CN108896752A - 一种用于等离子体金芯片的封闭缓冲液 - Google Patents

一种用于等离子体金芯片的封闭缓冲液 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于等离子体金芯片的封闭缓冲液，包括由牛血清白蛋白、海藻糖、甘氨酸、柠檬酸钠以及Proclin300所混合而成的混合液；在所述混合液中所述牛血清白蛋白浓度为5‑30g/L、所述海藻糖浓度为10‑100g/L、所述甘氨酸浓度为5‑30g/L、所述柠檬酸钠浓度为0.02‑0.2mol/L、所述Proclin300浓度为0.01‑0.2％；且所述混合液pH值范围为6.0‑7.2，本申请可以长时间保持被固定蛋白的生物活性，进一步提高蛋白芯片稳定性，由于混合液的pH值为6.0‑7.2，由此，本申请可以进一步在较长时间内保持被固定蛋白的生物活性。

Description

一种用于等离子体金芯片的封闭缓冲液
[技术领域]
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种能延长芯片表面蛋白的保存时间，提高蛋白芯片的稳定性的用于等离子体金芯片的封闭缓冲液。
[背景技术]
目前，临床领域应用的免疫检测方主要有免疫比浊、免疫层析、酶联免疫(Elisa)、化学发光免疫分析(CLIA)，以及近些年发展应用的蛋白芯片-免疫荧光法。蛋白芯片在医疗诊断领域，通过双抗夹心法来达到对疾病相关蛋白含量检测的目的，利用连接于固相载体上的抗体和荧光标记的抗体分别与待测样本中被检测抗原分子上两个抗原决簇结合，形成抗体-抗原-荧光染料标记的抗体复合物由于反应系统中固相抗体与标记抗体相对待测抗原过量，所以在监测范围内，复合物的量与待测抗原成正比，通过测定复合物中荧光的信号值，即可测定抗原含量。由于微量生物活性物质(如抗原或抗体)固定到芯片上后很容易丧失活性，蛋白芯片法都涉及到一项关键的技术，即保持蛋白芯片的稳定性。
等离子体材料通常指的是贵金属(例如金)及其复合物，其在特定波长范围内的光照下具有独特的表面等离子体共振效应。因为具有特定的结构和表面化学性质，这种等离子体材料在近红外区(NIR-FE，650-1700nm)具有荧光增强效应，通过微量点样技术在这种材料上固定特定的蛋白(抗体或抗原)，可实现生物标志物的检测。值得注意的是，目前常用的等离子体金芯片芯片封闭缓冲液是磷酸盐缓冲液，这类缓冲液只能对芯片上的蛋白质起保湿作用，短时间内防止因过度干燥而引起的蛋白质失活，并不能长期有效地保持其生物活性。保持芯片上蛋白质活性的方法通常是将芯片长期保存在-20℃以下的环境中，并且不能冻融，而在2-8℃冰箱存放一周或37℃破坏一天，其生物活性就损失了50％以上。可见，相关技术中存在蛋白质在芯片上易失活、稳定性差的问题。
[发明内容]
为克服现有技术所存在的问题，本发明提供一种能延长芯片表面蛋白的保存时间，提高蛋白芯片的稳定性的用于等离子体金芯片的封闭缓冲液。
本发明解决技术问题的方案是提供一种用于等离子体金芯片的封闭缓冲液，包括由牛血清白蛋白、海藻糖、甘氨酸、柠檬酸钠以及Proclin300所混合而成的混合液；在所述混合液中所述牛血清白蛋白浓度为5-30g/L、所述海藻糖浓度为10-100g/L、所述甘氨酸浓度为5-30g/L、所述柠檬酸钠浓度为0.02-0.2mol/L、所述Proclin300浓度为0.01-0.2％；且所述混合液pH值范围为6.0-7.2。
优选地，所述牛血清白蛋白浓度为5-15g/L。
优选地，所述海藻糖浓度为20-50g/L。
优选地，所述甘氨酸浓度为10-20g/L。
优选地，所述柠檬酸钠浓度为0.05-0.2mol/L。
优选地，所述Proclin300浓度为0.05-0.15％，更优选为0.1-0.15％。
优选地，所述牛血清白蛋白浓度为10-15g/L。
优选地，所述海藻糖浓度为30-50g/L。
优选地，所述甘氨酸浓度为10-15g/L。
