人免疫球蛋白G(IgG)恒定区具有交叉反应性的抗体,将亲和纯化的抗体上样至具有固定化的人IgG的亲和柱上,该亲和柱用本领域现有技术将非特异性人IgG与NHS-琼脂糖缀合制备得到。用PBS平衡该柱。将约6mg IgG/ml免疫吸附剂上样至该柱上。期望的特异性多克隆IgG级分在流出液中。用补充有0.05%(w/v)20的0.5M NaCl、30mMNaCl、1M丙酸和PBS令柱再生之后,重复两次对与人IgG恒定区非特异性结合的抗体的免疫吸附,以完全除去对人IgG具有交叉反应性的抗体。
将所得纯化的对人IgG恒定区不具有交叉反应性的抗-抗IL-6R抗体的多克隆抗体浓缩至约4mg/ml,储存在-80℃。
ii)抗-抗IL-6R抗体的多克隆抗体与多克隆人免疫球蛋白E、人免疫球蛋白G、人免疫球蛋白A和人免疫球蛋白M的缀合
制备兔抗-抗IL-6R抗体的多克隆抗体(aa-IL-6R pAb)与人免疫球蛋白G的缀合物
步骤1:制备兔aa-IL-6R pAb-SATP
以含有150mM NaCl,pH 7.8的100mM磷酸钾缓冲液透析aa-IL-6RpAb,将蛋白质溶液调整至蛋白质浓度为约15mg/ml。N-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸酯(SATP)溶于DMSO,以1∶5(aa-IL-6R pAb∶SATP)的摩尔比加入至抗体溶液。调整pH至pH 7.1,混合物在25℃孵育60分钟。通过加入终浓度为10mM的L-赖氨酸停止反应,以含有200mM NaCl、1mMEDTA,pH 6.1的10mM磷酸钾缓冲液透析除去剩余的SATP。
步骤2:制备人多克隆人免疫球蛋白G-MH
以pH 7.4的30mM磷酸钾缓冲液透析多克隆人抗体,而后将蛋白质溶液调整至蛋白质浓度为约25mg/ml。马来酰亚胺己酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Maleimidohexanoyl-N-hydroxysuccinimide ester,MHS)溶于DMSO,以1∶6(IgG∶MHS)的摩尔比加入至抗体溶液中。调整pH至pH 7.1,混合物在25℃孵育60分钟。通过加入L-赖氨酸至终浓度为10mM停止反应,调整pH至pH 6.2,通过以含有200mM NaCl、1mM EDTA,pH 6.1的10mM磷酸钾缓冲液透析除去剩余的MHS。
步骤3:aa-IL-6R pAb-SATP与多克隆人免疫球蛋白G-MH的缀合
通过用2%(v/v)1M羟胺(hydroxylamine),pH 7.5孵育将aa-IL-6RpAb-SATP脱去乙酰基为aa-IL-6R pAb-SH,在25℃孵育45分钟。脱去乙酰基的抗体与多克隆人免疫球蛋白G-MH混合(摩尔比为IgG-SH∶IgG-MH=1∶3),用含有200mM NaCl、1mM EDTA,pH 6.1的10mM磷酸钾缓冲液稀释至终浓度为1.5mg/ml aa-IL-6R pAb-SH和4.5mg/ml多克隆人免疫球蛋白G-MH。调整pH至pH 7.1,在25℃孵育混合物。用分析性凝胶过滤柱(例如TSK 3000)分析缀合过程。通常在45分钟后通过加入半胱氨酸至终浓度为1mM停止缀合。再经过30分钟孵育时间后,加入终浓度为5mM的N-甲基马来酰亚胺(NMM),并调整pH至pH7.5。在25℃孵育60分钟后,用S300凝胶过滤层析纯化缀合物,除去未缀合的抗体。
制备兔aa-IL-6R pAb与人免疫球蛋白M的缀合物
步骤1:制备兔aa-IL-6R pAb-SATP
