KR101182945B1 - 항-이디오타입 접합체, 및 면역분석에서 표준물로서의 그의 용도 - Google Patents

항-이디오타입 접합체, 및 면역분석에서 표준물로서의 그의 용도 Download PDF

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Abstract

모 항체의 CDR 영역에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 및 E, G, M 또는 A 클래스의 다클론 인간 혈청 면역글로불린의 접합체를 포함하는 조성물, 및 면역분석에서 표준물로서의 상기 조성물의 용도가 본원에 기재되어 있다.

Description

항-이디오타입 접합체, 및 면역분석에서 표준물로서의 그의 용도{ANTI-IDIOTYPE CONJUGATE AND ITS USE AS A STANDARD IN AN IMMUNASSAY}
본 발명은 접합체, 및 항-약물 항체를 확인하기 위한 면역분석에서 표준물 또는 양성 대조군으로서의 상기 접합체의 용도에 관한 것이다.
단일클론 항체를 사용하는 표준 고상 면역분석은 고형 지지체상에 흡착된 항체(포획(capture) 항체), 항원, 및 검출가능한 표지(label)와 접합된 항원의 또 다른 항원결정인자(epitope)에 대한 항체(탐침(tracer) 항체) 사이의 결합체 형성을 포함한다. 따라서, 고형 지지체-포획 항체-항원-탐침 항체의 샌드위치가 형성된다. 상기 샌드위치에서, 항체-접합된 검출가능한 표지의 세기는 배양 매질에 있는 항원 농도에 비례한다. 표준 샌드위치 방법은 이중 항원 가교 면역분석(double antigen bridging immunoassay)으로도 불리는데, 포획 및 탐침 항체가 항원의 다른 항원결정인자에 결합하기 때문이다. 문헌[Hoesel, W. 등, J. Immunol. Methods 294(2004) 101-110]은 아미노 기 및 탄수화물 기에 결합된 고정 rhEPO의 혼합물이 사용되는 항-EPO 이중 항원 가교 분석을 기재하고 있다.
이중 항원 가교 ELISA와 같은 면역분석은 항체 약물(치료용 또는 진단용 항체)에 대한 환자의 면역원성 해답의 연구에서 통상적인 분석 유형이다. 문헌[Mire-Sluis, A.R. 등, J. Immunol. Methods 289(2004) 1-16]은 생명공학 생성물에 대한 숙주 항체의 검출을 이용하는 면역분석의 설계 및 최적화를 위한 권고사항을 요약하고 있다. 마이어-슬루이스(Mire-Sluis) 등에 따르면, 널리 알려진 항-약물 항체 분석 포맷이 상당한 불이익을 나타낸다. 항-약물 항체 분석이 예컨대 국제특허출원 공개 제WO 2005/045058호 및 제WO 제90/006515호에 언급되어 있다. 항-이디오타입 항체 분석이 예컨대 미국특허 제5,219,730호, 국제특허출원 공개 제WO 87/002778호, 유럽특허 제0 139 389호 및 유럽특허 제0 170 302호에 언급되어 있다. 문헌[Wadhwa, M. 등, J. Immunol. Methods 278(2003) 1-17]은 치료용 생물학적 제제(biologicals)에 의해 유도된 불필요한 항체의 검출, 측정 및 평가를 위한 방법을 기록하고 있다.
인간의 항-인간 항체의 혈청학적 분석이 문헌[Ritter, G., Cancer Res. 61 (2001) 6851-6859] 및 국제특허출원 공개 제WO 2003/016909호에 기재되어 있다. IgG 클래스의 인간 항-인간 항체의 확인은 분석 이전에 단백질 G 침강이라는 부가적인 단계를 필요로 한다.
도 1은 시료에 있는 항-모-항체 항체의 검출 및 선택적인 후속의 하위클래스(subcalss) 결정의 개요를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 항-이디오타입 항체의 하위클래스 결정을 위한 바이어코어 SPR 도표를 나타낸다. (1)은 시료 주입, (2) + (3)은 항-인간-면역글로불린-E 항체의 주입, (4)는 항-인간-면역글로불린-G 항체의 주입이다.
도 3은 선택적인 클래스에 특이적인 항체와 함께, 표준물로서 본 발명에 따른 접합체의 사용에 대한 개요이다.
도 4는 표준물로서 본 발명에 따른 화합물(제 1 반응) 및 선택적인 후속의 항-표준물 면역글로불린 하위클래스 항체(제 2 반응)의 이용에 대한 바이어코어 SPR 도표를 나타낸다.
도 5는 항-이디오타입 항체의 ELISA-확인의 개요이다.
도 6은 항-이디오타입 항체를 확인하기 위한 ELISA의 표준 곡선을 나타낸다.
도 7은 항-모-항체 항체의 결합 영역의 다중 채널 검출 및 후속적인 면역글로불린 클래스 결정의 개요를 나타낸다.
발명의 요약
본 발명은 모 항체(parent antibody)의 CDR 영역에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 및 단일 면역글로불린 클래스인 기준 면역글로불린을 포함하는 접합체를 포함한다.
바람직하게, 상기 기준 면역글로불린은 상기 항-이디오타입 항체 및 상기 모 항체에 특이적으로 결합하지 않는다.
본 발명은 인간 시료에 있는 항-모-항체 항체를 확인하기 위한 면역분석에서 본 발명에 따른 접합체의 표준물로서의 용도를 추가로 포함한다.
바람직하게, 상기 접합체는 포획 항체 및 탐침 항체를 포함하는 샌드위치 면역분석을 이용하는 시료에 있는 항-모-항체 항체의 면역학적 확인에서, 표준물 또는 양성 대조군으로 이용된다.
바람직하게, 상기 포획 항체 또는 상기 탐침 항체는 상기 모 항체이다.
바람직하게, 상기 항-모-항체 항체는 상기 모 항체에 대한 항-이디오타입 항체이다.
바람직하게, 상기 모 항체는 치료용 항체 또는 진단용 항체이다.
바람직하게, 포획 항체는 상기 모 항체의 경쇄(light chain), 중쇄(heavy chain) 가변 영역, Fab, Fab', F(ab)2 또는 F(ab')2 분절을 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직하게, 포획 항체의 고형 지지체로의 접합은 피동 흡착에 의해 수행된다.
바람직하게, 포획 항체는 특이적 결합 쌍을 통해 고정된다.
바람직하게, 포획 항체는 바이오틴(biotin)에 접합되고, 고정은 고정된 아비딘(Avidin) 또는 스트렙타비딘(Streptavidin)을 통해 이루어진다.
바람직하게, 탐침 항체는 검출가능한 표지에 특이적 결합 쌍을 통해 접합된다.
바람직하게, 탐침 항체는 다이곡시제닌(digoxigenin)에 접합되고, 검출가능한 표지와의 연결은 다이곡시제닌에 대한 항체를 통해 이루어진다.
바람직하게, 면역학적 확인은 표면 플라스몬 공명에 의해 이루어진다.
바람직하게, 포획 및/또는 탐침 항체와 그의 접합 파트너의 접합은 항체의 아미노산 골격의 N-말단 및/또는 ε-아미노 기(라이신), 상이한 라이신의 ε-아미노 기, 카복시-, 설프하이드릴-, 하이드록시- 및/또는 페놀계 작용기, 및/또는 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올 기를 통해 달성한다.
바람직하게, 포획 항체는 피동 흡착에 의해 고형 지지체에 접합되고, 따라서 고형 지지체에 접합된 포획 항체는 상이한 항체 영역을 통해 고형 지지체에 접합되는 둘 이상의 포획 항체의 혼합물을 포함한다. 피동 흡착은 예컨대 문헌[Butler, J.E., Solid Phases in Immunoassay, In: Immunoassays, Diamandis, E.P. 및 Christopoulos, T.K.(eds.), Academic Press San Diego (1996), pp.205-225]에 기재되어 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 포획 항체는 특이적 결합 쌍을 통해 고정된다. 이러한 결합 쌍(제 1 구성요소/제 2 구성요소)은 예컨대 스트렙타비딘 또는 아비딘/바이오틴, 항체/항원(예컨대, 문헌[Hermanson, G.T. 등, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996] 참조), 렉틴/다당류, 스테로이드/스테로이드 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 효소/기질, IgG/단백질 A 및/또는 G 등이다. 바람직하게, 포획 모 항체는 바이오틴에 접합되고, 고정은 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 통해 이루어진다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 탐침 항체는 검출가능한 표지에 접합되고, 바람직하게는 특이적 결합 쌍을 통해 접합된다. 이러한 결합 쌍(제 1 구성요소/제 2 구성요소)은 예컨대 스트렙타비딘 또는 아비딘/바이오틴, 항체/항원(예컨대, 문헌[Hermanson, G.T. 등, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996] 참조), 렉틴/다당류, 스테로이드/스테로이드 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 효소/기질, IgG/단백질 A 및/또는 G 등이다. 바람직하게, 탐침 모 항체는 검출가능한 표지에 다이곡시제닌, 및 다이곡시제닌에 대한 항체를 통해 접합된다.
택일적으로, 탐침 모 항체는 루테늄 비스피리딜 결합체처럼 전기화학발광 표지에 접합된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 모 항체의 CDR 영역에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 및 단일 면역글로불린 클래스인 기준 면역글로불린을 포함하는 접합체를 포함한다. 바람직하게, 상기 모 항체는 치료용 항체이다. 바람직하게, 상기 모 항체는 진단용 항체이다.