优选地，所述柠檬酸钠浓度为0.05-0.1mol/L。
与现有技术相比，本发明一种用于等离子体金芯片的封闭缓冲液通过同时采用牛血清白蛋白、海藻糖、甘氨酸、柠檬酸钠以及Proclin300进行混合并最终得到pH值范围为6.0-7.2的混合液，经过多次重复性的实验，并控制各组成成分在混合溶液中的浓度值大小，当将本申请的封闭缓冲液用于封闭蛋白芯片，特别是等离子金芯片时，该缓冲液与目前常用缓冲液相比，可以使蛋白芯片更稳定，在2-8℃的保存条件下，长时间保持被固定蛋白的生物活性，进一步提高蛋白芯片稳定性，由于混合液的pH值为6.0-7.2，由此，本申请可以进一步在较长时间内保持被固定蛋白的生物活性。
[附图说明]
图1是本发明一种用于等离子体金芯片的封闭缓冲液的实施例1-4和对比例1-4缓冲液封闭芯片，37℃保存6天后，检测芯片上CEA、NSE、Cyfra21-1和羊抗鸡IgY抗体，测得的荧光扫描图。
图2是本发明一种用于等离子体金芯片的封闭缓冲液的实施例1-4和对比例1-4缓冲液封闭芯片，37℃保存6天后，检测芯片上CEA、NSE、Cyfra21-1和羊抗鸡IgY抗体，测得的荧光强度柱状图。
[具体实施方式]
为使本发明的目的，技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定此发明。
请参阅图1和图2，本发明一种用于等离子体金芯片的封闭缓冲液1，包括由牛血清白蛋白、海藻糖、甘氨酸、柠檬酸钠以及Proclin300所混合而成的混合液；在所述混合液中所述牛血清白蛋白浓度为5-30g/L、所述海藻糖浓度为10-100g/L、所述甘氨酸浓度为5-30g/L、所述柠檬酸钠浓度为0.02-0.2mol/L、所述Proclin300浓度为0.01-0.2％；且所述混合液pH值范围为6.0-7.2。
通过同时采用牛血清白蛋白、海藻糖、甘氨酸、柠檬酸钠以及Proclin300进行混合并最终得到pH值范围为6.0-7.2的混合液，经过多次重复性的实验，并控制各组成成分在混合溶液中的浓度值大小，当将本申请的封闭缓冲液用于封闭蛋白芯片，特别是等离子金芯片时，该缓冲液与目前常用缓冲液相比，可以使蛋白芯片更稳定，在2-8℃的保存条件下，长时间保持被固定蛋白的生物活性，进一步提高蛋白芯片稳定性，由于混合液的pH值为6.0-7.2，由此，本申请可以进一步在较长时间内保持被固定蛋白的生物活性。
根据本发明的具体实施例，所述蛋白芯片包括等离子体金芯片。
根据本发明的具体实施例，所述等离子体金芯片可以由玻璃基底和形成在所述玻璃基底表面的纳米金层组成。由此，可以通过点样技术将特定的蛋白按预定的序列固定到等离子体金芯片上，方便实现生物标志物的检测。
根据本发明的具体实施例，通过采用本发明的封闭缓冲液能够有效增加蛋白芯片的稳定性，具体地，在37℃下保存7天，其特定蛋白的活性依然保持在初始值的80％以上。
优选地，所述牛血清白蛋白浓度为5-15g/L。
优选地，所述海藻糖浓度为20-50g/L。
优选地，所述甘氨酸浓度为10-20g/L。
优选地，所述柠檬酸钠浓度为0.05-0.2mol/L。
优选地，所述Proclin300浓度为0.05-0.15％，更优选为0.1-0.15％。
优选地，所述牛血清白蛋白浓度为10-15g/L。
优选地，所述海藻糖浓度为30-50g/L。
优选地，所述甘氨酸浓度为10-15g/L。
优选地，所述柠檬酸钠浓度为0.05-0.1mol/L。
目前保持蛋白芯片上蛋白质活性的方法通常是将芯片长期保存在-20℃以下的环境中，并且不能冻融，而在2-8℃存放一周或37℃破坏一天，其生物活性就损失50％以上。由于-20℃保存的蛋白芯片具有保存成本高、不利于运输和不方便使用等缺点，因此研发人员开发了蛋白芯片封闭缓冲液，期望通过对蛋白芯片进行封闭来增加其稳定性，常用的蛋白芯片封闭缓冲液由牛血清、高分子聚合物、表面活性剂、糖类、甘油、磷酸盐缓冲液等组成，这类缓冲液只能对以玻璃、塑料和表面化学修饰的普通蛋白芯片起一定的保护作用，在以等离子体金为基底的蛋白芯片上，这类缓冲液并不能长期有效地保持芯片的稳定性。