以含有150mM NaCl,pH 7.8的100mM磷酸钾缓冲液透析aa-IL-6RpAb,将蛋白质溶液调整至蛋白质浓度为约15mg/ml。N-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸酯(SATP)溶于DMSO,以1∶5(aa-IL-6R pAb∶SATP)的摩尔比加入至抗体溶液。调整pH至pH 7.1,混合物在25℃孵育60分钟。通过加入终浓度为10mM的L-赖氨酸停止反应,以含有200mM NaCl、1mMEDTA,pH 6.1的10mM磷酸钾缓冲液透析除去剩余的SATP。
步骤2:制备多克隆人免疫球蛋白M-MH
以pH 7.4的30mM磷酸钾缓冲液透析多克隆人抗体,而后将得到的蛋白质溶液调整至蛋白质浓度为约20mg/ml。马来酰亚胺己酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MHS)溶于DMSO,以1∶50(IgM∶MHS)的摩尔比加入至抗体溶液中。调整pH至pH 7.1,混合物在25℃孵育60分钟。通过加入L-赖氨酸至终浓度为10mM停止反应。调整pH至pH 6.2,通过以含有200mMNaCl、1mM EDTA,pH 6.1的10mM磷酸钾缓冲液透析除去剩余的MHS。
步骤3:aa-IL-6R pAb-SATP与多克隆人免疫球蛋白M-MH的缀合
通过用2%(v/v)1M羟胺,pH 7.5孵育将aa-IL-6R pAb-SATP脱去乙酰基为aa-IL-6R pAb-SH,在25℃孵育45分钟。脱去乙酰基抗体与多克隆人免疫球蛋白M-MH混合(摩尔比为aa-IL-6R pAb-SH∶IgM-MH=1∶2),用含有200mM NaCl、1mM EDTA,pH 6.1的10mM磷酸钾缓冲液稀释至终浓度为约0.9mg/ml aa-IL-6R pAb-SH和9.1mg/ml多克隆人免疫球蛋白M-MH。调整pH至pH 7.1,在25℃孵育混合物。用分析性凝胶过滤柱(例如TSK 5000)监测缀合过程。通常在60分钟后通过加入半胱氨酸至终浓度为1mM停止缀合反应。再经过30分钟孵育时间后,加入终浓度为5mM的N-甲基马来酰亚胺(NMM),并调整pH至pH 7.5。在25℃孵育60分钟后,用S400凝胶过滤层析纯化缀合物,除去未缀合的抗体。
制备兔aa-IL-6R pAb与多克隆人免疫球蛋白E的缀合物
步骤1:制备兔aa-IL-6R pAb-SATP
以含有150mM NaCl,pH 7.8的100mM磷酸钾缓冲液透析aa-IL-6RpAb,将蛋白质溶液调整至蛋白质浓度为约15mg/ml。N-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸酯(SATP)溶于DMSO,以1∶5(aa-IL-6R pAb∶SATP)的摩尔比加入至抗体溶液。调整pH至pH 7.1,混合物在25℃孵育60分钟。通过加入终浓度为10mM的L-赖氨酸停止反应,以含有200mM NaCl、1mMEDTA,pH 6.1的10mM磷酸钾缓冲液透析除去剩余的SATP。
步骤2:制备多克隆人免疫球蛋白E-MH
以pH 7.4的30mM磷酸钾缓冲液透析多克隆人抗体,将得到的蛋白质溶液调整至最终蛋白质浓度为约13mg/ml。马来酰亚胺己酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MHS)溶于DMSO,以1∶6(IgE∶MHS)的摩尔比加入至抗体溶液中。调整pH至pH 7.1,混合物在25℃孵育60分钟。通过加入L-赖氨酸至终浓度为10mM停止反应,调整pH至pH 6.2,通过以含有200mMNaCl、1mM EDTA,pH 6.1的10mM磷酸钾缓冲液透析除去剩余的MHS。
