CN110093440A - 用于检测转基因植物的探针、探针组、表面等离子共振生物传感器及检测转基因植物的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种用于检测转基因植物的探针、探针组、表面等离子共振生物传感器及检测转基因植物的方法。所述探针的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。本公开的探针及含有该探针的表面等离子共振生物传感器能够特异性地检测NOS终止子，检测灵敏度高且可再生，便于使用。采用该探针及含有该探针的表面等离子共振生物传感器能够灵敏高效特异性地检测含有NOS终止子的转基因植物。本公开的方法克服了传统转基因检测PCR方法耗时长、费用高且不可重复再生检测的缺点，具有灵敏度高、重复性及稳定性好的优点。整个样品分析过程中芯片表面探针活性和结构不受影响，因此可实现传感器的重复利用。
Description
技术领域
本公开涉及生物技术产品分析测试领域，具体涉及一种用于检测转基因植物的探针、表面等离子共振生物传感器及检测转基因植物的方法。
背景技术
目前，用于转基因植物及其加工产品检测的方法主要有两种，一种基于核酸的检测，一种基于蛋白质的免疫学检测。其中，以针对核酸检测的PCR技术在转基因产品成分检测中应用最广泛。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。普通定性PCR在体外扩增特异性片段后，需结合利用电泳技术对产物进行定性分析；实时荧光定量PCR是通过对每一个循环获得的片段上的荧光信号进行实时检测，从而实现对起始模板中特异性片段的定性及定量分析。
但传统的PCR检测方法仪器价格昂贵，耗时较长，且为“终点法”，即每一个反应中所使用的试剂、耗材在实验结束后均不可重复使用，且整个反应过程中不能实现实时监控。
表面等离子体共振(SPR)技术可看做是一种物理光学现象，当入射光以临界角入射到两种不同透明介质界面时将发生全反射，若在介质表面镀上一层金属银或金的薄膜后，此时入射光可引起金属自由电子的共振，电子吸收光能量后导致反射光在一定角度内大大减小，而其中使反射光完全消失的入射光角度称为共振角(SPR角)。SPR角随金属表面流过的液相折射率变化而变化，这一变化又和结合在金属表面的物质的相对分子质量成正比，因此可以通过监测SPR角的动态变化来进行各方面的检测。
发明内容
本公开的目的是提供一种探针及既能提高检测灵敏度又可再生的生物传感器。
为了实现上述目的，本公开第一方面提供一种用于检测转基因植物的探针，所述探针的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。
本公开第二方面提供一种用于检测转基因植物的探针组，包括检测探针和内标探针，所述检测探针为权利要求1所述的探针，所述内标探针的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列。
本公开第三方面提供一种用于检测转基因植物的表面等离子共振生物传感器，所述表面等离子共振生物传感器包括传感芯片，所述传感芯片上偶联有本公开第一方面所述的探针和/或本公开第二方面所述的探针组。
可选地，所述传感芯片表面结合有链霉亲和素；所述探针的5’端标记有生物素。
可选地，所述偶联包括如下步骤：将含有所述探针的偶联溶液流经所述芯片，使所述探针与所述芯片表面结合，得到所述表面等离子共振生物传感器；或者，将含有所述检测探针的检测探针偶联溶液和含有所述内标探针偶联溶液分别流经所述芯片的表面，使所述检测探针和所述内标探针分别与所述芯片表面结合，得到所述表面等离子共振生物传感器。
可选地，所述偶联溶液还含有HEPES、NaCl、EDTA和Surfactant P20，所述探针在所述偶联溶液中的浓度为20～50nM，所述探针的偶联量为200～400RU；或者，所述检测探针偶联溶液和所述内标探针偶联溶液各自独立地还含有HEPES、NaCl、EDTA和Surfactant P20；所述检测探针在所述检测探针偶联溶液中的浓度为20～50nM；所述内标探针在所述内标探针偶联溶液中的浓度为20～50nM；所述检测探针的偶联量为200～400RU，所述内标探针的偶联量为200～400RU；其中，所述偶联的时间为180～500s。
本公开第四方面提供一种检测转基因植物的方法，所述检测的目标基因为NOS终止子，该方法包括如下步骤：S1，提取待测植物的基因组DNA；S2，使含有所述基因组DNA的待测溶液流经所述传感芯片，并检测RU值响应信号；若产生RU值响应信号，则所述待测植物中含有所述目标基因，若未产生RU值响应信号，则所述待测植物中不含有所述目标基因；所述传感芯片为本公开第二方面所述的传感器的所述传感芯片。
可选地，步骤S2中的所述待测溶液流经所述传感芯片的流速为10～30μL/min，时间为180～600s；所述待测溶液还含有浓度为10～13mM的HEPES、浓度为130～150mM的NaCl、浓度为3～5mM的EDTA和浓度为0.05～0.1体积％的Surfactant P20，所述待测溶液的pH为7.4～8.0。