实施例1：
按照以下浓度和组分配制本发明芯片封闭缓冲液：10g/L牛血清白蛋白、30g/L海藻糖、10g/L甘氨酸、0.05mol/L柠檬酸钠、0.05％Proclin300。用1M氢氧化钠溶液或1M盐酸溶液调节pH值至6.5，待完全混匀后，用0.22微米滤膜过滤2-8℃保存待用。
实施例2：
按照以下浓度和组分配制本发明封闭缓冲液：10g/L牛血清白蛋白、50g/L海藻糖、10g/L甘氨酸、0.05mol/L柠檬酸钠、0.05％Proclin300。用1M氢氧化钠溶液或1M盐酸溶液调节pH值至6.0，待完全混匀后，用0.22微米滤膜过滤2-8℃保存待用。
实施例3：
按照以下浓度和组分配制本发明封闭缓冲液：10g/L牛血清白蛋白、50g/L海藻糖、10g/L甘氨酸、0.1mol/L柠檬酸钠、0.1％Proclin300。用1M氢氧化钠溶液或1M盐酸溶液调节pH值至7.2，待完全混匀后，用0.22微米滤膜过滤2-8℃保存待用。
实施例4：
按照以下浓度和组分配制本发明封闭缓冲液：15g/L牛血清白蛋白、50g/L海藻糖、15g/L甘氨酸、0.1mol/L柠檬酸钠、0.15％Proclin300。用1M氢氧化钠溶液或1M盐酸溶液调节pH值至6.5，待完全混匀后，用0.22微米滤膜过滤2-8℃保存待用。
对比例1：
按照以下浓度和组分配制本发明封闭缓冲液：10g/L牛血清白蛋白、30g/L海藻糖、10g/L甘氨酸、0.05mol/L柠檬酸钠、0.1％叠氮化钠。用1M氢氧化钠溶液或1M盐酸溶液调节pH值至6.5，待完全混匀后，用0.22微米滤膜过滤2-8℃保存待用。
对比例2：
按照以下浓度和组分配制本发明封闭缓冲液：10g/L牛血清白蛋白、30g/L海藻糖、10g/L甘氨酸、0.05mol/L磷酸盐缓冲液、0.1％Proclin300。用1M氢氧化钠溶液或1M盐酸溶液调节pH值至7.2，待完全混匀后，用0.22微米滤膜过滤2-8℃保存待用。
对比例3：
按照以下浓度和组分配制本发明封闭缓冲液：50g/L牛血清白蛋白、5g/L海藻糖、10g/L甘氨酸、0.05mol/L柠檬酸钠、0.1％Proclin300。用1M氢氧化钠溶液或1M盐酸溶液调节pH值至6.5，待完全混匀后，用0.22微米滤膜过滤2-8℃保存待用。
对比例4：
按照以下浓度和组分配制本发明封闭缓冲液：20％小牛血清、1％聚乙二醇8000、1％蔗糖、0.05％吐温-20、1％甘油。用1M氢氧化钠溶液或1M盐酸溶液调节pH值至6.5，待完全混匀后，用0.22微米滤膜过滤2-8℃保存待用。
测试例1：
验证实施例1-4和对比例1-4的封闭缓冲液对芯片上CEA、NSE，Cyfra21-1、鸡IgY抗体的活性保护效果。
(1)将CEA、NSE，Cyfra21-1、鸡IgY抗体点样至等离子体金芯片
将CEA、NSE，Cyfra21-1、鸡IgY抗体分别用50mM柠檬酸三钠稀释到0.2mg/mL，并通过微量蛋白打印仪GeSim Nano-Plotter TM 2.1打印到等离子体金芯片上每孔的第一排、第二排、第三排和第四排。抗体按照3nL每个点、每个点重复5次打印，最终获得直径约400微米的圆形斑点。
(2)等离子金芯片封闭
将点样后的芯片在37℃真空孵育12h保存，然后把芯片分别放入各实施例和对比例配制的封闭缓冲液中浸泡15分钟进行封闭。
(3)芯片检测。
封闭后的芯片放入37℃保存7天，然后取出检测。具体步骤如下：用150μL/孔的PBST(0.05％吐温20)清洗后，每孔加入100微升的CEA、NSE、Cyfra21-1抗原(各10ng/mL厂家：上海领潮生物科技有限公司)，摇动2小时。芯片用PBST洗涤三次，随后加入荧光染料IRDye800(厂家：LI-COR Corporate，货号为：P/N929-7002)标记的四种检测抗体(各4nmol/L)，在黑暗中摇动染色40分钟，后依次用PBST洗涤三次、纯水清洗一次，离心机甩干。