步骤3:兔aa-IL-6R pAb-SATP与多克隆人免疫球蛋白E-MH的缀合
通过用2%(v/v)1M羟胺,pH 7.5孵育将aa-IL-6R pAb-SATP脱去乙酰基为aa-IL-6R pAb-SH,在25℃孵育45分钟。脱去乙酰基抗体与多克隆人免疫球蛋白E-MH混合(摩尔比为aa-IL-6R pAb-SH∶IgE-MH=1∶1.7),用含有200mM NaCl、1mM EDTA,pH 6.1的10mM磷酸钾缓冲液稀释至浓度为2.9mg/ml aa-IL-6R pAb-SH和6.3mg/ml多克隆人免疫球蛋白E-MH。调整pH至7.1,在25℃孵育混合物。用分析性凝胶过滤柱(例如TSK 4000)监测缀合过程。通常在90分钟后通过加入半胱氨酸至终浓度为1mM停止缀合过程。再经过30分钟孵育时间后,加入N-甲基马来酰亚胺(NMM)终浓度至5mM,并调整pH至pH 7.5。在25℃孵育60分钟后,用S300凝胶过滤层析纯化缀合物,除去未缀合的抗体。
制备兔aa-IL-6R pAb与多克隆人免疫球蛋白A的缀合物
步骤1:制备兔aa-IL-6R pAb-SATP
以含有150mM NaCl,pH 7.8的100mM磷酸钾缓冲液透析aa-IL-6RpAb,将蛋白质溶液调整至蛋白质浓度为约15mg/ml。N-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸酯(SATP)溶于DMSO,以1∶5(aa-IL-6R pAb∶SATP)的摩尔比加入至抗体溶液。调整pH至pH 7.1,混合物在25℃孵育60分钟。通过加入终浓度为10mM的L-赖氨酸停止反应,以含有200mM NaCl、1mMEDTA,pH 6.1的10mM磷酸钾缓冲液透析除去剩余的SATP。
步骤2:制备多克隆人免疫球蛋白A-MH
以pH 7.4的30mM磷酸钾缓冲液透析多克隆人抗体,将得到的蛋白质溶液调整至最终蛋白质浓度为约13mg/ml。马来酰亚胺己酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MHS)溶于DMSO,以1∶6(IgA∶MHS)的摩尔比加入至抗体溶液中。调整pH至pH 7.1,混合物在25℃孵育60分钟。通过加入L-赖氨酸至终浓度为10mM停止反应,调整pH至pH 6.2,通过以含有200mMNaCl、1mM EDTA,pH 6.1的10mM磷酸钾缓冲液透析除去剩余的MHS。
步骤3:兔aa-IL-6R pAb-SATP与多克隆人免疫球蛋白A-MH的缀合
通过用2%(v/v)1M羟胺,pH 7.5孵育将aa-IL-6R pAb-SATP脱去乙酰基为aa-IL-6R pAb-SH,在25℃孵育45分钟。脱去乙酰基抗体与多克隆人免疫球蛋白A-MH混合(摩尔比为aa-IL-6R pAb-SH∶IgA-MH=1∶2),用含有200mM NaCl、1mM EDTA,pH 6.1的10mM磷酸钾缓冲液稀释至浓度为2.9mg/ml aa-IL-6R pAb-SH和6.3mg/ml多克隆人免疫球蛋白A-MH。调整pH至7.1,在25℃孵育混合物。用分析性凝胶过滤柱(例如TSK 4000)监测缀合过程。通常在90分钟后通过加入半胱氨酸至终浓度为1mM停止缀合过程。再经过30分钟孵育后,加入终浓度为5mM的N-甲基马来酰亚胺(NMM),调整pH至pH 7.5。在25℃孵育60分钟后,用S300凝胶过滤层析纯化缀合物,除去未缀合的抗体。