可选地，该方法还包括在步骤S2之后，将所述传感芯片再生，所述再生的方法包括：使再生试剂与所述传感芯片接触30～60s进行再生处理；所述再生试剂为PH值为1.5～3.0的甘氨酸-HCl溶液和/或浓度为10～50mM的NaOH溶液。
可选地，所述待测植物包括水稻。
通过上述技术方案，本公开的探针及含有该探针的表面等离子共振生物传感器能够特异性地检测NOS终止子，检测灵敏度高且可再生，便于使用。采用该探针及含有该探针的表面等离子共振生物传感器能够灵敏高效特异性地检测含有NOS终止子的转基因植物。本公开的方法通过在表面等离子体共振(SPR)传感芯片上偶联与转基因目标分析物互补的单链DNA探针，利用SPR光学传感的原理，获得探针捕获分析物的信号，以实现对转基因目标的分析，在适宜条件下，分析物中存在的目标DNA与芯片表面的互补DNA探针结合，该传感器通过芯片表面重量改变所引起的光学角度的改变而产生信号响应；当改变条件以破坏两者之间的结合时，目标DNA便会从形成的双链DNA复合物中解离下来，而芯片表面的单链DNA探针并不会受到影响，因此便实现了传感器的再生。本公开的传感器及采用该传感器的检测方法克服了传统转基因检测PCR方法的耗时长、费用高且不可重复检测的缺点，具有灵敏度高，重复性及稳定性好的优点，可用于含有NOS基因的转基因水稻大规模高通量检测。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是本公开的检测转基因植物的方法的一种实施方式的检测过程传感图；
图2是本公开的检测转基因植物的方法的一种实施方式的芯片再生过程示意图；
图3是本公开的实施例1的六次进样检测再生结果图；
图4是本公开的实施例1检测非转基因水稻基因组产生的信号响应图；
图5是本公开的实施例1检测含有NOS终止子的转基因水稻基因组产生的信号响应图；
图6是本公开的实施例1的表面等离子共振生物传感器的特异性测试结果图；
图7是本公开的实施例1的表面等离子共振生物传感器的灵敏度测试结果图。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开第一方面提供一种用于检测转基因植物的探针，探针的核苷酸序列为SEQID NO：1所示的序列。其中，SEQ ID NO：1所示的序列为5’-GCAAGACCGGCAACAGGATTCAATC-3’。
本公开第二方面提供一种用于检测转基因植物的探针组，包括检测探针和内标探针，所述检测探针为权利要求1所述的探针，所述内标探针的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列，SEQ ID NO：2所示的序列为5’-ACTGGGACCTCTACGCGAGCGATGA-3’。
本公开第二方面提供一种用于检测转基因植物的表面等离子共振生物传感器，表面等离子共振生物传感器包括传感芯片，传感芯片上偶联有本公开第一方面的探针和/或偶联有本公开第二方面的探针组。
本公开的探针及含有该探针的表面等离子共振生物传感器能够特异性地检测NOS终止子，检测灵敏度高且可再生，便于使用。该SPR生物传感器在保证了PCR方法高特异性的同时，实现了整个检测过程的再生，且与普通定性PCR相比，可实时监控整个检测过程；与实时荧光定量PCR相比，用于SPR检测的样品不需标记，避免了样品因为标记不当而失活且可以实现样品浓度的绝对定量；与数字PCR相比，大大减少了样品的检测时间和流程，且SPR实验所需的传感芯片在实验结束后可再生，大大提高了经济效益。
根据本公开，传感芯片优选为表面结合有链霉亲和素的芯片，例如为购自GEHealthcare的SA芯片；进一步地，探针的5’端可以标记有生物素，以便于探针与芯片偶联。
根据本公开，表面等离子共振生物传感器的结构可以为本领域常规的，例如可以采用购自GE Healthcare的BiacoreTM T200表面等离子共振生物传感器(SPR生物传感器)，通过在传感芯片表面偶联本公开的上述探针得到本公开的表面等离子共振生物传感器。
根据本公开，偶联的方法可以为本领域常规的。为了保证探针在芯片表面的偶联效果，在传感芯片上偶联有本公开第一方面的探针的实施方式中，偶联可以包括如下步骤：将含有探针的偶联溶液流经芯片，使探针与芯片表面结合，得到表面等离子共振生物传感器；含有探针的溶液可以为探针与HBS-EP+缓冲液的混合溶液，即偶联溶液还可以含有HEPES、NaCl、EDTA和Surfactant P20，在一种实施方式中，偶联溶液可以含有10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05体积％Surfactant P20；进一步地，探针在偶联溶液中的浓度可以为20～50nM，优选为20nM。进一步地，为了提高生物传感器的检测灵敏度并且保证对NOS终止子的特异性检测，探针的偶联量优选为200～400RU，更优选为300RU。