(4)荧光测量定量和结果分析
用MidaScan扫描仪扫描该芯片，选择800纳米通道、激光强度设置为10.0、分辨率设置为20微米。扫描后获得16位灰度图像。用MidaScan Software V2.0.0软件分析该图像。选择栅阵列分析模式测量每个点的强度，点阵的形貌由程序自动识别。每个点的强度通过所选区域总信号强度除以面积获得。图像上平行的5个点的平均荧光强度被定义为测试的强度。CEA、NSE、Cyfra21-1和鸡IgY抗体活性与所获图像上的荧光强度之间存在正相关关系。
检测结果如表1、图1和图2所示。其中，表1是不同封闭缓冲液封闭的芯片在37℃保存6天后测得的荧光强度值，图1和图2分别是在37℃下保存6天的封闭后的芯片CEA、NSE、Cyfra21-1和鸡IgY抗体的荧光扫描图和荧光强度柱状图
表1不同封闭缓冲液封闭芯片，37℃保存6天后测得的荧光强度
结论：从表1、图1和图2中可以看出，实施例1-4的封闭缓冲液能有效保持芯片上抗体的活性，在37℃下保存6天，其活性依然能保持在初始值的80％以上，而此时对比例1和对比例2抗体活性只有初始值的50％以下，对比例3和对比例4抗体几乎完全失活。说明本发明一种用于等离子体金芯片的封闭缓冲液可以显著提高蛋白芯片稳定性，延长蛋白芯片，尤其是等离子体金芯片的保存时间。
与现有技术相比，本发明一种用于等离子体金芯片的封闭缓冲液1通过同时采用牛血清白蛋白、海藻糖、甘氨酸、柠檬酸钠以及Proclin300进行混合并最终得到pH值范围为6.0-7.2的混合液，经过多次重复性的实验，并控制各组成成分在混合溶液中的浓度值大小，当将本申请的封闭缓冲液用于封闭蛋白芯片，特别是等离子金芯片时，该缓冲液与目前常用缓冲液相比，可以使蛋白芯片更稳定，在2-8℃的保存条件下，长时间保持被固定蛋白的生物活性，进一步提高蛋白芯片稳定性，由于混合液的pH值为6.0-7.2，由此，本申请可以进一步在较长时间内保持被固定蛋白的生物活性。
以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于等离子体金芯片的封闭缓冲液，其特征在于：包括由牛血清白蛋白、海藻糖、甘氨酸、柠檬酸钠以及Proclin300所混合而成的混合液；在所述混合液中所述牛血清白蛋白浓度为5-30g/L、所述海藻糖浓度为10-100g/L、所述甘氨酸浓度为5-30g/L、所述柠檬酸钠浓度为0.02-0.2mol/L、所述Proclin300浓度为0.01-0.2％；且所述混合液pH值范围为6.0-7.2。
2.如权利要求1所述的一种用于等离子体金芯片的封闭缓冲液，其特征在于：所述牛血清白蛋白浓度为5-15g/L。
3.如权利要求1所述的一种用于等离子体金芯片的封闭缓冲液，其特征在于：所述海藻糖浓度为20-50g/L。
4.如权利要求1所述的一种用于等离子体金芯片的封闭缓冲液，其特征在于：所述甘氨酸浓度为10-20g/L。
5.如权利要求1所述的一种用于等离子体金芯片的封闭缓冲液，其特征在于：所述柠檬酸钠浓度为0.05-0.2mol/L。
6.如权利要求1所述的一种用于等离子体金芯片的封闭缓冲液，其特征在于：所述Proclin300浓度为0.05-0.15％，更优选为0.1-0.15％。
7.如权利要求2所述的一种用于等离子体金芯片的封闭缓冲液，其特征在于：所述牛血清白蛋白浓度为10-15g/L。
8.如权利要求3所述的一种用于等离子体金芯片的封闭缓冲液，其特征在于：所述海藻糖浓度为30-50g/L。
9.如权利要求4所述的一种用于等离子体金芯片的封闭缓冲液，其特征在于：所述甘氨酸浓度为10-15g/L。
10.如权利要求5所述的一种用于等离子体金芯片的封闭缓冲液，其特征在于：所述柠檬酸钠浓度为0.05-0.1mol/L。
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