实施例2
将生物素化的抗IL-6R抗体偶联到链霉抗生物素蛋白包被的芯片上
抗IL-6R抗体用缓冲液透析(100mM磷酸钾缓冲液,pH 8.5)。之后将溶液调整至蛋白质浓度为10mg/ml。D-生物素-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶于DMSO,以1∶5的摩尔比加入至抗体溶液中。60分钟后通过加入L-赖氨酸停止反应。通过以补充有150mM氯化钠,pH 7.5的25mM磷酸钾缓冲液透析除去剩余的标记试剂。
第一步,用NHS-EDC混合物活化CM5芯片流动池(flow cell)的表面。表面活化后,注入100μg/ml的中性链亲和素(Neutravidin)溶液(用pH4.5的缓冲液稀释;Pierce),以使其与活化的表面酯之间得以形成共价键。然后,通过注入1M乙醇胺实现剩余的未偶联的酯的失活。将生物素化的抗体注入单个流动池,以20μl/分钟的流速和20μg/ml的浓度流动5分钟。这使得抗体固定到流动池上。
实施例3
检测人血清中的IgG类抗-抗IL-6R抗体的抗体
将样品稀释至1∶10到1∶100之间,以20μl的体积、流速20μl/分钟注入到如实施例2中制备的芯片上。注入样品之后,抗IgG类抗体即单克隆抗人免疫球蛋白G抗体以20μl/分钟的流速和20μg/ml的浓度注入。最后,进行一次再生溶液(100mM H3PO4)的注射。在各测量开始时测量标准样品。20μl兔抗-抗IL-6R抗体的多克隆抗体(aa-IL-6R pAb)与人IgG的缀合物作为阳性标准,以流速20μl/分钟注入到具有固定化的抗IL-6R抗体完整抗体、F(ab’)2片段,和/或Fc片段的免疫原性芯片上。标准注射之后,任选地以相同流速注入抗IgG类抗体即单克隆抗人免疫球蛋白G抗体。
实施例4
检测人血清中的IgE类抗-抗IL-6R抗体的抗体
将样品稀释至1∶10到1∶100之间,以20μl的体积、流速20μl/分钟注入到如实施例2中制备的芯片上。注入样品之后,抗IgE类抗体即单克隆抗人免疫球蛋白E抗体以20μl/分钟的流速和20μg/ml的浓度注入。最后,进行一次再生溶液(100mM H3PO4)的注射。在各测量开始时测量标准样品。20μl兔aa-IL-6R pAb与人IgE的缀合物作为阳性标准,以流速20μl/分钟注入到具有抗IL-6R抗体的固定化完整抗体、F(ab’)2片段,和/或Fc片段的免疫原性芯片上。标准注射之后,任选地以相同流速注入抗IgE类抗体即单克隆抗人免疫球蛋白E抗体。
实施例5
检测人血清中的IgM类抗-抗IL-6R抗体的抗体
将样品稀释至1∶10到1∶100之间,以20μl的体积、流速20μl/分钟注入到如实施例2中制备的芯片上。注入样品之后,抗IgM类抗体即单克隆抗人免疫球蛋白M抗体以20μl/分钟的流速和20μg/ml的浓度注入。最后,进行一次再生溶液(100mM H3PO4)的注射。在各测量开始时测量标准样品。20μl兔aa-IL-6R pAb与人IgM的缀合物作为阳性标准,以流速20μl/分钟注入到具有抗IL-6R抗体的固定化完整抗体、F(ab’)2片段,和/或Fc片段的免疫原性芯片上。标准注射之后,任选地以相同流速注入抗IgM类抗体即单克隆抗人免疫球蛋白M抗体。
实施例6
检测人血清中IgE、IgG和IgM类抗-抗IL-6R抗体的抗体