在传感芯片上偶联有本公开第二方面的探针组的实施方式中，优选地，探针组中的检测探针和内标探针可以分别偶联于传感芯片的不同通道上；进一步地，为了保证偶联效果，偶联可以包括：将含有检测探针的检测探针偶联溶液和含有内标探针的内标探针偶联溶液分别流经芯片的表面，例如使两种溶液分别注入传感器的两个通道中，使检测探针和内标探针分别与芯片表面结合，得到表面等离子共振生物传感器；其中含有检测探针的溶液可以为检测探针与HBS-EP+缓冲液的混合溶液，即检测探针偶联溶液还可以含有HEPES、NaCl、EDTA和Surfactant P20，在一种实施方式中，检测探针偶联溶液可以含有10mMHEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05体积％Surfactant P20，检测探针的浓度可以为20～50nM，优选为20nM；含有内标探针的溶液可以为内标探针与HBS-EP+缓冲液的混合溶液，即内标探针偶联溶液还可以含有HEPES、NaCl、EDTA和Surfactant P20，在一种实施方式中，内标探针偶联溶液可以含有10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05体积％SurfactantP20，内标探针的浓度可以为20～50nM，优选为20nM。进一步地，为了提高生物传感器的检测灵敏度并且保证对NOS终止子的特异性检测，检测探针的偶联量优选为200～400RU，更优选为300RU；内标探针的偶联量优选为200～400RU，更优选为300RU。
其中，探针的偶联量可以采用本领域的常规方法测试，此处不再赘述，例如在本公开中，探针的偶联量可以通过表面等离子共振生物传感器的RU值表征，RU是指表面等离子共振生物传感器检测产生的响应信号值单位。进一步地，偶联的时间可以为180～500s，优选为300s，流经的流速可以为5～10μL/min，优选为5μL/min。
本公开第三方面提供一种检测转基因植物的方法，检测的目标基因为NOS终止子，该方法包括如下步骤：S1，提取待测植物的基因组DNA；S2，使含有基因组DNA的待测溶液流经传感芯片，并检测RU值响应信号；若产生RU值响应信号，则待测植物中含有目标基因，若未产生RU值响应信号，则待测植物中不含有目标基因；传感芯片为本公开第二方面的传感器的传感芯片。
本公开的方法克服了传统转基因检测PCR方法的耗时长、费用高且不可重复检测的缺点，具有灵敏度高，重复性及稳定性好的优点。整个样品分析过程包括结合、平衡/解离、再生三个过程，其中芯片的再生即分析物离开芯片表面偶联的探针的过程，该过程中芯片表面探针活性和结构不受影响，因此可实现传感器的重复利用。
本公开的检测转基因植物的方法能够对含有NOS终止子的植物进行特异性检测，检测方法方便快捷、灵敏度高且特异性好。该方法特异性高，且实现了整个检测过程的实时监控和再生；减少了样品的检测时间和流程，且SPR实验所需的传感芯片在实验结束后可再生，提高了经济效益。
在根据本公开的一种实施方式中，传感器的传感芯片上偶联有本公开第二方面的探针组，例如探针组中的检测探针和内标探针分别偶联于传感芯片的两个不同通道上，在这一实施方式中，可以使待测植物的基因组DNA溶液分别流经检测探针和内标探针，分别检测内标探针和检测探针的RU值响应信号，此时，步骤S2所述的产生RU值响应信号是指偶联了检测探针和内标探针的两个传感器通道上分别产生RU值响应信号；进一步地，可以根据内标探针的响应信号对待测植物的基因组DNA进行定量检测分析，从而可以实现样品浓度的绝对定量，且样品不需标记，避免了样品因为标记不当而失活。
在本公开的方法中，NOS终止子可以含有NOS靶序列(NOS target)，NOS靶序列的核苷酸序列可以为SEQ ID NO：3所示的序列，其中SEQ ID NO：3所示的序列为5’-GATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGC-3’。
在本公开的方法中，步骤S2中的待测溶液可以为基因组DNA与HBS-EP+缓冲液的混合溶液，即待测溶液还可以含有浓度为10～13mM的HEPES、浓度为130～150mM的NaCl、浓度为3～5mM的EDTA和浓度为0.05～0.1体积％的Surfactant P20；进一步地，待测溶液的pH为可以7.4～8.0，例如为7.4，；例如在一种实施方式中，待测溶液可以含有待测植物的基因组DNA和浓度为10mM的HEPES、浓度为150mM的NaCl、浓度为3mM的EDTA、浓度为0.05体积％的Surfactant P20；进一步地，为了提高检测效率和准确度，优选地，待测溶液流经传感芯片的流速可以为10～30μL/min，进一步优选为10μL/min，流经的时间可以为180～600s，进一步优选为300s。
在本公开的一种实施方式中，为了避免缓冲液基底带来的干扰，可以将上述的含有基因组的溶液注入到传感器的偶联有探针的测试通道和未偶联探针的空白通道中，并将测试通道检测的RU值响应信号与空白通道的RU值响应信号之差作为检测RU值响应信号，然后进行判断。