본 발명에 따른 "모 항체의 CDR 영역에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체"란 용어는 인간이 아닌 동물의 모 항체에 대해 생성되는 항체, 즉 비-인간 항체를 의미한다. 바람직하게, 모 항체에 대해 생성된 상기 항체는 설치류 또는 짧은 꼬리 원숭이(macaque), 특히 바람직하게는 생쥐(mouse), 토끼, 사이노몰거스 원숭이(cynomolgus)에서 생성되거나 또는 표시 기법(display technique), 바람직하게는 파지- 또는 리보솜-표시에 의해 수득된다. 바람직하게, 항-이디오타입 항체는 다클론 항체이다. 또한, 바람직하게 항-이디오타입 항체는 단일클론 항체이다. 동물의 면역화는 바람직하게는 모 항체 또는 그의 분절에 의해 이루어진다. 추가적인 단계에서, 상기 동물로부터의 면역글로불린이 단리되어, 모 항체의 CDR 영역에 대한 친화도 흡착을 이용하여 정제된다. "모 항체의 CDR 영역"이란 용어는 모 항체의 경쇄 및 중쇄의 CDR 영역을 의미하므로, 모 항체 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3, 모 항체 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3을 포함한다.
본 발명에 따른 "모 항체"란 용어는 개인에게 약물(약물 항체 또는 치료용 항체) 또는 진단용 수단(진단용 항체)으로 투여될 수 있는 항체를 의미하므로, 상기 개인의 시료는 투여후에 상기 모 항체를 포함할 것으로 생각된다. 본 발명에 따라 실시되는 하나의 분석에서, 모 항체, 포획(모) 항체 및/또는 탐침(모) 항체는 "동일한" 항체 분자, 예컨대 동일한 발현 벡터에 의해 재조합되어 생성되고 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 포함한다. 약물 항체(치료용 단일클론 항체)는 종양 질환(예: 비-호지킨 림프종, 유방암 및 결장암을 비롯한 혈액성 및 고형 종양)과 같은 다양한 질환을 치료하기 위해 널리 사용되고 있다. 이러한 항체는 예컨대, 문헌[Levene, A.P. 등, Journal of the Royal Society of Medicine 98 (2005) 146-152]에 기재되어 있다. 이러한 항체는 예컨대, CCR4, CD19, CD20, CD22, CD28, HLA-DR, CD33, CD40, CD52, CD80, CSF-1R, CTLA-4, 섬유아세포 활성 단백질(FAP), EGFR, G250, GD3, HER2/neu, HER3, HER4, 전립선-특이적인 막 항원(PSMA), CD56, VEGF, VEGF2, TLSP-R, TIE-1, TIE-2, TNF-알파, TNF형 세포자멸사의 약한 유도체(TWEAK), CEA, Ep-CAM, TRAIL, TRAIL-수용체 1, TRAIL-수용체 2, 림프독소-베타 수용체, 레비스(Levis) Y 항원, 헵신, 흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), IL-1 수용체, IL-6 수용체, VEGF-수용체 1, VEGF-수용체 2 또는 IGF-1 수용체에 대한 항체이다. 치료용 항체가 또한 문헌[Groner, B. 등, Curr. Mol. Med. 4(2004) 539-547; 및 Harris, M., Lancet Oncol. 5 (2004) 292-302]에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 "기준 면역글로불린"이란 용어는 완전 면연글로불린, 즉 Fab-영역 및 Fc-영역을 포함하는 면역글로불린, 뿐만 아니라 완전 면역글로불린의 분절, 예컨대 Fc-영역, CH2 도메인 또는 CH3 도메인을 의미한다. 기준 면역글로불린은 바람직하게는 인간 면역글로불린이다. 바람직하게 "기준 면역글로불린"은 인간 면역글로불린 또는 인간 면역글로불린의 Fc-영역이다. "기준 면역글로불린"은 항-이디오타입 항체에 특이적으로 결합하지 않고, 본 발명에 따른 접합체의 모 항체에 특이적으로 결합하지 않는다. 면역글로불린의 Fc-영역은 완전 면역글로불린의 펩신 또는 파파인 절단에 의해 수득된다. 기준 면역글로불린은 "단일 면역글로불린 클래스"이다. "단일 면역글로불린 클래스"란 용어는 기준 면역글로불린이 면역글로불린 A, E, M 및 G 클래스로부터 선택된 면역글로불린 클래스에 특이적인 불변 영역 아미노산 서열을 포함함을 의미한다. 면역글로불린 클래스에 특이적인 불변 영역 아미노산 서열에 대해서는 예컨대, 문헌[Pink, J.R. 등, Biochem. J. 117 (1970) 33-47]을 참조한다.
"항-모-항체 항체"는 모 항체에 특이적으로 결합하는 항체, 즉 모 항체에 대한 항체이다. 마찬가지로, 항-항-IL-6R-항체 항체는 항-IL-6R 항체에 특이적으로 결합하는 항체이다. "항-모-항체 항체"는 모 항체의 가변 영역, 불변 영역 또는 당구조와 같이 모 항체의 임의의 영역에 대한 항체이다. 이러한 항-모-항체 항체는 항체 요법동안에 환자의 면역원성 반응으로 발생할 수 있다(문헌[Pan, Y. 등, FASEB J. 9 (1995) 43-49] 참조). "항-이디오타입 항체"는 모 항체의 CDR 영역에 특이적으로 결합하는 항체이다. 항-이디오타입 항체는 모 항체의 경쇄 CDR1 영역, 경쇄 CDR2 영역, 경쇄 CDR3 영역, 중쇄 CDR1 영역, 중쇄 CDR2 영역 또는 중쇄 CDR3 영역에 특이적으로 결합한다.
예시적인 (바람직하게는 단일클론) 모 항체는 IL-6 수용체에 대한 항체(항-IL-6R 항체)이다. 이러한 항체는 예컨대, 문헌[Mihara, M. 등, Clin. Immunol. 98(2001) 319-326, Nishimoto, N. 등, Blood 106(2005) 2627-2632], 임상 시험 NCT00046774 또는 국제특허출원 공개 제WO 2004/096274호에 기재되어 있다.
예시적인 (바람직하게는 단일클론) 모 항체는 IGF-1 수용체에 대한 항체(항-IGF-1R 항체)이다. 이러한 항체는 예컨대 국제특허출원 공개 제WO 2004/087756호 또는 제WO 2005/005635호에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 "결합" 또는 "특이적 결합"이란 용어는 바이어코어( BIAcore) 분석에서 10-6M(M=몰/ℓ) 미만의 KD 값(예컨대, 10-12M), 더욱 바람직하게는 10-9M 내지 10-15M 범위의 KD 값으로 항원, 면역글로불린의 불변 영역, 모 항체 또는 모 항체 CDR 영역에 결합함을 의미한다. KD 값이 10-5M 보다 큰 경우(예컨대, 10-4M), "비-특이적 결합"으로 판단된다.
다른 면역분석의 원리가 예컨대, 문헌[Hage, D.S., Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R]에 기재되어 있다. 문헌[Lu, B. 등, Analyst 121 (1996) 29R-32R]은 면역분석에서 사용하기 위한 항체의 배향된 고정을 기록하고 있다. 아비딘-바이오틴-매개된 면역분석은 예컨대, 문헌[Wilchek, M. 및 Bayer, E.A., Methods Enzymol. 184 (1990) 467-469]에 기록되어 있다.
항체, 특히 이들의 불변 도메인은 표면, 단백질, 중합체(예컨대, PEG, 셀룰로즈 또는 폴리스티롤), 효소 또는 결합 쌍중 하나의 구성원과 같은 결합 파트너에 결합하기 위한 아미노산 측쇄 작용기, 즉 화학 반응기를 함유한다. 항체의 화학 반응기는 예컨대 아미노 기(라이신의 ε 아미노 기, α-아미노 기), 티올 기(시스틴, 시스테인 및 메티오닌), 카복시산 기(아스파트산, 글루탐산) 및 당-알코올계 기이다. 이러한 방법이 예컨대, 문헌[Aslam, M. 및 Dent, A., Bioconjugation, MacMillan Ref. Ltd. (1999) 50-100]에 기재되어 있다.
폴리펩타이드가 예컨대, 고형 지지체에 접합하기 위해서는 적합한 화학적 보호제가 필요하다. 이들은 예컨대 보호되지 않은 측쇄 아민에서 결합을 형성하고, N-말단에서의 결합보다 덜 안정적이고 이와는 다르다. 많은 이러한 화학적 보호제가 알려져 있다(예컨대, 유럽특허 제0 651 761호 참조). 바람직한 화학적 보호제는 말레산 또는 시트라코닐산 무수물과 같은 환형 다이카복시산 무수물을 포함한다.
"시료"란 용어는 인간으로부터 비롯된 임의의 양의 물질을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 물질은 비제한적으로 개인의 전혈(whole blood), 혈청 또는 혈장을 포함하며, 이들은 임상 경로에서 가장 널리 사용되는 시료 공급원이다.
본 발명에 따른 면역분석을 위한 고형 지지체가 당업계에 널리 기재되어 있다(예컨대, 문헌[Butler, J.E., Methods 22(2000) 4-23] 참조).