将样品稀释至1∶10到1∶100之间,以20μl的体积、流速20μl/分钟注入到如实施例2中制备的芯片上。注入样品之后,抗IgE类抗体即单克隆抗人免疫球蛋白E抗体以流速20μl/分钟和20μg/ml的浓度注入。注射之后,记录反应。之后抗IgM类抗体即单克隆抗人免疫球蛋白M抗体以20μl/分钟的流速和20μg/ml的浓度注入。注射之后,记录反应。之后抗IgG类抗体即单克隆抗人免疫球蛋白G抗体以流速20μl/分钟和20μg/ml的浓度注入。注射之后,记录反应。最后,进行一次再生溶液(100mM H3PO4)的注射。在各测量开始时测量所述的三种标准样品(缀合物)。标准物1∶20μl兔aa-IL-6R pAb与人IgM的缀合物作为阳性标准,注入到免疫原性芯片上;标准物2∶20μl兔aa-IL-6R pAb与人IgE的缀合物作为阳性标准注入到免疫原性芯片上;标准物3∶20μl兔aa-IL-6R pAb与人IgG的缀合物作为阳性标准注入到免疫原性芯片上。
实施例7
用标准缀合物对IgE类抗亲本抗体进行ELISA测定
第一步,将生物素化的针对IL-6受体(亲本抗体)的抗体结合到链霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板(SA-MTP)的孔表面上。用广域缓冲液洗涤除去未结合的抗体。之后,将样品和参考标准物(缀合多克隆人IgE的针对抗IL-6受体抗体的兔抗体)加入不同孔中并孵育。来自样品的抗亲本抗体和参考标准物分别与固定化亲本抗体结合。洗涤步骤之后,结合的抗亲本抗体和参考标准物分别用洋地黄毒苷化的针对人IgE的抗体进行检测,而后与辣根过氧化物酶标记的抗洋地黄毒苷抗体孵育。抗体-酶缀合物催化底物的显色反应。用ELISA读板器在波长405nm处(参考波长:490nm)测量信号。以一式三份测定各血清样品的吸光值。标准物获得阳性信号,在抗亲本抗体为IgE亚类的情况下,样品也得到阳性信号(图5和6)。
Claims (7)
1.缀合物,其包含与单克隆治疗性抗体的CDR区特异性结合的抗独特型抗体和属于单一免疫球蛋白类别的参考免疫球蛋白,其中所述参考免疫球蛋白为人免疫球蛋白或人免疫球蛋白的Fc区。
2.权利要求1所述的缀合物,其特征在于所述参考免疫球蛋白不与所述抗独特型抗体特异性结合,且不与所述治疗性抗体特异性结合。
3.权利要求1所述的缀合物在免疫测定中作为标准物或阳性对照的用途,所述免疫测定用于测定样品中抗亲本抗体的抗体。
4.权利要求3所述的用途,其特征在于所述免疫测定为包含捕获抗体和示踪抗体的夹心免疫测定法,其中捕获抗体或示踪抗体为所述亲本抗体。
5.权利要求3或4所述的用途,其特征在于所述抗亲本抗体的抗体为针对所述亲本抗体的抗独特型抗体。
6.权利要求3至5中任一项所述的用途,其特征在于所述捕获抗体选自所述亲本抗体的轻链、重链可变区、Fab、Fab’、F(ab)2或F(ab’)2片段。
7.测定样品中与亲本抗体的CDR区特异性结合的抗独特型抗体的免疫球蛋白类别的方法,所述方法使用包含捕获抗体和示踪抗体及本发明的缀合物的夹心免疫测定法,所述方法包含下列步骤:
a)所述样品在适合形成捕获抗体/抗独特型抗体复合物的条件下与捕获抗体接触,
b)分别以
i)抗人免疫球蛋白A抗体,
ii)抗人免疫球蛋白E抗体,
iii)抗人免疫球蛋白M抗体,和
iv)抗人免疫球蛋白G抗体
作为示踪抗体与所述捕获抗体/抗独特型抗体复合物接触,
c)测定所述示踪抗体与所述复合物的结合,由此确定所述抗独特型抗体的免疫球蛋白类别,
其中权利要求1所述的缀合物用作阳性对照。
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