在一种实施方式中，该方法还可以包括在步骤S2之后，将传感芯片再生，再生的方法可以包括：使再生试剂与传感芯片接触30～60s进行再生处理；再生试剂可以为PH值为1.5～3.0的甘氨酸-HCl溶液和/或浓度为10～50mM的NaOH溶液，甘氨酸-HCl溶液的pH值可以为1.5～3.0，例如为1.5、2.0、2.5或3.0；再生试剂流经传感芯片的流速可以为30～40μL/min，进一步优选为30μL/min，例如在一种实施方式中可以以30uL/min的流速将50mM的NaOH溶液注射30s。
在本公开的方法中，可以对含有NOS终止子的转基因水稻及其相关制品进行检测，待测植物可以为常规种类的含有NOS终止子的水稻及其相关制品。
以下通过实施例进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
在本公开的下述实施例和对比例中，未做特别说明的情况下，所用的试剂和仪器可以为本领域常规商购品。
实施例
采用5’端生物素化的单链DNA探针(NOS探针，SEQ ID NO：1)。
对比例
采用不完全互补寡聚核苷酸，即非NOS靶序列(non-target)，non-target的核苷酸序列为GCGAAACTGTGGAATTGATCAGCGT(SEQ ID NO：4)。
测试例
偶联：将20nM 5’端生物素化的单链DNA PLD探针(SEQ ID NO：2)、NOS探针(SEQ IDNO：1)分别偶联于芯片的通道2、4上，偶联过程采用的流动相为HBS-EP+1×缓冲液(由HBS-EP+10×缓冲溶液稀释10倍获得，稀释后PH值为7.4，其中包含0.1M HEPES、1.5M NaCl、30mMEDTA、0.5％(v/v)Surfactant P20)，进样流速为5uL/min，时间为300s，偶联量达到约300RU。
进样与再生：将浓度为100nM的NOS target(SEQ ID NO：3)，连续六次注入1、2通道且再生后(1通道为参比通道)，比较每次传感器响应值的变化，结果如图3所示；该过程中采用的流动相为HBS-EP+1×缓冲液(缓冲液成分同偶联过程)。进样过程中流速为10uL/min，进样时间为300s。采用流速为30uL/min的50mM NaOH溶液注射30s进行再生处理，表1为50mMNaOH再生循环稳定结合响应。
表1 50mM NaOH再生循环稳定结合响应
样品检测：
将提取的非转基因水稻和包含NOS元件的转基因水稻基因组DNA注入传感器的4个通道(1通道为参比通道)，当向传感系统中注入非转基因水稻基因组(non-target，序列为SEQ ID NO：4)时，2通道产生信号响应，4通道未产生信号响应，如图4所示；当向传感系统中注入包含NOS元件的转基因水稻基因组时，2通道、4通道均产生信号响应，如图5所示。1通道未偶联任何可与目标分析物互补的单链DNA探针，为参比通道，实验中为排除缓冲溶液本底的影响且证明检测通道上产生的信号变化并非目标分析物与芯片表面原有的链霉亲和素结合而致，因此，常扣减1通道上产生的信号响应(Fc2-1，Fc4-1)。
特异性和灵敏度检测：
特异性：为了确定DNA相互作用的特异性，用100nM 25bp的不完全互补寡聚核苷酸(non-target)作阴性对照，无响应信号产生，而100nM NOS靶序列(NOS target)则产生响应信号，证明该传感器特异性良好。实验结果如图6所示。
灵敏度：实验中分别测试了浓度为1000～0.001nM的NOS靶序列的结合响应信号，每个浓度进样3次，研究发现0.01nM的NOS靶序列可产生约1RU的响应信号，而0.001nM的NOS靶序列则不产生响应信号，说明该传感器的检出限为0.01nM，SPR传感器灵敏度测试结果如图7所示。
由实施例和对比例结果对比可知，与其他核苷酸序列相比，本公开的具有SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列的探针及含有该探针的表面等离子共振生物传感器通过与NOS靶序列互补识别，能够特异性地检测含有NOS终止子的转基因水稻及其相关制品，检测灵敏度高、可定量、可再生且使用方便。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 用于检测转基因植物的探针、探针组、表面等离子共振生物传感器及检测转基因植物的方法
<130> 11671CAAS_B
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcaagaccgg caacaggatt caatc 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
actgggacct ctacgcgagc gatga 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gattgaatcc tgttgccggt cttgc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgaaactgt ggaattgatc agcgt 25
Claims (10)