"고형 지지체"란 용어는 유체가 아닌 물질을 의미하며, 중합체, 금속(상자성, 강자성 입자), 유리 및 세라믹과 같은 물질로부터 제조된 칩(chip), 용기 및 입자(극미립자 및 비드(bead) 포함); 실리카, 알루미나 및 중합체 겔과 같은 겔 물질; 중합체, 금속, 유리 및/또는 세라믹으로 제조될 수 있는 모세관; 제올라이트 및 기타 다공질 물질; 전극; 미량역가판; 고형 스트립(solid strip); 및 큐벳, 시험관 또는 다른 분광계 시료 용기를 포함한다. 분석의 고형 지지체 구성요소는 분석물이 접할 수 있는 불활성 고형 표면과 구별되는데, "고형 지지체"는 그의 표면상에 하나 이상의 잔기를 함유하여서 포획 항체와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하도록 되어 있기 때문이다. 고형 지지체는 시험관, 스트립, 큐벳 또는 미량역가판과 같은 움직이지 않는 구성요소일 수 있거나, 또는 비드 및 극미립자와 같은 움직이는 구성요소일 수 있다. 극미립자는 또한 균질 분석 포맷을 위한 고형 지지체로 이용될 수도 있다. 단백질 및 다른 물질의 비공유 또는 공유결합 부착 둘다를 허용하는 각종 극미립자가 이용될 수 있다. 이러한 입자는 폴리스티렌 및 폴리(메틸메타크릴레이트)와 같은 중합체 입자; 금 나노입자 및 금 콜로이드와 같은 금 입자; 및 실리카, 유리 및 금속 산화물 입자와 같은 세라믹 입자를 포함한다. 예컨대, 본원에서 참고문헌으로 인용되는 문헌[Martin, C.R. 등, Analytical Chemistry-News & Features 70(1998) 322A-327A]을 참조한다.
"칩"은 금속, 유리 또는 플라스틱과 같은 고형의 비다공질 물질이다. 상기 물질은 전체적으로 또는 특정 부분에서 선택적으로 피복될 수 있다. 상기 물질의 표면에는 점 배열이 두드러지게 또는 조화되게 존재한다. 각각의 점에는 물질 표면에 대한 연결자 또는 간격자(spacer)를 갖거나 갖지 않는 한정된 폴리펩타이드가 고정될 수 있다.
본원의 상기 및 하기 둘다에 언급된 모든 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용된다.
색소원(형광 또는 발광 기 및 염료), 효소, NMR-활성 기 또는 금속 입자, 합텐(예: 다이곡시제닌)은 검출가능한 표지의 예이다. 검출가능한 표지는 또한 광활성화 가교결합 기, 예컨대 아지도 또는 아지린 기일 수 있다. 전기화학발광에 의해 검출될 수 있는 금속 킬레이트는 또한 검출가능한 표지로 이용되는 바람직한 신호-방출 기이고, 루테늄 킬레이트, 예컨대 루테늄(비스피리딜)3 2 + 킬레이트가 특히 바람직하다. 적합한 루테늄 표지 기가 예컨대 유럽특허 제0 580 979호, 국제특허출원 공개 제WO 90/05301호, 제WO 90/11511호 및 제WO 92/14138호에 기재되어 있다.
본 발명은 모 항체의 CDR 영역에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 및 단일 면역글로불린 클래스인 기준 면역글로불린을 포함하는 접합체를 포함한다.
본 발명은 모 항체의 CDR 영역에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체, 및 인간 면역글로불린 E, 인간 면역글로불린 G, 인간 면역글로불린 M 또는 인간 면역글로불린 A를 포함하는 군으로부터 선택된 단일 면역글로불린인 기준 면역글로불린, 즉, 인간 IgE 클래스, 인간 IgG 클래스, 인간 IgM 클래스 또는 인간 IgA 클래스인 기준 면역글로불린을 포함하는 접합체를 포함한다.
바람직하게, 본 발명은 모 항체의 CDR 영역에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체, 및 상기 항-이디오타입 항체에 특이적으로 결합하지 않고 상기 모 항체에 특이적으로 결합하지 않는 단일 면역글로불린 클래스인 기준 면역글로불린을 포함하는 접합체를 포함한다.
바람직하게, 상기 모 항체는 치료용 항체 또는 진단용 항체이다. 바람직하게, 상기 기준 면역글로불린은 단일 면역글로불린 클래스의 비작용성 면역글로불린 또는 단일 면역글로불린 클래스의 면역글로불린의 Fc-영역이다.
"진단용 항체"란 용어는 자연 항체 또는 재조합에 의해 생성된 항체로, 그의 표적 항원을 검출 및 시각화하기 위해 사용되는 항체를 의미한다. 진단용 항체는 예컨대, 분석시스템(예: ELISA) 또는 시험관내 영상화를 위해 사용된다. 진단용 항체는 예컨대 표지된 치료용 항체일 수 있다.
바람직하게, 상기 기준 면역글로불린은 인간 면역글로불린 또는 인간 면역글로불린 Fc-영역이다.
기준 면역글로불린은 항-인간-면역글로불린-G 항체와 같이 항-면역글로불린-클래스 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 면역글로불린 클래스에 특이적인 불변 영역을 제공한다. 따라서, 기준 면역글로불린은 면역글로불린 클래스에 특이적인 태그(tag)를 갖는 본 발명에 따른 접합체를 제공하여서, 태그에 특이적인 항체에 의해 특이적으로 확인될 수 있다. 예컨대, 태그가 면역글로불린 G 불변 영역인 경우, 태그에 특이적인 항체는 항-면역글로불린-G 항체이다.
바람직하게 상기 항-이디오타입 항체는 다클론 항체이고, 상기 기준 면역글로불린은 다클론 면역글로불린이다. 또한, 바람직하게 상기 항-이디오타입 항체는 다클론 항체이며, 상기 기준 면역글로불린은 단일클론 면역글로불린이다. 더욱 바람직하게 상기 항-이디오타입 항체는 단일클론 항체이고, 상기 기준 면역글로불린은 단일클론 면역글로불린이다.
본 발명에 따른 접합체는 항-이디오타입 항체와 기준 면역글로불린의 화학적 접합에 의해 수득된다.
본 발명에 따른 접합체에서 항-이디오타입 항체는 작용성 면역글로불린이고, 기준 면역글로불린은 작용성 면역글로불린이 아니다. 이는 항-이디오타입 항체가 그의 표적 항체에 특이적으로 결합하는 반면, 기준 항체는 임의의 인간 항원에 특이적으로 결합하지 않음을 의미한다. 기준 항체는 천연 발생 면역글로불린에 가능한 한 유사하게 Fc-영역을 제공하고 항원에 결합하지 않도록 제공된다. 항-이디오타입 항체 및 기준 항체가 동일한 항체가 아닌 것, 즉 아미노산 잔기중 20% 이상이 차이나고 아미노산 서열을 기준으로 80% 이하의 동일성을 갖는 것도 본 발명의 범주내에 포함된다. 기준 항체는 다클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있다. 본 출원에서 사용되는 "단일클론"이란 용어는 단일 세포 및/또는 그의 자손세포(progeny)에 의해 생성된 항체의 개체군을 의미한다. 상기 용어는 항체가 동일한 아미노산 서열을 가짐, 즉 항체가 이를 생성시키는 세포의 증식동안에 발생하는 우발 돌연변이에도 불구하고 동일한 아미노산 서열을 가짐을 의미한다.
본 출원에서 사용될 때 "비작용성 면역글로불린"이란 용어는 10- 5몰/ℓ 이상(예: 10- 3몰/ℓ)의 KD-값(결합 친화도), 바람직하게는 10- 6몰/ℓ 이상의 KD-값으로 인간 항원에 결합하는 면역글로불린을 의미한다. 결합 친화도는 표면 플라스몬 공명 기법(바이어코어(등록상표))과 같은 표준 결합 분석에 의해 측정된다. 이러한 결합 친화도 값은 정확한 값으로 취급될 필요는 없으며, 단지 기준을 목적으로 한 것이다. 이는 인간 항원에 대한 면역글로불린-전형적인 특이적 결합을 나타내지 않아서 인간에서 치료적 활성도를 갖지 않는 면역글로불린을 확인하고/하거나 선택하는데 이용된다. 이는 면역글로불린이 비-인간 항원에 대한 특이적 결합을 나타내는 것을 배제하는 것은 아니다. 비-인간 항원의 이러한 특이적 결합은 10-7몰/ℓ이하(예: 10-10몰/ℓ)의 KD-값, 바람직하게는 10-8몰/ℓ이하의 KD-값으로 달성된다.
형질감염체, 즉, 면역화된 마우스로부터 수득된 핵내주입(transfection)된 면역글로불린 유전자를 함유하는 림프구 세포에 근거하여, 본 발명에 따른 접합체는 핵산 수준에서의 접합에 의해 수득될 수 있다.
수용 생물 외부에서 일어나는 포유동물에 대한 약물 투여, 예컨대 외인성 치료용 폴리펩타이드의 투여는 수용 포유동물의 면역 반응을 초래한다. 이러한 면역 반응은 항-약물 항체의 발생에 의해 분명해진다. 이러한 면역 반응을 평가하기 위해, 약물에 대한 항체의 검출 방법이 필요하다.
본 발명에 따른 접합체는 면역분석에서 표준물로 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 인간 시료에 있는 항-모-항체 항체를 확인하기 위한 면역분석에서 모 항체의 CDR 영역에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 및 단일 면역글로불린 클래스인 기준 면역글로불린을 포함하는 접합체의 표준물로서의 용도를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 접합체는 면역분석에서 양성 대조군으로 이용될 수 있다. 이에 의해 예컨대, 검출 한계치를 정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 인간 시료에 있는 항-모-항체 항체를 확인하기 위한 면역분석에서 모 항체의 CDR 영역에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 및 단일 면역글로불린 클래스인 기준 면역글로불린을 포함하는 접합체의 양성 대조군으로서의 용도를 포함한다. 바람직하게, 상기 접합체는 본 실시양태에서 면역분석 이전에 인간 시료에 첨가된다.
모 항체는 바람직하게는 치료용 항체이다. 또한, 바람직하게 모 항체는 생쥐 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체이다. 바람직하게, 모 항체는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체이다. 특히 바람직하게, 상기 모 항체, 치료용 키메라, 인간화 또는 인간 항체이다. 모 항체에 대한 항체를 검출하기 위하여 방사면역 측정법(RIA), 효소면역 측정법(ELISA), 면역방사 측정법(IRMA) 또는 표면 플라스몬 공명법(SPR)과 같은 다른 방법이 이용될 수 있다.
본 출원에서 이용되는 "치료용 항체"란 용어 및 그에 상응하는 어구는 질환의 치료, 요법 또는 진단에서 사용하기 위해 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여하도록 되어있는 바람직하게는 단일클론인 항체를 의미한다. 치료용 항체는 일반적으로 재조합 수단, 예컨대 상기 치료용 항체를 암호화하는 핵산에 의해 핵내주입된 진핵세포의 배양에 의해 생성된다. 바람직하게 치료용 항체는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체이다. 치료용 항체는 목적하는 효과, 예컨대 표적 세포의 감소, ADCC(항체 의존적 세포매개 세포독성)의 매개 또는 CDC(보체 의존적 세포독성)의 매개를 이루기 위해 투여된다. 표적 세포는 예컨대, 암 세포 또는 바이러스-감염된 세포일 수 있다. ADCC 또는 CDC를 매개하기 위하여 치료용 항체는 표적 세포에 결합하여야 하므로 예컨대 종양 항원에 대한 특이성을 나타내어 종양 항원에 특이적으로 결합한다.
본원에서 사용될 때 "종양 항원"은 당업계에 알려진 의미를 포함하고, 종양 세포의 종양형성 특징에 기여한다고 알려지거나 판단되는 종양 세포상에 발현되는(또는 그의 발생과 관련된) 임의의 분자를 포함한다. 매우 많은 종양 항원이 당업계에 알려져 있다. 분자가 종양 항원인지 여부가 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 기법 및 분석, 예컨대 클론원성 분석, 형질전환 분석, 시험관내 또는 생체내 종양 형성 분석, 겔 이동 분석, 유전자 녹아웃(knockout) 분석 등에 따라 확인될 수도 있다. 바람직하게 본원에서 사용되는 "종양 항원"이란 용어는 인간 막통과 단백질, 즉 세포의 지질 양층에 고정되어 있는 세포막 단백질을 지칭한다. 인간 막통과 단백질은 일반적으로 본원에서 사용되는 "세포외 도메인"을 포함하며, 이들은 리간드, 친지질성 막통과 도메인, 보존 세포내 도메인, 예컨대 타이로신 키나아제 도메인, 및 인산화될 수 있는 여러 타이로신 잔기를 포함하는 카복시-말단 신호 도메인에 결합할 수 있다. 종양 항원은 EGFR, HER2/neu, HER3, HER4, EpCAM, CEA, TRAIL, TRAIL-수용체 1, TRAIL-수용체 2, 림프독소-베타 수용체, CCR4, CD19, CD20, CD22, CD28, CD33, CD40, CD80, CSF-1R, CTLA-4, 섬유아세포 활성 단백질(FAP), 헵신, 흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 전립선-특이적 막 항원(PSMA), VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, IGF1-R, TSLP-R, TIE-1, TIE-2, TNF-알파, TNF형 세포자멸사의 약한 유도체(TWEAK) 또는 IL-1R와 같은 분자를 포함한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 접합체는 포획 항체 및 탐침 항체를 포함하는 샌드위치 면역분석법을 이용하여 시료에 있는 항-모-항체 항체의 면역학적 확인에서 표준물로 이용된다. 특히 바람직하게, 상기 포획 또는 상기 탐침 항체는 상기 모 항체이다.
예컨대, 항-약물 항체 분석법이 국제특허출원 공개 제WO 2005/045058호 및 제WO 90/006515호에 언급되어 있으며, 항-이디오타입 항체 분석법이 미국특허 제5,219,730호, 국제특허출원 공개 제WO 87/002778호, 유럽특허 제0 139 389호 및 유럽특허 제0 170 302호에 언급되어 있다.
바람직하게, 상기 항-이디오타입 항체는 단일클론 항체이고, 상기 기준 면역글로불린은 다클론 인간 면역글로불린이다. 또한, 바람직하게 상기 항-이디오타입 항체는 단일클론 항체이고, 상기 기준 면역글로불린은 단일클론 인간 면역글로불린이다.
본 발명에 따른 접합체는 바람직하게는 시료에 있는 모 항체에 대한 항-이디오타입 항체의 면역학적 확인에서 표준물로 이용된다. 면역학적 확인을 위해서는 포획 및 탐침 항체가 이용된다. 한 실시양태에서, 포획 항체는 모 항체이다. 바람직하게, 포획 항체로 이용되는 모 항체는 완전 항체이어서 경쇄과 중쇄을 포함하고, 여기서 경쇄는 가변 도메인 및 불변 도메인을 포함하고 중쇄은 가변 도멘인, CH1 , CH2, CH3 및 선택적인 CH4 도메인, 및 힌지 영역(hinge region)을 포함한다. 바람직하게, 포획 항체는 상기 모 항체의 경쇄, 중쇄 가변 영역, Fab, Fab', F(ab)2 또는 F(ab')2 분절을 포함하는 군으로부터 선택되므로, 이는 상기 모 항체의 경쇄, 중쇄 가변 영역, Fab, Fab', F(ab)2 또는 F(ab')2 분절이다. 다른 실시양태에서, 탐침 항체는 모 항체이다. 상기 실시양태에서, 예컨대 본 발명에 따른 접합체는 접합체의 기준 면역글로불린을 고형 지지체에 특이적으로 결합시키는 면역글로불린을 통해 결합된다.
탐침 및/또는 포획 항체와 그의 접합 파트너의 접합은 피동 흡착, 화학 결합 또는 특이적 결합 쌍을 통한 결합과 같은 상이한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 본원에서 사용되는 "접합 파트너"란 용어는 예컨대, 고형 지지체, 폴리펩타이드, 검출가능한 표지, 특이적 결합 쌍의 구성원을 의미한다. 한 실시양태에서, 포획 및/또는 탐침 항체와 그의 접합 파트너의 접합은 항체의 아미노산 골격의 N-말단 및/또는 ε-아미노 기(라이신), 상이한 라이신의 ε-아미노 기, 카복시-, 설프하이드릴-, 하이드록시- 및/또는 페놀계 작용기, 및/또는 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올 기를 통한 화학 결합에 의해 이루어진다. 한 실시양태에서, 포획 및/또는 탐침 항체는 특이적 결합 쌍을 통해 그의 접합 파트너에 접합된다. 바람직하게, 포획 항체는 바이오틴에 접합되고, 고형 지지체로의 고정은 고형 지지체에 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 통해 이루어진다. 바람직하게, 탐침 항체는 다이곡시제닌에 접합되고, 검출가능한 표지와의 연결은 다이곡시제닌에 대한 항체를 통해 이루어진다. 포획 항체는 또 다른 실시양태에서 피동 흡착에 의해 고형 지지체에 접합된다. 피동 흡착에 의해 고형 지지체에 접합되는 항체는 상이한 항체 영역을 통해 고형 지지체에 접합되는 항체의 혼합물을 포함한다. 따라서, 피동 흡착에 의해 고형 지지체에 접합되는 포획 항체는 고형 지지체와의 접합이 이루어지는 항체 영역, 즉 항체 잔기에서 차이를 갖는 둘 이상의 상이한 접합체의 혼합물이다. 피동 흡착은 예컨대, 문헌[Butler, J.E., Solid Phases in Immunoassay, page 205-225; Diamandis, E.P. 및 Christopoulos, T.K. (Editors): Immunoassays (1996), Academic Press, San Diego]에 기재되어 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 포획 항체는 특이적 결합 쌍을 통해 고정된다. 이러한 결합 쌍(제 1 구성요소/제 2 구성요소)은 예컨대 스트렙타비딘 또는 아비딘/바이오틴, 항체/항원(예컨대, 문헌[Hermanson, G.T. 등, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996] 참조), 렉틴/다당류, 스테로이드/스테로이드 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 효소/기질, IgG/단백질 A 및/또는 G 및/또는 L 등이다. 바람직하게, 포획 모 항체는 바이오틴에 접합되고, 고정은 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 통해 이루어진다. 본 발명의 다른 바람직한 실시양태에서, 탐침 항체는 검출가능한 표지에 접합되고, 바람직하게는 특이적 결합 쌍을 통해 접합된다. 이러한 결합 쌍(제 1 구성요소/제 2 구성요소)은 예컨대, 스트렙타비딘 또는 아비딘/바이오틴, 항체/항원, 렉틴/다당류, 스테로이드/스테로이드 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 효소/기질, IgG/단백질 A 및/또는 G 및/또는 L 등이다. 바람직하게, 탐침 모 항체는 검출가능한 표지에 다이곡시제닌, 및 다이곡시제닌에 대한 항체를 통해 접합된다. 택일적으로, 탐침 모 항체는 루테늄 비스피리딜 결합체와 같은 전기화학발광 표지에 접합된다.