1.一种用于检测转基因植物的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为SEQ IDNO：1所示的序列。
2.一种用于检测转基因植物的探针组，其特征在于，包括检测探针和内标探针，所述检测探针为权利要求1所述的探针，所述内标探针的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列。
3.一种用于检测转基因植物的表面等离子共振生物传感器，其特征在于，所述表面等离子共振生物传感器包括传感芯片，所述传感芯片上偶联有权利要求1所述的探针和/或权利要求2所述的探针组。
4.根据权利要求3所述的传感器，其中，所述传感芯片表面结合有链霉亲和素；所述探针的5’端标记有生物素。
5.根据权利要求3所述的传感器，其中，所述偶联包括如下步骤：将含有所述探针的偶联溶液流经所述芯片，使所述探针与所述芯片表面结合，得到所述表面等离子共振生物传感器；或者，
将含有所述检测探针的检测探针偶联溶液和含有所述内标探针的内标探针偶联溶液分别流经所述芯片的表面，使所述检测探针和所述内标探针分别与所述芯片表面结合，得到所述表面等离子共振生物传感器。
6.根据权利要求3或5所述的传感器，其中，所述偶联溶液还含有HEPES、NaCl、EDTA和Surfactant P20，所述探针在所述偶联溶液中的浓度为20～50nM，所述探针的偶联量为200～400 RU；或者，
所述检测探针偶联溶液和所述内标探针偶联溶液各自独立地还含有HEPES、NaCl、EDTA和Surfactant P20；所述检测探针在所述检测探针偶联溶液中的浓度为20～50nM；所述内标探针在所述内标探针偶联溶液中的浓度为20～50nM；所述检测探针的偶联量为200～400RU，所述内标探针的偶联量为200～400 RU；
其中，所述偶联的时间为180～500s。
7.一种检测转基因植物的方法，其特征在于，所述检测的目标基因为NOS终止子，该方法包括如下步骤：
S1，提取待测植物的基因组DNA；
S2，使含有所述基因组DNA的待测溶液流经所述传感芯片，并检测RU值响应信号；若产生RU值响应信号，则所述待测植物中含有所述目标基因，若未产生RU值响应信号，则所述待测植物中不含有所述目标基因；所述传感芯片为权利要求3～6中任意一项所述的传感器的传感芯片。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，步骤S2中的所述待测溶液流经所述传感芯片的流速为10～30μL/min，时间为180～600s；所述待测溶液还含有浓度为10～13mM的HEPES、浓度为130～150mM的NaCl、浓度为3～5mM的EDTA和浓度为0.05～0.1体积％的Surfactant P20，所述待测溶液的pH为7.4～8.0。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，该方法还包括在步骤S2之后，将所述传感芯片再生，所述再生的方法包括：使再生试剂与所述传感芯片接触30s～60s进行再生处理；所述再生试剂为PH值为1.5～3.0的甘氨酸-HCl溶液和/或浓度为10～50mM的NaOH溶液。
10.根据权利要求7所述的方法，其中，所述待测植物包括水稻。
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| CN1580285A (zh) * | 2004-05-20 | 2005-02-16 | 厦门大学 | 转基因产品的表面等离子共振生物传感器检测方法 |
| US20160138080A1 (en) * | 2013-03-14 | 2016-05-19 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Methylcytosine detection method |
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-
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|---|---|---|---|---|
| CN1580285A (zh) * | 2004-05-20 | 2005-02-16 | 厦门大学 | 转基因产品的表面等离子共振生物传感器检测方法 |
| US20160138080A1 (en) * | 2013-03-14 | 2016-05-19 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Methylcytosine detection method |
| CN106018347A (zh) * | 2016-05-06 | 2016-10-12 | 中国科学院电子学研究所 | 一种表面等离子体共振传感芯片及其制备方法和应用 |
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