본 발명에 따른 접합체가 인간 시료에 있는 모 항체에 대한 항-이디오타입 항체를 확인하기 위한 면역분석에서 표준물로 이용되는 경우, 이는 바람직하게는 둘 이상의 상이한 농도로 이용된다. 표준물의 상이한 농도에 대해 확인된 반응을 이용하여 보정 곡선이 계산되고/될 수 있다.
본 발명에 따른 접합체가 인간 시료에 있는 모 항체에 대한 항-이디오타입 항체를 확인하기 위한 면역분석에서 표준물로 이용되는 경우, 상기 접합체의 상기 기준 면역글로불린을 특이적으로 결합시키는 (선택적인) 부가적인 항체가 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 접합체가 단독으로 또는 선택적인 부가적인 항-인간-면역글로불린 항체와 함께 표준물로 이용될 수 있다(도 3 및 4).
본 출원에서 바꿔 사용될 수 있는 "표준물" 또는 "표준 물질"이란 용어는 분석 방법에 대한 기준 정도를 의미하며, 동일한 분석 방법의 다른 결과가 비교되어지는 값을 제시하기 위해 이용된다. 본원에서 사용되는 "양성 대조군"이란 용어는 분석 방법에서 이용되는 경우에 정해진 제한 또는 역치 값을 넘는 반응을 이루는 표준 물질을 의미한다. 제한 값은 일반적으로 항-약물 항체를 함유하지 않는 시료의 분석에서 수득된 평균 값에, 수득된 값의 표준 편차의 2배 값, 바람직하게는 3배 값을 더한 값이다.
본 발명은 하기 단계, 즉 a) 본 발명에 따른 접합체와 포획 항체를 접촉시키는 단계, 및 b) 상기 접합체와 상기 포획 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 면역분석에서 본 발명에 따른 접합체를 표준물로 사용하는 방법을 추가로 포함한다. a) 단계에서 결합의 검출은 직접적으로, 예컨대 SPR 각의 변화를 통해, 또는 간접적으로, 예컨대 탐침 항체 및/또는 검출가능한 표지를 통해 이루어질 수 있다.
본 발명은 항-약물 항체가 모 항체의 Fc-영역 또는 Fab-영역에 결합하는지 여부 및 상기 항-약물 항체가 어떠한 면역글로불린 클래스를 갖는지를 확인하는 방법을 추가로 포함한다(도 7 참조). 이 방법에서, 시료 결합은 고정된 모 항체, 상기 모 항체의 고정된 Fc-영역 및/또는 상기 모 항체의 고정된 Fab-영역에 의해 결정된다. 이는 예컨대 바이어코어 칩상에서 실시될 수 있으며, 칩위에 4개 채널중 하나는 고정된 모 항체를 함유하고, 하나는 모 항체의 고정된 Fc-영역을 함유하며, 하나는 모 항체의 고정된 Fab-영역을 함유하고, 하나는 고정된 모 항체를 함유하지 않는다. 어느 채널 및 모 항체의 어느 부분이 시료로부터 항-약물 항체의 결합을 나타내는지에 따라, 항-약물 항체의 결합 영역이 결정될 수 있다. 면역글로불린 클래스는 항-인간-면역글로불린-E 항체, 항-인간-면역글로불린-M 항체, 항-인간-면역글로불린-G 항체 또는 항-인간-면역글로불린-A 항체의 결합에 의해 결정된다. 항-인간-면역글로불린 항체는 순차적으로 또는 동시적으로, 바람직하게는 순차적으로 사용된다. 본 발명에 따른 접합체는 상기 방법에서 표준물로 이용될 수 있다.
본 발명은, 포획 항체, 탐침 항체 및 본 발명에 따른 접합체를 포함하는 샌드위치 면역분석을 이용하여 시료에 있는 모 항체의 CDR 영역에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체의 면역글로불린 클래스를 결정하는 방법으로서,
a) 포획 항체/항-이디오타입 항체-결합체를 형성하기에 적합한 조건하에 상기 시료와 포획 항체를 접촉시키는 단계,
b) 탐침 항체로서 i) 항-인간-면역글로불린-A 항체, ii) 항-인간-면역글로불린-E 항체, iii) 항-인간-면역글로불린-M 항체 및 iv) 항-인간-면역글로불린-G 항체와 상기 포획 항체/항-이디오타입 항체-결합체를 별도로 접촉시키는 단계, 및
c) 상기 탐침 항체 각각과 상기 결합체의 결합을 측정하고, 그에 의해 상기 항-이디오타입 항체의 면역글로불린 클래스를 결정하는 단계
를 포함하고, 본 발명에 따른 접합체가 양성 대조군으로서 사용되는, 방법을 추가로 포함한다.
상기 방법의 개요 및 전형적인 반응 도표가 도 1 및 2에 제시되어 있다.
바람직하게, 상기 탐침 항체는 i) 항-인간-면역글로불린-A 항체, ii) 항-인간-면역글로불린-E 항체, iii) 항-인간-면역글로불린-M 항체 및 iv) 항-인간-면역글로불린-G 항체의 순서로 상기 포획 항체/항-이디오타입 항체-결합체와 접촉하므로, 즉 탐침 항체가 순차적으로 접촉된다.
바람직하게, 상기 포획 항체는 상기 모 항체의 경쇄, 중쇄 가변 영역, Fab, Fab', F(ab)2 또는 F(ab')2 분절을 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명은 항-IL-6R 항체의 CDR 영역에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 추가로 포함한다. 본 발명에 따른 다클론 항체의 제조방법이 실시예 1a)에 기재되어 있다.
바람직하게, 본 발명에 따른 항-이디오타입 항체의 면역글로불린 클래스를 결정하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 포획 항체/항-이디오타입 항체-결합체를 형성하기에 적합한 조건하에 상기 시료와 포획 항체를 접촉시키는 단계,
b) 항-인간-면역글로불린-G 항체, 항-인간-면역글로불린-E 항체, 항-인간-면역글로불린-M 항체 및 항-인간-면역글로불린-A 항체를 포함하는 탐침 항체의 군으로부터 선택된 탐침 항체와 상기 포획 항체/항-이디오타입-항체-결합체를 접촉시키는 단계,
c) 상기 탐침 항체와 상기 결합체의 결합을 측정하는 단계,
d) 상기 포획 항체/항-이디오타입 항체-결합체를 분해하는 단계,
e) 상기에서 선택되지 않은 탐침 항체를 이용하여 a) 내지 d) 단계를 반복하는 단계, 및
f) 상기 항-이디오타입 항체의 면역글로불린 클래스가 상기 포획 항체/항-이디오타입 항체-결합체에 특이적으로 결합하는 상기 탐침 항체의 면역글로불린인지를 확인하는 단계.
탐침 항체는 바람직하게는 항-인간-면역글로불린-G 항체, 항-인간-면역글로불린-E 항체, 항-인간-면역글로불린-M 항체 및 항-인간-면역글로불린-A 항체로부터 선택된다.
본 출원에서 사용되는 "결합체의 형성에 적합한 조건하에"라는 용어 및 그에 상응하는 어구는 해당 항체/면역글로불린, 예컨대 항-이디오타입 항체가 접촉시에 제 2 항체에 결합하게 되는 조건을 의미한다. 이는 제 2 항체에 해당 항체의 100%가 결합되는 것을 반드시 의미하지는 않지만, 본질적으로 해당 항체의 100%가 결합되므로, 즉 당해 항체의 85% 이상이 결합되며, 바람직하게는 당해 항체의 90% 이상이 결합되고, 바람직하게는 당해 항체의 95% 이상이 결합되고, 더욱 바람직하게는 당해 항체의 95% 보다 많은 양이 결합된다.
하기의 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 그의 진정한 범위가 첨부된 청구의 범위에 기재되어 있다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 기재된 절차에서 변형이 이루어질 수 있음을 이해한다.
하기 실시예에서 IL-6 수용체에 대한 항체의 이용은 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이고, 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1
모 항체의 CDR 영역에 특이적으로 결합하는 다클론 항-이디오타입 항체 및 E, G, A 및 M 클래스의 다클론 인간 혈청 면역글로불린의 조성물의 제조
다클론 항-항- IL -6R 항체 항체(항-항- IL -6R- mAb pAb )
i) 단일클론 항- IL -6R 항체에 대한 다클론 항체의 제조
토끼 혈청으로부터 다클론 항체의 정제
표준 방법에 따라 단일클론 항-IL-6R 항체에 의해 토끼를 면역화시켰다. 5마리의 면역화된 토끼의 원 혈청(raw serum)에서, 에어로실(Aerosil)(1.5% (w/v))에 의해 탈지시켜 지질 구성요소를 제거하고, 황산 암모늄(1.7M)에 의해 면역글로불린을 침강시켰다. 산 처리(30분, pH 5.5), 및 50mM NaCl으로 보충된 15mM 인산칼륨 완충액, pH 7.0에 대한 투석후에, pH 7.0에서 DEAE 이온 교환 크로마토그래피에 의해 혼합물을 분리하였다. 면역글로불린 G 분획물이 통과물질(= 토끼 항-항-IL-6R-mAb pAb)에 있으며, 약 25mg/ml으로 농축하였다.
IL -6R에 대한 모 항체의 CDR 영역에 특이적으로 결합하는 토끼 항-항- IL -6R- mAb 항체의 제조
이전 단계의 농축된 IgG 분획물을 150mM NaCl에 의해 보충된 50mM 인산 칼륨, pH 7.5을 갖는 완충 시스템(PBS)으로 옮겼다. 당업계의 기술에 의해 항-IL-6R 항체를 NHS-세파로즈에 접합시켜서 제조된 고정된 항-IL-6R 항체(모 항체)와 함께 면역흡착제를 컬럼에 충전시키고, 150mM NaCl에 의해 보충된 50mM 인산칼륨 완충액, pH 7.5에 의해 평형화하였다.
10mg의 농축된 면역글로불린 G 분획물/ml 면역흡착제를 PBS에 의해 평형화된 컬럼에 도포하였다. PBS, 0.05%(w/v) 트윈(Tween: 등록상표) 20에 의해 보충된 0.5M NaCl, 및 30mM NaCl에 의해 연속하여 컬럼을 세척하였다. 면역흡착제에 특이적으로 결합된 IgG를 3mM HCl 및 1M 프로피온산으로 용리시켰다. 용출액을 PBS에 대해 투석하였다.
인간 면역글로불린 G(IgG) 불변 영역에 대해 교차 반응성을 갖는 항체를 제거하기 위하여 당업계의 기술에 의해 비특이적인 인간 IgG를 NHS-세파로즈에 접합시켜서 제조된, 고정된 인간 IgG를 갖는 친화도 컬럼에 친화도-정제된 항체를 도포시켰다. 상기 컬럼을 PBS에 의해 평형화하였다. 약 6mg의 IgG/ml 면역흡착제를 컬럼에 도포하였다. 목적하는 특이적 다클론 IgG-분획물이 통과물질에 있다. 0.05%(w/v) 트윈(등록상표) 20에 의해 보충된 0.5M NaCl, 30mM NaCl, 1M 프로피온산 및 PBS를 사용하여 컬럼을 재생시킨 후에, 인간 IgG 불변 영역에 비특이적으로 결합하는 항체의 면역흡착을 2회 반복하여서 인간 IgG에 대해 교차 반응성을 갖는 항체를 완전히 제거하였다.
인간 IgG 불변 영역에 대해 교차 반응성을 갖지 않는 수득된 정제된 다클론 항-항-IL-6R-항체 항체를 약 4mg/ml로 농축시키고 -80℃에서 보관하였다.
ii ) 다클론 항-항- IL -6R-항체 항체와 다클론 인간 면역글로불린 E, 인간 면역글로불린 G, 인간 면역글로불린 A 및 인간 면역글로불린 M의 접합
다클론 토끼 항-항- IL -6R-항체 항체( aa - IL -6R pAb )와 인간 면역글로불린 G의 접합체의 제조
1 단계: 토끼 aa - IL -6R pAb - SATP 의 제조
150mM NaCl을 함유하는 100mM 인산 칼륨 완충액, pH 7.8에 대해 aa-IL-6R pAb을 투석하고, 단백질 용액을 약 15mg/ml의 단백질 농도로 조정하였다. N-숙신이미딜-3-아세틸티오프로피온에이트(SATP)를 DMSO에 용해시키고, 1:5(aa-IL-6R pAb:SATP)의 몰비로 항체 용액에 첨가하였다. pH를 pH 7.1로 조정하고, 혼합물을 25℃에서 60분동안 배양하였다. 10mM의 최종 농도로 L-라이신을 첨가하여서 반응을 중지시키고, 200mM NaCl, 1mM EDTA를 함유하는 10mM 인산 칼륨 완충액, pH 6.1에 대해 투석하여서 나머지 SATP를 제거하였다.
2 단계: 인간 다클론 인간 면역글로불린 G- MH 의 제조
30mM 인산 칼륨 완충액, pH 7.4에 대해 다클론 인간 항체를 투석하고, 이후에 단백질 용액을 약 25mg/ml의 단백질 농도로 조정하였다. 말레이미도헥산오일-N-하이드록시숙신이마이드 에스터(MHS)를 DMSO에 용해시키고, 1:6(IgG:MHS)의 몰비로 항체 용액에 첨가하였다. pH를 pH 7.1로 조정하고, 혼합물을 25℃에서 60분동안 배양하였다. L-라이신을 10mM의 최종 농도가 되도록 첨가하여서 반응을 중지시키고, pH를 pH 6.2로 조정하고, 200mM NaCl, 1mM EDTA을 함유하는 10mM 인산 칼륨 완충액, pH 6.1에 대해 투석하여서 나머지 MHS를 제거하였다.
3 단계: aa - IL -6R pAb - SATP 와 다클론 인간 면연글로불린 G- MH 의 접합
2%(v/v) 1M 하이드록시아민, pH 7.5과 함께 배양하여서 aa-IL-6R pAb-SATP를 aa-IL-6R pAb-SH로 탈아세틸화시키고, 25℃에서 45분동안 배양하였다. 탈아세틸화된 항체를 다클론 인간 면역글로불린 G-MH와 혼합시키고(IgG-SH:IgG-MH의 몰비 = 1:3), 200mM NaCl, 1mM EDTA을 함유하는 10mM 인산 칼륨 완충액, pH 6.1에 의해 1.5mg/ml aa-IL-6R pAb-SH 및 4.5mg/ml 다클론 인간 면역글로불린 G-MH의 최종 농 도로 희석하였다. pH를 pH 7.1로 조정하고, 혼합물을 25℃에서 배양하였다. 분석 겔 여과 컬럼(예: TSK 3000)으로 접합 과정을 분석하였다. 1mM의 최종 농도가 되도록 시스테인을 첨가하여서 일반적으로 45분후에 접합을 중지시켰다. 추가의 30분 배양 시간후에 N-메틸말레이마이드(NMM)을 5mM의 최종 농도가 되도록 첨가하고, pH를 pH 7.5로 조정하였다. 25℃에서 60분 배양후에, S300 겔 여과 크로마토그래피에 의해 접합체를 정제하여서 접합되지 않은 항체를 제거하였다.
토끼 aa - IL -6R pAb 와 인간 면역글로불린 M의 접합체의 제조
1 단계: 토끼 aa - IL -6R pAb - SATP 의 제조
150mM NaCl을 함유하는 100mM 인산 칼륨 완충액, pH 7.8에 대해 aa-IL-6R pAb을 투석하고, 단백질 용액을 약 15mg/ml의 단백질 농도로 조정하였다. N-숙신이미딜-3-아세틸티오프로피온에이트(SATP)를 DMSO에 용해시키고, 1:5(aa-IL-6R pAb:SATP)의 몰비로 항체 용액에 첨가하였다. pH를 pH 7.1로 조정하고, 혼합물을 25℃에서 60분동안 배양하였다. L-라이신을 10mM의 최종 농도로 첨가하여서 반응을 중지시키고, 200mM NaCl, 1mM EDTA를 함유하는 10mM 인산 칼륨 완충액, pH 6.1에 대해 투석하여서 나머지 SATP를 제거하였다.
2 단계: 다클론 인간 면역글로불린 M- MH 의 제조
30mM 인산 칼륨 완충액, pH 7.4에 대해 다클론 인간 항체를 투석하고, 이후에 수득된 단백질 용액을 약 20mg/ml의 단백질 농도로 조정하였다. 말레이미도헥산오일-N-하이드록시숙신이마이드 에스터(MHS)를 DMSO에 용해시키고, 1:50(IgM:MHS)의 몰비로 항체 용액에 첨가하였다. pH를 pH 7.1로 조정하고, 혼합 물을 25℃에서 60분동안 배양시켰다. L-라이신을 10mM의 최종 농도까지 첨가하여서 반응을 중지시켰다. pH를 pH 6.2로 조정하고, 200mM NaCl, 1mM EDTA을 함유하는 10mM 인산 칼륨 완충액, pH 6.1에 대해 투석하여서 나머지 MHS를 제거하였다.
3 단계: aa - IL -6R pAb - SATP 와 다클론 인간 면연글로불린 M- MH 의 접합
2% (v/v) 1M 하이드록시아민, pH 7.5과 함께 배양하여서 aa-IL-6R pAb-SATP를 aa-IL-6R pAb-SH로 탈아세틸화시키고, 25℃에서 45분동안 배양하였다. 탈아세틸화된 항체를 다클론 인간 면역글로불린 M-MH와 혼합시키고(aa-IL-6R pAb-SH:IgM-MH의 몰비 = 1:2), 200mM NaCl, 1mM EDTA을 함유하는 10mM 인산 칼륨 완충액, pH 6.1에 의해 약 0.9mg/ml aa-IL-6R pAb-SH 및 9.1mg/ml 다클론 인간 면역글로불린 M-MH의 최종 농도로 희석하였다. pH를 pH 7.1로 조정하고, 혼합물을 25℃에서 배양하였다. 분석 겔 여과 컬럼(예: TSK 5000)으로 접합 과정을 관측하였다. 1mM의 최종 농도가 되도록 시스테인을 첨가하여서 일반적으로 60분후에 접합 반응을 중지시켰다. 추가의 30분 배양 시간후에 N-메틸말레이마이드(NMM)를 5mM의 최종 농도로 첨가하고, pH를 pH 7.5로 조정하였다. 25℃에서 60분 배양후에, S400 겔 여과 크로마토그래피에 의해 접합체를 정제하여서 접합되지 않은 항체를 제거하였다.
토끼 aa - IL -6R pAb 와 다클론 인간 면역글로불린 E의 접합체의 제조
1 단계: 토끼 aa - IL -6R pAb - SATP 의 제조
150mM NaCl을 함유하는 100mM 인산 칼륨 완충액, pH 7.8에 대해 aa-IL-6R pAb을 투석하고, 단백질 용액을 약 15mg/ml의 단백질 농도로 조정하였다. N-숙신이미딜-3-아세틸티오프로피온에이트(SATP)를 DMSO에 용해시키고, 1:5(aa-IL-6R pAb:SATP)의 몰비로 항체 용액에 첨가하였다. pH를 pH 7.1로 조정하고, 혼합물을 25℃에서 60분동안 배양하였다. L-라이신을 10mM의 최종 농도로 첨가하여서 반응을 중지시키고, 200mM NaCl, 1mM EDTA를 함유하는 10mM 인산 칼륨 완충액, pH 6.1에 대해 투석하여서 나머지 SATP를 제거하였다.
2 단계: 다클론 인간 면역글로불린 E- MH 의 제조
30mM 인산 칼륨 완충액, pH 7.4에 대해 다클론 인간 항체를 투석하고, 수득된 단백질 용액을 약 13mg/ml의 최종 단백질 농도로 조정하였다. 말레이미도헥산오일-N-하이드록시숙신이마이드 에스터(MHS)를 DMSO에 용해시키고, 1:6(IgE:MHS)의 몰비로 항체 용액에 첨가하였다. pH를 pH 7.1로 조정하고, 혼합물을 25℃에서 60분동안 배양시켰다. L-라이신을 10mM의 최종 농도가 되도록 첨가하여서 반응을 중지시키고, pH를 pH 6.2로 조정하고, 200mM NaCl, 1mM EDTA을 함유하는 10mM 인산 칼륨 완충액, pH 6.1에 대해 투석하여서 나머지 MHS를 제거하였다.
3 단계: 토끼 aa - IL -6R pAb - SATP 와 다클론 인간 면연글로불린 E- MH 의 접합
2%(v/v) 1M 하이드록시아민, pH 7.5과 함께 배양하여서 aa-IL-6R pAb-SATP를 aa-IL-6R pAb-SH로 탈아세틸화시키고, 25℃에서 45분동안 배양하였다. 탈아세틸화된 항체를 다클론 인간 면역글로불린 E-MH와 혼합시키고(aa-IL-6R pAb-SH:IgE-MH의 몰비 = 1:1.7), 200mM NaCl, 1mM EDTA을 함유하는 10mM 인산 칼륨 완충액, pH 6.1에 의해 2.9mg/ml aa-IL-6R pAb-SH 및 6.3mg/ml 다클론 인간 면역글로불린 E-MH의 농도로 희석하였다. pH를 7.1로 조정하고, 혼합물을 25℃에서 배양하였다. 분석 겔 여과 컬럼(예: TSK 4000)으로 접합 과정을 관측하였다. 1mM의 최종 농도가 되 도록 시스테인을 첨가하여서 일반적으로 90분후에 접합 과정을 중지시켰다. 추가의 30분 배양 시간후에 N-메틸말레이마이드(NMM)를 5mM의 최종 농도가 되도록 첨가하고, pH를 pH 7.5로 조정하였다. 25℃에서 60분 배양후에, S300 겔 여과 크로마토그래피에 의해 접합체를 정제하여서 접합되지 않은 항체를 제거하였다.
토끼 aa - IL -6R pAb 와 다클론 인간 면역글로불린 A의 접합체의 제조
1 단계: 토끼 aa - IL -6R pAb - SATP 의 제조
150mM NaCl을 함유하는 100mM 인산 칼륨 완충액, pH 7.8에 대해 aa-IL-6R pAb을 투석하고, 단백질 용액을 약 15mg/ml의 단백질 농도로 조정하였다. N-숙신이미딜-3-아세틸티오프로피온에이트(SATP)를 DMSO에 용해시키고, 1:5(aa-IL-6R pAb:SATP)의 몰비로 항체 용액에 첨가하였다. pH를 pH 7.1로 조정하고, 혼합물을 25℃에서 60분동안 배양하였다. L-라이신을 10mM의 최종 농도로 첨가하여서 반응을 중지시키고, 200mM NaCl, 1mM EDTA를 함유하는 10mM 인산 칼륨 완충액, pH 6.1에 대해 투석하여서 나머지 SATP를 제거하였다.
2 단계: 다클론 인간 면역글로불린 A- MH 의 제조
30mM 인산 칼륨 완충액, pH 7.4에 대해 다클론 인간 항체를 투석하고, 수득된 단백질 용액을 약 13mg/ml의 최종 단백질 농도로 조정하였다. 말레이미도헥산오일-N-하이드록시숙신이마이드 에스터(MHS)를 DMSO에 용해시키고, 1:6(IgA:MHS)의 몰비로 항체 용액에 첨가하였다. pH를 pH 7.1로 조정하고, 혼합물을 25℃에서 60분동안 배양시켰다. L-라이신을 10mM의 최종 농도가 되도록 첨가하여서 반응을 중지시키고, pH를 pH 6.2로 조정하고, 200mM NaCl, 1mM EDTA을 함유하는 10mM 인산 칼륨 완충액, pH 6.1에 대해 투석하여서 나머지 MHS를 제거하였다.
3 단계: 토끼 aa - IL -6R pAb - SATP 와 다클론 인간 면연글로불린 A- MH 의 접합
2%(v/v) 1M 하이드록시아민, pH 7.5과 함께 배양하여서 aa-IL-6R pAb-SATP를 aa-IL-6R pAb-SH로 탈아세틸화시키고, 25℃에서 45분동안 배양하였다. 탈아세틸화된 항체를 다클론 인간 면역글로불린 A-MH와 혼합시키고(aa-IL-6R pAb-SH:IgA-MH의 몰비 = 1:2), 200mM NaCl, 1mM EDTA을 함유하는 10mM 인산 칼륨 완충액, pH 6.1에 의해 2.9mg/ml aa-IL-6R pAb-SH 및 6.3mg/ml 다클론 인간 면역글로불린 A-MH의 농도로 희석하였다. pH를 7.1로 조정하고, 혼합물을 25℃에서 배양하였다. 분석 겔 여과 컬럼(예: TSK 4000)으로 접합 과정을 관측하였다. 1mM의 최종 농도가 되도록 시스테인을 첨가하여서 일반적으로 90분후에 접합 과정을 중지시켰다. 추가의 30분 배양 시간후에 N-메틸말레이마이드(NMM)를 5mM의 최종 농도가 되도록 첨가하고, pH를 pH 7.5로 조정하였다. 25℃에서 60분 배양후에, S300 겔 여과 크로마토그래피에 의해 접합체를 정제하여서 접합되지 않은 항체를 제거하였다.
실시예 2
바이오틴화 항- IL -6R 항체와 스트렙타비딘 피복된 칩의 결합
항-IL-6R 항체를 완충액(100mM 인산 칼륨 완충액, pH 8.5)에 대해 투석하였다. 이후에, 상기 용액을 10mg/ml의 단백질 농도로 조정하였다. D-바이오틴오일-아미노카프로산-N-하이드록시숙신이마이드 에스터를 DMSO에 용해시키고, 1:5의 몰비로 항체 용액에 첨가하였다. 60분후에, L-라이신을 첨가하여서 반응을 중지시켰다. 150mM 염화나트륨으로 보충된 25mM 인산 칼륨 완충액, pH 7.5에 대해 투석하 여서 나머지 표지화 시약을 제거하였다.
CM5 칩의 유동 셀(flow cell)의 표면을 제 1 단계에서 NHS-EDC 혼합물에 의해 활성화하였다. 표면 활성화후에, 누트라비딘(Neutravidin)(pH 4.5의 완충액에 희석됨; 피어스(Pierce)) 100㎍/ml 용액을 주입하여서 활성화 표면 에스터에 대한 공유 결합이 형성되도록 하였다. 그 다음, 1M 에탄올아민을 주입하여서 나머지 결합되지 않은 에스터를 불활성화시켰다. 바이오틴화 항체를 20㎕/분 유속 및 20㎍/ml 농도로 5분동안 단일 유동 셀위로 주입하였다. 이로써 항체를 유동 셀에 고정시켰다.
실시예 3
인간 혈청에서 IgG 클래스 항-항-IL-6R-항체 항체의 검출
시료를 1:10 내지 1:100으로 희석하고, 실시예 2에서 제조된 칩위에 20㎕/분의 유속으로 20㎕ 체적씩 주입하였다. 시료 주입후에, 항 IgG-클래스 항체 mAb 항-인간-면역글로불린-G 항체를 20㎕/분의 유속 및 20㎍/ml의 농도로 주입하였다. 최종적으로, 재생 용액(100mM H3PO4)의 1회 주입을 실시하였다. 표준 시료를 각 측정을 시작할 때에 측정하였다. 다클론 토끼 항-항-IL-6R-항체 항체(aa-IL-6R pAb)와 인간 IgG의 접합체 20㎕을 20㎕/분의 유속으로 항-IL-6R 항체의 고정된 완전 항체, F(ab')2-분절, 및/또는 Fc 분절과 함께 면역원성 칩위에 양성 표준물로 주입하였다. 표준물 주입후에, 선택적으로 항 Ig-클래스 항체 mAb 항-인간-면역글로불린 G 항체를 동일한 유속으로 주입하였다.
실시예 4
인간 혈청에서 IgE 클래스 항-항- IL -6R-항체 항체의 검출
시료를 1:10 내지 1:100으로 희석하고, 실시예 2에서 제조된 칩위에 20㎕/분의 유속으로 20㎕ 체적씩 주입하였다. 시료 주입후에, 항 IgE-클래스 항체 mAb 항-인간-면역글로불린 E 항체를 20㎕/분의 유속 및 20㎍/ml의 농도로 주입하였다. 최종적으로, 재생 용액(100mM H3PO4)의 1회 주입을 실시하였다. 표준 시료를 각 측정을 시작할 때에 측정하였다. 토끼 aa-IL-6R pAb와 인간 IgE의 접합체 20㎕을 20㎕/분의 유속으로 항-IL-6R 항체의 고정된 완전 항체, F(ab')2-분절, 및/또는 Fc 분절과 함께 면역원성 칩위에 양성 표준물로 주입하였다. 표준물 주입후에, 선택적으로 항 IgE-클래스 항체 mAb 항-인간-면역글로불린 E 항체를 동일한 유속으로 주입하였다.
실시예 5
인간 혈청에서 IgM 클래스 항-항- IL -6R-항체 항체의 검출
시료를 1:10 내지 1:100으로 희석하고, 실시예 2에서 제조된 칩위에 20㎕/분의 유속으로 20㎕ 체적씩 주입하였다. 시료 주입후에, 항 IgM-클래스 항체 mAb 항-인간 면역글로불린 M을 20㎕/분의 유속 및 20㎍/ml의 농도로 주입하였다. 최종적으로, 재생 용액(100mM H3PO4)의 1회 주입을 실시하였다. 각 측정을 시작할 때에 표준 시료를 측정하였다. 토끼 aa-IL-6R pAb와 인간 IgM의 접합체 20㎕을 20㎕/분의 유속으로 항-IL-6R 항체의 고정된 완전 항체, F(ab')2-분절, 및/또는 Fc 분절과 함께 면역원성 칩위에 양성 표준물로 주입하였다. 표준물 주입후에, 선택적으로 항 IgM-클래스 항체 mAb 항-인간-면역글로불린 M 항체를 동일한 유속으로 주입하였다.
실시예 6
인간 혈청에서 IgE , IgG 및 IgM 클래스 항-항- IL -6R-항체 항체의 검출
시료를 1:10 내지 1:100으로 희석하고, 실시예 2에서 제조된 칩위에 20㎕/분의 유속으로 20㎕ 체적씩 주입하였다. 시료 주입후에, 항 IgE-클래스 항체 mAb 항-인간-면역글로불린 E를 20㎕/분의 유속 및 20㎍/ml의 농도로 주입하였다. 주입후에 반응을 기록하였다. 그 다음, 항 IgM-클래스 항체 mAb 항-인간-면역글로불린 M을 20㎕/분의 유속 및 20㎍/ml의 농도로 주입하였다. 주입후에 반응을 기록하였다. 그 다음, 항 IgG-클래스 항체 mAb 항-인간-면역글로불린 G을 20㎕/분의 유속 및 20㎍/ml의 농도로 주입하였다. 주입후에 반응을 기록하였다. 최종적으로, 재생 용액(100mM H3PO4)의 1회 주입을 실시하였다. 각 측정을 시작할 때에 3개의 전술된 표준 시료(접합체)를 측정하였다. 표준물 1: 토끼 aa-IL-6R pAb와 인간 IgM의 접합체 20㎕을 면역원성 칩위에 양성 표준물로 주입하였다; 표준물 2: 토끼 aa-IL-6R pAb와 인간 IgE의 접합체 20㎕을 면역원성 칩위에 양성 표준물로 주입하였다; 표준물 3: 토끼 aa-IL-6R pAb와 인간 IgG의 접합체 20㎕을 면역원성 칩위에 양성 표준물로 주입하였다.
실시예 7
표준 접합체를 이용하는 IgE 클래스의 항-모 항체의 ELISA -확인
제 1 단계에서, IL-6 수용체에 대한 바이오틴화 항체(모 항체)를 스트렙타비딘-피복된 미량역가판(SA-MTP)의 벽면에 결합시켰다. 통상의 완충액으로 세척하여서 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 그 다음, 시료 및 기준 표준물(다클론 인간 IgE에 접합된 항-IL-6 수용체 항체에 대한 토끼 항체)을 상이한 웰에 첨가하여 배양하였다. 시료 및 기준 표준물 각각으로부터의 항-모 항체가 고정된 모 항체에 결합하였다. 세척 단계이후에, 결합된 항-모 항체 및 기준 표준물 각각을 인간 IgE에 대한 다이곡시젠화 항체에 의해 검출하고, 이어서 호스래디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase) 표지된 항-다이곡시제닌-항체와 함께 배양하였다. 항체-효소 접합체는 ABTS(등록상표) 기질의 색 반응을 촉진시켰다. 405nm 파장(기준 파장: 490nm)에서 ELISA 판독기에 의해 상기 신호를 측정하였다. 각 혈청 시료의 흡수치를 3회 반복하여 측정하였다. 표준물에서, 그리고 항-모 항체가 IgE 하위클래스인 경우에는 시료에서도 양성 신호가 수득되었다(도 5 및 6).

Claims (7)

  1. 면역분석 방법에서 표준물 또는 양성 대조군으로서 사용하기 위한 접합체(conjugate)로서,
    단일클론 치료용 항체의 CDR 영역에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입(anti-idiotype) 항체 및 단일 면역글로불린 클래스의 기준 면역글로불린을 포함하고, 상기 기준 면역글로불린이 인간 면역글로불린 또는 인간 면역글로불린 Fc-영역이며,
    하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 접합체:
    a) 단일클론 치료용 항체의 CDR 영역에 특이적으로 결합하는 다클론 항체의 SATP(N-숙신이미딜-3-아세틸티오프로피온에이트)-유도체를 제조하는 단계,
    b) 단일 면역글로불린 클래스를 갖는 다클론 인간 면역글로불린 또는 인간 면역글로불린 Fc-영역의 MHS(말레이미도헥산오일-N-하이드록시숙신이미드 에스터)-유도체를 제조하는 단계, 및
    c) 단계 a)의 다클론 항체의 SATP-유도체 및 단계 b)의 다클론 인간 면역글로불린 또는 인간 면역글로불린 Fc-영역의 MHS-유도체를 탈아세틸화하여 접합시키는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 기준 면역글로불린이 상기 항-이디오타입 항체에 특이적으로 결합하지 않고 상기 치료용 항체에 특이적으로 결합하지 않음을 특징으로 하는 접합체.
  3. 시료에 있는 항-모 항체 항체(anti-parent-antibody antibody)를 확인하기 위한 면역분석 방법으로서, 제 1 항에 따른 접합체가 표준물 또는 양성 대조군으로서 사용되는 면역분석 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 면역분석 방법이 포획 항체(capture antibody) 및 탐침 항체(tracer antibody)를 포함하는 샌드위치 면역분석법이고, 상기 포획 또는 탐침 항체가 상기 모 항체임을 특징으로 하는 면역분석 방법.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    상기 항-모 항체 항체가 상기 모 항체에 대한 항-이디오타입 항체임을 특징으로 하는 면역분석 방법.
  6. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    상기 포획 항체가 상기 모 항체의 경쇄, 중쇄 가변 영역, Fab, Fab', F(ab)2 또는 F(ab')2 분절을 포함하는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 면역분석 방법.
  7. 포획 항체, 탐침 항체 및 제 1 항에 따른 접합체를 포함하는 샌드위치 면역분석법을 이용하여 시료에 있는 모 항체의 CDR 영역에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체의 면역글로불린 클래스를 결정하는 방법으로서,
    a) 포획 항체/항-이디오타입 항체-결합체의 형성에 적합한 조건하에 상기 시료와 상기 포획 항체를 접촉시키는 단계,
    b) 탐침 항체로서의 i) 항-인간-면역글로불린-A 항체, ii) 항-인간-면역글로불린-E 항체, iii) 항-인간-면역글로불린-M 항체, 및 iv) 항-인간-면역글로불린-G 항체를 상기 포획 항체/항-이디오타입 항체-결합체와 별도로 접촉시키는 단계, 및
    c) 상기 탐침 항체와 상기 결합체의 결합을 확인함으로써 상기 항-이디오타입 항체의 면역글로불린 클래스를 결정하는 단계
    를 포함하고, 이때 제 1 항에 따른 접합체가 양성 대조군으로서 사용되는 방법.
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